Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Систематика актиномицетов рода Kribbella
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Систематика актиномицетов рода Kribbella"
На правах рукописи
АВТУХ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ
СИСТЕМАТИКА АКТИНОМИЦЕТОВ РОДА КШВВЕЫЛ
03.02.03 Микробиология
005045812
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
1 л ({ЮН 2012
Пущино-2012
005045812
Работа выполнена в отделе «Всероссийская коллекция ■ микроорганизмов» Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.
Научный руководитель:
Научный консультант:
Официальные оппоненты:
Ведущая организация:
доктор биологических наук Евтушенко Людмила Ивановна
доктор химических наук Шашков Александр Степанович ФГБУН Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН
Лысак Людмила Вячеславовна
доктор биологических наук
ФГОУ ВПО «Московский государственный
университет им. М.В. Ломоносова», Факультет
почвоведения, кафедра биологии почв, доцент
Капаруллина Елена Николаевна кандидат биологических наук ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, лаборатория радиоактивных изотопов, научный сотрудник
ФГБУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе» РАМН
Защита состоится «29» июня 2012 г. в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., проспект Науки, д. 5.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.
Автореферат размещён на сайтах http://vak.ed.gov.ru/ и http://www.ibpm.ru/. Автореферат разослан « » мая 2012 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук
Доронина Н.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Представители порядка Actinomycetales (Stackebrandt et al. 1997) выделяются среди других прокариот высоким содержанием ГЦ-пар в ДНК (более 50%), сложной организацией и большими размерами генома (до 12 млн. п.н.), разнообразием морфологии клеток и жизненных циклов, химического состава клеточной оболочки (Goodfellow et al., 1984; Gao & Gupta, 2012). Актиномицеты превосходят другие группы микроорганизмов по способности синтезировать биологические активные соединения (Anderson & Wellington, 2001). Вместе с тем, значительная часть этих уникальных бактерий с высоким биотехнологическим потенциалом остается неизученной или слабо исследованной в таксономическом аспекте.
К одной из таких групп относится род Kribbella Park et al., 1999 emend. Sohn et al. 2003, который в настоящее время включает 17 видов (www.bacterio.cict.fr). Согласно описанию, представители рода образуют фрагментирующийся вегетативный и воздушный мицелий, имеют тип I клеточной стенки (LL-диаминопимелиновая кислота, отсутствие дифференцирующих Сахаров), фосфолипиды типа Pill (фосфати-дилхолин в качестве диагностического компонента) и доминирующй менахинон МК-9(Н4). Особенностью рода Kribbella является высокое сходство видов по нук-леотидным последовательностям гена 16S рРНК (97,1-99,7/100%) (Kirbi et al, 2010; Cui et al., 2010; Xu et al., 2012). Этот факт и проблема разграничения близких ви-дов/геномовидов криббелл по традиционным фенотипическим признакам (общая для бактериальной систематики) являются одной из причин того, что система классификации организмов этого рода остается разработанной крайне слабо и не отражает их реального природного разнообразия.
Ключевую роль в развитии систематики актиномицетов в «домолекулярный» период сыграло изучение хемотаксономических признаков (структура пептидогли-кана, состав Сахаров клеточной стенки, тип менахинонов, фосфолипидов, жирных кислот) (Goodfellow, 1989). Отличия по этим признакам, наряду с обособленным филогенетическим положением организмов, являются определяющим фактором при обосновании выделения нового рода актиномицетов и в настоящее время (Stackebrandt, 2006). Результаты изучения тейхоевых кислот клеточных стенок актиномицетов показали огромное разнообразие этих биополимеров и возможность использования их структур и структурных компонентов для дифференциации видов и групп видов внутри рода (Naumova et al., 2001; Потехина, 2005). Структуры других типов анионных полимеров установлены у представителей отдельных групп и не исследованы в таксономическом аспекте.
Белки и пептиды клетки, регистрируемые методом масс-спектрометрии с мат-рично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ MC) - другая группа биомолекул, которая в последние годы успешно используется при идентификации и классификации бактерий, преимущественно патогенных (Welker & Moore, 2011). Имеющиеся в литературе данные о МАЛДИ масс-спектрах актиномицетов весьма фрагментарны.
Цель н задачи исследования. Целью настоящей работы являлось таксономическое изучение актиномицетов рода Kribbella.
В задачи исследования входило:
1. Формирование рабочей коллекции штаммов рода Kribbella.
2. Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16Б рРНК и %угВ и определение филогенетического положения организмов.
3. Изучение культурально-морфологических, физиолого-биохимических и хемо-таксономических признаков штаммов рабочей коллекции.
4. Определение состава гликополимеров клеточных стенок криббелл.
5. Анализ МАЛДИ масс-спектров представители рода КпЬЬеИа и выявление таксон-специфичных компонентов спектров.
6. Определение видового состава изученных штаммов на основе принципов полифазной такономии и характеристика новых видов рода КпЬЬеИа.
7. Оценка положения рода КпЬЬеИа в системе высших таксонов бактерий.
Научная новизна. Методами фазово-контрастной и электронной микроскопии
обнаружены ранее неизвестные для рода КпЬЬеИа репродуктивные формы (споран-гиеподобные структуры, состоящие из полиморфных клеток). В составе Сахаров клеточных стенок криббелл обнаружены мадуроза и рамноза, а также 2,3-ди-О-метил-а-галактоза, найденная у грамположительных бактерий впервые. Впервые у организмов рода КпЬЬеИа определён состав гликополимеров клеточной стенки. Обнаружены уникальные тейхулозоновые кислоты (с псевдаминовой кислотой в основной цепи), относящиеся к новому классу биогликанов, и новые структуры тейху-роновых кислот. Выявлены специфичные для криббелл фосфолипиды и компоненты МАЛДИ масс-спектров. Выявлено и охарактеризовано 10 новых видов и предложено дополненное описание рода КпЬЬеИа. Предложены новые семейства "КпЬЬеНасеае" и "АсЧпоро!утогрИасеае" в составе порядка "РгорютЬас1епа!ез", а также изменение границ семейства Ыосагс1Шс1асеае. Для новых и ревизованного семейств определены маркерные (сигнатурные) нуклеотиды гена 16Б рРНК; в описания семейств включены фенотипические характеристики.
Пра1сгическая значимость. Создана коллекция охарактеризованных штаммов рода КпЬЬеИа, выделенных из почв разных регионов России, которые доступны широкому кругу специалистов для дальнейших исследований. Таксономические предложения и полученные данные о нуклеотидных последовательностях генов 16Б рРНК и компонентах клеточных стенок, МАЛДИ масс-спектров и других фе-нотипических признаках представителей рода КпЬЬеИа способствуют усовершенствованию системы классификации бактерий, развитию экспресс-методов идентификации криббелл на уровне вида и могут быть полезны при решении ряда практических задач эко- и биотехнологии, а также вопросов, касающихся защиты интеллектуальной собственности на штаммы. Полученные результаты могут быть использованы для аннотации геномов, данных метагеномики и метапротеомики, при исследованиях в области биохимии и химии природных полимеров.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009); Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009 и 2010); Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010); Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, приложений. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы и 24 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 190 ссылок.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. В работе были исследованы 38 штаммов нокардио-формных актиномицетов, выделенных из образцов почв и лиственного опада различных районов РФ и сохраняемых в рабочем фонде Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ). Штаммы выращивали при 28°С в течение 3-5 суток на пептонно-дрожжевом агаре (ПДА) (г/л): пептон - 5, дрожжевой экстракт - 3, глюкоза - 5, дигидрофосфат калия - 0,2, агар - 15, рН = 7,2, поддерживали на ПДА при 4°С и сохраняли в лиофилизованом виде.
Культуральные и морфологические признаки определяли после инкубирования штаммов на ПДА и ISP-средах (Гаузе с соавт., 1983) в течение 3, 7 и 14 суток. Морфологические характеристики изучали с помощью фазово-контрастной и электронной микроскопии.
Физиолого-биохимические признаки определяли по стандартным методикам (Методы общей бактериологии под ред. Герхардта, 1984; Методы почвенной микробиологии, 1980; Methods in Microbiology, 2011).
Хемотаксономические признаки. Культуры для анализов выращивали на пеп-тонно-дрожжевой среде и собирали на логарифмической фазе роста. Биомассу отмывали и осаждали центрифугированием. Липиды и менахиноны экстрагировали по ранее описанной методике (Collins et al, 1977). Менахиноны разделяли методом ТСХ, анализировали с использованием ВЭЖХ и масс-спектромет-рии. Полярные липиды определяли методом двумерной ТСХ (Minnikin et al., 1979). Состав жирных кислот изучали с помощью газовой хроматографии (Евтушенко и Зеленкова, 1989). Изомеры диаминоаминопимелиновой кислоты в гидролизатах клеток определяли методом ТСХ (Staneck & Roberts, 1974). Клеточную стенку получали методом дифференциального центрифугирования из сырого мицелия, разрушенного ультразвуком (Стрешинская с соавт., 1979). Аминокислотный состав клеточной стенки определяли на аминокислотном анализаторе ("Hitachi", Япония) после гидролиза (6N НС1, 12 ч). Состав Сахаров в гидролизатах клеточных стенок анализировали методом бумажной хроматографии (Tul'skaya et al., 1991). Гликополимеры экстрагировали 10% ТХУ, выделяли методом гель-хроматографии и подвергали кислотному гидролизу. Состав полученных компонентов изучали методами препаративного электрофореза и бумажной хроматографии с использованием различных проявителей (Tul'skaya et al., 1991). Структуры гликополимеров определяли с использованием различных методов ЯМР-спектроскопии (Shashkov et al., 2001, 2009).
Для МАЛДИ масс-спектрометрии суспензию клеток в 50%-ном растворе ацето-нитрила, содержащего 2,5% ТФУ, обрабатывали ультразвуком (30 мин, 37°С) с рабочей частотой 35 кГц. В качестве матрицы использовали а-циано-4-гидрокси-
коричную кислоту в 50%-ном водном растворе ацетонитрила. Масс-спектры регистрировали на приборе Auto flex II ("Bruker", Германия) как описано (Plotnikova et al., 2011), и обрабатывали с использованием программ Flex analysis 2.2 и MALDI Biotyper 2.0 ("Bruker Daltonic", Германия).
Генотипические характеристики и филогенетический анализ. Содержание ГЦ-пар в ДНК определяли методом тепловой денатурации (Marmur & Doty, 1962). ДНК-типирование проводили методом мультиплексного ПЦР с использованием праймеров (5'-ACCGGATACGACAACCGATT-3' и 5'-GGGTCCGTAAGGGTCCTAT-3'), специфичных для родов Kribbella и Nocardioides (Cook & Meyers, 2003). Для амплификации фрагмента гена 16S рРНК использовали универсальные бактериальные прайме-ры 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и 1492r (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')-Фрагменты гена gyrB амплифицировали с использованием праймеров KgyrB-F953 (5'-CSGTGCACACBTTCGCGAACG-3') и KgyrB-R1892 (5'-CCSAGRCCCTTGWAGCGCTGG-3') (Kirby et al., 2010). Последовательности нуклеотидов определяли на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL ("Beckman Coulter", США) в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Филогенетический анализ и построение дендрограмм проводили с помощью программы MEGA 5 (Tamura et al., 2011). Уровни сходства нуклео-тидных последовательностей определяли с помощью алгоритмов на сервере EzTaxon (www.eztaxon.org; Chun et al., 2007).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Формирование коллекции
По результатам ДНК-типирования из 38 штаммов были отобраны 15 потенциальных представителей рода Kribbella (табл. 1), которые были охарактеризованы на филогенетическом и фенотипическом уровне.
Таблица 1. Источники выделения изученных штаммов
№ Номер штамма_Источник выделения_
1 ВКМ Ас-2500 Луговая почва, Мордовия
2 ВКМ Ас-2527 Каменистая почва, Северный Кавказ
3 ВКМ Ас-2538 Техногенная почва, п. Никель, Оренбургская обл.
4 ВКМ Ас-2539 Листва опада, г. Туапсе, Краснодарский край
5 ВКМ Ас-2540 Садовая почва, Мордовия
6 ВКМ Ас-2541 Погребенная почва, г. Волгоград
7 ВКМ Ас-2566 Почва, окрестность г. Воткинск, Удмуртия
8 ВКМ Ас-2568 Почва, пойма р. Оки, г. Пущино
9 ВКМ Ас-2569 Почва у ручья, п. Кизитажка, Оренбургская обл.
10 ВКМАс-2570 Луговая почва, Калужская обл.
11 ВКМАс-2571 Луговая почва, п. Третьяки, Воронежская обл.
12 ВКМ Ас-2572 Чернозем, Белгородская обл.
13 ВКМ Ас-2573 Луговая почва, Калужская обл.
14 ВКМАс-2574 Луговая почва, п. Третьяки, Воронежская обл.
15 ВКМАс-2575 Луговая почва, п. Третьяки, Воронежская обл.
2. Филогенетический анализ и генотипические признаки
Содержание ГЦ-пар в ДНК изученных штаммов составило 65-67 мол.%, что соответствует содержанию ГЦ-пар у описанных видов рода КпЬЬеИа.
Филогенетическое положение изученных штаммов на основе анализа гена 16S рРНК (около 1400 п.н.) представлено на рис. 1.
ВКМ Ас-2571
- Kribbella aluminasa HKI 0478т (EF126967) ВКМ Ас-2566 ВКМ Ас-2574
-ВКМ Ас-2570
- Kribbella swartbergensis НМС25Т (AY995147)
,— ВКМ Ас-2573 72 L ВКМ Ас-2540 ВКМ Ас-2569
-Kribbella jejuensls HD9T (AY253866)
-Kribbella so/ал/ DSA1T (AY2538S2)
Kribbella hippodromi S14T (EF472955) Kribbella kamonensis Q41T (AY995146) BKM Ac-2538
-Kribbella lupini LU14T (AJ811962)
BKM Ac-2572 -BKM Ae-2541
Kribbella sandramycini KAAC 20249T Kribbella yunnanensis YIM 30006T (AY082061)
- Kribbella sancticallisti BC6331 (AM778577)
— Kribbella antiblotica YIM 31530T (AY082063)
r— Kribbella ginsengisoli Gsoil 001т (AB245391)
59 i-Kribbella koreensis LM 161T (Y09159)
I- BKM Ac-2539
_Kribbella catacumbae BC631T (AM778574)
BKM Ac-2500 67 L BKM Ac-2568 - BKM Ac-2575
_Kribbella alba YIM 31075T (AY082062)
_Kribbella amoyensis XMU 19ST (HM368615)
- Kribbella flavlda IFO 14399T (AF005017)
— BKM Ac-2527
Рис. 1. Филогенетическое положение штаммов рода Kribbella на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК; группировка по методу «ближнего соседа)) ("neighbor-joining"). Масштаб - одна замена на каждые 100 нуклеотидов. Указаны значения статистической достоверности порядка ветвления для 1000 альтернативных деревьев (выше 50%). В качестве внешней группы использована нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК Streptomyces avermitilis Ма-4680т (ВА000030).
Уровни сходства изолятов с типовыми штаммами видов криббелл - от 97,01% (для ВКМ Ас-2527-К. jejuensis) до 99,70% (для ВКМ Ас-2540-A', hippodromi). Эти значения соответствуют показателям сходства между известными видами рода
7
КпЬЬеИа (97,1-99,7/100%). ВКМ Ас-2527 с уровнем сходства 97,0-98,3% по отношению ко всем включённым в филогенетический анализ организмам занимал обособленное положение при всех алгортимах построения деревьев. Штаммы ВКМ Ас-2566, ВКМ Ас-2569, ВКМ Ас-2571 и ВКМ Ас-2574 («группа ВКМ Ас-2566») имели идентичные последовательности. Другие пары наиболее близких изолятов имели 99,92% сходства (ВКМ Ас-2500 и ВКМ Ас-2568) и 99,72% (ВКМ Ас-2538 и ВКМ Ас-2572).
Филогенетическое положение изученных штаммов на основе анализа фрагмента гена %угВ (390 п.н., позиции 1010-1400) представлено на рис. 2.
fC'
ВКМ Ас-2500 ВКМ Ас-2568 ВКМ Ас-2539
Г~
Ё Kribbella catacumbae DSM 19601' (FJ917358) ■ribbella yunnanensis DSM 15499' (EU434815) ribbella sancticallisti DSM 196021 (FJ917357) Kribbella lupini DSM 16683' (EU434811) -Kribbella alba DSM 15500' (EU434820)
_ Kribbella koreensis CIP 108301' (EU434810) Kribbella ginsengisoli DSM 17941' (JF775846) —Kribbella flavlda CIP 107494' (gEU434809) —Kribbella amoyensis XMU 198' (JF520392)
В KM Ac-2538 BK M Ac-2572 В KM Ac-2569 В KM Ac-2566 ^HBKM Ac-2574 —Kribbella swartbergensis DSM 17345' (EU434808) В KM Ac-2540
Kribbella sandramycini DSM 15626' (EU434812)
£
г
С
_ ВКМ Ac-2573
I_Kribbella jejuensis CIP 108509' (EU434818)
r* Kribbella hippodromi DSM 19227' (EU434817) Г Г Kribbella solani CIP 108508' (EU434813) "^-Kribbella antibiotica DSM 15501' (EU434819) — В KM Ac-2570 —Kribbella aluminosa DSM 18824' (EU434807) L Kribbella karoonensis DSM 17344' (EU434816)
_Streptomyces avermitilis MA-4680' (BA000030)
Рис. 2. Филогенетическое положение штаммов рода Kribbella на основе анализа нуклеотадных последовательностей фрагмента (390 п.н.) гена gyrB\ группировка по методу «ближнего соседа» ("neighbor-joining"). Масштаб - десять замен на каждые 100 нукпеотидов. Указаны значения статистической достоверности порядка ветвления для 1000 альтернативных деревьев (выше 50%).
Показатели эволюционных расстояний между изученными штаммами и описанными видами рода Kribbella, равные 0,031-0,121 (87,6-96,1% сходства фрагмен-
тов гена gyrB), выше минимальных значений между близкими описанными видами: 0,008 (К. ginsengisoli-K. koreensis), 0,013 (К. solani-K. antibiotica) и 0,015 (К. solani-К. hippodromi). Значения расстояний между более удаленными известными видами -от 0,028 до 0,128. Минимальные показатели эволюционных расстояний между изученными штаммами, равные 0,008 и 0,018 (99,4 и 98,1% сходства фрагментов гена gyrB), выявлены для пар штаммов ВКМ Ac-2566-BKM Ас-2574 (100% сходства по гену 16S рРНК) и ВКМ Ac-2500-BKM Ас-2568 (99,9% сходства по гену 16S рРНК). Показатели расстояний между ВКМ Ас-2569 и штаммами ВКМ Ас-2566 и ВКМ Ас-2574-0,038 и 0,036.
3. Культурально-морфологические признаки
На всех ISP-средах цвет колоний изученных штаммов бесцветный или слегка желтоватый, растворимые пигменты отсутствовали. Колонии на ранних стадиях роста плотные или пастообразные, складчатые, иногда гладкие, матовые, обычно вросшие в агар. Белый воздушный мицелий образуется на ряде сред в течение 5-7 суток. Тонкие разветвлённые вегетативные и воздушные гифы слабо или интенсивно фрагментируются с возрастом на палочковидные неподвижные элементы (рис. За). Морфология изученных штаммов характерна для описанных видов криббелл.
Рис. 3. Морфология клеток штамма ВКМ Ас-2538. Световая (а, б) и электронная (в) микроскопия.
У ряда штаммов при росте на жидкой и агаризованных средах наблюдались клетки сферической и угловатой формы (рис. За). Штаммы ВКМ Ас-2538 и ВКМ Ас-2541 формировали спорангиеподобные структуры (рис. 36, Зв), достигавшие 4 мкм в диаметре в свежевыделенных культурах. Электронно-микроскопическое изучение срезов этих структур выявило наличие плотных конгломератов полиморфных клеток, делящихся септами в продольном и поперечном направлениях (рис. Зв). При помещении в жидкую среду клетки прорастали, образуя гифы. Подобная морфология и способы репродукции свойственны ряду актиномицетов (Geodermatophilus, МойеьгоЬасгег и др.), но не были ранее описаны для представителей рода КпЬЬеПа.
4. Физиолого-биохимические признаки
Все штаммы росли в аэробных условиях при 28°С и концентрации ЫаС1 ниже 4%, не росли при 7% ЫаС1, а также при температурах 6 и 50°С. Почти все штаммы были способны расти при рН 5-11 и не росли при рН 4. Все или большинство штам-
мов использовали в качестве единственного источника углерода различные моно- и дисахариды, несколько слабее был рост на полиолах. Не росли на метаноле в качестве источника углерода. Несколько штаммов росли на среде без добавления источников углерода, а также в микроаэрофильных условиях на среде с глюкозой. Все штаммы были каталазоположительные, разжижали желатин (табл. 4, стр. 16).
5. Хемотаксономические признаки
Все штаммы содержали в клеточной стенке LL-диаминопимелиновую кислоту и глицин (тип пептидогликан АЗу; Shleifer & Kandier, 1972), а также маннозу и галактозу в разных количествах. У одиннадцати штаммов обнаружена глюкоза, у ВКМ Ас-2527 - рамноза. Шесть штаммов содержали мадурозу и редкий сахар 2,3-ди-О-метилгалактозу, ранее найденный в составе липополисахарида фотосинтези-рующих бактерий (Weckesser et al., 1979). Доминирующий менахинон у всех штаммов - МК-9(Н4). В составе фосфолипидов обнаружены фосфатидилхолин, фосфати-дилинозит, фосфатидилглицерин и дифосфатидилглицерин (тип фосфолипидов Pill), а также неидентифицированный полярный липид LI и 2-5 минорных компонентов (гликолипиды, фосфолипиды и липиды) (рис. 4).
Состав жирных кислоты изученных штаммов характерен для рода Кг1ЬЬеИа. Преобладали а«/е/50-15:0 (19,1^0,4%) и ио-16:0 (11,0-35,2%) кислоты. У всех изученных штаммов также обнаружены кислоты, которые ранее отмечались у большинства [/50-15:0 (3,6-14,5%)] или отдельных видов рода \anteiso-\l-ti (5,5-17,1%), /50-17:0 (3,6-13,2%), /50-17:1 (4,0-12,2%), /50-14:0 (0,9-8,8%), 16:0 (0,7-3,0%) и 16:1со7с/5 (0,2-3,0%)]. У штаммов ВКМ Ас-2500, ВКМ Ас-2538 и ВКМ Ас-2541 об-
ю
наружены в минорных количествах 2-ОН-ш>-17:0 и 11Ме-18:1 кислоты, у ВКМ Ас-2570 - 10Ме-17:0. По процентному содержанию доминирующих типов жирных кислот и их гомологов среди изученных штаммов выделялись штаммы ВКМ Ас-2527 и ВКМ Ас-2538, у которых преобладали изо-разветвленные кислоты ио-14:0, ш?-16:0 и мо-18:0 (в сумме), и восемь штаммов (ВКМ Ас-2539, ВКМ Ас-2540, ВКМ Ас-2568, ВКМ Ас-2569, ВКМ Ас-2572, ВКМ Ас-2573, ВКМ Ас-2574 и ВКМ Ас-2575), у которых доминировали антеизо-разветвленные кислоты аШе15о-\5'Л и ап/еио-17:0.
6. Гликополимеры клеточных стенок
Наряду с пептидогликаном, клеточные стенки всех изученных штаммов содержали нейтральный гликополимер (разветвлённый маннан), а также по два или три разных по структуре анионных полимера (табл. 2), в числе которых тейхоевая кислота (ТК), две тейхуроновые (ТУК-1 и ТУК-2) и три тейхулозоновые кислоты (ТУЛК-1, ТУЛК-2 и ТУЛК-3).
Таблица 2. Гликополимеры клеточных стенок изученных штаммов
Штаммы Нейтральный полимер Анионные полимеры
ВКМ Ас-2566, ВКМ Ас-2570, ВКМ Ас-2571, ВКМ Ас-2573 Маннан ТК, ТУК-1
ВКМ Ас-2538, ВКМ Ас-2540, ВКМ Ас-2569, ВКМ Ас-2574 Маннан ТУК-1
ВКМ Ас-2539 Маннан ТУК-2
ВКМ Ас-2541 Маннан ТУЛК-1
ВКМ Ас-2500, ВКМ Ас-2568 и ВКМ Ас-2575 Маннан ТУЛК-2
ВКМ Ас-2527 Маннан ТУЛК-3
ВКМ Ас-2572 Маннан ТУК-2, ТУЛК-2
Полимерная цепь маннана (более 20 повторяющихся звеньев) образована а-1,6-связанными остатками маннопиранозы, замещённых в положении 2 терминальными остатками а-маннопиранозы. Полимер такой структуры найден у прокариот впервые. Наличие разветвлённого маннана в клеточных стенках всех изученных штаммов и маннозы у большинства известных видов криббелл (отсутствует у К. gingengisoli, К. Ырройготг и К. 1ирШ), позволяют полагать, что этот полимер может являться хемотаксономическим маркером рода КпЬЪеПа.
Тейхоевая кислота - 1,3-поли(глицерофосфат), частично замещённый р-глюко-зой, найдена в препаратах клеточных стенок четырёх изученных штаммов. Подобный полимер ранее обнаружен в клеточных стенках ряда актиномицетов и других групп грамм-положительных бактерий.
Тейхуроновые кислоты найдены у десяти изученных штаммов и представлены двумя структурами, неизвестными ранее:
->4)-р-0-Мапр2,ЗЫАсА-(1^6)-а-0-С1ср2,ЗНАс-(1-> (ТУК-1) -^4)-р-0-МапяКАсА-(1->6)-а-0-С1ср2,ЗЫАс,40Ас-(1— (ТУК-2)
В основной цепи тейхулозоновых кислот, обнаруженных у шести штаммов, присутствуют остатки сиалоподобного кислого моносахарида - 5,7-диацил-амидо-3,5,7,9-тетрадезокси-Ь-глиг/еро-р-Ь-ладнно-нонулозоновой кислоты (Р-псевдамино-вой кислоты, Р-РБе), ацилированные по N7 остатками 4-гидрокси-бутирата (Ви), которые гликозилированы по 04 остатком Рэе или другим моносахаридом, входящим наряду с РБе в основную цепь полимера. Гидроксильная группа при С4 Рзе обычно замещена остатками моносахаридов: З-О-метил-а-галактозы (а-Са1/?ЗОМе), 2,3-ди-
п
О-метил-а-галактозы (а-Са1/?2,3 ОМе) или Ь-рамнозы ((З-Ь-Ма/?). Длина цепей полимеров примерно 30-40 сахарных остатков в цепи с (З-Рве и [3-галактозой. Повторяющееся звено ТУЛК-1:
(37%),
ТУЛК-1:
Я = Н (45%), <х-0-0а1/>30Ме а-0-0а1р2,ЗС>Ме (18%).
ТУЛК-2 представляет собой гетерополимер, в котором преобладающие фрагменты А с остатками Р-Оа!р, Ви и р-РБе в основной цепи нерегулярно чередуются с фрагментами В:
А чОН Р-Рэе В чЧОН Р-Рзе
ТУЛК-2: Я = Н или а-Б-ОфЗОМе, или а-О-Оа1р2,30Ме. ТУЛК-3: Я = сс-О-ОфЗОМе, или а-0-Са1р2,30Ме, или р-Ь-Юш.
ТУЛК-3 отличается от ТУЛК-2 наличием остатков Р-Ь-Ют/> (наряду с а-Оа1/?ЗОМе и а-Оа1/>2,ЗОМе) в положении 4 остатков Рее.
Новый класс гликополимеров с альдулозоновыми кислотами в основной цепи, названный «тейхулозоновыми кислотами» (Кшге1, 2009), был открыт сравнительно недавно (вЬазкоу е/ а!., 2000). Тейхулозоновые кислоты обнаружены пока только в клеточных стенках ряда актиномицетов (БЬаБкоу е/ а!., 2000; 2002; Тульская с соавт., 2007а, 2011). Во всех описанных ранее случаях эти полимеры содержали 3-дезокси-0-глицеро-В-галакто-нон-2-улозоновую кислоту (К<1п). Тейхулозоновые кислоты с псевдаминовой кислотой найдены впервые. Производные псевдаминовой кислоты обнаружены ранее в составе липополисахаридов грамотрицательных бактерий (Кп1ге1 е/ а1., 2003; ЗсИоегЛоГеп е/ а1., 2006; У;1тг е/ а1., 2004).
7. МАЛДИ масс-спектры
Анализ МАЛДИ масс-спектров 15 изученных штаммов показал, что спектры имели до 40 пиков и значительно различались по числу и составу компонентов. Дендрограмма, отражающая сходство штаммов по МАЛДИ масс-спектрам, представлена на рис. 5.
Штаммы В КМ Ас-2566, ВКМ Ас-2569 и ВКМ Ас-2574 с идентичными нуклео-тидными последовательностями гена 16Б рРНК имели 23 одинаковых компонента масс-спектра и формировали общий кластер, в то время как штамм ВКМ Ас-2571 значительно отличался от них по составу спектра (всего пять общих пиков с этой группой) и занимал обособленное положение на дендрограмме (рис. 5, 6).
—1
—ц-
—н
'—с 11111 -
УКМ Ас-2570 УКМ Ас-2571 УКМ Ас2575 УКМ Ас-2527 УКМ Ас25 ОТ УКЫ Ас-2541 УКМ дс^зза УКЫ Ас2572 УКМ Ас-2568 УКМ Ас2573 УКМ Ас-2540 УКЫ Ас-2539 УКМ Ас2569 УКМ Ас2566 УКЫ Ас2574
Ш4апсе1т1
Рис. 5. Дендрограмма, отражающая сходство изученных штаммов по МАЛДИ масс-спектрам.
Рис. 6. МАЛДИ масс-спектры штаммов ВКМ Ас-2566 и ВКМ Ас-2571.
13
Масс-спектры штаммов ВКМ Ас-2500 и ВКМ Ас-2568 (99,9% сходства по нук-леотидным последовательностям гена 16Э рРНК, содержали 13 общих компонентов. Спектры штаммов ВКМ Ас-2500, ВКМ Ас-2538 и ВКМ Ас-2541, кластерирующихся вместе, имели десять общих пиков. Спектры остальных штаммов содержали от пяти до десяти общих пиков. У всех изученных штаммов выявлены четыре общих пика (т/: = 4372, 5200, 5543, 5577 Да) разной интенсивности, которые могут являться хе-мотаксономическими маркерами рода КпЬЬеПа.
8. Видовой состав изученных штаммов
Из полученных результатов следует, что изученные штаммы и описанные виды рода КпЬЬеПа имеют более 97% сходства генов 168 рРНК (1400 п.н.). Для отнесения штаммов к новому виду при таких уровнях сходства требуется в общем случае ДНК-ДНК гибридизация ^аскеЬгапсИ е/ а1, 2002; Тшс1а1 е1 а!., 2010). Однако для видов рода КпЪЬеЫа было показано, что уровень сходства ДНК хорошо согласуется с показателями эволюционного расстояния, определённого по фрагментам гена %угВ длиной 1108 и 390 п.н. (позиции 292-1400 и 1010-1400) (КцЫ е/ а1, 2010; Сш е1 а1. 2010; Хи е! а!., 2012). При этом значения эволюционных расстояний для большинства видов, вычисленных по фрагменту 390 п.н., равны или выше 0,028 даже при уровнях сходства нуклеотидных последовательностей гена 16Э рРНК более 99%. Для трёх пар видов эти показатели ещё ниже (0,008; 0,013; 0,015) (рис. 7а).
Минимальные показатели эволюционных расстояний (¿угВ) между изученными штаммами и описанными видами рода КпЬЬеПа при любых значениях сходства нуклеотидных последовательностей гена 16Б рРНК не ниже 0,031 (рис. 76). Вышеизложенные данные, а также значительные отличия от известных видов по феноти-пическим признакам, в том числе, по составу Сахаров и гликополимеров клеточных стенок, свидетельствуют о том, что все изученные штаммы, для которых определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена &'гВ, относятся к нескольким новым видам рода КпЬЬеПа.
Представителями шести новых видов являются штаммы ВКМ Ас-2500, ВКМ Ас-2539, ВКМ Ас-2540, ВКМ Ас-2566, ВКМ Ас-2570 и ВКМ Ас-2572, эволюционные расстояния между которыми находятся в интервале от 0,044 до 0,097 (табл. 3). Эти штаммы отличаются также на фетотипическом уровне (табл. 4).
Новый вид представляет собой и штамм ВКМ Ас-2538, близкий к ВКМ Ас-2572 по нуклеотидным последовательностям фрагментов генов 16Э рРНК (99,7%) и %угВ (эволюционное расстояние 0,026), но отличающийся от него по морфологии (образует спорангиеподобные структуры), хемотаксономическим признакам (наличию тейхуроновой кислоты, МАЛДИ масс-спектру, составу жирных кислот и полярных липидов) и ряду физиолого-биохимических характеристик (табл. 4).
К новым видам безусловно относятся штаммы ВКМ Ас-2527 и ВКМ Ас-2541, для которых отсутствуют данные по гену Штамм ВКМ Ас-2527 наиболее удален от других представителей рода по данным анализа нуклеотидных последовательностей гена 168 рРНК (97,0-98,3% сходства; рис. 1) и выделяется наличием в клеточной стенке ТУЛК-3 (гетерополимер с нерегулярной структурой и рамнозой при С4 Рэе). От большинства изученных изолятов он отличается минорным количеством маннана, составом жирных кислот (доминируют изо-разветвленные насыщенные /50-14:0 и ио-16:0 - 40%) и рядом других признаков (табл. 4).
• •
• 1 •V •• •
• > • т • • •1. • ,
• • • /.
•
0,02 0,028 0,04 0.06 0,08 0,10 0.12 дугВ (390 н.п.), эволюционные расстояния
(б) Известные виды с изученными штаммами
0,02 0,028 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 дугВ (390 н.п.), эволюционные расстояния
Рис. 7. Сходство нуклеотидных последовательностей гена 16Б рРНК и эволюционные расстояния (рассчитанные по фрагменту гена 390 п.н.) для известных видов рода КпЬЬеНа (а) и изученных штаммов по отношению к известным видам (б).
Таблица 3. Эволюционные расстояния между изученными штаммами (по 390 п.н. гена &гВ)
№ Штаммы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 ВКМ Ас-2500
2 ВКМ Ас-2538 0,069
3 ВКМ Ас-2539 0,046 0,090
4 ВКМ Ас-2540 0,079 0,044 0,097
5 ВКМ Ас-2566 0,067 0,064 0,085 0,054
6 ВКМ Ас-2568 0,018 0,077 0,046 0,085 0,077
7 ВКМ Ас-2569 0,067 0,054 0,077 0,044 0,038 0,074
8 ВКМ Ас-2570 0,062 0,054 0,085 0,044 0,059 0,067 0,056
9 ВКМ Ас-2572 0,074 0,026 0,095 0,049 0,056 0,077 0,046 0,059
10 ВКМ Ас-2573 0,072 0,056 0,097 0,031 0,054 0,077 0,054 0,054 0,056
11 ВКМ Ас-2574 0,069 0,067 0,082 0,056 0,008 0,079 0,036 0,062 0,059 0,056
Признак
165 рРНК, %~
Жё._
Морфология
Полимеры
Сахара клеточной стенки
Поляр, липиды
Фосфолипиды
Гликолипиды
Липиды Жирн. к-ты, % I /14:0, /16:0, /18:0 Е /15:0, /17:0 2о15:0,а!7:0 10, 11Ме-разв.
Другие
Рост при 37°С Рост при 42°С ЫаС1, % Рост без С В микроаэроф.
условиях Образов. НгБ Деградация Гипоксантин Казеин Ксантин Крахмал Твин-80 L-Tиpoзин Уреаза Эскулин Утилизация Ь-Арабиноза О-Ксилоза Р-Лактоза Р-Манноза Ь-Рамноза Раффиноза Сахароза Целлюлоза Глицерин О-Маннит Сорбит_
-С V)
и
а ^
м
ГУЛКЗ мал дмг рам
РЫ
С1 03
40.0
20.2 25.2
1-3
1Л
а ч а «
м
ТУЛК2
мад дмг (глю)
в! а2
Ь2
14.4
13.0 46.0
17:0 /18:1
1^1
** О -о
¿е ™ а
а и а и < с
993
мад мад дмг дмг
РЫ РЫ 01
26.5 19.4
20.0 17.2 33.4 42.8 1.6
17.0
1-4 1-4
- 14 ов — гл <г и! а ч а . о СП е сл —
вкм Ас-25- м *? а и а >7 в „ 2 « а « вз « < 2 К о 6 < а "V а и 2 ¡8 а « П 4 2 1Л ж ^ 2 гч < А а о с
99.7 99.3 100
0.026 0.031 0.008-0.038
М м, к М М, К М м м М (М),Ф (М),Ф (М),Ф
ТУК2 ТУЛК1 ТУК2 ТУЛК2 ТУК1 ТУК1 ТК ТУК1 ТК ТУК1 ТК ТУК1 ТУК1 ТУК1 ТК ТУК1
(глю) мад дмг (глю) мад дмг (глю) (глю) глю глю глю (глю) (глю) глю
РЫ Р1Л РЫ РЬ2 РЫ РЫ РЬ2 РЫ РЬ2 РЫ РЬ2 РЫ РЫ Р1.2 -
С1 01 01 в1 01 01 С1 01 (31
02 03 аз 02 аз 03,04 02 03,04
12 - 12, ЬЗ 12 Ь2 Ь2 - - - Ь2 -
16.5 23.2 21.1 43.8 23.6 18.3 33.6 33.2 21.3 19.9 28.1
16.3 14.2 15.9 15.8 10.1 14.3 1.2 16.8 13.2 12.3 15.2
49.3 37.0 40.0 26.4 43.0 49.4 35.4 35.6 49.7 46.6 36.3
- 0.3 _ 0.8 - - 1.6 - - - -
17:0 /16:1 17:0 /16:1 /16:1 15:1 /16:1
/18:0 17:1с 17:1с 17:1с
+ + + - + + - - + + +
1-4 1-4 1-4 1-4 1-4 1-5 1-5
- + - + + - - - - + +
- - + + + + - + + + +
- - - + - - - - + + +
+ + + + + + _
+ + + ■ + + ■ - ■ + -
+ + + - + + - + + + +
- + + + + + + + + + +
- - + + + + - + + ± +
+ + - _ + - - - + + -
+ + + + + + + + + + +
+ + + - + + + + + + +
+ + + + + + + + + +
- + + + ■ + - + + + +
+ + + + + + - + + + +
+ + + + + + - + + + +
+ + + + + + - + + + +
+ + + + + + + + + + +
+ + + + + - - + + + +
+ + + + + _ + + + +
+ + + + - - - + + + +
+ - + - - ± - + - - +
Примечание: выделенным шрифтом указаны представители новых видов; "+" - рост, "±" - слабый рост, "-" - рост отсутствует; М - длинный ветвящийся мицелий, Ф - мицелий, быстро распадающийся на фрагменты, К - спорангиеподобные структуры и/или кластеры клеток; ТК - тейхоевая, ТУК - тейхуроновые, ТУЛК - тейхулозоновые кислоты; дмг - 2,3-диметилгалактоза, глю - глюкоза, (глю) - следы глюкозы, мад - мадуроза, рам - рамноза; РЬ - фосфолипид, в - гликолипид, Ь -липид.
Штамм ВКМ Ас-2541, наиболее близкий по гену 16S рРНК к ВКМ Ас-2538, ВКМ Ас-2572 и К. sandramycini (99,4, 99,3 и 98,9% сходства), отличается от них и других штаммов криббелл наличием в клеточной стенке маДурозы, 2,3-ди-О-метил-а-гала-ктозы и ТУЛК-1 (с регулярной структурой); от большинства других изученных организмов - морфологией, относительно бедным спектром полярных липидов, способностью расти на среде без источника углерода и при 42°С.
Штамм ВКМ Ас-2575, представитель ещё одного нового вида, наиболее близок к К. alba и К, koreensis по нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК (99,4% и 99,2% сходства). Отличается от них и других описанных видов рода присутствием в клеточной стенке мадурозы и 2,3-ди-О-метил-а-галактозы и, следовательно, иной структурой или типом гликополимеров. От других близких организмов (К. catacumbae, ВКМ Ас-2539, ВКМ Ас-2500; 99,0-99,1% сходства 16S рРНК) отличается медленным ростом, составом анионных полимеров и липидов, МАЛДИ масс-спектром и физиолого-биохимическими характеристиками.
Помимо перечисленных, к новым видам (подвидам) могут быть отнесены и некоторые другие исследованные нами штаммы, в частности, ВКМ Ас-2573 и представители «группы ВКМ Ас-2566», отличные от других организмов по генам gyrB, МАЛДИ масс-спектрам и фенотипическим признакам.
9. Дополнение описания рода Kribbella
На основании полученных данных предложено дополненное описание рода Kribbella Park et al, 1999 emend. Sohn et al. 2003, включающее новые признаки рода.
Ряд организмов образует спорангиеподобные репродуктивные структуры, состоящие из плотных конгломератов полиморфных клеток, формирующихся пуём деления септами в продольном и поперечном направлениях. В составе Сахаров клеточных стенок ряда видов присутствуют мадуроза, 2,3-ди-О-метил-а-галактоза и L-рамноза. Клеточные стенки содержат нейтральный гликополимер (разветвлённый маннан). Анионные полимеры различных видов представлены тейхулозоновыми кислотами (с ß-псевдаминовой кислотой в основной цепи) или тейхуроновыми кислотами (с производными ß-маннопиранозидов уроновых кислот) и 1,3-поли(глице-рофосфат)ом. Виды рода содержат дополнительно от двух до пяти минорных полярных липидов (гликолипиды, фосфолипиды и неидентифицированные соединения). МАЛДИ масс-спектры включают четыре компонента {ml: = 4372, 5200, 5543, 5577 Да) разной интенсивности, характерные для большинства видов рода.
10. Ревизия семейства Nocardioidaceae
Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК организмов порядка "Propionibacteriales" (Ludwig et al, 2011), включающего род Kribbella, показал, что представители семейства Nocardioidaceae Nesterenko et al., 1985, 1990 emend. Rainey et al., 1997 emend. Zhi et al., 2009 образуют три кластера, которые находятся примерно на равном филогенетическом расстоянии друг от друга и от кластера семейства Propionibacteriaceae (рис. 8). Каждый кластер имеет уникальный набор сигнатурных нуклеотидов гена 16S рРНК (табл. 5). Представители кластеров, для которых секвенированы полные геномы (Nocardioides sp. JS614 и Kribbella flavida DSM 17836), отличаются также по их размеру (4,99 и 7,58 Mb) и числу генов, кодирующих белки (4645 и 7086) (Copeland et al, 2006; Pukall et al., 2010).
NocardtoKSes (Pimelobacter) s/mptex KCTC 9106 (AP005009) IVocerdioides fonbcola HAA-M (EF62S689)
-Nocaidvtíes b/geumensis MSL 05 (EF466120)
Nocsrdíoides aquiterrae GW-9 (AF529063)
-Nocardioides oleworans DSM 16090 (AJ698724)
_p Nocardioides albus KCTC 9186 (AF004988)
"iíoo1- Nocardioides luteus NC! B114 55 (X53212) Nocardioides dokdonensis FR1436 (EF633986) Nocardioides marinisabuU SBS-12 (AM22448) Nocardioides ditutus MSL 11 (EF466121) Nocardioides dubius KSL-104 (AY928902)
Nocarú/o/cjes daphniae D287 (AM398438) Nocardioides daedukens/s MDN 22 (FJ842646) Nocard'oides mesophikis MSL 22 (EF466117) Marmoncola bigeumensis MSL 05 (EF46612Q) Marmoncola aequoreus SSJA5 (AM295338) Marmoncola kor&cusSco-A36 (FN386723) Marmoricola scoriae Sco-001 {FN386750) Marmoncola aurart&3a/s(Y18629) Nocardioides koreensis MSL 09 (EF466115) Nocardioides lentus KSL-17 (DQ121389) Aeromcrob/oties flava TYLN1 (EF133690) Aeromicrobium tamlense SSW1 -57 (D0411541) Aeromicrobium halocynthiae KME 001 (FJ042789)
Aeromicrobium pont>HSW1 (AM778683) Aeromcrobium erythreum NRRL B-3381 (AF005021) Aeromicrobium alkaliterrae (AY822044) Aeromicrobium tasttiiosum (AF005022) Aeromtcrobium mamumDSM 15272 (AY166703) Aeromicrobium panaciterrae Gsoil 161 (AB245387) PrédmannéUa antarctica DSM 11053 (Z78206) Propionicicella superfundia BL-10 (DQ176646) Propioniomonas paludcola VSO (AB078858) Mcropruma glycogemca LG2 (AB012607) - Mic/olunatus phosphorusDSM 10555 (Z78207)
-Granuhcoccus phenohvorans PG-02 (AY566575)
- proponterax innocua ATCC 499 29 (AF227165)
Кластер I Семейство Nocardioidaceae
ta
- Aestuanimiaobium fwangyangense R27 (DQ830982)
— Luteococcusjapomcus DSM 10546 (Z78208) - Propbmbacferium freudenreichii DSM 202 71 (X 53217)
- Propon bacterium propioncus DSM 43307 ()
• Tessaracoccus bendgontensis BEN 106 (AF038504) — Brookfawnia cerclae BL-34 (DQ196625)
- Propon ¡bacterium lymphophilum DSM 4903 (AJ003056./
Порядок " Propionibacteriales"
у Семейство Proplonlbactirlaciae
— BKM Ac-2527
j-KnbbeBa jejuensisH D9 (AY253866)
Л- KnbbeBa a/ummosa HKI 0478 (EF126967)
,|-BKM Ac-2573
if— KribbeSa swarfóergenasHMC25 (AY995147) rj1- KribbeSa hippodromi$\A (EF472955) L— KribbeSa karoonensis 041 (AY995146)
— Kribbella flavida IFO 14399 (AF005017) Khbbella alba YIM310 75 (AY 0 8206 2) BKM Ac-2500 BKM Ac-2539
KribbeBa koreensis\M 161 (Y09159) KnbbeBa sandramyani (AY2 52864) BKM Ac-257 2 BKM Ac-2541
KnbbeBa anbbiotca YIM31530 (AY082063) Ftindersmia endophytca EUM 378 (FJ805430) [he rmasporomyces compos?/} AB53 5715) Actinopolymorpha alba YiM 48868 (EU706350) rtinopolymorpha singaporensis (AF237815) Actinopolymorpha pittosporiP\P 143 (FJ805429) Actinopolymorpha rubia YIM 45725 (EF601829) Actinopolymorpha cephafotaxi06-2230 (EU438909) Ha/oactmopofyspora alba YIM 93246 (CP001778) Jiangella gansuensis YIM 002 (AY631071) Jiangella elkaitphita D8-87 (AM422451) Jiangella muralrs 15-Je-017 (FN645214) Jiangella alba YIM 61503 (FJ157186) Stackebrandtia nassauensis NRRL B-16338 (FJ969846)
- Stackebrandtia alb/lava YIM 45751 (DQ985165)
-HaloglycomycesalbusYM 92370 (EUG60053)
1|-Glycomyces tenuis IFO 15904 (D85482)
~-Glycomyces arizonensisNRRL B-16153 (AY462042)
, '00, GlycomycessambucasE71 (DQ460469) г-^-Р Glycomyces scopanae YJM 56256 (EU200682) 1— Glycomyces maytem YIM 61331 (EU814511) ^7] r- Glycomyces endophytics YIM 56134 (EU200681) 1 Glycomyces harbinensis IFO 14487 (DS5483) w i Glycomyces alger/ensts NRRL 8-16327 (AY462044) ioóT glycomyces rutgersens/s IMSNU 22074T(AJ293748) eo' Glycomyces lechevatrerae NRRL B-16149 (AY462041) -Bifidobacterium gall/cum XM 8224 (D86191)
Кластер II Семейство 'Kribbellaceav"
Кластер III Семейство "Adinopolymorphacea«"
Семейство Jiang effaceae
Порядок "Jiangellales"
Семейство Glycomycttactae Порядок " Glycomycetales"
Рис. 9. Филогенетическое положение рода Kribbella и других родов порядка"Propionibacteriales" (анализ выполнен с использованием программы MEGA5).
В соответствии с изложенными данными и современными тенденциями развития системы классификации прокариот три кластера в составе семейства Nocardioidaceae могут быть квалифицирован как отдельные семейства. При такой таксономической структуре рассматриваемой группы более чётко выражены границы семейств в терминах эволюционных расстояний и нуклеотидных сигнатур, и каждое семейство приобретает индивидуальные фенотипические контуры и таксономические маркеры (табл. 5).
Таблица 5. Характеристики семейств Nocardioidaceae nom. rev.,"Kribbellaceae" fam. nov. и "Actinopolymorphaceae" fam. nov.
Семейство
Роды, входящие в семейство
Сигнатурные нуклеотиды 165 рРНК
Морфологический тип
Способ деления клеток
Подвижность
Типы полисахаридов клеточной стенки
Тип фосфолипидов Тип менахинонов
Nocardioidaceae (кластер 1)
Nocardioides АеготкгоЫит Магтогко!а 134:305 (в-Т), 371:372 (в-А), 386 (С), 391:392 (Т-С), 672 (А), 678:714 (Т-С), 736:777 (Т-О)
неправильные палочки кокки, нокардиоформы
фрагментация, бинарное деление
-/+
анионные, фосфатсодер-жащие (тейхоевые кислоты или сахарофосфаты)
PI (PII, Pill у единичных)
"Kribbellaceae" (кластер II)
анионные: без фосфатов (тейхулозоновые или тейхуроновые кислоты) или фосфатсо-держащие (тейхоевые); нейтральные: маннан
Pill
"Actinopolymorphceae" (кластер III)
не определено PI
9/4, 10/4, 11/4,9/6, 10/6
8/4,9/4
9/4
Kribbella
134:305 (А-С), 371:372 (C-G), 386 (Т), 391:392 (C-G), 672 (G), 678:714 (С-А), 736:777 (С-Т)
нокардиоформы
фрагментация, дробление
Actinopolymorpha
Flindersiella Thermasporomyces 134:305 (G-C), 371:372 (С-А), 386 (С), 391:392 (T-G), 672 (G), 678:714 (Т-О), 736:777 (C-G) нефрагментирующиеся гифы, полиморфизм, нокардиоформы фрагментация, дробление, выраженное почкование
Примечание: *новые неодобренные названия таксонов (Ludwig et al., 2011).
Для новых семейств "Kribbellaceae" и "Actinopolymorphaceae" и ревизованного семейства Nocardioidaceae Nesterenko et al. 1985, 1990 emend. Rainey et al, 1997 emend. Zhi et al 2009 предложены описания, включающие наборы сигнатурных нуклеотидов генов 16S рРНК, а также фенотипические характеристики.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
По приблизительным оценкам, число видов прокариотных микроорганизмов, обитающих на Земле, составляет около 107-109. Принято считать, что организмы пока неописанных видов составляют значительную часть «некультивируемых» в лабораторных условиях, а также являются компонентами слабо изученных (экстремальных) экосистем и микробных сообществ, ассоциированных с высшими организмами. Результаты проведённых исследований продемонстрировали, что множество новых видов можно обнаружить и среди известных групп относительно легко культивируемых почвенных актиномицетов, имеющих высокий уровень сходства генов 16S рРНК (более 99%) с описанными видами. Метод МАЛДИ масс-спектро-метрии позволяет выявить потенциальных представителей новых видов среди филогенетически близких штаммов.
На примере изучения филогенетически близких актиномицетов рода Kribbella показано, что такие организмы могут обладать уникальными свойствами, неизвестными ранее как для генетически близких описанных видов, так и прокариот в целом. При этом виды, обнаруженные в одном почвенном образце, зачастую различались между собой значительно больше, чем организмы, выделенные из почв географически удалённых районов.
В работе получены новые данные о морфологических структурах, физиолого-биохимических свойствах и составе компонентов клетки и клеточной стенки (моносахаров, гликополимеров, фосфолипидов) актинобактерий рода Kribbella. В клеточных оболочках представителей новых видов обнаружены биополимеры с ранее неизвестными структурами - тейхолузоновые кислоты с псевдаминовой кислотой в основной цепи и тейхуроновые кислоты с производными маннопиранозидов уроно-вой кислоты и редким диаминосахаром. Клеточные стенки всех изученных штаммов содержали маннозу и нейтральный полимер — маннан необычной структуры, обнаруженный у прокариот впервые. На основании полученных в данной работе данных предложена усовершенствованная структура высших таксонов, включающих род Kribbella, а также фенотипические маркеры новых и ревизованного семейств.
Результаты изучения бактерий рода Kribbella, часто ассоциированных с растениями, могут быть полезны для выявления элементов естественной системы, понимания закономерностей функционирования и эволюции популяций, сообществ микроорганизмов и экосистем, для аннотации геномов и данных метагеномики и мета-протеомики, а также при исследовании разнообразия природных биополимеров.
ВЫВОДЫ
1. Проведено таксономическое исследование 15 филогенетически близких штаммов рода Kribbella Park et al. 1999 emend. Sohn et al. 2003, выделенных из почв различных регионов России. На основании анализа гено- и фенотипических характеристик установлено, что изученные штаммы представляют собой не менее 10 новых видов. Эволюционные расстояния между изученными организмами и типовыми штаммами описанных видов (0,031-0,121), определённые по фрагменту гена gyrB, выше минимальных показателей расстояний между известными видами.
2. Впервые у нокардиоформных актиномицетов рода КпЬЬеПа обнаружены споран-гнеподобные репродуктивные структуры, состоящие из плотных конгломератов полиморфных клеток, образующихся путем деления септами в продольном и поперечном направлениях.
3. В составе Сахаров клеточных стенок криббелл впервые найдены мадуроза, Ь-рам-ноза и редкий сахар 2,3-ди-О-метил-а-галактоза; выявлены значимые отличия видов по составу жирных кислот и полярных липидов.
4. У всех изученных штаммов рода КпЬЬеПа (впервые у прокариот) обнаружен нейтральный гликополимер, состоящий из а-1,6-связанных остатков маннопиранозы с а-маннопиранозой в терминальном положении. Анионные гликополимеры представлены ранее неизвестными тейхулозоновыми кислотами, в состав которых входит сиалоподобный кислый моносахарид - псевдаминовая кислота, и тейхуроновы-ми кислотами, содержащими производные маннопиранозидов уроновой кислоты и диаминоглюкозы. У ряда штаммов найден 1,3-поли(глицерофосфат), замещённый глюкозой.
5. Показано, что метод МАЛДИ масс-спектрометрии позволяет обнаружить потенциальных представителей новых видов среди филогенетически близких штаммов рода КпЬЬеПа. Анализ МАЛДИ масс-спектров выявил наличие общих для всех штаммов компонентов (т/: = 4372, 5200, 5543 и 5577 Да), которые являются хемо-таксономическими маркерами рода.
6. На основании полученных данных предложено дополненное описание рода КпЬЬеПа. Предложны два новых семейства в составе порядка "Ргор'ютЬаМепакв" -"КпЬЬеПасеае" и "АсПпоро1утогрИасеае", ревизован состав семейства Nocardioidaceae. Определены наборы сигнатурных нуклеотидов генов 16Б рРНК и предложены фенотипические маркеры новых и ревизованного семейств.
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор выражает искреннюю благодарность коллегам за помощь и консультации при выполнении работы на различных её этапах и соавторам публикаций: к.б.н. Л.М. Барышниковой, к.б.н. Е.В. Арискиной, к.б.н. Б.П. Баскунову, Н.Г. Винокуровой, к.б.н. Л.В. Дорофеевой, к.х.н. Н.Ф. Зеленковой, к.б.н. А.Е. Китовой, В.Я. Лы-санской, Н.В. Присяжной, к.б.н. Н.Е. Сузиной (Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН); д.б.н. Е.М. Тульской и к.б.н. Г.М. Стре-шинской (Биологический факультет МГУ); к.х.н. С.Н. Сенченковой (Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН).
Работа выполнена при поддержке Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» (государственные контракты № 16.518.11.7035 и№ 16.552.11.7050).
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи
1. Shashkov A.S., Tul'skaya Е.М., Streshinskaya G.M., Senchenkova S.N., Avtukh A.N., Evtushenko L.I. New cell wall glycopolymers of the representatives of the genus Kribbella II Carb. Res. 2009. V. 344. № 8. P. 2255-2262.
2. Tul'skaya E.M., Streshinskaya G.M., Shashkov A.S., Senchenkova S.N., Avtukh A.N., Baryshnikova L.M., Evtushenko L.I. Novel teichulosonic acid from cell walls of some representatives of the genus Kribbella II Carb. Res. 2011. V. 346. № 12. P. 2045-2051.
3. Автух A.H., Винокурова Н.Г., Арискина E.B., Дорофеева Л.В., Барышникова Л.М. Состав полярных липидов как хемотаксономический маркер видов рода Kribbella II Вестник Уральской медицинской академической науки. 2011. №4/1. С. 71.
Тезисы докладов и сообщений
4. Автух А.Н., Присяжная Н.В., Василюк Н.В., Шашков A.C., Винокурова Н.Г., Ха-саева Ф.М., Барышникова Л.М. Видовое разнообразие актиномицетов рода Kribbella // Сборник тезисов Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, октябрь, 2009. С. 3.
5. Автух А.Н., Барышникова Л.М., Тульская Е.М., Шашков A.C., Евтушенко Л.И. Физиолого-биохимические и хемотаксономические характеристики актиномицетов рода Kribbella II Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». Москва, декабрь, 2009.
6. Автух А.Н., Присяжная Н.В., Малошицкая O.A., Барышникова Л.М., Евтушенко Л.И. Характеристика актинобактерий рода Kribbella с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии // Сборник тезисов 14-ой Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, апрель, 2010. Т. 2. С. 209.
7. Автух А.Н., Винокурова Н.Г., Зеленкова Н.Ф., Арискина Е.В., Тульская Е.М., Шашков A.C., Барышникова Л.М. Филогенетические и хемотаксономические характеристики новых актиномицетов рода Kribbella II Сборник тезисов Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, октябрь, 2010. С. 3.
8. Автух А.Н., Барышникова Л.М., Евтушенко Л.И. Факультативные автотрофы -представители новых актиномицетов рода Kribbella Н Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Автотрофные микроорганизмы». Памяти академика РАН E.H. Кондратьевой. Москва, декабрь, 2010.
9. Тульская Е.М., Стрешинская Г.М., Шашков A.C., Сенченкова С.Н., Автух А.Н., Присяжная Н.В., Арискина Е.В., Барышникова Л.М. Гликополимеры клеточных стенок как хемотаксономические маркеры актиномицетов рода Kribbella II Сборник тезисов Всероссийской школы-конференции «Химия и биохимия углеводов». Саратов, сентябрь, 2011.
Подписано в печать:
24.05.2012
Заказ № 7396 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499)788-78-56 www.autoreferat.ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Автух, Александр Николаевич
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Вид и род - основные категории классификации прокариот.
1.2. Таксономические характеристики и методы их определения.
1.2.1. Генотипические и филогенетические характеристики.
1.2.2. Культурально-морфологические и физиолого-биохимические характеристики.
1.2.3. Хемотаксономические характеристики.
1.2.4. Некоторые методы определения хемотаксономических признаков.
1.2.5. Таксономическое разрешение методов.
1.3. Система классификации класса Actinobacteria.
1.4. Характеристика семейства Nocardioidaceae.
1.5. Характеристика рода Kribbella.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Объекты исследования.
2.2. Определение генотипических признаков и филогенетического положения.
2.3. Определение культурально-морфологических признаков.
2.4. Определение физиолого-биохимических признаков.
2.5. Определение хемотаксономических признаков.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Формирование рабочей коллекции штаммов.
3.2. Генотипические характеристики и филогенетическое положение штаммов.
3.3. Культурально-морфологические характеристики.
3.4. Физиолого-биохимические характеристики.
3.5. Традиционные хемотаксономические характеристики.
3.6. Состав гликополимеров клеточной стенки.
3.7. Анализ МАЛДИ масс-спектров.
3.8. Определение видового состава изученных штаммов.
3.9. Описание предлагаемых видов рода Kribbella.
3.10. Дополнения к описанию рода Kribbella.
3.11. Таксономическая ревизия семейства Nocardioidaceae.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Систематика актиномицетов рода Kribbella"
Актуальность проблемы. Представители порядка Actinomycetales (Stackebrandt et al., 1997) выделяются среди других прокариот высоким содержанием ГЦ-пар в ДНК (более 50%), сложной организацией и большими размерами генома (до 12 млн. п.н.), разнообразием морфологии клеток и жизненных циклов, химического состава клеточной оболочки (Goodfellow et al., 1984; Gao & Gupta, 2012). Актиномицеты превосходят другие группы организмов по способности синтезировать биологические активные соединения (Anderson & Wellington, 2001). Вместе с тем, значительная часть этих уникальных бактерий с высоким биотехнологическим потенциалом остается неизученной или слабо исследованной в таксономическом аспекте.
К одной из таких групп относится род Kribbella Park et al., 1999 emend. Sohn et al. 2003, который в настоящее время включает 17 видов (www.bacterio.cict.fr). Согласно описанию, представители рода образуют фрагментирующийся вегетативный и воздушный мицелий, имеют тип I клеточной стенки (LL-диаминопимелиновая кислота, отсутствие дифференцирующих Сахаров), фос-фолипиды типа Pill (фосфатидилхолин в качестве диагностического компонента) и доминирующий менахинон МК-9(Н4). Особенностью рода Kribbella является высокое сходство видов по нук-леотидным последовательностям гена 16S рРНК (97,1-99,7/100%) (Kirbi et al., 2010; Cui et al., 2010; Xu et al., 2012). Этот факт и проблема разграничения близких видов/геномовидов криббелл по традиционным фенотипическим признакам (общая для бактериальной систематики) являются одной из причин того, что система классификации организмов этого рода остается разработанной крайне слабо и не отражает их реального природного разнообразия.
Ключевую роль в развитии систематики актиномицетов в «домолекулярный» период сыграло изучение хемотаксономических признаков (структура пептидогликана, состав Сахаров клеточной стенки, тип менахинонов, фосфолипидов и жирных кислот) (Goodfellow, 1989). Отличия по этим признакам, наряду с обособленным филогенетическим положением организмов, являются определяющим фактором при обосновании выделения нового рода актиномицетов и в настоящее время (Stackebrandt & Schumann, 2006). Результаты изучения тейхоевых кислот клеточных стенок актиномицетов выявили показали огромное разнообразие этих биополимеров и возможность использования их структур и структурных компонентов для дифференциации видов и групп видов внутри рода (Naumova et al., 2001; Потехина, 2006). Структуры других типов анионных полимеров установлены у представителей отдельных групп и не исследованы в таксономическом аспекте.
Белки и пептиды клетки, регистрируемые методом масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ MC) - другая группа биомолекул, которая в последние годы успешно используется при идентификации и классификации бактерий, преимущественно патогенных (Welker & Moore, 2011). Имеющиеся в литературе данные о MAJI-ДИ масс-спектрах актиномицетов весьма фрагментарны.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось таксономическое изучение актиномицетов рода Kribbella.
Для решения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Формирование рабочей коллекции штаммов рода Kribbella.
2. Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК и gyrB и определение филогенетического положения организмов.
3. Изучение культурально-морфологических, физиолого-биохимических и хемотаксономических признаков штаммов рабочей коллекции.
4. Определение состава гликополимеров клеточных стенок криббелл.
5. Анализ МАЛДИ масс-спектров представителй рода Kribbella и выявление таксон-специфичных компонентов спектров.
6. Определение видового состава изученных штаммов на основе принципов полифазной таконо-мии и характеристика новых видов рода Kribbella.
7. Оценка положения рода Kribbella в системе высших таксонов бактерий.
Научная новизна. Методами фазово-контрастной и электронной микроскопии обнаружены ранее неизвестные для рода Kribbella репродуктивные формы (спорангиеподобные структуры, состоящие из полиморфных клеток). В составе Сахаров клеточных стенок криббелл обнаружены мадуроза и рамноза, а также 2,3-ди-О-метил-огалактоза, найденная у грамположительных бактерий впервые. Впервые у организмов рода Kribbella определён состав гликополимеров клеточной стенки. Обнаружены уникальные тейхулозоновые кислоты (с псевдаминовой кислотой в основной цепи), относящиеся к новому классу биогликанов, и новые структуры тейхуроновых кислот. Выявлены специфичные для криббелл фосфолипиды и компоненты МАЛДИ масс-спектров. Выявлено и охарактеризовано 10 новых видов, предложено дополненное описание рода Kribbella. Предложены новые семейства "Kribbellaceae" и "Actinopolymorphaceae" в составе порядка "Propionibac-teriales", а также изменение границ семейства Nocardioidaceae. Для новых и ревизованного семейств определены маркерные (сигнатурные) нуклеотиды гена 16S рРНК; в описания семейств включены фенотипические характеристики.
Практическая значимость. Создана коллекция охарактеризованных штаммов рода Kribbella, выделенных из почв разных регионов России, которые доступны широкому кругу специалистов для дальнейших исследований. Таксономические предложения и полученные данные о нуклеотидных последовательностях генов 16S рРНК и gyrB, компонентах клеточных стенок, МАЛДИ масс-спектров и других фенотипических признаках представителей рода КпЪЪеИа способствуют усовершенствованию системы классификации бактерий, развитию экспресс-методов идентификации криббелл на уровне вида, и могут быть полезны при решении ряда практических задач эко- и биотехнологии, а также вопросов, касающихся защиты интеллектуальной собственности на штаммы. Полученные результаты могут быть использованы для аннотации геномов, данных метагено-мики и метапротеомики, при исследованиях в области биохимии и химии природных полимеров.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009); Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009 и 2010); Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино,
2010); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010); Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов,
2011).
Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы исследования", "Результаты и их обсуждение", "Заключение", "Выводы", "Список литературы" и "Приложения". Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит 36 таблиц и 26 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 209 ссылок.
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Автух, Александр Николаевич
выводы
Проведено таксономическое исследование 15 филогенетически близких штаммов рода Kribbella Park et al. 1999 emend. Sohn et al. 2003, выделенных из почв различных регионов России. На основании анализа гено- и фенотипических характеристик установлено, что изученные штаммы представляют собой не менее 10 новых видов. Эволюционные расстояния между изученными организмами и типовыми штаммами описанных видов (0,031-0,121), определённые по фрагменту гена gyrB, выше минимальных показателей расстояний между известными видами.
Впервые у нокардиоформных актиномицетов рода Kribbella обнаружены спорангиеподобные репродуктивные структуры, состоящие из плотных конгломератов полиморфных клеток, образующихся путём делением септами в продольном и поперечном направлениях.
В составе Сахаров клеточных стенок криббелл впервые найдены мадуроза, L-рамноза и редкий сахар 2,3-ди-О-метил-а-галактоза; выявлены значимые отличия видов по составу жирных кислот и полярных липидов.
У всех изученных штаммов рода Kribbella (впервые у прокариот) обнаружен нейтральный гли-кополимер, состоящий из а-1,6-связанных остатков маннопиранозы с а-маннопиранозой в терминальном положении. Анионные гликополимеры представлены ранее неизвестными тейхуло-зоновыми кислотами, в состав которых входит сиалоподобный кислый моносахарид - псевда-миновая кислота, и тейхуроновыми кислотами, содержащими производные маннопиранозидов уроновой кислоты и диаминоглюкозы. У ряда штаммов найден 1,3-поли(глицерофосфат), замещённый глюкозой.
Показано, что метод МАЛДИ масс-спектрометрии позволяет обнаружить потенциальных представителей новых видов среди филогенетически близких штаммов рода Kribbella. Анализ МАЛДИ масс-спектров выявил наличие общих для всех штаммов компонентов {miz = 4372, 5200, 5543 и 5577 Да), которые являются хемотаксономическими маркерами рода.
На основании полученных данных предложено дополненное описание рода Kribbella. Пред-ложны два новых семейства в составе порядка "Propionibacteriales" - "Kribbellaceae" и "Actinopolymorphaceae", ревизован состав семейства Nocardioidaceae. Определены наборы сигнатурных нуклеотидов генов 16S рРНК и предложены фенотипические маркеры новых и ревизованного семейств.
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор выражает глубокую благодарность всем коллегам за помощь и консультации при выполнении работы на различных её этапах и соавторам публикаций: к.б.н. JIM. Барышниковой, к.б.н. Е.В. Арискиной, Б.П. Баскунову, Н.Г. Винокуровой, к.б.н. JI.B. Дорофеевой, к.х.н. Н.Ф. Зе-ленковой, к.б.н. А.Е. Китовой, В.Я. Лысанской, Н.В. Присяжной, к.б.н. Н.Е. Сузиной (ИБФМ РАН им. Г.К. Скрябина); д.б.н. Е.М. Тульской и к.б.н. Г.М. Стрешинской (Биологический факультет МГУ); к.х.н. С.Н. Сенченковой (Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН).
Автор бесконечно признателен своему научному руководителю и д.б.н. Людмиле Ивановне Евтушенко и научному консультанту д.х.н. A.C. Шашкову (Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
По приблизительным оценкам, число видов прокариотных микроорганизмов, обитающих
7 9 на Земле, составляет около 10-10 . Принято считать, что организмы пока неописанных видов составляют значительную часть «некультивируемых» в лабораторных условиях, а также являются компонентами слабо изученных (экстремальных) экосистем и микробных сообществ, ассоциированных с высшими организмами. Результаты проведённых исследований продемонстрировали, что множество новых видов можно обнаружить и среди известных групп относительно легко культивируемых почвенных актиномицетов, имеющих высокий уровень сходства генов 16Б рРНК (более 99%) с описанными видами. Метод МАЛДИ масс-спектро-метрии позволяет выявить потенциальных представителей новых видов среди филогенетически близких штаммов.
На примере изучения филогенетически близких актиномицетов рода КпЬЬеНа показано, что такие организмы могут обладать уникальными свойствами, неизвестными ранее как для генетически близких описанных видов, так и прокариот в целом. При этом виды, обнаруженные в одном почвенном образце, зачастую различались между собой значительно больше, чем организмы, выделенные из почв географически удалённых районов.
В работе получены новые данные о морфологических структурах, физиолого-биохимических свойствах и составе компонентов клетки и клеточной стенки (моносахаров, глико-полимеров, фосфолипидов) актинобактерий рода КпЬЬеНа. В клеточных оболочках представителей новых видов обнаружены биополимеры с ранее неизвестными структурами - тейхулозоновые кислоты с псевдаминовой кислотой в основной цепи и тейхуроновые кислоты с производными маннопиранозидов уроновой кислоты с редким диаминосахаром. Клеточные стенки всех изученных штаммов содержали маннозу и нейтральный полимер - маннан необычной структуры, обнаруженный у прокариот впервые. На основании полученных в настоящей работе данных предложена усовершенствованная структура высших таксонов, включающих род КпЬЬеНа, а также предложены фенотипические маркеры новых и ревизованного семейств.
Результаты изучения бактерий рода КпЬЬеНа, часто ассоциированных с растениями, могут быть полезны для выявления элементов естественной системы, понимания закономерностей функционирования и эволюции популяций, сообществ микроорганизмов и экосистем, для аннотации геномов и данных метагеномики и метапротеомики, а также при исследовании разнообразия природных биополимеров.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Автух, Александр Николаевич, Пущино
1. Евтушенко Л.И. и Зеленкова Н.Ф. О таксономическом положении актиномицетов Proactino-myces farineus II Микробиология. 1989. Т. 58. № 3. С. 498-500.
2. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография // М.: изд-во «Мир». 1981. Т. 1,2.
3. Козлова Ю.И., Стрешинская Г.М., Шашков A.C., Сенченкова С.Н. и Евтушенко Л.И. Углево-дсодержащие полимеры клеточной стенки стрептомицета-термофила Streptomyces ther-movidgaris subsp. thermovidgaris BKM Ac-1857 II Биохимия. 2006. Т. 71. С. 954-960.
4. Методы общей бактериологии // Пер с англ. Под ред. Герхардта Ф. и др. . М.: изд-во «Мир». 1984. Т. 3. С. 264.
5. Методы почвенной микробиологии и биохимии // Под ред. Звягинцева Д.Г. М.: изд-во Московского университета. 1980. С. 224.
6. Наумова И.Б. и Шашков A.C. Анионные полимеры в клеточной стенке грамположительных бактерий // Биохимия. 1997. Т. 62. С. 809-840.
7. Стрешинская Г.М., Наумова И.Б. и Панина Л.И. Химический состав клеточной стенки Streptomyces chrysomallus, образующего антибиотик аурантин // Микробиология. 1979. Т. 48. С. 814-819.
8. Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография // М.: Химия. 1986. С. 288.
9. Тульская Е.М. Тейхоевые кислоты и гликополимеры актиномицетов: стрктурное разнообразие, таксономические и экологические аспекты // Докторская диссертация. М.: МГУ. 2009.
10. Тульская Е.М., Шашков A.C., Буева О.В. и Евтушенко Л.И. Анионные углеводсодержащие полимеры клеточных стенок Streptomyces melanosporofaciens и близких видов // Микробиология. 2007. Т. 72. № 1. С. 39-45.
11. Тульская Е.М., Шашков A.C., Стрешинская Г.М., Сенченкова С.Н., Потехина Н.В., Козлова Ю.И. и Евтушенко Л.И. Тейхуроновые и тейлухозоновые кислоты актиномицетов // Биохимия. 2011. Т. 76. С. 904-913.
12. Шашков A.C., Козлова Ю.И., Стрешинская Г.М., Космачевская Л.Н., Буева О.В., Евтушенко Л.И. и Наумова И.Б. Углевод-содержащие полимеры клеточной стенки некоторых видов кластера "Streptomyces lavendulae" II Микробиология. 2001. Т. 70. № 4. С. 413—421.
13. Altenburger P., Kämpfer P., Schumann P., Steiner R., Lubitz W. and Busse H.J. Citricoccus muralis gen. nov., sp. nov., a novel actinobacterium isolated from a medieval wall painting // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002a. V. 52. P. 2095-2100.
14. Altenburger P., Kämpfer P., Schumann P., Vybiral D., Lubitz W. and Busse H.J. Georgenia muralis gen. nov., sp. nov., a novel actinobacterium isolated from a medieval wall painting // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002b. V. 52. P. 875-881.
15. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J.H., Zhang Z., Miller W. and Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 3389-3402.
16. Anderson A.S. & Wellington E.M.H. The taxonomy of Streptomyces and related genera // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V. 51. P. 797-814.
17. Arnold R.J., Karty J.A., Ellington A.D. and Reilly J.P. Monitoring the growth of a bacteria culture by MALDI-MS of whole cells // Anal. Chem. 1999. V. 71. P. 1990-1996.
18. Baddiley J. Teichoic acids in cell walls and membranes of bacteria // Essays Biochem. 1972. V. 8. P. 35-77.
19. Brodie E.L., DeSantis T.Z., Moberg Parker J.P., Zubietta I.X., Piceno Y.M. and Andersen G.L. Urban aerosols harbor diverse and dynamic bacterial populations // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2007. V.104. P.299-304.
20. Brims A., Philipp H., Cypionka H. and Brinkhoff T. Aeromicrobium marinum sp. nov., an abundant pelagic bacterium isolated from the German Wadden Sea // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 1917-1923.
21. Buczolits S., Schumann P., Weidler G., Radax C. and Busse H.-J. Brachybacterium muris sp. nov., isolated from the liver of a laboratory mouse strain II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 1955-1960.
22. Busse H.-J. & Schumann P. Polyamine profiles within genera of the class Actinobacteria with LL-diaminopimelic acid in the peptidoglycan // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. V. 49. P. 179-184.
23. Butler W.R. & Guthertz L.S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification Mycobacterium species // Clin. Microbiol. Rev. 2001 .V. 14. P. 704-726.
24. Cao Y.R., Jiang Y., Wu J.Y., Xu L.H. and Jiang C.L. Actinopolymorpha alba sp. nov., isolated from a rhizosphere soil // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009. V. 59. P. 2200-2003.
25. Carlsohn M.R., Groth I., Spröer C., Schütze B., Saluz H.-P., Munder T. and Stackebrandt E. Kribbella aluminosa sp. nov., isolated from a medieval alum slate mine // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 1943-1947.
26. Choi D.H., Kim H.M., Noh J.H. and Cho B.C. Nocardioides marinus sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. 57. P. 775-779.
27. Chun J., Lee J.-H., Jung Y., Kim M., Kim S., Kim B.K. and Lim Y.W. EzTaxon: a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 2259-2261.
28. Collins M.D. Genus Brevibacterium II In: Prokaryotes. Edited by Balows A., Truper H.G., Dworkin M., Harder W., Schleifer K.-H. New York: Springer Verlag. 1992. V. 2. P. 1351-1354.
29. Collins M.D. & Jones D. The distribution of isoprenoid quinone structural types in bacteria and their taxonomic implications // Microbiol. Rev. 1981. V. 45. P. 316-354.
30. Collins C.H. & Lyne P.M. Microbiological Methods. 5th edition. London: Ltd Frome. 1985. P. 450.
31. Collins M.D., Cockcroft S. and Wallbanks S. Phylogenetic analysis of a new LL-diaminopimelic acid-containing coryneform bacterium from herbage, Nocardioides plantarum sp. nov. //. J. Gen. Microbiol. 1977. V. 100. P. 221-230.
32. Collins M.D., Pirouz T., Goodfellow M. and Minnikin D.E. // J. Appl. Bacteriol. 1980. V. 48. P. 277-282.
33. Collins M.D., Shah H.N. and Minnikin D.E. // J. Appl. Bacteriol. 1980. V. 48. P. 277-282.
34. Cook A.E. & Meyers P.R. Rapid identification of filamentous actinomycetes to the genus level using genus-specific 16S rRNA gene restriction fragment patterns // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. №6. P. 1907-1915.
35. Coombs J.T., Michelsen P.P. and Franco C.M.M. Evaluation of endophytic actinobacteria as antagonists of Gaeumannomyces graminis var. tritici in wheat 11 Biol. Control. 2003. V. 29. P. 359-366.
36. Cui Y.-S., Lee J.-S., Lee S.-T. and Im W.-T. Kribbella ginsengisoli sp. nov., isolated from soil of a ginseng field // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010. V. 60. P. 364-368.
37. Dastager S.G., Lee J.C., Ju Y.J., Park D.J. and Kim C.J. Marmoricola bigeumensis sp. nov., a member of the family Nocardioidaceae II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. V. 58. P. 1060-1063.
38. Daubin V. & Ochman H. Bacterial genomes as new gene homes: the genealogy of ORFans in E. coli II Genome Res. 2004. V. 14. P. 1036-1042.
39. Deloger M., Karoui M.E. and Petit M.-A. A Genomic distance based on MUM Indicates Discontinuity between most bacterial species and genera // J. Bacteriol. 2009. V. 191. № 1. P. 91-99.
40. Everest G.J. & Meyers P.R. Kribbella hippodromi sp. nov., isolated from soil from a racecourse in South Africa // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. V. 58. P. 443-446.
41. Fenselau C. & Demirev P.A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry // Mass Spectr. Rev. 2001. V. 20. P. 157-171.
42. Fiedler F. & Schäffler M.J. Teichoic acids in cell walls of strains of the 'nicotianae' group of Ar-throbacter: a chemotaxonomic marker // Syst. Appl. Microbiol. 1987. V. 9. P. 16-21.
43. Fiedler F., Schleifer K.H., Cziharz B., Interschick E. and Kandier O. Murein types in arthrobacter, brevibacteria, corynebacteria and microbacteria // Publ. Fac. Sei. Univ. J.E. Perkyne Brno. 1970. V. 47. P. 111-122.
44. Gao B. & Gupta R.S. Phylogenetic framework and molecular signatures for the main clades of the phylum Actinobacteria II Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2012. V. 76. № 1. P. 66-112.
45. Gevers D., Cohan F.M., Lawrence J.G., Spratt B.G., Coenye T., Feil E.J., Stackebrandt E., Van de Peer Y., Vandamme P., Thompson F.L. and Swings J. Opinion: re-evaluating prokaryotic species // Nat. Rev. Microbiol. 2005. V. 3. P. 733-739.
46. Goodfellow M. The actinomycetes 1. Supra genetic classification of actinomycetes // In: Bergey's Manual of systematic bacteriology. The Williams and Wilkins Co: Baltimore. 1989. V. 4. P. 2333-2339.
47. Goodfellow M. & Minnikin D.E. Introductions of chemosystematics // In: Cytmical Methods in Bacterial Systematics. Edited by Goodfellow M. & Minnikin D.E. London: Academic Press. 1985. P. 1-15.
48. Goodfellow M. & O'Donnell A.G. Roots of bacterial systematics // In: Handbook of new bacterial systematics. Edited by Goodfellow M. & O'Donnell A.G. London: Academic Press. 1994. P. 3-56.
49. Goodfellow M., Williams S.T. and Mordarski M. Introduction to and importance of actinomycetes // In: The biology of actinomycetes. Edited by Goodfellow M., Mordarski M. and Williams S.T. London: Academic Press. 1984. P. 1-6.
50. Goris J., Konstantinidis K.T., Klappenbach J.A., Coenye T., Vandamme P. and Tiedje J.M. DNADNA hybridization values and their relationship to whole-genome sequence similarities // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 81-91.
51. Griffin D.W. Atmospheric movement of micro-organisms in clouds of desert dust and implications for human health // Clin. Microbiol. Rev. 2007. V. 20. P. 459^177.
52. Grice E.A., Kong H.H., Renaud G., Young A.C., Bouffard G.G., Blakesley R.W., Wolfsberg T.G., Turner M.L. and Segre J. A. A diversity profile of the human skin microbiota // Genome Res. 2008. V. 18. P.1043-1050.
53. Gvozdiak O.R., Schumann P., Griepenburg U. and Auling G. Polyamine profiles of Gram-positive catalase positive cocci // Syst. Appl. Microbiol. 1998. V. 21. P. 279-284.
54. Hamana K. Polyamine distribution patterns in aerobic Grampositive cocci and some radio-resistant bacteria//J. Gen. Appl. Microbiol. 1994. V. 40. P. 181-195.
55. Hamana K. Polyamine distribution patterns in coryneform bacteria and related gram-positive eubac-teria // Annu. Rep. Coll. Med. Care. Technol. Gunma. Univ. 1995. V. 16. P. 69-77.
56. Hancock I.C. Analysis of cell wall constituents of Gram-positive bacteria // In: Chemical Methods in Prokaryotic Systematics. Edited by Goodfellow M. & O'Donnell A.G. Chichester: John Wiley & Sons. 1994. P. 63-84.
57. Harayama S. & Kasai H. Bacterial phylogeny reconstruction from molecular sequences // In: Molecular Identification, Systematics, and Population Structure of Prokaryotes. Edited by Stackebrandt E. New York: Springer. 2006. P. 105-140.
58. Hatano K. & Nishii T. Taxonomic studies on Streptomyces violaceoruber group and related species based on gyrB sequences // IFO Res. Commun. 2001. V. 20. P. 83-91.
59. Henz S.R., Huson D.H., Auch A.F., Nieselt-Struwe K. and Schuster S.C. Whole-genome prokaryotic phylogeny // Bioinformatics. 2005. V. 21. P. 2329-2335.
60. Hounsell O.F. Nuclear Magnetic Resonance // A Specialist Periodical Report. 2002. V. 31. P. 338352.
61. Kaewkla O. & Franco C.M.M. Actinopolymorphapittospori sp. nov., an endophytic actinobacterium isolated from surface-sterilized leaves of an Australian native apricot tree // Int. J. Syst. Bacteriol. 201 la. V. 61. № . P. 000-000.
62. Kaewkla O. & Franco C.M.M. Flindersiella endophytica gen. nov., sp. nov., an endophytic actinobacterium isolated from the root of Grey Box, an endemic eucalyptus tree // Int. J. Syst. Bacteriol. 2011b. V. 61. №9. P. 2135-2140.
63. Kasai H., Tamura T. and Harayama S. Intrageneric relationships among Micromonospora species deduced from gyrß-based phylogeny and DNA relatedness // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 127-134.
64. Kim H.M., Choi D.H., Hwang C.Y. and Cho B.C. Nocardioides salarius sp. nov., isolated from sea water enriched with Zooplankton // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. V. 58. P. 2056-2064.
65. Kirby B.M., Everest G.J. and Meyers P.R. Phylogenetic analysis of the genus Kribbella based on the gyrB gene: proposal of a gyrß-sequence threshold for species delineation in the genus Kribbella II Antonie Van Leeuwenhoek. 2010. V. 97. P. 131-142.
66. Kirby B.M., Le Roes M. and Meyers P.R. Kribbella karoonensis sp. nov. and Kribbella swartber-gensis sp. nov., isolated from soil from the Western Cape, South Africa // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. V. 56. P. 1097-1101.
67. Knirel Yu.A. Structures of bacterial polysaccharides // In: Progress in the synthesis of complex carbohydrate chains of plant and microbial polysaccharides. Edited by Nifantiev N.E. Kerala, India: Transworld Research Network. 2009. P. 181-198.
68. Knirel Yu.A., Shashkov A.S., Tsvetkov Yu.E., Jansson P.-E. and Zahringer U. 5,7-diamino-3,5,7,9-tetradeoxynon-2-ulosonic acids in bacterial glycopolymers: chemistry and biochemistry // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 2003. V. 58. P. 371-417.
69. Komagata K. & Suzuki K.-I. Lipid and cell wall analysis in bacterial systematics // In Colwell R.R. and Grigorova R. ed. Methods in microbiology. Academic Press: New York. 1987. V. 19. P. 161-207.
70. Konstantinidis K.T., Ramette A. and Tiedje J.M. Toward a more robust assessment of intraspecies diversity, using fewer genetic markers // Appl. Environ. Microbiol. 2006a. V. 72. P. 7286-7293.
71. Konstantinidis K.T., Ramette A. and Tiedje J.M. The bacterial species definition in the genomic era // Phil. Trans. R. Soc. B. 2006b. V. 361. P. 1929-1940.
72. Konstantinidis K.T. & Tiedje J.M. Genomic insights that advance the species definition for pro-karyotes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 2567-2572.
73. Kurtz S., Phillippy A., Delcher A.L., Smoot M., Shumway M., Antonescu C. and Salzberg S.L. Versatile and open software for comparing large genomes // Genome Biol. 2004. V. 5.
74. Lauer A., Simon M.A., Banning J.L., Lam B.A. and Harris R.N. Diversity of cutaneous bacteria with antifungal activity isolated from female four-toed salamanders // ISME J. 2008. V. 2. P. 145-157.
75. Lechevalier M.P., De Bievre C. and Lechevalier H.A. Chemotaxonomy of aerobic actinomycetes: phospholipid composition // Biochem. Syst. Ecol. 1977. V. 5. P. 249-260.
76. Lechevalier H., Lechevalier M.P. and Gerber N.N. Chemical composition as a criterion in the classification of actinomycetes // Adv. Appl. Microbiol. 1971. V. 14. P. 47-72.
77. Lee S.D. Marmoricola aequoreus sp. nov., a novel actinobacterium isolated from marine sediment // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 1391-1395.
78. Lee S.D., Kang S.O. and Hah Y.C. Hongia gen. nov., a new genus of the order Actinomycetales // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 191-199.
79. Lee D.W. & Lee S.D. Aeromicrobium ponti sp. nov., isolated from sea water // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. V. 58. P. 987-991.
80. Lee D.W. & Lee S.D. Marmoricola scoriae sp. nov., isolated from volcanic ash // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010. V. 60. P. 2135-2139.
81. Lee S.D., Lee D.W. and Ko Y.-H. Marmoricola korecus sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2011. V. 61. № 7. P. 1628-1631.
82. Levy-Frebault V.V. & Portales F. Proposed minimal standards for the genus Mycobacterium and for description of new slowly growing Mycobacterium species // Int. J. Syst. Bacteriol. 1992. V. 42. P. 315-323.
83. Li W.J., Wang D., Zhang Y.Q., Schumann P., Stackebrandt E., Xu L.H. and Jiang C.L. Kribbella antibiotica sp. nov., a novel nocardioform actinomycete strain isolated from soil in Yunnan, China // Syst. Appl. Microbiol. 2004. V. 27. P. 160-165.
84. Li W.J., Wang D., Zhang Y.Q., Xu L.H. and Jiang C.L. Kribbella yunnanensis sp. nov., Kribbella alba sp. nov., two novel species of genus Kribbella isolated from soils in Yunnan, China // Syst. Appl. Microbiol. 2006. V. 29. P. 29-35.
85. Liu H., Du Z., Wang J. and Yang R. Universal sample preparation method for characterization of bacteria by matrix-assisated laser desorption ionization time-of-flight mass-spectrometry // Appl. Env. Microbiol. 2007. V. 73. P. 1899-1907.
86. Maiden M.C.J. Multilocus sequence typing of bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 2006. V. 60. P. 561— 88.
87. Marmur J. & Doty P. Determination of the dase composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation // J. Mol. Biol. 1962. V. 5. P. 109-118.
88. Matson J.A. & Bush J.A. Sandramycin, a novel antitumor antibiotic produced by a Nocardioides sp. Production, isolation, characterization and biological properties // J. Antibiotics. 1989. V. 42. P. 1763-1767.
89. Matson J.A., Colson K.L., Belofsky G.N. and Bleiberg B.B. Sandramycin, a novel antitumor antibiotic produced by a. Nocardioides sp. // J. Antibiotics. 1993. V. 46. P. 162-166.
90. Miller E.S., Woese C.R. and Brenner S. Description of the erythromycin-producing bacterium Ar-throbacter sp. strain NRRL B-3381 as Aeromicrobium erythreum gen. nov., sp. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1991. V. 41. P. 363-368.
91. Minnikin D.E., Collins M.D. and Goodfellow M. Fatty asid and polar lipid composition in the classification of Cellulomonas, Oerskovia and related taxa // J. Appl. Bacteriol. 1979. V. 47. P. 87-95.
92. Murray R.G.E. Report of the Ad Hoc Commitee on Approches to Taxonomy within the Proteobacteria // Int. J. Syst. Bacteriol. 1990. V. 40. P. 213-215.
93. Naumova I.B. The teichoic acids of actinomycetes // Microbiol. Sci. 1988. V. 5. P. 275-279.
94. Nesterenko O.A., Kvasnikov E.I. and Nogina T.M. Nocardioidaceae fam. nov., a new family of the order Actinomycetales Buchanan 1917 // Mikrobiol. Zhurnal. 1985. V. 47. № 2. P. 3-12.
95. Potekhina N.V., Evtushenko L.I., Senchenkova S.N., Shashkov A.S. and Naumova I.B. Structures of cell wall teichoic acids of Brevibacterium iodinum VKM Ac-2106 // Biochemistry (Moscow). 2004. V. 69. P. 1353-1359.
96. Potekhina N.V., Shashkov A.S., Evtushenko L.I., Senchenkova S.N. and Naumova I.B. The mannitol teichoic acid from the cell wall of Brevibacterium permense VKM Ac-2280 // Carbohydr. Res. 2003b. V. 338. P. 2745-2749.
97. Prauser H. Nocardioides, a new genus of the order Actinomycetales II Int. J. Syst. Bacteriol. 1976. V. 26. P. 58-65.
98. H.-P. and Brettin T. Complete genome sequence of Kribbella flavida type strain (IFO 14399T) // Stand. Genomic Sci. 2010. V. 2. P. 186-193.
99. Rainey F.A., Ward-Rainey N.L. and Stackebrandt E. Proposal for a new hierarchic classification system Actinobacteria classis nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. V. 47. P. 479-491.
100. Richert K., Brambilla E. and Stackebrandt E. Development of PCR primers specific for the amplification and direct sequencing of gyrB genes from microbacteria, order Actinomycetales // J. Microbiol. Methods. 2005. V. 60. № 1. P. 115-23.
101. Richert M. & Rossello-Mora R. Shifting the genomic gold standard for the prokaryotic species definition // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. P. 19126-19131.
102. Rosenthal R.S. & and Dziarski R. Isolation of peptidoglycan and soluble peptidoglycan fragments // Methods Enzymol. 1994. V. 235. P. 253-285.
103. Rossello-Mora R. & Amann R. The species concept for prokaryotes // FEMS Microbiol. Rev. 2001. V. 25. P. 39-67.
104. Santos S.R. & Ochman H. Identification and phylogenetic sorting of bacterial lineages using universally conserved genes and proteins // Environmental Microbiology. 2004. V. 6. P. 754-759.
105. Schippers A., Schumann P. and Sprôer C. Nocardioides oleivorans sp. nov., a novel crude-oil-degrading bacterium // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V. 55. P. 1501-1504.
106. Scherer P. & Kneifel H. Distribution of polyamines in methanogenic bacteria // J. Bacteriol. 1983. V. 154. P.1315-1322.
107. Schleifer K.H. Analysis of the chemical composition and primary structure of murein // In: Methods in microbiology. Edited by Bergan T. London: Academic Press. 1985. V. 18. P. 123-156.
108. Schleifer K.H. Classification of Bacteria and Archaea: past, present and future // Syst. Appl. Microbiol. 2009. V. 32(8). P. 533-542.
109. Schleifer K.H. & Kandler O. Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications // Bacteriol. Rev. 1972. V. 36. P. 407^177.
110. Schleifer K.H. & Seidl P.H. Chemical composition and structure of murein // In: Chemical methods in bacterial systematics. Edited by Goodfellow M. & Minnikin D.E. London: Academic Press. 1985. P. 201-219.
111. Schoenhofen I.C., McNally D.J., Brisson J.R. and Logan S.M. Elucidation of the CMP-pseudaminic acid pathway in Helicobacter pylori: synthesis from UDP-iV-acetylglucosamine by a single enzymatic reaction // Glycobiology. 2006. V. 16. P. 8-14.
112. Schubert K. & Fudler F. Structural investigations on the cell surface of Eiysipelothrix rhusiopathiae II2001. System. Appl. Microbiol. V. 24. P. 26-30.
113. Schumann P. Peptidoglycan structure // Methods in Microbiology. Elsevier Ltd. 2011. V. 38. P. 101129.
114. Schumann P., Prauser H., Rainey F.A., Stackebrandt E. and Hirsch P. Friedrnanniella antarctica gen. nov., sp. nov., an LL-diaminopimelic acid-containing actinomycete from Antarctic sandstone // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. V. 47. P. 278-283.
115. Sfanos K., Harmody D., Dang P., Ledger A., Pomponi S., McCarthy P. and Lopez J.A. A molecular systematic survey of cultured microbial associates of deep-water marine invertebrates // Syst. Appl. Microbiol. 2005. V. 28. P. 242-264.
116. Shashkov A.S., Kochanowski H., Kozlova Yu.I., Streshinskaya G.M., Terekhova L.P. and Galatenko O.A. Teichuronic acid of the cell wall of Actinoplanes brasiliensis II Biochim // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1201. P. 333-338.
117. Shashkov A.S., Kozlova Y.I., Streshinskaya G.M., Kosmachevskaya L.N., Bueva O.V., Evtushenko L.I. and Naumova I.B. // Mikrobiologiya (Moscow). 2001. V. 70. P. 413-421.
118. Shashkov A.S., Potekhina N.V., Evtushenko L.I. and Naumova I.B. Cell wall teichoic acids of two Brevibacterium strains // Biochemistry (Moscow). 2004. V. 69. P. 658-664.
119. Shashkov A.S., Streshinskaya G.M., Gnilozub V.A., Evtushenko L.I. and Naumova I.B. Poly-(arabitolphosphate) teichoic acid in the cell wall of Agromyces cerinus subsp. cerinus VKM Ac-1340//FEMS Lett. 1995. V. 371. P. 163-166.
120. Shashkov A.S., Tul'skaya E.M., Evtushenko L.I., Gratchev A.A. and Naumova I.B. Structure of a teichoic acid from Nocardioides luteus VKM Ac-1246T cell wall // Biochemistry (Moscow). 2000. V. 65. P. 509-514.
121. Shashkov A.S, Tul'skaya E.M., Evtushenko L.I. and Naumova I.B. A teichoic acid of Nocardioides albus VKM Ac-805T cell walls // Biochemistry (Moscow). 1999. V. 64. P. 1305-1309.
122. Shen F.T., Goodfellow M., Jones A.L., Chen Y.P., Arun A.B., Lai W.A., Rekha P.D. and Young C.C. Gordonia soli sp. nov., a novel actinomycete isolated from soil 11 Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. V. 56. № 11. P. 2597-2601.
123. Shirling E.B. & Gottlieb D. Methods for characterization of Streptomyces species // Int. J. Syst. Bac-teriol. 1966. V. 16. P. 313-340.
124. Smole S.C., King L.A., Leopold P.E. and Arbeit R.D. Sample preparation of grm-positive bacteria for identification by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight // J. Microbiol. Methods. 2002. V. 48. P. 107-115.
125. Snel B., Bork P. and Huynen M.A. Genome phylogeny based on gene content // Nat. Genet. 1999. V.21.P. 108-110.
126. Sohn K., Hong S.G., Bae K.S. and Chun J. Transfer of Hongia koreensis Lee et al. 2000 to the genus Kribbella Park et al. 1999 as Kribbella koreensis comb. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P.1005-1007.
127. Song J., Kim B.-Y., Hong S.-B., Cho H.-S., Sohn K., Chun J. and Suh J.-W. Kribbella solani sp. nov. and Kribbella jejuensis sp. nov., isolated from potato tuber and soil in Jeju, Korea // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V. 54. P. 1345-1348.
128. Song G.C., Yasir M., Bibi F., Chung E.J., Jeon C.O. and Chung Y.R. Nocardioides caricicola sp. nov., an endophytic bacterium isolated from a halophyte, Carex scabrifolia Steud. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2011. V. 61. P. 105-109.
129. Stackebrandt E. & Goebel B.M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. V. 44. P. 846-849.
130. Stackebrandt E., Rainey F.A. and Ward-Rainey N.L. Proposal for a new hierarchic classification system, Actinobacteria classis nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. V. 47. P. 479-491.
131. Staneck J.L. & Roberts G.D. Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin layer chromatography // Appl. Microbiol. 1974. V. 28. P. 226-231.
132. Sutcliffe I.C. The lipoteichoic acids and lypoglycans of Gram-positive bacteria: a chemotaxonomic perspective // System. Appl. Microbiol. 1994. V. 17. P. 467-480.
133. Suzuki K. & Komagata K. Taxonomic significance of cellular fatty acid composition in some cory-neform bacteria// Int. J. Syst. Bacteriol. 1983. V. 33. P. 188-200.
134. Suzuki K., Goodfellow M. and O'Donnel. Cell envelope and classification // In: Handbook of New Bacterial Systematics. Edited by Goodfellow M. & O'Donnel A.G. London: Academic Press. 1993. P. 195-250.
135. Tabor C.W. & Tabor H. Polyamines in microorganisms // Microbiol. Rev. 1985. V. 49. P. 81-99.
136. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M. and Kumar S. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods // Mol. Biol. .Evol. 2011. V. 28 (10). P. 2731-2739.
137. Takeuchi M. and Yokota A. Cell-wall polysaccharides in coryneform bacteria // J. Gen. Appl. Microbiol. 1989. V. 35. P. 233-252.
138. Tindall B.J., Rossello-Mora R., Busse H.-J., Ludwig W. and Kampfer P. Notes on the characterization of prokaryote strains for taxonomic purposes // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010. V. 60. P. 249-266.
139. Trujillo M.E., Kroppenstedt R.M., Schumann P. and Martinez-Molina E. Kribbella lupini sp. nov., isolated from the roots of Lupinus angustifolius II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. V. 56. P. 407411.
140. Tul'skaya E.M., Senchenkova S.N., Evtushenko L.I., Shashkov A.S. and Naumoval.B. A new neuTtral polymer from the cell wall of actinomycete Kineosporia aurantiaca VKM Ac-702 // Carbohydr. Res. 2005. V. 340. P. 1247-1251.
141. Tyth E.M., Keki Z., Homonnay Z.G., Borsodi A.K., Marialigeti K. and Schumann P. Nocardioides daphniae sp. nov., isolated from Daphnia cucullata (Crustacea: Cladocera) // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. V. 58. P. 78-83.
142. Urzi C., De Leo F. and Schumann P. Kribbella catacumbae sp. nov. and Kribbella sancticallisti sp. nov., isolated from whitish-grey patinas in the catacombs of St Callistus in Rome, Italy // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. V. 58. P. 2090-2097.
143. Urzi C., Salamone P., Schumann P. and Stackebrandt E. Marmoricola aurantiacus gen. nov., sp. nov., a coccoid member of the family Nocardioidaceae isolated from a marble statue // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 529-536.
144. Vandamme P. & Dawyndt P. Classification and identification of the Burkholderia cepacia complex: Past, present and future // Syst. Appl. Microbiol. 2011. V. 34. P. 87-95.
145. Vandamme P., Pot B., Gillins M., De Vos P., Kersters K. and Swings J. Poliphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics // Microbiol. Rev. 1996. V. 60. P. 407-438.
146. Vaneechoutte M. DNA fingerprinting techniques for microoorganisms // Mol. Biotechnol. 1996. V. 6. P. 115-142.
147. Vargha M., Takats Z., Konopka A. and Nakatsu C.H. Optimization of MALDI-TOF MS for strain level differentiation of Arthrobacter isolates // J. Microbiol. Methods. 2006. V. 66. P. 399^409.
148. Versalovic J., Schneider M., de Bruijn F.J. and Lupski J.R. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction // Meth. Cell Mol. Biol. 1994. V. 5. P. 25-40.
149. Vimr E.R., Kalivoda K.A., Deszo E.L. and Steenbergen S.M. Diversity of microbial sialic acid metabolism // M. M. B. R. 2004. V. 68. P. 132-153.
150. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., Van de Lee T., Homes M., Frijters A., Pot J., Peleman J. and Kuiper M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting // Nucl. Acids Res. 1995. V. 23. P. 4407—4414.
151. Wang Y.M., Zhang Z.S., Xu X.L., Ruan J.S. and Wang Y. Actinopolymorpha singaporensis gen. nov., sp. nov., a novel actinomycete from the tropical rainforest of Singapore // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V. 51. P. 467^173.
152. Ward J.B. Teichoic and teichuronic acids: biosynthesis, assembly, and location // Microbiol. Rev. 1981. V. 45. P. 211-243.
153. Weckesser J., Drews G. and Mayer H. Lipopolysaccharides of photosynthetic prokaryotes // Ann. Rev. Microbiol. 1979. V. 33. P. 215-239.
154. Welker M. & Moore E.R.B. Applications of whole-cell matrix-assisted laser-desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in systematic microbiology // Syst. Appl. Microbiol. 2011. V. 34. P. 2-11.
155. Welsh J. & McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. P. 7213-7218.
156. Williams J.G.K., Kubelic A.R., Livak K.J., Rafalski J.A. and Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. P. 65316535.
157. Wilson K. Preparation of Genomic DNA from Bacteria // In: Current Protocols in Molecular Biology. 1997. John Wiley & Sons, Inc.
158. Xu Z., Xu Q., Zheng Z., Huang Y. Kribbella amoyensis sp. nov., isolated from the rhizosphere soil of a pharmaceutical plant, Typhonium giganteum Engl. 11 Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2011 (in Press).
159. Yabe S., Aiba Y., Sakai Y., Hazaka M. and Yokota A. Thermasporomyces composti gen. nov., sp. nov., a thermophilic actinomycete isolated from compost // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2011. V. 61. P. 86-90.
160. Yoon J.H., Lee S.T. and Park Y.-H. Genetic analyses of the genus Nocardioides and related taxa based on 16S-23S rDNA internally transcribed spacer sequences // Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. V. 48. P. 641-650.
161. Yoon J.H., Kim I.G., Lee M.H., Lee C.H. and Oh T.K. Nocardioides alkalitolerans sp. nov., isolated from an alkaline serpentinite soil in Korea // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V. 55. P. 809-814.
-
Автух, Александр Николаевич
-
кандидата биологических наук
-
Пущино, 2012
-
ВАК 03.02.03
