Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РОЛЬ ЛЕГОГЛОБИНА, МЕТЛЕГ0ГЛ0БИНРЕДУХТАЗЫ И АСК0РБИНАТ0КСИДАЗЫ В КИСЛОРОДНОМ ОБМЕНЕ КЛУБЕНЬКА ЛЮПИНА

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "РОЛЬ ЛЕГОГЛОБИНА, МЕТЛЕГ0ГЛ0БИНРЕДУХТАЗЫ И АСК0РБИНАТ0КСИДАЗЫ В КИСЛОРОДНОМ ОБМЕНЕ КЛУБЕНЬКА ЛЮПИНА"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н.БАхХ

РОЛЬ ЖГОГЛОБИНА, МЕТЛЕРОГДОЕИНРБДУКТЛЗЫ И АСКОРБИНАТОКСИМЭЫ В КИСЛОРОДНОМ ОБМЕНЕ КЛУБЕНЬКА ЛШИНА

03.00.04 - биологическая химия

I

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На оравах рукопиои

Башрова Нина Федоровна

Москва - 1978

Работа выполнена в лаборатории энзимологкт! Ордена Ленина Института биохимии иы. А.Н.Баха АН СССР

Научные руководители - член - корреспондент АН СССР,

профессор В.Л.Кретович кандидат биологических наук С. С.Ыелик-Саркасян

Официальные оппоненты;

Доктор биологических наук Г.Я.йиэневская, [

доктор биологических наук Д.Н,Островский.

Ведущая организация — Московская Ордена Ленина и Ордена Трудового Красного ашмеыя Сельскохозяйственная Академия ' им. К.А.Тимирязева.

Защита диссертации состоится * " ^г-^^/^г 1978 г. ■ в час на заседании Специализированного совета / Л 002. 96. 01./ по защите диссертаций на соискание ученой с'-.'^яни доктора биологических наук при Институте биохимии ' га. А.Н.Баха АН СССР / 117071 Москва В-71, Ленинский прос-пе>'л\ 33, корпус 2/.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической лигатуры АН СССР /Москва, Ленинский проспект,33,корп.2/

Автореферат разослан " Л/ъ&у;^ 1978 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат биологических наук " Н.Н.Дьячков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что легоглобин синтезируется в клубеньках бобовых растений в результате эффективного симбиоза бактерий рода RhUo6tu.ni а высшего растения. Клубеньки, содержащие легоглобин, интенсивно фиксируют: молекулярный азот. Эффективное функционирование азотфлксирующей системы в кпубенйках бобовых растений осуществляется при очень низких р02 в бактероидиой зоне клубенька. В то же время известно,что АТФ, необходимая для осуществления процесса азотфнксацпи, сш-тезярустся в результате дахания бактероидов. Очевидно, при аэрации клубенька одновременно с беспрепятственным поступлением азота к бактероидам поток кислорода должен регулироваться. Как известно, дахаяие бактероидов осуществляется за счет кислорода, доставляемого дегоглобинаи. Легоглобин способен присоединять кислород, только когда железо ¿''группе хека находится в двухвалентном состоянии, аналогично гемоглобину и мио-глобину животных. Доя эритроцитов человека доказано существование в них фермента метгемоглобгаредуктазы / ^а^/е > 1974/, поддергивающей гемоглобин в физиологически активном состоянии; данные об аналогичной ферментной системе в клубеньках бобовых растений отсутствуют.

В клубеньках люпина нами были впервые обнаружены ферменты: метлегоглобинредуктаза /мет-|_6 -редуктаза/ и аскорбинатоксида-эа, участвующие в кислородном обмене клубенька. Аскорбинаток-сидаза, кы полагаем, может играть роль "барьера", препятствующего прохождению избытка кислорода к бактероадной зоне клу -бенька, осуществляя таким образом защиту нитрогеназы. Роль мет-1Ь -редуктазы заключается, по нашему предположению, в поддержании легоглобяна в физиологически активном восстановленном состоянии, в котором он обладает очень большим сродством к кислороду.

- Изучение как легоглобина, так и обнаруженных нами ферментов - мет- |_Ь -редуктазы и аскорбинатоксядазы, представляется очень важным с точки зрения нахождения оптимальных условий для аффективной работы геимбиотичеоких азотфиксирующах систем бобовых растений. ------------ ---------------------------

} ;."' * : . ■ - |

V • • • \ |

/■ ' ! л

Цель и задачи исследования. Цель» настоящей работы являлось изучение легоглобина люшша и обнарувешшх наш ферментов мет-13 -редуктазы и аскорбинатокоидазы, Bunt поставлены следующие задачи: изучение гетерогенности легоглобина люшша методом изозлектряческого фокусирования; изучение рола отдельных макрокоыпонентов легоглобина в процессе аэотфиксагрга суспензиями бактероидов; выделение и очистка мет— L6 —редуктазы и исследование ее свойств; изучение активности мет-L8 -редуктазы в процессе вегетации люшша, исследование влияния . мет-L6-редуктазы на процесс азотфиксадаи суспензиями бактероидов в присутствии кисло роднереносящих гемопротеадов; выделение и частичная очистка аскорбинатоксвдазы, изучение распределения активности аскорбинатоксвдазы в ткадах клубенька.

Научная новизна. Впервые обнаружено присутствие в клубеньках люпина ферментов: ^лет-16 -редуктазы и аскорбанатоксидазы. Разработан метод выделения мет- L6 -редуктазы из клубеньков люпина и изучены ее некоторые свойства. Предложен метод определения активности мет-Lb-редуктазы. Показана положительная корреляция мет-Lb -редуктазпой активности с содержанием легоглобина в клубеньках в процессе вегетации растений. Установлено, что азотфикслруюцая активность бактероидов значительно ' стсядулируется кислородпереносяцлма гемопротеидамн в прнсут-^ ствли мет- L& -редуктазы. Впервые проведено изучение роли отдельных макрокомпонентов легоглобина люпина в процессе азот-фиксации суспензиями бактероидов и в присутствии мет- LS -редуктазы. Предложен метод частичной очистки аскорб инатокспдазы из клубеньков люпина. Показано, что аскорбинатоксвдазная активность в основном локализована в коре клубенька. Активность аскорбинатоксидазы понижена при старении клубеньков и при не-вффектавном симбиозе.

Практическая ценность. Изучение кислородного обмена клубеньков бобовых растений и роли в этом обмене легоглобина , кет- L6 -редуктазы и аскорбинатоксидазы способствует выяснению механизмов процесса восстановления молекулярного азота сим-бнотическаыи азйтфиксируювдаш системами. Расшифровка этого процесса, как известно, имеет огромное значение о тонки зре—

- з -

кия повышения содержания в. почве усваиваемых растениями азотистых соединений, а, следовательно, повышения урожайности сельскохозяйственных культур.

Апробация работы. Материалы диссертации была долоиены на V Ваковском коллоквиуме /КаневДЭ7б/, а тажде на совместных коллоквиумах лаборатории энзимояогии Института биохимии им. А.Н.Баха и кафедры биохимии и зерповедения ЬШ1ПП.

П^бтакащл. Опубликовано 4 работы, отражающие основное содержание диссертация, 2 находятся в печати.

Объем работа. Дрссертадая состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования и использованных материалов, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы /170 ссылок/. В обзоре литературы рассматриваются данные, посвященные изучению легоглоби-на различных бобовых растений. Рассмотрен вопрос о физиологической роли легоглобина на основе современных исследований и приведены данные об особенностях функционирования азотфиксируюцей системы в клубеньках бобовых растений.

ЭКСПШМЕНТАЛШАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы исследования

В работе объектом исслеловтптя являлись корневые клтбекъ— ки люпина желтого / Lupinus tuAeu-s L. /, сорт Елотрорасту-щий 4, селекции Новозыбковской опытной станцаи. Семена лшнна били инокулированы серед посевом эффективным птаммом Rhuotium /359 а/. Клубеньки собирали на различных фазах вегетации растений в зависимости от условий эксперимента.

Для препаративного получения легоглобина / |_6 / люпина и его компонентов наш была разработана модификация метода выделения и очистки Lb люпина, предложенного ранее /д!елик -Саркисян с соавт.,1969/. При гомогенизации клубеньков использовала паливашиширролидон для защиты Lb / Koch et аС., 1967/ от контакта с полифенолами растительной клетки. Удаление сопутствующих 1Ь белков осуществляли хроматографией на биогеле Р-30 и последующей хроматографией на дяэт^ишминоэтил целлшо-зе ДБ-52.

/

Шделение бактероидов проводили, как описано у Дайхин-штейн с соавт.,1374/.

Изучение 16 методом изоэлектрического фокусирования проводили по Свенссону и Вестербергу/Siíensíort, 1963; VeiUîêeiç, Siíensson, 1966/ о использованием естественного градиента рН, стабилизированного сахарозой в термостатируемой при 4°колонкв объемом 110 «л /LKB 8Ï0I/* Изоэлектрическую фокусировку /ИЗФ/ суммарного свежеввделенного препарата L6 и его основных фракций Lfc-I и L6-H проводили с использованием аюфолинов диапазона рН 4 - 6 при конечной кондентрадш последних 1%. На колонку подавала надрядение 500 в, сила тока составляла 5 ма в течение первых десяти часов и I ма в конце опыта. Разделение длллось 48 часов. С целью получения более полного разделения компонентов L6 , различающихся на 0,02-0,03 ед..рН,ШФ проводили в более узком интервале рН. Для получения узкого градиента рН использовали двойной метод ИЗО. В первом опыте при создании градиента рН в колонку вводили анфолины pli 4-6, конечная концентрация которых составляла 4Í?, По завершении опыта сфокусированное в узком интервале рН белки использовали для второго опыта, в котором градиент рН обеспечивался уже имеющимися в растворе белка амфолинами. В обоих опытах на ' колонку подавали напряжение 1000 в, причем анод был расположен в нижней части колонки* Сила тока составляла в первом опыте 13 - 14 в в конце S на, во втором опыте 2 и О,в ма , соответственно. Первый опыт продолжался 24, второй - 72 часа. По завершении ИЭФ фракции объемом 1,2 мл собирали со скорос — тью 18 мл/час. Элпцюэ белков регистрировали по поглощение при 280 нм при помощи денситометра "UiítcoxcL II" / LKB 8300a/. Определение величины рН в полученных фракциях проводили с помощь» рН - метра "pIÎ-340" при t = 4°, Каждый опыт по ГОФ проводили по 3 - 4 раза. Спектры поглощения записывали на регистрирувдем спектрофотометре марки Unica m S Р-700. Фракции белков предварительно диаллзовали против раствора I M WaCÍB 0,01 M К-фоофатнш буфере рН 6,3 для удаления саха- ■ розы и амфолинов /Ûuast, Vesleiteag, 1968/. Спектра поглощения исходных препаратов снимали в растворе 0,01 И К-

фосфатного буфера pli 6,3.

Мдоглобин :гз сптткшх мышц кашалота очи дали методом /Уата-аак! etae.,X9ô4/. Производные L.6 ï LfcVH^O/ - ферри-Lfe , высокосшшовагс форма; X.V/CU'/ - цканферри- « нлзкоспино-вая форма; Uf> 02 - окси- L6 ; производные коилонентов1&'(.6-1 и LB-1I» а также MßVHgQ/ и Мб 02 получали, как описано ранее /Шаронов о соавт.,1973/. Определение концентрации лего-глоблна и миоглобина проводили спектральным методом, используя коэффициент молярной экстинкции 9,25.103смпри А » 525 нм. Наш было показано, что данная длина волны является изосбестической точкой спектров L&M^O/i \А*/СЫ'/ и LßOg» так же, как и для спектров окси- и метгемоглобина / Quast, Ve steige15 ,1968/.

Определение азот^иксигующей активности бактероидов проводили по скорости восстановления ацетилена в;эгален / Hcwcty ttaC.,1973/. Условия пнкубадаи бактероидов были разработаны нами совместно в И.А.ИноэемцевоЙ. Наибольшее стимулирование азотфиксирутоей активности изолированных бактероидов наблюдалось при концентрации геыопротеида 0,5 объеме пробц 1,мл, количестве бактероидов 50 иг. Газовая фаза содержала /в мм Hg /: Og - 15, ацетилена - 152 и аргона до 600. В опытах использовали гемопротеида: суммарный препарат L& из клубеньков люпина, его отдельные компоненты L&-I и 18 -II, полученные методом ионообменной хроматографии на ДЕ-52, Мб . При изучении влияния гемопротеидов на азотфихсируюцую активность бактероидов в присутствии мет-L6-редуктазы использовали препараты мет- L6 -редуктазы из растворимой фракции клубенька, oWneiffloiî дршатогрофаей на биогеле Р-ЭО.

Измерение поглощения кислорода бактешяламя проводили на полярографе L Р7 /ЧССР/ в ячейке с закрытым платиновым электродом /Шольц, Островский,1975/. В ячейку помещали 20 мг бактероидов в 2 мл 0,1 M К-фойфатного буфера pH 7,4. Концентрация сукданата в ячейке составляла 12 цМ. Температура опыта 28°.

Выделение игет-LS-редуктазы проводили из растворимой фрак-цни клубенька и из белков, выделяемых бактероидами при инкубации. Локализацию фракции с мет-ЦБ -редуктазно! активностью' из "

растворимой фракции клубенька определяли методом дробного высаливания сульфатом аммония.'Мет-1&~редуктазная активность била обнаружена во фракции 40-80 % насыщения сульфатом аммония. После центрифугирования 20 мин при 23000g осадок бел -ков с мет- 1Ь -редуктазной активностью растворяли в шнималь- . ном количестве К-фосфатного буфера рН 7,4 и хроматографкро -вали в колонке /60x2,3 см/ на биогеле Р-30, уравновешенном 0,01 M К-фосфатным буфером рН 7,4. При данных условиях хромат огради мет- L6 -редуктазная активность обнаруживалась в I фракции. Белки I фракции высаливали сульфатом аммония до 80 % насыщения и обессоливали на колонке с биогелем Р-2 при злю-ции 0,002 M К-фоофаттщ буфером pli 7,0. Полученный раствор хрокатографировгли на ионообменнике ЛЗАЭ-сефаселе. Принцип работы колонок с Д)АЭ-сефаселем и их приготовления перед хроматограф;!ей такой же, как и для ДЭАЭ-сефадексов. Колонку размером 35x18 см уравновешивали 0,002 M К-фосфатным буфером рН 7,0. Проводили ступенчатую елвдвд К-фосфатным буфером рН 7,0 возрастаний ионной силы: 0,03 М; 0,1 М; 0,2 М; 0,3 М. Сбор фракций проводили на автоматическом коллекторе "Шнярак" фирмы LKB. Скорость выкапывания составляла 42 мл/час, В процессе хроматографии проводили запись профиля элщии белков при Л и 280 на на спектрофотометре *5ресогс1". Нет- Lt>-редук-тазнув активность обнаруживали во фракции, элюируемой 0,2 U буфером. *

Мет-LS —редуктазу. выделяемую бактероидамиР получали при инкубации 'дважды отштых бактероадов при комнатной температуре при встряхивании на качалке в течение 15 часов в 0,01 M ' К-фосфатиом буфере рН 7,4. Буфер содержал 50 мМ сукцинат Wa, ^ I Mil 0,3 M сахарозу при отношении бактеро;шов к буферу

1:1. Бактероиды отделяли центрифугированием в течение 20 мин при 23000 g . Центрифугах служил источником редуктазы. Фракцию белков, содержащую редуктаэу, выделяли из центрифугата высаливанием сульфатом аммония при pli 6,8 в пределах насыщения от 40 до 80 %4 После обессоливания на колонке с биоге -леи Р-2, уравновешенным 0,002 Ы К-фосфатнш буфером рН 7,0 » проводили хроматографию на ионообменшке ДОАЭ-сефаселе в ia-

ких кв условиях, как и при выделении мет-ЦБ -редуктазы из растворимой фракции клубенька. Мет-ЦЬ -редуктазяая актив -ность также была обнаружена во фракции, влюируемой 0,2 М буфером.

Изучение активности мет-1.6 -редуктазы проводили спек — трофотометрическим методом. В качестве субстратов мет-|_6 -редуктазы были использованы МЬ» К&*", окисленный цито -х£ом'сД02. ^б активности редуктазы судили по скорости восстановления соответствующего субстрата. Регистрацию спектров поглощения восстанавливаемых гемопротеидов проводили через определенные промежутки времени или не автоматически записывали скорость восстановления гемопротшдов при соответствующей длине волны. Все опыты по восстановлению гемопротеидов мет-16 -редуктаэой проводили при комнатной температуре. При изучении восстановления 0,1 м!Л растворов гемопротеидов неочищенными препаратами мет-16 -редуктазы использовали в качестве доноров электронов как НАЛ!, так и НАДСЙ при конечной концентрации 1,8.10~4М. Опыты по восстановлению проводили в аэробных условиях в X см оптических кюветах или в таких же кюветах с герметичными пробками в отсутствии газовой фазы. Реакцию начинали добавлением НАДИ ¡их НАДЗН. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре "Зресог<А В длительных опытах в качестве антисептика применяли тимол. При определении активности мет- |_Ь -редуктазы аз растворимой фракции клубенька в процессе ее очистки субстратом служил цятохром с, как наиболее быстро ею восстанавливаемый. В I см оптическую кювету помещали опытную смесь объемом 2 мл, которая содержала: 0,05 мМ цзтохром с , 2,5.10~%1 метиленовута синь и соответствующее количество мет-16-редуктазы. Реакцию инициировали добавлением ИАД1 при конечной концентрации 3,6.Ю^М. Контрольная кювета содержала все компонент, кром§ НАД!. После перемешивания автоматически записывали скорость восстановления цятохрома с мет-1 Ц& -редуктаэой по изменению оптической плотности при Л »550 им. За единицу активности мет-1.6 -редуктазы принимали изменение оптической плотности в 0,01 в I мин. Удельную активность выражали в единицах активности на

I мг белка.

Для огагтов по изучению активности иет-ЬЬ -редуктазы в процессе вегетации растений использовали неочищенные препараты редуктазы, подученные при инкубации бактероидов, выделенных на различных стадиях развитая растений. Использовал:! фракцию белков, высаливаемую от 40 до 80 % насыщения сульфатом аммония. Обессоленный на колонке с биогелем Р-2 препарат мет--редуктазы добавлял;! в X см оптическую кювету к раствору окисленного миоглобина. Реакшиа начинали добавлением ШЦШ и сразу же измеряли величину оптической плотности данного раствора при Д = 582 нм /А полоса поглощения Мб02/. Повторное измерение оптической плотности проводили через I час. Об актив -ности мет- -редуктазы судили по величине иэменеш1я оптической плотности за I час, вызываемого тем количеством мет-16 -редуктазы,которое выделяется I г сухого веса бактероидов.

Изучение влияния рН на активность мет-16 -редуктазы проводили в оптических кювётах. Использовали 0,1 М К-фосфатныЙ буфер следующих значений рН: 5,59; 5,91; 6,47; 6,98; 7,38; 8,04; 8,68; 9,45, Активность мет-Ц6 -редуктазы определяли по восстановлению М&+, концентрация которого в пробе составляла 0,1 мЫ; концентрация метиленовой сини - 2,5.10"%. В' каждую пробу добавляли по 0,05 мг очищенного препарата мет- .

-редуктазы,* полученного путем хроматографии на ЛЗАЭ-се-фаселе. Реакдаю начинали добавлением ШЦЩ при конечной концентрации 3,6.Ю^М и после перемешивания записывали ско -рость восстановления Мб* при Д я 562 нм. При расчетах для построешш кривой максимальную скорость восстановления при опкпяальном значении рН- принимали за 100$. Намерения рН буферных растворов проводили стеклянным электродом на -рН-метре "рН-340". Все ошты вели при комнатной температуре 20°.

Изучение специфичности мет- -редуктазы по отношению к > кофакторам и субстратам проводили о очищенным на ВЭАЭ-сефасе-ле препаратом мет-Ц6 -редуктазы. Записывали скорость восстановления гемопротеидов при Я = 574 нм для Ь60„, при Д = 582нм для М602, при А о, 577 нм для Нб02, при Д » 550 км для восста-

новленного щтохрома с . В качестве кофакторов использовали НАДН при конечной концентрации 3,6.10"%.

Определение аскорбинатоксидазиой активности'в тканях клубенька и корнях люпина проводили полярографическим методом. Гомогенаты получали растирашгем в ступке с 0,1 М К-фосфатным буфером рН 7,4 при соотношении 1:6. Красную бактероидную зону клубенька тщательно очищали от перемежающихся с ней бес -цветных участков. Кору клубенька срезали скальпелем в виде тонких пленок. Корни использовали целиком. Дня получения фракции.растворимых белков гомогенаты центрифугировали 15 мин при 23000д . Выделение и частичную очистку препарата аскорбинатоксидазы проводили из растворимой фракции клубенька по следующим этапам; I — высаливание сульфатом аммония растворимых белков клубенька в пределах насыщения 55-80 % при рН 7,2; II - фракционировшше в колонке с биогелем Р-Э0, как указано в пункте 2 "Методов исследования? Аскорбинаток-сидазнал активность обнаруживалась в I фракции. Об аскорби-натоксидазной активности фравдй растворимых белков клубенька, тканей клубенька или корней люпина судили по скорости поглощения кислорода из инкубационной сред* при окислении аскорбината. Объем инкубационной смеси составлял 2 мл 0,1 Ы К-фосфатного буфера рН 6,4. В пробы вводили 0,1 - 0,3 мг белка растворимой фракции или 35-38 мг гомогената или 20 мг бактероэдов, Реакцию начинает добавлением аскорбината, концентрация которого составляла 6 мМ, Опыты вели при ^ = 28°. Измерен;!е поглощения кислорода проводили акперометрическкм методом /Шольц, Островский, 1975/ на полярографе 1_Р7 /ЯСС?/ в ячейке с закрытым платиновым электродом. Скорость окисления сукцината /при концентрации 22 Ш/ определяли в тех асе условиях.

Лля определения оптимума рН аскорбинатоксидазы клубеньков использовали 0,1 М ацетатный буфер рН 4,4 - Ь,7 и 0,1 11 К-фосфатный буфер рН 7,5 - 7,9. Величины рН регистрировали стеклянные электродом. В опыте использовали препарат аскорбинатоксидаэы после его очистки на биогеле Р-ЭО.

Белок определяли по Лоури / 1.оийту »1 а!., 1951/.

/

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Изучение легоглобина люгглпа метолом н з о эле ктр'.тче ского <Ьокусд розалия

Как известно; легоглобин из клубеньков бобовых растений при хроматографии и электрофорезе обнаруживает гетероген -ность, которая подтвердилась и при изучении легоглобина методом Ш лсследовади методом ИЗО как суммарный препарат L6, так и его основные фракции ЬВ-I и иб-П, полученные хроматографячески. В результате ИЭФ суммарного препарата бшш получены три окрашенные зоны белков. Величины язоэлев-трпческпх точек /ИЭТ/ отдельных компонентов , определенные в результате их 1Ш, составляли для1_6-1 - 5,00, для 1.6 -II - 4,91.

Наш была проведена ИЗО комплексов 16 люпина ЬбЯу)/ и ШУСМУ,- В результате ИЗФ получали разделение легоглоба-на лгаина на два макрокомпонента и 1-3 микроког-понента /рис.1,А,Б/ При добавлении к комплексу перед опытом небольшого избытка Кд[Рв/С или КСМ в результате КЭО также наблюдала разделение на два основных макрокомпонента. Спектральные характеристики показали, что все компоненты находятся в одной форме комплекса. Поэтому можно считать, что разделение 1.Б в данном случае определялось свойствами полипептидных цепей его компонентов. ^, ^ ,. г. ,

1 Л г>! | ! а:

-а е| •

[ с V -

. , ; . е! .

РисЛ. Изоэлектрические спектры суммарного препарата в виде комплекса иб^^О/. А -разделение в первом опыте; £ - разделение во втором опыте.

Из полученных камк данных можно заключить, что при ИЗФ как суммарного 16 ,так и его кошлексов. происходило разделе-ление 16 на два основных какрокомпонента. Согласно полученным наш величинам ПЭТ для компонентов Ь6 люпина и литературным данным /ЕЕЕ|о£к, 1360; ВгоидМоп а о.е.( 1972/, монно считать, что все изученные, к настоящему времени 1.6 бобовых растений являются белками, кислыми по своей природе. В этом отношении она значительно отличаются отНби М& позвоночных животных , .ИИ которых лежат, как правило, в нейтральной зоне рН /Ыелик-Саркнсян, Кретович, 1975/, Можно считать такте, что 16 люпина, аналогично сои /Еее^сСк, 1972/ представлен двумя основными подипептидкымл цепями и шкрокомпонентами.

2. Исследование влияния 1,6 и его компонентов на процесс азот^ксагаи суспензт'-ямк бактетюнлов.

В литературе отсутствуют данные по изучении влияния от -дельных макрокомпонентов 1.6 на процесс азотфпксагрш суспензиями бактероидов.

Результаты, приведенные на рло. 2, показывают, что 1802-1 и 16С^-П так же, как и суммарный Ь602 значительно стимулировали азотфшхирующуа активность бактероидов. Следовательно, эти белкй являются близкими по своим функциональным свойствам. !_6 0^-11 стимулировал азотфиксащга несколько слабее, чемио2-1, «¿¡коррелирует с данными о несколько меньшем сродстве к кислороду аналогичного компонента 18 /1,6 с/ из клубеньков сои / Д ррСеб^, 1962/. Присутствие в клубеньке двух компонентов ■с одинаковой функцией обуславливает, возмошо, определенную гибкость системы, обеспечивающей бактероида кислородом. Возможно, что таким образом поддергивается определенное р02 в "бактероидной зоне"клубеныса, оптимальное для работы китро-геназы бактероидов, инакгивирующейся в присутствии молекулярного кисл5(рода.

Полученные наг,« данные по спалуляции азотфиксации сус -пензяями бактероидов в присутствии ЬЬ О2 еще раз свидетельствуют о той, что физиологически активной формой этого геко-протеяда является его восстановленная, оксигенирозаиная форма.

1

о

1 Я Й §

В

I о.. ж <ч

§

3

ч>

н

1,5

1,0

0,5

0,2 •

/

12 3 4

мм проб

Рас,2. Вешние 1602-1 и 1&02-11 на азот-факсируицую активность бактероидов 6iu.ro еир1п1 I - контроль без гемопротеида, 2-е и02, 3-е 1602-1, 4 - с 1& О^-И.

3* Условия выделения и свойства мет- 1Ь -педуктады.

Из литературных данных известно, что стимуляцию азотфик-сирующей актавно'ста бактероидов осуществляют и окисленные гемопротеида, хотя и в меньшей степени, чем оксигеиировашше /\КЛилпвегд Ног,1974; Мелнк-СаргсIсян с соавт. ,1976/. На этом основании ми предположила, что бактероида выделяют фермент редуктазной природы, способный восстанавливать кет-

На рас. 3 показано восстановление 1_6*и М6+в присутствии белков, выделяемых бактероида:,а при инкубации. Ыожио видеть, что и МБ^воостанавливались с последующей их оксигенацпей, поскольку опыты проводили в аэробных условиях. Это явление могло объяснять действием редуктазы, выделенной бактероидами при инкубации. Ь'д предположим, что бактероида и 1п\Мо выделяют редуктазу в растительные клетки клубенька. Действительно, аналогичная редуктазная активность была каьег обнаружена такке

и в растворной фракции клубенька, Еа рте.4 представлено восстановление М6>+в опыте без газовой фазы. Можно видеть, что здесь ямело место только восстановление гемопротеида без его оксагенации.

1,0

0,5-

20

18

20 18

16

14

см

.-X

16 14 Я X Ю3

Рис.З. Восстановление 1Ь*и _ неочищенным препаратом мет-1&-редуктазы, выделенной бактероидами при их инкубации. Спектры сдвинуты относительно друг друга по вертикалу. I - исходные растворы, 2 -через I час, 3-через 3 часа.

Таким образом, в растворимой фракции клубенька нами был обнаружен фермент, восстанавливаюсь окисленные гемопротеида. Фермент был назван мет- 1.6 -редуктазой, аналогично мет- Ц6 -ре-дуктазе эритроцитов /КО 1.6.99/, функция которой заключается в поддержании физиологически активного восстановленного сос-_

Рис.4. Восстановление МбГнео-читенкым препаратом мет-16 -редуктазы из растворной фракции клубенька. Опыт без газовой фазы. I - исходный раствор, 2 - через 3 часа.

тоягая МБ .

Haïra был разработан метод выделения и очистки мет- L6 -ре-дуктазы из растворимой франции клубенька и из белков, выделяемых бактероидами при юс инкубации. Был такке разработан метод определения активности фермента. На рис. 5 приведены профили

Рис.5. Хроматогра\&м вц ЗЭАЭ-сефаселе препаратов мет-|_&~ редуктазы из растворимой фракпдн клубенька /А/, из белков^ выделяемых бактероздгсли при инкубации /Е/, Стрелкой отмечен пик с кет-Ц}-реду1Стазной активностью.

элшии белков при хроматографии препаратов мет- -редуктаза на ЛЭАЗ-сефаселе..

Как кояно видеть из табл. I ,в результате был получек ' фермент, очищенный в 125 раз. Выход составлял 21$,

Таблица I

Очистка мет- Lb -редуктазы из клубеньков люпина.

Этапы Г "Г Общий белок, мг Общая активность, ед¥ Удельная активность, ед/мг Й1ХОД,

Растворимая фракция 1133 4190 3,7 100

/К/Н4/2504 40 - 60 % 161 2090 13,0 47

Биогель Р-30 28 1180 42,0 28

^ЭАЗ-сефасель 1,9 890 463,0 21

^единица активности - изменение оптической плотности а t) в 0,01 за I мин при А = 550 нм /восстановление вдтохрока с/

Восстановление окисленных гсмопротеидов мет- Lb -редукта-зой наблюдалось только в присутствии кофакторов.Если до очистки на ЮАЗ-сефаселе в качестве кофакторов мокло било исполь-*зовать как НАДН, так и НАДСН, мот- Lfc -редуктаза после хроматографии на ДЭАЗ-сефаселе работала только с НАШ. Согласно литературным даншм, мет- Н8-редуктаза эритроцитов также является НАД1-завнсимым ферментом / » 1974/.

Скорость восстановлена окисленных гемопротеидов мет- L6 -редуктазой значительно возрастала, если опыты проводили в присутствии переносчика электронов - метшгеновой елки. Лрисут -ствие метиленовой сини было обязательны:.:, если для восстановления гемопротевдов использовали препараты мет- L6-редуктазы после хроматограф:® на ДЭАЭ-сефаселе. По-видимому, при хроматографии на ионообменнике фракции белков с мет- L6 -редук -* тазной активностью происходит удаление природного переносчика

электронов.

Интересной особенностью мет- Ц -редуктазы является отсутствие специфичности по отношению к субстратам. Фермент восста-навллвал L6\MÜ>* И^окисленкый цитохром с . Конечным акцептора.! электронов мог быть также Ög. Старость восстановления ге-мопротеидов убывала в ряду : окисленный цитохром о >М8+>16% HSt Несмотря на то, что мет- L6 -редуктаза хорошо восстанавливала окисленный датохром с, мы полагаем, что цитохром о не является естественным субстратом мет-Lfe -редуктазы. Методом диф-ферегащальной спектрофотометрии нам не удалось обнаружить ци-тохром с в растворимой фракции клубенька. Об отсутствии да-ioxpor.ta с в растворимой фракции клубенька свидетельствуют также опубликованные данные / SrrvitK, 1949; Ыслик-Саркисян с' соавт, ,1969/. Мет-Н&-редуктаза эритроцитов человека также неспецафичва в отпошешщ субстратов / Scott, б гаи!, 1962/.

Определение опткмука pH мет- 16 -редуктазы проводили, используя в качестве субстрата Мб*. Величина pH, при которой наблюдалась максимальная активность редуктазы, составляла 7,4.

На основании полученных нами данных можно предположить, что в растительные клетки клубенька мет- L6 -редуктаза выделяется бактероидами. Это подтверждается тем, что одинаковая ре-дуктазная активность была наги обнаружена как в растворимой . фракции клубенька, так и в белках, выделяемых бактероидами при инкубации.

4. Влдя1г,те MR, L6 и его ^ ш; рокомп он ен тов на лропесс азбтЗшсслши суспсиз'.шшг бактепоилов в присутствии мет- L6 -пслуктазы.

[Лы исследовали влияние как фсррк-; так и ферроформ IX и М8, ^ а такжО отдельных комонентов L6 на азотфаксирующутэ активность изолированных бактероидов в ррлсутствии мет- L8 -редуктазы.

Результаты опытов, приведет те на рис.6 показывают, что при добавлении мет- L6 -редуктазы и НАДОН к проба:.;, содеряа-пда LbfH Н6*, скорость восстановлении ацетилена значительно увеличивалась. Ш полагаем, что окисленные гемопротеиды в присутствии мет-L6-редуктазы восстанавливались. Затем, оксигени-руясь, они начинали функционировать как переносчики кислорода

к оксидазной системе, связанной с' генерацией ЛТФ /8егд«г*е«-> Тагпг'г, 1975/. В результате азотфиксация значительно ^тныули-

гемопро- |_Ь0, IV-1 1-Ь0г-1 160,-1 МЬ*

теид

Рис.6., Влияние мет-(.6 -редуктазы на азотфиксзрующую активность бактероидов люшна в присутствии /А/ и МЙ/Б/. Проба I - контроль /суспензия бактероидов в буфере/. Пробы 3',6,8,10,12,14,16 содержат препарат мет-ЦЕ> -редуктазы /к /. в - без кофактора; а - в присутствии кофактора.

Можно видеть, что мет- и -редуктаза вызывала увеличение скорости восстановления ацетилена также и в пробах с оксите-нированнымл гемопротеядамн.

На рис.6 приведены данные по влиянию мет- 1&-редуктазы на азотфиксирующу» активность бактероидов в присутствии макроком-понелтов ; [6-1 и 16-11. Мокно видеть, что изолированные макрокомпоненты , как окисленные, так и оксигенировашше при добавлении мет- 16 -редуктазы значительно увеличивала азот-• фиксируют» активность бактероидов.

Полученные результаты позволяют предположить, что функционирование 1.6 в клубеньках обеспечивается ферментативной системой, компонентом которой является кет- -редуктаза, поддерживающая 16 в физиологически активной состоянии. Можно также

считать, что макрокоотоненты Ц> выполняют одинаковые или очень близкие функции.

5. Активность мет--редуктазы в процессе вегетации люпина и при неэффективном стенозе.

Известно, что максимальное содержание в клубеньках бобовых растений приходится на период бутонизации - начала цветения. Представляло большой интерес изучить активность мет- |_Ь -редуктазы в процессе развития растешй и ее корреляцию с содержание!.! Ц> . Препараты фермента для этих опытов получали путем инкубации бактероидов.

На рис. 7 можно видеть, что в перше восемь педель развития растений активность редуктазы постепенно нарастала, дости-

а Но

ел

о

<»

и

а

I«

О О

'"•а

и ш

'а В

и* о

3,0

£ 2.0

0 <

1

х.о

с» о <а

Кво *

о и

-2 о

^ о,

3 1-1

I-1 й

«о

_I

I

сч

20

10

& ®

гН Э 1 О

Р) о> * ®

Р

а> о

хэ

(

со

12

4 в 8 10 Возраст растений , недели Рио.7 Мат-1Б -редуктазная активность в процессе вегетации люпина. I - мет-1.6 -редуктазная активность, 2 — содержание 16 в клубеньках, 3 - количество белков, выделяемых бактероидами при инкубации.

гая максимума в период бутонизации - начала цветения, в период цветения активность мет- ЬЬ -редуктазы снижалась.

Максимальная азотфиксирующая активность изолированных бактероидов люшгаа /йелик-Саркисян с соавт.,1976/ так^е наблюдается в период бутонизации - начала цветения, "т.е. соответствует времени наибольшей активности мет-16 -редуктазы.

IIa рис. 7 (ложно также видеть, что общее количество белков, выделяемых бактероидами при инкубации, изменялось в процессе вегетации и положительно коррелировало с активностью мет-16 -редуктазы.

При сравнении мет-16 -редуктазной активности в растворимой фракции клубенька из "неэффективных" и "эффективных" растений люпина было показано, что активность мет-16 -редуктазы в клубеньках растений, ияокулировапных неэффективным штаммом, была почти в 5 раз шгае, чем при эффективном симбиозе. В клубеньках "неэффективных" растений содержание L6 было в 7 раз нихе, чем в "эффективных". Следовательно, в этих опытах была подтверждена прямая зависимость между активностью мет- L6 -редуктазы и содержанием L6 в клубеньке.

6. Изучение ас ко пбинатокс ил.тноЯ активности в гомогенатах Т1таней клубенька в процессе вегетации люпина и при неэффективном симбиозе.

Изучение функции L& , физиологически активное состояние которого, как иоапо думать,- поддерживается мет- Lb -редуктазой, должно быть тесно связано с изучением транспорта кислорода в клубеньки бобовых растений. Как считает Тьепкема /Tj«picema, Yocunrt ,1974/, в коре клубенька существует "барьер", препятствующий свободному проховдению кислорода. Этот факт согласуется с данными Эпплбл / Йрреебу, 1969/, установившим присутствие в клубеньках сои 20 % оксигекированного L6 от всего количества восстаповлеiшого гсмопротеида. Очевидно, дыхашге бактероидов в клубеньке осуществляется за счет связанного кислорода, перенос которого обеспечивает U6 . Свободный кислород, как было шмсазано, инактишрует ферментный комплекс ннтроге-назу/ßiigfstn, Tu г пел.. 1968; Wonj, биг-iis, 1972/.

Нами было обнаружено, что клубеньки люпина содержат растворимую ферментную систему, катализирующую окисление аскор-бината молекулярным кислородом. Присутствие аскорбиновой кис-

лоты в клубеньках и корнях бобовых растений было показано ШемахановоЙ и Бунько /Шемаханова, Бунько, 1968/.

В табл. 2 приведены данные по изучению аскорбинатоксидаэ-но2 активности в различных тканях клубенька люпина. Моано ви-

Таблица 2

Окисление субстратов гомогенатами тканей клубенька и бакт ероидаки.

Ткань Субстрат нмоли 02/мин/кг

Кора к 0,0

Сукцинат 0,0

Аскорбинат 19,60

Бактероидная к 2,6

зона 1 Сукцинат 3,63

Аскорбинат 1*8

Бактероиды ж 3,25

Сукцинат 5,61

Аскорбинат 0,0

* .Дыхание за счет эндогенных субстратов

деть, что в ткани коры окисление аскорбината проходило очень интенсивно, В бактероадной зоне активность была примерно в 10 раз меньше и могла быть связана с недостаточной очисткой ткани бактероидаой зоны от клеток коры. Изолированные бактероиды аскорбинат не окисляли. Аскорбинатоксидазная активность не была каш обнаружена и в растворе белков, выделяемых бактероидами при инкубации.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в ) клетках коры клубенька весьма интенсивно происходит окисление аскорбиновой кислоты под влиянием аскорбинатоксадазы. Этот процесс играет, возможно, задатную роль, поскольку в клетках коры может быть использована значительная доля кис-

лорода воздуха, проходящего по промежуточным полостям в центр клубенька. При старении клубеньков аскорбинатоксчдаэ-ная активность уменьшалась. Она значительно понижалась и при неэффективном симбиозе. Так, скорость поглощения кислорода в присутствии аскорбината, катализируемая препаратом аскорбинатоксидазы из "неэффективных" клубеньков люпина, по сравнению с препаратом из "эффективных" клубеньков растений т<£го жеVвозраста составляла 15,3 и 51,7 /л. молей 02час~*,мг~? соответственно.

Таким образом, в ткали коры клубеньков люпина нами был обнаружен фермент - аокорблпатокеидаза, Оптимум рН аокорйи-натоксэдазы , выделенной из растворимой фракции клубеньков, оказался очень близким к величинам, найденным для фермента из других растительных объектов / Ро^ьъ* «Л не., 1944/ и лежал при рН 5,7. Активность фермента тормозили п-хлормеркурнбен-зоат, КС// , салипилальдоксим и диэтилдитиохарбамат.

7. Предполагаемая роль у» . кет-1& -редуктазы и аскорби-натоксилазы в кислородном обмене клубенька.

Ряд фактических данных, имеющихся в литературе, подтверждает, что условия кислородного обмена клубенька бобового растения должны быть приспособлены, с одной стороны', к защите нитрогеназы от избытка кислорода и, о другой, к обеспечению бактероидов кислородом, необходимым им для.процессов дыхания.

Как известно, максимальная активность нитрогеназы в бактероидах наблюдается только при определенных условиях, одним из которых является равномерное и низкое рО^ в клубеньках бобовых растений, а также присутствие оксигенированного 16 в растительных клетках, содержащих бактероиды /ШШпЪпу ас., 1974/ Вйгделз«*, Т"-гпег, 1975/. Действительно, низкое рОд в бактероидной зоне клубенька, обнаруженное в ряде работ /ЗДсг-1959; ЛррСеб^» 1969; \ЙЧиепвег£ ¿1 <¡.1., 1972; Т/еркета,' Yocu.ru, 1973,1974/, наличие в клубеньках только примерно 20% оксигенированного 1-6 / Дррее^у, 1969/цри очень большом сродстве 1.В к 02, ингибирующее влияние на ферментный КОМШГеКО нитрогеназу / Бея^егсеп, Титпе«, 1968; и/ог^, в»л«и.

1972/ - все эти факты заставляют предположить, что количество кислорода, поступающего к бактероидам, должно регулироваться при одновременном беспрепятственном поступлении азота.

Аскорблнатоксидаза может играть роль "барьера", обнаруженного в коре клубеньков Тьепксма, регулирующего поступление кислорода в бактероидную зону. Ш полагаем, что значительная часть кислорода, поступающего в клубеньки, используется аскорбанатоксидазой. В результате ткань коры, содержащая аскорбинатоксидазиую активность, пропускает к бакте-ровдной зоне клубенька только определенное количество кислорода, который в силу большого сродства сразу же соединяется с 16 . 0ксиге1Шрованный 16 участвует в обеспечении бактероидов кислородом, прячем, как показано в ряде работ, активность нитрогеназа наиболее высока именно при низких р02. Таким образам, 16 .очевидно, выполняет две функции: обеспечение бактероидов кислородом, в результате чего синтезируется необходимая для азотфаксацни АТФ и, в то же время, обладая исключительно высоким сродством к кислороду, осуществляет тонкую регулировку парциального давленая кислорода в бак-'тероидной зоне клубенька.

В свете этих рассуждений роль мет-|_6 -редуктазы заключается в постоянном поддержании физиологически активного восстановленного состояния Ь6 . Действительно, литературные данные подтверждают отсутствие окисленного ЦЬ в клубеньках.

Проведенные нами опыты по изучению азотфиксирующей активности бактероидов в присутствии гемопротеядов показали, что активность нитрогеназы значительно возрастала при добавлении в опытную смесь кет-1Б -редуктазы. Корреляция активности ' мет- 16 -редуктазы с содержанием 1.6 в процессе вегетации бобовых растений, значительно пониженная активность мет-1Л-редуктазы у неэффективных растегсй - все эта полученные нами данные свидетельствуют о той важной роли, которую играет фермент в симбиотической азотфиксацяи.

Обнаружение наш мет-1Ь -редуктазы в клубеньках люпина , аналогичной по функвди мет- Н6 -редуктазе эритроцитов, указывает на универсальность редуцирующих систем, поддерживающих

кислородпереносявде гемопротеяда $ фк заологиче ски активном

восстановленном состоянии и поэтому представляет большой ин- .

терес с эволюционной точки эрендя.

вывода

1. Методом изозлектрического фокусирования показана гетерогенность 16 люЕша. Установлено, что люпина представлен двумя основными макрокомпонентами с изоэлектрически-ми точками 5,0 и 4,91 и 2 -3 микрокомпонентагш.

2. Показано, что как суммарный 1.6 , так и его изолированные макрокомпоненты значительно стимулируют азотфикси -рующую активность бактероидов. По-видимому, компонент 1Л выполняют одинаковые или очень близкие функции.

3. В растворимой фракции клубенька открыт фермент — мет- |_6 — редуктаза, способный катализировать восстановление 1£*и других гемопротеидоз. Показано, что в растительные клетки клубенька фермент выделяют бактероиды. Разработан метод очистки мет-16 -редуктазы, а также метод определения активности фермента. В результате был получен фермент, очищенный в 125 раз. <

4. Показано, что наибольшая активность мет-и-редуктазы соответствует фазе бутонизация - начало цветения растений люпина и значительно понижена при неэффективном симбиозе.

5. Показано, что азотфиксируюцая активность изолированных бактероэдов люпина значительно стимулируется кет- СБ —ре— дуктазой в присутствии окисленных гемопротеидов 1Ь+и а также в присутствии изолированных компонентов 1.6 . Стлыу-

* лирова^ие азотфиксирующей активности бактероидов мет- и -редуктазоЙ наблюдалось также в присутствии 1Б02.

6. В клубеньках люпина обнаружена аскорбинатоксидаза. Показано, что наибольшая аскорбипатоксидазная активность сосредоточена в коре клубенька. Установлено, что наибольшая ' аскорбипатоксидазная активность в клубеньках лшина соответствует фазе бутонизация - начало цветения и понижена при неэффективном симбиозе. Разработан метод частичной очистки аскорбинатоксидаза из клубеньков люпина. ~-\

■ 7. Предполагается, что , мет- [.& -редуктаэа и аскорбинат-оксвдаза участвуют в создают оптимального кислородного режима в клубеньке. Аскорбинатоисидаза может играть роль "барьера", препятствующего поступлению избытка свободного кислорода в клубенек. 16 осуществляет свою функцию переноса кислорода бактероидам, только находясь в физиологически активном восстановленном состоянии, которое может поддерживаться ферментом ист-1.6 -редуктазой.

8. Обнаружение в клубеньках люпина фермента мст- |_6 -редукта-зы, аналогичной мет-НБ -редуктазе эритроцитов, представляет большой интерес с эволюционной точки зрения, так как указывает на универсальность редуцирующих систем, поддерживающих кислородпереносяцяе гемопротеидн в физиологически активном состоянии у различней: представителей живого мира.

СПИСОК

работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. С.С.Мелик-Саркасян, Н.ф.Башрова, Л.Л.Владзиевская, Г.П. Карпиленко, В.Л.Кретович,Х975. Изучение легоглобина клубеньков лшинаулетодом изоэлектрического форсирования. Изв. АН СССР, сер.биол.,6,837-845.

2. С.С.Мелик-Саркнсян, Л.П.Вдадзневская, Н,Ф.Еаширова,1975. ^деление легоглобина из клубеньков люпина. В сб."Методы современной биохимии",М.,Наука, 151-155.

3. С.С.Мелик-Саркнсян, Н.О.Башрова.И.О.Зауралова, В.Л.Крето-вич,1976. Ферментативное восстановление легоглобина. Вю-хпмля, 41,шп.7,1330-1333.

4. С.С.Мелак-Саркислн, Н.О.Бшырова, В.Л.Кретович,1977. О роли аскорбанатоксидазы в клубеньках люпина. Снзлол. растений, 24,вып.5,1038-1042.

5. Н.ф.Башрова, И. А.Иноземцева, С,С.Мелик-Саргасяк, В.Л.Кре-тович,1Э78. Ешиние гемопротеидов на азотфиксирутоцую активность бактероидов ЯЫговшт (ирш^ . физиол. растений, 25, шп. 1,18.

6. Н.Ф.Езшрова, С.С.Мелик-Саркнсян, В.Л.Кретович,1978. Влияние ферментативного восстановления М6*на азотфиксарую-щу» активность бактероидов ^¡.говшт Си.р1пи .Фязиол. растений /в печати/. ^

от 20/1 1978г._3«к. 225_Тир. 150

Типография ЮНО Госплан» СиСР