Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание генетически маркированных растений и клеточных линий для использования в биотехнологии картофеля

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Создание генетически маркированных растений и клеточных линий для использования в биотехнологии картофеля"

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии

На правах рукописи

ДАВЫДОВА Юлия Владимировна

СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МАРКИРОВАННЫХ РАСТЕШИ И КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИИ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В БИОТЕХНОЛОГИИ КАРТОФЕЛЯ (03.00.23 - биотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии.

Научный руководитель

кандидат сельскохозяйственных наук О.С.Мелик-Свркисов

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, в.н.с. В.В. Мазин кандидат биологических наук, в.н.с. Г.В. Рассадина

Ведущая организация

- Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН

Я { (^лироц,

та * я О Тс

Защита состоится __

заседании специализированного совета

1994 г. в Д 020.40.01

час. на

при ВНИИ

сельскохозяйственной биотехнологии (127550, Москва, ул. Тимирязевская, д.42)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии.

Автореферат разослан "(у (ЛХ^ь^ 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук С.А. Меликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Генетически маркированные клеточные линии и растения играют огромную роль в развитии исследований в области биотехнологии, генетики, биологии развития, физиологии и биохимии растений. С помощью маркирования клеток мутациям! можно ответить на многие вопросы онтогенеза растений. Генетически маркированные линии необходимы для отбора продуктов слияния в экспериментах по соматической гибридизации растений. Они являются незаменимыми реципиентами в работах по генетической трансформации растений, служат ценным источником для выделения генов, кодирующих важные признаки и широко используются в качестве моделей для различных теоретических и прикладных исследований (Сидоров, 1990).

Развитие клеточных технологий, особенно в сочетании с мутагенезом, явилось эффективным средством создания новых маркерных форм, часто ранее вообще неизвестных у растений, например, мутантов, устойчивых к антибиотикам, которые способствовали развитию цитоплазматической генетики растений. Развитие методов генной инженерш позволило целенаправленно маркировать клетки и целые растения определенными генами.

Широков применение получили методы соматической гибридизации, клеточной селекции; генетической трансформации, требуутив, как правило, наличия четких генетических маркеров, для улучшения "картофеля, у которого полученные в культуре in vitro ценные формы могут быть быстро размножены вегетативным путем.

Однако, несмотря на то, что у картофеля на сегодняшний день уже получено значительное число маркеров (Сидоров, 1990), все еще существует настоятельная необходимость в создании новых генетически маркированных форм, что в значительной степени обусловлено сложностью стоящих перед исследователями задач в области биотехнологии картофеля

Актуальны вопросы получения у диких видов Solanum и сортов S. tuberosum различных генетически маркированных линий с устойчивостью к канамицину, хлорофилдцефектных форм и форм с измененным уровнем эндогенных фитогормонов, являющихся хорошими фенотипичес-кими маркерами, которые могут с успехом применяться для изучения

гормональной регуляции ростовых и морфогенетических процессов (Кефали и др., 1991), а также устойчивости растений (Memelink et al., 1987; Каштан и др., 1988).

Особый интерес представляет создание форм, маркерный признак которых одновременно являлся бы в какой-то степени и полезным. В этом плане интересны формы устойчивые к гидролитическим ферментам микроорганизмов, с помощью которых фитопатогены проникают в растения. Было высказано предположение (Аввтисов, Мелик-Саркисов, 1988), что гидролитические ферменты микроорганизмов могут служить в качестве селективного маркера для отбора линий, устойчивых к фитопатогенам.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ . В связи с вышеизложенным целью настоящей работы было, используя как уже известные биотехнологические приемы, так и-новые нетрадиционные подхода, получить различные генетически маркированные линии картофеля, в том числе и устойчивые к заболеваниям и охарактеризовать их.

Для осуществления этой цели были поставлены следующие задачи:

- ввести в культуру In vitro различные дикие виды Solanum -доноры генов устойчивости и изучить их способность к морфогенезу в каллусной культуре;

- получить устойчивые к канамицкну. и с бета-глюкуронидазной активностью трансгенные клеточные линии диких видов Solanum и охарактеризовать их;

- получить трансгенные растения картофеля, несущие агробакте-риальный ген биосинтеза цитокининов и охарактеризовать их свойства;

-..изолировать в культуре in vitro хлорофиллдефектные. формы Картофеля и изучить их;

- изучить действие гидролитических ферментов микроорганизмов на изолированные протопласты, клетки и растения картофеля и отобрать формы, устойчивые к этим ферментам;

- проанализировать отобранные устойчивые к гидролитическим ферментам формы картофеля на их устойчивость к различным заболеваниям. • ..-•'.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Впервые получены трансгенные клеточ-'ные линии S. vernel и S. stolonlierum с маркерными генами nptll и gu3. Впервые создана коллекция трансгенных форм культурного картофеля и дикого вида S. vemei, различающихся по эндогенному содер-

.жанию цитокининов. В результате введения в их геном дополнительного агробактериального гена биосинтеза цитокининов изучено влияние цитокиншового гена на регенврационные процессы в трансформированных тканях картофеля и показана способность таких тканей регенерировать побеги на безгормональной среде. Показано, что высокий уровень цитокининов в тканях картофеля не только вызывает появление характерного shooty-фенотипа, но и ведет к нарушению анатомического строения ткани листа. Впервые показано, что сортовая и видовая устойчивость к патогенам у растений рода Solanum коррелирует с устойчивостью растений в условиях tn vitro к гидролитическим ферментам микроорганизмов. Эта корреляция сохраняется также и на клеточном уровне. Предложена нетрадиционная система создания форм картофеля с комплексной устойчивостью к патогенам на основе использования в качестве единственного селективного фактора гидролитических ферментов микроорганизмов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Полученные трансгенные клеточные линии S.vernel и S. stoloniierum о маркерными генами nptll и gas . являются ценными донорами генов устойчивости для картофеля и могут Сыть использованы для повышения устойчивости сортов картофеля к патогенам.

Пластомные мутанты картофеля, выделенные у с. Янтарный, могут служить хорошей основой для улучшения этого сорта путем введения в его геном ценных генов. Предложенная селективная система с использованием в качестве селективного фактора гидролитических ферментов микроорганизмов позволяет получать формы картофеля с комплексной устойчивостью к различным патогенам. Среди регенератов, устойчивых к гидролитическим ферментам, выделены формы, устойчивые к черной ножке, кольцевой гнили и к начальной фазе развития фитофторо-за. ...

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследований доложены на : конференции "Современные проблемы генетики и селекции сельскохозяйственных растений 22-26 апреля 1991г., г.Одесса; 0 Международном Симпозиуме по протопластам растений, 16-20 июня 1991г., г. Уписала, Швеция; Всесоюзной'конференции "Достижения биотехнологии агропромышленному комплексу"т 14-18 октября 1991г., г.Черновцы и на I Всесоюзном Симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений", 20-22. ноября 1991 г., г. Пущинб.

ПУЕЛИКАОДИ. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, одна из которых за рубежом.

СТРУКТУРА И .ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 200 наименований, из них 118 на иностранном языке. Работа содержит 25 рисунков и 18 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объекты исследования. В экспериментах были использованы дикие вида рода Solanum, устойчивые к различным заболеваниям, семена которых были получены из коллекции ВИРа: Solanum vernel Bitt. et Wittn. (K-2488), S. demlssum Lindl. -(K-7412), S. mlcrodontum Bltt. (K-9180), S. polladenium Greenra. (K-T422) и S. stoloniferum Bitt. (K-3360), а также сорта S.. tuberosum - Янтарный, Домодедовский, Невский, Зарево, Изобилие и Гатчинский, выращиваемые в асептических условиях в коллекции лаборатории безвирусных культур ВНИИСБ.

Бактериальные штаммы.В эспериментах по трансформации использовали следующие штаммы Agrobacterlum tumefaclens:

A28I - сильновирулентный необезоруженный, в который методом прямой трансформации Гартелем (Гартель и др., 1990) была перенесена плазмида рВП21, любезно предоставленная доктором Джефферсоном (Plant Breeding Institute, Англия). Эта плазмида содержит гены прШ и gas Е. coli под промоторами, соответственно, нопалинсинте-тазы и гена 35S РНК ВМЦК (Jefferson et al., 198Т), что обусловливает..устойчивость трансформированных клеток к канамицину и наличие в них бета-глюкуронидазной активности.

LBA4404 - обезоруженный штамм, содержащий бинарный вектор pBII2I, также любезно предоставленный доктором Джефферсоном.

pGV2206 - "shooty" - мутант А. tumefaclens, полученный на основе плазмида pTIB6S3 путем интеграционного мутагенеза с замещением генов синтеза ауксинов Т-ДНК последовательностью плазмида pGVII06, -содержащей бактериальный ген устойчивости к канамицину прШ (Leemans et al.,- 1981).

Культура in vitro картофеля и диких видов Solanum. Каллус индуцировали на листовых эксплантах, а интенсивность каллусообра-зования оценивали, по 5- бальной шкале, в зависимости от. объема

каллуса и занятой им площади листа. Клеточную суспензию получали и культивировали на жидкой среде МО с 7 мг/л 2,4-Д.

Введение в клетки диких видов Solanum генов nptll и киз. Листовые диски S. vernei и S.atoloniierum инфицировали штаммами A28I и LBA4404 A.tumefaclens и выращивали по модифицированной методике Блока (Block, 1988). Трансгенную природу полученных каллусов определяли флюориметрическим количественным тестированием бета-глюку-ронидазной активности по Джефферсону (Jeiierson et al., 1987).

Получение трансгенных растений картофеля с агробактериальным геном биосинтеза цитокининов. Листовые диски растений разных сортов картофеля, а также дикого вида S. vernei инфицировали штаммом A. tumefaciens pGV2206. Выращивали экспланты на агаризованной среде МС, содержащей либо 2 мг/л 2,4-Д, либо 2 мг/л 2,4-Д + 0,5 мг/л БАП. После появления первых признаков образования каллусов экспланты переносили для индукции морфогенеза на безгормональную среду того же состава, но содержащую 500 мг/л клафорана.

Изолирование и культивирование протопластов. Протопласты изолировали из каллусной ткани по описанной ранее методике (Аветисов и др., 1987) и культивировали в среде SW (Сидоров и др., 1985) в 40 мкл каплях при плотности высева 2-4 х Ю3 протопластов в I мл среды. В каждом варианте опыта высевали по 10 капель среды с протопластами и анализировали не менее 1000 протопластов.

Мутагенная обработка каллуса Каллусы с небольшими зачатками регзнврантов обрабатывали 8 мМ раствором ШМ в течение I часа при температуре 25°С. Затем каллусы отмывали жидкой средой МС и высевали на морфогенную агаризованную среду.

Изучение влияния гидролитических ферментов. В экспериментах использовали коммерческие препараты пектиназ и целлкшаз,с помощью которых обычйо изолировали протопласты. Ферменты в различных концентрациях вносили в кидкие питательные среды (для суспензионных клеток и изолированных протопластов) или в остуженную до 40° агаризованную среду (для растений и листовых эксплантов). Жизнеспособность протопластов и клеточной суспензии определяли с помощью, раствора синьки Эванса, 'соответственно, в 0,5М манните или воде (1:1000). Анализ процесса каллусогенеза проводили через 3 недели выращивания эксплантов в темноте при температуре 25°. Влияние ферментов на рост пассируемой ткани определяли по изменении енрой массы ткани в течение второго пассака.

Измереще замедленной флуоресценции хлорофилла. В экспресс-скрининге, основанном на реакции замедленной флуоресценции хлорофилла (Маторин и др., 1985; Brzostowicz, 1990), проводили отбор регенерантов, устойчивых к пектолитическим ферментам. Для этого в 10%-ный раствор Мацерозима помещали на I час при температуре 30°С листочки испытуемых образцов. Затем измеряли в них реакцию замедленной флюоресценции хлорофилла с помощью установки, работающей на базе фосфороскопа.

Определение устойчивости регенерантов к болезням было проведено по методикам, разработанным в НШКХ (Методические указания НШКХ, 1980).

Определение активности ингибиторов пектиназ было проведено в лаборатории иммунитета Института биохимии им. А.Н.Баха РАН. Из корневых и стеблевых тканей регенерантов выделяли препарат клеточ-шх стенок, который экстрагировали IN NaCl. Экстракты высаживалй с сернокислым аммонием до 90% насыщения. Осадок растворяли в воде и получали раствор, содержащий белок клеточных стенок. Для определения активности полигалактуроназы (ПГ) использовали метод "cap-plate" (Dingle et al.,1953) на чашках Петри с пектинсодержащей агаризованной средой, активность пектинлиазы (ПЛ) определял! спектрофотометрическим методом. Об ингибирущей активности белковых препаратов судили по уменьшению диаметра ( в мм) зоны разрушения пектина вокруг лунки после проявления рутениевым красным или по изменению оптической плотности (в условных ед.).

Определение содержания эндогенных фитогормонов проводили в лаборатории экспрессии генома растений Института физиологии расте-• ний им,К.А.Тимирязева РАН иммунохимическим методом (Seller et al., ■ 1976).

Ультраструктурное и анатомическое изучение регенерантов. Для электронно-микроскопического и - анатомического исследования листовой ткани готовили препараты из одних и тех же участков листовой пластинки по общепринятой методике (Электронномикроскопические методы исследования биологических объектов, 1963). Для исследования в световом микроскопе использовали полутонкие срезы.

Статистическая обработка. Данные проведенных исследований обработаны статистичекими методами по Плохинскому (1967).

-7--

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I.Получение трансгенных клеточных линий диких видов Solanum.

1.1. Культура In vitro диких видов Solanum. Скорость образования каллуса на листовых эксплантах разных видов Solanum зависела как от генотипа, так и от состава среды. У S. demlssum время появления ■ каллуса на эксплантах не зависело от состава среды. Для эксплантов S. mlcrodontum оптимальной средой, индуцирующей образование каллуса, оказалась среда, содержащая 2 мг/л 2,4-Д и 0,1 мг/л БАЛ. У S. polladenlum несколько Солее эффективно образовывался каллус на среде, содержащей 2 мг/л НУК и ОД мг/л БАП. У эксплантов S. vernel на среде с 2,4-Д каллус образовывался очень плохо. В то же время экспланты большинства сортов S. tuberosum хорошо образовывали каллус на средах, содержащих до 7 мг/л 2,4-Д ( Аветисов, Мелик- Саркисов, 1985). Возможно, что такие различия в чувствительности к 2,4-Д клеток листьев S. vernel и культурных сортов S. tuberosum: можно будет использовать при соматической гибридизации этих видов.

В каллусах S. demlssum и S. poliadenium на морфогенннх средах были получены регенеранты. Причем, процесс регенерации зависел как от состава морфогенной среда, так и от состава среды для каллусо-генеза. У S. vernel и S. mlcrodontum не удалось получить регенерацию ни на одной из испытанных сред.

1.2. Введение в геном -диких видов Solanum маркерных генов nptll и p^ia. Методом трансформации на листовых дисках с помощью штаммов A28I и IBA4404 A. tumeiaciens, несущих гены nptll и gus, были получены клеточные клоны S. vernel и S. stolonlferum, способные расти на средах, содержащих до 200 мг/л канамицииа. Трансгенная природа полученных каллусов была показана при измерении активности GUS в их клетках, которая достигала 5000- 6000 ед. Стимулирующий каллусообразование и рост каллуса эффект был гораздо менее выражен при'инфицировании обезоруженным штаммом LBA4404, чем необезоружек -ним A28I (рис.1). Трансгенный каллус S. vernel был способен расти, примерно с одинаковой скоростью при различных концентрациях квна-мицина в среде (от 50 до 200 мг/л), причем даже несколько лучше, чем на среде без канамицина. Он также рос на безгормональной бреде, в то время как контрольный каллус на среде с канамицином и на безгормональной среде нэ растет (рис.2). Т^ким образом, при транс-

A28I

К ' A2SI LBA44Q4

Рис.I Прирост трансгенннх калусов Э. уегпе! и 8. вЬо-1оп11егшп на среде с 7 мг/л 2,4-Д (37 сутки культивирования ).

[¡¿23 - й. ■ уегпе! ВШ. - Б. з1о1оп1Гегш'

"1

Л

О 50 100 200 100 50 7 7 7 7-0 О

Рис.2 Прирост трансгенного каллуса Б. уегпе1 на средах с различным содержанием канамици-на и 2,4-Д (37 сутки культивирования ).

¿-концентрация канамицина,мг/л ¿¿-концентрация 2,4-Д, мг/л

- трансгенный каллус;

- контрольный каллус

формации штаммами A28I и IBA4404 А. tumefaclens получены марке! •нне устойчивые к канамицину и с Оета-глюкуронидазной активность клеточше линии S. verrisl и S. stolonilerum.

2. Создание трансгенных форм картофеля с агроСактериальным геном биосинтеза цитокининов. Контрольные и инфицированные. штаммом А. 1;итеГас1епз рСУ22С листовые экспланты 5. ШЬегозш сортов Янтарный, Зарево, НеЕ

К

ский, Изобилие и S. vernei, как правило, на среде с 2 мг/л 2,4-Д + 0,5 мг/л БАЛ раньше начинали образовывать каллус, чем на среде без БАЛ. При этом каллусы, образовавшиеся на среде с БАП, гораздо раньше регенерировали побеги на безгормональной среде, чем каллусы, образовавшиеся на среде, содержащей только 2,4-Д (табл. I). Резко уменьшается время, необходимое для регенерации побегов, в каллусах, полученных на инфицированных эксплпнтах. У S. vernei регенерировать побеги удалось на безгормональной среде лишь в каллусе, полученном на среде с БАП из инфицированных эксгогантов.

■ Морфогенную реакцию, показателями которой были число эксплан-тов с побегами и число регенерантов на одном экспланте, значительно усиливало инфицирование эксплантов агробактерией (табл. 2). Однако, стимуляция морфогенных процессов у каллусов, образовавшихся на инфицированных эксплантах, не была связана с контаминацией их агробактериями, что было показано высевом на бактериальную среду yTG гомогенизированной ткани регенерантов. Присутствие БАЛ в среде для каллусогенеза на этих показателях отразилось очень слабо.

Полученные из инфицированных эксплантов регенеранты различных сортов картофеля резко отличались по своим морфологическим характеристикам. Большинство регенерантов сортов Невский, Изобилие, Зарево по морфологии мало отличались от контрольных регенерантов и в зависимости от сорта 28-68% их нормально укоренялись. Регенеранты же сорта Янтарный и S. vernei не образовывали корней и имели сильные морфологические- отклонения, характерные для так называемого shooty - фенотипа: наблюдались нарушение апикального доминирования и кущение побегов, редукция листовой пластинки, сближение междоузлий, карликовость.

Среди первичннх регенерантов S. vernei, полученных на инфицированных эксплантах», был выделен регенервнт N2 с нормальной морфологией и способный укореняться на среда с 0,1 мг/л ИМК.

Shooty-регенеранты обоих видов характеризовались нарушениями анатомического строения листа и гораздо более крупными мезофилыты-ми клетками, содержащими очень небольшое число хлороплпстов. Уро-. вень эндогенных цитокининов был гораздо выше, чом в контроле (табл. 3), что служит четким доказательством интеграции в их ядерный геном и экспрессии агробактериального генл 4, отвечающего за биосинтез цитокининов."

Таблица I.

Влияние ВАЛ в среде для индукции каллуса и инфицирования эксплантов картофеля суспензией А. ШпеГас1епз рСУ2206 на последующую индукцию побегов на безгормональной среде.

Вид и сорт картофеля Время появления побегов •сутки)

Контроль pGV2206 Контроль PGV2206 II

S. tuberoзш

сорт Янтарный 37 27 47 35

Невский 40 25 50 29

• Изобилие 43 22 '50

Зарево ■ ■ - 50 -

S. vernei - 29 - -

I - каллус получали на среде,содержащей 2 мг/л 2,4-Д и 0,5мг/л ВАЛ; II- каллус получали на среде,содержащей 2 мг/л 2,4-Д.

Сравнение уровня эндогенных цитокининов в клонах Й 2 (нормальная морфология) и * 8 (з1юо1;у-фенотип) Б. 7егпе1 показывает, что превышение уровня эндогенных цитокининов более, чем в 4 раза, ведет к формированию зЬоогу-фенотипа. Характерный з1гоо1у-фенотип сохранялся у вторичных регенерантов, полученных из тканей вЛоогу-форм и из изолированных из них протопластов на безгормональной среде, что говорит о стабильной экспрессии гена 4 при прохождении через стадию недифференцированного роста и возможности использования еЬоойу-форм в качестве маркеров в работе с изолированными протопластами. .

Таким образом, в результате проведенных экспериментов была создана коллекция форм картофеля, различающихся по содержанию эндогенных цитокининов и являющихся хорошими маркерами в экспериментах по клеточной инженерии, которую можно также использовать для изучения влияния цитокининов на самые различные процессы жизнедеятельности растений картофеля. Эти формы, в частности, уже используются для изучения влияния цитокининов на экспрессию хлоро-пластных генов в лаборатории экспрессии генома Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН.

ТаОлица 2.

Влияние БАЛ в среде для индукции каллуса и инфицирования эксплантов картофеля суспензией А. гите!ас1епз рСУ220б на морфогенные процессы на безгормональной среде.

Вид и сорт . картофеля Контроль pGV2206 Контроль ' ■ " PGV2206 II

1 2 1 .2 1 2 1 2,

S. tuberosum сорт Янтарный 33,3± ¿9,4 1 70,0± ±9,1 6 16,6± ±5,0 1 57,1± ±9,9 8

Невский 33,3± ±9,4 1 70,0± ±9,1 4 14,3± ±7,0 1 50,0± ±10,0 2

Изобилие 20,0± ±8,1 1 •66,6± ±9,4 2 11,1± ±6,2 • 1

Зарево 0 0 14,3± ±6,9 1 0 0 0 0

S. verne 1 0 0 23,0± 2

Примечания:

I - каллус получали,на среде.содержащей 2мг/л 2,4-Д и 0,5мг/л БАЛ; II- каллус получали на среде,содержащей 2мг/л 2,4-Д;

1 - число эксплантов с'побегами (%);

2 - число побегов на одном экспланте-. •

3. Получение и анализ хлорофиллдефектных мутантов. Через две недели после обработки ИМ каллуса сорта Янтарный на нем появились вполне сформировавшиеся регенеранты, почти 50% из которых составляли хлорофиллдефектные фермы и, примерно, 15% с различными морфологическими отклонениями.

После ряда черенкований среди дефектных по хлорофиллу форм были выделены 3 формы, стабильно сохраняющие свой фенотип: Б-1 и Е-Ю светло-желтой и 3-50 желтой окраски. Форш Б-1 и Б-10 имели одинаковую окраску листьев в течение всего периода роста, в то время как у формы 3-50 наблюдалось изменение окраски листьев по мере их старения от зеленоватой до желтой, в результате деградации

Таблица 3,

Содержашк зеатша в контрольных и трансформированных растениях S. tuberosum (сорт Янтарный) и S. vernel.

Вид, Клоны Фенотип Содержание зеатина

сорт J6» (пм/г сырого веса) отношение к контролю

S. vernel контроль норм. 36 • 1,0

J62 норм. ' 130 3,6

N3 "shooty" 265 7,3

N5 "shooty" 243 6,8

N6 "shooty" 179 5,0

NT "shooty" 205 5,7

N8 "shooty" 174 4,8

S.tuberosum контроль норм. 64 1,0

с.Янтарный N11 "shooty" • 704 11,0

N12 "shooty" 456 7,1

N13 "shooty" 610 9,5

NU "shooty" 603 9,4

хлорофилла под действием света. Возможно, что у полученной нами формы 3-50 дефектен белок, защищающий хлорофилл от деградации, как это имело место у пластомных мутантов табака, описанных Веттштей-ном и Эриксодом (Wettstein, Eriksson, 1963).

У всех трех выделенных нами форм иногда наблюдали на листьях появление небольших участков зеленых тканей. Анейшз хлорофиллде-фектных тканей мутантов с помощью методов культуры ткани показал, что регенеранты, полученные из таких тканей и из изолированных из них протопластов, повторяли окраску ткани, из которой они возникли.. Однако, изредка возникали нормальные по окраске регенеранты. Это- свидетельствует о наличии в хлорофиллдефектной ткани также клеток, содержащих нормальные пластида, что подтверждается данными влектронномикроскопического анализа мутанта Б-I и говорит о плас-томной природе полученных мутантов.

Таким образом, у сорта Янтарный, были выделены три-генетически

маркированнне по цитоплазма линии, представляющие сооой ценный материал для получения сортов картофеля с замещенной цитоплазмой.

4. Выделение форм картофеля, устойчивых к гидролитическим

ферментам.

Предполагалось , что пектолитические ферменты микроорганизмов возможно удастся использовать в качестве селективного фактора в клеточной селекции на устойчивость к патогенам, так как ткани, состоящие из клеток, устойчивых к пехтолитическим ферментам, долзйш представлять собой более сложное препятствие для проникновения в них возбудителей болезни (Аветисов, Мелик-Саркисов, 1388). В связи с этим наш было изучено влияние гидролитических ферментов на интактные растения, ткани, клетки и изолированные протопласты картофеля. ■

Влияние на интактные растения пектолитических ферментов было обнаружено лишь при использовании довольно высоких их концентраций - 5 и 10 мг/мл. Растения сорта Янтарный на среде, содержащей 10 мг/мл мацерозима, были развиты слабее, чем в контроле и лишь 25% из них были способны образовывать небольшие корни. Растения же сорта Изобилие, отличающегося слабой устойчивостью ко многим заболеваниям, на этой среде вообще не укоренялись и были в два раза меньше контрольных по высоте. В то же время на этой же среде все. растения S. vernei, вида устойчивого ко многим заболеваниям, образовывали довольно хорошо развитые корни и лишь незначительно отставали в росте от контроля. Таким образом, была отмечена определенная корреляция между устойчивостью растений к гидролитическим ферментам в условиях in vitro и их общей устойчивостью к заболеваниям.

Процесс каллусообразования на листовых эксплантах оказался более чувствительным к действию ферментов, чем процессы укорена-ния и роста черенков и в значительной степени ингибировался уже при содержании в среде 600 мкг/мл ферментов (табл. 4), причем, большее повреждающее действие ферменты оказывали на дигаплоидные ткани (дигаплоид с. Гатчинский) по сравнению с тетраплоидными (с. Гатчинский).

Пассируемая каллусная ткань оказалась еще более чувствительной к ферментам, чем листовая. Присутствие в среде всего 70 мкг/мл ферментов снижало в 2,5 раза по сравнению с контролем прирост

Таблица 4.

Влияние гидролитических ферментов на каллуссообра-зование у листовых эксплантов сорта Домодедовский.

Вариант Площадь листа, Высота-каллуса

опыта занятая каллусом (%) (мм)

Контроль 90 5

I 80 3

II 70 3

III 30 I

Примечание:

1-50 мкг целюлизина + 20 мкг мацерозима + 5 мкг дрейселазы;

II - 200 мкг целюлизина + 80 мкг мацерозима + 20 мкг дрейселазы; III - 400 мкг целюлизина + 160' мкг мацерозима + 40 мкг дрейселазы в I мл питательной среды.

сырой массы каллусной ткани 2 пассажа сорта Домодедовский, росшей на среде с V мг/л 2,4-Д. В опытах с суспензионной культурой клетки S. stoloniíerum и культурного картофеля сорта Изобилие выращивали в присутствии пектиназного фермента мацерозима, взятого в концентрациях 25-400 мкг/мл. Культивируемые In vitro клетки дикого, устойчивого к заболеваниям, вида S. stoloniíerum оказались, как правило, более устойчивыми и к действию пектиназ, чем клетки сорта Изобилие, подверженного многим заболеваниям '(рис. 3).

В экспериментах на изолированных протопластах было .показано, что чувствительность' образующихся из них кле.ток к пектолитическим ферментам зависит от условий, в которых <ie novo синтезировалась кле,точная стенка: Изолированные протопласты нечувствительны к пектиназам и могут в их присутствии синтезировать клеточную стенку, формировать клеточные колонии и каллусы, которые нечувствительны к пектиназам. Клетки же, образовавшиеся из протопластов на среде без пектиназ оказываются чувствительными к ним (табл. 5).

Каллусы, полученные уа средах с пектиназами и устойчивые к ним, были неспособны регенерировать побеги. На морфогенных .средах они некротизировались и погибали. Поэтому в дальнейшем ферменты вводили в среду лишь на стадии, когда в каллусе уже имелись небольшие (1-2 мм в высоту) зачатки рэгенерантов. В результате, на

О 25 ' 100 400

Концентрация мацерозима, мкг/мл Рис. 3. Влияние мацерозима на жизнеспособность клеточных агрегатов 8.з1;о1оп1Гегшп (ЦЭ и с.Изобилие [£<д.

• ,Таблица 5.

Влияние мацерозима на изолированные протопласты Б. з1о1оп11егш). (состояние на 10-е сутки культивирования).

Вариант Клетки,% Протопласты,%

живые мертвые делящиеся живые мертвые

К 59,0±2,2 20Д±0,8 6,2-1,1 II,4-1,3 4,6±0,9

I 70,2±2,0 15,4*1,6 0 П,2±1,3 4,3±0,9

2 39,1+-2,2 41,6-2,2 0 14,5±1,6 6,1±1Д

Примечание:

К - протопласты культивировали на среде без мацерозима;

1 - протопласты культивировали на среде с 100 мкг/мл мацерозима;

2 - мацерозим (100 мкгЛал) добавлен в среду на 5-ые сутки культи-

вирования протопластов

Таблица 6.

Активность ингибиторов пектиназ у родительского сорта Янтарный и выделенных из него мутантов *6, 10.

Фермент и его ингибитор Активность Ш1 (отн.ед.) Активность ПГ(мм)

ПЛ V. üahlíae 1,350

ПГ V. dahliae 18 - 19

. ф-т + ингибитор J6I 1,250 17 - 18

+ -"- Л2 1,000 13 - 14

+ -"- . JK3 1,350 15 - 16

Примечание: белковый ингибитор из: XI - корней с.Янтарный;

Ш - корней мутанта №6; Хй - корней мутанта МО.

среде, содержащей ферменты, из каллуса картофеля сорта Невский была получено 23 регенеранта, из которых лишь один оказался нормальной зеленой окраски, два светло-зеленой, остальные - с выраженной хлоротичной окраской.

Формы с нормальной морфологией и окраской, полученные в наших экспериментах с применением мутагенной обработки каллусов и без нее, были исследованы на устойчивость к пектиназе с помощью экспресс-скрининга, основанного на реакции замедленной флуоресценции хлорофилла (Маторин и др., 1985). В результате были отобраны регв-неранты с предполагаемой повышенной устойчивостью к пектолитичес-ким ферментам. Среди них два, * 6 и Л 10, с наибольшей устойчивостью к пектиназам, .хорошо укоренялись и росли на средах, содержащих 10 мг/мл мацерозима, в отличие от родительского сорта Янтарный, растения которого на среде с 10 мг/мл мацерозима очень слабо укоренялись. Высокая устойчивость этих форм к пектиназам объясняется повышенной активностью ингибиторов пектинлиазы и далкгалакту-роназы в их корнях (табл. 6). ' •

Высокоустойчивые к пектиназам формы 6 иЛО характеризовались также комплексной устойчивостью к таким заболеваниям, как черная ножка и кольцевая гниль, возбудители которых продуцируют большие количества пектслитических ферментов, а также, к начальным

этапам заболевания фитофторозом. Таким образом, подтвердилось наше предположение, что формы, устойчивые к гидролитическим ферментам могут обладать комплексной устойчивостью к разным патогенам.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В задачу настоящего исследования входило создание различных генетически маркированных клеточных линий и форм картофеля, которые могут служить хороним экспериментальным материалом как для фундаментальных, так и для чисто прикладных исследований. В работе были получены трансгенные клеточные линии S.stolonlferum и S.vernei генетически маркированные по генам nptll и gus и способные расти на средах, содержащих до 200 мкг/мл канамицина. Полученные линии могут быть в дальнейшем использованы, для передачи в геном сортов культурного картофеля генов устойчивости к фитопатогенам, в частности, к такому опасному заболеванию как фитофтороз, устойчивостью к которому обладают S.vernei и S.stoloniierum.

У с. Янтарный было выделено 3 пластбмных мутанта, которые могут служить хорошей основой для улучшения этого сорта путем вовлечения в его геном методами клеточной-инженерии ценных генов устойчивости от диких сородичей картофеля. Была получена коллекция трансгенных форм картофеля с. Янтарный и S.vernei, несущих агро-бактериальный ген биосинтеза цитокининов и различающихся по содержанию эндогенных цитокининов. Была показана способность трансформированных тканей картофеля, несущих'ген 4, регенерировать с очень высокой эффективностью побеги на безгормональной среде. Это свойство, одновременно со специфическим shooty-фенотипом форм, характеризующихся высоким содержанием эндогенных цитокининов, служит четким маркерным признаком, который можно использовать в клеточной инженерии картофеля. В то ке время, полученные нами трансгенныа формы картофеля с различным уровнем эндогенных цитокининов уже используются в фундаментальных исследованиях, например, в экспериментах по изучению влияния цитокининов на функции хлоропластных генов, проводимых в Институте физиологии растений РАН.

Особый интерес представляют эксперименты с гидролитическими ферментами микроорганизмов, в которых нам удалось показать возможность получения форм картофеля, устойчивых к этим ферментам, а также определенную корреляцию между видовой и сортовой устойчивостью растений картофеля к патогенам и их устойчивостью к гидро-

литическим ферментам б условиях In vitro. Причем, корреляция, обнаруженная на уровне растений, сохраняется _и на клеточном уровне. Результаты, полученные в работе, подтвердили высказанное ранее предположение (Аветисов, Мелик-Саркисов, 1988) о том, что устойчивые к гидролитическим ферментам растения должны обладать большей устойчивостью к фитопатогенам. Полученные наш устойчивые к гидролитическим ферментам формы картофеля с.Янтарный характеризовались также комплексной устойчивостью к черной ножке и кольцевой гнили, а тага,о были более устойчивыми к фитофторозу на начальной стадии развития этой болезни.

Таким образом, в результате проведения данной работы были получены различные генетичэски маркированные формы и клеточные клоны картофеля и диких видев Solanum, которые могут быть использованы в биотехнологии картофеля для улучшения его сортов и в фундаментальных исследованиях.

ВЫВОДЫ

1. Изучены процессы каллусо и морфогенеза в культуре In vitro у некоторых диких видов рода Solanum и получены трансгенные клеточные линии S.vernel и S.stoloniierum с маркерными генами nptll и gus.

2. В результате введения агробактериального гена биосинтеза цитокининов получены трансгенные растения-регенеранты с повышенным содержанием эндогенных цитокининов у разных сортов S.tuberosum, а также у вида S.vernel и создана коллекция форм картофеля с. Янтарный и S.vernel, различающихся'по эндогенному содержанию цитокининов. _ . '

3. Выявлено, что ткани растений картофеля с повышенным уровнем 'эндогенных цитокининов обладают гораздо более высоким регене-рационным потенциалом и способны эффективно регенерировать побей на безгормональной среде. . '

4. Показано, что, гормональный состав среда для каллусогенезг влияет на последующие регенерационные процессы в каллусе картофеля.. '

5. Получены и изучены пластомные мутанты картофеля с.Янтарны! являющиеся удобными реципиентами для введения в его геном. ценньн цптоплязматических генов.

6. Показано, что сортовая и видовая устойчивость.кпатогена!.

в роде Solanum в определенной степени коррелирует с устойчивостью растений в условиях in vitro к гидролитическим ферментам .микроорганизмов, которая сохраняется также и на клеточном уровне.

7. На основе использования гидролитических ферментов микроорганизмов в качестве селективного фактора разработана новая селективная система для получения маркерных форм картофеля, устойчивых к гидролитическим ферментам, которые характеризовались также комплексной устойчивостью к фитопатогенам.

8. Полученные в работе различные генетически маркированное формы и клеточные клоны картофеля и диких видов Solanum могут быть использованы для улучшения сортов картофеля и в фундаментальных исследованиях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Давыдова Ю.В. Использование химического мутагенеза и генетической трансформации в создании маркерных форм для соматической гибридизации картофеля Тез. докл. Всес. Конф. "Современные-проблемы генетики и селекции сельскохозяйственных растений". Одесса, 1991, С.125-126.

2. Давыдова Ю.В., Аветисов В.А., Мелик-Саркисов О.С. Создание трансгенных форм диких видов картофеля для использования в соматической гибридиз^ации Тез. докладов Всес. Конф. "Достижения биотехнологии агропромышленному комплексу". 14-18 октября 1991, Черновцы, т.1, С.51.

3. Аветисов В.А., Стефанович A.M., Давыдова Ю.В., Мелик-Саркисов О.С. Использование sftooty-мутанта Agrobacterium tumeia-ciens для повышения регенерационной активности эксплантов картофеля в культуре in-vitro Биотехнология. 1991, N6, С. 19-22.

4. Мелик-Саркисов О.С., Давыдова J0.B., Аветисов В.А. Созда-' ние маркированных по различным признакам партнеров для соматической гибридизации картофеля Тез. I Всес. Симп. "Новые методы биотехнологии растений". Пущино, 20-22 ноября 1991, С.28-29.

5. Давыдова Ю.В., Мелик-Саркисов О.С., Аветисов В.А., Процен-ко М.А. Получение клонов картофеля с повышенной резистентностью к грибной инфекции Тез. I Всес. Симп. "Новые методы биотехнологии растений". Пущино, 20-22 ноября 1991, С. 60.

6. Avetisov V.A., Davidova Y.V., Mellk-Sarklaov O.S. The pro-

ductlon of marker forms for potato somatic hybridization and their protoplasts culture. Physlologla Flantarum, 1991, V.82, N1, P. A9.

7. Аветисов В.А., Давыдова Ю.В., Мелик-Саркисов O.C., Процента М.А. Получение резистентных к гидролитическим ферментам клеточных клонов и регенерантов картофеля с повышенной устойчивостью к фитофторозу Биотехнология. 1992, N1, С. 18-22.

8. Давыдова Ю.В., Аветисов В.А., Мелик-Саркисов О.С. Создание маркерных устойчивых к канамицину клеточных линий диких видов картофиля Цитология и генетика. 1993, Т. 27, К 2, С. 18-22.