Лектиновые рецепторы холерных вибрионов

Колякина, Анастасия Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Лектиновые рецепторы холерных вибрионов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Лектиновые рецепторы холерных вибрионов"

На правах рукописи

КОЛЯКИНА Анастасия Владимировна

ЛЕКТИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ставрополь - 2009

003469524

Работа выполнена в ФГУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук Телесманич Наталья Робертовна.

доктор медицинских наук, профессор Афанасьев Евгений Николаевич;

доктор медицинских наук Алиева Елена Васильевна.

ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора.

Защита диссертации состоится

2009

Г. В /У ЧЕ

часов

на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.09 в Ставропольском государственном университете по адресу:

355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корп. 2, комн. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан О^Л^Лс-Я*-? 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Ржепаковский И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее время большое внимание уделяется изучению лектиновых свойств различных биологических объектов, из которых патогенные микроорганизмы представляют наибольшую актуальность.

Лектины - это протеины или гликопротеины, содержащие как минимум два или четыре активных центра, обладающих способностью связывать углеводы, не изменяя их структуры, которые обеспечивают возможность агглютинировать клетки и преципитировать гликоконъюгаты, взаимодействуя с углеводами, особенно с групповыми детерминантами крови (Boyd W., 1970). Однако микроорганизмы, обладая лектинами (адгезинами, агглютининами), могут участвовать и в таких взаимодействиях in vitro, как гемагглютинация, преципитация, цитотоксичность (Луцик М.Д., 1981; Лахтин В.М., 1994), гемолиз (Телесманич Н.Р., 2003). Можно предположить важную роль лектинов и лектиновых рецепторов в персистенции холерных вибрионов и вибрионосительстве, явлениях бактериоциногении, в прикреплении к зоо- и фитопланктону, в формировании биопленок.

Безусловно, адгезия является начальным и необходимым элементом патогенеза, а структуры, обусловливающие адгезивность возбудителя к клеткам хозяина, признаны определяющими факторами патогенности, так как специфическая адгезия является пусковым механизмом для каскада патологических реакций (Луцик М.Д., 1981; Лахтин В.М., 1994; Тихомирова Е.И., 2003). В 80-90 годы исследованиям адгезии холерных вибрионов был посвящен ряд работ (Смоликова Л.М., 1989; Урбанович Л.Я., 1984; Андрусенко И.Т., 1991). На наличие адгезивных свойств исследовались клеточные стенки (Оленечева Л.С., 1984, 1985), пили, компоненты слизи, жгутиков (Уралева B.C., 1983). Некоторые из них были выделены и охарактеризованы (Король В.В., 1992; Ларионова Л.В., 1992). Относительно лектиновых рецепторов холерных вибрионов и их участия в различных процессах в литературе имеются отрывочные сведения. Предполагается, что лектины кишечной группы микроорганизмов взаимодействуют с гликокаликсом щёточной каймы энтероцитов кишечника и вызывают его повреждение. Это приводит к нарушению функции всасывания слизистой кишечника, повышает ее проницаемость для бактериальных токсинов. Они же усиливают катаболизм белков в тканях и приводят к нарушению азотистого баланса. Лектины устойчивы к протеолизу в желудочно-кишечном тракте (Brady Р., 1978; Liener I., 1976).

Известно, что холерный токсин является типичным лектином, углеводсвязыва-ющая (лектиновая) активность которого сосредоточена в В субъединице (Yangulu N.K., 1996) и специфична ганглиозиду (GM1) (Ouchterlonie О., 1980).

3 i

последнее время привлекают внимание исследователей в связи с их возможной ролью в экологии холерных вибрионов - в сохранении вирулентных клонов в межэпидемический период, формировании новых патогенных клонов в результате передачи генетической информации.

Установлено, что атоксигенные гемолитические V. cholerae eltor используют связанный с клеткой рецептор, специфичный N-ацетил-Д-глюкозамину гемагглю-тинин (лектин), как для формирования биологической пленки на поверхности раздела фаз жидкой питательной среды и воздуха, так и для специфической адгезии к клеткам макроорганизма. Следует отметить, что полимер N-ацетил-Д-глюкозамина - хитин, входящий в состав экзоскелета ракообразных и зоопланктона, является питательной средой, которую многие виды Vibrio используют как источник углерода и азота (Sasmal D., 2002).

В последнее время установлено, что ген hlyA, отвечающий за продукцию гемолизина, кодирует синтез рициноподобного галактозоспецифичного лектина, принимающего участие в лизисе эритроцитов барана, но не эритроцитов кролика, а также в гемагглютинирующей способности атоксигенных и токсигенных штаммов холерных вибрионов (Телесманич Н.Р., 2003).

Генетическим маркером эпидемической значимости штаммов холерных вибрионов являются гены ctx АВ, кодирующие продукцию холерного токсина -одного из основных факторов вирулентности, который по своим свойствам и строению является типичным лектином (Ouchterlony О., 1980; Holmgren J., 1978). Вместе с тем токсигенные штаммы без токсин-корегулируемых пилей адгезии (TCP) не способны колонизировать слизистую кишечника и вызывать инфекционный процесс. Поэтому ген tcpA, контролирующий биосинтез TCP, признан наряду с ctx АВ ключевым генетическим фактором, определяющим эпидемический потенциал вибрионов (Tracksis М., 1998). Однако фенотипическому проявлению гена tcpA, изучению уровня адгезии штаммов и углеводной специфичности их лектиновых рецепторов, а также участию углеводных рецепторов мембраны-мишени в различных процессах взаимодействия не уделяется должного внимания. Вместе с тем известно, что филаментозные придатки бактерий фимбрии или пили (Brinton С., 1959) представляют собой надмолекулярные сложноорганизованные структуры, являющиеся поливалентным лектином. Поливалентность лектина достигается за счет их углеводсвязывающих доменов.

Таким образом, понимание молекулярных основ адгезии холерных вибрионов, которая имеет место в различных межклеточных взаимодействиях, требует знаний о поверхностных структурах патогена, ответственных за этот процесс. Однако бактериальные клетки имеют на своей поверхности целый спектр рецепторов, узнающих углеводы и определяющих специфичность межклеточных взаимодействий. Спектр этих рецепторов различается у разных видов бактерий и является определяющим в проявлениях патогенности и в механизмах адаптации к условиям окружающей среды. Поэтому изучение углеводной специфичности лектиновых рецепторов микроорганизмов является чрезвычайно важным для разработки подходов к дифференциальной диагностике и познания механизмов патогенности и персистенции.

Цель работы: определение спектра углеводной специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп.

Задачи исследования:

1. Для изучения углеводной специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов оценить возможность использования эритроцитов четырех групп крови человека и эритроцитов животных in vitro.

2. Оптимизировать методические подходы in vitro для определения адгезивной и агглютинирующей способности токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов на эритроцитах четырех групп крови человека, нативных и формалинизированных эритроцитах барана и кролика.

3. Выяснить возможность использования эритроцитов человека для постановки пробы Грейга.

4. Отработать в условиях in vitro методы ингибирования сахарами процессов адгезии и гемагглютинации.

5. Определить спектр углеводов, специфически связывающихся с лектиновы-ми рецепторами, локализованными на поверхности токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов.

6. Оценить роль лектиновых рецепторов в адгезивной и гемагглютинирующей активности холерных вибрионов.

7. Отработать условия для изучения специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов, участвующих в образовании биопленки in vitro.

8. Провести сравнительный анализ специфичности лектиновых рецепторов, участвующих в образовании биопленок холерными вибрионами в эксперименте, в сравнении с механизмами адгезии холерных вибрионов in vitro.

Научная новизна. Впервые адгезивная и гемагглютинирующая способности холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп были изучены на широком спектре нативных и формалинизированных эритроцитов млекопитающих in vitro.

Впервые установлено, что адгезивная активность холерных вибрионов коррелирует с гемагглютинирующей активностью на эритроцитах II группы крови человека.

Впервые предложен экспресс-тест для оценки эпидемической значимости холерных вибрионов in vitro на основании комплекса показателей: адгезии, гемагглютинации и гемолиза на эритроцитах II группы крови человека.

Впервые показана возможность использования эритроцитов II группы крови человека для постановки пробы Грейга.

Впервые выявлены внутривидовые различия между возбудителями холеры 01 и 0139 серогрупп по углеводной специфичности лектиновых рецепторов.

Впервые показан доминирующий спектр углеводной специфичности рецепторов адгезии холерных вибрионов и установлены отличия токсигенных (негемолитических) штаммов от атоксигенных (гемолитических) по специфичности лектиновых рецепторов.

Впервые изучены лектиновые рецепторы, участвующие в адгезии и гемагглютинации, и показана гетерогенность популяции гемолитических холерных вибрионов эльтор, имеющих ген tcpA.

Впервые предложен способ фенотипической дифференциации гемолитических вибрионов эльтор, имеющих ген tcpA, с помощью выявления специфичности некоторых лектиновых рецепторов.

Впервые отработаны условия для изучения углеводной специфичности лектиновых рецепторов, необходимых для образования биопленок холерными вибрионами эльтор in vitro.

Впервые проведен сравнительный анализ специфичности лектиновых рецепторов, участвующих в механизмах адгезии и в формировании биопленки в эксперименте.

Теоретическая значимость. Изучение углеводной специфичности лектиновых рецепторов на эритроцитах человека является удобной моделью для исследования рецепторов клеточной мембраны не только холерных вибрионов, но и других микроорганизмов.

Знание углеводной специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов на поверхности цитомембраны полезно для выяснения участия последних в различных физиологических и патофизиологических процессах, а также разработки новых подходов к дифференциальной диагностике.

Изучение ингибирующего действия углеводов на адгезию и агглютинацию эритроцитов холерными вибрионами in vitro, дает возможность определить наличие или отсутствие лектиновых рецепторов, участвующих в адгезии, что перспективно для изучения патогенеза холеры, а ингибирование способности вибрионов к пленкообразованию на поверхности жидких питательных сред важно для понимания механизмов выживания вибрионов в окружающей среде.

Характеристика спектра углеводной специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов расширила наши представления о биологии и фенотипе возбудителя холеры и может быть использована для дальнейшего углубленного изучения роли лектинов в патогенезе холеры и способности возбудителя образовывать микробиологические сообщества в условиях окружающей среды.

Данные по адгезивности и лектиновому составу токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов, имеющих и не имеющих ген tcpA, 01 и 0139 серогрупп могут быть использованы для дальнейшего научного исследования, и в результате привести к совершенствованию подходов диагностики и лечения холеры.

Практическая значимость. Данные оценки адгезивной активности холерных вибрионов in vitro по среднему показателю адгезии на стекле и гемагглютиниру-ющей активности позволили предложить новый тест для дифференциации токсигенных (негемолитических) и атоксигенных (гемолитических) штаммов холерных вибрионов.

Отличия лектинового состава вибрионов классического биовара от вибрионов эльтор и «Бенгал», а также токсигенных штаммов от атоксигенных, имеющих и не имеющих ген tcpA, дает возможность на основании экспресс-метода определения фенотипических свойств возбудителя установить принадлежность выделенной культуры не только к биовару и серологической группе, но и ориентировочно прогнозировать эпидемическую значимость выделяемых культур.

Предложена модификация пробы Грейга с возможностью ее использования для постановки теста с эритроцитами II группы крови человека, взамен эритроцитов барана.

Получен патент «Способ определения ингибирующей способности Сахаров на адгезию холерных вибрионов» (№ 2288274 РФ от 27.11.06)

Получен патент на изобретение «Способ выявления эпидемически значимых холерных вибрионов Vibrio eltor и Vibrio cholerae 0139 по их адгезивной способности» (№2332460 РФ от 27.08.08).

Разработаны Методические рекомендации по постановке экспресс-теста для определения эпидемической значимости штаммов холерных вибрионов на основании комплекса показателей: адгезии, гемолиза, гемагглютинации на эритроцитах II группы крови человека in vitro и Методические рекомендации по фенотипической идентификации гемолитических штаммов, имеющих ген tcpA, с помощью выявления специфичности лектиновых рецепторов.

Предложенный экспресс-тест для определения эпидемической значимости выделяемых штаммов холерных вибрионов внедрен в практику в ФГУЗ Иркутском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока Рослотребнадзора и ФГУЗ Северо-Кавказской противочумной станции Роспотребнадзора. Этот метод также используется в лаборатории микробиологии холерных вибрионов ФГУЗ Ростовского противочумного института - головного по проблеме холеры в стране, ведущего постоянный мониторинг за свойствами свежевыделенных штаммов холерных вибрионов.

Метод фенотипической идентификации гемолитических штаммов, имеющих ген tcpA, с помощью выявления специфичности лектиновых рецепторов внедрен в практику в ФГУЗ Северо-Кавказской противочумной станции Роспотребнадзора и используется в лаборатории микробиологии холерных вибрионов ФГУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора при мониторинге свежевыделенных культур.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Эритроциты II группы крови человека могут быть использованы в качестве модели для определения эпидемической значимости штаммов холерных вибрионов в тесте адгезии, гемагглютинации и применены в пробе Грейга, взамен эритроцитов барана.

2. Токсигенные Vibrio cholerae eltor и V. cholerae 0139 имеют рецепторы, специфичные гексозам (глюкозе, маннозе, сахарозе, галактозе и лактозе).

3. Гемолитические атоксигенные штаммы V. cholerae eltor и V. cholerae 0139, наряду с рецепторами, специфичными гексозам (глюкозе, маннозе, сахарозе, галактозе и лактозе), обладают лектинами, специфичными аминосахарам (Д-глюкозамину, Д-галактозамину, N-ацетил-Д-галактозамину, N-ацетил-Д-манноза-мину), которые полностью отсутствуют у токсигенных штаммов.

4. Vibrio cholerae eltor, Vibrio cholerae 0139 не имеют рецептора, специфичного арабинозе. Холерные вибрионы классического биовара отличаются наличием рецептора арабинозы, наряду с гексозами, при отсутствии аминосахаров.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на проблемных комиссиях Научного совета по Санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008 гг.); научной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН И.Н. Блохиной «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний» (Нижний Новгород, 2005 г.); VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006 г.); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007 г.).

Диссертация выполнена в рамках трех научных тем ФГУЗ РостНИПЧИ Роспотребнадзора: «Основы гемолитической активности холерных вибрионов» (№ гос. регистрации 01.20.03 115443); «Пектиновые рецепторы холерных вибрионов» (№ гос. регистрации 0120.0 507858); «Липазная и адгезивная активность холерных вибрионов не 01 серогруппы» (№ гос. регистрации 01.2.007 07281).

Публикации результатов исследований. По теме диссертационного исследования опубликовано 14 научных работ, в том числе 2 из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени, получено 2 патента на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 148 страницах, содержит введение, обзор литературы, три главы собственных исследований, заключение и выводы, иллюстрирована 26 таблицами и 10 рисунками. Библиография представлена 131 отечественными и 57 зарубежными источниками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

В работе использовано 236 штаммов токсигенных (негемолитических) и аток-сигенных (гемолитических) холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп, предоставленных музеем живых культур ФГУЗ Ростовского НИПЧИ Роспотребнадзора.

Для изучения адгезивного потенциала холерных вибрионов нами был модифицирован метод В.И. Брилиса (1986). На предметное стекло наносили по капле: 1 миллиардной взвеси V. cholerae, затем 8% эритроциты I, II, III, IV групп крови человека, барана, кролика, а также формалинизированные эритроциты барана. Инкубировали 20 минут, фиксировали и окрашивали. Адгезивные свойства оценивали с помощью среднего показателя адгезии (СПА), подсчет которого производили под световым микроскопом.

Для изучения способности холерных вибрионов к гемагглютинации эритроцитов в U-образные планшеты вносили 50 мкл взвеси вибрионов и 50 мкл 2,5% эритроцитов. Образование «зонтика» на дне лунки оценивали как положительный результат, «пуговки» - отрицательный. Для ингибирования реакции гемагглютинации в U-образные планшеты вносили 25 мкл взвеси вибрионов и 25 мкл 1% раствора исследуемого углевода. Образование «зонтика» на дне лунки свидетельствовало об отрицательной реакции - ингибирования не произошло и, следовательно, данный рецептор отсутствует; «пуговки» - реакция положительная, указывающая на то, что конкретный углеводный (лектиновый) рецептор участвует в гемагглютинации исследуемой культуры.

Для изучения образования пленок холерными вибрионами на жидких питательных средах и рецепторов, участвующих в этом процессе, культуру вибрионов засевали в 1% пептонную воду. Учет производили визуально по наличию пленки на поверхности среды. Перед окрашиванием кристалл-фиолетовым культуру удаляли и через 45 минут экспозиции учитывали наличие и размер окрашенного кольца. Участие лектиновых рецепторов, узнающих определенные углеводы, в образовании пленки изучали при помощи культивирования холерных вибрионов в 1% пептонной воде, содержащей 1% углевода. Наличие осадка в данном случае свидетельствовало о том, что ингибирование исследуемым углеводом произошло и, следовательно, данный рецептор участвует в образовании пленки холерными вибрионами.

Гемолитическую активность определяли в модифицированной нами пробе Грейга, где вместо эритроцитов барана использовали эритроциты I, II, III, IV групп крови человека.

Статистическую обработку проводили по общепринятым формулам на ПК Pentium IV в программе Exel 8.0.

Результаты исследований и их обсуждение

Сравнительный анализ адгезивной активностихолерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп на эритроцитах человека и живитных

Используя способность микроорганизмов «прилипать» к эукариотическим клеткам, В.И. Брилис (1986) на ряде энтеропатогенных бактерий разработал метод изучения адгезии in vitro на эритроцитах млекопитающих, имеющих на своей поверхности гликофорин - вещество, идентичное гликокаликсу эпителиальных клеток кишечника, на которых расположены рецепторы микробных адгезинов. Ранее при сравнении адгезивности холерных вибрионов на кишечнике (изолированная петля, тканевые диски, изолированные микроворсинки эпителиоцитов) со способностью вибрионов «прилипать» к эритроцитам (животных и человека) выявлено сходство показателей (Саппо С.Г., 1984).

В таблице 1 приведены сводные данные изучения адгезивности токсигенных (негемолитических) и атоксигенных (гемолитических) холерных вибрионов эль-тор, «Бенгал» и вибрионов классического биовара. На эритроцитах человека средний показатель адгезии (СПА) атоксигенных штаммов характеризовался низкими значениями от 0,6 до 0,8. На эритроцитах животных средний показатель адгезии был более высоким - от 1,7 до 2,4. Показатель адгезии токсигенных

штаммов значительно отличался от СПА гемолитических штаммов и на эритроцитах человека варьировал от 1,1 до 5,0. Следует отметить, что на эритроцитах II группы крови показатель адгезии носил четкий дифференциальный характер: штаммы с характеристикой ctx+tcp+Hly" были высокоадгезивными и имели средний показатель адгезии СПА>1,5, культуры ctx'tcp'Hly+ - низкоадгезивны, СПА<1,5. Вибрионы «Бенгал», как и эльтор вибрионы, на эритроцитах II группы крови имели СПА >1,5 у ctx'tcp'Hly штаммов и СПА<1,5 у ctx'tcp'Hly+ штаммов.

Таблица 1 - Средние показатели адгезии V. с1ю1егае еИог и V. с!го1егае 0139 __на модели эритроцитов человека и животных_

Био-вар серо-группа Объект выделения Кол-во штаммов Характеристика СПА средний*

Адгезия к эритроцитам

mn крови человека Животных

I II III IV ФЭБ НЭБ ЭК

Vibrio cholerae eltor Человек 28 ctx tcp' Н1у+ 0,6 0,6 0,7 0,8 2,4 1,7 2,2

Объекты окр.среды 30 0,9 0,5 0,9 0,7 1,9 2,2 2,5

Человек 29 ctx+ tcp+ Hly 2,6 5,0 3,8 1,1 3,2 1,6 2,5

Объекты окр. среды 31 2,5 4,0 2,7 1,0 1,8 1,2 1,8

Больные 2 ctx" tcp+ Hly+ 2,1 3,0 1,9 2,0 1,8 1,9 1,7

Вибрио-носители 30 2,8 3,3 2,1 2,4 1,4 2,0 1,6

Объекты окр. среды 10 0,8 0,7 1,1 1,0 0,8 1,1 1,7

Оч «1 О си S о ■5 •Э с -о щ Человек 28 ctx+ tcp+ Hly" 3,1 2,9 3,0 2,6 0,4 3,4 2,3

Объекты окр.среды 29 ctx" tcp" Hly+ 1,7 1,2 1,8 1,6 0,7 1,7 3,0

1 § о •§ tu 2 -Si о -с SJ неизвестно 20 ctx+ Hly 1,7 2,2 1,8 1,9 1,8 1,6 1,8

Примечания: *р<0,01; ФЭБ - формалинизированные эритроциты барана; НЭБ -нативные эритроциты барана; ЭК - эритроциты кролика.

Интересными и недостаточно изученными являются гемолитические штаммы вибрионов эльтор, выделяемые в последние годы от больных и вибрионосителей, а также из объектов окружающей среды, которые в своей генетической характеристи-

ке при отсутствии гена холерного токсина ctxAB имеют ген токсин-коррегулируе-мых пилей адгезии tcpA. В процессе исследования способности к адгезии мы разделили их на две группы: ctx-tcp+Hly+, выделенные от человека, с симптомами ОКИ, которые имели СПА>1,5, как и токсигенные; штаммы, выделенные из объектов окружающей среды (ctx-tcp+Hly+), на эритроцитах человека имели СПА<1,5. Следует отметить, что на эритроцитах II группы крови показатель адгезии носил четкий дифференциальный характер, по сравнению с эритроцитами других групп крови человека и эритроцитов животных.

Значения СПА вибрионов классического биовара варьировали от 1,6 до 2,2. В этой связи необходимо обратить внимание на то, что в случае с V. cholerae cholerae, которые всегда имеют ген ctx, диагностическая значимость эритроцитов II группы крови снижается, а низкая биологическая активность классических холерных вибрионов вполне понятна, так как исследуемые штаммы классических холерных вибрионов были выделены в 30-х годах прошлого века.

Тестовые системы на основе эритроцитов применялись ранее в исследованиях с холерными вибрионами. В частности J. Jones (1973, 1974), а впоследствии Г.В. Королева с соавт. (1992) установили, что адгезивная активность возбудителя холеры коррелирует с его способностью агглютинировать эритроциты человека и некоторых видов животных. В исследованиях Н.И. Смирновой (1999) показано несоответствие адгезивной и агглютинирующей активности на эритроцитах кролика. По нашему мнению, подобные расхождения в результатах связаны с тем, что исследователи не принимали во внимание различную зависимость уровня адгезии от природы эритроцитов и характеристики штаммов холерных вибрионов. В связи с этим нами проведен сравнительный анализ среднего показателя адгезии и способности к агглютинации на 236 штаммах и эритроцитах 6 видов. Нами показано, что на эритроцитах II группы крови человека положительная реакция гемагглютинации соответствует высокой адгезивной активности (средний показатель адгезии - СПА > 1,5), включая атоксигенные высокоадгезивные tcp культуры, выделенные от человека; атоксигенные (гемолитические) неадгезивные штаммы, имеющие СПА<1,5, не агглютинируют эритроциты II группы крови человека.

Таким образом, на эритроцитах II группы человека положительная реакция агглютинации совпадает с высокой адгезивной активностью токсигенных штаммов, а отсутствие гемагглютинации - с низкой способностью к адгезии, что может быть использовано для дифференциации эпидемических и неэпидемических штаммов холерных вибрионов, аналогично использованию среднего показателя адгезии in vitro по методу В.И. Брилис в нашей модификации. Исходя из этого, нами был предложен экспресс-метод определения эпидемической значимости холерных вибрионов на основании комплекса показателей: адгезии, гемагглютинации и гемолиза в мазке на эритроцитах II группы крови человека. Следует отметить, что оценка эпидемической значимости, предложенная в нашем методе, не ограничивалась только параметром адгезии. У гемолитических штаммов при СПА<1,5 и положительной реакции гемагглютинации наблюдался гемолиз в мазке, что проявлялось в виде разрушенных или увеличенных в размере эритроцитов (Рис. 1), в отличие токсигенных культур (Рис 2). Штаммы с характеристикой ctx'tcp*Hly*, выделенные от человека, с симптомами ОКИ, как правило, обладают СПА>1,5, что подтверждает-

ся положительной реакцией гемагглютинации, но при этом в мазке наблюдается гемолиз, что дает основание свидетельствовать, что штамм является гемолитическим и эпидемически не опасным. Штаммы, выделенные из объектов окружающей среды на эритроцитах II группы крови имеют СПА<1,5 и также вызывают гемолиз эритроцитов.

(

Рисунок 1. Адгезия V. cholerae eltor ctx- tcp- Hly+ к эритроцитам II группы крови человека.

На рисунке 3 показана высокая адгезия и, вместе с тем, наличие гемолиза эритроцитов II группы крови человека, что отличает данную группу штаммов от токсигенных (негемолитических) и атоксигенных (гемолитических), не имеющих гена токсин-коррегулируемых пилей адгезии tcp А.

, и

, о , ( . •О

О . í-> С г, ..

<) /

V-

Рисунок 3. Адгезия V. cholerae eltor ctx- tcp+Hly+, выделенных от человека, к эритроцитам II группы крови человека.

Таким образом, метод позволяет одновременно оценить три показателя: адгезию, гемагглютинацию и гемолиз, и выдать результат в течение 3 часов с момента выделения культуры, а предложенный нами подход может расширить арсенал простых и доступных методик ориентировочной оценки эпидемической значимости штаммов холерных вибрионов эльтор и «Бенгал».

Важным показателем, который мы наблюдали у гемолитических атоксигенных штаммов - это гемолиз эритроцитов при просмотре мазка, что не наблюдалось у токсигенных штаммов. Этот факт лег в основу предположения о возможности использования эритроцитов II группы крови человека, взамен эритроцитам барана для постановки пробы Грейга, в случае, если последние недоступны.

Рисунок 2. Адгезия V. cholerae eltor ctx+ tcp+ Hly- к эритроцитам II группы крови человека.

Специфичность лектиновых рецепторов холерных вибрионов разных биоваров и серологических групп

На сродство лектинов к углеводам обратили внимание исследователи (W. Boyd, 1949; М. Krupe, 1956), которые обнаружили, что моносахариды подавляют гемаг-глютинирующую активность лектинов. При этом углеводы блокируют специфические активные центры лектина, участвующие в гемагглютинации частиц.

Из таблицы 2 видно, что ингибирующей способностью на реакцию гемагглютинации V. cholerae eltor и V. cholerae 0139 с характеристикой ctx+tcp+Hly" обладали глюкоза, манноза, галактоза, сахароза, лактоза и Д-глюкозамин. К доминирующим лектинам у токсигенных штаммов эльтор относятся глюкозо-, маннозо-, сахарозо- и лактозоспецифичные рецепторы, так как рецепторы, специфичные данным гексозам, выявлены у 100% исследуемых штаммов. Не обнаружено рецепторов, специфичных арабинозе и изученным аминосахарам: Д-галактозамину, N-ацетил-Д- галактозамину, N-ацетил-Д-маннозамину.

Таблица 2 - Специфичность лектиновых рецепторов холерных вибрионов

Vibrio Vibrio Vibrio cholerae 0139 Vibrio Vibrio

Серогруппа cholerae choler- Vibrio cholerae eltor choler- cholerae

cholerae ae eltor ae eltor 0139

Характеристика ctx+ Hly- ctx" tcp Hly+ ctx" tcp fHIy+ ctx+ tcp" Hly

Неадгезивные Адгезивные

Глюкоза 50% 34% 58% 67% 30% 100% 100%

Манноза 50% 37% 78% 50% 30% 100% 100%

Галактоза 50% 34% 56% 67% 50% 35% 35%

Сахароза 100% 67% 67% 67% 100 100% 100%

Лактоза 100% 67% 67% 67% 100 100% 100%

Арабиноза 100% 0 0 0 0 0 0

Д-глюкозамин 0 100% 100% 30% 30% 30% 70%

Д-гапактозамин 0 100% 100% 86% 0 0 0

N-ацетил-Д-галактозамин 0 100% 100% 0 100% 0 0

N-ацетил-Д-манозамин 0 50% 100% 0 0 0 60%

Примечания: в процентах указано количество штаммов, агглютинация которых ингибируется конкретным углеводом.

Вибрионы 0139 серовара, наряду с доминирующими глюкозо- и маннозо- специфичными рецепторами, отличались наличием активного рецептора, специфичного Ы-ацетил-Д-маннозамину. В отличие от токсигенных штаммов, у холерных вибрионов с характеристикой Ох^ср'Шу* лектиновые рецепторы, специфичные глюкозе, маннозе, галактозе, сахарозе и лактозе, определяются у малого процента штаммов. Следует отметить, что реакция гемагглютинации гемолитических штаммов V. сИокгае еИог, в отличие от с0с+ Юр* Н1у\ активно ингибировалась всеми использованными в работе аминосахарами: Д-галактозамином, Д-глюкозамином, ]Ч-ацетил-Д-галактозамином, Ы-ацетил-Д-маннозамииом. Общим характерным признаком для изученных групп штаммов явилось отсутствие рецептора, специфичного арабинозе.

V. скокгае еНог с характеристикой с1х1ср*Н1у' выделяются из окружающей среды крайне редко. За последние 10 лет таких культур, выделенных из водоемов и хранящихся в музее живых культур ФГУЗ РостНИПЧИ Роспотребнадзора, насчитывалось всего 10. Штаммы, выделенные от человека так же чрезвычайно редки, однако вспышка в Каменск-Шахтинске Ростовской области в 2005 году, где было зарегистрировано 30 вибрионосителей и 2 больных, вызванная атоксигенными холерными вибрионами, имеющими ген 1:срА, позволила создать коллекцию таких культур в нашем институте. Подавляющей активностью в отношении высокоадгезивных (выделенных от человека) штаммов V. с!го1егае еког сйс" 1ср+Н1у+ обладали все изученные нами углеводы, за исключением Д-галактозамина и И-ацетил-Д-ман-нозамина. Доминирующими у адгезивных вариантов являются сахарозо- и лактозоспецифичные лектиновые рецепторы, что роднит их с с/х+ ¡ср*Н1у штаммами. Штаммы, выделенные из объектов окружающей среды и определенные нами как низкоадгезивные, отличаются наличием активного рецептора, узнающего >1-ацетил-Д-галактозамин, что может быть использовано для фенотипической дифференциации данных вариантов у эльтор вибрионов. Особенностью пектинового состава классических холерных вибрионов является наличие рецептора, специфичного арабинозе, который отсутствует у вибрионов эльтор и 0139 серогрупп и может быть использован как фенотипический дифференциальный признак. На основании определения специфичности некоторых лектиновых рецепторов холерных вибрионов, нами предложен метод фенотипической идентификации гемолитических холерных вибрионов эльтор, имеющих и не имеющих 1:срА ген (с1х~1ср' Я(у+). Схема исследования показана на рисунке 4.

Рисунок 4. Схема исследования метода фенотипической идентификации гемолитических холерных вибрионов эльтор, имеющих и не имеющих 1срА ген (ейПср+Н1у+), на основании определения углеводной специфичности лектиновых рецепторов.

Как показано нами ранее для дифференциации данных групп штаммов с исследуемой культурой необходимо поставить реакцию гемагглютинации и ингибировать ее Д-галактозамином и N-ацетил-Д-галактозамином. Закономерность установлена на 57 штаммах холерных вибрионов эльтор, в том числе на свежевыде-ленных в период вспышки в Каменск-Шахтинске Ростовской области (2005 г.).

Таким образом, очевидно, что для всех холерных вибрионов независимо от биовара и токсигенности характерно наличие рецепторов, узнающих глюкозу, маннозу, галактозу, сахарозу, лактозу. У гемолитических штаммов преобладают рецепторы, узнающие аминосахара, что важно для адаптации атоксигенных штаммов к различным условиям обитания. С появлением гена tcp утрачиваются рецепторы, узнающие аминосахара, а способность к адгезии у атоксигенных гемолитических штаммов, имеющих ген tcpA обусловлена наличием лектинов, узнающих сахарозу, лактозу и N-ацетил-Д-галатозамин. Отличительной особенностью атоксигенных высокоадгезивных штаммов, несущих ген tcp, является наличие N-ацетил-Д-галактозамин специфичного рецептора. V. cholerae cholerae имеют рецептор, специфичный арабинозе, который отсутствует у эльтор и «Бен-гал» вибрионов.

Некоторые механизмы образования биопленки холерными вибрионами in vitro

Моделью изучения адгезии in vitro к клеткам эукариотического происхождения являются эритроциты млекопитающих. Углеводная специфичность белков поверхностных структур, участвующих в «прикреплении» холерных вибрионов к клеткам эукариот, определена нами ранее с помощью подхода блокирования углеводами процесса адгезии и гемагглютинации эритроцитов. Использование подхода изучения влияния углеводов на образование пленки в жидких питательных средах может дать информацию об участии определенных лектинов в образовании биопленки. Исходя из этого, следующим этапом исследования явилось определение способности холерных вибрионов к образованию пленки на поверхности 1% пептонной воды и определение углеводной специфичности рецепторов холерных вибрионов 01 серогруппы, участвующих в образовании пленки.

В ходе исследования нами показано, что все изученные штаммы эльтор образуют пленку на поверхности жидкой питательной среды. Пленка, образуемая гемолитическими штаммами, более толстая, чем у токсигенных культур. У штаммов классических холерных вибрионов образование биопленки без окрашивания кристалл-фиолетовым не наблюдалось, а при окрашивании тонкую пленку можно было наблюдать лишь у нескольких штаммов (таблица 3).

Нами выявлены два вида пленок, образуемых холерными вибрионами эльтор на поверхности 1% пептонной воды при окраске кристалл-фиолетовым - на поверхности питательной среды и на поверхности стекла пробирки, которая также окрашивается в фиолетовый цвет, что свидетельствует об образовании экзополи-сахарида и пленки в анаэробных условиях.

Следует отметить, что при окрашивании кристалл-фиолетовым культур с характеристикой ctx'tcp'Hly* кольцо было двойным, шириной не менее 3 мм, а ширина кольца, образуемого токсигенными штаммами (ctx+tcp+Hly), не превышало 1 мм.

Таблица 3 - Способность холерных вибрионов эльтор к образованию пленки

Характеристика штаммов Наличие пленки на поверхности жидкой питательной среды Наличие окрашенной пленки Примечания

ctx" tcp"Hly+ + + Двойное кольцо при окрашивании, толщиной 3 мм

ctx"tcp+ Н1у+ + +

ctx+tcp+ Hly- + + Тонкое кольцо до 1мм

Таким образом, холерные вибрионы могут образовывать пленку на поверхности раздела фаз жидкость-воздух и жидкость-твердый субстрат; характер образования пленки различается у токсигенных и атоксигенных штаммов; способность холерных вибрионов к пленкообразованию на поверхности жидких питательных сред, можно использовать в качестве модели для изучения механизмов образования биопленок и структур, в них участвующих.

ВЫВОДЫ

1. На основании оценки комплекса показателей: адгезии, гемагтлютинации и гемолиза эритроцитов II группы крови человека разработан экспресс-тест для дифференциации токсигенных (негемолитических) и атоксигенных (гемолитических) холерных вибрионов. Токсигенные штаммы при использовании эритроцитов II группы крови высокоадгезивны, гемагглютинируют, но не лизиру-ют эритроциты данной группы крови.

2. Культуры холерных вибрионов эльтор с характеристикой ctx' tcp 'Hly* гетеро-генны по адгезивным свойствам и могут быть как высокоадгезивными, так и низкоадгезивными, но всегда отличаются наличием гемолиза в мазке при использовании эритроцитов II группы крови.

3. Эритроциты II группы крови человека, наряду с эритроцитами барана, могут быть использованы для постановки пробы Грейга.

4. Все холерные вибрионов эльтор и «Бенгал» (токсигенные и атоксигенные) обладают лектиновыми рецепторами, специфичными гексозам - глюкозе, манно-зе, сахарозе и лактозе.

5. Гемолитические атоксигенные штаммы Vibrio cholerae eltor, Vibrio cholerae 0139, наряду с рецепторами гексоз, обладают лектинами, специфичными аминоса-харам: Д-глюкозамину, Д-галактозамину, N-ацетил-Д-галактозамину, N-ацетил-Д-маннозамину, которые полностью отсутствуют у токсигенных штаммов.

6. Холерные вибрионы классического биовара имеют рецепторы, специфичные гексозам - глюкозе, маннозе, сахарозе и лактозе, как у токсигенных вариантов эльтор и «Бенгал», и отличаются от них наличием рецептора, специфичного арабинозе.

7. Лектиновые рецепторы холерных вибрионов эльтор, участвующие в образовании биопленок на жидких питательных средах, специфичны как гексозам

(глюкозе, сахарозе, маннозе, галактозе), так и аминосахарам (N-ацетил-Д-глюко-замину, N-ацетил-Д-маннозамину).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Колякина, A.B. Сравнение адгезивности токсигенных и атоксигенных штаммов V. cholerae eltor / A.B. Колякина, Н.Р. Телесманич // Обмен веществ при адаптации и повреждении: Труды IV Межвуз. междунар. конф. - Ростов н/Д,

2005.-С. 100-101.

2. Ломов, Ю.М. Новые технологии в системе эпиднадзора за холерой / Ю.М. Ломов, Н.Р. Телесманич, Л.С. Подосинникова , В.В. Агафонова, A.B. Колякина // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участником Содружества Независимых Государств: Мат. VII Межгосуд. научно-практ. конф. государств-участников СНГ. - Оболенск, 2006. - С. 43-44.

3. Колякина, A.B. Характеристика биологических свойств Vibrio cholerae eltor с генотипом ctx' tcp+ / A.B. Колякина, B.B. Агафонова, E.M. Курбатова // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: Мат. VII Межгосуд. научно-практ. конфер. государств-участников СНГ. - Оболенск, 2006. - С. 107-108.

4. Колякина, A.B. Адгезивная активность V. cholerae eltor, V. cholerae 0139 на модели эритроцитов млекопитающих во взаимосвязи с их эпидемической значимостью / A.B. Колякина, Н.Р. Телесманич // Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний: Мат. науч. конф., посвящ. 85-летию со дня рожд. акад. РАМН И.Н. Блохиной. - Н. Новгород,

2006. - С.73-74.

5. Телесманич, Н.Р. Некоторые фенотипические свойства ctx" tcp+ штаммов V. cholerae eltor / Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов, A.B. Колякина, В.В. Агафонова // Холера и патогенные для человека вибрионы: Пробл. комиссия 50.04 Научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Ростов н/Д, 2006. - Вып. 19. - С. 48-51.

6. Патент № 2288274 РФ Способ определения степени ингибирующей способности Сахаров на процесс адгезии холерных вибрионов / Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов, A.B. Колякина, И.Д. Бардых - Приоритет от 04.04.2005; Опубл. 27.11.2006.-Бюл.№ 33.

7. Патент № 2332460 РФ Способ выявления эпидемически значимых холерных вибрионов Vibrio eltor и Vibrio cholerae 0139 по их адгезивной способности / Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов, A.B. Колякина - Приоритет от 26.12.2006; Опубл. 27.08.2008.-Бюл.№ 24.

8. Ломов, Ю.М. Перспективы использования новых диагностических методов в системе эпидемиологического мониторинга за холерой / Ю.М. Ломов, Н.Р. Телесманич, Л.С. Подосинникова , A.B. Колякина и др. // Мат. IX съезда Всерос. научно-практ. общества эпидемиол., микробиол. и паразитол.: В 3-х томах. -Москва, 2007. - Т. 3 - С.42-44.

9. Телесманич, Н.Р. Адгезивная активность Vibrio cholerae eltor и Vibrio cholerae 0139 на модели эритроцитов млекопитающих как экспресс-метод ориентировочной оценки эпидемической опасности выделяемых культур / Н.Р. Телесманич, A.B. Колякина, Ю.М. Ломов, Е.А. Меньшикова и др. // Холера и патогенные для человека вибрионы: Пробл. комиссия 50.04 Научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Ростов н/Д, 2007. - Вып. 20. - С. 55-59.

10. Ломов, Ю.М. Специфичность лектиновых рецепторов холерных вибрионов / Ю.М. Ломов, Н.Р. Телесманич, A.B. Колякина // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2007. - № 6. - С. 68-72.

11. Колякина, A.B. Сравнительное изучение углеводной специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов при образовании биопленки на поверхности жидких питательных сред / A.B. Колякина, Е.М. Курбатова, Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов // Холера и патогенные для человека вибрионы: Мат. совещания и проблемной комиссии. - Ростов н/Д, 2008. - Вып. 21. - С. 67-72.

12. Колякина, A.B. Углеводная специфичность и спектр лектиновых рецепторов / A.B. Колякина, Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов // Холера и патогенные для человека вибрионы: Мат. совещания и проблемной комиссии. - Ростов н/Д, 2008. -Вып. 21.-С. 74-82.

13. Колякина, A.B. Изучение лектин-углеводных взаимодействий холерных вибрионов эльтор при образовании биопленок на поверхности раздела фаз жидкость-воздух / A.B. Колякина, Н.Р. Телесманич, Е.М. Курбатова // Обмен веществ при адаптации и повреждении (дни мед. лаб. диагн.): Мат. VII Межвуз. конфер. с международным участием. - Ростов н/Д, 2008. - С. 71-74.

14. Телесманич, Н.Р. Характеристика адгезивной активности холерных вибрионов на эритроцитах млекопитающих для выбора дополнительного ориентировочного теста их эпидемической значимости / Н.Р. Телесманич, A.B. Колякина, Ю.М. Ломов, Е.А. Меньшикова и др. // Клин. лаб. диагн. - 2008. - № 2. -С. 45-48.

Подписано в печать 27.04.09 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать цифровая. Объем 1,0 печ. д. Тираж 200. Заказ № 29/04. Отпечатано в типографии ООО «Диапазон». 344010, г. Ростов-на-Дону, ул. Красноармейская, 206. Лиц. ПЛД № 65-116 от 29.09.1997 г.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Колякина, Анастасия Владимировна

Введение.

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Адгезия холерных вибрионов.

1.1.1. Адгезины холерных вибрионов.

1.1.2. Факторы, влияющие на адгезивную активность холерных вибрионов.

1.1.3. Модели изучения адгезии in vivo и in vitro.

1.2. Лектины микроорганизмов.

1.2.1. Общие сведения о лектинах.

1.2.2. Распространение и биологическое значение лектинов.

1.2.3. Состав и структура лектиновых рецепторов.

1.2.4. Углеводная специфичность лектиновых рецепторов и методы их выявления.

1.2.5. Лектины холерных вибрионов.

1.2.6. Некоторые механизмы образования биопленки холерными вибрионами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы, используемые в работе.

2.2. Питательные среды.

2.3. Коммерческие препараты углеводов.

2.4. Эритроциты млекопитающих.

2.5. Методы.

2.5.1. Методы изучения лектиновых рецепторов холерных вибрионов.

2.5.1.1. Метод изучения адгезии холерных вибрионов на эритроцитах in vitro.

2.5.1.2. Метод изучения гемагглютинации холерных вибрионов с эритроцитами и ингибирование сахарами реакции гемагглютинации.

2.5.1.3. Метод изучения образования биопленок холерными вибрионами на жидких питательных средах и рецепторов, участвующих в этом процессе.

2.5.1.4. Метод определения гемолитической активности холерных вибрионов на эритроцитах человека.

2.6. Фотографирование микробиологических мазков.

2.7. Статистическая обработка результатов.

Глава 3 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АДГЕЗИВНОЙ

АКТИВНОСТИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ РАЗНЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ГРУПП НА ШИРОКОМ СПЕКТРЕ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

3.1. Адгезивный потенциал токсигенных (негемолитических) и атоксигенных (гемолитических) V. cholerae eltor на модели эритроцитов человека и животных (in vitro).

3.1.1. Характеристика адгезивных свойств токсигенных штаммов вибрионов эльтор (ctx^cp^ly") in vitro.

3.1.2. Характеристика адгезивности гемолитических штаммов эльтор (ctx'tcp'Hly4) in vitro.

3.1.3. Характеристика гемолитических вибрионов эльтор, имеющих ген токсинкоррегулируемых пилеи адгезии (ctx"tcp+Hly+) по адгезивным свойствам in vitro.

3.2. Характеристика токсигенных (негемолитических) и атоксигенных (гемолитических) вибрионов «Бенгал» на модели эритроцитов человека и животных.

3.3. Особенности адгезивного потенциала

V. cholerae cholerae in vitro.

3.4. Изучение возможности использования эритроцитов человека для постановки пробы Грейга.

3.5. Экспресс - метод определения эпидемической значимости холерных вибрионов на основании комплекса показателей: адгезии и гемолиза в мазке на эритроцитах II группы крови человека.

Глава 4 СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЛЕКТИНОЫХ РЕЦЕПТОРОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ РАЗНЫХ БИОВАРОВ И СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ГРУПП

4.1. Изучение способности холерных вибрионов к гемагглютинации эритроцитов человека и животных (I, II, III и IV групп крови человека, нативных и формалинизированных эритроцитов барана, эритроцитов кролика).

4.1.1. Особенности гемагглютинации эритроцитов человека и животных токсигенными (негемолитическими) и атоксигенными (гемолитическими) вибрионами эльтор.

4.1.2. Гемагглютинирующая активность V. ско1егае 0139.

4.1.3. Особенности реакции гемагглютинации вибрионов классического биовара.

4.2. Определение углеводной специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов различных биоваров и серологических групп.

4.2.1. Изучение спектра лектиновых рецепторов токсигенных негемолитических (с1х+1;ср+Н1у") и атоксигенных гемолитических (с1хЧср"Н1у+) V. ско1егае еког.

4.2.2. Особенности специфичности лектиновых рецепторов атоксигенных вибрионов эльтор, имеющих ген токсин-коррегулируемых пилеи адгезии 1:ср (с1хЧср+Н1у+).

4.2.3. Изучение углеводной специфичности лектиновых рецепторов токсигенных и атоксигенных

V. Мегае 0139.

4.2.4. Спектр лектиновых рецепторов вибрионов классического биовара.

4.2.5. Возможности фенотипической идентификация гемолитических холерных вибрионов эльтор имеющих и не имеющих 1;срА ген на основании определения углеводной специфичности некоторых лектиновых рецепторов.

Глава 5 НЕКОТОРЫЕ МЕХАНИЗМЫ ОБРАЗОВАНИЯ БИОПЛЕНКИ ХОЛЕРНЫМИ ВИБРИОНАМИ IN VITRO.

5.1. Изучение закономерностей образования биопленок холерными вибрионами на поверхности жидких питательных сред.

5.2. Изучение спектра лектинов и соответствующих им углеводов, участвующих в образовании биопленки холерными вибрионами эльтор в сравнении с механизмами адгезии.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Лектиновые рецепторы холерных вибрионов"

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

В последнее время большое внимание уделяется изучению лектиновых свойств различных биологических объектов, из которых патогенные микроорганизмы представляют наибольшую актуальность.

Лектины - это протеины или гликопротеины, содержащие как минимум два или четыре активных центра, обладающих способностью связывать углеводы, не изменяя их структуры, которые обеспечивают возможность агглютинировать клетки и преципитировать гликоконъюгаты, взаимодействуя с углеводами, особенно с групповыми детерминантами крови (Boyd W., 1970). Однако микроорганизмы, обладая лектинами (адгезинами, агглютининами), могут участвовать и в таких взаимодействиях in vitro, как гемагглютинация, преципитация, цитотоксичность (Луцик М.Д., 1981; Лахтин В.М., 1994), гемолиз (Телесманич Н.Р., 2003). Можно предположить важную роль лектинов и лектиновых рецепторов в персистенции холерных вибрионов и вибрионо-сительстве, явлениях бактериоциногении, в прикреплении к зоо- и фитопланктону, в формировании биопленок.

Известно, что холерный токсин является типичным лектином, углево-дсвязывающая (лектиновая) активность которого сосредоточена в В субъединице (Yangulu N.K., 1996) и специфична ганглиозиду (GM1) (Ouchterlonie О., 1980).

Имеются сведения о том, что маннозочувствительный лектин Vibrio cholerae eltor и Vibrio cholerae 0139 способствует адгезии к зоопланктону, образуя на своей поверхности маннозочувствительные пили. Их синтез кодируется кластером генов msh. Экспрессия маннозочувствительного гемагглю-тинина и не выявленных факторов адгезии различается в зависимости от се-рогруппы и биотипа V cholerae (Chivelli D.A., 2001). Предполагается, что маннозочувствительный лектин V cholerae принимает участие в формировании биопленок, которые в последнее время привлекают внимание исследователей в связи с их возможной ролью в экологии холерных вибрионов - в сохранении вирулентных клонов в межэпидемический период, формировании новых патогенных клонов в результате передачи генетической информации.

Установлено, что атоксигенные гемолитические V cholerae eltor используют связанный с клеткой рецептор, специфичный N-ацетил-Д-глюкозамину гемагглютинин (лектин), как для формирования биологической пленки на поверхности раздела фаз жидкой питательной среды и воздуха, так и для специфической адгезии к клеткам макроорганизма. Следует отметить, что полимер N-ацетил-Д-глюкозамина — хитин, входящий в состав экзоскелета ракообразных и зоопланктона, является питательной средой, которую многие виды Vibrio используют как источник углерода и азота (Sasmal D., 2002).

В последнее время установлено, что ген hlyA, отвечающий за продукцию гемолизина, кодирует синтез рициноподобного галактозоспецифичного лек-тина, принимающего участие в лизисе эритроцитов барана, но не эритроцитов кролика, а также в гемагглютинирующей способности атоксигенных и токсигенных штаммов холерных вибрионов (Телесманич Н.Р., 2003).

Генетическим маркером эпидемической значимости штаммов холерных вибрионов являются гены ctx АВ, кодирующие продукцию холерного токсина - одного из основных факторов вирулентности, который по своим свойствам и строению является типичным лектином (Ouchterlony О., 1980; Holmgren J., 1978). Вместе с тем токсигенные штаммы без токсин-корегулируемых пилей адгезии (TCP) не способны колонизировать слизистую кишечника и вызывать инфекционный процесс. Поэтому ген tcpA, контролирующий биосинтез TCP, признан наряду с ctx АВ ключевым генетическим фактором, определяющим эпидемический потенциал вибрионов (Tracksis М., 1998). Однако фенотипическому проявлению гена tcpA, изучению уровня адгезии штаммов и углеводной специфичности их лектиновых рецепторов, а также участию углеводных рецепторов мембраны-мишени в различных процессах взаимодействия не уделяется должного внимания. Вместе с тем известно, что фила-ментозные придатки бактерий фимбрии или пили (Brinton С., 1959) представляют собой надмолекулярные сложноорганизованные структуры, являющиеся поливалентным лектином. Поливалентность лектина достигается за счет их углеводсвязывающих доменов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель: определение спектра углеводной специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп.

Задачи исследования:

3. Выяснить возможность использования эритроцитов человека для постановки пробы Грейга.

4. Отработать в условиях in vitro методы ингибирования сахарами процессов адгезии и гемагглютинации.

5. Определить спектр углеводов, специфически связывающихся с лекти-новыми рецепторами, локализованными на поверхности токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов.

6. Оценить роль лектиновых рецепторов в адгезивной и гемагглютини-рующей активности холерных вибрионов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые адгезивная и гемагглютинирующая способности холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп были изучены на широком спектре нативных и формалинизированных эритроцитов млекопитающих in vitro.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Изучение углеводной специфичности лектиновых рецепторов на эритроцитах человека является удобной моделью для исследования рецепторов клеточной мембраны не только холерных вибрионов, но и других микроорганизмов.

Данные по адгезивности и лектиновому составу токсигенных и атокси-генных холерных вибрионов, имеющих и не имеющих ген tcpA, OI и 0139 серогрупп могут быть использованы для дальнейшего научного исследования, и в результате привести к совершенствованию подходов диагностики и лечения холеры.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Данные оценки адгезивной активности холерных вибрионов in vitro по среднему показателю адгезии на стекле и гемагглютинирующей активности позволили предложить новый тест для дифференциации токсигенных (негемолитических) и атоксигенных (гемолитических) штаммов холерных вибрионов.

Получен патент «Способ определения ингибирующей способности Сахаров на адгезию холерных вибрионов» (№2288274 РФ от 27.11.06).

Предложенный экспресс-тест для определения эпидемической значимости выделяемых штаммов холерных вибрионов внедрен в практику в ФГУЗ Иркутском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока Роспот-ребнадзора и ФГУЗ Северо-Кавказской противочумной станции Роспотреб-надзора. Этот метод также используется в лаборатории микробиологии холерных вибрионов ФГУЗ Ростовского противочумного института — головного по проблеме холеры в стране, ведущего постоянный мониторинг за свойствами свежевыделенных штаммов холерных вибрионов.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Эритроциты II группы крови человека могут быть использованы в качестве модели для определения эпидемической значимости штаммов холерных вибрионов в тесте адгезии, гемагглютинации и применены в пробе Грей-га, взамен эритроцитов барана.

3. Гемолитические атоксигенные штаммы V. cholerae eltor и V. cholerae 0139, наряду с рецепторами, специфичными гексозам (глюкозе, маннозе, сахарозе, галактозе и лактозе), обладают лектинами, специфичными аминосахарам (Д-глюкозамину, Д-галактозамину, N-ацетил-Д-галактозамину, N-ацетил-Д-маннозамину), которые полностью отсутствуют у токсигенных штаммов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации были представлены на проблемных комиссиях Научного совета по Санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростовна-Дону, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008 гг.); научной конференции, посвященi ной 85-летию со дня рождения академика РАМН И.Н. Блохиной «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний» (Нижний Новгород, 2005 г.); VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006 г.); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007 г.).

Диссертация выполнена в рамках трех научных тем ФГУЗ РостНИПЧИ Роспотребнадзора: «Основы гемолитической активности холерных вибрионов» (№ гос. регистрации 01.20.03 115443); «Лектиновые рецепторы холерных вибрионов» (№ гос. регистрации 0120.0 507858); «Липазная и адгезивная активность холерных вибрионов не 01 серогруппы» (№ гос. регистрации 01.2.007 07281).

ПУБЛИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

По теме диссертационного исследования опубликовано 14 научных работ, в том числе 2 из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени, получено 2 патента на изобретение.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Колякина, Анастасия Владимировна

выводы

1. На основании оценки комплекса показателей: адгезии, гемагглюти-нации и гемолиза эритроцитов II группы крови человека разработан экспресс-тест для дифференциации токсигенных (негемолитических) и атокси-генных (гемолитических) холерных вибрионов. Токсигенные штаммы при использовании эритроцитов II группы крови высокоадгезивны, гемагглюти-нируют, но не лизируют эритроциты данной группы крови.

2. Культуры холерных вибрионов эльтор с характеристикой ctx" tcp+Hly+ гетерогенны по адгезивным свойствам и могут быть как высокоадгезивными, так и низкоадгезивными, но всегда отличаются наличием гемолиза в мазке при использовании эритроцитов II группы крови.

4. Все холерные вибрионов эльтор и «Бенгал» (токсигенные и атокси-генные) обладают лектиновыми рецепторами, специфичными гексозам -глюкозе, маннозе, сахарозе и лактозе.

5. Гемолитические атоксигенные штаммы Vibrio cholerae el tor, Vibrio cholerae 0139, наряду с рецепторами гексоз, обладают лектинами, специфичными аминосахарам: Д-глюкозамину, Д-галактозамину, N-ацетил-Д-галактозамину, N-ацетил-Д-маннозамину, которые полностью отсутствуют у токсигенных штаммов.

6. Холерные вибрионы классического биовара имеют рецепторы гексоз - глюкоза, манноза, сахароза и лактоза, как у токсигенных вариантов эльтор и «Бенгал», и отличаются от них наличием рецептора, специфичного арабинозе.

7. Лектиновые рецепторы холерных вибрионов эльтор, участвующие в образовании биопленок на жидких питательных средах, специфичны как гексозам (глюкозе, сахарозе, маннозе, галактозе), так и аминосахарам (N-ацетил-Д-глюкозамину, N-ацетил-Д-маннозамину).

Заключение

В образовании биопленки холерными вибрионами участвуют белок-углеводные взаимодействия между холерными вибрионами, а модель изучения пленки, образуемой на поверхности 1% пептонной воды можно использовать для изучения специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов, участвующих в этом процессе.

Нами показано, что гемолитические штаммы вибрионов эльтор образуют плотные пленки, на поверхности раздела фаз жидкость - воздух шириной более 3 мм и твердый субстрат-жидкость. Токсигенные штаммы эльтор образуют пленку не более 1 мм шириной. Классические вибрионы в большинстве случаев, не образуют пленку.

Лектиновые рецепторы, участвующие в образовании биопленок специфичны как гексозам (глюкозе, сахарозе, маннозе, галактозе), так и некоторым аминосахарам (N-ацетил-Д-глюкозамину, N-ацетил-Д-маннозамину).

Таким образом, в процессе образования биопленки холерными вибрионами на поверхности жидких питательных сред принимает участие больший спектр лектиновых рецепторов, по сравнению с процессами адгезии in vitro.

Изучение молекулярных основ взаимодействия холерных вибрионов с клетками человека и животных, идентификация лектиновых гаптенов и их углеводной специфичности является важным моментом для понимания механизмов патогенности, вирулентности и эпидемической значимости холерных вибрионов. Одним из параметров, характеризующим патогенность холерных вибрионов, является адгезия.

Изучение процесса адгезии холерных вибрионов традиционно проводилось на кишечнике чувствительных животных (изолированная петля, тканевые диски, изолированные микроворсинки эпителиоцитов).

В.И. Брилисом (1986) разработан метод для кишечной группы, который основан на способности микроорганизмов «прилипать» к гликофорину эритроцитов барана.

По данным Е.Г. Абрамовой (1995), гликофорин эритроцитов идентичен гликофорину гликокаликса кишечника и эритроциты могут служить моделью для изучения адгезивных свойств бактерий.

Исходя из этого, нами была выбрана и адаптирована к особенностям микробиологии холерных вибрионов, методика, разработанная В.И. Брилисом, а в качестве модели для исследования адгезивности в сравнительном аспекте выбраны эритроциты четырех групп человека, нативные и формалини-зированные эритроциты барана и эритроциты кролика.

Нас интересовало изучение адгезии холерных вибрионов не только с патогенетической точки зрения, но и со стороны использования данного фактора в диагностических целях - для диффренциации токсигенных и атокси-генных вибрионов различных серологических групп, то есть для ориентировочного определения эпидемической значимости холерных вибрионов.

В результате проведенных исследований нами было показано, что каждая изученная группа эритроцитов млекопитающих вступает во взаимодействие с холерными вибрионами сохраняя свою особенность, а оптимальной моделью, отражающей эпидемическую значимость V. cholerae eltor, V. cholerae 0139 с характеристикой ctx' tcp~ Hly+, ctx+ tcp+ Hly при адгезии холерных вибрионов являются эритроциты II группы крови человека. Адгезия к эритроцитам I, III групп крови менее демонстративно отражает наличие гена ctx АВ. Адгезия на эритроцитах IV группы крови человека, формалинизиро-ванных и нативных эритроцитах барана и кролика не коррелируют с основными факторами патогенности и эпидемической значимости V. cholerae.

Наличие групп со средней адгезивной активностью среди токсигенных и атоксигенных штаммов на моделях эритроцитов I, III, IV групп крови человека, формалинизированных и нативных эритроцитов барана и кролика свидетельствует о сложности процесса адгезии, суть которого заключается во взаимодействии вибрионов с различными углеводными детерминантами, то есть с широким и разнообразным спектром рецепторов адгезинов холерных вибрионов.

Заслуживает внимания тот факт, что консервированные эритроциты не чувствительны к холерным вибрионам «Бенгал» и менее чувствительны к эльтор вибрионам, чем нативные эритроциты, что, по нашему мнению, делает их непригодными для изучения адгезивности холерных вибрионов.

Установлено, что значения адгезии у культур, выделенных от людей, выше показателей адгезии штаммов, выделенных из объектов окружающей среды.

Нами показано, что штаммы, в общепринятых тестах эпидемической значимости определенные как токсигенные, не гемолитичные при использовании эритроцитов II группы крови имеют средний показатель адгезии -СПА >1,5; атоксигенные гемолитичные СПА <1,5.

Исходя из этого, нами сделан вывод о возможности использования теста адгезии для ориентировочной оценки эпидемической опасности выделяемых культур - дифференциации токсигенных не гемолитических штаммов, имеющих высокий показатель адгезии от атоксигенных гемолитических, являющихся низкоадгезивными.

Следует отметить, что разработанный нами метод является экспрессным, занимающим около трех часов.

В процессе исследования способности к адгезии атоксигенных вибрионов холеры эльтор с генотипом сЫ 1ср+ , мы разделили их на две группы: культуры, обладающие высокой способностью к адгезии, и вторая группа, №р+ штаммы с низкими показателями адгезии. Вторая группа крови в этом случае отражает повышенную вирулентность культур с генотипом с/х

Следует отметить, что при исследовании атоксигенных штаммов холерных вибрионов в мазках возможна не только количественная оценка адгезии, но и определение наличия гемолитической активности, по лизису эритроцитов.

Вышесказанное свидетельствует о том, что при выделении штаммов с генотипом Ох №р+, помимо определения гена ^рА, необходим дополнительный тест на наличие или отсутствие адгезивной активности, так как наличие гена токсин-коррегулируемых пилей не всегда свидетельтвует о способности последних к адгезии, аналогично, тому, как токсигенные штаммы не всегда могут вызывать холерогенный эффект. Штаммы данного типа, имеющие СПА >1,5, являются потенциально опасными, способны вызывать спорадические случаи холеры, локальные вспышки при общем источнике заражения, обуславливать вибрионосительство, и, по всей видимости, приводить к формированию токсигенных эпидемически значимых популяций.

Важным моментом для понимания механизмов вирулентности и эпидемической значимости холерных вибрионов является изучение молекулярных основ взаимодействия холерных вибрионов с клетками эукариот и определение специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов. Характерным и показательным свойством лектинов является агглютинация взвеси частиц, на поверхности которых находятся остатки углеводов (углеводные детерминанты).

В связи с этим, на первом этапе изучения спектра лектиновой специфичности холерных вибрионов различных серогрупп и характеристик (наличие генов ctx А,В, tcpA и гемолитической активности) мы выявляли штаммы агглютинирующие эритроциты I - IV групп крови человека, эритроциты барана и кролика, и не только сделали вывод о соответствии гемагглютини-рующей и адгезивной активности, но и показали, что выявленные лектино-вые рецепторы составляют адгезивный потенциал холерных вибрионов.

Нами впервые получены данные о составе лектиновых рецепторов холерных вибрионов, а также проведен сравнительный анализ лектиновой специфичности вибрионов различных биоваров и серогрупп эпидемически опасных и неэпидемических вариантов возбудителя холеры.

Многие исследователи, рассматривая формирование вирулентных клонов холерных вибрионов, находят объяснение этому процессу в приобретении клеткой мобильных генетических элементов (СТХФ, RSl<p, VIP — 1, VIP — 2 и др.). Однако в этом эволюционном процессе просматривается и другая сторона, а именно, утрата рецепторов лектинов на поверхности патогенной клетки, что делает ее менее жизнеспособной в условиях внешней среды. Целесообразность этого процесса в эволюционном понимании требует более глубокого специального изучения.

Если анализировать полученные нами результаты в эволюционном плане (классические холерные вибрионы, гемолитические эльтор, гемолитические эльтор, имеющие ген tcp, гемолитические Бенгал, токсигенные Бенгал вибрионы), то можно ориентировочно предсказать какие рецепторы приобретались, и какие были утрачены в процессе эволюции. А также, какие рецепторы характерны для эпидемических вариантов и важны в патогенезе, а какие лектины, возможно, играют важную роль в экологии холерных вибрионов, обитающих во внешней среде.

Очевидно, что для всех холерных вибрионов независимо от биовара и токсигенности характерно наличие рецепторов, узнающих глюкозу, маннозу, галактозу, сахарозу, лактозу. У гемолитических штаммов появляются рецепторы узнающие аминосахара, которые исчезают с появлением tcp А и ctx АВ генов, что, по всей видимости, важно для приспособления атоксигенных штаммов к различным условиям обитания. Несмотря на то, что гемолитические эльтор вибрионы имеют все рецепторы, углеводную специфичность которых мы изучали на разных эритроцитах глюкозо -, маннозо -, сахарозо -, лактозоспецифичные рецепторы экспрессируются у значительно меньшего количества штаммов.

С появлением tcp гена утрачиваются рецепторы, узнающие амминоса-хара, а способность к адгезии у атоксигенных гемолитических штаммов, имеющих tcp А ген совпадает с наличием лектинов, узнающих сахарозу, лактозу и N-ацетил-Д-галактозамин.

Отличительной особенностью атоксигенных высокоадгезивных штаммов, имеющих tcp ген, является наличие N-ацетил-Д-галактозамина.

V. cholerae cholerae по лектиновой специфичности рецепторов отличаются от патогенных вибрионов эльтор и Бенгал по наличию рецепторов, специфичных арабинозе. Не обнаружено рецепторов специфичных амминосаха-рам у классических холерных вибрионов.

Очевидно, что высокая адгезивная активность эпидемически значимых штаммов связана с наличием у большого количества культур гемагглютини-нов, узнающих глюкозу, маннозу, галактозу, сахарозу, лактозу.

Можно предположить, что патогенность холерных вибрионов, по всей видимости, развивалась от авирулентных свободноживущих гемолитических холерных вибрионов к вирулентным эпидемически значимым, где вирулентные клоны являются более деградированными представителями холерных вибрионов. Это находит подтверждение в том, что рецепторы специфичные амминосахарам (N-ацетил-Д-галактозамин, N-ацетил-Д-маннозамин, Д-галактозамин, Д-глюкозамин) утрачиваются токсигенными холерными вибрионами, у которых лектины более ограничены и представлены только гексо-зами. Выживание во внешней среде вирулентных штаммов ограничено во времени, однако, гемолитические штаммы постоянно циркулируют. Наличие рецепторов специфичных аминосахарам у гемолитических штаммов делает их более приспособленными к выживанию в различных условиях обитания.

Интересным является факт, что у штаммов с характеристикой ctx tcp+ Hly+, выделенных от вибрионосителей в 2005 году, обнаружен рецептор, специфичный N-ацетил-Д-галактозамину, у штаммов с данной характеристикой, выделенных из объектов окружающей среды в 2002 году, этот рецептор отсутствует. Таким образом, с появлением tcpA гена начинают исчезать рецепторы, узнающие амминосахара, а способность к гемагглютинации у атоксигенных гемолитических штаммов, имеющих ген tcpA, преимущественно связана с наличием лектинов, узнающих сахарозу, лактозу и в меньшей степени с другими сахарами.

Нами показано, что по наличию лектиновых рецепторов специфичных N-ацетил-Д-галактозамину и Д-галактозамину, определяемых методом ин-гибирования гемагглютинации эритроцитов II и IV групп крови человека, можно делать заключение о том, содержит ли выделенный штамм ген tcpA и если содержит, то является ли вирулентным, попавшим в окружающую среду от человека, который представляет собой потенциальную опасность в развитии ограниченных эпидситуаций и вибрионосительства, или исследуемая культура не является вирулентной и выделена из объектов окружающей среды при наличии рецепторов характерных для гемолитических штаммов, имеющих ген tcpA.

Очевидно, что углеводная специфичность лектиновых доменов микроорганизмов как структурных компонентов клеточной стенки играет важную роль в межклеточных взаимодействиях патогена и клетки-мишени хозяина, таких как адгезия, а так же, являясь структурными составляющими экзотоксинов (холерного токсина, гемолизина, коклюшного, дифтерийного, шигопо-добного и других токсинов), участвуют в реализации патогенетического потенциала при инфекционных заболеваниях.

Ключевым моментом, определяющим стратегию выживания холерных вибрионов, является способность образовывать микробные сообщества, названные биопленками, как во внешней среде, так и в организме хозяина. Взаимодействие, как между бактериальными клетками, так и между клетками про и эукариот носит характер лектиновых взаимодействий, что определяет многообразие механизмов адгезии, одним из которых является способность к образованию биопленочных структур в различных условиях обитания, в частности у холерных вибрионов. Взаимодействие между клетками холерных вибрионов может носить характер как гидрофобных взаимодействий (липид-липид), так и гидрофильных, лектиновых (белок-углеводных) взаимодействий, что может лежать в основе механизмов образования биопленок в растворах.

Образование пленки холерными вибрионами на жидких питательных средах является одним из визуальных диагностических признаков. Эта способность на определенном этапе знаний связывалась с подвижностью и аэ-рофильностью холерных вибрионов. Способность холерных вибрионов ме-таболизировать в аэробных и анаэробных условиях может определять многообразие субстратов для образования пленок, в том числе и формирование последних при отсутствии твердых объектов.

Согласно современным представлениям, под биопленкой понимается совокупность микроорганизмов и внеклеточных полимерных веществ. В литературе показано, что процесс формирования биопленок зависит от многих факторов, которые связаны с характеристиками раствора, свойствами носителя, а также во многом определяются составом популяции микроорганизмов. Огромное количество вариантов взаимодействия всех этих факторов обуславливает разнообразие адгезивных механизмов при использовании различных поверхностей и микроорганизмов.

Нами получены данные и проведен сравнительный анализ спектра лектиновых рецепторов, участвующих в образовании биопленок на жидкой питательной среде и адгезии к эукариотическим клеткам.

При выявлении и сравнении доминирующего спектра лектиновых рецепторов V. cholerae eltor, участвующих во взаимодействии с эукариотиче-скими клетками на модели in vitro и в создании биопленочного сообщества на поверхности жидкой питательной среды мы нашли как общие характерные биологические признаки, так и отличия. Так, общим для токсигенных и атоксигенных вибрионов эльтор в любых межклеточных взаимодействиях (в собственных и с клетками эукариот) является наличие сахарозоспецифичных рецепторов, независимо от характеристики штаммов и используемой модели. Атоксигенные гемолитические tcp ~ V cholerae eltor используют рецептор N-ацетил-Д-глюкозамина как для формирования биологической пленки на поверхности раздела фаз жидкой питательной среды и воздуха, так и для специфической адгезии к клеткам макроорганизма. Следует отметить, что полимер N-ацетил-Д-глюкозамина - хитин, входящий в состав экзоскелета ракообразных и зоопланктона, является питательной средой, которую многие виды Vibrio используют как единственный источник углерода и азота.

По нашим данным маннозоспецифичные рецепторы участвуют в адгезии к эукариотическим клеткам только у токсигенных штаммов, в то время как в собственных межклеточных взаимодействиях при образовании пленки ;s. в эксперименте in vitro рецептор маннозы принимает участие у всех групп штаммов.

Интересным, на наш взгляд, является факт использования токсигенны-ми и атоксигенными холерными вибрионами одинаковых лектиновых рецепторов как для формирования биопленки на поверхности питательной среды так и при адгезии к эритроцитам млекопитающих. Однако, для создания микробных сообществ в виде пленки на поверхности жидких питательных сред, гемолитические холерные вибрионы дополнительно используют рецепторы, специфичные глюкозе и маннозе, что еще раз свидетельствует об экологической пластичности атоксигеных вибрионов эльтор, по сравнению с эпидемическими.

Как известно, холерные вибрионы эльтор не ферментируют арабинозу. В результате проведенных нами исследований установлено, что лектиновые рецепторы, специфичные арабинозе не участвуют ни в процессах адгезии и гемагглютинации, ни в пленкообразовании, то есть вибрионы эльтор, по всей видимости, не имеют рецепторов, специфичных арабинозе.

Результаты наших исследований свидетельствуют, что модель биопленки, образуемой холерными вибрионами на поверхности жидких питательных сред, можно использовать для изучения механизмов образования биопленок, в которых участвуют лектин-углеводные взаимодействия между клетками холерных вибрионов, аналогично процессам адгезии холерных вибрионов к клеткам эукариот.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Колякина, Анастасия Владимировна, Ставрополь

1. Абрамова, Е.Г. Адгезивные свойства холерных эльтор вибрионов, выделенных в 1992 — 1993 гг / Е.Г. Абрамова, Е.С. Казакова // Сборник науч. трудов. Новороссийск, 1994. - Вып. 1. - С. 177- 180.

2. Адамов, А.К. О связи вирулентности с антигенной структурой холерных вибрионов / А.К. Адамов, И. И. Шуркина, Л. П. Алексеева // Генетика и биохимия вирул. возб. особо опас. инф. Матер. Рос. науч. конф. Волгоград, 1992.-С. 69.

3. Адамов, А.К. Значение взаимодействий изогемагглютининов и ге-терогемагглютининов в иммунологических реакциях / А.К. Адамов // Пробл. особо опас. инф. Саратов, 1968. - Вып. 4. - С. 98-101.

4. Адаме, Г.А. Линополисахариды. Выделение линополисахаридов из грамотрицательных бактерий / Г.А. Адаме // Методы исследования углеводов.-М.: Мир, 1975.-С. 126-130.

5. Андрусенко, И. Т. Изучение биологического действия холерного энтеротоксина холерных вибрионов 01 и не 01 / И. Т. Андрусенко, А. К. Адамов, Э.А. Яговкин, А. П. Шепелев // Сборник науч. трудов. Новороссийск, 1994.-Вып. 1.-С. 173-175.

6. Андрусенко, И.Т. Исследование факторов, влияющих на вирулентность холерных вибрионов и разработка новых методов ее определения // Автореф. дис. . докт. биол. наук. Саратов, 1991. -43с.

7. Андрусенко, И.Т. Использование реакции гемагглютинации с целью изучения адгезивности вибрионов / И. Т. Андрусенко, О.В. Фрунзе, А.П. Шепелев // Лаб. дело. 1987. № 3. - С.

8. Биохимия человека / Р. Мари, Д. Греннер, П. Мейес, В. Родуэлл. -М.: Мир, 1993.-Т. 1.-384 с.

9. Брилис, В.И. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов / В.И. Брилис, Т.А. Брилене, Х.П. Ленцнер, A.A. Ленцнер // Лаб. дело. 1986. №4. - С. 210 - 212.

10. Вертиев, Ю.В. Токсин-опосредованная обусловленность инфекционных заболеваний / Ю.В. Вертиев // Мол. структура бактериальных токсинов и генетич. контроль их биосинтеза: Тез. 1-й Всесоюз. конф. М., 1985. -С. 28-30.

11. Ветчинкина, Е.П. Внутриклеточные лектины на разных стадиях развития Lentinus edodes / Е.П. Ветчинкина, О.И. Соколов, В.Е. Никитина // Микробиология. 2008. - Т. 77, №4. - С. 496 - 501.

12. Водопьянов, С.О. Генетическое разнообразие гена tcpA у предста

13. Водопьянов, С.О. Разработка способа выявления гена tcpA холерного вибриона биотипа эльтор и сероварианта 0139 Бенгал с помощью по-лимеразной цепной реакции / С.О. Водопьянов, М.Б. Мишанькин, И.П. Олейников // Биотехнология. 1999. - № 6. - С. 19-23.

14. Войтенко, А. С. Конструирование штаммов Е. coli, содержащих гены В-субъединицы холерного токсина и адгезинов CFAI и К88 / А. С. Войтенко, Г. В. Чеховская, JI. Ф. Ливанова // Пробл. особо опас. инф. Саратов, 1999. - Вып. 79. - С. 148-152.

15. Гофман, Е. Л. Растворимый гемагглютинин возбудителя холеры / Е. Л. Гофман, Е. В. Рожков, В. В. Король // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасн. инф.: Тез. докл. Рос. науч. конф. Волгоград, 1992.-С. 88.

16. Громов, Б.В. Строение бактерий. Л.: Изд-во ЛГУ, 1985. - 190 с.

17. Гусева, Е.В. Антигены крови системы ABO и восприимчивость человека к дифтерии / Е.В. Гусева, Р.Ю. Ташпулатов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2004. - №4. - С. 79 — 81.

18. Давыдова, H.A. Тест-система для выявления возбудителя холеры методом полимеразной цепной реакции / H.A. Давыдова, А.Н. Кулическо, H.A. Федоров // Пробл. особо опас. инф. Саратов, 1999. - Вып. 79. - С. 72 -76.

19. Домарадский, И.В. Зачем микробам токсины? (о роли токсинов в экологии бактерий) / И.В. Домарадский // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1990.-№ 9.-С. 3-10.

20. Евлахова, С.П. Протеолитическая и лецитиназная активность холерных вибрионов 0139 серовара / С.П. Евлахова, Б.Н. Мишанькин // Пробл. сан. эпид. охраны территории стран СНГ: Тез. докл. Международ, науч. -практ. конф. - Саратов, 1998. - С. 154-155.

21. Езепчук, Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. М.: Медицина, 1985.-240 с.

22. Езепчук, Ю.В. Роль нейраминидазы в функции бактериальных токсинов / Ю.В. Езепчук, Ю.В. Вертиев, JI.A. Денисов // Мол. генетт., микробиол. и вирусол. 1983. - № 1. - С. 21-24.

23. Ефремов, В.Е. Мыши-сосунки как модель для изучения энтероток-сигенных свойств вибрионов / В.Е. Ефремов // Острые кишеч. инфекции: Республ. сб. JI, 1978. - Вып. 2. - С. 87 - 92.

24. Ефремов, В.Е. Оценка адгезии, колонизации и энтеротоксигенности холерных вибрионов при энтеральном заражении интактных и пассивно иммунизированных новорожденных животных / В.Е. Ефремов, Ю.Е. Полоцкий,

25. A.Ю. Самострельский // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1981. № 12.-С. 69-75.

26. Захарова, Т. Л. Факторы адгезии холерного вибриона / Т. Л. Захаро- „ ва, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опас. инф. Саратов, 1999. - Вып. 79. —с. 12-20.

27. Зиатдинов, В.Б. Особенности эпидемиологии современной холеры /

28. B.Б. Зиатдинов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 2003. — №1. С. 96-102.

29. Ипполитов, К.Г. Закономерности развития биопленки и особенности образования внеклеточных полимерных веществ штаммов Sphingomonas sp. / К.Г. Ипполитов, A.C. Сироткин, С.А. Понкратва, М. Юон. // Биотехнология. 2003. - №3. - С. 3 - 11.

30. Кагава, Я. Биомембраны. М.: Высш. шк., 1985. - 303 с.

31. Каплиев, В. И. Адгезивные свойства возбудителя мелиоидоза / В. И. Каплиев, В. С. Замараев, Н. Н. Пивень // Генетика и биохимия вирул. возбу

32. Королев, Н.П. Функции лектинов в клетках / Н.П. Королев // Итоги науки и техники. Общие проблемы физико-химической биологии. М., Т.1. — 1984.

33. Королева, Г.В. Адгезивные свойства вибрионов разных видов и адгезивных препаратов / Г. В. Королёва, В.В. Король, Л.М. Смоликова // Холера. Вопр. эпидемиол., микробиол. и лаб. диагност.: Матер. Рос. науч. конф. — Ростов-на-Дону, 1992. С. 88 - 89.

34. Король, В. В. Получение и характеристика адгезина возбудителя холеры / В. В. Король, Е. В. Рожков, Е. Л. Гофман, И. Д. Бардых // Генетика и биохимия вирул. возб. особо опас. инф.: Тез. докл. Рос. науч. конф. — Волгоград, 1992.-С.101.

35. Король, В.В. Современное состояние и перспективы развития проблемы адгезии патогенных микроорганизмов / В. В. Король // Известия

36. Король, В.В. Метод изучения адгезивных свойств холерных вибрионов, меченных радиоактивным углеродом /В.В. Король, Л.П. Алексеева, Е.Л. Гофман // Профилакт. природноочагов. инф.: Тез. докл. Всесоюз. науч. -практ. конф. Ставрополь, 1983. - С. 300-301.

37. Король, В.В. Изучение защитного действия экстрацеллюлярного гликопротеина холерных вибрионов на различных экспериментальных моделях / В.В. Король, Е.В. Глянько, Г.В. Королева // Сборник научных трудов. — Новороссийск, 1994. Вып. 1. - С. 180 - 181.

38. Король, В.В. Факторы, влияющие на адгезию возбудителя холеры к слизистой кишечника /В.В. Король, Е.Л. Гофман // Актуал. вопр. микробиол. лаб. диагност, и профилакт. холеры: Тез. Всесоюз. науч. конф. Ростов-на-Дону, 1988.-С. 115-116.

39. Крю, Ж. Биохимия. Медицинские и биологические аспекты. М.: Медицина, 1979. - 510с.

40. Лабораторная диагностика холеры: Методические указания МУК 4.2.2218-07. М.:, 2007. - 87с.

41. Ларионова, Л. В. Мембранный белок возбудителя холеры с адгезивной функцией / Л. В. Ларионова, В. В. Король, Г. В. Королёва // Генетика и биохимия вирул. возб. особо опас. инф.: Тез. докл. Рос. науч. конф. Волгоград, 1992. - С.107.

42. Лахтин, В.М. Биотехнология лектинов / В.М. Лахтин // Биотехнология. 1989. - Т. 5, № 6. - С. 676-691.

43. Лахтин, В.М. Лектины и аспекты их изучения / В.М. Лахтин // Микробиологический журнал. 1990. - Т.52, №1. - С. 84 - 87.

44. Лахтин, В.М. Молекулярная организация лектинов / В.М. Лахтин // Молекулярная биология. 1994. - Т. 28. Вып. 2. - С. 245 - 273.

45. Литвин, В.Ю. Факторы патогенности бактерий: функции в окружающей среде / В.Ю. Литвин, В.И. Пушкарева // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 1994. Приложение 1. - С. 83 - 87.

46. Ломов, Ю. М. Эпидемически опасные холерные вибрионы нового серовара 0139 «Бенгал» / Ю. М. Ломов, Б. Л. Мазрухо, Л. Г. Воронежская, В.

47. B. Малеев // Сборник научных трудов. — Новороссийск, 1994. Вып. 1. —1. C.92-97.

48. Луцик, М.Д. Методы поиска лектинов (фитогемагглютининов) и определение их иммунохимической специфичности / М.Д. Луцик, Е.Н. Пана-сюк, В.А. Антонюк // Метод, рекомендации. Львов, 1980. - С. 20.

49. Макаренкова, И.Д. Ингибирование адгезии патогенных микроорганизмов на эукариотических клетках / И.Д. Макаренкова, Г.Г. Компанец, Т.С. Запорожец // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 2006. №3. -С.121 - 125.

50. Меньшикова, Е. А. Гемолитическая активность vct+ и vet- штаммов холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп / Е.А. Меньшикова, Л.С. Подо-синникова // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». — Ростов-на-Дону, 2000. Вып. 13. - С.68-69.

51. Меньшикова, Е.А. Гемолитическая активность и токсигенность Vibrio cholerae различных серогрупп / Е.А. Меньшикова, JI.C. Подосиннникова, A.B. Миронова, О.И. Сальникова // Журн. микробиол., эпидемиол. и имму-нобиол.- 2002. №5. - С. 7 - 11.

52. Миронова, A.B. Инвазивность токсигенных и нетоксигенных холерных вибрионов различных серогрупп / A.B. Миронова, Е.А. Меньшикова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2002. - №3. - С. 58 - 60.

53. Михайлова, А.Е. Факторы сохранения холерных вибрионов в водоемах / А.Е. Михайлова, А.Б. Хайтович // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2000. - №6. - С. 99 - 104.

54. Москвитина, Э.А. Оценка эпидемиологического потенциала территории при холере с использованием комплекса показателей / Э.А. Москвитина, A.B. Горобец, Ю.М. Ломов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-2003. №6.-С. 26-29.

55. Никитина, В.Е. Влияние лектина Azospirillum brasilense на кинетику клеточных популяций / В.Е. Никитина, И.О. Бугаева, Е.Г. Пономарева // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 2003. — №1. С. 37 - 42.

56. Николаев, Ю.А. Биопленка — «город микробов» или аналог многоклеточного организма? / Ю.А. Николаев, В.К. Пласкунов // Микробиология. -2007. Т. 76, №2. - С. 149 - 163.

57. Онищенко, Г.Г. Характеристика холерных вибрионов эльтор, выделенных в г.Казани в 2001 году / Г.Г. Онищенко, Ю.М. Ломов, Б.М. Мишань-кин // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2002. - №2. - С. 3 - 6.

58. Онищенко, Г.Г. Холера, обусловленная Vibrio cholerae OI ctxAB" tcpA+ / Г.Г. Онищенко, Ю.М. Ломов, Э.А. Москвитина // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 2007. № 1. — С. 23 - 29.

59. Петровская, В.Г. Адгезины энтеропатогенных кишечных палочек: роль в патогенезе диарей и генетический контроль / В.Г. Петровская, В.М. Бондаренко // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1990. - №5. -С. 99-104.

60. Подосинникова, Л. С. Экспрессия вирулентности холерных вибрионов на экспериментальных животных / Л. С. Подосинникова // Сборник науч. трудов. — Новороссийск, 1994.— Вып. 1. —С.138-140.

61. Подосинникова, JI.C. Холерные вибрионы, выделенные на территории СССР в период седьмой пандемии // Автореф. дис. . докт. мед. наук. -Саратов, 1993.-44с.

62. Подосинникова, JI.C. Формула эпидзначимых штаммов V.cholerae Ol / JI.C. Подосинникова, В.П. Власов, Е.В. Монахова, Е.В. Глянько // Пробл.-темат. комиссия по пробл. «Холера»: Информация.- Ростов-на-Дону, 1989. С. 9.

63. Рожков, Е.В. Экстрацеллюлярный адгезин возбудителя холеры / Е.В. Рожков, В.В. Король, E.JI. Гофман // Холера. Вопр. эпидемиол., микро-биол. и лаб. диагност.: Матер. Рос. науч. конф. Ростов-на-Дону, 1992. - С. 92 - 94.

64. Рожков, Е.В. Иммунохимический анализ структуры адгезина возбудителя холеры / Е.В. Рожков, В.В. Король, E.JI. Гофман, Г.В. Королева // Генетика и биохимия вирул. возб.особо опас. инф.: Тез. докл. Волгоград, 1992. - С. 125.

65. Романова, Ю.М. Способность к формированию биопленок в искусственных системах у различных штаммов Salmonella typhimurium / Ю.М. Романова, Н.В. Алексеева, Т.А. Смирнова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2004. - 4. - С. 38 - 42.

66. Савельев, В.Н. Холера Эльтор (эпидемиологические и микробиологические аспекты) // Автореф. дис. . докт. мед. наук. Саратов, 1998. - 48с.

67. Сагеева, О.Ф. Изучение адгезии и колонизации у различных по вирулентности штаммов холерного вибриона при энтеральном заражении кроликов сосунков на фоне введения иммунодепрессантов / О.Ф. Сагеева, И.В.

68. Исупов, Д.Л. Шмеркевич // Биотехнол., иммунол. и биохимия особо опас. инф. Саратов, 1989. - С. 148 - 152.

69. Саппо, С.Г. Использование эритроцитов для выявления адгезивной способности вибрионов / С.Г. Саппо, Л .Я. Урбанович, B.C. Колесник // Соврем. аспекты профилакт. зооноз. инф. Иркутск, 1984, Ч.З. - С. 126 - 127.

70. Святой, В.И. Изучение вирулентности гемолитически активных вибрионов Эль Тор в тесте Грейга / В.И. Святой // Пробл. особо опас. инф. -Саратов, 1978. Вып. 3. - С. 42-44.

71. Смирнова, Н.И. Генетические маркеры эпидемически значимых штаммов холерного вибриона / Н.И. Смирнова, О. А. Кириллина, Н. Б. Бирюкова, В. В. Кутырев // Пробл. особо опас. инф. — Саратов, 1999. Вып. 79. — С.25-35.

72. Смирнова, Н.И. Основные факторы патогенности холерных вибрионов и их генетический контроль / Н.И. Смирнова // Журн. микробиол., эпи-демиол. и иммунобиол. 1997. - №9. - С. 102-108.

73. Смоликова Л.М. Методические рекомендации по количественной оценке адгезивной активности холерных вибрионов in vivo / Сост.: Л.М. Смоликова, В.В. Король, Л.Г. Сомова. Ростов-на-Дону, 1987. - 8с.

74. Суханова, Г.А. Патохимия клетки. Томск: изд-во Томского мед. инта, 1990.- 150 с.

75. Телесманич, Н.Р. Триациглицероллипазная активность гемолитических холерных вибрионов / Н.Р. Телесманич // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2004. - №2. - С. 11 - 14.

76. Телесманич, Н.Р. Анализ гемолизинов холерных вибрионов с помощью монослойных перевиваемых культур и моноклональных антител // Ав-тореф. дис. . канд. биол. наук. Ростов-на-Дону, 1996. - 20с.

77. Телесманич, Н.Р. Гемо-цитолизин Vibrio cholerae: механизмы действия in vitro и in vivo / Н.Р. Телесманич // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1999. - № 3. - С. 89-93.

78. Телесманич, Н.Р. Механизмы гемолитической активности холерных вибрионов // Автореф. дис. . докт. биол. наук. Ростов-на-Дону, 2006. -38с.

79. Телесманич, Н.Р. Общебиологическая роль гемолизина холерных вибрионов / Н.Р. Телесманич // Intern. J. Immunorehabilitation. 2002. - Т. 4, № 2. - С. 222-227.

80. Телесманич, Н.Р. Получение моноклональных антител к гемолизину нехолерных вибрионов / Н.Р. Телесманич // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1999. - № 2. - С. 19-22.

81. Телесманич, Н.Р. Роль лектина (HLY А) в гемолитической и гемма-гютинирующей активности Vibrio cholerae / Н.Р. Телесманич, Е.В. Безуглова, М.Б. Мишанькин, Н.И. Винокур // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2004. - № 5. - С. 12 - 16.

82. Телесманич, Н.Р. Бактерицидные свойства гемоцитолизина Vibrio cholerae non OI / Н.Р. Телесманич, Н.И. Винокур, Н.Б. Непомнящая, Е.А. Меньшикова // Журн., микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 2000. - № 5. -С. 84-86.

83. Телесманич, Н.Р. Способ выявления лектиновых рецепторов холерных вибрионов / Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов // Патент № 2278899 от 27 июня 2006 г.

84. Телесманич, Н.Р. Лектиновые рецепторы холерных вибрионов, роль Сахаров в адгезии / Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов, И.Д. Бардых, Н.И. Винокур // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2004. - Вып. 17. - С. 33-36.

85. Телесманич, Н.Р. Биологическая роль гемоцитолизина холерных вибрионов / Н.Р. Телесманич, М.Б. Мишанькин // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2002. - Вып. 15. - С. 4649.

86. Телесманич, Н.Р. Анализ гемолизинов холерных вибрионов с помощью монослойных перевиваемых клеточных культур / Н.Р. Телесманич, Н.Б. Непомнящая // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1998. - № 6. -С. 30-32.

87. Тихомирова, Е.И. Лектин вакцинного штамма Yersinia pestis EV и изучение его иммунобиологических свойств / Е.И. Тихомирова, С.П. Задно-ва, О.А. Волох // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 2003. - № 1. -С. 51 -55.

88. Уралева, B.C. Адгезивные свойства штаммов и мутантов холерных вибрионов с различной биологической характеристикой / B.C. Уралева, И.В. Кутырева, И.Я. Черепахина, В.А. Трубникова // Журн. микробиол., эпидеми-ол. и иммунобиол. 1983. - №7. — С. 51-55.

89. Уралева, B.C. Оценка значения некоторых свойств для вирулентности Vibrio cholerae и выявление их коррелятивных связей / B.C. Уралева, И.Я. Черепахина, О.П. Фецайлова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1984.- №10.-С. 58-63.

90. Франц, X. Применение токсических растительных лектинов в изготовлении иммунотоксинов (аффинотоксинов) / X. Франц, К. Пфюллер // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1983. — №5. - С. 18 - 25.

91. Фрунзе, О.В. Использование реакции геммаглютинации с целью изучения адгезивности вибрионов / О.В. Фрунзе, И.Т. Андрусенко, А.П. Шепелев // Лаб. дело. 1987. - №3. - С. 12 - 15.

92. Челядинова, A.B. Изучение биологических свойств холерных вибрионов Ol39 серогруппы // Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ростов-на-Дону, 2000. - 18с.

93. Шиманюк, Н.Я. Получение очищенной нейраминидазы Vibrio cholerae eltor / Н.Я. Шиманюк, Б. Н. Мишанькин, О. Ю. Рябухина // Биотехнология. 1991. - №4. - С. 17-19.

94. Шиманюк, Н.Я. Нейраминидаза холерных вибрионов 0139 серовара «Бенгал» / Н.Я. Шиманюк, О.В. Дуванова, Б.Н. Мишанькин // Матер, науч. -практ. конф., посвящ. 100-лет. образов, противочум. службы России. Саратов, 1997.-Т. 2.-С. 151-152.

95. Baxter, A. Changes in surface carbohydrate of human erythrocytes aged/in vivo / A. Baxter, J: Beeley // Biochem. Soc. Trans. 1975. - Vol. 3-, № 1. - P. 134-136.

96. Bhattacharya, S.K. N-acetye-D-glucosamine specific hemagglutinin receptor of Vibrio cholerae Ol in; chicken erythrocute membranes / S.K. Bhattacharya, C.R. Pal, A. Datta I IFEMS Immunol. Med. Microbiol: 2002. - Vol. 32, M-P 187-189.

97. Boyd, W. The anti- N lectin of Bauhiniapurpurea / W. Boyd, D; Everhart, M. Mc Master // J. Immunol. 1958. - Vol: 81. - P. 414-418.

98. Boyd, W. Hemagglutinating substances in various plants / W. Boyd, R. Reguera // J. Immunol. 1949: - Vol. 62. - P. 333-339.

99. Brady,. P. Identification of the dietary lectin, wheat germ agglutinin, in human intestinal contents / P. Brady, A. Vannier, J. Banwell // Gastroenterology. -1978. Vol. 75; № 2. - P. 236-239.

100. Chitnis, D.S. Role of somatic antigen of Vibrio cholerae in adhesion to intestinal mucosa / D.S. Chitnis, K.D. Sharma, R.S. Kamat // J. Med. Microbiol. -1982. Vol. 15, №1. - P. 53 - 61.

101. Covazzr hariague, A. Vibrios in association with sedimentary crustaceans in three beaches of the northern Adriatic Sea / A. Covazzi hariague, M.D. Brino //

102. Duguid, J. Adhesive properties of enterobacteriaceae / J. Duguid, D. Old // In Bacterial adherence. Receptor and recognition. — London — New York, 1980. -Vol. 6.-P. 184-217.

103. Dziejman, M. Genomic characterization of non-Ol, non 0139 Vibrio cholerae reveals genes for a type III secretion system / M. Dziejman, D. Serruto, V. C. Tarn // Proc. Nat. Acad. Sci. 2005. - Vol. 102, №9. - P. 3465-3470.

104. Eshdat, Y. Isolation of a mannose-specific lectin from E. coli and its role in the adherence of the bacteria to epithelial cells / Y. Eshdat, I. Ofek, Y. Yashow-Gan // Biochem. Biophis. Res. Comm. 1978. - Vol. 85, № 4. - P. 1151-1559.

105. Finkelstein, R.A. Infection purification and characterization of the soluble hemagglutinin (cholera lectin) produced by Vibrio cholerae / R.A. Finkelstein, L.F. Hanne // Intect. Immun. 1982. - Vol. 36, № 3, P. 1199-1208.

106. Folster, J.P. The extracellular transport signal of the Vibrio cholerae endo-chitinase (Chi A) is a structurae motif located between amino acids 75 and 555 / J.P. Folster, T.D. Connell // J. Bacteriol. 2002, Vol. 184, № 8. - P. 2225-2234.

107. Franz, H. Lectins: Biology, biochemistry and clinical biochemistry / H. Franz, P. Ziska // Eds. T.C Bog-Hansen.- Berlin; New York: Walter de Gruyter, 1981.-Vol. l.-P. 179-184.

108. Fuerst, J.A. Demonstration of lypopolysaccharide on sheathed flagella of Vibrio cholerae Ol By protein A gold immunoelektron microscopy / J. A. Fuerst, J.W. Perry 11 J. Bacteriol. - 1988. - Vol. 170, №4. - P. 1488 - 1494.

109. Fukasawa, S. Some properties of a chitinase from luminous bacteria Vibrio fischeri strain COT-A136 / S. Fukasawa, M. Arai, T. Wada // Chem. Pharm. Bull.

110. Gancik, J. Sialic acid — a determinant of the life-time of rabbit erythrocytes / J. Gancik, R. Schaner // Hoppe Seylers's Zschr. Physiol. Chem. - 1974. -Vol. 355, № 4. - P. 395-400.

111. Gangulu, N.K. Mechanism of action of cholerae toxin and other toxins / N.K. Gangulu, T. Kaur // Indian J. Med. Res. 1996. - Vol. 104. - P. 28-37.

112. Hall, R.H. Vibrio cholerae HlyA hemolysin is processed by proteolysis / R.H. Hall, B.S. Drasar // Infect. Immun. 1990.- Vol. 58, № 10.- P. 3375-3379.

113. Hanne, L.F. Characterization and distribution of the hem agglutinins produced by Vibrio cholerae / L.F. Hanne, R.A. Finkelstein // Infect. Immun. — 1982. Vol. 36, №1.-P. 209-214.

114. Hansen, G.H. Cholera toxin entry into pig enterocytes occurs via a lipid \ ratt and depended mechanism / G.H. Hansen, S.M. Dalskov, C.R. Rassmussen // Biochemistry. 2005. - Vol.44, №3. - P. 873-882.

115. Ikigai, H. Two forms of Vibrio cholerae Ol El Tor hemolysin derived from identical precursor protein / H. Ikigai, T. Ono, T. Nakae // Bioch. Bioph. Acta. 1999. - Vol. 1415, № 5. - P. 297-305.

116. Jesudason, M.V. Blood stream invasion by Vibrio cholerae 0139 / M.V. Jesudason, A.M. Cherian, T.J. John // Lancet. 1993. - Vol. 342, № 8868. - P. 431.

117. Jones, G.W. Adhesive properties of Vibrio cholerae'. adhesion to isolated rabbit brush border membranes and hemmaglutinating activity / G.W. Jones, G.D. Abrams, R. Freter // Infect. Immun. 1976. - Vol.114, №1. - P. 232-239.

118. Jones, G.W. Adhesive properties Vibrio cholerae: nature of the interaction with isolated rabbit brush border membranes and human erythrocytes / G.W. Jones, R. Freter // Infect. Immun. 1979. - Vol.14, №1. - P. 240 - 245.

119. Jones, G.W. Adhesion microorganisms in vitro. / G.W. Jones, J. Rutter

120. Jost, P.S. Evidens for boundary lipid in membranes (membranous cytochrome oxidase spin label) / P.S. Jost, O.H. Griffith, R.A. Capaldi // Proc. Nat. Acad. Sci. 1973. - Vol.70, №2. - P.480 - 484.

121. Kirschner, A.K. Rapid growth of Vibrio cholerae non OI/O 139 in a large alkaline lake in Austria / A.K. Kirschner, J. Schlesinger, A.H. Farnleiter // Appl. Environ. Microbiol. 2008. - P. 2 - 4.

122. Paula, I. Heps in the development of a Vibrio cholerae El Tor biofilm / Paula I., Watnick P., Kolter R. // J. Molecular Microbiology. 1999, 34(3): 586595.

123. Rogers, H. Adgesion microorganisms surfaces. London., 1979. 129 PP.

124. Sasmal, D. N-acetyl-D-glucosamine specific hemagglutinin receptor of Vibrio cholerae Ol in chicken erythrocyte membranes / D. Sasmal, B. Guhathakurta, S.K. Bhattachaiya // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2002 - Vol. 32, № 3. - P. 187189.

125. Shan, M. Transmissibility of cholera: in vivo formed biofilms and their relationship to infectivity and persistence in the environment / M. Shan, Kuntan Biswas, Nashir Udden. // PNAS. - 2006. - vol. 103. - №4. - P.6350 - 6355.

126. Silva, A. Y. Haemagglutinin protease expression and mucin gel penetration in El tor biotipe Vibrio cholerae / A. Y. Silva, K. Pham // Microbiology. - 2003. - Vol. 149 pt 7.-P. 1883 - 1891.

127. Simpson, D. Lectins: endogenous carbohydrate-binding proteins from vertebrates tissues. Functional role in recongnition processes / D. Simpson, D. Thorne, H. Loh // Life Sci. 1978. - Vol. 22, № 9. - P. 727-748.

128. Thomas, A colonization factor links Vibrio cholerae environmental survival and human infection / J. Thomas, H. Kirn // Nature. — 2005. P. 27-48.

129. Trucksis, M. The Vibrio cholerae genome contains two um-gue circular chromosomes/ M. Trucksis, J. Michalski // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998.

130. Vance, R.E. A constitutively Active Variant of the Quorun-Sensing Regulator Zux O Affects Protease Production and Biofilm Formation in Vibrio chol-erae / R.E. Vance, , Jun Zhu, J J. Mekalonos // J. Infect, and Immun. 2003, 71, (5): 2511-2576.

131. Waters, C.M. Quorum sensing control biofilm formation in Vibrio cholerae through modulation of cyclic di GMP levels and repression of vpsT / C.M. Waters, Lu W., Rabinowitz J.D. // J. Bacteriol. - 2008. - P. 25 - 28.

132. Watnick Paula I., Fullner K. J., Kolter R. A role for Mannose sensitive hemagglutinin in Biofilm formation by Vibrio cholerae El Tori II Journal of Bacteriology. - 1999. -p.3606 - 3609.

133. Zhang, D. Analysis of receptor for Vibrio cholerae Eltor hemolysin with a monoclonal antibody that recognizes glycophorin B of human erythrocyte membrane / D. Zhang, J. Takahashi, T. Seno // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67, № 10.-P. 5332-5337.

134. Zitzer, A. Potent membrane permeabilizing and cytocidal action of Vibrio cholerae cytolysin on human intestinal cells / A. Zitzer, T.M. Wassenaar, I. Walev, S. Bhakdi // Infect. Immun. - 1997. - Vol. 65, № 4. - P. 1293-1298.

135. Zitzer, A. Oligomerization of Vibrio cholerae cytolysin yields a pen-tameric pore and has a dual specificity for cholesterol and sphingolipids in the

136. Серо группа биовар штамм № источник место год характеристикавыделения с1х 1ср Н1у

137. Серо группа биовар штамм № источник место год характеристикавыделения йх 1:ср Н1у

138. Серо группа биовар штамм № источник место год характеристикавыделения с1х 1:ср Н1у

139. Серо группа биовар штамм источник место год характеристикавыделения с1х Н1у

Информация о работе

Колякина, Анастасия Владимировна
кандидата медицинских наук
Ставрополь, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Лектиновые рецепторы холерных вибрионов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы