Роль метил-ДНК-связывающего белка каизо в контроле транскрипции генов позвоночных, регулируемых метилированием ДНК

Саложин, Сергей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль метил-ДНК-связывающего белка каизо в контроле транскрипции генов позвоночных, регулируемых метилированием ДНК
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль метил-ДНК-связывающего белка каизо в контроле транскрипции генов позвоночных, регулируемых метилированием ДНК"

На правах рукописи

САЛОЖИН СЕРГЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

РОЛЬ МЕТИЛ-ДНК-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА КАИЗО В КОНТРОЛЕ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ ПОЗВОНОЧНЫХ, РЕГУЛИРУЕМЫХ МЕТИЛИРОВАНИЕМ ДНК

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ медицины Института Биологии Гена РАН и в лаборатории генетической инженерии клеток млекопитающих Центра «Биоинженерия» РАН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат биологических наук

Прохорчук Егор Борисович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор

Карпов Вадим Львович

доктор химических наук, профессор

Громова Елизавета Сергеевна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биохимии им. А Н. Баха РАН

Защита состоится «СИ » ои-сн^ 2006 года в ЯО на заседании диссертационного •совета Д 501.001.76 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «2£» апреля 2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Н.О. Калинина

9Л0Ч

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Регуляция экспрессии генов у высших эукариот — сложный процесс, включающий контроль синтеза РНК и белков на всех возможных уровнях: от связывания транскрипционных факторов и внутриядерной локализации кодирующей последовательности до посттрансляционных модификаций белков. Важную роль в этом процессе играют и механизмы, связанные с изменением/поддержанием структуры хроматина, в которых участвуют хроматин-ремоделирующие факторы: гистондеацетилазы, гистон-ацетилтрансферазы, метил-ДНК-трансферазы и др. Важную роль в большинстве процессов эпигенетической регуляции экспрессии генов, таких как Х-инактивация, геномный импринтинг, репрессия транскрипции мобильных элементов, репрессия транскрипции генов-супрессоров опухолевого роста, играет метилирование ДНК. Оно связано с негативной регуляцией экспрессии генов и может оказывать непосредственное влияние на транскрипцию, блокируя взаимодействие активирующих белковых факторов с регуляторными последовательностями [Clark et al., 1997]. Однако существует и другой механизм - привлечение к метилированной ДНК так называемых метил-ДНК-связывающих белков.

Описанный недавно новый метил-ДНК-связывающий белок Каизо имеет два функциональных домена: BTB/POZ и «цинковые пальцы» [Prokhortchouk et al., 2001]. Последний обеспечивает специфическое взаимодействие с метилированной ДНК, тогда как BTB/POZ-домен может принимать участие в образовании комплексов с другими белками того же семейства. Исходно Каизо был охарактеризован как белок, взаимодействующий с катенином р120 [Daniel, Reynolds, 1999]. Таким образом, Каизо является фактором, способным как взаимодействовать с метилированной ДНК, так и участвовать в других внутриклеточных процессах, обеспечивая связь между событиями в цитоплазме и регуляцией экспрессии генов в ядре.

Кроме того, известно, что BTB/POZ-белки играют важную роль в процессах органогенеза, являются супрессорами опухолевого роста [Deweindt et al., 1995]. Следовательно, поиск генов, экспрессия которых зависит от Каизо, представляет интерес для общего понимания эпигенетической регуляции экспрессии генов, а также может оказаться полезным при изучении явлений Х-инактивации, геномного импринтинга, канцерогенеза и т.д.

Цель работы: изучение возможной роли нового метил-ДНК-связывающего белка Каизо в процессах эпигенетической регуляции экспрессии генов.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать способность Каизо взаимодействовать in vitro и in vivo с регуляторными последовательностями ДНК, подвергающимися метилированию в живом организме:

- 5'-LTR мобильных элементов (на примере мобильного элемента IAP -

intracistirnal A-particle);

- промоторными областями генов-супрессоров опухолевого роста (на примере

гена р 16);

- областями контроля локуса импринтных генов (на примере Ш9/1££2-локуса).

2. Исследовать влияние нокаута метил-ДНК-связывающего белка Каизо на транскрипцию этих генов.

3. Исследовать влияние нокаута Каизо на изменение эпигенетических маркеров в исследуемых районах.

Научная новизна

В работе впервые был проведен поиск генов-мишеней нового метил-ДНК-связывающего белка Каизо, а также исследовано влияние делеции гена, кодирующего Каизо у мыши, на экспрессию генов-мишеней в живом организме. Кроме того, впервые было изучено влияние нокаута Каизо на структуру хроматина в районе Н19 DMR и уровень метилирования ДНК в районе промотора reHaTctexl.

Теоретическое и практическое значение работы

В работе показано, что метил-ДНК-связывающий белок Каизо способен взаимодействовать с широким спектром последовательностей-мишеней как in vitro, так и in vivo. При этом было продемонстрировано, что отсутствие Каизо приводит к изменению гистонового кода в районе Н19 DMR, а также установлено, что Каизо подавляет транскрипцию гена Tctexl.

Полученные результаты представляют интерес как при изучении механизмов интерпретации сигналов метилирования ДНК, так и при общем рассмотрении процессов регуляции экспрессии генов. Кроме того, учитывая, что белок, кодируемый геном Tctexl, важен в процессах роста аксона и формирования дендритов у созревающих нейронов [Chuang et al., 2005], можно предположить,

что нарушение функций Каизо связано с какими-либо психическими расстройствами и нейродегенеративными заболеваниями. Продолжение работы в этом направлении может указать пути лечения подобных заболеваний.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации были представлены на: III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), 7-й Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003), International congress of medical sciences for students and young doctors (8-11 May 2003; Sofia, Bulgaria), Eighteenth IGB Meeting: Epigenetic Bases of Genome Reprogramming (Capri, Italy, 2005).

Структура диссертации

Диссертационная работа представлена на -Ц& страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы, включающий 2)0 3 источника. Материал проиллюстрирован SO рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Каизо in vitro взаимодействует с фрагментами, соответствующими 5'-LTR IAP-элемента и промоторной области гена р16.

Для определения потенциальной способности Каизо участвовать в основных процессах, связанных с метилированием ДНК, был применен метод EMSA (ElectroMobility Shift Assay, задержки ДНК-белкового комплекса в геле) с ПЦР-амплифицированным фрагментом ДНК, соответствующим участку 5'-LTR регротранспозонного элемента IAP и ПЦР-амплифицированным фрагментом ДНК, соответствующим ЦфГ-богатому участку промоторной области гена р16.

При использовании ядерных экстрактов из линии клеток КСМЛ-0 было детектировано метилзависимое связывание с обоими фрагментами ДНК (рис. 1). Наличие Каизо в ДНК-белковом комплексе подтверждали, внося в реакционную смесь специфические (ZFH6) или нерелевантные (анти-1кВ) антитела. Добавление поликлональных антител к Каизо приводило к уменьшению подвижности комплекса в геле, тогда как наличие антител к IkB никак не отражалось на массе комплекса.

Для подтверждения метилспецифичности образующегося комплекса в реакционную смесь был добавлен неметилированный или метилированный специфический конкурент в 10 и 50-кратном избытке. Присутствие

А.

3 4 5 6 7 8

Б.

1 2 3

неметилированного конкурента не влияло на образование комплекса, тогда как при избытке метилированного конкурента сигнал исчезал.

Также была исследоване возможность взаимодействия рекомбинантно-экспрессированного Каизо с двуцепочечным олигонуклеотидом «матрилизин», содержащим консенсусную последовательность CTGCNA. Показано, что данное взаимодействие наблюдается только при высоких концентрациях белка (710 мкг/ре акцию).

Рис. 1. Взаимодействие Каизо с различными ДНК-мишенями in vitro (EMS A-эксперименты):

А. с промоторным участком ретротранспозонного элемента IAP; Б. с ЦфГ-богатым участком гена р16.

1 - неметилированная проба;

2 - метилированная проба;

3 - метилированная проба + поликлональные антитела к Каизо;

4 - метилированная проба + антитела к IkB; 5,6 - метилированная проба + неметили-рованный конкурент в 10 и 50-кратном избытке, соответственно; 7,8 - метилированная проба + метилированный конкурент в 10 и 50-кратном избытке, соответственно.

Таким образом, была продемонстрирована возможность метил-специфического in vitro взаимодействия Каизо-содержащего комплекса как с регуляторными областями мобильных элементов, так и с последовательностями, подвергающимися абнормальному метилированию при канцерогенезе.

Каизо in vivo взаимодействует с регуляторными областями «молчащих» генов LAP и р16.

Взаимодействие Каизо с исследуемыми последовательностями ДНК в живой клетке было подтверждено методом иммунопреципитации хроматина. Для изучения взаимодействия Каизо с 5'-LTR мобильного элемента IAP использовали хроматин, полученный из свежевыделенных тканей печени мышей дикого типа. Хроматин, выделенный из тканей мышей, нокаутных по Каизо, был использован в качестве отрицательного контроля. Продемонстрировано in vivo связывание Каизо с 5'-LTR мобильного элемента IAP (рис. 2А.). Взаимодействие с промоторм гена «матрилизин» не было детектировано.

Уровень метилирования промотора гена р16 в клетках линии НСТ116 составляет около 45% [Meehan et al., 1991]. При использовании хроматина, выделенного из клеток этой линии, показано, что Каизо метилспецифически взаимодействует с промотором р16 (рис. 2Б.): при обработке полученного в результате ChlP'a (Chromatin ImmunoPrecipitation, иммунопреципитация хроматина) пула ДНК неметилчувствительной рестриктазой Mspl невозможно было получить специфический для исследуемой области ПЦР-продукт, тогда как обработка метилчувствительной рестриктазой Hpall не препятствовала амплификации. A, WT КО

—^ Input

ZFH6 -Ab - (5%)

IAP 5' LTR

Б. ZFH6 PI -Ab Р-ры - Input (5%)

pl6

Рис. 2. Каизо in vivo взаимодействует с регуляторными областями генов IAP и р16 (иммунопреципитация хроматина):

А. Каизо взаимодействует с 5'-LTR IАР-элемента. Б. Каизо метилспецифически взаимодействует с промотором гена р 16. ZFH6 - иммунопреципитация с поликлональными антителами к Каизо; Р1 -сыворотка крови кролика; «-Ab» - контроль без антител; «-/Input» - отрицательный и положительный контроли для ПЦР, соответственно.

Каизо дифференциально взаимодействует с разными участками Ш 9 DMR как in vitro, так и in vivo.

Имнринтные гены могут быть использованы как уникальная система для изучения эпигенетических процессов: отцовский и материнский аллели генов отличаются как уровнем метилирования ДНК, Так и модификациями гистонов. В случае H19/Igf2^0Kyca материнский (неметилированный) аллель DMR является внутренним контролем при исследовании метилирования ДНК.

Для изучения возможности Каизо взаимодействовать с Н19 DMR была проведена серия EMSA-экспериментов. В качестве ДНК-зонда использовали метилированные и неметшшрованные ПЦР-продукты длиной от 100 до 200 п.о., перекрывающие весь дифференциально метилированный участок (рис. ЗА.), ксперименты проводили с рекомбинантно-экспрессированным полноразмерным Каизо (в количестве 1, 3 и 5 нг), а также ядерными экстрактами, полученными из

нормальных фибробластов мыши (в количестве 1, 3 и 5 мкг). Для подтверждения специфичности связывания реакционная смесь, содержащая метилированный зонд, была дополнительно проинкубирована с поликлональными анти-Каизо антителами 2РН6. Наличие т.н. «супершифта» свидетельствовало о присутствии Каизо в метил-ДНК-связывающем комплексе.

Показано, что Каизо метилспецифически взаимодействует с рядом зондов. Так, рекомбинантно-экспрессированный белок образовывал комплекс со следующими ПЦР-продуктами: Н1, НЗ, 02, ОЗ, 04, Об, 09 и Н4, тогда как в случае ядерных экстрактов метилспецифическое взаимодействие было получено только для районов НЗ, ОЗ, 04, Об и D9 (рис. ЗБ.).

А.

"""""" Н19

ZFH6 Ядерные экстракты

Свободная

Рис. 3. Взаимодействие Каизо с Н19 DMR in vitro-. А. Схема Н19/^£2-локуса. Черный прямоугольник - экзон, стрелки - точка старта транскрипции гена HI9. CBS - сайты связывания белка CTCF. Кроме того, обозначены пары праймеров, использованные для синтеза зондов для EMSA-экспериментов.

Б. Взаимодействие рекомбинантно-экспрессированного Каизо (верхняя панель) и Каизо-зависимого метил-ДНК-связывающего комплекса (нижняя панель) с фрагментами HI 9 DMR.

«М-/М+» - неметилированный/метилированный зонд. ZFH6 - кроличьи поликлональные антитела к Каизо.

Разница во взаимодействии с зондами Каизо-содержащего комплекса и рекомбинантного белка может быть объяснена наличием посттрансляционных модификаций или разницей в ко-трансляционном сворачивании (фолдинге) исследуемого белка, что может отражаться на способности Каизо взаимодействовать с метилированными последовательностями.

С помощью программы OptiQuant была проведена количественная оценка взаимодействия Каизо с проанализированными фрагментами ДНК (рис. 4; сплошная и пунктирная линии). Для более точного картирования участков связывания Каизо был применен метод ПЦР в реальном времени, где в качестве матрицы использовали ДНК, полученную в результате иммунопреципитации хроматина с антителами к Каизо (рис. 4; вертикальные столбцы). Праймеры для ПЦР в реальном времени подбирали к участкам, показавшим наибольшее сродство к Каизо в экспериментах по торможению ДНК-белкового комплекса в геле. Обсчет результатов проводили отдельно для каждого эксперимента; общий «профиль» связывания Каизо был построен на основании четырех независимых экспериментов. Наиболее сильный сигнал (в 5,5 раз выше по отношению к Input) получен для фрагмента D3 участка HI9 DMR.

Разница во взаимодействии Каизо с фрагментами HI9 DMR in vitro и in vivo может быть объяснена тем, что в живой клетке часть сайтов связывания исследуемого белка недоступна для узнавания

HI Н2 НЗ 01 02 03 D4 D6 ОТ 08 Н4 Фрагменты HI9 DMR

Рис. 4. Количественный анализ взаимодействия Каизо с районом Н19 БМЯ. Сплошная линия - «профиль» взаимодействия Каизо, полученный при анализе экспериментов с рекомбинантно-экспрессированным белком, прерывистая - при анализе экспериментов с ядерными экстрактами. Вертикальные столбцы - «профиль» взаимодействия Каизо, полученный в экспериментах по иммунопреципитации хроматина с последующей ПЦР в реальном времени. ЕЛ/мм2 - удельная интенсивность радиоактивности геля в районе ДНК-белкового комплекса.

Каизо аллель-специфично взаимодействует с районом HI 9 DMR.

Для изучения метилспецифичности связывания Каизо с районом HI 9 DMR был картирован рестрикционный полиморфизм в участке D3 между подвидом Mus musculus domesticus и видом Mus spretus (рис. 5А.). В экспериментах по иммунопреципитации хроматина использовали хроматин, полученный из печени гибридной мыши Mus musculus domesticus/SD7, причем из скрещиваемых особей самец принадлежал линии C57Black (Mus. musculus domesticus), а самка - линии SD7 (у таких животных обе 7 хромосомы частично заменены на хромосомы вида Mus. spretus).

А. Б.

dorn. spr. dorn, x spr. НжШ

+ Нае III mb&w*

Dom.(/) - TlTTT - t мг

spr<?) _ 9999 _ <j> цг

ZFH6 CTCF -Ab Input

rv>/„1

ZFH6 CTCF Input (5%)

ШЁЛI Ш - ?

+ Пае ill ЗЕ» /

Рис. 5. Взаимодействие Каизо с метилированным аллелем HI9 DMR: А. Картирование рестрикционного полиморфизма в ОЗ-районе HI 9 DMR (ПЦР с последующей рестрикцией продукта НаеШ-эндонуклеазой).

В качестве матрицы использована ДНК следующих видов мышей: Mus musculus domesticus (dorn.), Mus spretus (spr.), M.m domesticus x M.spretus (dorn, x spr.).

Б. Иммунопреципитация хроматина с последующей ПЦР и рестрикцией продукта HaelII.

Иммунопреципитация с антителами: ZFH6 - поликлональными к Каизо, CTCF - к CTCF. «-Ab» - контроль без антител; «Input» - положительный контроль для ПЦР. ЦфГ-динуклеотид, содержащий цитозин: МГ - в метилированной форме; ЦГ - в неметшшрованной форме.

После иммунопреципитации с антителами к Каизо или CTCF (положительный контроль) полученная фракция ДНК была проанализирована методом ПЦР с парой праймеров DMD56/1 - DMD78/1 к участку D3. Полученный ПЦР-продукт расщепляли эндонуклеазой Нае1П и далее гибридизовали с пробой, соответствующей полноразмерному ПЦР-продукту. При использовании антител к Каизо был получен ПЦР-продукт только с ДНК Mas. musculus domesticus, тогда

как при использовании антител к CTCF (положительный контроль) можно было детектировать только сигнал, соответствующий ДНК Mus. spretus (рис. 5Б.). Таким образом, Каизо взаимодействует только с отцовским метилированным аллелем HI 9 DMR.

Делеция Каизо приводит к изменению структуры хроматина в районе Н19 DMR.

Для изучения функциональной роли Каизо в районе HI9 DMR был применен метод иммунопреципитации хроматина с антителами к различно модифицированным гистонам. Были использованы следующие антитела: к ацетилированному гистону НЗ, к ацетилированному в положении К9 гистону НЗ, к триметилированному в положении К9 гистону НЗ, к диметилированному в положении К27 гистону НЗ. В качестве контроля использовались антитела к инсуляторному белку CTCF.

Хроматин получали из тканей животных дикого типа, а также нокаутных по Каизо, рожденных после скрещивания самца линии SD7 и самки линии С57В1аск. Полученные в результате иммунопреципитации с различными антителами фрагменты ДНК были проанализированы также, как в случае использования антител к Каизо и CTCF. При использовании антител к метилированному по остатку К9 либо К27 гистону НЗ разницы в распределении модификаций хроматина между отцовским и материнским аллелями для нокаутных животных и животных дикого типа выявлено не было. Однако, показано, что убиквитинирование гистона Н2А характерно только для отцовского метилированного аллеля HI 9 DMR, и делеция Каизо приводит к полному исчезновению данной модификации гистона в исследуемом районе (рис. 6А.,Б.). Кроме того, при использовании антител к ацетилированному гистону НЗ или к гистону НЗ, ацетилированному только в положении К9, детектировано появление слабого сигнала на отцовском аллеле HI9 DMR (рис. 6Б.). В то же время, как в животных дикого типа, так и в животных с делетированным геном, кодирующим Каизо, было показано взаимодействие белка CTCF только с материнским аллелем Н19 DMR.

Таким образом, Каизо способен привлекать убиквитинирование гистона Н2А к метилированным последовательностям ДНК. Роль данной модификации хроматина во внутриклеточных процессах еще не установлена. Возможно, именно отсутствие убиквитинирования Н2А на отцовском аллеле HI9 DMR связано с накоплением ацетилирования гистона НЗ.

« < я 2 э a s

SS S S 2 % % I«

•I ? « I

<< 5 < < Ч& SB

s "é 5 "S "fi 5 « é 5 'à à

+ НаеП1

Рис. 6. Делеция Каизо приводит к исчезновению убиквитинирования на отцовском аллеле HI 9 DMR.

А. ПЦР-анализ преципитированной ДНК с парой праймеров к D3-участку. Иммунопреципитация хроматина с антителами- anti-Ub Н2А - к убиквитинированному гистону Н2А, anti-Ac К9 НЗ - к гистону НЗ, ацеталированному в 9 положении, anti-Ac НЗ - к ацетилированному гистону НЗ, ZFH6 - поликлональными к Каизо. «- Ab» - контроль без антител; «Р-ры» - контроль без антител и хроматина; «-/Input» - отрицательный и положительный контроли для ПЦР, соответственно.

Б. Рестрикционный анализ полученного ПЦР-продукта. Иммунопреципитация хроматина с антителами: anti-diMe К27 - к гистону НЗ, диметштированному в положении К27; anti-triMe К9 - к гистону НЗ, триметилированному в 9 положении. Dom. - Mus. musculus domesticus-, Spr. - Mus spretus.

Делеция Каизо не влияет на экспрессию генов Н19 и Igf2.

Полученные при анализе распределения модификаций хроматина данные позволяют предположить, что Каизо может играть важную роль в регуляции экспрессии генов Н19 и Ïgf2. Поскольку эпигенетические маркеры импринтных генов образуются во время гаметогенеза, можно было ожидать, что отсутствие Каизо во время спермато- или оогенеза приведет к нарушению импринтинга в исследуемом локусе.

NtaM >119

I V КО I 1С ко It Mc< ! 12 КО j И КО U КО I ИМ)! Ift »

BMN

IpO

! ! ■

I 1*1-1*1-1"

I ■ I* I • I M • IM

Б.

Номер животного

9 10 И 12 13 14 15 16

■ , - *

*„• . л*

' г ■■ •-

в.

OWT

И КО

Pat Mat

Рис. 7. Делеция Каизо не влияет на уровень экспрессии Н19 и Igf2.

A. Обратная транскрипция с последующим расщеплением рестриктазами Nlalll и BsaAI.

В качестве матрицы для ОТ-ПЦР взята тотальная РНК из тканей мышей, полученных от скрещиваний Каизо-нокаутного самца и самки линии SD7, а также реципроктного скрещивания.

Б. Нозерн-блот анализ тотальной РНК из тканей животных, полученных от срещивания самца линии SD7 и Каизо-нокаутной самки. Стрелка указывает положение Каизо-специфичского транскрипта.

B. Аллель-специфичная ПЦР в реальном времени.

В качестве матрицы для ОТ-ПЦР взята тотальная РНК из печени мышей, полученных от скрещиваний Каизо-нокаутной самки и самца линии SD7. Аллели HI 9: Pat. - отцовский, Mat. -материнский

Для проверки данного предположения было проанализировано потомство от скрещивания Каизо-нокаутного самца с самкой дикого типа, а также реципроктного скрещивания: самца дикого типа с Каизо-нокаутной самкой. В обоих экспериментах животные дикого типа принадлежали к линии SD7. Потомство от данных скрещиваний имело рестрикционный полиморфизм между

отцовским и материнским аллелями как в кодирующей последовательности гена Н19 (полиморфизм по рестрикционному сайту для Nlalll), так и в кодирующей последовательности гена Igf2 (полиморфизм по рестрикционному сайту для BsaAI). При анализе РНК, выделенной из печени таких животных, было установлено, что отсутствие Каизо во время гаметогенеза не влияет на формирование эпигенетических маркеров импрнтинга (рис. 7А.,Б.).

Для более точного изучения экспрессии гена HI 9 применили методику аллель-специфичной ПЦР в реальном времени. Результаты анализа свидетельствуют о том, что делеция Каизо не приводит к реактивации экспрессии гена HI 9 с •

отцовского аллеля (рис. 7В.).

Экспрессия IAP-элемента не зависит от взаимодействия Каизо с его 5'-LTR последовательностью.

Поскольку отсутствие поддерживающей ДНК-метилтрансферазы DNMT1 приводит к существенному увеличению уровня экспрессии IAP-элемента [Walsh et al., 1998], делеция метил-ДНК-зависимого репрессора, взаимодействующего с регуляторной последовательностью данного мобильного элемента, также могло оказать влияние на его транскрипцию.

А. Б.

■т ко

Рис. 8. Уровень экспрессии 1АР-элемента в тканях животных дикого типа (WT) и нокаутных по Каизо (КО): А. Обратная транскрипция.

«ОТ +/-» — наличие/отсутствие обратной транскриптазы в реакции.

Б. Относительная экспрессия 1АР-элемента в тканях животных дикого типа и нокаутных по Каизо (ПЦР в реальном времени).

Для изучения уровня экспрессии IAP-элемента были применены методы обратной транскрипции с последующим использованием полученной кДНК в качестве матрицы для ПЦР или, в случае количественной оценки, ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР/ОТ-ПЦР в реальном времени). Уровень экспрессии оценивали относительно экспрессии гена 18S рРНК. Разницы в количестве IAP транскрипта у животных дикого типа и нокаутных животных обнаружено не было (рис. 8). Кроме того, не было детектированно разницы в уровне экспрессии гена Wntl 1.

Недавно было охарактеризовано семейство Каизо-подобных белков (KL-белки - от Kaiso-like proteins) [Filion et al., 2006]. Отсутствие изменения в экспрессии генов HI 9 и IAP при нокауте Каизо, можно объяснить тем, что нокаут Каизо частично компенсируется другими членами KL-семейства.

Делеция Каизо приводит к усилению экспрессии гена Tctexl.

Методом гибридизации на микрочипах был проведен глобальный анализ изменения уровня экспрессии 30 тыс. генов в Каизо-нокаутных мышах. Идентифицирован ряд генов, транскрипция которых оказалась изменена при отсутствии Каизо. Одним из генов с наиболее увеличенным уровнем экспрессии оказался ген Tctexl, кодирующий легкую цепь динеинового комплекса. Данные гибридизации были подтверждены Нозерн-блот анализом. Уровень экспрессии Tctexl оказался в 4,4 раза выше в печени нокаутных животных, чем у животных дикого типа, и в 2,6 раза выше в мозге животных с делецией гена, кодирующего Каизо, чем в мож животных дикого типа (рис. 9).

Печень Мозг

Рис. 9. Увеличение уровня экспрессии гена Тйех1 в тканях мышей, нокаутных по Каизо.

А. Нозерн-блот анализ. Тотальная РНК из печени животных дикого типа (\УТ) и Каизо-нокаутных (КО). Верхняя панель - гибридизация с зондом к мРНК гена Тс1ех1; нижняя панель - контрольная гибридизация с пробой к 188 рРНК.

Б. Количественный обсчет результатов Нозерн-блот гибридизации тотальной РНК из тканей животных дикого типа и нокаутных по Каизо.

ЕЛ/мм2 - удельная интенсивность радиоактивности геля в районе специфического трапскрипта.

Каизо взаимодействует с геном Tctexl только на 17, но не на 6 хромосоме.

В геноме мыши содержится два гена Tctexl: на 17 и 6 хромосомах [база данных Entrez Map Viewer]. При этом ген, находящийся на 17 хромосоме, имеет сложную интрон/экзонную структуру и включает 5 экзонов, тогда как кодирующая часть гена, расположенного на 6 хромосоме, состоит из одного экзона. С помощью ChIP было показано, что Каизо взаимодействует только с ЦфГ-островком гена Tctexl, расположенного на 17 хромосоме (рис. 10). Интересно отметить, что ацетилирование гис гонов НЗ и Н4, являющееся *

маркерами активного хроматина, можно было детектировать в той же области одновременно со связыванием Каизо. При этом ни взаимодействия Каизо, ни ацетилирования гистонов в районе промотора гена, расположенным на

Рис 10. Каизо взаимодействует с геном Tctexl на 17, но не на 6 хромосоме (Иммунопреципитация хроматина).

Иммунопреципитация с антителами: ZFH6 - поликлонапышми к Каизо; anti-Ac НЗ - к ацетилированному гистону НЗ; anti-Ac Н4 - к ацетилированному гистону Н4; PI - сыворотка крови кролика; «-АЬ» - контроль без антител; «-/+» - отрицательный и положительный контроля для ПЦР, соответственно.

При компьютерном анализе последовательностей данных генов был идентифицирован рестрикционный полиморфизм в последовательностях мРНК. (

Замена цитозина на тимин привела к исчезновению сайта узнавания рестриктазой Mspl в мРНК гена, расположеного на 17 хромосоме.

Методом ОТ-ПЦР с последующим рестрикционным анализом была проанализирована тотальная РНК, полученная из печени мышей дикого типа, а также нокаутных по Каизо. Поскольку ген Tctexl имеет только один экзон, препарат геномной ДНК мыши был использован в качестве контроля для теста: ПЦР-продукт, полученный с использованием той же пары праймеров, что и для ОТ-ПЦР, был полностью расщеплен рестриктазой Mspl. Показано, что в препаратах тотальной РНК, полученной как из органов животных дикого типа, так и из органов мышей с делецией гена, кодирующего Каизо, содержится только

6 хромосоме, детектированно не было.

транскрипт, соответствующий гену Tctexl, расположенному на 17 хромосоме (рис. 11).

Mspl

670 j, 680 690

6 хромосома 17 хромосома

582 С т А А А А А С т с А А е т с т е с с в G т в G А А А С А i в

661 С т А А А А А С т с А А в т с т « с г G <5 т в G А А А С А <5

кДНК

Mspl

Рис. 11. В тканях животных как дикого типа, так и с делецией Каизо экспрессируется только ген, расположенный на 17 хромосоме. Верхняя панель - полиморфизм в последовательностях мРНК двух генов. Заштрихованный пуклеотид - полиморфизм, нарушающий сайт узнавания рестриктазой Mspl. Нижняя панель -обратная транскрипция с последующей ПЦР и расщеплением ПЦР-продукта ферментом Mspl

Делеция Каизо не приводит к изменению метилирования «ЦфГ-островка» гена Tctexl.

Поскольку Каизо взаимодействует с метилированной ДНК, был проанализирован уровень метилирования в районе «ЦфГ-островка» гена Tctexl методом бисульфитного секвенирования. Для исследования использована ДНК, полученная из печени мышей дикого типа и с делецией гена, кодирующего Каизо. Было проанализировано две области: «-189; -57» и «+160; +460» по отношению к точке старта транскрипции.

В области «-189; -57» метилирование ДНК детектировано не было (проанализировано по 10 клонов для ДНК животных дикого типа и Каизо-нокаутных) Показано, что область «+160; +460» характеризуется малым процентным содержанием метилированных ЦфГ-динуклеотидов (проанализировано 20 клонов для ДНК животных дикого типа и 21 - для Каизо-нокаутных), причем уровень метилирования ДНК не зависит от присутствия Каизо (рис. 12).

Поскольку ген Tctexl экспрессируется и в нормальном организме, можно предположить, что Каизо является модулятором активности Tctexl, взаимодействуя с остаточным метилированием ДНК в промоторной области.

Район 1 Район 2

ion mo

со in и mil дм мин пин i mi 11 11 ни мин i i nil mn mm ii iiiihii гпт

- " —t Tctexl

Район 1

ко

iHl.lMtMMHi.MM t.i i.iitt

Рис. 12. Делеция Каизо не приводит к изменению метилирования ДНК в районе Срв-островка гена Тйех1 (Бисульфитное секвенирование). Верхняя панель - плотность метилирования ЦфГ-динуклеотидов на 17 хромосоме в районе гена Тс1ех1. Серые прямоугольники - экзоны; стрелка - направление транскрипции. Районы I и 2 -участки, для которых был исследован статус метилирования.

Таким образом, в результате проведенных исследований продемонстрирована возможность взаимодействия Каизо-содержащего белкового комплекса с последовательностями ДНК, подвергающимися метилированию в результате таких процессов как геномный импринтинг, опухолеобразование и подавление транскрипции мобильных элементов. То, что нокаут Каизо не приводил к изменениям в экспрессии большинства исследованных генов, может быть объяснено наличием т.н. Каизо-подобных белков. Тем не менее, зависимость экспрессии гена Tctexl от присутствия исследуемого фактора позволяет предположить, что наличие Каизо является важным при таких сложных процессах как, например, созревание нервной системы.

ВЫВОДЫ

1. Новый метил-ДНК-связывающий белок Каизо обладает способностью метилспецифически взаимодействовать с широким спектром последовательностей-мишеней как in vitro, так и in vivo. Каизо метилспецифически взаимодействует с регуляторными областями генов Xist, р16

и мобильного элемента IAP, однако связывания с промоторной областью гена «матрилизин» детектировано не было.

2. Делеция Каизо не влияет ни на уровень экспрессии, ни на количество копий мобильного элемента IAP в геноме нокаутных животных. Кроме того, делеция гена, кодирующего Каизо, не приводит к повышению уровня экспрессии гена Wntl 1.

3. Белок Каизо in vivo взаимодействует с Н19 DMR, причем только с метилированным отцовским аллелем. Делеция Каизо не приводит к полной или частичной реактивации молчащих аллелей генов HI 9 и Igf2. Таким образом, присутствие Каизо в районе HI9 DMR не является критическим для установления и поддержания импринтинга в данном локусе.

4. Структура хроматина в районе HI 9 DMR характеризуется метилированием гистона НЗ в положениях К27 и К9, а также убиквитинированием гистона Н2А в положении 119 на отцовском аллеле. При этом материнский аллель характеризуется ацетилированием гистона НЗ. Делеция Каизо приводит к исчезновению убиквитинирования гистона Н2А в положении 119 на отцовском аллеле HI 9 DMR.

5. Каизо взаимодействует с промоторной областью гена Tctexl, кодирующего легкую субъединицу динеинового комплекса. Делеция Каизо приводит к существенному увеличению экспрессии данного гена, однако не влияет на уровень метилирования ДНК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Саложин C.B., Прохорчук Е.Б., Георгиев Г.П. Метилирование ДНК как один из основных эпигенетических маркеров// Биохимия, 2005.-Т.70(5).-С.525-532

2. Prokhortchouk A., Sansom О., Selfridge J., Caballero I.M., Salozhin S., Aíthozhina D., Cerchietti L., Meng F.G., Augenlicht L.H., Mariadason J.M., Hendrich В., Melnick A., Prokhortchouk E., Clarke A., Bird A. Kaiso-deficient mice show resistance to intestinal cancer//Mol. Cell Biol., 2006.-Vol.26(l).-P.199-208

3. Filion G., Zhenilo S., Salozhin S., Yamada D., Prokhortchouk E., Defossez P-A. A family of human zinc finger proteins that bind methylated DNA and repress transcription//Mol. Cell Biol., 2006.-Vol.26(l).-P.169-181

4. Саложин C.B., Прохорчук Е.Б. Взаимодействие метил-ДНК-связывающих белков с локусом контроля импринтинга генов H19/Igf2. В сб.: III съезд

биохимического общества (Санкт-Петербург; 26 июня-1 июля 2002 г.) Тезисы докладов//СПб, 2002.-С.417

5. Саложин С.В., Прохорчук Е.Б. Новый метил-ДНК-связывающий белок Kaiso взаимодействует с районом H19/Igf2 и молчащими генами на Х-хромосоме. В сб.: 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых: Биология - наука XXI века (Пущино; 14—18 апреля 2003 г.). Сборник тезисов// Пущино, 2003-С.373-374

6. Salozhin S., Prokhortchouk Е. New methyl-DNA-binding protein Kaiso interacts with imprinted H19/Igf2 region and Xist gene in Mus. musculus domesticus. In: International congress of medical sciences for students and young doctors (Bulgaria; Sophia; 8-11 May 2003). Abstract book// Sophia, 2003.-P.23

7. Zhenilo S., Filion G., Salozhin S., Defossez P.-A., Prokhortchouk E. A family of Kaiso-like proteins that bind methylated DNA and repress transcription. In: 18th IGB Meeting: Epigenetic bases of genome reprogramming (Italy; Capri; 8 11 October 2005). Abstract book // Capri, 2005.-P.70

Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт» г. Москва, Ленинский пр-т, Д.37А Тираж 100 экз.

Л оОбА

1Т9Ч

.к

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Саложин, Сергей Владимирович

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Общая характеристика метилирования ДНК.

2.2 Геномный импринтинг и Х-инактивация.

2.3 Абнормальное метилирование при канцерогенезе.

2.4 Метил-ДНК-связывающие белки.

2.5 Гены-мишени MBD-белков.

2.6 Гистоновый код.

2.7 Строение и возможные функции метил-ДНК-связывающего белка Каизо (Kaiso).

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Работа с культурами эукариотических клеток.

3.2 Получение радиоактивно меченных ДНК-зондов для экспериментов по торможению ДНК-белковых комплексов в геле.

3.3 Метилирование ДНК-зондов для экспериментов по торможению ДНК-белковых комплексов в геле.

3.4 Получение радиоактивно меченных ДНК-зондов для Саузерн- и Нозерн-блот анализа.

3.5 Выделение ядерных экстрактов.

3.6 Получение рекомбинантно-экспрессированных белков.

3.7 Выделение тотальной ДНК из тканей.

3.8 Выделение тотальной РНК из тканей.

3.9 Полимеразная цепная реакция.

3.10 Клонирование ПЦР-продукта в p-GEM-T вектор.

3.11 Рестрикционный анализ.

3.12 Трансформация E.coli и выделение плазмидной ДНК.

3.13 Исследование ДНК-белкового взаимодействия методом торможения ДНК-белкового комплекса в геле.

3.14 Иммунопреципитация хроматина.

3.15 Обратная транскрипция.

3.16 Бисульфитное секвенирование.

3.17 Саузерн-блот анализ.

3.18 Нозерн-блот анализ.

3.19 ПЦР в реальном времени.

3.20 Количественный обсчёт результатов иммунопреципитации хроматина с последующей «ПЦР в реальном времени».

3.21 Производство нокаута.

3.22 Олигонуклеотиды.

3.23 Компьютерный анализ.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Метилзависимое взаимодействие Каизо с широким спектром последовательностей ДНК in vitro.

4.2 Каизо взаимодействует с регуляторными областями «молчащих» генов р16, IAP и генов, расположенных на неактивной Х-хромосоме, но не гена Матрилизин.

4.3 Каизо взаимодействует с областью HI9 DMR in vitro.

4.4 Каизо дифференциально взаимодействует с разными участками

HI 9 DMR.

4.5 Определение профиля связывания Каизо в H19/Igf2^0Kyce.

4.6 Каизо взаимодействует с отцовским метилированным районом t HI9 DMR.

4.7 Делеция Каизо приводит к изменению структуры хроматина в районе HI 9 DMR.

4.8 Делеция Каизо не влияет на экспрессию генов HI9 и Igf2.

4.9 Экспрессия IAP-элемента, а также генов Xist и Wntl 1 не зависит щ от взаимодействия Каизо с их регуляторными последовательностями.

4.10 Делеция Каизо приводит к усилению экспрессии гена

Tctexl.

4.11 Каизо взаимодействует с геном Tctexl только на 17, но не на 6 хромосоме.

4.12 Разница в экспрессии Tctexl не зависит от разницы в строении

Т-комплекс содержащего локуса.

4.13 Делеция Каизо не приводит к изменению метилирования * ЦфГ-островка гена Tctexl.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль метил-ДНК-связывающего белка каизо в контроле транскрипции генов позвоночных, регулируемых метилированием ДНК"

Регуляция экспрессии генов у высших эукариот осуществляется на всех уровнях контроля синтеза РНК и белков: от связывания транскрипционных факторов и внутриядерной локализации кодирующей последовательности до посттрансляционных модификаций белков. Важную роль в этом процессе играют и механизмы, не зависящие напрямую от первичной структуры ДНК, а являющиеся «надгеномными» (или эпигенетическими). Основную роль в большинстве процессов эпигенетической регуляции экспрессии генов (X-инактивации, геномном импринтинге, репрессии транскрипции мобильных элементов, подавлении транскрипции генов-супрессоров опухолевого роста и т.д.) играют хроматин-ремоделирующие факторы, изменения гистонового кода, а также метилирование ДНК. Последнее связано с негативной регуляцией экспрессии генов и может оказывать влияние на транскрипцию напрямую, блокируя взаимодействие активирующих белковых факторов с регуляторными последовательностями [Clark et al., 1997]. Однако существует и другой механизм - привлечение к метилированной ДНК так называемых метил-ДНК-связывающих белков.

Гомологи белка Каизо найдены во многих группах позвоночных. Относительно раннее возникновение Каизо в процессе эволюционного развития позвоночных может свидетельствовать о важности выполняемых им функций.

Действительно, в работе, выполненной в лаборатории R. Meehan, показано, что снижение уровня мРНК Каизо во время раннего эмбрионального развиттия Xenopus laevis приводит к существенным нарушениям эмбриогенеза и ранней гибели зародыша [Ruzov et al., 2004]. Доказано также, что функция Каизо напрямую связана с метилированием ДНК, поскольку большинство генов, экспрессия которых оказывается нарушеной при делеции Каизо, имеют ЦфГ-островки вблизи регуляторных последовательностей [там же].

Кроме того, известно, что белки, имеющие в своем составе BTB/POZ-домен, играют важную роль в процессах органогенеза, являются генами-супрессорами опухолевого роста [Deweindt et al., 1995]. Следовательно, поиск генов, экспрессия которых зависит от Каизо, представляет интерес для общего понимания эпигенетической регуляции работы генов, а также может оказаться полезным при изучении явлений Х-инактивации, геномного импринтинга, механизмов канцерогенеза и т.д.

Исходя из этого, целью настоящей работы было изучение возможной роли нового метил-ДНК-связывающего белка Каизо в процессах эпигенетической регуляции экспрессии генов.

В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

- 5'-LTR Qong terminal repeats) мобильных элементов (на примере мобильного элемента IAP - intracisternal-A-garticle);

- промоторными областями генов-супрессоров опухолевого роста (на примере гена р16);

- областями контроля локуса импринтных генов (на примере H19/Igf2-локуса).

2. Определить влияние нокаута метил-ДНК-связывающего белка Каизо на транскрипцию этих генов.

3. Определить влияние нокаута Каизо на изменение эпигенетических маркеров в исследуемых районах.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Саложин, Сергей Владимирович

6. ВЫВОДЫ

3. Белок Каизо in vivo взаимодействует с HI9 DMR, причем только с метилированным отцовским аллелем. Делеция Каизо не приводит к полной или частичной реактивации молчащих аллелей генов HI9 и Igf2. Таким образом, присутствие Каизо в районе HI9 DMR не является критическим для установления и поддержания импринтинга в данном локусе.

4. Структура хроматина в районе HI9 DMR характеризуется метилированием гистона НЗ в положениях К27 и К9, а также убиквитинированием гистона Н2А в положении 119 на отцовском аллеле. При этом материнский аллель характеризуется ацетилированием гистона НЗ. Делеция Каизо приводит к исчезновению убиквитинирования гистона Н2А в положении 119 на отцовском аллеле Н19 DMR.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В представленной работе был впервые проведен поиск генов-мишеней метил-ДНК-связывающего белка Каизо, а также исследовано влияние нокаута данного фактора на экспрессию этих генов. Поскольку делеция Каизо не приводит ни к явно выраженным поведенческим отклонениям, ни к каким-либо нарушениям в развитии животных, а единственным детектированным на данный момент отличием Каизо-нокаутных мышей от животных дикого типа является их лучшая выживаемость и более низкая частота возникновения рака в АРС-модели канцерогенеза [Prokhortchouk et al., 2006], также были исследованы изменения таких эпигенетических модификаций, как метилирование ДНК и гистонового кода, в областях взаимодействия Каизо.

Показано, что Каизо взаимодействует с широким спектром последовательностей-мишеней как in vitro, так и in vivo: промотором гена Xist, ЦфГ-островком гена р16 и 5'-LTR мобильного элемента IAP. Полученные данные позаоляют предположить, что исследуемый белок принимает участие в таких процессах как геномный импринтинг, X-инактивация, репрессия транскрипции генов-супрессоров опухолеобразования.

Делеция кодирующего Каизо гена не приводит к изменению уровня экспрессии большинства генов, транскрипция которых контролируется исследованными регуляторными элементами - кроме гена Tctexl, кодирующего легкую цепь динеинового комплекса. Показано, что при нокауте Каизо уровень экспрессии данного гена увеличивался в 3-5 раз по сравнению с экспрессией в органах животных дикого типа. Экперименты по изучению метилирования ДНК в районе ЦфГ-островка Tctexl показали, что отсутствие Каизо не влияет на уровень метилирования цитозина в данной области. Вероятно, одной делеции метил-ДНК-связывающего белка недостаточно для изменения метилирования в регуляторной области.

Вместе с тем, отсутствие Каизо приводит к изменению гистонов ого кода в районе HI9 DMR: в хроматине животных с делецией гена, кодирующего Каизо, исчезает убиквитинирование гистона Н2А на отцовском аллеле HI9 DMR. Возможно, одна из функций Каизо заключается в привлечении убиквитинирования гистона Н2А к метилированным последовательностям ДНК, что, в свою очередь, влияет на транскрипцию генов-мишеней. Хотя на текущий момент взаимодействие Каизо с убиквитин-лигазами не продемонстрировано, представленные результаты могут стать первым шагом в исследованиях данного направления.

Кроме того, белок, кодируемый геном Tctexl, играет важную роль в процессах роста аксона и формирования дендритов у созревающих нейронов [Chuang et al., 2005]. Можно предположить, что нарушение функций Каизо может быть связано с различными психическими расстройствами и нейродегенеративными заболеваниями. Продолжение работы в этом направлении может пролить свет на механизм возникновения подобных заболеваний и указать возможные пути их лечения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Саложин, Сергей Владимирович, Москва

1. Albagli О., Dhordain P., Bernardin F., Quief S., Kerkaert J.P., Leprince D. Multiple domains participate in distance-independent LAZ3/BCL6-mediated transcriptional repression// Biochem.Biophys.Res.Commun.-1996.-Vol.220.-P.911-915

2. Antequera F., Bird A. Number of CpG islands and genes in human and mouse// Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A-1993.-Vol. 90.-P.11995-11999

3. Arnaud P., Goubely C., Lissier T.P., Deragon J-M. SINE retroposons can be used in vivo as nucleation centers for de novo methylation// Mol.Cell.Biol.-2000.-P.3434-3441

4. Bannister A.J., Schneider R., Myers F.A., Thome A.W., Crane-Robinson C., Kouzarides T. Spatial distribution of di- and tri-methyl lysine 36 of histone H3 at active genes// J.Biol.Chem.-2005.-Vol.280.-P. 17732-17736

5. Bardwell V.J., Treisman R. The POZ domain: a conserved protein-protein interaction motif / Genes Dev.-1994.-Vol.8(14).-P. 1664-1677

6. Bartolomei M.S., Webber A.L., Brunkow M.E., Tilghman S.M. Epigenetic mechanisms underlying the imprinting of the mouse HI9 gene// Genes Dev.-1993 .-Vol.7.-P.l 663-1673

7. Bartolomei M.S., Zemel S., Tilghman S.M. Parental imprinting of the mouse H19 gene// Nature.-l 991 .-Vol.351 .-P. 153-155

8. Baylin S.B., Hoppener J.W., de Bustros A., Steenbergh P.H., Lips C.J., NelkinB.D. DNA methylation patterns of the calcitonin gene in human lung cancers and lymphomas// Cancer Res.-1986.-Vol.46.-P. 2917-2922

9. Bell A.C., Felsenfeld G. Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Ig£2 gene// Nature.-2000-Vol.405.-P.482-485

10. Brown C.J., Jafrenier R.G., Powers V.E., Sebastio G., Ballabio A., Pettigrew A.L., Ledbetter D.H., Levy E., Craig I.W., Willard H.F. Localization of the X inactivation center on the human X chromosome in Xql3// Nature—1991.-Vol.349.-P.82-84

11. Buiting K., Gross S., Lich C., Gillessen-Kaesbach G., El-Maarri O., Horsthemke B. Epi-mutations in Prader-Willi and Angelman syndromes: a molecular study of 136 patients with an imprinting defect// Am.J.Hum.Genet.-2003.-Vol.72.—P.571-577

12. Cameron E.E., Bachman K.E., Myohanen S., Herman J.G., Baylin S.B. Synergy of demethylation and histone deacetylase inhibition in the re-expression of genes silenced ih cancer//Nat.Genet.-1999.-Vol.21.-P. 103-107

13. Caspary Т., Cleary M.A., Baker C.C., Guan X-J., Tilghman S.M. Multiple mechanisms regulate imprinting of the mouse distal chromosome 7 gene cluster// Mol.Cell.Biol—1998-Vol. 18.-P.3466-3474

14. Chao W., Huynh K.D., Spencer R.J., Davidow L.S., Lee J.T. CTCF, a candidate trans-acting factor for X-inactivation choice// Science-2002.-Vol.295.-P.345-347

15. Chen W., Zollman S., Couderc J.L., Laski F.A. The BTB domain of brie a brae mediates dimerization in vitro//Mol.Cell.Biol.-1995.-Vol.l5.-P.3424-3429

16. Chen W.G., Chang Q., Lin Y., Meissner A., West A.E., Griffith E.C., Jaenisch R., Greenberg M.E. Derepression of BDNF transcription involves calcium-dependent phosphorylation of MeCP2// Science.-2003.-Vol.302.-P.885-889

17. Chuang J., Yeh Т., Bollati F., Conde C., Canavosio F., Caceres A., Sung C. The dynein light chain Tctex-1 has a dynein-independent role in actin remodeling during neurite outgrowth developmental// Cell.- 2005.-Vol.9.-P.75-86

18. Clark S.J., Harrison J., Molloy P.L. Spl binding is inhibited by (m)Cp(m)CpG methylation// Gene-1997.-Vol. 195 .-P.67-71

19. Cohen D.E., Lee J.T. X-chromosome inactivation and the search for chromosome-wide silencers// Curr.Opin.Genet.Dev.-2002.-Vol. 12.-P.219-224

20. Collins Т., Stone J.R., Williams A.J. All in the family: the BTB/POZ, KRAB, and SCAN domains// Mol.Cell.Biol.-2001.-Vol.21(11).-P.3609-3615

21. Costanzi C., Pehrson J.R. Histone MacroH2Al is concentrated in the inactive X chromosome of female mammals//Nature.-1998.-Vol.393.-P.599-601

22. Cremer Т., Cremer C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells// Nat.Rev.Genet.-2001.-Vol.2.-P.292-301

23. Cross S., Meehan R., Nan X., Bird A. A component of the transcriptional repressor MeCPl shares a motif with DNA methylatransferase and HRX proteins// Nat.Genet.-1997.-Vol.l3.-P.256-259

24. Davis M.A., Ireton R.C., Reynolds A.B. A core function for pl20-catenin in cadherin turnover// J.Cell.Biol.-2003.-Vol.l63.-P.525-534

25. Davis T.L., Trasler J.M., Moss S.B. Yang G.J., Bartolomei M.S. Acquisition of the H19 methylation imprints occurs differentially on the parental alleles during spermatogenesis// Genomics.-1999.-Vol.58.-P. 18-28

26. Davis T.L., Yang G.J., McCarrey J.R., Bartolomei M.S. The H19 methylation imprint is erased and re-established differentially on the parental alleles during male germ cell development// Hum.Mol.Genet.-2000.-Vol.9(19).-P.2885-2894

27. DeChiara T.M., Robertson E.J., Efstratiadis A. Parental imprinting of the mouse insulin-like growth factor П gene// Cell.-1991.-Vol.64.-P.849-859

28. Drewell R.A., Goddard С J., Thomas J.O., Surani M.A. Methylation-dependent silencing at the HI9 imprinting control region by MeCP2// Nucleic Acids Res.-2002.-Vol.30.-P.l 139-1144

29. Duncan B.K., Miller J.H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA// Nature—1980—Vol.287.-P.560-561

30. Ehrlich M., Gama-Sosa M.A., Huang L.H., Midgett R.M., Kuo K.C., McCune R.A., Gehrke C. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells// Nucleic Acids Res.-1982.-Vol. 10.-P.2709-2721

31. J.Natl.Cancer Inst.-2002.-Vol.94.-P.26-32

32. Fang J., Chen Т., Chadwick В., Li E., Zhang Y. Ring lb-mediated H2A ubiquitination associates with inactive X chromosomes and is involved in Initiation of X-inactivation// J.Biol.Chem.-2004.-Vol.279(51 ).-P.52812-52815

33. Feinberg A.P., Vogelstein B. Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts//Nature.-l 983.-Vol.301.-P.89-92

34. Feinberg A.P., Gehrke C.W., Kuo K.C., Ehrlich M. Reduced genomic 5-methylcytosine content in human colonic neoplasia// Cancer Res.-1988.-Vol.48.-P.l159-1161

35. Feng Q., Zhang Y. The MeCPl complex represses transcription through preferential binding, remodeling, and deacetylating methylated nucleosomes// Genes Dev.-2001 .-Vol. 15.-P.827-832

36. Fernandez-Capetillo О.Д Allis D.C., Nussenzweig A. Phosphorylation of histone H2B at DNA double-strand breaks// J.Experim.Med.-2004.-Vol.l99(12).-P.1671-1677

37. Filion G., Zhenilo S., Salozhin S., Yamada D., Prokhortchouk E., Defossez P-A. A family of human zinc finger proteins that bind methylated DNA and repress transcription// Mol. Cell Biol.-2006.-Vol.26.-P. 169-181

38. Fitzpatrick G.V., Soloway P.D., Higgins M.J. Regional loss of imprinting and growth deficiency in mice with a targeted deletion of KvDMRl// Nat.Genet-2002.-Vol.32.-P.426-431

39. Fournier C., Goto Y., Ballestar E., Delaval K., Hever A.M., Esteller M., Feil R. Allele-specific histone lysine methylation marks regulatory regions at imprinted mouse genes// EMBO J.-2002.-Vol.21(23).-P.6560-6570

40. Friesen W.J., Darby M.K. Specific RNA binding by a single C2H2 zinc finger//

41. J.Biol.Chem.-2001.-Vol.276(3).-P.l 968-1973

42. Fujita N., Watanabe S., Ichimura Т., Ohkuma Y., Chiba Т., Saya H., Nakao M. MCAF mediates MBD1 -dependent transcriptional repression// Mol.Cell.Biol.-2003a.-Vol.23.-P.2834-2843

43. Fuks F., Hurd P.J., Wolf D., Nan X., Bird A.P., Kouzarides T. The methyl-CpG-binding protein MeCP2 links DNA methylation to histone methylation// J.Biol.Chem.-2003.-Vol.278.-P.4035-4040

44. Garcia-Cao M., O'Sullivan R., Peters A.H., Jenuwein Т., Blasco M.A. Epigenetic regulation of telomere length in mammalian cells by the Suv39hl and Suv39h2 histone methyltransferases//Nat Genet.-2004.-Vol.36.-P.94-99

45. Gautam, M., Noakes P.G., Mudd J., Nichol M., Chu G.C., Sanes J.R., MerlieJ.P. Failure of postsynaptic specialization to develop at neu-romuscular junctions of rapsyn-deficient mice// Nature.- 1995.-Vol.377.-P.232-236

46. Goldknopf I.L., Taylor C.W., Baum R.M., Yeoman L.C., Olson M.O., Prestayko A.W., Busch H. Isolation and characterization of protein A24, a "histone-like" non-histone chromosomal protein// J.Biol.Chem.-1975.-Vol.250.-P.7182-7187

47. Grandjean V., O'Neill L., Sado Т., Turner В., Ferguson-Smith A. Relationship between DNA methylation, histone H4 acetylation and gene expression in the mouse imprinted Igf2-H19 domain//FEBS Lett.-2001.-Vol.488.-P.165-169

48. Gribnau J., Hochedlinger K., Hata K., Li E., Jaenisch R. Asynchronous replication timing of imprinted loci is independent of DNA methylation, butconsistent with differential subnuclear localization// Genes Dev.-2003.-Vol. 17.-P.759-773

49. Gritsko T.M., Coppola D., Paciga J.E., Yang L., Sun M., Shelley S.A., FioricaJ.V., Nicosia S.V., Cheng J.Q. Activation and overexpression of centrosome kinase BTAK/Aurora-A in human ovarian cancer// Clin.Cancer Res.-2003 .-Vol.9.-P. 1420-1426

50. Hashida S.N., Kitamura K., Mikami Т., Kishima Y. Temperature shift coordinately changes the activity and the methylation state of transposon Tam3 in Antirrhinum majus// Plant.Physiol.-2003.-Vol.l32.-P.1207-1216

51. Hata К., Okano M., Lei H., Li E. Dnmt3L cooperates with the Dnmt3 family of de novo DNA methyltransferases to establish maternal imprints in mice// Development.-2002.-Vol.129.-P. 1983-1993

52. Не H., Lehming N. Global effects of histone modifications// Brief Funct. Genomic Proteomic.-2003.-Vol.2(3).-P.234-243

53. Heard E., Rougeulle C., Arnaud D., Avner P., Allis C.D., Spector D.L. Methylation of histone H3 at Lys-9 is an early mark on the X chromosome during X inactivation// Cell.-2001.-Vol.l07.-P.727-738

54. Hendrich В., Bird A. Identification and characterization of a family of mammalian methyl-CpG binding proteins// Mol.Cell.Biol.-1998.-Vol.18.-P.6538-6547

55. Hendrich В., Abbott C., McQueen H., Chambers D., Cross S., Bird A. Genomic structure and chromosomal mapping of the murine and human Mbdl, Mbd2, Mbd3, and Mbd4 genes//Mamm.Genome-1999a.-Vol.l0.-P.906-912

56. Hendrich В., Guy J., Ramsahoye В., Wilson V.A., Bird A. Closely related proteins MBD2 and MBD3 play distinctive but interacting roles in mouse development// Genes Dev.-2001.-Vol.l5.-P.710-723

57. Hendrich В., Hardeland U., Ng H.H., Jiricny J., Bird A. The thymine glycosylase MBD4 can bind to the product of deamination at methylated CpG sites// Nature.-1999b.-Vol.401 .-P.3 01 -3 04

58. Hernandez L., Kozlov S., Piras G., Stewart C.L. Paternal and maternal genomes confer opposite effects on proliferation, cell-cycle length, senescence, and tumor formation// Proc Natl Acad Sci U S A.-2003.-Vol.100(23).-P. 1334413349.

59. Horike S., Cai S., Miyano M., Cheng J.F., Kohwi-Shigematsu T. Loss of silent-chromatin looping and impaired imprinting of DLX5 in Rett syndrome// Nat. Genet.-2004.—Vol.37.-P.31-40

60. Howell C.Y., Bestor Т.Н., Ding F., Latham K.E., Mertineit C., Trasler J.M., Chaillet J.R. Genomic imprinting disrupted by a maternal effect mutation in the Dnmtl gene// Cell.-2001.-Vol.104.-P. 829-838

61. Hu J., Pham J., Dey I., Li Т., Vu Т.Н., Hoffman A.R. Allele-specific histone acetylation accompanies genomic imprinting of the insulin-like growth factor II receptor gene// Endocrinology.-2000.-Vol. 14 l(12).-P.4428-4435

62. Hu J.F., Oruganti H., Vu Т.Н., Hoffman A.R. Tissue-specific imprinting of the mouse insulin-like growth factor II receptor gene correlates with differential allele-specific DNA methylation//Mol.Endocrinol.-1998.-Vol.l2.-P.220-232

63. Hung M.S., Karthikeyan N., Huang В., Koo H.C., Kiger J., Shen C.J. Drosophila proteins related to vertebrate DNA (5-cytosine) methyltransferases// Proc.Natl. Acad.Sci.U.S. A.-1999.-Vol.96.-P. 11940-11945

64. Hutchins A.S., Mullen A.C., Lee H.W., Sykes K.J., High F.A., Hendrich B.D., Bird A.P., Reiner S.L. Gene silencing quantitatively controls the function of a developmental trans-activator// Mol.Cell.-2002.-Vol.l0.-P.81-91

65. Huynh K.D., Bard well V.J. The BCL-6 POZ domain and other POZ domains interact with the co-repressors N-CoR and SMRT// Oncogene.-1998.-Vol. 17.-P.2473-2484

66. Isalan M., Klug A., Choo Y. Comprehensive DNA recognition through concerted interactions from adjacent zinc fingers// Biochemistry.-1998.1. Vol.37(35).-P.12026-12033

67. Isalan M., Choo Y. Engineered zinc finger proteins that respond to DNA modification by Haelll and Hhal methyltransferase enzymes//J. Mol. Biol.-2000.-Vol.295.-P.471-477.

68. Jacobs S.A., Taverna S.D., Zhang Y., Briggs S.D., Li J., Eissenberg J.C., Allis C.D., Khorasanizadeh S. Specificity of the HP1 chromo domain for the methylated N-terminus of histone H3// EMBO J.-2001.-Vol.20(18).-P.5232-5241

69. Jasencakova S., Soppe W.J.J., Meister A., Gernand D., Turner B.M., Schubert I. Histone modifications in Arabidopsis high methylation of H3 lysine 9 is dispensable for constitutive heterochromatin// Plant J.-2003.-Vol.33.-P.471-480

70. Johnston M.V., Mullaney В., Blue M.E. Neurobiology of Rett syndrome// J.Child Neurol.-2003.-Vol.l8.-P.688-692

71. Jones B.K., levorse J., Tilghman S.M. Deletion of a nuclease-secsitive region between the Ig£2 and HI9 genes leads to Igf2 misregulation and increased adiposity// Hum.Mol.Genetics.-2001 .-Vol. 10(8).-P.807-814

72. Jones B.K., Levorse J.M., Tilghman S.M. Igf2 imprinting does not require its own DNA methylation or H19 RNA// Genes Dev.-1998.-Vol.l2(14).-P.2200-2207

73. Jorgensen H.F., Ben Porath I., Bird A.P. Mbdl is recruited to both methylated and nonmethylated CpGs via distinct DNA binding domains// Mol.Cell.Biol.-2004,-Vol.24.-P.3387-3395

74. Kaffer C.R., Srivastava M., Park K.Y., Ives E., Hsieh S., Batlle J., Grinberg A., Huang S.P., Pfeifer K. A transcriptional insulator at the imprinted H19/Igf2 locus// Genes Dev.-2000.-Vol. 14.-P.1908-1919

75. Kafri Т., Ariel M., Brandeis M., Shemer R., Urven L., McCarrey J., Cedar H., Razin A. Developmental pattern of gene-specific DNA methylation in the mouse embryo and germ line// Genes Dev.-1992.-Vol.6.-P.705-714

76. Katsani K.R., Hajibagheri M.A., Verrijzer C.P. Co-operative DNA binding by GAGA transcription factor requires the conserved BTB/POZ domain and reorganizes promoter topology// EMBO J.-1999.-Vol.l8.-P.698-708

77. Ke X., Collins A. CpG islands in human X-inactivation// Ann.Hum.Genet.-2003 .-Vol.67.-P.242-249

78. Khosla S., Aitchison A., Gregory R., Allen N.D., Feil R. Parental allele-specific chromatin configuration in a boundaiy-imprinting-control element upstream of the mouse H19 gene//Mol.Cell.Biol.-1999.-Vol.l9(4).-P.2556-2566

79. Kim S.W., Park J.I., Spring C.M., Sater A.K., Ji H., Otchere A.A., Daniel J.M., McCrea P.D. Non-canonical Wnt signals are modulated by the Kaiso transcriptional repressor and pl20-catenin// Nat. Cell Biol.-2004.-Vol.6(12).-P.1212-1220.

80. Klose R.J., Bird A.P. MeCP2 behaves as an elongated monomer that does not stably associate with the Sin3a chromatin remodelling complex// J.Biol.Chem.-2004.- Vol.279.-P.46490-46496

81. Kondo Y., Shen L., Yan P.S., Huang Т.Н., Issa J.P. Chromatin immunoprecipitation microarrays for identification of genes silenced by histone H3 lysine 9 methylation// Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.-2004.-Vol.l01 .-P.7398-7403

82. Laird C.D., Pleasant N.D., Clark A.D., Sneeden J.L., Hassan K.M.A., Manley N.C., Vary J.C., Morgan Т., Hansen R.S., Stoger R. Hairpin-bisulfite PCR:

83. Assessing epigenetic methylation patterns on complementary strands of individual DNA molecules // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.-2004.-Vol.l01.-P.204-209

84. Lee J.T., Davidow L.S., Warshawsky D. Tsix, a gene antisense to Xist at the X-inactivation center// Nat.Genet -1999a.-Vol.21 -P.400-404

85. Lee J.T., Lu N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation// CeIl.-1999.-Vol.99.-P.47-57

86. Leighton P.A., Ingram R.S., Eggenschwiler J., Efstratiadis A., Tilghman S.M. Disruption of imprinting caused by deletion of the HI 9 gene region in mice// Nature.-1995a.-Vol.375.-P.34-39

87. Leighton P.A., Saam J.R., Ingram R.S., Stewart C.L., Tilghman S.M. An enhancer deletion affects both HI 9 and Ig£2 expression// Genes Dev.-1995b.-Vol.9(17).-P.2079-2089

88. Lewis J.D., Meehan R.R., Henzel W.J., Maurer-Fogy I., Jeppesen P., Klein F., Bird A. Purification, sequence, and cellular localization of a novel chromosomal protein that binds to methylated DNA// Cell.-1992.-Vol.69.-P.905-914

89. Li X., Lopez-Guisa J.M., Ninan N., Weiner E.J., Rauscher F.J., III, Marmorstein R. Overexpression, purification, characterization, and crystallization of the BTB/POZ domain from the PLZF oncoprotein// J.Biol.Chem.-1997.-Vol.272.-P.27324-27329

90. Lindroth A.M., Shultis D., Jasencakova Z., Fuchs J., Johnson L., Schubert D., Patnaik D., Pradhan S., Goodrich J., Schubert I., Jenuwein Т., Khorasanizadeh S.,

91. Jacobsen S.E. Dual histone H3 methylation marks at lysines 9 and 27 required for interaction with chromomethylase3// EMBO J.-2004.-Vol.23.-P.4286-4296

92. Macleod D., Clark V.H., Bird A. Absence of genome-wide changes in DNA methylation during development of the zebrafish// Nat.Genet.-1999.-Vol.23.-P.139-140

93. Magdinier F., Wolffe A.P. Selective association of the methyl-CpG binding protein MBD2 with the silent pl4/pl6 locus in human neoplasia// Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.-2001.-Vol.98.-P.4990-4995

94. Maher E.R., Reik W. Вeckwith-Wiedemann syndrome: imprinting in clusters revisited// J.Clin.Invest.-2000.-Vol.l 05.-P.247-252

95. Mann J.R. Imprinting in the germ line// Stem Cells.-2001.-Vol.19(4).-P.287-94

96. Martinowich K., Hattori D.} Wu H., Fouse S., He F., Hu Y., Fan G., Sun Y.E. DNA methylation-related chromatin remodeling in activity-dependent BDNF gene regulation//Science.-2003.-Vol.302.-P.890-893

97. Mathieu O., Probst A.V., Paszkowski J. Distinct regulation of histone H3 methylation at lysines 27 and 9 by CpG methylation in Arabidopsis// EMBO J.-2005.-Vol.24.-P.2783-2791

98. Meehan R.R., Lewis J.D., McKay S., Kleiner E.L., Bird A.P. Identification of a mammalian protein that binds specifically to DNA containing methylated CpGs// Cell.-1989.-Vol.58.-P.499-507

99. Millar C.B., Guy J., Sansom O.J., Selfridge J., MacDougall E., Hendrich В., Keightley P.D., Bishop S.M., Clarke A.R., Bird A. Enhanced CpG mutability and tumorigenesis in MBD4-deficient mice// Science.-2002.-Vol.297.-P.403-405

100. Min J.R., Zhang, Y.} Xu, R.M. Structural basis for specific binding of polycomb chromodomain to histone H3 methylated at Lys 27// Genes Dev.-2003.-Vol. 17.-P. 1823—1828

101. Molyneaux K., Wylie C. Primordial germ cell migration// Int.J.Dev.Biol.-2004.-Vol.48.-P.537-544

102. Muller C., Readhead C.} Diederichs S., Idos G.} Yang R.} Tidow N.} Serve H.,

103. Berdel W.E., Koeffler H.P. Methylation of the cyclin Al promoter correlates with gene silencing in somatic cell lines, while tissue-specific expression of cyclin Al is methylation independent// Mol.Cell.Biol.-2000.-Vol.20.-P.3316-3329

104. Murrell A., Heeson S., Bowden L., Constancia M., Dean W., Kelsey G., Reik W. An intragenic methylated region in the imprinted Igf2 gene augments transcription// EMBO Rep.-2001.-Vol.2.-P.l 101-1106

105. Murrell A., Heeson S., Reik W. Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and HI9 into parent-specific chromatin loops// Nat.Genet.-2004.-Vol.36(8).-P.889-893

106. Murzina N., Verreault A., Laue E., Stillman B. Heterochromatin dynamics in mouse cells: interaction between chromatin assembly factor I and and HP1 proteins// Cell.—1999.-Vol.4.-P.529-540

107. Mutskov V., Felsenfeld G, Silencing of transgene transcription precedes methylation of promoter DNA and histone H3 lysine 9// EMBO J.-2004.-Vol.23(l).-P. 138-149

108. Nan X., Bird A. The biological functions of the methyl-CpG-binding protein MeCP2 and its implication in Rett syndrome// Brain Dev.-2001.-Vol.23(l).-P.S32-S37

109. Nan X., Campoy F.J., Bird A. MeCP2 is a transcriptional repressor with abundant binding sites in genomic chromatin// Cell.-1997.-Vol.88.-P.471-481

110. Nan X., Meehan R.R., Bird A. Dissection of the methyl-CpG binding domain from the chromosomal protein MeCP2// Nucleic Acids Res.-1993.-Vol.21.— P.4886-4892

111. Nan X., Ng H-H., Johnson C.A., Laherty C.D., Turner B.M., Eisenman R.N., Bird A. Transcriptional repression by the methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a histone deacetylases complex// Nature.-1998.-Vol.393.-P.386-389

112. Ng H.H., Jeppesen P., Bird A. Active repression of methylated genes by the chromosomal protein MBD1// Mol.Cell Biol.-2000.-Vol.20.-P.1394-1406

113. Ng H.H., Zhang Y., Hendrich В., Johnson C.A., Turner B.M., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Reinberg D., Bird A. MBD2 is a transcriptional repressorbelonging to the MeCPl histone deacetylase complex// Nat.Genet.-1999.-Vol.23.-P.58-61

114. Nicholls R.D., Knepper J.L. Genome organization, function, and imprinting in Prader-Willi and Angelman syndromes// Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.-2001.-Vol.2.-P.153-175

115. Nickel B.E., Davie J.R. Structure of polyubiquitinated histone H2A// Biochemistry.-1989.-Vol.28.-P.964-968

116. Nixon G.M., Brouillette R.T. Sleep and breathing in Prader-Willi syndrome// Pediatr.Pulmonol.-2002.-Vol.34(3).-P.209-217

117. Nolte R.T., Conlin R.M., Harrison S.C., Brown R.S. Differing roles for zinc fingers in DNA recognition: structure of a six-finger transcription factor IIIA complex//Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-1998.-Vol.95(6).-P .2938-2943

118. Peters A., Mermoud J.E., O'Carroll D., Pagani M., Schweizer D., BrockdorffN., Jenuwein T. Histone H3 lysine 9 methylation is an epigenetic imprint of facultative heterochromatin// Nat.Genet.-2002.-Vol.30(l).-P.77-80

119. Peters J., Beechey C. Identification and characterisation of imprinted genes inthe mouse// Brief Funct. Genomic. Proteomic.-2004.-Vol.2(4).-P.320-333

120. Pintard L., Willis J.H., Willems A., Johnson J.L., Srayko M., Kurz Т., Glaser S., Mains P.E., Tyers M., Bowerman В., Peter M. The BTB protein MEL-26 is a substrate-specific adaptor of the CUL-3 ubiquitin-ligase// Nature.-2003.-Vol.425(6955).-P.311-316

121. Plath K., Fang J., Mlynarczyk-Evans S.K., Cao R., Worringer K.A., Wang H., de la Cruz C.C., Otte A.P., Panning В., Zhang Y. Role of histone H3 lysine 27methylation in X inactivation// Science.-2003.-Vol.300.-P. 131-135

122. Plath K., Mlynarczyk-Evans S., Nusinow D.A., Panning B. Xist RNA and the mechanism of X chromosome inactivation// Annu. Rev. Genet.-2002.-Vol.36.-P.233-78.

123. Pradhan S., Bacolla A., Wells R.D., Roberts R.J. Recombinant human DNA (cytosine-5) methyltransferase. I. Expression, purification, and comparison of de novo and maintenance methylation//J.Biol.Chem.-1999.-Vol.274.-P.33002-33010

124. Prokhortchouk A., Hendrich В., Jorgensen H., Ruzov A., Wilm M., Georgiev G., Bird A., Prokhortchouk E. The pl20 catenin partner Kaiso is a DNA

125. Ф methylation-dependent transcriptional repressor// Genes Dev.-2001.-Vol. 15.1. P.l 613-1618

126. Reik W., Santos F., Dean W. Mammalian epigenomics: reprogramming the genome for development and therapy// Theriogenology.-2003.-Vol.59.-P.21-32

127. Rhee I., Jair K.W., Yen R.W., Lengauer C., Herman J.G., Kinzler K.W., Vogelstein В., Baylin S.B., Schuebel K.E. CpG methylation is maintained in human cancer cells lacking DNMTl//Nature.-2000.-Vol.404(6781).-P.1003-1007

128. Rice J.C., Briggs S.D., Ueberheide В., Barber C.M., Shabanowitz J., HuntD.F., Shinkai Y., Allis C.D. Histone methyltransferases direct different degrees of methylation to define distinct chromatin domains// Mol.Cell.-2003.-Vol.l2(6).-P. 1591-1598

129. Robzyk K., Recht J., Osley M.A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast// Science.-2000.-Vol.287.-P.501-504

130. Roder K., Hung M.S., Lee T.L., Lin T.Y., Xiao H., Isobe K.I., Juang J.L., Shen C.J. Transcriptional repression by Drosophila methyl-CpG-binding proteins// Mol.Cell.Biol.-2000.-Vol.20.-P.7401-7409

131. Rodova M., Kelly K.F., VanSaun M., Daniel J.M., Werle M.J. Regulation of the rapsyn promoter by kaiso and delta-cateninII Mol.Cell.Biol.-2004.-Vol.24.-P.7188-7196

132. Rozenblum E., Schutte M., Goggins M., Hahn S.A., Panzer S., Zahurak M., Goodman S.N., Sohn T.A., Hruban R.H., Yeo C.J., Kern S.E. Tumor-suppressive pathways in pancreatic carcinoma// Cancer Res.-1997.-Vol.57.-P.1731-1734

133. Ruas M., Peters G. The pl6INK4a/CDKN2A tumor suppressor and its relatives//Biochim.Biophys.Acta.-1998.-Vol.l378(2).-P.Fl 15-177

134. Ruzov A., Dunican D.S., Prokhortchouk A., Pennings S., Stancheva I., Prokhortchouk E., Meehan R.R. Kaiso is a genome-wide repressor of transcription that is essential for amphibian development// Development.-2004.-Vol. 131(24).-P.6185-6194

135. Santos F., Hendrich В., Reik W., Dean W. Dynamic reprogramming of DNA methylation in the early mouse embryo// Dev.Biol.-2002.-Vol.241.-P.l72-182

136. Santos-Rosa H., Schneider R, Bannister A.J., Sherriff J., Bernstein B.E., Ф EmreN.C., Schreiber S.L., Mellor J., Kouzarides T. Active genes are trimethylated at K4 of histone H3// Nature.-2002.-Vol.419.-P.407-411

137. Sarraf S.A., Stancheva I. Methyl-CpG binding protein MBD1 couples histone H3 methylation at lysine 9 by SETDB1 to DNA replication and chromatin assembly// Mol.Cell.-2004.-Vol. 15.-P.595-605

138. Schneider R., Bannister A.J., Myers F.A., Thorne A.W., Crane-Robinson C., Kouzarides T. Histone H3 lysine 4 methylation patterns in higher eukaryotic genes//Nat. Cell Biol.-2004.-Vol.6(l).-P.73-77

139. Schoenherr С J., Levorse J.M., Tilghman S.M. CTCF maintains differential # methylation at the Ig£2/H19 locus// Nat.Genet.-2003.-Vol.33.-P.66-69

140. Selker E.U. Epigenetic phenomena in filamentous fungi: useful paradigms or repeat-induced confusion?//Trends Genet.-1997.-Vol.l3.-P.296-301

141. Shemer R., Hershko A.Y., Perk J., Mostoslavsky R., Tsuberi В., Cedar H., Buiting K., Razin A. The imprinting box of the Prader-Willi/Angelman syndromeф domain// Nat.Genet.-2000.-Vol.26(4).-P.440-443

142. Shemer R., Birger Y., Riggs A.D., Razin A. Structure of the imprinted mouse Snrpn gene and establishment of its parental-specific methylation pattern// Proc.Natl. Acad. Sci.US A.-1997.-Vol.94.-P. 10267-10272

143. Sherr C.J. Cancer cell cycles// Science.- 1996.-Vol.274.-P. 1672-1677

144. Siavash K.K., Tavazoie S., Grunstein M. Mapping global histone acetylation patterns// Cell.-2004.-Vol.l 17.-P.721-733

145. Simmen M.W., Leitgeb S., Charlton J., Jones S.J., Harris B.R., Clark V.H., Bird A. Nonmethylated transposable elements and methylated genes in a chordate genome// Science.-1999.-Vol.283.-P. 1164-1167

146. Sleutels F., Zwart R., Barlow D.P. The non-coding Air RNA is required for silencing autosomal imprinted genes//Nature.-2002.-Vol.415.-P.810-813

147. Srivastava M., Hsieh S., Grinberg A., Williams-Simons L., Huang S.P., Pfeifer K. HI9 and Igf2 monoallelic expression is regulated in two distinct ways by a shared cis acting regulatory region upstream of HI9// Genes Dev.-2000.-Vol.l4(10).-P.l 186-1195

148. Stancheva I., Meehan R.R. Transient depletion of xDnmtl leads to premature gene activation in Xenopus embryos// Genes Dev.-2000.-Vol.l4.-P.313-327

149. Stancheva I., El Maarri O., Walter J., Niveleau A., Meehan R.R. DNA methylation at promoter regions regulates the timing of gene activation in Xenopus laevis embryos// Dev.Biol.-2002.-Vol.243.-P. 155-165

150. Stebbins C.E., Kaelin W.G., Pavletich N.P. Structure of the VHL-ElonginC-ElonginB complex: implications for VHL tumor suppressor function// Science.-1999.-Vol.284(5413).-P.455-461

151. Stoger R., Kibicka P., Liu C.G., Kafri Т., Razin A., Cedar H., Barlow D. Maternal-specific methylation of the imprinted mouse Igf2r locus identities the expressed allele as carrying the imprinting signal// Cell.-1993.-Vol.73.-P.61-71

152. Strahl B.D., Ohba R., Cook R.G., Allis C.D. Methylation of histone H3 at lysine 4 is highly conserved and correlates with transcriptionally active nuclei in Tetrahymena//Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-1999.-Vol.96.-P.14967-14972

153. Stuhmer Т., Anderson S.A., Ekker M., Rubenstein J.L. Ectopic expression of DLX genes induces glutamic acid decarboxilase and Dlx expression// D evelopment.-2002-Vol. 129 .-P.245-252

154. Tai A.W., Chuang J.-Z., Sung C.-H. Localization of Tctex-1, a cytoplasmicdynein light chain, to the Golgi apparatus and evidence for dynein complex heterogeneity// J.Biol.Chem.-1998.-Vol.273.-P.19639-19649

155. Takagi N. Imprinted X-chromosome inactivation: enlightenment from 9 embryos in vivo// Semin.Cell Dev.Biol.-2003.-Vol.l4.-P.319-329

156. Tamaru H., Zhang X., McMillen D., Singh P.B., Nakayama J., Grewal S.I., Allis C.D., Cheng X., Selker E.U. Trimethylated lysine 9 of histone H3 is a mark for DNA methylation in Neurospora crassa//Nat.Genet.-2003.-Vol.34.-P.75-79

157. Tani M., Ito J., Nishioka M., Kohno Т., Tachibana K., Shiraishi M., Takenoshita S., Yokota J. Correlation between histone acetylation and expression of the MY018B gene in human lung cancer cells// Genes Chromosomes.Cancer.-2004.-Vol.40.-P. 146-151

158. Thorne A.W., Sautier P., Briand G., Crane-Robinson C. The structure of 0 ubiquitinated histone H2B// EMBO J.-1987.-Vol.6.-P. 1005-1010

159. Thorvaldsen J.L., Duran K.L., Bartolomei M.S. Deletion of the HI9 differentially methylated domain results in loss of imprinted expression of H19 and Igf2// Genes Dev.-1998.-Vol.l2.-P.3693-3702

160. Tremblay K.D., Duran K.L., Bartolomei M.S. A 50 2-kilobase-pair region of the imprinted mouse HI9 gene exhibits exclusive paternal methylation throughout development//Mol.Cell.Biol.-1997.-Vol.17.-P .4322-4329

161. Verona R.I., Mann M.R.W., Bartolomei M.S. Genomic imprinting: intricacies of epigenetic regulation in clusters// Annu.Rev.Cell Dev.Biol.-2003.-Vol.19-P.237-259

162. Vostrov A.A., Quitschke W.W. The zinc finger protein CTCF binds to the APBbeta domain of the amyloid beta-protein precursor promoter. Evidence for arole in transcriptional activation// J.Biol.Chem.-1997.-Vol.272(52).-P.3335333359

163. Walsh C.P., Chaillet J.R., Bestor Т.Н. Transcription of IAP endogenous retroviruses is constrained by cytosine methylation// Nat.Genet.-1998.-Vol.20.-P.l 16-117

164. Wang H., Wang L., Erdjument-Bromage H., Vidal M., Tempst P., Jones R.S., Zhang Y. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing// Nature.-2004.-Vol.431 .-P.873-878

165. West M.H., Bonner W.M. Histone H2B can be modified by the attachment of ubiquitin//Nucleic Acids Res.-1980.-Vol.8.-P.4671-4680

166. Wilkinson K.D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome// Semin.Cell Dev.Biol.-2000.-Vol.l 1.-P.141-148

167. Wutz A., Smrzka O.W., Schweifer N., Schellander K., Wagner E.F., Barlow DP. Imprinted expression of the Igf2r gene depends on an intronic CpG island// Nature—1997.-Vol.3 89.-P.745-749

168. Xu L., Wei Y., Reboul J., Vaglio P., Shin Т.Н., Vidal M., Elledge S.J., Harper J.W. BTB proteins are substrate-specific adaptors in an SCF-like modular ubiquitin ligase containing CUL-3//Nature.-2003.-Vol.425(6955).-P.316-321

169. Yang D.H., Smith E.R., Cohen C., Wu H., Patriotis C., Godwin A.K., Hamilton T.C., Xu X.X. Molecular events associated with dysplastic morphologic transformation and initiation of ovarian tumorigenicity// Cancer.-2002.-Vol.94.-P.2380-2392

170. Yoder J.A., Walsh C.P., Bestor Т.Н. Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites// Trends Genet.-1997.-Vol.l3.-P.335-340

171. Yoon H.G., Chan D.W., Reynolds A.B., Qin J., Wong J. N-CoR mediates DNA methylation-dependent repression through a methyl CpG binding protein Kaiso//Mol.Cell.-2003 .-Vol. 12.-P.723-734

172. Zegerman P., Canas В., Pappin D., Kouzarides T. Histone H3 lysine 4 methylation disrupts binding of nucleosome remodeling and deacetylase (NuRD) repressor complex// J.Biol.Chem.-2002.-Vol.277(14).-P.l 1621-11624

173. Zhang Y., Griffin K., Mondal N., Parvin J.D. Phosphorylation of histone H2A inhibits transcription on chromatin templates// J.Biol.Chem.-2004.-Vol.279(21).-P.21866-21872

174. Zhang Y., Ng H.H., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Bird A., Reinberg D. Analysis of the NuRD subunits reveals a histone deacetylase core complex and a connection with DNA methylation// Genes Dev.-1999.-Vol.l3.-P.1924-1935

175. Zhang Y., Tycko B. Monoallelic expression of the human H19 gene// Nat.Genet.-1992 -Vol. 1 .-P.40-44

176. Zhang Y. Transcriptional regulation by histone ubiquitination and deubiquitination// Genes Dev.-2003.-Vol.l7.-P.2733-2740

177. Zwart R., Sleutels F., Wutz A., Schinkel A.H., Barlow D.P. Bidirectional action of the Igf2r imprint control element on up-stream and downstream imprinted genes// Genes Dev.-2001 -Vol. 15.-P.2361-2366

Информация о работе

Саложин, Сергей Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Роль метил-ДНК-связывающего белка каизо в контроле транскрипции генов позвоночных, регулируемых метилированием ДНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы