Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ белков человека, контролирующих транскрипцию ретропозонов Alu-семейства

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кропотов, Андрей Владимирович, Санкт-Петербург

5 о ¿з — ц / н1 и ^ - ¿?

РОСИИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

На правах рукописи 577.214.39

КРОПОТОВ Андрей Владимирович

АНАЛИЗ БЕЛКОВ ЧЕЛОВЕКА, КОНТРОЛИРУЮЩИХ ТРАНСКРИПЦИЮ

РЕТРОПОЗОНОВ А1и-СЕМЕЙСТВА.

03.00.25 - клеточная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: профессор, доктор биологических наук Томилин Н.В.

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

I. ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................8

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................13

§1 Структура и функции ретропозонов Alu-семейства......................13

§2 Регуляция транскрипции генов 3-го класса..................................20

§3 Регуляция транскрипции Alu-повторов...........................................36

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.........................................................................45

§1. Линии клеток, использованные в работе.......................................45

§2. Получение ядерной и цитоплазматической фракций

культивируемых клеток........................................................................45

§3. Мечение проб для гель-шифт экспериментов..............................46

§4. Гель-шифт эксперименты...............................................................46

§5. Определение равновесной константы ДНК-связывания

для комплексов С2 и СВ.......................................................................46

§6. Транскрипция in vitro........................................................................48

§7. Отбор DB31 клона из экспрессионной клонотеки HeLa в

векторе A,gt11..........................................................................................48

§8. Секвенирование ДНК........................................................................49

§9. Экспрессия рекомбинантного белка ACR1 (rACR1)

в E.coli......................................................................................................50

§10. Получение и очистка антител на ACR1..........................................51

§11. Электрофорез и иммуноблоттинг...................................................51

§12. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток..............................52

§13. Определение пероксидазной активности ACR1.............................53

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ.............................................................................................54

Часть1. Анализ взаимодействия ядерных белков

человека с промотором ретропозонов А1и-семейства..........................54

§1 Участок А1и-повторов, покрывающий В-бокси последовательность, расположенную в З'-направлении от него (ВОВ-регион), взаимодействует с несколькими

ядерными белками сиквенс-специфическим образом....................54

§2 Белок, формирующий комплекс СЗ, с большей аффинностью связывается с олигонуклеотидами, представляющими ВОВ-регионы наименее

транскрипционно-активных подсемейств А1и-ретропозонов...........56

§3 Один из комплексов (комплекс С2), между человеческими ядерными белками и А1и-ВРВ-пробами, формируется В-бокс

связывающим белком.........................................................................58

§4 Формирование некоторых из гель-шифт комплексов, между ядерными белками человека и промотором А1и-повторов, подавляется в клетках, инфицированных аденовирусом или

экспрессирующих аденовирусный Е1 А-ген.......................................60

§5 Комплекс С2 формируется белком, отличным от ТР1НС2...........63

§6 Белок, формирующий гель-шифт комплекс С2 с А1и-ВРВ-олигонуклеотидом, взаимодействует с В-боксом аденовирусного

\/А1-гена с той же афинностью, что и с В-боксом А1и-повторов......65

§7 Белки НМС1/2 взаимодействует с ВОВ-регионом

А1и-повторов.......................................................................................69

§8 Формирование одного из комплексов (СЗ), образуемых ядерными белками человека с А1и-ВОВ-последовательностью,

стимулируется при добавлении экзогенных белков НМС1/2..........73

§9 Последовательность, расположенная правее В-бокса промотора А1и-повторов (РВ-регион), связывается с

негативными факторами РПЗ-зависимой транскрипции, а последовательность, расположенная левее (UB-регион) с

позитивными факторами...................................................................76

Часть 2. Клонирование и исследование свойств вероятного

репрессора РПЗ-зависимой транскрипции Alu-повторов.......................78

§1 Отбор и секвенирование кДНК-клона , кодирующего белок,

который связывается с DB-регионом Alu-повторов..........................78

§2 Компьютерный анализ белковой последовательности................82

§3 Экспрессия ACR1 в E.coli и его очистка........................................87

§4 rACR1 связывается с BDB-регионом Alu-повторов in vitro..........89

§5 rACR1 имеет пероксидазную активность......................................89

§6 Определение клеточной локализации ACR1.................................92

§7 Рекомбинантный ACR1 специфически репрессирует РПЗ-зависимую транскрипцию Alu-повторов in vitro..................................94

V. ОБСУЖДЕНИЕ И ВЫВОДЫ.........................................................................96

VI. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.............................................105

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.

АТФ - аденозин-5'-трифосфат

БДУ - 5-бром-2'-дезоксиуридин

БР - блокирующий реагент

БУ - 5-бромуридин

ГТФ - гуанозин-5'-трифосфат

ГЦ - гуанин+цитозин

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дАТФ - 2'-дезоксиаденозин-5'-трифосфат

дГТФ - 2'-дезоксигуанозин-5'-трифосфат

дТ - 2-дезокситимидин

дТТФ - 2'-дезокситимидин-5'-трифосфат

дУТФ - 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат

KT - комнатная температура

м.п.н. - миллион пар нуклеотидов

(отт)ДНК - ДНК тимуса теленка, обработанная ультразвуком

РП1 - РНК полимераза I

РП2 - РНК полимераза II

РПЗ - РНК полимераза III

рРНК - рибосомная РНК

п.н. - пара нуклеотидов

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

УТФ - уридин-5'-трифосфат

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

ФСКРС - фетальная сыворотка крупного рогатого скота

ЭДТА - ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt (этилендиаминтетраацетат) ABP - Alu- связывающий белок

ADPRT - poly(ADP-ribosyl) transferase (поли(АДФ-рибозил) трансфераза)

Alu - Alu-повтор

BDB - BDB-регион Alu-повторов

BSA - бычий сывороточный альбумин.

CP - нерастворимая цитоплазматическая фракция клеток

CS - консервативное подсемейство Alu-повторов.

CyS - раствримая цитоплазматическая фракция клеток

DB - DB-регион Alu-повторов

DE - Переферический элемент (Distal Element) промотора Alu-повторов DSE - Переферический элемент(0181а1 Sequence Element) промотора DTT - дитиотрейтол

ЕЕ - энхансерный элемент промотора Alu-повторов

EGTA - ethylene glycol tetraacetic acid (этиленгликольчетырехуксусная кислота)

GR3 - глютаредоксин 3

HAT - гистон-ацетилтрансфераза

HMG - High Mobility Group proteins (группа гистоновых белков, обладающих высокой подвижностью)

HS - подсемейство Alu-повторов, специфическое для людей (human-specific

subfamily of Alu-repeats)

IgG - иммуноглобулин G

IPTG тио-р-й-галактозид

LTR - длинные концевые повторы

MS - основное (Major) подсемейство Alu-повторов

NP - нерастворимая ядерная фракция клеток после экстракции 0.5М NaCI

NS - ядерный экстракт клеток

[32Р]-ДТТФ - ДТТФ, конъюгированный с [32Р]

PBS - phosphate buffered saline (фосфатно-солевой буфер)

PMSF - фенилметилсульфонилфторид

PSE - проксимальный элемент последовательности (Proximal Sequence Element)

PTF - транскрипционный фактор, связывающийся с PSE (Proximal Sequence Element-Binding Transcriptional Factor.) RT - обратная транскриптаза

SDS - додецилсульфат натрия (sodium dodecylsulfate)

SRP - сигнал распознающая частица (signal responsible particle)

TAFs - белковые факторы, связанные с ТВР

ТВЕ - трис-боратный буфер

ТВР - ТАТА-Бокс-связывающий белок

TDF - translation depended factor (фактор, зависящий от трансляции)

TFIIIA - транскрипционный фактор III А

TFIIIB - транскрипционный фактор III В

TFIIIC - транскрипционный фактор III С

TFIIIC1 - транскрипционный фактор III 01

TFIIIC2 - транскрипционный фактор II! 02

ВВЕДЕНИЕ

Мобильные генетические элементы человека в основном представлены ретротранспозонами двух семейств -Ни Alu, которые занимают около 10% ядерного генома. Кроме последовательности нуклеотидов эти элементы различаются длиной, а также наличием в длинных L1 элементах двух открытых рамок считывания, одна из которых кодирует белок, обладающий активностями обратной транскриптазы и эндонуклеазы [Feng et al., 1996]. Этот белок расщепляет ДНК по тимин-богатым участкам и катализирует обратную транскрипцию L1 и Alu РНК, начинающуюся с полиаденилатного блока, обеспечивая встраивание ДНК-копий этих элементов в хромосому [Luán et al. 1993; Boeke, 1997]. Было показано, что вставки L1- или Alu-ретропозонов в экзоны генов приводят к возникновению наследственных заболеваний [Labuda et al., 1995]. Поэтому должны существовать клеточные механизмы, контролирующие процесс амплификации указанных элементов. Однако механизм этого контроля неизвестен.

Что касается Alu, то контроль, по-видимому, осуществляется на стадии их транскрипции РНК полимеразой III (РПЗ), поскольку число соответствующих транскриптов в клетках человека очень мало [Poulson et al., 1986; Liu et al., 1994]. Тем не менее, Alu хорошо транскрибируются РПЗ in vitro [Perez-Stable et al., 1984; Perez-Stable, Shen, 1986], что указывает на существование эффективного механизма подавления этих элементов in vivo.

РНК полимераза III транскрибирует ряд коротких генов, кодирующих РНК, и в частности гены тРНК, которые имеют внутренний промотор, составленный из консервативных А- и В-боксов [Fowlkes and Shenk, 1980; Sharp et al., 1981]. За последнее время были идентифицированы позитивные базальные факторы транскрипции млекопитающих, такие как TFIIIC2, TFIIIC1 и TFIIIB [Dean and Berk, 1988], контролирующие эту транскрипцию. Недавно была изолирована и описана форма РПЗ, связанная с этими

базальными факторами (РПЗ-голофермент) [Wang et al., 1997]. Однако не так много известно о регуляции РПЗ-зависимой транскрипции in vivo. Было идентифицировано много дополнительных транскрипционных факторов, которые взаимодействуют с базальными комплексами и могут стимулировать или репрессировать РП2-зависимую транскрипцию. Вероятно, сходные небазальные факторы могут участвовать в регуляции РПЗ-зависимой транскрипции. Известно, что транскрипция некоторых генов III класса специфически стимулируется в клетках, экспрессирующих аденовирусный Е1А белок [Hoefler and Roeder, 1985; Berger and Folk, 1985; Yoshinaga et al., 1986; Hoefler et al., 1988]. Некоторые транскрипционные факторы для РП2 могут репрессировать РПЗ-зависимую транскрипцию, например, ТВР-связывающий репрессор Dr1 [White et al., 1994], белок ретинобластомы [White et al., 1996; Chu et al., 1997] и p53 [Chesnokov et al., 1996]. Однако до настоящего времени не было идентифицировано активатора или репрессора, специфически регулирующего РПЗ-зависимую транскрипцию.

В частности остается неясным почему человеческие ретропозоны Alu семейства, транскрибируемые in vitro РПЗ на уровне тРНК-генов [Perez-Stable et al., 1984], неактивны в соматических клетках in vivo [Poulson and Schmid, 1986; Liu et al., 1994]. Например, 4 копии 7SL RNA гена, также транскрибируемого РПЗ, производят около 1млн. транскриптов на клетку HeLa, а 1млн. Alu - около 100 [Liu et al., 1994]. Таким образом Alu-повторы транскрибируются на 8-9 порядков хуже чем 7SL или тРНК ген в пересчете на одну копию.

Существует две основных гипотезы, объясняющих транскрипционную неактивность Alu повторов:

Первая заключается в том, что большинство Alu-повторов являются псевдогенами, имеют вырожденый промотор и поэтому не транскрибируются [Shen et al., 1991]. Транскрипционно-активными являются только "мастер" Alu-последовательности, которые содержат внешние элементы промотора [Chesnokov and Schmid, 1995].

Вторая основывается на предположении о существовании эффективных клеточных механизмов репрессии Транскрипции Alu-повторов [Tomilin and Bozhkov, 1989; Tomilin et al., 1990]. Первая гипотеза по-видимому не верна, так как высокая транскрипционная активность Alu-элементов in vitro может быть супрессирована специфическими мутациями промотора Alu-повторов [Perez-Stable et al., 1984] и, следовательно, не является артефактом. Анализ геномных копий Alu-повторов показал, что значительное число Alu-элементов имеют промоторы, последовательность которых совпадает с консенсусной последовательностью промотора для Alu-элементов, транскрибируемых in vivo. Кроме того, все РПЗ-зависимые транскрипты Alu, выделенные из соматических клеток имеют слегка различные последовательности [Liu et al., 1994; Sinnet et al., 1992; Maraia et al., 1993]. Следовательно большое число геномных копий Alu-повторов транскрибируется in vivo примерно с одинаковой, очень низкой, эффективностью. Эти наблюдения указывают, что по крайней мере в соматических клетках, транскрипционно-активными являются не только "мастер" Alu-последовательности, которые содержат внешние элементы промотора.

Таким образом, транскрипция Alu повторов в соматических клетках in vivo, по-видимому, сильно репрессирована. Было предложено несколько гипотез, объясняющих возможные механизмы репрессии Alu in vivo: существование Alu-специфичного репрессора транскрипции [Tomilin and Bozhkov, 1989; Tomilin et al., 1990; Humphrey et al., 1996]; метилирование Alu-ДНК в соматических клетках [Liu et al., 1994; Schmid, 1991; Liu and Schmid, 1993; Kochanek et al., 1993; Kochanek et al., 1995]; Alu-специфическое расположение нуклеосом, приводящее к инактивации промотора [Englander et al., 1993; Englander and Howard, 1995]. Предложенные механизмы не являются альтернативными и, вероятно, работают кооперативно. Однако любой из этих механизмов должен объяснять тот факт, что транскрипция Alu стимулируется в клетках, инфицированных аденовирусом V-ro типа [Panning

and Smiley, 1993; Panning and Smiley 1995]. Недавно было показано, что основное число транскрипционно-компетентных Alu-повторов в ядрах клеток HeLa маскированы от факторов транскрипции 3-го класса, и что индукция экспрессии Alu-элементов при инфекции клеток аденовирусом в основном связана с увеличением их доступности для взаимодействия с базальными транскрипционными факторами [Russanova et al., 1995]. Эти наблюдения согласуются с предположением о том, что аденовирусная инфекция инактивирует Alu-специфичный репрессорный комплекс, блокирующий промотор Alu-элементов.

Внутренний промотор для транскрипции Alu-повтров РПЗ in vitro, как и промотор генов тРНК, состоит из двух ключевых элементов - А и В боксов [Perez-Stable et al., 1984]. Сборка активного транскрипционного комплекса на подобных промоторах начинается со связывания базального транскрипционного фактора TFIIIC2 с В-боксом промотора. Затем с промотором связываются TFIIIC1 и TFIIIB [Boulander et al., 1987; Dean and Berk, 1988]. Были идентифицированы 2 формы TFIIIC2 млекопитающих: транскрипционно-активная TFIIIC2a и транскрипционно неактивная TFIIIC2b [Hoefler et al., 1988; Clark and Dasgupta, 1990; Sinn et al., 1995]. Они имеют идентичные В-бокс-связывающие свойства, но различаются составом субъединиц и степенью фосфорилирования. TFIIIC2a и b содержат несколько субъединиц, одна из которых (массой 220кД) является В-бокс-связывающей [L'Etoile et al., 1994; Lagna et al., 1994]. Однако были сообщения и о других В-связывающих полипептидах, которые имеют массу 55 и 120кД и очищаются вместе с TFIIIC [Cromlish and Roeder, 1989; Waldschmidt et al., 1990].

Кроме того было идентифицировано несколько белков, взаимодействующие с различными участками Alu-повторов [Perelygina et al., 1987; Tomilin and Bozhkov, 1989; Tomilin et al., 1990; Chesnokov et al., 1991; Tomilin et al., 1992; Humphrey et al., 1996]. Один из этих белков (АВР) связывается с консервативной ГЦ-богатой последовательностью, расположенной между А- и В-боксами промотора Alu-повторов [Tomilin and

Bozhkov, 1989; Tomilin et al., 1990; Chesnokov et al., 1991], другой - с последовательностью, расположенной левее В-бокса промотора [Humphrey et al., 1996]. Еще несколько белков взаимодействуют с участком Alu-повторов, прокрывающим В-бокс промотора, и последовательность, расположенную правее, который содержит несколько диагностических различий между МС и PV подсемействами Alu-элементов [Tomilin et al., 1992]. Предположительно эти белки могут участвовать в репрессии транскрипции Alu-повторов, однако прямых доказательств, поддерживающих это предположение, получено не было.

Основной целью данного исследования было получение доказательств в пользу ранее выдвинутой гипотезы о существовании специфического репрессора РПЗ-зависимой транскрипции Alu-повторов in vivo. Предполагалось, что этот комплекс должен интерферировать со связыванием базального фактора TFIIIC2 с В-боксом промотора. В работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1. В Alu последовательности идентифицировать участок промотора, связывающий репрессорный комплекс для РПЗ.

2. Используя этот участок в качестве пробы на ДНК связывающий белок, из экспрессионной клонотеки клеток HeLa выделить и секвенировать клон кДНК, кодирующий потенциальный репрессор Alu транскрипции.

3. Экспрессировать указанный клон кДНК в E.coli, очистить рекомбинантный белок и исследовать его репрессорную активность в системе Alu транскрипции in vitro.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

§1 Структура и функции ретропозонов Alu-семейства

Большая часть геномов эукариот не содержит информации о белковых последовательностях. У некоторых видов некодирующая ДНК составляет 97% всего генома. Она очень гетерогенна по составу нуклеотидов и основная ее фракция представлена уникальными нуклеотидными последовательностями интронов, регуляторными элементами, микросателитами, тандемными повторами, псевдогенами и ретроэлементами (ретровирусы, ретротранспозоны, LINEs, SINEs).

Ретроэлементы (ретропоследовательности) являются мобильными геномными последовательностями, которые увеличивают число своих копий, используя в качестве посредника РНК. Эта амплификация осуществляется через обратную транскрипцию на их РНК копиях с последующим внедрением образовавшейся кДНК копии в геном [Rogers, 1985; Weiner et al., 1986].

Существует пять категорий ретроэлементов. Две из них, ретровирусы и ретротранспозоны, имеют длинные концевые повторы (LTR) и кодируют ферменты, необходимые для обратной транскрипции и внедрения в геном. Три других категории называются ретропозонами и включают: LINEs (Long Interspersed Repeated Elements), представл�