Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание и свойства штаммов холерного вибриона с повышенной продукцией протективных антигенов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Создание и свойства штаммов холерного вибриона с повышенной продукцией протективных антигенов"

Р Г Б ОД

2 С Г.•"."] 'Г?

На правах рукописи

ЗАХАРОВА Татьяна Львовна

СОЗДАНИЕ И СВОЙСТВА ШТАММОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА С ПОВЫШЕННОЙ ПРОДУКЦИЕЙ ПРОТЕКТИВНЫХ АНТИГЕНОВ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 1997

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: Доктор биологических наук, старший научный сотрудник Смирнова Н.И.

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор Попов Ю.А. Кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник СаяпинаЛ.В.

Ведущая организация: Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Автореферат разослан с^С&Л. 1997 г.

Защита диссертации состоится <<№» ИЮНЯ 1997 г. в 13 часов на заседании Диссертационного Совета Д 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» (410005, г.Саратов, у л. Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ «Микроб».

Ученый секретарь

Диссертационного Совета

доктор биологических наук, профессор

Корнеев Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Разработка холерных вакцин, вызывающих образование у человека напряженного иммунитета, до сих пор является одним из важнейших направлений в исследованиях по проблеме «Холера». В отличие от клинически выраженной холеры, которая, видимо, обеспечивает защиту от повторного заражения возбудителем холеры на несколько лет, убитые холерные вакцины вызывают лишь частичную защиту (Finkelstein R. А., 1992). Такая относительно низкая эффективность холерных вакцин может быть обусловлена недостаточным содержанием протективных антигенов, среди которых основными являются 01-антиген сероваров Инаба иОгава, адгезины, В-субъединица холерного токсина I (токсин Vibrio cholerae классического биовара) и II (токсин V.cholerae биовара эльтор) типов, обеспечивающих, соответственно, формирование антибактериального, антиколонизирующего и антитоксического иммунитета.

К настоящему времени созданы различные типы холерных вакцин:живые; убитые целыюклеточные (корпускулярные); химические; ферментные; пскусственноклеточпые. Однако лишь некоторые из них получили практическое применение. Одной из таких вакцин является химическая вакцина холероген-анатокснн, содержащая Ol-антиген сероваров Инаба и Огава и анатоксин, формирующая образование антибактериального и антитоксического иммунитета при холере.

Для приготовления указанной вакцины используют высокотоксигенный штамм V.cholerae 569В серовара Инаба, а также производный этого штамма V.cholerae КМ76 серовара Инаба, являющийся гнперпродуцентом холерного токсина (Джапаридзе М.Н. с соавт.,1991; Наумов A.B. с соавт., 1992). Для внесения в вакцину 01 -антигена серовара Огава дополнительно выращивают нетоксигенный штамм V.cholerae 41 Огава. Выбор штаммов 569В Инаба и КМ76 Инаба был обусловлен их уникальным свойством продуцировать и секретировать в культуральную среду значительное

количество холерного токсина, а также ряд других протективных антигенов. Однако клетки названных штаммов сшггезируюч незначительное количество адгезинов Оонбоп С. е1 а1., 1989; KetleyJ.M. & а1., 1990; Ьеуте М.М. е1 а1. 1988),которые в настоящее время считаются одними из основных протективных антигенов, обеспечивающих формирование секреторных антител, препятствующих бактериально!" колонизации тонкого кишечника. Поэтому, одним из приоритетны? направлений в повышении защитных свойств холерных вакцин является создание производственных штаммов холерного вибриона, продуцирующих повышенное количество адгезинов. Кроме того, штаммы с повышенно!" продукцией адгезинов должны также синтезировать значительное количестве В-субъединицы холерного токсина I и II типов, обеспечивающих формирование антитоксического иммунитета при холере. Получение таких штаммов откроет новые возможности для усовершенствования холерных вакцин.

Один из возможных путей конструирования штаммов с повышенной продукцией адгезинов состоит во введении в клеткг холерного вибриона чужеродных генов адгезии а СРА1, обнаруженного у энтеротоксигенных штаммов кишечной палочки, выделенных от человека. Этот адгезии участвует в колонизации тонкого кишечникг человека, непосредственно взаимодействуя с микроворсинками или гликокаликсом эпителиальных клеток.

Клонирование к настоящему времени структурных генов холерногс токсина I и II типов и его В-субъедшшцы позволяет создавать штаммы с повышенной продукцией этих белков. Однако накопленная информация по этому вопросу является недостаточной. До сих пор нет сведений с возможности стабильного наследования в клетках холерного вибрионг двух или более рекомбинантных плазмид, контролирующих биосинтез необходимых протективных антигенов. Отсутствует также информация об особенностях экспрессии хромосомных I: плазмидиых генов в таких штаммах. Вместе с тем, получение и аналиг штаммов холерного вибриона с заданным набором протективных антигенов за счет введения в клетки этого возбудителя различных рекомбинантных плазмид может внести существенный вклад е изучение плазмидно-хромосомных взаимоотношений и способствовать

решению такой практической задачи как разработка более эффективных вакцин.

Цель работы- создание и изучение свойств изогенных штаммов холерного вибриона с повышенной продукцией адгезинов и В-субъединицы холерного токсина.

Задачи исследования:

1. Ввести путем конъюгации плазмиду рСРА1 энтеротоксигенной кишечной палочки в клетки изогенных штаммов У.с1ю1егае 569В Инаба и КМ1801 Огава (классического биовара).

2. Изучить особенности наследования и экспрессии генов сГа1, контролирующих биосинтез адгезина СРА1, в клетках холерного вибриона.

3. Определить оптимальные условия культивирования для биосинтеза клетками холерного вибриона чужеродного адгезина СРА1

4. Получить штаммы с дополнительной продукцией В-субъединицы холерного токсина эльтор путем введения в созданные изогенные штаммы \Лс1ю1егае 569В(рСРА1) и КМ1801(рСРА1) рекомбинантных нлазмид с клонированными генами ^хАВ-эльтор и с1хВ-эльтор.

5. Получить очищенный адгезии СРА1 и антитела к нему для выявления продукции адгезина СРА1 созданными штаммами холерного вибриона.

Научная новизна работы.

Впервые получены изогенные штаммы холерного вибриона классического биовара сероваров Инаба и Огава с дополнительной продукцией таких протективных антигенов, как адгезии СРА1 и В-субъедшшца холерного токсина эльтор.

Установлено, что оптимальными условиями для экспрессии чужеродного адгезина СРА1 в клетках холерного вибриона являются культивирование па СРА-агаре в течение 24 час при 37°С и последующее выращивание в течении 18 час при 37"С в триптиказосоевом бульоне. В этих условиях адгезивная активность холерных вибрионов с плазмндой рСРА! повышается в 8-30 раз по сравнению с исходными штаммами.

Впервые показано, что в клетках холерного вибриона классического

биовара могут стабильно наследоваться и эффективно экспрессироваться две рекомбинантные плазмиды, контролирующие биосинтез адгезина СРА1 и В-субъединицы холерного токсина эльтор.

Впервые установлено, что присутствие в клетках холерного вибриона чужеродных клонированных генов адгезивности и В-субъединицы холерного токсина эльтор, находящихся в составе плазмид, не влияет на экспрессию / хромосомных генов, контролирующих продукцию собственных протективных антигенов.

Получен очищенный адгезии СРА1 и поликлональные антитела к нему, что позволяет определять продукцию адгезина СРА1 у холерных вибрионов в дот-иммуноанализе и реакции преципитации.

Практическая значимость.

Депонированы в Российской коллекции патогенных бактерий «Микроб» один моноилазмидный и три днплазмидных изогенных штамма У.сЬо1егае классического биовара сероваров Инаба и Огава, несущих рекомбинантные плазмиды, кодирующие биосинтез адгезина СЕА1, холерного токсина эльтор и В-субъединицы холерного токсина эльтор. Данные изогенные штаммы с повышенной продукцией протективных антигенов могут быть использованы для получения холерной химической вакцины холероген-анатоксин.

По результатам работы составлены «Методические рекомендации по определению адгезина СРА1 у рекомбинантных штаммов холерного вибриона в дот-иммуноанализе», которые одобрены Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол N 7 от 12.03.1997г.) и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» по учрежденческому уровню внедрения.

Выделен очищенный препарат адгезина СРА1 и получены поликлональные антитела к нему, позволяющие определять продукцию адгезина СРА1 у холерных вибрионов в иммунологических реакциях. Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на итоговой апрельской научной конференции института «Микроб» 1994 г., на I съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров 1994 г. и на межлабораторных научных конференциях института «Микроб».

II у б л и 1< а Ц И и. По теме диссертации опубликовано 5 научных статей.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы, илюстрирована 8 рисунками и 5 таблицами. Библиографический указатель содержит 195 источников.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Плазмидные чужеродные гены cfal, контролирующие биосинтез адгезина энтеротоксигенной кишечной палочки CFA1, стабильно наследуются и эффективно экспрессируются в клетках холерного вибриона классического биовара.

2. Культивирование штаммов холерного вибриона, содержащих плазмиду кишечной палочки pCFAl, в течение 24 час tía CFA-arape с последующим выращиванием 18 час в триптиказосоевом бульоне при 37°С обеспечивает оптимальные условия для экспрессии адгезина CFA1.

3. Получены изогенные диплазмидные штаммы холерного вибриона классического биовара сероваров Ннаба и Огава, стабильно продуцирующие, в дополнение к собственным протективным антигенам, адгезии CFA1 и В-субъединицу холерного токсинаэльтор.

4. Присутствие в клетках изогенныхштаммов холерного вибриона двух плазмнд, определяющих продукцию адгезина CFA1 и В-субъединицы холерного токсина эльтор, не влияет на экспрессию хромосомных генов, контролирующих биосинтез таких протективных антигенов как Ol-антиген сероваров Инаба и Огава, холерный классический токсин, протеаза, фосфолипаза, нейраминидаза и ряд белков внешней мембраны.

5. Получен очищенный адгезии CFA1 и поликлональные антитела к нему; показана возможность применения полученных препаратов в дот-иммуноаналпзе и реакции преципитации для выявления адгезина CFA1.

Материалы и методы.

В работе использованы природные и генетически маркированные штаммы V.cholerae и E.coli, характеристика которых дана в диссертации. Штаммы E.coli, несущие рекомбинантные плазмиды pCFAl, рСОЮ7-2 и р1ЕМЗ с клонированными генами адгезина CFA1, холерного токсина эльтор и В-субъединицы холерного токсинаэльтор, любезно предоставлены профессором Гинцбургом А. Л. и профессором И льиной Т. С. (I IЭ М им. Н. Ф. Гам алей, Москва).

В качестве полноценных питательных сред использовали бульон и агар Хоттингера, LB-бульон и LB-arap, синказный бульон и синказный агар, триптиказо-соевый бульон, CFA-arap. Минимальной средой служила глюкозо-солевая плотная среда K.Braskaran и D. Rowley (1956), приготовленная на основе агара «Difco».

В ходе выполнения , работы использовались различные микробиологические, серологические, биохимические, генетические и молекулярно-биологические методы, описание которых приводится в диссертации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Создание изогенных штаммов холерного вибриона сероваров Инаба и Огава, продуцирующих адгезин CFA1

Первый этан нашей работы был посвящен созданию изогенных штаммов холерного вибриона сероваров Инаба и Огава с повышенной продукцией адгезина. Поскольку возбудитель холеры Ol-серогруппы может принадлежать к двум разным сероварам(Инаба или Огава), то холерная вакцина из-за отсутствия перекрестного серовароспецифического иммунитета, должна содержать Ol-антиген обоих сероваров. В этой связи ранее с помощью генетических методов у производственного штамма V.cholerae 569В Инаба, который обладает уникальной способностью продуцировать значительное количество холерного токсина, но отличается низкой колонизирующей активностью, был изменен серовар, и полученный штамм получил обозначение КМ1801 Огава (Давыдова Н.И., 1993). Изогенность токсигенных штаммов V.cholerae 569В Инаба и КМ 1801 Огава послужила основанием для выбора их в качестве основы для конструирования штаммов с повышенной продукцией адгезинов.

Накопленная к настоящему времени информация о возможности экспрессии чужеродных генов в клетках холерного вибриона открывает следующий путь к повышению адгезивности указанных штаммов V.cholerae: внесение в их клетки генов энтеротоксигенной кишечной палочки cfa 1, контролирующих биосинтез адгезина CFA1, являющегося протективным антигеном.

Для осуществления такого подхода была использована конъюгативная рекомбинантная плазмида pCFAl(TpR), несущая гены cfal и ген резистентности к триметоприму. Донором указанной плазмиды служил прототрофный штамм E.coliJ53(pCFAl)TpRStr^ В результате конъюгационных скрещиваний донора E.coliJ53(pCFAl ) с резистентными к стрептомицину реципиентами V.cholerae 569В и КМ 1801 были получены с частотой п • 1 (Г^трансконъюганты TpRStrR. После двукратной чистки на селективной среде (агар Хоттингера с триметопримом и стрептомицином) все проверенные трансконъюганты (по 250 колоний) V.cholerae569B(pCFAl) и KM180l(pCFAl) несли маркер плазмиды pCFAl - резистентность к триметоприму.

Поскольку введенная в клетки холерного вибриона плазмида pCFAl может оказаться неспособной к сохранению в клетках нового хозяина в неселективных условиях, по пять произвольно выбранных трансконъюгантов 569В(рСЕА1)и KM1801(pCFAl ) были проверены на стабильность наследования указанной плазмиды. Оказалось, что на протяжении 60 генераций все проверенные трансконъюганты в 100% слачаев сохраняли плазмиду pCFAl. При этом, как показали данные электрофореза в агарозном геле, в клетках холерных вибрионов плазмида адгезивности находится по отношению к хромосоме в автономном состоянии.

Поскольку введение какого-либо структурного гена в клетки бактерий Fie всегда может обеспечить выражение (или экспрессию) этого гена в новом хозяине, очень важно было оценить экспрессию генов cía i в клетках холерного вибриона. Для решения этой задачи была использована реакция маннозорезистентной гемагглютинации (МРГА) свежих эритроцитов человека I группы крови, так как адгезии CFA1 способен агглютинировать указанные эритроциты. На первом этапе этой работы были определены оптимальные условия для биосинтеза клетками

холерных вибрионов адгезина CFA1. С этой целью исходные и полученные моноплазмидные штаммы выращивались в течение 3-24 час при 37 С на различных твердых и жидких питательных средах: агарах Хоттингера, Мартена, LB-arape, CFA-агаре; в бульоне Хоттингера, LB, триптиказосоевом бульоне. Затем адгезивная активность выращенных культур оценивалась с помощью реакции МРГА. В результате были выявлены следующие оптимальные условия для экспресии генов cfat в клетках холерного вибриона: выращивание при 37 С в течение 24 часов на CFA-агаре и затем 18 часов - в триптиказосоевом бульоне.

Данные реакции МРГА человеческих эритроцитов холерными вибрионами, выращенными при указанных оптимальных условиях представлены в таблице 1. Оказалось, что исходные штаммы 569В Инаба и КМ 1801 Огава агглютинируют человеческие эритроциты в титре 1:20 - 1:40. Эта агглютинация обеспечивается, видимо, собственными фукозо-маннозореристентными гемагглютининами/адгезинамн. В то же время титр положительной реакции МРГА у сконструированных штаммов V.cholerae KM1801(pCFAl) и 569B(pCFAl) составлял, соответственно, 1:160 и 1:1280, что в 8 и 30 раз превышает титр исходных штаммов. Эти данные указывают на эффективную экспрессию чужеродных генов адгезнвности в клетках холерного вибриона.

Таблица 1.

Результаты определения продукции адгезина СЕЛ1 изогекннми штаммами V. сЬо1егае 569В Инаба и V.сПо1егае КН1801 Огава.несущими плазмиду рСГЛ1. с помощью маннозорезистентной гемагглютинадии (МРГА) человеческих эритроцитов I группы крови

Штамм

V otiolerye

Титр реакции ИРГА человеческих эритроцитов

10 20 40 80 160 320 640 1280 2500

569В

569В(рСГА1> КМ1801

КМ1Я01 (riCFAI ) t.69BipCFAl ) (pCLMU7-2) S69B(nCFAl)(pIEM3) КМ1801(pCFAl) (pCO107-2)

+

++++

+++ + + +-+ +

+ -(- +

+ -t- + + + + + +

+ + + + + Ч + +

Примечание: количество «+» обозначает интенсивность реакции.

+

+ + + +

+ + + +

+ Ч- + +

+ + +

* +

+ + + I

+ 4

+ +

+ +

++ +

Принимая во внимание тот факт, что введение чужеродных генов и их экспрессия может привести к заметному изменению экспрессии собственных генов, у сконструироованных штаммов \/.сЬо1егае 569В(рСРА1) и КМ1801(рСРА1) была определена продукция ряда собственных протективных антигенов, присутствие которых в вакцинных препаратах является необходимым. К таким антигенам прежде всего относятся В-субъединица холерного токсина, 01-антиген сероваров Инаба и Огава, а также протеазы, нейраминидаза, фосфолипаза и ряд белков внешней мембраны. Полученные результаты, представленые в таблице 2., свидетельствуют о том, что присутствие чужеродных генов с?а1 не влияет на экспрессию собственных генов, контролирующих биосинтез В-субъединицы холерного токсина I, 01-антигена обоих сероваров и указанных ферментов.

Таблица 2.

Результаты определения продукции холерного то мина, 01-антигсна и ферментов нзогекными штаммами У. :По1егае 559В Инаба и у.сшегае КИ1801 Огава, несущими плазмиду рСГА1

Итанн V. "1по1егае

Юли-чезтво хелеэ-

НС'ГО

токсина

ют/мл

Титр реакции агглютинации с антисыворотками

0 Е0 Инаба Огава

Фэрменты

протз-азз

фосфолипаза

зона пэосвет-лення з им

нейраминидаза ;титр реакц)

10 1:1600 - 1:400 _ 4 3 1:8

10 1:1600 - 1:400 - 4 3 1:8

10 1:1500 - 1:600 4 3 1:8

10 1:1600 - - 1: £00 4 3 1:8

25 1:1600 - 1:400 - 4 3 1 8

20 1:1600 - 1'400 - 4 3 1: Я

20 1:1600 - - 1: £00 4 3 1:8

569В

Р65В(рСКА1> КМ1Й01

КМ1801 (рСТА1) 5в5В(рСгА1) ШС0107-2) ?6иВ(рСТА1) фСТд27) КМ1801(рСГА1) (рй 107-2)

Примечание: << -» - отрицательный результат; количество холерного токсина определено методом ОМ^ЕЬВА; продукция протеазы - на 10% молочном агаре, фосфолипазы - на среде с лецитином, а нейраминидазы - в агаре, содержащем овомуцин.

Что касается белков внешней мембраны, среди которых основной белок OmpU с молекулярной массой 38 кДа является иммуногенным белком, то и по этому признаку исходные и моноплазмидные штаммы не отличались друг от друга. У изученных штаммов отсутствовали также фенотипические различия в подвижности, изменение которой, согласно последним данным (Gardel C.L., Mekalanos J.J., 1996), тесно связано с изменением экспрессии ряда факторов вирулентности и иммуногенности.

Таким образом, основным итогом проведенных исследований является создание стабильных изогенных штаммов холерного вибриона классического биовара 569BHna6a(pCFAl) и KM18010raBa(pCFAl), у которых сохранилась продукция собственных протективных антигенов и значительно повысилась (в 8-30 раз) адгезивная активность за счет введенных чужеродных генов cfa 1, контролирующих биосинтез основного фактора колонизации энтеротоксигенной кишечной палочки CFA1.

2. Повышение продукции холерного токсина и его В-субъединицы у изогенных штаммов холерного вибриона сероваров Инаба и Огава, содержащих плазмиду pCFAl.

Успех работы, направленной на дальнейшее совершенствование химической вакцины холероген-анатоксин, во многом определяется наличием штаммов холерного вибриона, которые бы продуцировали наряду с адгезинамн значительное количество В-субъединнцы холерного токсина как I (токсин холерных вибрионов классичесого биовара) так и II (токсин холерных вибрионов биовара эльтор) типов. Такое требование основано на данных ряда исследователей (Tamplin M.L. etal.,1989; KazemiM., Finkelstein R.A.,1991; Boesman-Finkelstein M.et al. ,1996), свидетельствующих о том, что В-субъединицы холерных токсинов I и II типов отличаются друг от друга по антигенным свойствам. Следовательно, для обеспечения образования эффективного антитоксического иммунитета к холерным вибрионам как классического, так и эльтор биоваров необходимо присутствие в вакцинных препаратах обоих типов В-субъединицы. При этом В-субъединица может присутствовать как сама по себе, так и в составе целой молекулы голотоксина.

Молекулярное клонирование генов холерного токсина и его субъединиц, осуществленное в отечественных и зарубежных лабораториях (Гинцбург А.Л.с соавт., 1984), открывает следующий путь к решению поставленной задачи: введение в полученные моноплазмидные изогенные штаммы V.cholerae классического биовара с чужеродным репликоном pCFAl второй рекомбинантной плазмиды pC0107-2(TcRKm*), несущей клонированные гены холерного токсина эльтор (ctxAB-эльтор) или плазмиды р1ЕМЗ(ТсяКтк) с клонированным структурным геном В-субъедшшцы холерного токсина эльтор (ctxB-эльтор).

Для получения изогенных штаммов холерного вибриона с повышенной продукцией адгезина CFA1 и дополнительной продукцией холерного токсина эльтор в штаммы классического биовара V.cholerae569B(pCFAl)nKM1801(pCFAl)6buia введена конъюгацией плазмида рСО 107-2. Коинтегратная конъюгативная плазмида рСОЮ7-2, сконструированная в 1986 г. А.Л.Гинцбургом с соавт., состоит из двух плазмпд: плазмиды pC0105::mini-kan, содержащей гены устойчивости к тетрациклину (Тс " ) и канамицину (KmR), а также вставку хромосомной ДНК штамма V.cholerae RV79 (биовара эльтор) размером 7,0 т.п.п., в состав которой входит оперон ctxAB, кодирующий биосинтез холерного токсина, и плазмиды рОХ38, которая является производным F-фактора. Донором плазмиды рСО 107-2 служил штамм E.coli KS1574(pC0107-2). В качестве селективной среды использовали минимальный агар с канамицином. Контрселекция донора обеспечивалась отсутствием в среде пролипа, необходимого для его роста. Частота образования Km^-трансконъюгантов составляла 2,5-3,0 х 10 . Все изученные KmR -клоны оказались одновременно Тс и TpR. Такой фенотип трансконъюгантов (KmR Тс*Тр^) указывает на присутствие в клетках штаммов V.cholerae 569В и КМ1801 двух плазмид: pCFAl(TcR) и рСО 107-2(KmRТсПри этом, согласно данным электрофореза в агарозном геле, обе плазмиды были в автономном состоянии.

Особый интерес представляет вопрос о стабильности наследования и экспрессии двух рекомбинантных плазмид в клетках холерного вибриона, поскольку очевиден тот факт, что полученные штаммы будут

представлять ценность для производства лишь в том случае, если введенные плазмидные гены будут стабильно сохраняться и эффективно выражаться. В результате проведенных исследований было установлено, что после выращивания диплазмидных штаммов 18 час в полноценном бульоне без антибиотиков у 70% изученных клонов рекомбинантная плазмида рСОЮ7-2 изменяется по своей структуре, что выражается в образовании клонов, утративших маркер резистентности либо к канамицину, либо к тетрациклину. В то же время среди изученных диплазмидных трансконъюгантов штамма 569В удалось обнаружить клоны с фенотипом Tpft Kmft TcR, который был обусловлен стабильным наследованием обеих рекомбинантных плазмид pCFAl и рСОЮ7-2. Что касается штамма КМ1801, то стабильными оказались лишь TpRTcRKm-s -клоны, сохранившие плазмиду pCFAl и коинтеграт рСОЮ7-2, лишенный транспозона mini-

Одним из важных результатов нашего исследования является получение сведений о том, что присутствие чужеродной плазмиды pCFAl в клетках холерного вибриона не влияет на экспрессию внесенных клонированных генов ctxAB-эльтор. С помощью реакции пассивного иммунного гемолиза и иммуноферментного метода GM 1 ELISA было установлено, что у созданных диплазмидных штаммов V.cholerae569B(pCFAl ХрСО 107-2) и KM1801(pCFAl)(pC0107-2) продукция холерного токсина повысилась более чем в 2 раза по сравнению с исходными штаммами и составила 20-25 мкг/мл (табл.2). Такое повышение биосинтеза холерного токсина служит, на наш взгляд, доказательством эффективной экспрессии введенных клонированных генов ctxAB-эльтор, локализованных на плазмиде рСОЮ7-2.

Поскольку введение в бактериальный геном различных плазмид с целью повышения биосинтеза какого-либо белка может изменить экспрессию собственных хромосомных генов, у созданных диплазмидных штаммов была определена продукция ряда собственных протективных антигенов. Оказалось, что присутствие в клетках холерного вибриона двух рекомбинантных плазмид не влияет на выражение хромосомных генов, контролирующих биосинтез 01-антигена сероваров Инаба и Огава, протеазы, фосфолипазы, нейраминидазы, а также ряда белков внешней мембраны. Основанием для

такого утверждения служит тот факт, что сконструированные пзогепные штаммы холерного вибриона, содержащие плазмиды pCFAl и рСО 107-2, не отличались от исходных штаммов но продукции указанных протективных антигенов (табл.2).

Таким образом, практически важным результатом проведенного исследования явилось получение стабильных изогенных штаммов холерного вибриона классического биовара сероваров Инаба и Огава, содержащих две рекомбинантные плазмиды и продуцирующих в дополнение к собственным протективным антигенам адгезии CFA1 и холерный токсин эльтор, в состав которого входит иммуногенная В-субъедшшца.

Другим важным итогом нашей работы явилось создание диплазмидных изогенных штаммов холерного вибриона обоих сероваров, продуцирующих адгезии CFA 1 и В-субъединицу холерного токсина эльтор. Эта задача решалась путем введения в моноплазмидные штаммы 569BIIna6a(pCFAl) и KM18010raBa(pCFAl) рекомбинантной коинтегратнои плазмиды р1ЕМЗ(КтяТс*), состоящей из двух плазмид, одна из которых (рСТд27) несла клонированные гены В-субъедишщы эльтор и маркер резистентности к тетрациклину. Донором этой плазмиды служил штамм E.coli KS1690(pIEM3). Частота образования трансконъюгантов, получивших плазмиду р1ЕМЗ составляла 1,0 -1,4 х 10~Ä. При анализе отобранных диплазмидных трансконъюгантов было обнаружено, что в клетках холерного вибриона коинтеграт р1ЕМЗ, в отличие от коинтеграта плазмиды рСОЮ7-2, разъединяется на две исходные плазмиды с последующим стабильным сохранением лишь одной плазмиды рСТД27(Тсй), несущей клонированные гены ctxB. Плазмида адгезивности pCFAl во всех случаях наследовалась стабильно.

Таким образом, были выделены изогенные стабильные штаммы 569В Инаба и КМ 1801 Огава, содержащие две плазмиды pCFAl и рСТд 27. Введенные в составе указанных плазмид гены адгезивности cfal и гены В-субъедшшцы холерного токсина эльтор ctxB также эффективно экспрессировались в новом хозяине и не влияли на выражение хромосомных генов, контролирующих биосинтез основных протективных антигенов.

Итак, на основе штамма V.cholerae 569В классического биовара впервые получено два тина диилазмидных изогенных штаммов сероваров Инаба и Огава, с дополнителной продукцией таких протективных антигенов как адгезии CFA1 и В-субъединица холерного токсина эльтор. Созданные штаммы с необходимым набором протективных антигенов открывают новую перспективу получения более эффективных химических вакцин.

3. Получение очищенного адгезина CFA1 и специфических поликлональных антител к нему для определения продукции штаммами холерного вибриона этого антигена.

Для проверки в производственных условиях антигенных свойств штаммов холерного вибриона, используемых для получения вакцинных препаратов, небходимы доступные простые и чувствительные методы. Определение продукции у созданных штаммов адгезина CFA1 основано на реакции гемагглютинации свежих человеческих эритроцитов I группы крови, которые не всегда доступны для исследователей. Кроме того, указанный метод не совсем специфичен, поскольку человеческие эритроциты агглютинируются не только фактором колонизации CFA1, но и адгезинами других типов. Высокоспецифичных диагностических антисывороток или антител, которые можно использовать в простых и доступных иммунологических реакциях для выявления адгезина CFA1, в нашем распоряжении не было. В этой связи были проведены эксперименты по получению очищенного адгезина CFA1 и поликлональных антител к нему.

На первом этапе этой работы был выделен и очищен адгезии CFA1 из клеток штамма E.coliJ53(pCFAl), который является естественным хозяином генов этого адгезина. Штамм E.coliJ53(pCFAl) выращивали на CFA-агаре, который является оптимальной средой для продукции клетками этого антигена, и после отделения фимбрий от клеток получили очищенный белок CFA1. Основными этапами очистки были: мембранная фильтрация, фракционирование сульфатом аммония и хроматография на колонке с DEAE-сефадексом. Схема очистки CFA 1-адгезина представлена в таблице 3. В результате был выделен белок, молекулярная масса которого (около 24000 Да) соответствовала таковой адгезина CFA1.

Второй этап работы был связан с получением поликлоналъных антител к адгезину СРА1, которые готовили путем внутрибрюшинной иммунизации мышей линии ВАЬВ/с полученным очищенным адгезином. Полученные полпклональные антитела, титр которых в дот-иммуноанализе составлял 1:5000, использовали затем для оценки продукции адгезина С17А1 у созданных штаммов холерного вибриона.

Таблица 3.

Очистка адгезина CFA1.

Процедура Продукт Объем (мл) Кони, белка мг/мл Общее кол.белка (мг) 7, CFA 1

Гомогени зация Исходный гомогенат 200 5,63 ига 4

Центрифугирование Исходный супернатант 160 1,2! 193.6 23

Мембранная фильтрация Первичный фильтрат Неочищенный экстракт 160 160 0.835 0,78 133,5 124.8 33.7 30

фракционирование AHS (£0? - 40е?) АНЗ-препарат 10 10,4 104 43. 3

Хроматография Рчпщенный CFA 1 45 1,0 45 100

Для обнаружения продукции адгезина CFA1 у созданных изогенных штаммов холерного вибриона, несущих в своем геноме плазмиду pCFAl, пользовались двумя методами, являющимися достаточно чувствительными и в то же время быстрыми и доступными для контроля при производстве вакцинных препаратов: непрямым вариантом твердофазного дот-иммуноаналша на нитроцеллюлозных фильтрах (Hawkes R. et al., 1982) и реакцией двойной диффузионной преципитации в геле (Ouchterlony О., 1949). Результаты представлены в таблице 4. Сначала для проверки полученных поликлональных антител

на специфичность в качестве положительных контролен были использованы выделенный очищенный CFAl-антиген и штамм Е.соП J53(pCFAl ), из которого он был выделен. Б обоих случаях результаты, полученные с помощью двух методов, были положительными. В качестве отрицательного контроля был взят исходный штамм V.cholerae 569В, не содержащий плазмиду pCFAl, а также бычий сывороточный альбумин (BSA). Оба использованных метода показали отрицательные результаты (табл.4). Эти данные свидетельствовали о специфичности полученных антител. Затем было проведено тестирование специфическими антителами сконструированных изогенных штаммов холерного вибриона, содержащих плазмиду pCFAl. Полученные результаты свидетельствовали об образовании комплекса антиген-антитело всеми проверенными сконструированными штаммами V.cholerae, несущими гены cfal (табл.4), что подтверждает наличие на поверхности их клеток адгезина кишечной палочки CFA1.

Таблица 4.

Результаты дот-иммуноанализа (ДИА) и метода двойной диффузионной преципитации, использованных для обнаружения адгезина кишечной палочки СШ в клетках холерного вибриона. содержащих плазмиду рСШ

Штамм ДИА Реакция преципитации

t.coll J53(pCFAl) + +

V.cliolerac 569В (исходный) - —

V.cholerae 569B(pCFAl) + +

V. cïiolerae 569B(pCFAl ) (pC0107-2) 4- +

V. ufiolerae 569B(pCFAl ) (рСТл27) + +

V.cdolerae KM1801(pCFAl)(pC0107-2) H +

Очищенный CFAl-антиген(" ^'контроль) + +

BSA ("-"контроль) - -

Таким образом, основным итогом этого раздела работы явилось получение очищенного адгезпна СРА1 и приготовление на его основе поликлональных антител. Полное совпадение результатов реакции гемагглютинации с человеческими эритроцитами и данных дот-иммуноанализа и реакции преципитации указывает на возможность использования полученных антител, а также очищенного адгезина СЕА1 (в качестве положительного контроля) для выявления этого антигена как у штаммов холерного вибриона, так, видимо, и в вакцинных препаратах в производственных условиях.

ВЫВОДЫ

1. Установлено стабильное наследование в клетках холерного вибриона классического биовара плазмиды кишечной палочки рСЕА1, несущей гены сГа), контролирующие биосинтез адгезина СЕА1.

Показано, что чужеродные гены сГа1 эффективно экспрессируются в клетках холерного вибриона, что проявляется в повышении адгезивной активности штаммов У.сЬо1егае в 8-30 раз.

2. Получены изогенные днплазмидные штаммы классического биовара У.с1ю1егае 569В11наба(рСРА 1 )(рСО 107-2) и КМ 1801 Опша(рСЕА1) (рСО 107-2), продуцирующие в дополнение к собственным иротективным антигенам адгезии СРА1 и холерный токсин эльтор, биосинтез которых контролируется плазмидами рСЕА1 и рСО 107-2, соответственно.

3. Созданы изогенные днплазмидные штаммы У.с1ю1егае569В Пнаба (рСЕА1)(рСТд 27) и КМ180Югава(рСЕА1 ХрСТД27) с повышенной продукцией иротективных антигенов за счет введения в клетки холерных вибрионов плазмиды адгезивности рСЕА1 и плазмиды рСТд27, несущей клонированные гены В-субъединицы холерного токсина эльтор. Установлено, что нлазмидные гены с£а1 и с1хВ, контролирующие, соответственно, биосинтез адгезина СЕА1 и В -субъединицы холерного токсина эльтор, стабильно наследуются и эффективно выражаются в клетках холерного вибриона классического бповара.

4. Показано, что присутствие в клетках холерного вибриона нлазмидных генов не влияет на выражение хромосомных генов, детерминирующих синтез таких факторов иммуногенности как Ol-антиген сероваров Инабаи Огава, холерный токсин (классический), протеаза, фосфолшюза, нейраминидаза и ряд белков внешней мембраны.

5. Получен очищенный адгезии CFA1 из штамма E.coli и поликлональные антитела к этому антигену. Показана возможность использования очищенного адгезина и антител к нему вдот-иммуноанализе и реакции преципитации для выявления продукции этого протективного антигена созданными штаммами холерного вибриона.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Джапаридзе М.Н., Наумов A.B., Никитина Г.П., Мелещенко М.В..Захарова Т.Л., Доброва Г.В., Заворотных В.II., Грачева В.П. Оральная химическая вакцина из гипертоксигенных штаммов КМ76 Инаба н КМ68 Огава возбудителя холеры // ЖМЭИ.-Москва.-1991.-N4.-с.31-34.

2. Захарова Т.Л., Джапаридзе М.Н., Смирнова H.H. Создание штаммов холерного вибриона сероваров Инаба и Огава с повышенной адгезивной активностью // Иммунология и специфическая профилактика ООН. Матер. Российск. научи, конф.- Саратов.-1993.-с.179-180.

3. ЗахароваТ.Л. Изогенные штаммы холерного вибриона различных сероваров с повышенной продукцией протективных антигенов // Генетика,-1994.-Том 30 .-с .54-55.

4. Захарова Т.Л., Смирнова H.H., Джапаридзе М.Н. Адгезины возбудителя холеры /./ Деп. ВИНИТИ.-17.02.97.-N 505-В97,- 14 с.\

5. Захарова Т.Л., Джапаридзе М.Н., Смирнова H.H. Создание штаммов холерного вибриона сероваров Инаба и Огава, продуцирующих антиген кишечной палочки СЕА1 // Деп. ВИНИТИ.-

• 17.02.97.-N506-B97.-9 с.