Роль ретропозонов ALU-семейства в регуляции генной экспрессии в клетках линий НЕК293 и А549 человека

Усманова, Надежда Маратовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль ретропозонов ALU-семейства в регуляции генной экспрессии в клетках линий НЕК293 и А549 человека
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль ретропозонов ALU-семейства в регуляции генной экспрессии в клетках линий НЕК293 и А549 человека"

На правах рукописи

003166957

УСМАНОВА ^^^ Надежда Маратовна

РОЛЬ РЕТРОПОЗОНОВ АШ-СЕМЕЙСТВА В РЕГУЛЯЦИИ ГЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ ЛИНИЙ НЕК293 И А549 ЧЕЛОВЕКА

03.00 25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

16 дпр гт

Санкт-Петербург 2008

003166957

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Казаков Василий Иванович Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Воробьев Владимир Иосифович

доктор биологических наук, профессор Горбунова Виктория Николаевна

Ведущая организация: ВНИИ Генетики и разведения

сельскохозяйственных животных, Санкт-Петербург - Пушкин

Защита состоится 25 апреля 2008 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 002 230 01 при Институте цитологии РАН по адресу 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр , д 4 http //www cytspb rssi ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан SJ марта 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук лЛиР^^ ЕВ Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Секвенирование генома человека позволило установить, что -55% нуклеотидной последовательности составляют различные повторяющиеся элементы [1] Изначально эти последовательности относили к «эгоистической ДНК», представляющей собой нефункциональную часть генома В последние годы накапливаются доказательства того, что те или иные повторяющиеся элементы генома выполняют различные функции, как на генном, так и на геномном уровнях [2, 3] Ретропозоны Alu семейства относятся к классу SINE повторов (короткие диспергированные нуклеотидные элементы) и представлены более 106 копий в геноме человека В настоящее время имеются данные, указывающие на то, что Alu повторы могут участвовать в регуляции генной экспрессии на нескольких уровнях [4, 5] Например, Alu повторы содержат в своем составе множественные CpG динуклеотиды, являющиеся сайтами метилирования в геноме Посредством метилирования осуществляется не только регуляция генной экспрессии, но и контроль эмбрионального развития, а также подавление амплификации мобильных элементов генома [6] Многие исследования показали наличие в Alu повторах сайтов связывания транскрипционных факторов Экспериментально доказано связывание некоторых из этих транскрипционных факторов, например, Yin Yang 1 (YY1), Estrogen receptor a (ERa), Stimulating protein 1 (Spl), с консенсусной последовательностью Alu [7] Инсерции Alu повторов в экзоны белок-кодирующих генов, в области экзон-интронных границ, а также незаконная гомологичная рекомбинация между различными копиями Alu могут приводить к возникновению наследственных заболеваний [4] Показано, что Alu РНК стимулирует трансляцию всех репортерных мРНК в бесклеточной системе трансляции [8] Регуляция стабильности транскрипта может осуществляться за счет связывания Alu повтора, локализованного в З'-нетранслируемой области, с SRP9/14 субъединицей сигнал-распознающей частицы [9]

Регуляция генной экспрессии является важным этапом в поддержании клеточного гомеостаза Она лежит в основе клеточной пролиферации и дифференцировки в ходе эмбрионального развития Изменение экспрессии генов в ответ на внеклеточные стимулы обуславливает адаптацию организмов к условиям окружающей среды [ 10]

В свете вышеизложенного, изучение роли Alu повторов в регуляции генной экспрессии представляется актуальной задачей Такие исследования позволят не только детализировать механизмы регуляции, но и сделать выводы касательно функций повторяющихся элементов генома

Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в исследовании регуляции экспрессии генов посредством Alu повторов на уровне транскрипции и на уровне формирования факультативного гетерохроматина Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи

1) При помощи методов компьютерного анализа выбрать гены для изучения роли Alu повторов, локализованных в промоторах, в регуляции экспрессии генов,

2) Экспериментально показать сайленсерную или энхансерную функцию Alu повторов, расположенных в промоторах выбранных генов, в постоянных клеточных линиях человека,

3) На примере AluYa5 повтора, содержащегося в 16-м интроне гена ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), показать функциональную роль Alu повторов, локализованных в интронах,

4) На примере инактивации X хромосомы показать возможность функционирования Alu повторов и SfNE повторов мыши в качестве вспомогательных элементов при формировании факультативного гетерохроматина

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Alu повторы, локализованные в промоторах генов лиганда циклофилипа, регулирующего кальциевый ответ (CAML) и дезоксирибонуклеазы II (DNAse II), участвуют в регуляции их транскрипции в клетках линий НЕК293 и А549 человека

2 Инсерция AluYa5 повтора в 16-й интрон гена АПФ коррелирует с уровнем фенилаланина и смеси лейцин+изолейцин в плазме крови людей

3 Alu-ассоциированные кластеры сайтов связывания транскрипционных факторов (ССТФ) способствуют формированию в ходе эволюции регуляторных элементов в промоторах и интронах некоторых человеческих генов

4 Распределения Alu повторов человека и SINE повторов мыши (Bl, В2), но не LINE1 повторов, в X хромосомах коррелируют с распределениями CpG островков, белок-кодирующих генов и некоторых маркеров гетерохроматина

Вспомогательными элементами при формировании факультативного гетерохроматина в ходе инактивации X хромосомы могу! служить SINE-ассоциированные негативные элементы транскрипции

Научная новизна. Впервые предложен принцип поиска в промоторах генов Alu повторов, участвующих в регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции Этот принцип подтвержден экспериментально на примере Alu повторов, локализованных в промоторах генов CAML и DNAsell Впервые показано, что инсерция AluYa5 повтора в 16-й интрон гена АПФ коррелирует с уровнем некоторых аминокислот в плазме крови людей На этом примере показана функциональная роль Alu повторов, локализованных в интронах Впервые показано, что Alu повторы человека и SINE повторы мыши могут участвовать в регуляции генной экспрессии на уровне формирования факультативного гетерохроматина в ходе инактивации X хромосомы

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в работе результаты важны для понимания функций повторяющихся элементов генома Работа вносит определенный вклад в современные представления о механизмах регуляции экспрессии генов В практическом отношении представляет интерес установленная корреляция между инсерционно-делеционным полиморфизмом в гене АПФ и уровнем фенилаланина и смеси лейцин+изолейцин в плазме крови людей Коррекция уровня свободных аминокислот имеет значение при лечении некоторых наследственных заболеваний, в частности, аминоацидопатий Результаты настоящего исследования могут быть использованы в курсах лекций по клеточной и молекулярной биологии для студентов медицинских и биологических специальностей высших учебных заведений

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007), Международной конференции «II съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН» (Санкт-Петербург, 2007) Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научных семинарах

лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии Института цитологии РАН

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего З^/ссылок Диссертация изложена на dfi страницах и иллюстрирована Sf рисунками и ¿О таблицами

Список основных сокращений. CAML - ген лиганда циклофилина, регулирующего кальциевый ответ, DNAsell - ген дезоксирибонуклеазы II, LINE - (long interspersed nucleotide elements) - длинные диспергированные нуклеотидные элементы, LI - повторы LINE1 семейства, PcG -белки фуппы Polycomb, SINE - (short interspersed nucleotide elements) - короткие диспер! ированные нуклеотидные элементы, XIC - (X inactivation center) - центр инактивации X хромосомы, АПФ - ангиотензинпревращающий фермент, ПЦР -полимеразиая цепная реакция, ССТФ - сайты связывания транскрипционных факторов, ЦРМ - ifMC-регуляторный модуль

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Компьютерный анализ Из базы данных промоторов DBTSS (http //dbtss hgc jp) произвольным образом выбрали 3375 промоторов Каждый промотор содержал 1000 н п до и 200 н п после точки инициации транскрипции Нуклеотидные последовательности X хромосом человека и мыши взяли из базы данных Ensembl v 44 (www ensembl org) Alu повторы человека, SINE повторы мыши, LINE1 повторы и CpG островки идентифицировали в промоторах, в 16-м интроне гена АПФ и в X хромосомах при помощи программ RepeatMasker (www repeatmasker org) и CPGPLOT (www ebi ac uk/emboss/cpgplot/) Весовые матрицы для поиска ССТФ Spl, YY1 и ERa взяли из базы данных транскрипционных факторов TRANSFAC (www gene-regulation corn/pub/databases html/) Поиск ССТФ в промоторах осуществляли при помощи программы RSA-tools-patser (http //rsat ulb ас be/rsat/)

Клонирование фрагментов промоторов генов DNAse II и CAML в плазмидный вектор pGL3-Basic. При помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплифицировали различные фрагменты промоторов генов DNAse II и CAML

Последовательности олигоиуклеотидных праймеров подбирали при помощи программы Vector NTI™ (InforMax, США) Для удобства клонирования в 5'-концы праймеров вводили сайты для эндонуклеаз рестрикции Bgñ I, Xho\ или Hind III Для более точной амплификации мы использовали смесь двух полимераз - PlatinurnDP/x DNA Polymerase и Taq DNA Polymerase (Invitrogen, США) Температуру отжига (Т01Ж °С) подбирали экспериментально для каждой пары праймеров В качестве матрицы использовали геномную ДНК, выделенную из лейкоцитарной фракции периферической крови человека По окончании ПЦР реакционную смесь очищали от излишков праймеров, dNTPs и полимераз при помощи QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen, Германия) Продукты ПЦР и вектор pGL3-Basic (Promega, США) обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Bgñl, Xhol или Hm dill Векторную ДНК дополнительно обрабатывали щелочной фосфатазой Shrimp Alkaline Phosphatases (Fermentas, Литва) После рестрикции фрагменты ДНК разделяли при помощи электрофореза в 0,7 %-ом агарозном геле и выделяли из геля при помощи QIAquick Gel Extraction Kit (Quiagen, Германия) Затем проводили лигирование вектора и вставки в соотношении 1 3 при помощи ДНК-лигазы фага Т4 (Invitrogen, США) Трансформацию бактериального штамма Е coli DH5a продуктами лигазной реакции проводили по методу Мандела и Хиги [11] с применением хлористого кальция Плазмидиую ДНК из положительных трансформантов выделяли при помощи Plasmid Midi Kit (Quiagen, Германия) Наличие необходимых фрагментов промоторов в рекомбинантных плазмидах подтверждали секвенированием

Траисфекция клеточных линий человека рекомбинантными плазм идами и измерение активности люциферазы Клетки карциномы легкого человека линии А549 и клетки почки эмбриона человека линии НЕК293, предоставленные банком клеточных культур Института цитологии РАН, культивировали в среде RPMI 1640 (Биолот, Россия), содержащей 10% эмбриональной сыворотки телят (Gibco BRL, США), 1 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100мкг/мл стрептомицина Клетки котрансфицировали 0,5 мкг ДНК конструкции и 5 нг плазмиды pRL-TK при помощи реагента Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя Через 1 сутки после трансфекции клетки лизировали при помощи буфера Passive Lysis Buffer (Promega, США) Активность люцифераз измеряли ручным люминометром TD 20/20 DLReady™ Luminometer

(Turner BioSystems, США) при помощи Dual-Luciferase® Reporter Assay system (Promega, США) в соответствии с инструкциями изготовителя Векторы pGL3-Basic и pGL3-Control (Promega, США) использовали как отрицательный и положительный контроли соответственно Трансфекцию и измерения активности люциферазы в лизатах проводили трижды в двойной повторности

Определение I/D полиморфизма в гене АПФ. Геномную ДНК выделяли из лейкоцитарной фракции периферической крови К пробе крови добавляли лизирующий буфер, содержащий 0,15 мг/мл протеиназы К, 0,1 M NaCl, 20 мМ ЭДТА, 1 % додецилсульфата натрия и 50 мМ трис-HCl Полученную смесь инкубировали в течение ночи при 37 °С ДНК выделяли из лизата стандартным фенол-хлороформным метдом Амплификацию фрагмента 16-го интрона гена проводили при помощи ПЦР В качестве праймеров использовали следующие олигонуклеотидные последовательности прямой праймер 5'- CTG GAG АСС ACT ССС АТС СТТ ТСТ - 3', обратный праймер 5'- GAT GTG GCC АТС АСА TTC GTC AGA Т - 3' [12] Температура отжига праймеров составляла 60 °С Материал, полученный в результате ПЦР, подвергали разделению при помощи гель-электрофореза в 8% полиакриламидном геле По окончании разделения гель окрашивали при помощи бромистого этидия Фрагменты визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете

Определение уровня свободных аминокислот в плазме крови. Определение уровня свободных аминокислот в плазме крови проводили в клинико-диагностической лаборатории Санкт-Петербургской Медицинской Академии Последипломного Образования методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор генов для изучеиия функциональной роли Alu повторов, локализованных в промоторах. Консенсусная последовательность Alu повторов содержит г/г/орегуляторные элементы, которые взаимодействуют с различными эффекторами гормонами, кальцием, транскрипционными факторами [7, 13] Единичные изолированные ССТФ, как правило, не оказывают существенного влияния на транскрипцию большинства эукариотических генов Важную роль в регуляции экспрессии генов играют так называемые i/t/c-регуляторные модули

(ЦРМ) Они представляют собой последовательности ДНК длиной 100-1000 нп, с которыми взаимодействует целый набор транскрипционных факторов Различными группами исследователей [14-16] было показано, что важную роль в регуляции транскрипции в ходе раннего эмбрионального развития у Diosopfiila melanogaster играют кластеры сайтов связывания 3-6 транскрипционных факторов, плотность которых превышает некоторое критическое значение Для изучения функциональной роли Alu повторов мы решили выбрать промоторы белок-кодирующих генов, которые содержат в своем проксимальном сегменте Alu элементы, перекрывающиеся с CpG островками и ЦРМ ЦРМ мы считали те области в составе промоторов, которые, имея длину не более 700 н п , содержали 7 или более ССТФ Spl, ERa, YY1 При помощи методов компьютерного анализа мы идентифицировали перечисленные элементы в последовательностях 3375 промоторов, выбранных случайным образом

Фракция Alu повторов в промоторах составила 7,5%, что ниже содержания Alu в интронах, в межгенных промежутках, а также в геноме в целом Вероятно, в ходе эволюции выработались механизмы, препятствующие инсерции Alu повторов в промоторы белок-кодирующих генов Оказалось, что с Alu повторами перекрываются лишь 133 из 3044 идентифицированных в промоторах CpG островков Из этих 133 CpG островков 48 (1,58%) находятся в проксимальном положении в промоторах Большая часть Alu повторов в геноме метилирована [17] и, следовательно, путем спонтанной реакции дезаминирования в них происходит постепенное снижение фракции CpG-динуклеотидов [18] Остается неясным, почему некоторые члены этого семейства повторов неметилированы и способствуют формированию CpG островков Мы полагаем, что Alu повторы, ассоциированные с CpG островками, участвуют в регуляции генной экспрессии, так как могут нести в своем составе важные цис-регуляторные элементы для РНК-полимеразы II

В результате компьютерного анализа мы идентифицировали несколько белок-кодирущих генов, промоторы которых полностью удовлетворяют нашим критериям Например, ген выживаемости мотонейронов (SMN), 1ен человеческого гомолога белка Rad51 дрожжей (hRad51), ген субъединицы 4 пуринэргического рецептора (Р2Х), ген субъединицы IV третьего фактора инициации трансляции эукариот (EIFS4), ген, ассоциированный с многоочаговой лейкоэнцефалопатией (MLC1), ген поли(АДФ-рибоза) полимеразы 1 (ADPRT1), ген субъединицы В

сукцинатдегидрогеназного комплекса (SDHB). В качестве моделей для дальнейшего

исследования функциональной роли Alu повторов в промоторах были выбраны

промоторы двух генов: дезоксирибонуклеазы II (DNAse II) и лиганда циклофилина,

регулирующего кальциевый ответ (CAML) (рис. 1).

Рис. 1. Схема строения промоторов генов С AML (а) и DNAse II (б) и расположения олигонуклеотидных праймеров, используемых в ПЦР. Spl, YYI, ER - сайты связывания транскрипционных факторов Spl, YYI, ERa; ЦРМ - цис-регуляториый модуль:

CaMAluF2, CaMDF, CaMF, DNA ¡иF. DNAluF2, DNF -прямые олигопуклеотидпые праймеры, CaMAluR, CaMR, DNAluR, DNR - обратные олигопуклеотидпые праймеры; CpG - CpG островки; AluSg, AluJb, AluSq - Alu повторы различных подсемейств. Ноль на оси соответствует точке инициации транскрипции. Звездочками отмечены сайты связывания Spl, функциональная значимость которых выла доказана экспериментально [19].

На первом этапе мы амплифицировали различные фрагменты этих промоторов при помощи ПЦР. Олигонуклеотидиые праймеры для реакции выбирали таким образом, чтобы ее продукты различались по составу элементов: Alu повторов и CpG островков (Табл. 1). Продукты ПЦР субклонировали в полилинкер плазмиды pGL3-Basic, содержащей репортерный ген люциферазы Photinus pyralis (рис. 2). Полученными конструкциями трансфицировали клетки линии карциномы легкого человека (А549) и почки эмбриона человека (НЕК293). Эти линии были выбраны по следующим причинам: по литературным данным в легких и почках наблюдается высокий уровень экспрессии генов DNAse II и CAML, культивирование этих клеток не требует особых условий и сложных по составу сред, а эффективность трансфекции этих клеток относительно высокая. Для внутреннего контроля эффективности

CAML

CsMAluF! CsHOF CaMF

трансфекции клеток мы проводили котрансфекцию полученных конструкций с вектором рКЬ-ТК, который содержит ген люциферазы ЯетНа гет/дтт и промотор гена тимидинкиназы вируса простого герпеса Вектор рСЬЗ-Соп№о1 использовали в качестве положительного контроля трансфекции Он отличается от вектора рОЬЗ-Ва81с тем, что перед геном люциферазы в него встроен промотор вируса 8У40 обезьян, а после гена - его энхансер

Таблица 1. Состав ампчифицируемых фрагментов промоторов

№ п/па Пара праймеров Лмплифицируе-мый фрагмент0 Длина, н п Состав амплифицируемого фрагмента

1 ОКАШИ-ОНАЫЯ -926/+163 1089 ■ш 1 АЫЬ I I А1и8с| | о нб! | СрС5 || СрОГ

2 ОЫА1иР2-ОКА1иЯ -603/+163 766 -6011 А1и8ч | о нбз 1 СрО II СрО|'

3 -161/+163 324 -181 а па 1 СрО г

5 ОКА1иР2- ож -603/+243 846 -лоз 1 А1и$ц I а »2« 1 СрО II сро Г

6 ПОТ-ОЫИ -161/+243 404 1 сро|'

7 СаМА1иР2-СаМА1иЯ -908/+116 1024 -908 I АЬ^ I 0 4116

8 СаМБР-СаМА1иЛ -549/+116 665 -549 1 А1оБ§ I « +116 1 СрО I I С*С|

9 СаМР-СаМА1иЯ -178/+116 294 -178 0 »116 1 С^О|

10 СаМА1иР2-СаМЯ -908/+215 1123 -908 | А1иБВ I 0 -<215 | СрО I I €¿0 |

11 СаМОР-СаМЯ -549/+215 764 -49 | I 0 +215 1 СрО I I с№ |

12 СаМР-СаМЯ -178/+215 393 -178 0 +215 1 С[кз |

"Пары праймеров №№1-6 испочьзуются для амплификации фрагментов промотора гена DNA.se II, №№7-12 - САМЬ, ''Положение амплифицаруемого фрагмента указано относительно точки инициации транскрипции

Результаты измерения активносш люциферазы в лизатах клеток, трансфицироваиных различными конструкциями. В ходе измерений определяли

относительную люциферазную активность лизата - отношение интенсивностей люминесценции, сопровождающей две люциферазные реакции: с участием люциферазы Photinus pyralis и с участием люциферазы Renilla reniformis. Результаты измерения активности люциферазы в лизатах клеток линий А549 и НЕК293, трансфицированных различными конструкциями, представлены на рис. 3. Относительная люциферазная активность для положительного и отрицательного контролей составила соответственно 2,0 ±0,1 и 415 ±25 (для клеток линии А549) или 2,6±0,7 и 3272+170 (для клеток линии НЕК293). Клетки линии НЕК293 трансфицировали только конструкциями -908/+116, -549/+116, -178/+1I6 (CAML) и -926/+243, -603/+243, -116/+243 (DNAse II). Выбор данных конструкций был обусловлен результатами, полученными при измереиии активности люциферазы в лизатах трансфицированных клеток линии А549.

Рис. 2. Карта плазмиды pGL3-Basic: luc+ - ген люциферазы Photinus pyralis, Amp' - ген [3-лактамазы, обусловливающий устойчивость бактерии-хозяина к ампициллину, fl orí - fl орнджин репликации. Жирным шрифтом выделены эндонуклеазы рестрикции, по сайтам которых проводили клонирование фрагментов промоторов.

Рис. 3. Результаты измерения активности люцифераз в лизатах клеток линий А549 и НЕК293, трансфицированных конструкциями, содержащими различные фрагменты промоторов генов САМЬ (а) и ТЖАхе II (б).

Заштрихованные столбики - результаты для клеток линии НЕК293, светлые - для клеток линии А549.

Для конструкций с фрагментами промотора гена CAML (рис 3, а) самая высокая активность (для обеих клеточных линий) соответствовала конструкции -178/+U6, которая не содержала в своем составе Alu Активность люциферазы в лизатах клеток, трансфицированных конструкцией -549/+116, была на 32 (линия А549) и на 23 % (линия НЕК293) ниже Эта конструкция включает в себя фрагмент промотора, содержащий повтор AluSg Активность люциферазы, соответствующая конструкции -908/+116, достоверно не отличалась от активности, соответствующей конструкции -549/+116, в клетках линии А549, но отличалась в клетках линии НЕК293 Конструкции -908/+215, -549/+215, -178/+215 при трансфекции в клетки линии А549 показали активность на порядок меньшую, чем конструкции -178/+116, -549/+116 и -908/+116 (на рисунке не показано, см стр 97 диссертации) При этом активности, соответствующие этим конструкциям, достоверно не отличались друг от друга Для конструкций с фрагментами промотора гена DNAse II (рис 3, б) самая высокая активность (для обеих клеточных линий) также соответствовала конструкции, не содержащей в своем составе Alu (-161/+243) Активность люциферазы в клетках, трансфицированных конструкцией -603/+243, содержащей AluSq повтор, была на 32 (линия А549) и на 60 % (линия НЕК293) ниже Люциферазная активность в лизатах клеток, трансфицированных конструкцией -926/+243, содержащей повторы AluJb и AluSq, была также ниже, но всего на 13 (линия А549) и на 32 % (линия НЕК293) После трансфекции в клетки линии А549 конструкции -926/+163, -603/+163, -161/+I63 показали активности люциферазы того же порядка, что и другие конструкции с фрагментами промотора гена DNAse II Эти активности не отличались друг от друга, но достоверно отличались от активности, соответствующей конструкции -161/+243 (на рисунке не показано, см стр 97 диссертации)

Таким образом, исследования промотора гена CAML показали, что AluSg-повтор, находящийся в районе -526/-271, ослабляет экспрессию гена как в клетках линии А549, так и в клетках линии НЕК293 Конструкции -908/+215, -549/+215, -178/+215 для клеток линии А549 показали активность на порядок меньшую, чем конструкции -178/+116, -549/+116 и -908/+116 Это может быть связано с тем, что на участке +116/+215 расположены два ССТФ Spl или же сайты связывания других транскрипционных факторов, которые мы не рассматривали в настоящей работе

Исследования промотора гена DNAse II показали, что AluSq повтор, находящийся в проксимальном сегменте, ослабляет, а повтор AluJb, локализованный в дистальном сегменте, усиливает экспрессию гена С AluJb повтором перекрываются два ССТФ ERa Возможность функционирования Alu повтора как ER-зависимого транскрипционного энхансера была показана на примере гена BRCA-1 [20] Помимо этого, воспользовавшись базой данных SAGEmap (www nebí nlm nih gov/sage), мы определили, что специфический маркер транскриптов гена DNAse II (AGCTGAGCTA) встречается в клетках MCF7, обработанных эстрадиолом, в 6 раз чаще Наши результаты свидетельствуют о том, что Alu повторы в составе промоторов генов CAML и DNAse II обладают аналогичной активностью в клетках линии А549 и НЕК293 Возможно, в клетках других типов эти Alu повторы обладают прямо противоположной активностью или не имеют таковой вовсе Тканеспецифическая активность некоторых сайтов для YY1 обнаружена на примере миозиновых генов мышей [21] Экспрессия обоих генов осуществляется во всех тканях человека Можно сделать предположение, что негативные Alu-ассоциированные элементы в промоторах генов CAML и DNAse II не работают в тех тканях, где гены экспрессируются на высоком уровне в лимфоцитах, тканях мозга и мочеполовой системы - ген CAML, в тканях простаты, легких, щитовидной железы -ген DNAse II (http //symatlas gnf org/SymAtlas/)

В гене паратиреоидного гормона был обнаружен негативный кальций-чувствительный элемент 2-го типа (nCARE2) расположенный в Alu повторе, находящимся за 3,6 т п н вверх по течению от точки инициации транскрипции [22] Таким образом, Alu повторы могут выполнять регуляторную функцию, находясь за несколько тысяч пар нуклеотидов от точки инициации транскрипции Мы обнаружили, что область -5000/0 гена DNAse II содержит еще 3 Alu повтора, помимо тех, которые указаны на рис 1 Область -5000/0 гена CAML содержит еще 6 полноразмерных и 7 частично делетированных Alu повторов Вполне вероятно, что указанные последовательности также участвуют в регуляции экспрессии этих генов Помимо этого, интроны указанных генов также содержат многочисленные Alu элементы

Вероятнее всего, инсерция Alu повторов в промоторы генов CAML и DNAse II произошла до дивергенции архантропов и высших обезьян, так как они содержатся в

гомологичных локусах шимпанзе (Pan troglodytes) и макаки-резуса (Масаса mulatto) При этом число ССТФ, ассоциированных с Alu повторами, неодинаково у разных видов У человека ЦРМ полностью перекрываются с промоторами, в то время как у обезьян в промоторах уже можно обнаружить фрагменты, в которых плотность ССТФ меньше критического значения Возможно, что данные гены регулируются у обезьян посредством Alu повторов иным образом или не регулируются вовсе На данном примере видно, что в ходе эволюции может происходить формирование ЦРМ Изначальное наличие в промоторах Alu повторов, перекрывающихся с ССТФ, ускоряет этот процесс

Анализ 16-го интрона гена АПФ. В результате компьютерного анализа в составе нуклеотидной последовательности 16-го интрона гена АПФ нами был обнаружен ЦРМ, перекрывающийся с двумя Alu повторами и CpG островком (рис 4 ) Полиморфизм гена АПФ по типу инсерция/делеция (I/D) определяется

16-м интроне

Рис. 4. ЦРМ в составе 16-го интрона гена АПФ Звездочкой обозначен AluYa5-noemop, серым цветом - CpG островок, плюсами - ЦРМ Цифрами обозначено расстояние в m пн от точки инициации транскрипции

Известно, что у инсерционных гомозигот (II) уровень АПФ в плазме крови вдвое ниже, чем у делеционных гомозигот (DD) [23] На основании того, что Alu повтор локализован в интроне, многие исследователи считают маловероятной возможность его непосредственного участия в регуляции экспрессии гена В большинстве случаев они склоняются к мысли, что Alu повтор находится в неравновесном сцеплении с каким-либо локусом количественных признаков Однако поиски функциональных полиморфизмов пока что не увенчались успехом [24] Мы полагаем, что в случае гена АПФ AluYa5 повтор играет роль транскрипционного сайленсера Примеры негативной регуляции экспрессии генов транскрипционными факторами YY1 и ERa хорошо известны [25, 26], фактор Spl также может выступать в роли репрессора транскрипции [27]

Влияние ID-полиморфизма в гене АПФ на уровень фенилаланина и смеси лейцин+изолейцин в плазме крови людей. Проанализировав ди- и трипептиды,

наличием или отсутствием AluYa5 повтора в

125 13 0 135 140 145 ISO

ЬКа

SP1 II 1

!i 1 1 1 1 ' , VV1 II

1 1

отщепляемые АПФ от его основных субстратов, мы пришли к выводу, что в их состав входит неодинаковое количес1во различных аминокислотных остатков Поскольку уровень фермента в крови у делеционных гомозигот превосходит таковой у инсерционных гомозигот почти в два раза, у нас возникло предположение о возможной корреляции между инсерцией AluYa5 повтора в 16-й интрон и уровнем некоторых аминокислот в плазме крови людей Нами были определены I/D полиморфизм в гене АПФ и уровень свободных аминокислот в плазме крови у 102 человек [28] Статистическая обработка материалов проводилась при помощи t-критерия Стьюдента Во всех случаях различия в уровнях свободных аминокислот между II и ID, а так же между DD и ID оказались недостоверными У ID этот уровень практически не отличался от средних значений У DD по отношению к II оказались повышены уровни Leu+Ile (Р = 0,03) и Phe (Р = 0,004)

Анализ X хромосом человека и мыши. Инактивация X хромосомы - это один из наиболее примечательных примеров эпигенетической регуляции генной экспрессии, посредством которой происходит полное подавление транскрипции большинства генов одной из двух хромосом в диплоидных соматических клетках самок млекопитающих Она инициируется в так называемом «центре инактивации» (XIC) и распространяется в обе стороны in cis [29] Самым важным геном этого района является Xist Усиленная транскрипция гена Xist начинается на ранних стадиях эмбриогенеза Образующаяся нетранслируемая Xist РНК специфически покрывает инактивированную X хромосому в течение клеточного цикла Это приводит к многочисленным последовательным модификациям гистонов, которые способствуют установлению и поддержанию транскрипционно неактивного гетерохроматина [30, 31] Еще одним признаком гетерохроматина является метилирование CpG островков, локализованных в промоторах [32] Согласно принятой модели, в X хромосоме имеются специализированные вспомогательные элементы («way stations» или «boosters»), которые способствуют процессу распространения инактивации [33] Сначала Xist РНК связывается с вспомогательными элементами, расположенными около XIC, индуцируя тем самым локальные конформационные изменения Вследствие этого становится возможным связывание с белками, способствующими гетерохроматинизации РНК-белковые комплексы привлекают более удаленные вспомогательные элементы, происходит

кооперативное распространение инактивации Была выдвинута гипотеза, утверждающая, что подобными «way station» являются LINE повторы, в частности, LINE1 (LI) повторы мыши и человека [34]

При помощи методов компьютерного анализа мы установили, а затем сравнили распределения генов, SINE и LI повторов, CpG островков и некоторых маркеров гетерохроматина в X хромосомах человека и мыши (рис 5 ) Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что распределение SINE повторов (Alu и В1, В2-В4), но не LI повторов, сходно с распределениями CpG островков и таких важных признаков факультативного i етерохроматина в X хромосоме, как Xist РНК и НЗ-К27тЗ (триметилирование гистона НЗ по лизину в 27-м положении) Известно, что распределение другого маркера гетерохроматина - убиквитинилированного гистона Н2А по лизину в 119-м положении - также совпадает у мыши с распределением ген-богатых сегментов, а также с распределением Xist РНК [35] Исходя из вышесказанного, мы полагаем, что именно SINE повторы млекопитающих играют роль вспомогательных элементов при распространении инактивации вдоль X хромосомы

Важную роль в инактивации X хромосомы играют белки группы Polycomb (PcG), которые могут образовывать два белковых комплекса - Polycomb repressive complex 1 и 2 Белки EED и Ring 1 А/В этой группы осуществляют метилирование гистона НЗ по лизину в 27-м положении и убиквитинилирование гистона Н2А соответственно [36, 37] Транскрипционный фактор YY1 единственный из всей группы PcG способен специфически связываться с последовательностью ДНК Мы считаем, что взаимодействие комплексов PcG с SINE повторами может осуществляться за счет связывания с ССТФ YY1 Известно, что ССТФ YY1 присутствуют в консенсусной последовательности Alu Кроме того, непосредственное связывание YY1 с Alu было доказано нами экспериментально [38]

Мы обнаружили (рис 6 ), что распределение Alu повторов (но не LI повторов) строго коррелирует с распределением ССТФ YY1, то есть большое число Alu повторов, локализованных в X хромосоме, могут связывать YY1 Мотив CCATSTTGNC, который является консенсусной последовательностью ССТФ YY1 у человека, не обнаруживает корреляции с SINE повторами мыши При этом, консенсусная последовательность В2 элементов у мыши содержит мотив

ОССАТСТСАСС, который, вероятно, и является сайтом связывания УУ1 у мышей, что, однако, требует экспериментального подтверждения.

Рис. 5. (а) Распределение генов, Alu повторов, CpG островков и LINE повторов (L1) в X хромосоме человека. Распределение НЗ-К27тЗ взято из [39]. (б) Распределение генов, SINE повторов (В1, В2-В4), CpG островков и L1 в X хромосоме мыши. Распределение Xist РНК взято аз [35].

а 6

I3 - 0,840 , . г* = 0,250 •

§ 300 го <л 200 со > 5 100 2Е и 0 Л* * 300 2 х 200 to со >• g 100 3 X 0 • 'к » * * •: ♦ * •

О 5 10 15 20 25 доля Alu, % 0 10 20 30 40 50 60 70 доля L1,%

Рис. 6. Корреляция между потенциальными сайтами связывания YYl (YBS) и плотностью Alu повторов (а) и LI (б) в Xхромосоме человека

ВЫВОДЫ

1. Транскрипция генов CAML и DNAsell в клетках линий НЕК293 и А549 регулируется Alu повторами, локализованными в их промоторах

2. Инсерция А1иУа5-повтора в 16-й интрон гена ангиотензинпревращающего фермента приводит к формированию в его составе z/иорегуляторного модуля и коррелирует с уровнем Phe и Leu+Ile в плазме крови людей

3. Глобальное распределение Alu повторов человека и SINE повторов мыши (Bl, В2) в X хромосомах коррелирует с распределением СрО островков и белок-кодирующих генов

4. SINE-ассоциированные негативные элементы транскрипции могут служить вспомогательными элементами при формировании факультативного гетерохроматина в ходе инактивации X хромосомы

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Oei S L , Babich V S , Kazakov V I, Usmanova N.M., Kropotov A V , Tomilm N V 2004 Clusters of regulatory signals for RNA polymerase II transcription associated with Alu family repeats and CpG islands in human promoters Genomics 83 873-882

2 Казаков В И , Кадурина Т И , Усманова Н.М , Томилин Н В 2003 Влияние инсерционно-делеционного полиморфизма в гене ангиотензин-превращающего фермента на уровень свободных аминокислот в сыворотке крови больных с дисплазиями соединительной ткани Генетика 39(8) 1136-1140

Имеется перевод: Kazakov V I, Kadunna Т I, Usmanova N.M., Tomilin N V 2003 Insertion-deletion polymorphism of the angiotensin converting enzyme gene and its relationship to serum levels of free amino acids in the patients with connective tissue dysplasias Russian Journal of Genetics 39 955-959

3 Усманова H.M., Казаков В И , Томилин Н В 2008 Ретропозоны Alu-семейства из г/г/с-регуляторных модулей промоторов генов DNAse II и CAML влияют на генную экспрессию в клетках А549 и НЕК293 Цитология 50 (3) 249-255

4 Усманова Н.М., Казаков В И, Томилин Н В 2008 SINE элементы в геномах млекопитающих могут служить вспомогательными элементами при формировании факультативного гетерохроматина Цитология 50 (3) 256-260

5 Усманова Н.М., Казаков В И 2007 Роль Alu повторов в регуляции экспрессии гена дезоксирибонуклеазы II человека Сборник материалов международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии», Томск, Май 9-12 1 172-173

6 Усманова Н.М., Казаков В И, Томилин Н В 2007 Особенности строения промотора гена CAML человека и роль Alu повтора в регуляции экспрессии этого гена Материалы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, Июнь 5-7 1 44-45

7 Усманова Н.М., Казаков В И , Томилин Н В 2007 О роли ретротранспозонов Alu семейства в негативной регуляции транскрипции в клетках человека Тезисы докладов и сообщений, представленных на II съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН, Санкт-Петербург, Октябрь 16-19, Цитология 49(6) 800

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

I. Lander ES et al 2001 Nature 409 860-921 2. Makalowski W 2003 Science 300 1246-1247 3. Slotkin R К , Martienssen R 2007 Nat Rev Genet 8 272-285 4. Graver D et al 2005 Genetica 124 273-289 5. Hasler J, Strub К 2006 Nucleic Acids Res 34 5491-5497 6. Paulsen M , Ferguson-Smith А С 2001 J Pathol 195 97-110 7. Polak P , DomanyE 2006 BMC Genomics 7 133 8. Hasler J, Strub К 2006 Nucleic Acids Res 34 2374-2385 9. Hasler J et al 2007 Cell Mol Life Sci 64 1793-1800 10. Villard J 2004 Swiss Med Wkly 134 571-579 11. Mandel M, Higa A 1970 J Mol Biol 53 159-62 12. Rigat В et al 1992 Nucleic Acids Res 20 1433 13. Shankar R et al

2004 BMC Evol Biol 4 37 14. Berman BP et al 2002 Proc Natl Acad Sci USA 99 757-762 15. HalfonMS et al 2002 Genome Res 12 1019-1028 16. Rajewsky N et al 2002 BMC Bioinformatics 3 30 17. Weisenberger D J et al 2005 Nucleic Acids Res 33 6823-6836 18. Xing J et al 2004 J Mol Biol 344 675-682 19. Chou S F et al 2003 Eur J Biochem 270 1855-1862 20. Norris J et al 1995 J Biol Chem 270 2277722782 21. Caretti G et al 2004 Genes Dev 18 2627-2638 22. Hamdi H К et al 2000 J Mol Biol 299 931-939 23. Rigat В et al 1990 J Clin Invest 86 1343-1346 24. Sayed-Tabatabaei F A etal 2006 Circ Res 98 1123-1133 25. Gordon S et al 2006 Oncogene 25 1125-1142 26. Heldring N etal 2007 Physiol Rev 87 905-931 27. Won J etal 2002 J Biol Chem 277 38230-38238 28. Казаков В И и др 2003 Генетика 39 (8) 1136-1140 29. Duthie S М etal 1999 Hum Mol Genet 8 195-204 30. Chow J С etal

2005 Annu Rev Genomics Hum Genet 6 69-92 31. Duret L etal 2006 Science 312 1653-1655 32. Norris D P etal 1991 Mamm Genome 1 78-83 33. Gartler S M, Riggs AD 1983 Annu Rev Genet 17 155-190 34. Lyon M F 1998 Cytogenet Cell Genet 80 133-137 35 Smith К P etal 2004 Chromosoma 113 324-335 36. Ng К etal 2007 EMBORep 8 34-39 37. Moss T J , Wallrath L L 2007 Mutat Res 618 163-174 38.0ei S L et al 2004 Genomics 83 873-882 39. Chadwick В P , Willard H F 2004 Proc Natl Acad Sci USA 101 17450-17455

Лицензия ЛР №020593 от 07 08 97

Подписано в печать 13 03 2008 Формат 60x84/16 Печать цифровая Уел печ л 1,0 Тираж 100 Заказ 2726Ь

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул , 29 Тел 550-40-14 Тел/факс 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Усманова, Надежда Маратовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. Структура и свбйства ретропознов Alu семейства.

1.1. Строение ретропозонов Alu семейства.

1.2. Классификация и амплификация Alu повторов.

1.3. Механизм ретропозиции Alu повторов.

1.4. Распределение Alu повторов в геноме человека.

2. Роль Alu повторов в регуляции генной экспрессии.

2.1. Регуляция генной экспрессии Alu повторами на уровне транскрипции и процессинга мРНК.

2.1.1. Ассоциация Alu повторов с CpG динуклеотидами и островками.

2.1.2. Ассоциация Alu повторов с ССТФ.

2.1.3. Последствия инсерции Alu повторов de novo в кодирующую часть генов.

2.1.4. Последствия Alu-опосредованной рекомбинации.

2.1.5. Ассоциация Alu повторов с простыми повторами.

2.1.6. Роль Alu повторов в аденозин-инозин дезаминировании.

2.2. Регуляция генной экспрессии Alu повторами на уровне трансляции.

2.3. Регуляция генной экспрессии Alu повторами на уровне стабильности мРНК.

2.4. Alu повторы и малые интерферирующие РНК (миРНК).

3. Ангиотензинпревращающий фермент.

3.1. Строение ангиотензинпревращающего фермента.

3.2. Локализация, субстраты и функции АПФ.

3. 3. Инсерционно-делеционный полиморфизм в гене АПФ.

4. Инактивация X хромосомы.

1П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Обработка базы данных промоторов.

1.1. Описание базы данных промоторов DBTSS.

1.2. Описание программы CPGPLOT.

1.3. Описание программы RepeatMasker.

1.4. Описание базы данных TRANSFAC.

1.5. Описание программы RSA-tools-patser.

2. Клонирование фрагментов промоторов генов DNAse II и CAML в экпрессионные плазмиды, содержащие ген люциферазы.

2.1. Выделение ДНК из крови фенольно-хлороформным методом.

2.2. Амплификация фрагментов промоторов генов.

2.3. Рестрикция вставки и плазмиды pGL3-Basic.

2.4. Лигирование вектора и вставки.

2.5. Трансформация бактериального штамма E.coli DH5a плазмидной ДНК с применением хлористого кальция.

3. Трансфекция клеточных линий рекомбинантными плазмидами и измерение активности люциферазы.

4. Определение I/D полиморфизма в гене АПФ.

5. Определение уровня свободных аминокислот.

6. Обработка последовательности X хромосом человека и мыши.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Создание модельного объекта для изучения функциональной роли Alu повторов в промоторах генов.

2. Дизайн праймеров.

3. Клонирование фрагментов промоторов генов DNAse II и CAML в плазмиду pGL3-Basic.

4. Трансфекция клеток линий НЕК293 и А549 полученными конструкциями и измерение активности люциферазы в клеточных лизатах.

5. Результаты измерения активности люциферазы в лизатах клеток, трансфицированных различными конструкциями.

6. В составе 16-го интрона гена АПФ обнаружен Alu-ассоциированный цис-регуляторный модуль.

7. ID-полиморфизм в гене АПФ влияет на уровень фенилаланина и смеси лейцин+изолейцин в плазме крови людей.

8. Анализ X хромосом человека и мыши.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль ретропозонов ALU-семейства в регуляции генной экспрессии в клетках линий НЕК293 и А549 человека"

Актуальность исследования. Секвенирование генома человека позволило установить, что ~55% нуклеотидной последовательности составляют различные повторяющиеся элементы (Lander et al., 2001). Изначально эти последовательности относили к «эгоистической ДНК», представляющей собой нефункциональную часть генома. В последние годы накапливаются доказательства того, что те или иные повторяющиеся элементы генома выполняют различные функции, как на генном, так и на геномном уровнях (Makalowski, 2003; Slotkin and Martienssen, 2007). Ретропозоны Alu семейства относятся к классу SINE повторов (короткие диспергированные нуклеотидные элементы) и представлены более 106 копий в геноме человека. В настоящее время имеются данные, указывающие на то, что Alu повторы могут участвовать в регуляции генной экспрессии на нескольких уровнях (Grover et al., 2005; Hasler and Strub, 2006 а). Например, Alu повторы содержат в своем составе множественные CpG динуклеотиды, являющиеся сайтами метилирования в геноме. Посредством метилирования осуществляется не только регуляция генной экспрессии, но и контроль эмбрионального развития, а также подавление амплификации мобильных элементов генома (Paulsen and Ferguson-Smith, 2001). Многие исследования показали наличие в Alu повторах сайтов связывания транскрипционных факторов. Экспериментально доказано связывание некоторых из этих транскрипционных факторов, например, Yin Yang 1 (YY1), Estrogen* receptor alpha (ERa), Stimulating protein 1 (Spl), с консенсусной последовательностью Alu (Polak and Domany, 2006). Инсерции Alu повторов в экзоны белок-кодирующих генов, в области экзон-интронных границ, а также незаконная гомологичная рекомбинация между различными копиями Alu могут приводить к возникновению наследственных заболеваний (Grover et al., 2005). Показано, что Alu РНК стимулирует трансляцию всех репортерных мРНК в бесклеточной системе трансляции (Hasler and Strub, 2006 b). Регуляция стабильности транскрипта может осуществляться за счет связывания Alu повтора, локализованного в З'-нетранслируемой области, с SRP9/14 субъединицей сигнал-распознающей частицы (Hasler et al., 2007).

Регуляция генной экспрессии является важным этапом в поддержании клеточного гомеостаза. Она лежит в основе клеточной пролиферации и дифференцировки в ходе эмбрионального развития. Изменение экспрессии генов в ответ на внеклеточные стимулы обуславливает адаптацию организмов к условиям окружающей среды (Villard, 2004).

В свете вышеизложенного, изучение роли Alu повторов в регуляции, генной экспрессии представляется актуальной задачей. Такие исследования позволят не только детализировать механизмы регуляции, но и сделать выводы касательно функций повторяющихся элементов генома.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в исследовании регуляции экспрессии генов посредством Alu повторов на уровне транскрипции и на уровне формирования факультативного гетерохроматина. Для достижения-данной цели были поставлены следующие задачи:

1) При помощи методов компьютерного анализа выбрать гены для изучения роли Alu повторов, локализованных в промоторах, в *. регуляции экспрессии генов;

2) Экспериментально показать сайленсерную или энхансерную функцию Alu повторов, расположенных в промоторах выбранных генов, в постоянных клеточных линиях человека;

4) На примере инактивации X хромосомы показать возможность функционирования Alu повторов и SINE повторов мыши в качестве вспомогательных элементов при формировании факультативного гетерохроматина.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Alu повторы, локализованные в промоторах генов лиганда циклофилина, регулирующего кальциевый ответ (CAML) и дезоксирибонуклеазы II (DNAse II), участвуют в регуляции их транскрипции в клетках линий НЕК293 и А549 человека.

2. Инсерция AluYa5 повтора в 16-й интрон гена АПФ коррелирует с уровнем фенилаланина и смеси лейцин+изолейцин в плазме крови людей.

3. Alu-ассоциированные кластеры сайтов связывания транскрипционных факторов (ССТФ) способствуют формированию в ходе эволюции регуляторных элементов в промоторах и интронах некоторых человеческих генов.

4. Распределения Alu повторов человека и SINE повторов мыши (В 1, В2), но не LINE1 повторов в X хромосомах коррелируют с распределениями CpG островков, белок-кодирующих генов и некоторых маркеров гетерохроматина. Вспомогательными элементами при формировании факультативного гетерохроматина в ходе инактивации X хромосомы могут служить SINE-ассоциированные негативные элементы транскрипции.

Научная новизна. Впервые предложен принцип поиска в промоторах генов Alu повторов, участвующих в регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции. Этот принцип подтвержден экспериментально на примере Alu повторов, локализованных в промоторах генов CAML и DNAselL Впервые i показано, что инсерция AluYa5 повтора в 16-й интрон гена АПФ коррелирует с уровнем некоторых аминокислот в плазме крови людей. На этом примере показана функциональная роль Alu повторов, локализованных в интронах. Впервые показано, что Alu повторы человека и SINE повторы мыши могут участвовать в регуляции генной экспрессии на уровне формирования * факультативного гетерохроматина в ходе инактивации X хромосомы.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в работе результаты важны для понимания функций повторяющихся элементов генома. Работа вносит определенный вклад в современные представления о механизмах регуляции экспрессии генов. В практическом отношении представляет интерес установленная корреляция между инсерционно-делеционным полиморфизмом в гене АПФ и уровнем фенилаланина и смеси лейцин+изолейцин в плазме крови людей. Коррекция уровня свободных аминокислот имеет значение при лечении некоторых наследственных заболеваний, в частности, аминоацидопатий. Результаты настоящего исследования могут быть использованы в курсах лекций по клеточной и молекулярной биологии для студентов медицинских и биологических специальностей высших учебных заведений.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007), Международной конференции «II съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН» (Санкт-Петербург, 2007). Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научных • семинарах лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии Института цитологии РАН.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Усманова, Надежда Маратовна

ВЫВОДЫ

1. Транскрипция генов CAML и DNAse II в клетках линий НЕК293 и А549 регулируется Alu повторами, локализованными в их промоторах.

2. Инсерция AluYa5-повтора в 16-й интрон гена ангиотензинпревращающего фермента приводит к формированию в его составе z/wc-регуляторного модуля и коррелирует с уровнем Phe и Leu+Ile в плазме крови людей.

3. Глобальное распределение Alu повторов человека и SINE повторов мыши (Bl, В2) в X хромосомах коррелирует с распределением CpG островков и белок-кодирующих генов.

4. SINE—ассоциированные негативные элементы транскрипции могут служить вспомогательными элементами при формировании факультативного гетерохроматина в ходе инактивации X хромосомы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Усманова, Надежда Маратовна, Санкт-Петербург

1. Елисеева Ю. Е. 1998. Структурно-функциональные особенности ангиотензин-превращающего фермента. Биоорганическая химия. 24 (4): 262-270.

2. Кочетов А.В., Григорович Д.А., Титов И.И., Воробьев Д.Г., Сырник О.А., Вишневский О.В., Сараи А., Колчанов Н.А. 2001. Компьютерная система mRNA-FAST (mRNA-Function, Activity, Structure). Мол. Биол. 35(6): 1039-1047.

3. Тиц Н. У. Энциклопедия клинических лабораторных тестов.// М.: Лабинформ, 1997.- 460 с.

4. Хитринская И.Ю., Степанов В.А., Пузырев В.П. 2003. Alu повторы в геноме человека. Мол. биол. 37(3): 382-391.

5. Agarwal A., Williams G.H., Fisher N.D. 2005. Genetics of human hypertension. Trends Endocrinol. Metab. 16:127-133.

6. Almenoff J.S., Jurka J., Schoolnik G.K. 1994. Induction of heat-stable enterotoxin receptor activity by a human Alu repeat. J. Biol. Chem. 269: 16610-16617.

7. An H.J., Lee D., Lee K.H., Bhak J. 2004. The association of Alu repeats with the generation of potential AU-rich elements (ARE) at 3' untranslated regions. BMC Genomics. 5: 97.

8. Apoil P.A., Kuhlein E., Robert A., Rubie H., Blancher A. 2007. HIGM syndrome caused by insertion of an AluYb8 element in exon 1 of the CD40LGgene. Immunogenetics. 59: 17-23.

9. Arcot S.S., Wang Z., Weber J.L., Deininger P.L., Batzer M.A. 1995. Alurepeats: a source for the genesis of primate microsatellites. Genomics. 29: 136-144.

10. Atchison L., Ghias A., Wilkinson F., Bonini N., Atchison M.L. 2003. Transcription factor YY1 functions as a PcG protein in vivo. EMBO J. 22: 1347-1358.

11. Athanasiadis A., Rich A., Maas S. 2004. Widespread A-to-I RNA editing of Alu-containing mRNAs in the human transcriptome. PLoS Biol. 2: 21442158.

12. Babich V., Aksenov N., Alexeenko V., Oei S.L., Buchlow G., Tomilin N. 1999. Association of some potential hormone response elements in human genes with the Alu family repeats. Gene. 239: 341-349.

13. Bailey J.A., Carrel L., Chakravarti A., Eichler E.E. 2000. Molecular evidence for a relationship between LINE-1 elements and X chromosome inactivation: the Lyon repeat hypothesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6634-6639.

14. Bantignies F., Cavalli G. 2006. Cellular memory and dynamic regulation of polycomb group proteins. Curr. Opin. Cell. Biol. 18: 275-283.

15. Bartel D.P. 2004. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116: 281-297.

16. Batzer M.A., Deininger P.L. 2002. Alu repeats and human genomic diversity. Nat. Rev. Genet. 3: 370-379.

17. Batzer M.A., Deininger P.L., Hellmann-Blumberg U., Jurka J., Labuda D.,

18. Bird A. 2002. DNA methyliation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16: 6-21.

19. Bird«- A^P: 1995: Gene number, noise; reduction and biological complexity.; Trends Genet. 11: 94-100:

20. Boggs B:A., Cheung P:, Heard E., Spector D.L.,. Ghinault A.C., Allis C D. 2002. Differentially methylated forms of histone H3 show unique association patterns with inactive human X chromosomes. Nat: Genet. 30: 73-76.

21. Boothby M:, RuddomR,W., Anderson-C., McWilliams D., Boime I: 1981. A single gonadotropin: alpha-subunit gene in normal tissue and tumor-derived cell lines. J. Biol: Chem. 256: 5121-5127.

22. Borchert G.M., Lanier W., Davidson B.L. 2006. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat. Struct.Mol. Biol. 13: 1097-1101.

23. Botto M., Fong K.Y., So A.K., Barlow R., Routier R., Morley B.J., Walport

24. MJ. 1992. Homozygous hereditary G3 deficiency due to a partial gene deletion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 4957-4961.

25. Boyle A.L., Ballard S.G., Ward D.C. 1990. Differential distribution of long and short interspersed element sequences in the mouse genome: chromosome karyotyping by fluorescence in situ hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 7757-7761.

26. Brini A.T., Lee G.M., Kinet J.P. 1993. Involvement of Alu sequences in the cell-specific regulation of transcription of the gamma chain of Fc and T cell receptors. J. Biol. Chem. 268: 1355-1361.

27. Britten R.J. 1994". Evolutionary selection against change in many Alu repeat sequences interspersed through primate genomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 5992-5996.

28. Britten RJ. 1996. DNA sequence insertion and evolutionary variation in gene regulation. Proc. Natl: Acad: Sci. USA. 93: 9374-9377.

29. Britten R.J., Rowen L., Williams J., Cameron R.A. 2003. Majority of divergence between closely related DNA samples is due to indels. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100: 4661-4665.

30. Chadwick B.P., Willard H.F. 2001. Histone H2A variants and the inactive X chromosome: identification of a second macroH2A variant. Hum. Mol. Genet. 10:1101-1113.

31. Chadwick В .P., Willard H.F. 2003. Barring gene expression- after XIST: maintaining facultative heterochromatin on the inactive X. Semirn Cell. Dev. Biol. 14: 359-367.

32. Chadwick B.P., Willard H.F. 2004. Multiple spatially distinct types of facultative heterochromatin on the human inactive X chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101: 17450-17455.

33. Chang D.Y., Hsu K., Maraia R.J. 1996. Monomeric scAlu and nascent dimeric Alu RNAs induced- by adenovirus are assembled into SRP9/14-containing RNPs in HeLa cells. Nucleic Acids Res. 24: 4165-4170.

34. Chang S.C., Tucker Т., Thorogood N.P., Brown C.J. 2006. Mechanisms of X-chromosome inactivation. Front Biosci. 11: 852-866.

35. Chauhan C., Dash D., Grover D., Rajamani J., Mukerji M. 2002. Origin and instability of GAA repeats: insights from Alu elements. J. Biomol. Struct. Dyn. 20: 253-263.

36. Chaumeil J., Okamoto I., Guggiari M., Heard E. 2002. Integrated kinetics of X chromosome inactivation in differentiating embryonic stem cells. Cytogenet. Genome Res. 99: 75-84.

37. Chen C.Y., Gherzi R., Ong S.E., Chan E.L., Raijmakers R., Pruijn G.J., Stoecklin G., Moroni C., Mann-M., Karin M: 2001. AU binding proteins recruit the exosome to degrade ARE-containing mRNAs. 107: 451-464.

38. Chesnokov I.N., Schmid C.W. 1995. Specific Alu binding protein from human sperm chromatin prevents DNA methylation. J. Biol. Chem. 270: 18539-18542.

39. Chou S.F., Chen H.L., Lu S.C. 2003. Spl and Sp3 are involved in upregulation of human deoxyribonuclease II transcription during differentiation of HL-60 cells. Eur. J. Biochem. 270: 1855-1862.

40. Chow J.C., Yen Z., Ziesche S.M., Brown C.J. 2005. Silencing of the mammalian X chromosome. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 6: 69-92.

41. Chu W.M., Ballard R., Carpick B.W., Williams B.R., Schmid C.W. 1998. Potential Alu function: regulation of the activity of double-stranded RNA-activated kinase PKR: Mol. Cell. Biol. 18: 58-68.

42. Chureau C., Prissette M., Bourdet A., Barbe V., Cattolico L., Jones L., Eggen A., Avner P., Duret L. 2002. Comparative sequence analysis of the X-inactivation center region in mouse, human, and bovine. Genome Res. 12: 894-908.

43. Claverie-Martm F., Flores C., Anton-Gamero M., Gonzalez-Acosta H., Garcia-Nieto V. 2005. The Alu insertion-in the CLCN5 gene of a patient with Dent's disease leads to exon 11 skipping. J. Hum. Genet. 50: 370-374.

44. Cooper D.N., Youssoufian H. 1988. The CpG dinucleotide and human genetic disease. Hum. Genet. 78: 151-155.

45. Cost G.J;, Feng Q., Jacquier A., Boeke J.D. 2002. Human LI element target-primed reverse transcription in vitro. EMBO J. 21: 5899-5910.

46. Costanzi C., Pehrson J.R. 1998. Histone macroH2Al is concentrated in the inactive X chromosome of female mammals. Nature. 393: 599-601.

47. Counis M.F., Torriglia A. 2006. Acid DNases and their interest among apoptotic endonucleases. Biochimie. 88: 1851-1858.

48. Nesterova T.B., Silva J., Otte A.Pi, Vidal M., Koseki H., Brockdorff N. 2004. Polycomb group proteins RinglA/B link ubiquitylation of histone H2A to heritable gene silencing and X inactivation. Dev. Cell. 7: 663-676.

49. Deininger P.L., Batzer M.A. 1999. Alu repeats and human disease. Mol. Genet. Metab. 67: 183-193.

50. Deininger P.L., Batzer M.A. 2002. Mammalian retroelements. Genome Res. 12: 1455-1465.

51. Devlin R.H., Deeb S., Brunzell J., Hayden M.R. 1990: Partial gene duplication involving exon-Alu interchange results in lipoprotein lipase deficiency. Am. J. Hum. Genet. 46: 112-119.,

52. Dewannieux M., Esnault C., Heidmann T. 2003. LINE-mediated retrotransposition of marked Alu sequences. Nat. Genet. 35: 41-48.

53. Duthie S.M., Nesterova T.B., Formstone E.J., Keohane A.M., Turner B.M., Zakian S.M., Brockdorff N. 1999. Xist RNA exhibits a-banded localization on the inactive X chromosome and is excluded from, autosomal material in cs. Hum. Mol. Genet. 8: 195-204.

54. Eisenberg E., Nemzer S., Kinar Y., Sorek R., Rechavi G., Levanon E.Y. 2005. Is abundant A-to-I RNA editing primate-specific? Trends Genet. 21:77.81.

55. Evans С J., Aguilera R.J. 2003. DNAse II: genes,' enzymes and function. Gene. 322: 1-15.

56. Fleming I. 2006. Signaling by the angiotensin-converting enzyme. Circ. Res. 98: 887-896.

57. Fornasari D.', Battaglioli E., Flora A., Terzano S., Clementi F. 1996. Structural and functional characterization of the human alpha3 nicotinic subunit gene promoter. Mol. Pharmacol. 51: 250-261.

58. Ganguly A., Dunbar Т., Chen P., Godmilow L., Ganguly T. 2003. Exon skipping caused by an intronic insertion of a young Alu Yb9 element leads to severe hemophilia A. Hum. Genet. 113: 348-352.

59. Gardiner-Garden M., Frommer M. 1987. CpG islands in vertebrate genomes. J. Mol. Biol. 196:261-282.

60. Gilbert S.L., Pehrson J.R., Sharp P.A. 2000. XIST RNA associates with specific regions of the inactive X chromatin. J. Biol. Chem. 275: 3649136494.

61. Gilbert S.L., Sharp P.A. 1999. Promoter-specific hypoacetylation of X-inactivated genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 13825-13830.

62. Goodyer C.G., Zheng H., Hendy G.N. 2001. Alu elements in human growth hormone receptor gene 5' untranslated region exons. J. Mol. Endocrinol. 27: 357-366.

63. Gordon S., Akopyan G., Garban H., Bonavida B. 2006. Transcription factor YY1: structure, function, and theurapeutic implications in cancer biology. Oncogene. 25: 1125-1142.

64. Graves J.A. 1982. 5-azacytidine-induced re-expression of alleles on the inactive X chromosome in a hybrid mouse cell line. Exp: Cell: Res. 141: 99105.

65. Greally J.M. 2002. Short interspersed transposable elements (SINEs) are excluded from imprinted regions in the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 327-332.

66. Grover D., Kannan K., Brahmachari S.K., Mukerji M. 2005. ALU-ring elements in the primate genomes. Genetica. 124: 273-289.

67. Grover D., Majumder P.P., В Rao C., Brahmachari S.K., Mukerji M. 2003. Nonrandom distribution of alu elements in genes of various functional categories: insight from analysis of human chromosomes 21 and 22. Mol. Biol. Evol. 20: 1420-1424.

68. Grover D., Mukerji M., Bhatnagar P;, Kannan K., Brahmachari S.K. 2004. Alu repeat analysis in the complete human genome: trends and variations with' respect to genomic composition. Bioinformatics. 20: 813-817.

69. Gu Y., Kodama H., Watanabe S. Kikuchi N., Ishitsuka I., Ozawa H. Fujisawa C., Shiga K. 2007. The first reported case of Menkes disease caused by an Alu insertion mutation. Brain Dev. 29: 105-108.

70. Halfon M.S., Grad Y., Church G.M., Michelson A.M. 2002. Computation-based discovery of related transcriptional regulatory modules and motifs using an experimentally validated combinatorial model. Genome Res. 12:1019-1028.

71. Hambor J.E., Mennone J., Coon M.E., Hanke J.H., Kavathas P. 1993. Identification and characterization of an Alu-containing, T-cell-specific enhancer located in the last intron of the human CD8 alpha gene. Mol. Cell. Biol. 13: 7056-7070.

72. Hamdi H.K., Nishio H., Tavis J., Zielinski R., Dugaiczyk A. 2000. Alu-mediated phylogenetic novelties in gene regulation and development. J. Mol. Biol. 299: 931-939.

73. Harmer D., Gilbert M., Borman R., Clark K.L. 2002. Quantitative mRNA expression profiling of ACE 2, a novel homologue of angiotensin converting enzyme. FEBS Lett. 532:107-110.

74. Has C., Wessagowit V., Pascucci M., Baer C., Didona В., Wilhelm C., Pedicelli C., Locatelli A., Kohlhase J., Ashton G.H*, Tadini G., Zambruno G., Bruckner-Tuderman L., McGrath J.A., Castiglia D. 2006. Molecular basis of

75. Kindler syndrome in Italy: novel and recurrent Alu/Alu recombination, splicesite, nonsense, and frameshift mutations in the KIND1 gene. J. Invest. Dermatol. 126: 1776-1783.

76. Hasler J., Samuelsson Т., Strub K. 2007. Useful 'junk': Alu RNAs in the human transcriptome. Cell. Mol. Life Sci. 64: 1793-1800.

77. Hasler J., Strub K. 2006 a. Alu elements as regulators of gene expression. Nucleic Acids Res. 34: 5491-5497.

78. Hasler J., Strub K. 2006 b. Alu RNP and Alu RNA regulate translation initiation in vitro. Nucleic Acids Res. 34: 2374-2385.

79. Heldring N., Pike A., Andersson S., Matthews J., Cheng G., Hartman J., Tujague M., Strom A., Treuter E., Warner M., Gustafsson J.A. 2007. Estrogen Receptors: How Do They Signal and What Are Their Targets. Physiol. Rev. 87: 905-931.

80. Hemming M.L., Selkoe D.J. 2005. Amyloid beta-protein is degraded' by cellular angiotensin-converting enzyme (ACE) and elevated by an ACE inhibitor. J. Biol. Chem. 280: 37644-37650.

81. Hilgard P., Huang Т., Wolkoff A.W., Stockert R.J. 2002. Translated Alu sequence determines nuclear localization of a novel catalytic subunit of casein kinase 2. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283: C472-C483.

82. Hogeveen K.N., Talikka M., Hammond G.L. 2001. Human sex hormone-binding globulin promoter activity is influenced by a (TAAAA)n repeat element within an Alu sequence. J. Biol. Chem. 276: 36383-36390.

83. Hu X.Y., Ray P.N., Worton R.G. 1991. Mechanisms of tandem duplication in the Duchenne muscular dystrophy gene include both homologous and nonhomologous intrachromosomal recombination. EMBO J. 10: 2471-2477.

84. Huang'L.S., Ripps M.E., Korman S.H., Deckelbaum R.J., Breslow J.L. 1989. Hypobetalipo-proteinemia due to an apolipoprotein В gene exon 21 deletionderived by Alu-Alu recombination. J. Biol. Chem. 264: 11394-11400.

85. Hubert C., Houot A.M., Corvol P., Soubrier F. 1991. Structure of the angiotensin I-converting enzyme gene. Two alternate promoters correspond to evolutionary steps of a duplicated gene. J. Biol. Chem. 266:15377-15383.

86. Jaenisch R., Bird A. 2003. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33 Suppl: 245-254.

87. Jones P.A., Takai D. 2001. The-role-of DNA methylation in mammalian epigenetics. Science. 293: 1068-1070.

88. Jurka J. 1997. Sequence patterns- indicate an enzymatic involvement in integration of mammalian retroposons. Proc: Natl. Acad. Sci. USA'. 94: 18721877.

89. Jurka J., Kapitonov V.V., Pavlicek A., Klonowski P., Kohany O., Walichiewicz J. 2005. Repbase Update, a database of eukaryotic repetitive elements. Cytogenet. Genome Res. 110: 462-467.

90. Jurka J., Kohany O., Pavlicek A., Kapitonov V.V., Jurka M.V. 2003. Duplication, coclustering, and selection-of human Alu retrotransposons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101: 1268-1272.

91. Jurka J., Krnjajic M., Kapitonov V.V., Stenger, J.E., Kokhanyy O. 2002. Active Alu elements are passed primarily through paternal1 germlines. Theor. Popul. Biol. 61: 519-530.

92. Kanno J., Hutchin Т., Kamada F., Narisawa A., Aoki Y., Matsubara Y., Kure S. 2007. Genomic deletion within GLDC is a major cause of non-ketotic hyperglycinaemia. J. Med. Genet. 44: e69.

93. Kapitonov V., Jurka J. 1996. The age of Alu subfamilies. J. Mol. Evol. 42: 5965.

94. Kazakov V.I., Tomilin N.V. 1996. Increased concentration of some transcription factor binding sites in human retroposons of the Alu family. Genetica. 97: 15-22.

95. Kazazian H.H. Jr. 2004. Mobile elements: drivers of genome evolution. Science. 303: 1626-1632.

96. Kazazian H.H. Jr. Genetics. LI retrotransposons shape the mammalian genome. Science. 289: 1152-1153.

97. Kim S.Y., Kim Y. 2007. Genome-wide prediction of transcriptional regulatory elements of human promoters using gene expression and promoter analysis data. BMC Bioinformatics. 7: 330.

98. Kim V.N. 2004. MicroRNA precursors in motion: exportin-5 mediates their nuclear export. Trends Cell. Biol. 14: 156-159.

99. Kimura H., Sugaya K., Cook P.R. 2002. The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells. J*. Cell. Biol. 159: 777-782.

100. Kloor M., Sutter C., Wentzensen N., Cremer F.W., Buckowitz A., Keller M., von Knebel Doeberitz M., Gebert J. 2004. A large MSH2 Alu insertionmutation causes HNPCC in a German kindred. Hum. Genet. 115: 432-438.

101. Knebelmann В., Forestier L., Drouot L., Quinones S., Chuet C., Benessy F., Saus J., Antignac C. 1995. Splice-mediated insertion of an Alu sequence in the COL4A3 mRNA causing autosomal recessive Alport syndrome. Hum. Mol. Genet. 4: 675-679.

102. Knuppel R., Dietze P., Lehnberg W., Freeh K., Wingender E. 1994. TRANSFAC retrieval program: a network model database of eukaryotic transcription regulating sequences and proteins. J. Comput. Biol. 1: 191-198.

103. Kohlmaier A., Savarese F., Lachner M., Martens J., Jenuwein Т., Wutz A. 2004. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation. PLoS Biol. 2: El71.

104. Kondoh G., Tojo H., Nakatani Y., Komazawa N., Murata C., Yamagata K.,t

105. Maeda Y., Kinoshita Т., Okabe M., Taguchi R., Takeda J. 2005. Angiotensin-converting enzyme is a GPI-anchored protein releasing factor crucial for fertilization. Nat. Med. 11: 160-166.

106. Korenberg J.R., Rykowski M.C. 1988. Human genome organization: Alu, lines, and the molecular structure of metaphase chromosome bands. Cell. 53: 391-400.

107. Kornreich R., Bishop D.F., Desnick R.J. 1990. Alpha-galactosidase A gene rearrangements causing Fabry disease. Identification of short direct repeats at breakpoints man Alu-rich gene. J. Biol. Chem. 265: 9319-9326.

108. Kuznetsov V.A., Knott G.D., Bonner R.F. 2002. General statistics of stochastic process of gene expression in eukaryotic cells. Genetics. 161: 13211332.

109. Lander E.S. et al. 2001. Initial sequencing and analysis of the human genome.1. Nature. 409: 860-921.

110. Landry J.R., Medstrand P., Mager D.L. 2001. Repetitive elements in the: 5' untranslated; region of a human zinc-finger gene modulate transcription and translation efficiency. Genomics. 76: 110-116.

111. Laperrier'e D., Wang T.T., White J.H., Mader S. 2007. Widespread Alu repeat-driven expansion of consensus DR2 retinoic acid response elements during primate evolution. BMC Genomics. 8:23.

112. Lash A.E., Tolstoshev C.M(, Wagner L.,. Schuler GtD:, Strausberg R.L., Riggins G.J., Altschul S.F. 2000. SAGEmap: a public gene expression- . resource. Genome Res. 10: 1051-1060.

113. Le Goff W., Guerin M:, Chapman: M. J., Thillet J. 2003A CYP7A promoter binding factor site and Alu repeat in the distal promoter region'are implicated in regulation of human CETP gene expression. Jt5 Lipid: Res; 44: 902-910;

114. Lee Y., Kim M., Han J;, Yeom K.H., Lee S.,'Baek S.H;, Kim V.N: 2004: MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23: 40514060.

115. Lehrman MlA;i Goldstein JlL.,.RusselFD:W.3 Brown:M:Sv 1987.,Duplicatiom of seven exons inrBDL receptor gene caused by Alu-Alu recombination in a subject.with familial hypercholesterolemia. Cell. 48: 827-835.

116. Leppig K.A., Brown C.J., Bressler S.L., Gustashaw K., Pagon R.A., Willard IT.F., Disteche С.МГ 1993. Mapping of the distal boundary of the X-inactivation center in a rearranged X chromosome from a female expressing XIST. Hum. Mol. Genet. 2: 883-887.

117. Levanon K., Eisenberg E., Rechavi G., Levanon E.Y. 2005. Letter from the editor: Adenosine-to-inosine RNA editing in Alu repeats in the human genome. EMBO Rep. 6: 831-835.

118. Lewis E.B. 1978. A gene complex controlling segmentation in Drosophila. Nature. 276: 565-570.

119. Lobachev K.S., Stenger J.E., Kozyreva O.G., Jurka J., Gordenin D.A., Resnick M.A. 2000. Inverted Alu repeats unstable in yeast are excluded from the human genome. EMBO J. 19: 3822-3830.

120. Long X., Miano J.M. 2007. Remote control of gene expression. J. Biol. Chem. 282: 15941-15945.

121. Luan D.D., Korman M.H., Jakubczak J.L., Eickbush Т.Н. 1993. Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: a mechanism for non-LTR retrotransposition. Cell. 72: 595-605.

122. Lyle R., Watanabe D., te Vruchte D., Lerchner W., Smrzka O.W., Wutz A., Schageman J., Hahner L., Davies C., Barlow D.P. 2000. The imprinted antisense RNA at the Igf2r locus overlaps but does not imprint Masl. Nat. Genet. 25: 19-21.

123. Lyon M.F. 1998. X-chromosome inactivation: a repeat hypothesis. Cytogenet. Cell. Genet. 80: 133-137.

124. Maas S., Rich A. 2000. Changing genetic information through RNA editing. Bioessays. 22: 790-802.

125. Maas S., Rich A., Nishikura K. 2003. A-to-I RNA editing: recent news and-residual mysteries. J. Biol. Chem. 278: 1391-1394.

126. Makalowski W. 2003. Genomics. Not junk after all. Science. 300: 1246-1247.

127. Mandel M., Higa A. 1970. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. J. Mol. Biol. 53: 159-62.

128. Maouche L., Cartron J.P., Chretien S. 1994. Different domains regulate the human erythropoietin receptor gene transcription. Nucleic Acids Res. 22: 338-346.

129. Marcus S., Hellgren D., Lambert В., Fallstrom S.P., Wahlstrom J. 1993. Duplication in the hypoxanthine phosphoribosyl-transferase gene caused by Alu-Alu recombination in a patient with Lesch Nyhan syndrome. Hum. Genet. 90: 477-482.

130. McGehee D.S., Role L.W. 1995. Physiological diversity of nicotinic acetylcholine receptors expressed by vertebrate neurons. Annu. Rev. Physiol. 57: 521-546.

131. McHaffie G.S., Ralston S.H. 1995. Origin of a negative calcium response element in an ALU-repeat: implications for regulation of gene expression by extracellular calcium. Bone. 17: 11-14.

132. Mignone F., Gissi C., Liuni S., Pesole G. 2002. Untranslated regions of mRNAs. Genome Biol: 3: reviews0004.1-reviews0004.10.

133. Miki Y., Katagiri Т., Kasumi F., Yoshimoto Т., Nakamura Y. 1996. Mutation analysis in the BRCA2 gene in primary breast cancers. Nat. Genet. 13: 245247.

134. Modrek В., Lee C.J. 2003. Alternative splicing in the human, mouse and ratgenomes is associated with an increased frequency of exon creation and/or loss. Nat. Genet 34: 177-180.

135. Moss T.J., Wallrath L.L. 2007. Connections between epigenetic gene silencing and human disease. Mutat. Res. 618: 163-174.

136. Myerowitz R., Hogikyan N.D. 1987. A deletion involving. Alu sequences in the beta-hexosaminidaser alpha-chain gene of French Canadians with? Tay-Sachs disease. J; Biol; Chem; 262: 15396-15399;

137. Nagai K., Oubridge C., Kuglstatter A., Menichelli E., Isel C., Jovine L. 2003; Stmctore, iunction?and?evolution<of;the signalrecognition ;particle. EMBO J. 22: 3479-3485. •

138. Natesh R., Schwager S.L., Sturrock E.D., Acharya K.R. 2003. Crystal structure of the- human angiotensiri-converting enzyme-lisinopril complex. 421:551-554.

139. Nekrutenko A., Li W.H. 2001. Transposable elements are found in a large number ofhuman proteinrcoding genes; Trends Genet. 17: 619-621.

140. Neote K., Mclnnes В., Mahuran D;J., Gravel R.A. 1990. Structure and distribution of an Alu-type deletion mutation im Sandhoff disease. J. Clin. Invest. 86:1524-1531,

141. Ng K., Pullirsch D;, Leeb Mi,.Wutz A. 2007: Xist and the order of silencing. EMBO Rep. 8: 34-39.

142. Norris D.P., Brockdorff N., Rastan S. 1991. Methylation stattis of CpG-rich islands on active andi inactive mouse X chromosomes. Mamm. Genome. 1:78.83;

143. Gei S;b., Babich V.S;, Kazakov V.I., Usmanova N.M., Kropotov A.V., Tomilin N.V. 2004. Clusters of regulatory signals for RNA polymerase II transcription associated with Alu family repeats and CpG islands in human promoters. Genomics. 83: 873-882.

144. Okada N., Hamada M. 1997. The 3' ends of tRNA-derived SINEs originated from the^"3! ends -of.'^LINEs: a^^new- example fromsthe bovine ;genome;.J. MolL livol. 44 Suppl 1: S52-S56.

145. Olds R.J., Lane D.A., Chowdhuiy V., De Stefano>V., Leone G., Thein S.L. 1993; Complete nucleotide sequence of the antithrombin. gene: evidence for homologous recombination causing thrombophilia; Biochemistry.- 32:: 4216-•4224.

146. Ottolenghi S:, Giglioni B. 1982. The deletion in a type of delta 0-beta 0-thalassaemia begins in an:inverted Alul repeat. Nature. 300: 770-771.

147. Paulsen M., Ferguson-Smith: A.C. 2001. DNA methylation in genomic, imprinting, development, and disease. J. Pathol; 195: 97-110.

148. Pennings S., Allan J., Davey C.S. 2005. DNA methylation, nucleosomeformation and positioning. Brief. Funct. Genomic. Proteomic. 3: 351-361.

149. Perez-Stable C., Ayres T.M., Shen C.-KJ. 1984. Distinctive sequence organization and functional programming of an Alu repeat promoter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 5291-5295.

150. Perez-Stable C., Shen C.-KJ. 1986. Competitive and cooperative functioning of the anterior and posterior promoter elements of an Alu family repeat. Mol. Cell. Biol. 6: 2041-2052.

151. Peters A.H., Mermoud J.E., O'Carroll D., Pagani M:, Schweizer D., Brockdorff N., Jenuwein T. 2002. Histone H3 lysine 9 methylation is an epigenetic imprint of facultative heterochromatin. Nat. Genet. 30: 77-80.

152. Piedrafita F.J., Molander R.B., Vansant G., Orlova E.A., Pfahl M., Reynolds W.F. 1996. An Alu element in the myeloperoxidase promoter contains a composite SPl-thyroid hormone-retinoic acid response element. J. Biol. Chem. 271:14412-14420.

153. Polak P., Domany E. 2006. Alu elements contain many binding-sites for transcription factors and may play a role in regulation of developmental processes. BMC Genomics. 7: 133.

154. Rajewsky N., Vergassola M., Gaul' U., Siggia E.Di- 2002. Computational detection of genomic cis-regulatory modules applied to body patterning in the early Drosophila embryo. BMC Bioinformatics. 3: 30.

155. Rigat В., Hubert C., Alhenc-Gelas F., Cambien F., Corvol P.r, Soubrier F. 1990. An insertion/deletion polymorphism in the angiotensin I-converting enzyme gene accounting for half the variance of serum enzyme levels. J. Clin. Invest. 86: 1343-1346.

156. Rigat В., Hubert C., Corvol P., Soubrier F. 1992. PCR detection of the insertion/deletion polymorphism of the human angiotensin converting enzymegene (DCP1) (dipeptidyl carboxypeptidase 1). Nucleic Acids Res. 20: 1433.

157. Riordan J.F. 2003. Angiotensin-I-converting enzyme and its relatives. Genome Biol. 4: 225.1-225.5.

158. Rome C., Loiseau H., Arsaut J., Roullot V., Couillaud F. 2006. Diversity of contactin mRNA in human brain tumors. Mol. Carcinog. 45: 774-785.

159. Ross M.T., Grafham D.V., Coffey A J. et al. 2005. The DNA sequence of the human X chromosome. Nature. 434: 325-337.

160. Roy A.M., West N.C., Rao A., Adhikari P., Aleman C., Barnes A.P., Deininger P.L. 2000. Upstream flanking sequences and- transcription of SINEs. J. Mol. Biol. 302: 17-25.

161. Roy-Engel A.M;, Carroll M.L., Vogel E., Garber R.K., Nguyen S.V., Salem A.H., Batzer M.A., Deininger P.L. 2001. Alu insertion polymorphisms for the study of human genomic diversity. Genetics. 159: 279-290.

162. Roy-Engel A.M., Salem A.H., Oyeniran O.O., Deininger L., Hedges D.J., Kilroy G.E., Batzer M.A., Deininger P.L. 2002. Active Alu element "A-tails": size does matter. Genome Res. 12: 1333-1344.

163. Rubin C.M., Kimura R.H., Schmid C.W. 2002. Selective stimulation of translational expression by Alu RNA. Nucleic Acids Res. 30: 3253-3261.

164. Russell L.B. 1963. Mammalian X-chromosome action: inactivation limited in spread and region of origin. Science. 140: 976-978.

165. Salstrom J.L. 2007. X-inactivation1 and the dynamic maintenance of gene silencing. Mol Genet Metab. 92: 56-62.

166. Samani NJ., Thompson J.R., O'Toole L., Channer K., Woods K.L. 1996. A meta-analysis of the association of the deletion allele of the angiotensin-converting enzyme gene with myocardial infarction. Circulation. 94: 708-712.

167. Satijn D.P., Hamer K.M., den Blaauwen J., Otte A.P: 2001. The polycomb group protein EED interacts with YY1, and both proteins induce neural tissue in Xenopus embryos. Mol. Cell. Biol. 21: 1360-1369.

168. Saxonov S., Berg P., Brutlag D.L. 2006. A genome-wide analysis of CpG dinucleotides in the human genome distinguishes two distinct classes ofpromoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103: 1412-1417.

169. Sayed-Tabatabaei F.A., Houwing-Duistermaat J.J., van Duijn C.M., Witteman J.C. 2003. Angiotensin-converting enzyme gene polymorphism and carotid artery wall thickness: a meta-analysis. Stroke. 34: 1634-1639.

170. Sayed-Tabatabaei F.A., Oostra B.A., Isaacs A., van Duijn C.M., Witteman J.C. 2006. ACE polymorphisms. Circ. Res. 98: 1123-1133.

171. Scadden A.D., Smith C.W. 2001. RNAi is antagonized by A»>I hyper-editing. EMBO Rep. 2: 1107-1 111.

172. Shankar R., Grover D., Brahmachari S.K., Mukerji M. 2004. Evolution and distribution of RNA polymerase II regulatory sites from RNA polymerase III dependant mobile Alu elements. BMC Evol. Biol. 4: 37.

173. Sharp A.J., Spotswood.H.T., Robinson D.O., Turner B.M., Jacobs P.A. 2002. Molecular and cytogenetic analysis of the spreading of X inactivation in X;autosome translocations. Hum. Mol. Genet. 11: 3145-3156.

174. Shimada F., Taira M., Suzuki Y., Hashimoto N., Nozaki O., Taira M., TatibanaM., Ebina Y., Tawata M., Onaya T. et al. 1990. Insulin-resistant diabetes associated with partial deletion of insulin-receptor gene. Lancet. 335: 1179-1181.

175. Sinha S., van Nimwegen E., Siggia E.D. 2003. A probabilistic method to detect regulatory modules. Bioinformatics. Suppl 1: i292-i301.

176. Skeggs L.T., Kahn J.R., Shumway N.P. 1956. The preparation and function of the hypertensin-converting enzyme. J. Exp. Med. 103: 295-299.

177. Slotkin R.K., Martienssen R. 2007. Transposable elements and the epigenetic regulation of the genome. Nat. Rev. Genet. 8: 272-285.

178. Smalheiser N.R., Torvik V.I. 2006. Alu elements within human mRNAs are probable microRNA targets. Trends Genet. 22: 532-536.

179. Sorek R., Ast G., Graur D. 2002. Alu-containing exons are alternatively spliced. Genome'Res. 12: 1060-1067.

180. Sorek R., Lev-Maor G., Reznik M»., Dagan Т., Belinky F., Graur D., Ast G. 2004. Minimal conditions for exonization of intronic sequences: 5' splice site formation in alu exons. Mol. Cell. 14: 221-231.

181. Stoppa-Lyonnet D., Carter P.E., Meo Т., Tosi M. 1990. Clusters of intragenic Alu repeats predispose the human CI inhibitor locus to deleterious rearrangements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 1551-1555.

182. Strahl B.D., Allis C.D. 2000. The language of covalent histone modifications. Nature. 403: 41-45.

183. Suzuki Y., Sugano S. 2003. Construction of a full-length enriched and a 5'-end enriched cDNA library using the oligo-capping method.

184. Szabo Z., Levi-Minzi S.A., Christiano A.M., Struminger C., Stoneking M.,i

185. Batzer M.A., Boyd C.D. 1999. Sequential loss of two neighboring exons ofthe tropoelastin gene during primate evolution. J. Mol. Evol. 49: 664-671.

186. Takagi N., Sasaki M. 1975. Preferential inactivation of the paternally derived X chromosome in the extraembryonic membranes of the mouse. Nature. 256: 640-642.

187. Takai D., Jones P. A. 2002. Comprehensive analysis of CpG islands in human chromosomes 21 and 22. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 3740-3745.

188. Tall A. 1995. Plasma lipid transfer proteins. Annu. Rev. Biochem. 64: 235257.

189. Thorey I.S., Cecena G., Reynolds W., Oshima R.G. 1993. Alu sequence involvement in transcriptional insulation of the keratin 18 gene in transgenic mice. Mol. Cell. Biol. 13: 6742-6751.

190. Tipnis S.R., Hooper N.M., Hyde R., Karran E., Christie G., Turner A.J. 2000: A human homolog of angiotensin-converting enzyme. Cloning and functional expression as a captopril-insensitive carboxypeptidase. J.Biol. Chem. 275: 33238-33243.

191. Tomilin N.V. 1999. Control of genes by mammalian retroposons. Int. Rev. Cytol. 186: 1-48.

192. Tomilin N.V., Iguchi-Ariga S.M., Ariga H. 1990. Transcription and replication silencer element is present within conserved region of human Alu repeats interacting with nuclear protein. FEBS Lett. 263: 69-72.

193. Tovey S.C., Bootman M.D:, Lipp P., Berridge M.J., Bram R.J. 2000. Calcium-modulating cyclophilin ligand desensitizes hormone-evoked calciumrelease. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276: 97-100.

194. Tran D.D.*, Edgar C.E., Heckman K.L., Sutor S.L., HuntoomC.J., van Deursen J., McKean D.L., Bram R.J. 2005. CAML is a p56Lck-interacting protein that is required for thymocyte development. Immunity. 23:139-152.

195. Tran D.D., Russell H.R., Sutor S.L., van Deursen J., Bram R.J. 2003. CAML is required for efficient EGF receptor recycling. Dev. Cell. 5: 245-256.

196. Tsuchiya K.D; Greally J.M., Yi Y., Noel K.P., Truong J.P., Disteche C.M. 2004. Comparative1 sequence and x-inactivation analyses of a domain of escape in human xpll.2 and the conserved segment in mouse. Genome Res. 14: 1275-1284.

197. Ullu E., Tschudi C. 1984. Alu sequences are processed 7 SL RNA genes. Nature. 312: 171-172.

198. Ullu E., Weiner A.M. 1984. Human-genes and pseudogenes for the 7 SL components of signal recognition particle. EMBOJ. 3: 3303-3310.

199. Vansant'G., Reynolds W.F. 1995. The consensus sequence of a major Alu subfamily contains a functional retinoic acid response element. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 8229-8233.

200. Villard J. 2004. Transcription regulation and human disease. Swiss. Med. Wkly. 134:571-579.

201. Wang Q., Zhang Z., Blackwell K., Carmichael G.G. 2005. Vigilins bind topromiscuously A-to-I-edited RNAs and are involved in the formation of heterochromatin.Curr. Biol. 15: 384-391.

202. Waterston R.H., Lindblad-Toh K., Birney E. et al. 2002. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420: 520-562.

203. Weber M., Hellmann I., Stadler M.B., Ramos L., Paabo S., Rebhan M., Schubeler D. 2007. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA» methylation in the human genome. Nat. Genet. 39: 457466.

204. Weichenrieder O., Stehlin C., Kapp U., Birse D.E., Timmins P.A.,.Strub K., Cusack S. 2001. Hierarchical assembly of the Alu domain of the mammalian signal recognition particle. RNA. 7: 731-740.

205. Weisenberger D.J., Campan M., Long T.I., Kim M., Woods C., Fiala E., Ehrlich M., Laird P.W. 2005. Analysis of repetitive element DNA methylation by MethyLight. Nucleic Acids Res. 33: 6823-6836.

206. White W.M., Willard H.F., Van Dyke D.L., Wolff D.J. 1998. The spreading of X inactivation into autosomal material of an x;autosome translocation: evidence for a-difference between,autosomal and X-chromosomal DNA. Am. J. Hum. Genet: 63: 20-28.

207. Wild'K., Halic M., Sinning I., Beckmann R. 2004. SRP meets the ribosome. Nat. Struct Mol. Biol. 11: 1049-1053.

208. Wilkinson F.H., Park K., Atchison M.L. 2006. Polycomb recruitment to DNA in vivo by the YY1 REPO domain: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103: 1929619301.

209. Williams B.R. 1999. PKR: a sentinel kinase for cellular stress. Oncogene. 18: 6112-6120.

210. Wilson G.M., Vasa M.Z., Deeley R.G. 1998. Stabilization and cytoskeletalassociation of LDL receptor mRNA are mediated by distinct domains in its 3' untranslated region. J. Lipid. Res. 39: 1025-1032.

211. Won J., Yim J., Kim Т.К. 2002. Spl and Sp3 recruit histone deacetylase to repress transcription of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) promoter in normal human somatic cells. J. Biol. Chem. 277: 38230-38238.

212. Wu J., Grindlay G.J., Bushel P., Mendelsohn L., Allan M. 1990. Negative regulation of the human epsilon-globin gene by transcriptional interference: role of an Alu repetitive element. Mol. Cell. Biol. 10: 1209-1216.

213. Xing J., Hedges D.J., Han K., Wang H., Cordaux R., Batzer M.A. 2004. Alu element mutation spectra: molecular clocks and the effect of DNA methylation: J. Mol. Biol: 344: 675-682.

214. Xu G.F., Nelson L., O'Connell P., White R. 1991. An Alu polymorphism* intragenic to the neurofibromatosis type 1 gene (NF1). Nucleic Acids Res. 19: 3764.

215. Yi P., Zhang W., Zhai Z., Miao L., Wang Y., Wu M. 2003. Bcl-rambo beta, a special splicing variant with an insertion of an Alu-like cassette, promotes etoposide- and'Taxol-induced cell death. FEBS Lett. 534: 61-68.

216. Zee R.Y., Ridker P.M., Stampfer M.J., Hennekens C.H., Lindpaintner K. 1999. Prospective evaluation of the angiotensin-converting enzyme insertion/deletion polymorphism and the risk of stroke. Circulation. 99: 340343.

217. Zhang G., Fukao Т., Sakurai S., Yamada K., Michael Gibson K., Kondo N. 2006. Identification of Alu-mediated, large deletion-spanning exons 2-4 in a patient with mitochondrial acetoacetyl-CoA thiolase deficiency. Mol. Genet. Metab. 89: 222-226.

218. Zhang M., Murphy R.F., Agrawal D.K. 2007. Decoding IgE Fc receptors. Immunol. Res. 37: 1-16.

219. Zhang Z., Carmichael G.G. 2001. The fate of dsRNA in the nucleus: a p54(nrb)-containing complex mediates the nuclear retention of promiscuously A-to-I edited RNAs. Cell. 106: 465-475.

220. Zietkiewicz E., Richer C., Sinnett D., Labuda D. 1998. Monophyletic origin of Alu elements in primates. J. Mol. Evol. 42: 172-182.

221. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

222. Oei S.L., Babich V.S., Kazakov V.I., Usmanova N.M., Kropotov A.V., Tomilin N.V. 2004. Clusters of regulatory signals for RNA polymerase II transcription associated with Alu family repeats and CpG islands in human promoters. Genomics. 83: 873-882.

223. Усманова H.M., Казаков В.И., Томилин Н.В. 2008. Ретропозоны Alu-семейства из г/мс-регуляторных модулей промоторов генов DNAse II ич

224. CAML вляют на генную экспрессию в клетках А5491 и- НЕК293. Цитология. 50 (3): 249-255.

225. Усманова Н.М., Казаков В.И., Томилин Н.В. 2008. SINE элементы, в геномах млекопитающих могут служить вспомогательными элементами при* формировании факультативного гетерохроматина. Цитология. 50 (3): 256-260.

Информация о работе

Усманова, Надежда Маратовна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2008
ВАК 03.00.25

Диссертация

Роль ретропозонов ALU-семейства в регуляции генной экспрессии в клетках линий НЕК293 и А549 человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы