Функционирование легоглобина и регуляция кислородного режима в клубеньках бобовых

Топунов, Алексей Федорович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функционирование легоглобина и регуляция кислородного режима в клубеньках бобовых
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Функционирование легоглобина и регуляция кислородного режима в клубеньках бобовых"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им.А.Н.БАХА

На правах рукописи

2 9 ДПР Ы)6

ХОДУНОВ

Алексей Федорович

УДК 577.152.1

ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ЛЕГОГЛОБИНА И РЕГУЛЯЦИЯ КИСЛОРОДНОГО РЕЖИМА В КЛУБЕНЬКАХ БОБОВЫХ

03.00.04 - Биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в лаборатории метаболизма азота и синтеза белка у растений Института биохимии им.А.Н.Баха РАН.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук профессор С.Ф.Измайлов,

доктор химических наук профессор К.Л.Гладилин,

доктор биологических наук профессор А.У.Игамбердиев.

Ведущая организация: Институт почвоведения и фотосинтеза РАН.

Защита состоится 1996 г. в 10 час. на заседании

специализированного совета (Д 002.96.0t) по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биохимии им.А.Н.Баха РАН (117071 Москва, Ленинский проспект 33, корп.2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы БЕН РАН (117071 Москва, Ленинский проспект 33, корп. 1).

Автореферат разослан 1996 года.

Ученый секретарь специализированного совета,

Доктор биологических наук - /• : Т.А.Нллуепа

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Проблема симбиотической фиксации атмосферного азота бобовыми растениями привлекает внимание большого числа исследователей во всем мире. Она важна не только с точки зрения фундаментальной науки, но и представляет исключительное практическое значение. Процесс азотфиксации важен и как один из источников пищевого и кормового белка, и для поддержания плодородия почв, причем без ухудшения экологической обстановки.

Симбиотическая система бобового растения включает в себя само растение-хозяина и клубеньковые бактерии радов Rhizobium и Bradyrhizobium. Эти бактерии находятся в клубеньках бобовых растений в виде бактероидов, в которых и проходит сам процесс фиксации азота. Для нормального протекания этого процесса в клубеньках в целом и в инфицированных клетках, где содержатся бактероиды, должны поддерживаться определенные условия. Чрезвычайно важным является поддержание оптимального кислородного режима, поскольку, с одной стороны, нитрогеназа - фермент, катализирующий реакцию связывания азота, ингибируется свободным кислородом, а, с другой, кислород необходим для метаболизма самих бактероидов.

Было известно, что донором связанного кислорода для бактероидов является легоглобин (леггемоглобин) - миоглобинподобиый кислородпереносящий гемопротеид клубеньков. Было изучено строение легоглобина, известны многие его свойства. Также известно, что первым этапом регуляции кислородного режима в клубеньках является барьер газовой диффузии в коре, после прохождения которого концентрация кислорода резко снижается.

Однако к началу наших исследований многое в этой проблеме оставалось

Сокращения, использованные в работе: Lb - легоглобин, Lb2*, Lb3+, IЬ02 -восстановленная, окисленная и оксигенированная формы легоглобина, мет-Lb-редуктаза - метлегоглобинредуктаза, FOL - доля оксигенириванного легоглобина, Ое, Os, Oi - концентрация кислорода вне клубенька, в межклеточных газовых пространствах и в инфицированной клетке соответственно.

невыясненным. Хотя в лаб. чл.-корр. РАН В.Л.Кретовича в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН было показано существование процесса ферментативного восстановления легоглобина, этот процесс, необходимый для поддержания легоглобина в физиологически активном состоянии, не был изучен. Не было исследовано взаимодействие процессов с участием легоглобина. Не были окончательно выяснены и кислородные условия в самой инфицированной клетке. В связи с этим не были ясны вклад инфицированных клеток в регуляцию кислородного режима в клубеньке по сравнению с кортикальным t барьером диффузии и, соответственно, общая схема такой регуляции.

Цель и задачи работы.

Основной целью работы было изучение функционирования легоглобина, механизмов, поддерживающих его в физиологически активном состоянии, его роли в регуляции кислородных условий в инфицированной клетке, и, на основании полученных данных, всей системы регуляции кислородного режима в клубеньке.

В связи с эгим в работе были поставлены следующие задачи:

1) изучить процесс ферментативного востановления легоглобина, необходимый для его поддержания в физиологически активном состоянии, и метлегоглобинредуктазу -фермент, катализирующий этот процесс,

2) изучить взаимосвязь между процессами, в которых участвует легоглобин в клубеньке и которые необходимы для его нормального функционирования: восстановление, окисление, оксигенация, деоксигенация,

3) изучить кислоподный статус инфицированной клетки с учетом функционирующего в ней легоглобина и участие самой этой клетки в регуляции кислородных условий,

4) выяснить вклад различных этапов (барьер газовой диффузии коре и инфицированная клет..а) в общую регуляцию кислородного режима в клубеньке, дать описание системы такой регуляции с учетом полученных данных.

Научная новизна и практическая неннос-ть работы.

Изучен процесс ферментативного восстановления легоглобина i клубеньках бобовых. Впервые получен гомогенный препарат мстлегоглобинрсдуктаны цитозоля кчубеш.кон люпина. Изучены свойства фермента. Пыли также изучены свойства .ш.гкч ИММ01 о фермент;! ii:i клубеньков сои. Установлено, что мст-ЬЬ-ргдуктаза

является белком растительного происхождения, но не является нодулином. Похазано, что ферментативное восстановление Lb является в клубеньках основным.

Изучено взаимодействие различных процессов с участием легоглобина. Проведено сравнение процессов восстановления легоглобина 'в анаэробных и аэробных условиях, показано, что легоглобин может восстанавливаться в обоих случаях. Изучена роль легоглобина как донора кислорода в опытах с бактероидами in vitro. Впервые описан процесс спонтанной деоксигенации легоглобина, выдвинута гипотеза о возможной роли этого процесса в клубеньках. Предложена схема функционирования легоглобина в клубеньках, учитывающая различные процессы с его участием и различные пути протекания этих процессов.

Проведено изучение фермента, обладающих мет-ЬЬ-редуктазной активностью, из бактерий и бактероидов Bradyrhizobium lupini. Впервые получен гомогенный препарат этого фермента, изучены его свойства. Показано наличие аналогичных редуктаз и в некоторых других бактериях.

Впервые проведена экспрессия легоглобина (Lb I люпина) в клетках Е. coli. Получен гем-содержащий физиологически активный легоглобин. »

Изучено сродство легоглобина к кислороду в физиологическом диапазоне температур (15-25°С). Показано, что данные оксиметрии по влиянию температ оы на долю окснгенировакиого LbÜ2 и на концентрацию кислорода в инфицированной клетке согласуются с данными ö сродстве легоглобина к кислороду.

С использованием метода оксиметрии и с помощью математического моделирования изучен кислородный статус инфицированной клетки клубенька. Подтверждена гипотеза, что понижение концентрации кислорода происходит и во внешней зоне самой инфицированной клетки. Проведено моделирование ситуации в целом клубеньке с одновременным учетом роли как кортикального барьера газовой диффузии, так и самой инфицированной клетки. Рассчитан вклад обоих этих этапов в общую регуляцию кислородного режима в клубеньке.

Полученные данные позволили предложить схему регуляции кисло] одного режима в клубеньках бобовых с учетом ее различных этапов. Показано, что в такой регуляции принимает участие как барьер газовой диффузии в коре клубенька, так и сама инфицированная клетка. Тем самым показана роль легоглобина не только как донора связанного кислорода для бактероидов, но и как важной составной час гп системы регуляции кислородного режима в инфицированной клетке.

Полученные данные существенно расширяют знания о ситуации в инфицированной клетке .и в целом клубеньке, позволяют полнее представить, как в клубеньках происходит поддержание кислородных условий, необходимых для оптимального протекания процесса симбиотической азотфиксации.

В ходе исследований разработаны методики очистки как метлегоглобинредуктазы цитозоля клубеньков люпина, так и редуктаз из других объектов, которые могут быть использованы в дальнейших исследованиях. Полученный штамм Е. coli может быть использован для получения препарата легоглобина I люпина. Данные о сродстве легоглобина к кислороду при различных температурах и другие связанные с этим данные, могут быть использованы как для расчета экспериментальных данных, так и для использования в математических моделях, описывающих инфицированную клетку и клубенек в целом.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены более чем на 30 научных конференциях и симпозиумах, в том числе на VI (Чернигов, 1980), VII (Тбилиси, 1983), VIII (Кобулети, 1988) и IX (Москва, 1995) Баховских Коллоквиумах по азотфиксации, на IV (Ленинград, 1979) и V (Киев, 1986) Всесоюзных биохимических съездах, на II Всесоюзном съезде физиологов растений (Минск, 1990), на III Международном молодежном симпозиуме по физиологии растительной клетки (Варна, Болгария, 1983), на XVI конференции Федерации Европейских Биохимических Обществ (Москва, 1984), на V Международном люпиновом конгрессе (Познань, Г >льша, ¡988), на VII Восточно-европейской конференциях по азотфиксации (Бендлево, Польша, 1990), на Восточно-Канадской конференции физиологов растений (Кингстон, Канада, 1993), на Гордоновской конференции ло кислородпсреиосящим белкам (Плимут, Нью-Гемпшир, США, 199'), на X Международном конгрессе по азотфиксации (Санкт-Петербург, 199S).

Работа отмечена бронзовой медалью ВДНХ в 1987 г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 64 печатных работы. .

Структура и объем диссертации,

Диссертация'. состоит из нислеими, обзора литературы (4 главы), .иаигримситальнои члеш (6 Улан), заключения, «ыподои и списки цитируемом

■ . jyu ' '

.'lMitp.nvpi.i Дтччрг.ишя -.изложена ira .... np.miifl.ix машинописного гекста,

включает & таблиц и ^рисунков. Список цитируемой литературы включает & источников, а том числе на иностранных языках. В обзоре литературы рассматриваются работы, посвященные свойствам и функционированию легоглобина, системам воссстановления кислородпереносящих гемопротеидов,' барьеру газовой диффузии, общей регуляция кислородного режима в клубеньках.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОПЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований.

В опытах по изучению ферментативного восстановления легоглобина и других процессов с его участием использовались корневые клубеньки растений желтого люпина (Lupinus luteus L.) сортов Быстрорастущий-4 и Брянский-6, инокулированных эффективным штаммом Bradyrhizobium lupini 359а и выращенных в полевых условиях Московской области, и растений сон (Glycine max L. (Мегг.)) сорта "Амурская-310", инокулированных эффективным штаммом В г. japonicum 648 и выращенных в оранжерейных условиях в сосудах с песком при температуре 25°С с фотопериодом 16 часов. Растения сои снабжали питательным раствором (Johnson et al., 1966) с ежедневным внесением 120 мг NH4N03 на сосуд до начала функционирования клубеньков. Клубеньки люпина и сои собирали на стадии бутонизации - начала цветения, так как и содержание Lb и мет-Lb-редуктазиая активность максимальны на данной фазе развития растений.

Для изучения бактериальных редуктаз использовали бактероиды, выделенные из клубеньков люпина, клубеньковые бактерии Br. lupini штамм J59a (эффективный) и 400 (неэффективный) и Br. japonicum штамм 648, бактерии Azotobacter vinelandii штамм OP, Bacillus mucilagenosis штамм 4 и Escherichia coli штамм B'/e. Br. lupini выращивали в питательной среде, описанной в (Топупов с соавт., 1987), A. vinelandii - на среде Эшби с сахарозой, р. mucilagenosis ■ на сахарно-минеральной среде , Е. coli - на триптоновом бульоне. Бактерии разрушали на прессе Хьюза-Итона в камере модификации (Любимов, Львов, 1968). Разрушенные бактерии центрифугировали в течение 20 минут при 23000 g для удаления клеточных структур.

- б -

В опытах По влиянию температуры на FOL и Oi использовали растения сои (.Glycine max L. сорт Maple Arrow), выращенные в кварцевом песке в сосудах, которые могли быть заклеены для анализа газового обмена (Hunt et а!., 1987), в контролируемой климатической камере (модель PGV 36, Conviron Environments Ltd., Виннипег, Канада) при 20°С с 16-часовым фотопериодом. Для экспериментов по быстрым температурным изменениям отдельных клубеньков сосуды были снабжены съемными стенками (Kuzma et al., 1993). Через 4 дня после прорастания растения были инокулированы Br. japonicum USDA 16, штаммом, у которого отсутствует аптэйк-гидрогеназная активность (Layzell et al., 1984). В течение первых двух недель после посева растения поливали 2 раза в день питательным раствором, содержащим 0,5 мМ KNO3, в оставшийся период роста - питательным раствором, свободным от азота. Растения были использованы для опытов через 28-32 дня после инокуляции.

Выделение и очистка Lb.

В опытах по изучению мет-И)-редуктазы был использован легоглобин, полученный нами из цитозоля клубеньков люпина (Мелик- Оаркисян с соавт., 1975) и окисленный феррицианидом калия (Шаронов с соавт., 1973).

В опытах по экспрессии экстракт клубеньков люпина был получен по методу (Szybiak-Strozycka et al., 1987), и легоглобин был очищен до гомогенности с использованием методов высаливания сульфатом аммония (40-80% насыщения), ион-обменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой и гель-хроматографии на колонке с Суперозой 6 HR 10/30 (Pharmacia LKB, Швеция).

'егоглобш! для опытов по изучению влияния температуры на сродство к кислороду получали по модифицированному методу (Kanayama, Yamamoto, 1990). Очистка включала в себя стадии: высаливание с помощью (NH^SO,! от 40 до 80% насыщения, гель-филь" ,>апия на колонке с био-гелем Р-30 (Bio-Rad, Канада) и ионообменная хроматография на колонке с ДЭАЭ-Ссфацслсм (Pharmacia, Канада). Восстаноилснная форма Lb (Lb2+) была получена с помощью неферментаиь юй реакции с NADH с использованием процедуры (Saari, Klucas, 1987), в модификации с использованием растворов 10 мкМ Lb и 5 мМ NADU (pH 6,5). Для получения (¡M),) чсрем раствор Lb'24 был пропущен чистый кислород. Окисленный Ll>:,+ был помучен iiyirM реакции l.b с 1мМ ([м-ррццнаннлом калия.

Концентрация Lb была рассчитана прямо из спектров образцов с использование коеффициента экстинкцни 9,52 ед. А/мМ при изосбестической точке 525 нМ (Quast, Vesterberg, 1968). Этот коеффициент был ранее использован для расчета концентраций всех форм Lb (Мелик-Саркисян с соавт., 1975).

Определение метлегоглобинредуктазной активности _проводили по

восстановлению легоглобина как в присутствии искусственного переносчика электронов, которым являлась метиленовая синь (Топунов с соавт., 1980), так и в отсутствие его (Голубева с соавт., 1987). Проверяли также наличие цитохром с-редуктазной активности и активности по восстановлению миоглобина и гемоглобин а.

Спектрц флуоресценции и возбуждения флуоресценции, записывали на спектрофлуориметре"^ШасЫ MPF-4" (Япония) при температуре 20°С. Длина волны возбуждения при снятии спектров флуоресценции была равна 450 нм , длина волны испускания при снятии спектра возбуждения флуоресценции - 540 нм , при ширине щели 10 нм. Идентификацию флавинов по спектрам флуоресценции проводили по методу (Faeder, Siegel, 1973).

Элетрофорез белковых фракций проводили в 7,5% полиакрила^идном геле по методу (Tombs, Akroyd, 1967). Окрашивание гелей после электрофореза проводили с использованием Кумасси голубого (Chrambach et at., 1967), зимограммы ппучали по методу (Kaplan, Beutler, 1967) в модификации (Топунов с соавт., 1980).

Методы, использовнные в работе по экспрессии Lb.

Были использованы штаммы Е. coli HMS174 (F"rccAr"itl2m+iti2RifR) и BL21 (F' отрТгвпгв) (Studier et al 1990). Клетки Е. coli выращивали в среде LB при 37°С с добавлением при необходимости 50 мкг ампициллина и/или 25 мкг хлорамфеникола на мл.

Синтетические олигонуклеотиды были приготовлены В центральной лаборатории по синтезу ДНК Европейской Молекулярно-биологической лаборатории и очищены^ методом HPLC (на колонке Cynchropak 300 С18, 6,5 мкм, MZ Analezentechnik). Белок А из Staphylococcus aureus (Pharmacia LKB) был но,.ечен с помощью Na[)25I] (1 mCi; Amersham) с использованием хлорамина Т (Sigma) в качестве оксиданта.

Смесь для реакции амплификации на 50 мкл содержала 10 мМ Tris-HCl pH 8,3, 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 50 нг ДНК плазмиды, несущей 1Ы кДНК клон (pSP25), 20 пмолей N праймера, 20 пмолей С праймера, 200 мкм каждого из dNTP и

- а -

1;0 U Taql полнмеразы. Реакция проводилась в три этапа на цикл: денатурация при Э4°С в течение 1 мин., отпуск при 55°С в течение 1 мин. и полимеризация при 72°С в течение 2 мин. (30 циклов) с использованием системы TwinBlock (Ericomp Inc., США). Аликвота объемом 5 мкл . из 50 мкл реакционной смеси была проанализирована на 1% агарозном геле в буфере 1 х TBE.

Получение быстрых тепературных изменений в клубеньках.

Растения выращивали в специальных расщепленных сосудах (Kuzma et ai., 1993). Перед опытом одна сторона сосуда была отделена, чтобы подставить клубеньки для измерения FOL. Блок спайки, соединенный с медным наконечником, был помещён против отдельного клубенька и температуру клубенька изменяли с помощью воды, циркулирующей через наконечник из водяной бани. Когда температура водяной бани изменялась до 35°С или до 5°С, клубеньки достигали температуры 25 и 15°С соответственно в течение 2 мин., что было определено с помощью термопары, сделанной из медно-колстантановой проволоки (0,127 мм в диаметре), помещенной внутрь клубенька.

Получите постепенна* температурим» изменений в ' -1У<$?иыш,

Сосуды с растениями были помещены в рециркуляционную водяную баню при 15 или 25°С. Было показано, что среда вокруг корня достигает конечной температуры в течение 25 мин после помещения сосудов в водяную баню (Kuzma, Layzell, 1994). Сосуды с растениями были вынуты из водяной бани с 6-, 30- и 120-мин. интервалами и помещены и камеру для роста с нужной температурой. Для каждого оксиметрического замера был использован один клубенек с каждого растения. Контрольные растения были оставлены в камере для роста при 20°С в течение всего эксперимента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ ЛЕГОГЛОБИНА.

МЕТЛЕГОГЛОБИНРЕДУКТАЗА

Процесс ферментативного восстановления легоглобина заключается 1) том, что шнчч.ппнисшн' :kv:wx¡ ic.w.t (переход vio ш трсхпажчттИ и лоухшлеитную форму) • к.п.\ iii.iiipyricii ферментом Mcr.UT(Hvio6inip0;iyKni:io¡i (приставка мет- традиционно

используется для обозначения окисленной формы гемоглобинподобных белков). Динамику восстановления легоглобина можно легко определять по изменению его оптического спектра поглощения (Рис. 1). Нами были проведены исследования мет-ЬЬ-редуктаэы.

Разработана методика очистки фермента из цнтозоля клубеньков люпина, позволяющая получить его электрофоретически гомогенный препарат. Были использованы различные последовательности этапов очистки', последний включал в себя зысаливание сульфатом аммония, адсорбционную хроматографию на гидроксп л апатите, ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе и жидкостную хроматографию высокого давления- с использованием колонки иНгараск ТЗК-545 БЕАЕ.

Фллвопротеилная природа.

Для определения • флавопротеидной природы мет-ЬЬ-редуктазы были использованы различные методы. При использовании« флуориметрии при длине волны возбуждения 450 им максимум флуоресценции наблюдался при 520 нм, что характерно для флавопротеидов. Было показано, что все флавины, содержащиеся в составе мет-ЬЬ-редуктазы, находятся в виде ФАД. Содержание флавинов Зыло также подтверждено методом тонкослойной хроматографии на пластинах "ЗПиСоГ.

На рис. 2 представлен спектр оптического поглощения гомогенного препарата мет-ЬЬ-редуктазы, записанный на спектрофотометре "Ш1асЫ-557" (Япония). Спектр поглощения имеет максимумы при 273 и 460 нм и плечо при 325 нм. Максимум поглощения при 460 нм характерен для флавинсодержащих белков.

Таким образом, на основе всех полученных данных мы можем сделать вывод о том, что мет-ЬЬ-редуктаза клубеньков люпина является оксидоредуктазой флавопротеидной природы. В связи с этим следует отметить, что в составе метгемоглобинредуктазы эритроцитов также обнаружен ФАД (Киша, !потаи, 1972).

Содержание металлов.

Было проведено определение содержания металлов в составе мет-ЬЬ-редуктазы. Проверялось наличие железа, меди и молибдена, так как эти металлы часто входят в состав ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные реакции. Результаты опытов свидетельствуют об отсутствии указанных металлом в составе фермента.

Plu-, 2. Спектр оптического поглощения мстлггоглобшфедуктазы цнтозоля клубеньков

ЛКЧШМ.1

Изоэлектрическую точку мет-ЬЬ-редуктазы определяли как методом изоэлектрического фокусирования на колонке с градиентом сахарозы, так и методом изоэлектрического фокусирования в полиакриламидном геле. Значения ИЭТ, определенные обоими методами, совпали и составили 5,8.

Молекулярная масса гомогенной мет-ЬЬ-редуктазы цитозоля клубеньков люпина была определена двумя методами: гель-хроматографией на сефадексе G-100 и электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата Na. Молекулярная масса, определенная этими методами, оказалась идентичной, равной 62000 Да.

Взаимодействие с донорами, акцепторами и промежуточными переносчиками

электронов.

В начале наших исследований опыты по восстановлению легоглобина, а также миоглобина и гемоглобина проводили в присутствии промежуточных переносчиков электронов: метиленовой сини или цитохрома Ьз, выделенного из микросом печени кролика (Топунов с соавт., 1982). В то же время цитохром с, и такие акцепторы электронов, как 2,6-дихлорофенолиндофенол и феррицианид К, восстанавливались без промежуточного переносчика электронов.

В дальнейшем нам удалось показать, что гомогенный препарат мет-Lb-редуктазы способен восстанавливать Lb , Hb и Mb без промежуточного переносчика электронов (Голубева с соавт., 1987).

Исследования мет-НЬ-редуктазы развивались в аналогичной последовательности. В начале опыты in vitro проводили с добавлением в реакционную смесь метиленовой сини, затем было показано, что. естественным промежуточным переносчиком электронов в эритроцитах является цитохром Ьз, и лишь впоследствии удалось показать, что восстановление гемоглобина in vitro можно получить и без промежуточного переносчика электронов.

В наших опытах по ферментативнму 'восстановлению легоглобина без промежуточного переносчика электронов в качестве донора электронов могли быть использованы как НАДН, так и НАДФН. Начальная скорс т> восстановления в присутствии НАДФН составляла 29% от таковой в присутствии НАДН. Для мет-Lb-. редуктазы из цитозоля клубеньков сои (Saari, Klucas, 1984) скорость восстановления Lb при использовании в качестве донора электронов НАДФН составляла 31% or таковой в случае НАДН.

Кинетические характеристики метлегоглобинредуктазы.

Было определено сродство мет-ЬЬ-редуктазы к акцепторам электронов: легоглобину (нами был взят Lbl - основной из компонентов), гемоглобину, миоглобину, цитохрому с, а также к исусственным акцепторам: метилсновой сини, феррицианиду К и 2,6-дихлорофенолиндофенолу. В табл. 1 приведены значения констант Михаэлиса для этих веществ. Как видно, наивысшее сродство мет-Lb-редуктаза имеет именно к легоглобину - своему естественному субстрату.В таблице приведены также значения Km для донора электронов - НАДН, причем как в реакции, где субстратом был Lb3*, так и в реакции восстановления цитохрома с.

Значения констант Михаэлиса для Lbl люпина и НАДН, полученные нами, близки значениям, определенным для mct-Lb-редуктазы из клубеньков сои (Saari, Kluca's, 1984). Кш для Lba соя составляла 9,5 мкМ, для НАДН - 18,8 мкМ.

Взаимодействие с ингибиторами.

Было изучено взаимодействие MeT-Lb-родуктазы с ингибиторами. Были исследованы следующие соединения: хииокрнн (атебрин), этилмалеимид, п-оксимеркурибензоат (ПОМБ), цианид К и НАД. Были рассчитаны значения констант ингибирования, которые приведены в Табл. 2.

Активность MeT-Lb-рсдуктазы ингибировалась хинокрином, который является ингибитором ферментов флавопротеидной природы (Haas, 1944). Это подтверждает флаиопротсидную природу MeT-Lb-рсдуктазы и говорит об участии флавиноной группировки в каталитическом акте. Значительное ингибирование было получено при блокировании сульфгидрильных групп в присутствии как ПОМБ, так и этилмалеимида. Как известно, этилмалеимид в первую очередь взаимодействует с поверхностно расположенными SH- группами, в то время как ПОМБ действует и на более глубоко расположенные сульфгндрильиыс группы (Торчипскнй, 1!)7(1). ПОМБ оказывал на MCT-Lb-редуктозу более сильное ингнбируютсс действие, чем этилмалеимид, что может свидетельствовать о том, что SH-грунны, возможно, играют роль и » подлержашш каталитически активной конформлшш молекулы >ит-1.1>-редукта;1ы. Было получено иншбироиаимс мет-1.Ь-рсдукта:п.1 11ЛД, которое ни.тнл ось конкурентным по отнонкчшюю к НЛДП. Цианид К не нншбироиал .iMiiiiHoi-iii мет !.!> редуктазы, Min подтверждает данные о юм, чю мем.т.ты не нршшм.пщ v'ii» ihm и каылишчеекои ампшшпп <|m-|>mciiш.

Таблица 1

Сродство мет-ЬЬ-редуктазы к донору и акцепторам электронов

Вещество

Роль в реакции

Константа Михаэлиса Km, мкМ

НАДН

Донор электронов

Lbl люпина миоглобин гемоглобин цитохром с метиленовая синь дихлорофеиолиндофенол феррицианид К

Акцептор электронов

9 (в реакции с Lbl) 24 (в реакции с

цитохромом с)

10 18

20 (в расчете на гем)

21 25 57 175

Таблица 2

Действие ингибиторов на мет-ЬЬ-редуктазу

Ингибитор Константа ингибирования

Ki.M

3,2 х 10-4

3.5 х Ю-4 1,4 х 10-3

1.6 х 10-2

п-оксимеркурибензоат НАД

Хинокрин Этилмалеимид

Цианид К ингибирующего действия не оказывал

( Метлегоглобинредуктаза клубеньков сои..

Была проведена работа по выделению и изучению свойств фермента и из клубеньков сои Glycine max L. (Мегг.), способного восстанавливать Lb3+. В клубеньках сои удалось обнаружить фермент, близкий по свойствам к мет-Lb-редуктазе клубеньков люпина. Мет-ЬЬ-редуктазная активность была обнаружена как в цитозоле, так и в бактероидах клубеньков сои.

Нам также удалось разделить, собственно мет-ЬЬ-редуктазу, которая обладает цитохром-с-редуктазной активностью, от цитохром-с-редуктазы, практически не способной восстанавливать окисленный. Lb3+ , поскольку до проведения данных опытов существовала точка зрения, что мет-ЬЬ-редуктазная активность может являться побочной функцией цитохром с-редуктазы.

Как и фермент из клубеньков люпина, мет-ЬЬ-редуктаза клубеньков сои является флавопротеидом, содержащим в своем составе ФАД. Молекулярная масса мет-ЬЬ-редуктазы цитозоля клубеньков сои, определенная методом гель-фильтрации на колонке с Toyopearl WH-55S, оказалась равной 95000 Да, что отличалось от молекулярной массы Mef-Lb-рвдуктазы цитозоля клубеньког, люпина, но совпадало с данными для фермента из клубеньков сои, (Saari, Klucas, 1984).

Метлегоглобинредуктаза является растительным белком, но не является

110ДУЛИИРМ.

В течение длительного времени невыясненным оставался вопрос о месте л синтеза мст-ЬЬ-редуктазы. Предполагалось, что фермент может выделяться в цитозоль растительной клетки бактероидами, в которых происходит его синтез (Мелик-Саркисян с соавт., 1976). В то же время мет-ЬЬ-редуктаза могла синтезироваться и растением- хозяином, в этом случае выделение фермента из бактероидов было бы связанным с условиями опытов in vitro. На выяснение этого вопроса и были направлены наши исследования.

Был проведен электрофорез мет-ЬЬ-редуктазы в пластинах 12,5% нолнакриламидного геля, после чего - элсктроблоттинг с нигроцеллкш :юй. Одновременно с ферментом на пластину наносили препараты суммарных белков ктубенькон и суммарных белков корней нсинфицпропанных растений люпина. Пшроцеллюлолу обрабатывали антителами трех индон, полученных и Институте биохимии IhuiNiilbCKoii ссл1.скоХ(ШПи-1 ионной академии: а) прошв белков-

нодулинов, б) против суммарных белков клубеньков, в) против суммарных белков неинфицированных корней люпина.

Нитроцеллюлозу обрабатывали белком А из Staphylococcus aureus, меченым радиоактивным иодом. На рис. 3 показаны результаты радиографии. Фермент реагировал с антителами на белки клубеньков и на белки неинфицированных корней, но не реагировал с антителами на нодулины. Можно сделать заключение, что мет-Lb-реду ктаза цитозоля клубеньков люпина является растительным белком, но не является нодулином, т.е. может содержаться не только в клубеньках бобовых растений, но и в других тканях, в том числе и в неинфицированных растениях.

В .то же время некоторые белки, которые считались иодулинами, могут быть обнаружены и в неинфицированных растениях, хотя и в незначительных количгсчвах, а для многих белков характерны лишь количественные изменения при образокшии клубеньков. Для выяснения наличия такие количественных.различий у MerLb-рсдуктазы были проведены опыты с использованием антител, полученных нами против мет-Lb-редуктазы цитозоля клубеньков люпина,и препараты суммарны < растворимых белков клубеньков и корней неинфицированных растений люпина. Антитела против мет-ЬЬ-редуктазы взаимодействовали с обоими препаратами белков, ' т.е. мет-ЬЬ-редуктаза не является нодулином в классическом смысле и присутствует как в неинфицированных растениях, так И в клубеньках инфицированных растений. В то же время количество мет-ЬЬ-редуктазы в клубеньках резко возрастает по сравнению с корнями неинфицированных растений. Нам удалось также показать и наличие самих белков с мет-ЬЬ-редуктазной активностью не только в клубеньках, но в корнях и листьях как инфицированных, так и неинфицированных растений люпина.

ПРОЦЕССЫ С УЧАСТИЕМ ЛЕГОГЛОБИНА

Ферментативное восстановление легоглобина является основным.

Восстановление Lb3+ в клубеньках может проходить несколькими путями. В ' опытах in vitro была показана возможность и неферментативных путей восстановления (например, индолил-уксусной кислотой, свободными флавинамн или НАДН). Представлялось интересным выяснить, какой вклад в общее восстановление Lb3+ вносит ферментативное восстановление. На основании полученных нами и литературных данных были проведены расчеты вклада различных путей

Рис. 3. Результаты радиографии после обработки антителами.

1 - мет-ЬЬ-редуктаза, 2 - суммарные белки неиифицированных корней, 3 - суммарные белки клубеньков,

А - антитела против нодулинов: Б - против белков корней, В - против белков клубеньков

Рис 1 Шмсигннс спектр» .■нтог.'юбина при шнчтлнон.'н-нин » А - .-пробных п Ь .И1.1 «робных уе.кишях С'иск1рм ааиисамы чг|им 1 ■ О, 2 - 10, -20 мии\1

восстановления Lb3+ с учетом физиологических концентраций восстановителей н клубеньках. Показано, что ферментативное востановление, катализируемое мет-Lb-редуктазой, составляет не менее 60% от общего восстановления. Неферментативное восстановление, катализируемое одним НАДН, по-видимому,' в клубеньках in vivo можно вообще не принимать в расчет.

Восстановление и осигенания.

Только восстановленный Lb2+, т.е. легоглобин, у которого железо гема находится в двухвалентном состоянии, способен оксигагароваться, т.е. присоединять молекулу кислорода. Нами была изучена взаимосвязь между процессами восстановления и оксигецации легоглобина. С этой целью были проведены эксперименты по ферментативному восстановлению легоглобина как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Восстановление было получено в обоих случаях, причем в случае аэробного восстановления наблюдалось появление оксигенированной формы легоглобина Lb02, а при анаэробном - восстановленного, но не оксигенированного Lb2+ (Рис. 4). Восстановление в анаэробных условиях происходило, хотя его скорость была примерно в 2 раза ниже, чем в аэробных (данные получены при расчете так называемых истинных скоростей восстановления).

В случае восстановления легоглобина в аэробных условиях при наблюдении за изменением спектра поглощения легоглобина . заметно появление спектра оксигенированного LbOj.' Ввиду высокого сродства легоглобина к кислороду связывание восстановленного Lb2+ с кислородом в аэробных условиях происходит настолько быстро, что наличие собственно восстановленного, но не оксигенированного Lb2+ просто по визуальному анализу полученного спектра определить практически невозможно. Это удалось сделать при использовании компьютерного метода анализа спектров поглощения Lb (это был первый случай использования мультикомпонентного анализа для исследования спектров Lb). На основании полученных данных можно было сделать вывод о присутствии небольшого количества (до 5%) восстановленного, но не оксигенированного Lb2+ в первые минуты аэробного восстановления (Рис. 5). Таким образом, можно сказать, что при нормальном протекании процесса восстановления Lb его оксигенация происходит практически беспрепятственно, и именно восстановление является лимитирующей стадией в функционировании легоглобина.

X юм

Рис. 5. Динамика изменения соотношения форм легоглобина при аэробном восстановлении по результатам расчетов на ЭВМ. На врезке - изменение спектра. ----1Ъ3\-ШЭ2,

1Время, мин.

1,(

0,6

).2

А (и

500

600

2 •

г/з

, Я/а

X., нм

Рис.6. Изменение спектра легоглобина при спонтанной деоксигенации. А - норный цикл, Б - поиториый цикл.

1 - [.1>(\ 2 - поегтанопленпый и оксигашронанный. 3 - дсоксигениронаннмй, 4 - 1.\>02 после повторной аэрации, 5 - повторно дсоксигсиироианный.

Леоксигенания..

Следующим процессом, который был нами рассмотрен, является деоксигенация легоглобина, т.е. отделение кислорода от молекулы ЬЬ02. Этот процесс также может проходить несколькими путями. Во-первых, передача кислорода бактероидам для обеспечения их метаболизма, в т.ч. и процесса фиксации азота, во-вторых, описанное в опытах in vitro возможное взаимодействие легоглобина с митохондриями растительной клетки (Suganuma et al., 1987), и, наконец, спонтанная деоксигенация.

Были проведены опыты по взаимодействию легоглобина с бактероидами, выделенными из клубеньков люпина. Показано, что добавление Lb в среду повышает как азотфиксирующую активность, так и интенсивность дыхания бактероидов, что свидетельствует о том, что даже в таких модельных опытах легоглобин способен функционировать как донор связанного кислорода для бактероидов. Добавление к среде мет-ЬЬ-редуктазы еще более повышало эти параметры.

Спонтанная деосигенания.

Процесс спонтанной деоксигенации легоглобина был описан нами при проведении опытов с Lb in vitro. Он заключается в том, что окснгенированный Lb02 освобождается от связанного кислорода без его передачи каким-либо клеточным или субклеточным структурам, причем деоксигенированный Lb2+ мог быть снова оксигенирован при поступлении кислорода в реакционную среду (Рис. 6). Ранее аналогичный процесс был описан для гемоглобина крови (Ueda, Tyuma, 1971).

Можно предположить, что процесс спонтанной деоксигенации может быть важен и в клубеньках in vivo в случае неожиданного резкого по,.ышеиия концентрации кислорода в цитозоле растительной клетки, или в тех зонах, где такая концентрация может быть повышенной постоянно. Т.е. можно сказать, что в клубеньках существует определенный баланс между различными путями деоксигенации Lb02, 'который может изменяться при различных кислородных условиях в инфицированной клетке.

На основании как полученных нами, так и литер: гурных данных мы предложили схему функционирования Lb в клубеньке, учитывающую как различные' процессы с его участием, так и пути, по которым эти процессы могут проходить (Рис. 7). Именно благодаря взаимодействию между всеми этими процессами

ЬЬО,

4 • 6 ^

V М

ХЬ3+

7 8 9

0 II

Рис.7. Схема функционирования легоглобина в клубеньке.

1 - передача кислорода бактероидам,

2 - передача кислорода митохондриям,

3 - спонтанная деоксигенацня,

4 - окисляющее действие супероксид-иона,

5 - "обезвр живание" супероксид-иона,

6 - действие других окислителей,

7 - восстановление метлегоглобинредуктазйй,

8 - окисление индолил-уксусиой кислоты,

9 - восстановление негсмонмм железопротеидом,

10 - нефсрмснтативнос поссганоиленне,

11 - восстановление ПАДИ,

12 - сунсрокисление

легоглобин способен нормально выполнять свои функции в инфицированной клетке клубенька.

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ РЕДУКТАЗЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ МЕТЛЕГОГЛОБИНРЕДУКТАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Ранее было показано, что бактероиды клубеньков люпина в опытах in vitro при инкубации выделяют в окружающую среду фермент, способный восстанавливать легоглобин (Мелик-Саркисян с соавт., 1976). Нами была обнаружена мет-Lb-реду ктазная активность в самих бактероидах (Тихомирова с соавт., 1982) и в клубеньковых бактериях Br. lupini и Br. japonicum, выращенных в свободной культуре (Топунов с соавт., 1987). Аналогичная активность была обнаружена и в бактероидах клубеньков сои (Saari, Klucas, 1984). В то же время, как было отмечено выше, метлегоглобинредуктаза цитозоля клубеньков является растительным белком. Для объяснения этого факта нами были проведены исследования фермента из бактероидов.

Очистка редуктазы из бактероидов и бактерий Bradurhizobium lupini.

Разработанная нами схема очистки фермента из бактероидов включала стадии высаливания сульфатом аммония в диапазоне насыщения 40-80%, адсорбционную хроматографию на гидроксилапатите, жидкостную хроматографию высокого давления на ионообменной колонке Ultrapack TSK 545 DEAE. Данная методика была также использована для очистки редуктазы- из бактерий Br. lupini, выращенных в свободной культуре (ранее изучения фермента из таких бактерий не проводилось). В результате проведенной очистки был получен электрофоретически гомогенный фермент как из бактероидов, так и из бактерий Br. lupini.

Таким образом, в бактериях рода Bradyrhizobium содержится фермент, обладающий мет-ЬЬ-редуктазной активностью, который по некоторым свойствам (способность восстанавливать окисленные легоглобин, миоглобин, гемоглобин) сходен с мет-ЬЬ-редуктазой клубеньков бобовых, а по другим свойствам, например, по поведению на стадиях выделения и очистки, отличается от них.

И бактериальный, и бактёроидный являются фл'авопротеидами, что было' установлено с помощью спектрофлуориметрии. Молекулярная масса ферментов из

бактероидов и бактерий Br. lupini была равна 85 ООО Да по данным гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-100.

Сравнение свойств бактерои^.юго и цитозольного ферментов.

В связи с тем, что ферменты, обладающие мет-ЬЬ-редуктазной активностью были ранее обнаружены как в цитозоле, так и в бактероидах клубеньков люпина, представлялось важным сравнение свойств ферментов из этих объектов. В настоящее время мы можем с уверенностью заявить, что цитозольная и бактериальная редуктазы представляют из себя ферменты разного происхождения.

По некоторым свойствам эти редуктазы оказались близки между собой. Они являются флавопротеидамн, не содержат в своем составе металлов, ингибируются ПХМБ (ингибитором, действующим на SH-группы). Следует также отметить, что все эти '* ферменты способны восстанавливать различные кислородпереносящие гемопротеиды: легоглобин, миоглобин и гемоглобин. Они обладают также и цитохром-с-редуктазной активностью.

Указанные свойства изучаемых нами ферментов свидетельствуют о том, что они являются редуктазами близкого спектра действия. 3 то же время следует отметить и определенные различия в их функционировании. В то время, как мет-Lb-редуктаза цитозоля клубеньков люпина имеет наибольшее сродство к легоглобину (именно легоглобин является для нее естественным субстратом), ферменты из бактероидов и клубеньковых бактерий лучше восстанавливают гемоглобин. Этот факт подтверждает наше мнение о том, что для бактериального и бактероидного ферментов легоглобин не является естественным субстратом. В то же время сходство бактсроидной и бактериальной редуктаз свидетельствует о том, что они представляют собой, по всей видимости, один и тот же фермент.

Обнаружение рслуктаз в других бактериях.

В связи с ('шаружением ферментов, обладающих мет-ЬЬ-редуктазной активностью, в бактериях рода Bradyrhizobium, представлялось интересным проверить наличие подобных ферментов у бактерий, существенно различающих!.л по физиологии и метаболизму. Для исследований были взяты бактерии Azotobacter vitirlandii, Bacillus mucilagcnosu и Esclwrichia coli. Бактерии Azotobacter -снободножннушне азотфнкгаторы. Они эффективно снязыпают азот (около 20 мг на 1 г использованного сахара), В. mucilagcnosus (олигонитрофнлы) относятся к так называемым силикатным бактериям. Нами они были выбраны в качестве объекта

исследования, так как хотя они не относятся к азотфиксаторам, местом их обитания, как и у клубеньковых и свободноживущнх азотфиксаторов, является почва.

Во всех исследованных бактериях нами были обнаружены ферменты, способные восстанавливать кислородпереносящие гемопротеиды:легоглобин, миоглобин и гемоглобин, то есть наличие подобных редуктаз не является особенностью, характерной только для клубеньковых бактерий рода Bradyrhizobium. Ферменты выделены и частично очищены.

Все исследованные бактериальные редуктазы являютсй флавопротеидами. Их активность ингибируется ПХМБ. Они имели различную молекулярную массу от 60000 до 125000 Да.

Для объяснения функций бактериальных редуктаз можно выдвинуть следущие предположения:

а) бактериальные редуктазы могут являться ферментами широкого спектра действия,

б) выделенные нами ферменты могут выполнять в бактериях функцию цитохром-редуктаз, так как такие редуктазы часто не обладают строгой специфичностью по отношению к акцепторам электронов, «

в) также вполне возможной функцией бактериальных редуктаз может быть восстановление бактериальных гемоглобинов.

В связи с этим следует отметить, что интерес исследователей к бактериальным редуктазам в последнее время резко возрос в связи с сообщениями об обнаружении в ряде бактерий гемоглобииподобных белков. Именно возможным наличием такой редуктазы объяснялось восстановленное состояние гемоглобина Vitreoscilln как в самой этой бактерии, так и в Е. coli при экспресии в ней этого гемоглобина (Dikshit, Webster, 1988; Dikshit et al., 1992). Такое же объяснение предложили и мы для аналогичных результатов, полученных при экспресии легоглобина люпина в клетках Е. coli (Sikorski et al., 1995).

ЭКСПРЕССИЯ Lbl ЛЮПИНА В КЛЕТКАХ Escherichia coli'

Селекция клона и пробы.

кДНК клон полной длины для Lbl из Lupinus luteus (846 пар оснований) был выделен из библиотеки кДНК люпина (Konieczny et al., 1987). Фрагмент HindlU длиной 754 пары оснований, состоящий из кодирующей области кДНК клона 1Ы,

был использован о качестве пробы (Konieczny, 1987). кДНК клон для Lbl был далее субклонирован в сайт Pstl плазмиды рК18.

In vitro амлификаиия. клонирование и экспрессия последовательности ДНК.

Нлазмида рК18, несущая кДНК lbl длиной 846 пар оснований и вставленная в сайт Pstl (pSP25), была использована как образец для копирования и амплификации методом PCR открытого читаемого фрагмента для белка Lbl.

использованием двух олигонуклеотидных праймеров. N праймер был сконструирован для построения сайта Ndel на 5'-конце гена 1Ы. С праймер был сконструирован для добавления к BamUl и двум терминирующим кодонам на З'-конце гена 1Ы. АмпЛИфицированный ген 1Ы размером 462 пары оснований был далее вставлен в плазмиду рЕТ-За путем прямого клонирования в рестрикционные сайты ВатШ и Ndel (Studier et al., 1990, Studier, Moffatt, 1986). Конструкт был введен в Е. coli штамм HMS174 для сохранения и препаративной очистки. Плазмида рЕТ-За, несущая ген 1Ы, была проверена путем секвенирования ДНК, с использованием метода терминации цепи (Sanger et al., 1977). Конструкт рЕТ-За/Ш в дальнейшем был вставлен в Е. coli штамм BL21(DE3)pLysS для оверэкспрессии. Трансформация проводилась с помощью метода СаС1г (Mandel, Higa, 1970). Молекулярпо-бнологнчсскнс процедуры проводились, как описано в (Sambrook et al., 1989).

Конструкт pET-3a//W позволил проводить экспрессию гена 1Ы под контролем промотора РНК-полимеразы Т7 после добавления IPTG к растущим клеткам (Studier et al., 1990).

Индукция гена 1Ы в BL21(DE3)pLysS при различных условиях была проанализирована методом SDS-электрофореза в 15% полиакриламидном геле. Рскомбпнантпыи бел(и; Lbl двигался в геле в той же зоне, что и белок Lbl из корневых клубеньков люпина и составлял значительную долю от всех бактериальных белков.

Очистка н характеристика лкгирсссиронаниого логоглобина.

Осажденные клетки Е. coli после .»кснресснн Lbl имели красно-коричневый цпег и бактериальный ли.чат также был красным, что характерно дли гем-iолержлщич белков.

Кодирующая область для белка Lb I была копирована и амплифицирована с

Спектральный анализ подтверждает, что бактериальный протопорфирип IX (непосредственный предшественник тема) используется для синтеза натинных гемоглобин-подобных белков в бактериальных системах экспрессии. Факт, что Lbl синтезируется в клетках Е. coli как гем-содержащий белок, согласуется с данными об экспрессии бактериального гемоглобина Vitreoscilla (Dikshit, Webster. 1988; Khosla, Bailey, 1988) и гемоглобина цианобактерии Nostoc (Potts et al., 1990).

Спектр оптического поглощения лизатов бактериальных IPTG индуцированных клеток (рис. 8Б) имел вид, характерный для гемопротеида (с максимумом поглощения 412 им в полосе Соре). Два пика с максимумом поглощения при 542 и 574 им соответствуют оксигенированной форме легоглобина, т.е. экспрессированный легоглобин был не только гем-содсржащнм, но и восстановленным. В целом спектр экспрессироваиого Lbl был близок спектру легоглобина из клубеньков люпина (рис. 8А, спектр суммарных растворимых белков корневых клубеньков люпина).

Мы полагаем, что легоглобин находился в физиологически активной восстановленной форме благодаря присутствию в клетках Е. coli описанною нами фермента, обладающего мет-ЬЬ-редуктазной активностью (Талызин с соавт., 1988).

Бактериальный белковый лизат, содержащий экспрессированный Lbl, был очищен в соответствии со схемой, включающей фракционирование сульфатм аммония, ион-обменную хроматографию па колонке с ДЕЛЕ-целдюдоюп и дальнейшую очистку с использованием FPLC: гель-фильтрацию па колонке с супсрозой 6 и две возможные ступени: ион-бмепная хроматографию на колонке Mono Q или хроматографию и обратной фазе на колонке Pro-Rp. Получении» гомогенный Lbl был затем использован для микросеквсннрованпя и Western blot анализа.

Экспрессированный LM был иммунохимнчески амивен и с моносиецифнчсскимн антителами против природного 1.1)1 и с антителами принт суммарных подулиной люпина. Анализ N-комцеиой последовательности подписи шла также подтверждает, что :жп1ресенронанный белок идентичен природному Lbl

Отметим, что в нашей работе была проведена первая онер и.еир'■ емч глобшюнои кДПК па высших растении.

а':

650 нм

Рис. 8. Спектры оптического поглощения образцов: А - суммарные растворимые белки клубеньков люпина, Б - суммарные белки лизата трансформированных клеток Е. coli, В - суммарные белки лизата нетрансформированных клеток.

ДЕЙСТВИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА СОСТОЯНИЕ ЛЕГОГЛОБИНА

И КИСЛОРОДНЫЙ РЕЖИМ В ИНТАКТНЫХ КЛУБЕНЬКАХ СОИ

Сродство легоглобина к кислороду при различных температурах.

Аликвота (2 мл) раствора Lb2+ (10 мМ) была помещена в пластиковую спектрофотометрическую кювету (1 см оптического пути), через которую был пропущен газ, содержащий различные р02. Чтобы предотвратить образование пузырьков на пути луча света спектрофотометра во время оксигенации Lb2+, в вертикальном положении рядом со стенкой кюветы вне пути луча света была помещена пластиковая перегородка (20 х 10 х 1 мм) с 3 отверстиями, каждое 2,5 мм в диаметре. Раствор Lb2+ был закрыт в кювете с помощью резиновой пробки с 2 трубками, которые позволяли газу входить и выходить из кюветы. Трубка для входа газа была расположена между перегородкой и стенкой кюветы, и поступающий газ проходил через раствор Lb2+ и диффундировал .через отверстие в перегон адке -в главную часть кюветы. Поступавший газ представлял из себя смесь, содержавшую от ЗхЮ"4 до 8х10"2 объемных %' кислорода и уравновешенную аргоном, свободным от кислорода. Смеси получали с помощью насосов Wosthoff (Bochum, Germany) тип NA 27/За. Аргон, свободный от кислорода, был получен путем пропускания коммерческого аргона через серию из 2 колб, каждая из которых содержала 30 мм 0.5 M раствора пирогаллола.

Равновесие между Lb и кисло; ">дом было получено для каждой р02 при каждой температуре (15, 20, 25°С). Спектр оксигенации Lb записывали в диапазоне 450 - 650 им, используя спектрофотометр со встроенным диодом (Spectronic 3000; Milton Roy, Rochester, NY). Температура раствора Lb поддерживалась с помощью термоэлектрического кюветодержателя. Спектры оксигенации отдельных растворов Lb из главной серии были записаны при каждой температуре. Для целей калибровки спектры чистых Lb2+, Lb3+, Lb02 были измерены при каждой температуре. Относительное соотношение Lb2+, Lb3*, Lb02 было рассчитано из запиеанмх спектров при каждой температуре с использованием Multicomponent Ana' sis Software (On-Line Instrument Systems, Inc., Bogart, GA).

Наша работа иперпые показывает, как температура влияет на сродспт соевого Lb к кислороду. Врезка на рис. 9 показывает кривые оксигенации LI) ил клубгнько» сои при 15, 20 и 25"С. Кривые оксигенации Lb при всех ..'Miirp.irvp.ix были

прямоугольными гиперболами и концентрация кислорода, при которой 50% Lb было в оксигенированной состоянии (Ке, нМ) была рассчитана из этих кривых в форме Лайнунвера-Берка (рис. 9). При 15, 20 и 25°С величины Ке были 44, 60 и 78 нМ кислорода соответственно. Изменение на 10 С приводит к изменению Ке в 1,77 раза - величина, близкая к данным, доложенным для других гемоглобинов (1,5-2,5; di Prisco et al., 1991).

Величины Ке, полученные в настоящей работе, были близки к величинам, ранее и-меренным для легоглобина сои, которые варьировали от 71 цМ при 25°С (Appleby, 1962) до 44 нМ при 16°С (Uheda, Syono ,1982). Величина 48 нМ при 20°С (Appleby et al., 1983) чаще всего цитируется и используется в расчетах Oi из FOL (Gibson et al., 1989; Becana, Klucas, 1992; Kuzma et al., 1993; Diaz del Castillo, Layzell, 1995). Различия в величинах Ке не связаны исключительно с действием температуры, по могут быть также связаны с чистотой использованных препаратов Lb и с возрастом клубеньков, из которых был получен Lb. Было показано (Appleby, 1984), что Lba, форма, доминантная в зрелых клубеньках сои, имеет более высокое сродство к кислороду, чем Lbc, форма, типичная для молодых клубеньков. 4-недельные растения, использованные для выделения Lb, скорее всего содержали Lba как доминантную форму.

Методы, использованные для измерения Ке, также могут влиять на полученные абсолютные величины. Как правило, величины Ке, полученные при исследовании равновесия Lb-Oj, выше, чем величины, полученные из кинетических исследовании, в которых константы связывания (К() и диссоциации (К2) для Lb л кислорода измерялись отдельно (Appleby, 1962; Imamura et al., 1961) и Ке рассчитывалась как К(/К2.

Измерение FOL метопом оксиметрин клубеньков.

Для измерения пропускания красного света (660 нм) и инфракрасного излучения (820 нм) через клубеньки был использован контролируемый компьютером клубеньковый окснметр (Morgan Instruments, Andover, MA). Источником света были фокусированные лазерные диоды. Это привело к уменьшению нарушений клубенька, связанных с ранее нспользованными светоиспускающими диодами, соединенными/с оптическим волокном (Kuzma et al., 1993). При оксигенировании легоглобина в . клубеньке происходит изменение пропускания красного света (660 нм) (Layzell et al.. tWO). Использование ПК излучения (820 нм) позволяло корректировать сигнал

I- <§ о

>д

х! 1

й-

Л'

400 800 У

г -» Л 'Г*'

[О^НМ <

0.15 0.2

0.25

1/Ю2], нМ"1

Рис. 9. Определение сродства легоглобина к кислороду при различных температурах. На вгрезке - кривые оксигенации.

§ га .

400

огЗОО-

8 200-Н;

б!

О! и.

100-

. ' Температура клубенька, "С

Рис. 10. изменение''доли пкенгениршмшюго легоглобина при быстрой (----) и медлешюГ (______) темн<рагурнпн обработке. Исходная температура 20"С.

пропускания для оптических изменений, не связанных с оксигенацией Lb (Denison, Layzell, 1991). FOL во время t (FOLt) была рассчитана с использованием уравнения 1 (Denison, Layzell, 1991):

где (R/IR)0 - соотношение пропускания, при 660 и 820 им полученное в атмосфере чистого азота, (R/IR)|oo - соотношение, полученное в атмосфере чистого кислорода, и (R/lK)t ■ соотношение, полученное в момент времени t. Oi во время t (Oit) была рассчитана из FOL, используя уравнение 2 (Layzell et al., 1990):

В опытах по быстрым изменениям температуры оксиметрические замеры делались непрерывно на каждом клубеньке в течение примерно 20 мин. В каждом замере клубенек вначале кратко выдерживали (30 с) в чистом азоте, затем в чистом кислороде и затем снова в чистом азоте перед возвращением клубенька в обычную воздушную атмосферу (Denison, Layzell, 1991). После достижения стабильного оптического пропускания в воздухе проводилась быстрая температурная обработка (2 мин.). Фииальая стандартная операция проводилась, когда величина пропускания при 660 нм в воздухе достигала новой стабильной величины.

В опытах по постепенным температурным изменениям использовался только один описаный выше стандартный окснметрический прием. Он был применен клубенькам из растений, подвергнутых температурной обработке в течение различного времени (6, 30 и 120 мин.). Продолжителы )сть каждой» окснметрического замера составляла примерно 3 мин. Ответ FOL и Oi на изменения температуры,

Было высказано предположение (Kuzma, Layzelj, 1994), что понижение температуры приводит к понижению дыхательной потребности клубенька, заставляв кислород аккумулироваться внутри инфицированных клеток, тем самым повышая FOL и Oi. Наоборот, повышение температуры клубенька повышает потребность клубенька в дыхании, тем самым вызывая у ¡еныиение FOL и Oi. Результаты данной работы подтверждают эту гипотезу, поскольку оксиметрические измерения

_ FOL * К " 1 - F0Lo

пока, .лвают, что FOL и Oi увеличиваются при понижении температуры и понижаются при ее возрастании.

Быстрая температурная обработка (меньше 2 мин. на 5°С) вызывает более сильное изменение FOL на градус, приводя к более высокой величине FOL при 15°С и более низкой величине FOL при 25°С, чем медленная температурная обработка (около 25 мин на 5°С) • (рис. 10). Эти данные предполагают, что механизм, ответственный за акклиматизацию клубеньков к изменениям температуры, не реагирует достаточно быстро, чтобы противодействовать быстрым температурным изменениям.

Обычно такие воздействия, как нарушения клубенька, перекрытие флоэмного сока, отделение клубенька и питание нитратами, которые понижают проницаемость клубенька, также понижают способность клубенька к дальнейшей регуляции Oi (Minchin et al., 1986; Hunt et al., 1987; Vessey et al., 1988; Sung et al., 1991). Это также может быть одной из причин, почему в клубеньках, подвергнутых быстрой температурной обработке, происходят такие большие изменения в FOL и Oi. Так как произошло воздействие на дыхательную потребность клубеньков в кислороде и изменилось Oi, нарушенные условия ограничивают их способность регулировать проницаемость к диффузии кислорода, что приводит к большим изменениям Oi в этих клубеньках, чем в подвергнутых медленным температурным воздействиям.

МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ СИТУАЦЬ.1 В ИНФИЦИРОВАННОЙ КЛЕТКЕ И В ЦЕЛОМ КЛУБЕНЬКЕ

До сих пор большинство математических моделей диффузии кислорода в клубеньках бобовых (Hunt étal., 1988) предсказывали, что концентрация кислорода в заполненных газом межклеточных пространствах центральной зоны (Os) близка к равновесию со средней концентрацией кислорода в инфицированных клетках (Oi). При заданной Oi менее 50 нМ в растворе и растворимости около 0,0.4, величины Os были оценены в диапазоне от 0,3 до 5,0 мкМ Oj в газоном фазе. Для сравнения, воздух (20,7 кПа 02 при длнленнн н I атм.) при 25"С содержит околи 8,75 мМ Oi, так чго величины Os были предсказаны менее чем 0,01 кНл ОНгдашк> и .luv* модельных рабоих (ПегЦегчеп, 1!)!И, Tluimiort et al.. 1!)!)1) было опублимщ.жи. чю роль инфицированной К.КЧКН и диффузии кне.юродл доХННЛ бы II. Ill р> ' ЧП1|»'И.| и

было предсказано, что величины Os могут быть существенно выше чем 5 мкМ О2. Эти модели имеют важное приложение для диффузии кислорода в клубеньках, поскольку они показывают, что центральная инфицированная область клубенька может играть более важную роль в регуляции диффузии кислорода и метаболизме клубенька, чем предполагалось ранее.

Для проверки этих гипотез нами были проведены модельные исследования как ситуации в инфицированной клетке, так и ситуации в клубеньке в целом. В качестве варнабе мото параметра в обоих случаях была взята температура, так как это позволяло как рассмотреть взаимосвязь между различными физико-химическими и биохимическими параметрами, так и связать данные, полученные в результате моделирования, с данными, полученными экспериментально.

Рис. 11 показывает путь диффузии кислорода от ризосферы до места его потребления внутри бактероидов инфицированной клетки. Показанные на рисунке символы представляют физические и биохимические параметры, которые влияют на диффузию кислорода. Растворимость кислорода в цитоплазме клетки и концентрация кислорода в воздухе при 1 атм. являются единственными параметрами, которые больше при 15, чем при 25°С. Все остальные рассчитанные величины чуть ниже (коеффициенты диффузии для кислорода и LbOj) или намного ниже (Kstb, KsR, Vmß) при 15, чем при 25°С.

Молель диффузии кислорода в инфицированной клетке.

Данные о доле оксигенированного легоглобина (FOL) и о концентрации кислорода (Oi), полученные методом оксиметрии с использованием значений сродства легоглобина к кислороду, являются усредненными для всей инфицированной клетки. В то же время представляет большой интерес изменение как этих, так и других связанных с ними параметров уже в самой клетке.

Диффузия кислорода от заполненных газом пространств в центральной зоне клубенька к инфицированным клеткам была моделирована для исследованых температур (15, 20 и 25°С) с использованием математического метода (Thumfort et al., 1994). В модели Тумфорта принимается, что центральная зона клубенька состоит из упакованных одинаковых кубических клеток с воздушными пространствами в до11 () ребер, а не сферических клеток, как в предыдущих моделях диффузии кислорода g , инфицированных клетках. Модель включает установление концентрации кислороду (область от 0.5 до 20 нМ) для положения в клетке, которое будет самым дальним от

Симбносомы с бактероидами

Рис. 11. Поток диффузии кислорода из ризосферы к месту его потребления в бактероидах инфицированной клетки. Обозначены физические и биохимические параметры, на которые влияет температура и которые учитывались при математическом моделировании:

растворимость О2 («о»), косффшшенгы диффузии Ог (Пог) и И)02 концентрация кислорода, при которой 50°» И» связано с 02 (^ц,), макгнмлльнмй уровень дыхании инфицированной клетки (Ушц) и кажущаяся Кш(02) для дыхания

межклеточного газового пространства (т.е. внутренняя Oi). Затем модель использует уравнения для диффузии и кинетики дыхания, чтобы определить для постоянного уровня дыхания концентрацию LbOj и концентрацию свободного кислорода в этом положении и в каждом из 400 "слоев", которые рассматриваются существующими между внутренней точкой инфицированной клетки и заполненным газом мс.» I..к-точным пространством. Эти расчеты были проведены для значений Oi от 0.5 ■о 20 иМ с шагом 0.5 нМ.

Дчя каждой Oi была полученна информация о предполагаемых профилях концентраций Oj и LbOj через инфицированную клетку. Эта информация былп п. пользована для расчета средней FOL в сплошной клетке (FOLavg), средней концентрации кислорода в сплошной клетке, общего уровня дыхания инфицированной клетки и эффективного соротивления инфицированной клетки к диффузии кислорода от газового пространства к зонам дыхания внутри клетки. Кроме того из концентрации кислорода во внешнем слое клетки была рассчитана концентрация кислорода в газовом пространстве (Os),

Предсказания модели инфицированной клетки.

Данные нашей работы подтверждают предсказания, сделанные в работе (Thumfort et al., 1994). Действительно, мы получаем как градиент концентрации кислорода в инфицированной клетке, так и связанный с ним градиент доли оксигеннрованного легоглобина (рис. 12). Соответственно при продвижении внутрь инфицированной клетки изменяется> соотношение потоков диффузии свободного кислорода и кислорода, связанного с легоглобином. р!<оло газовых пространств большая доля Lb могла быть связана с Oj, вызывая частичный или полный коллапс Lb-облегченный диффузии в этой области. Поток Lb02 возрастал вдоль направления от газового пространства, достигая максимальной величины на некоторой ограниченной дисстанции, и понижался по направлению к центру клетки. Около пространства должно быть увеличение градиента свободного кислорода, чтобы поддерживать общик поток кислорода и, следовательно, увеличение эффективной сопротивления клетки к диффузии кислорода (рис. 13). Такие данные был'ц. получены для всех исследованных температур. Однако, при 15°С максимум потока диффузии LbOj находится ближе к газовому пространству, чем при 25°С. Например, • при внутренней концентрации кислорода (.Oi), равной 10 нМ, максимум потока

Рис 12 Граднсшм к.шцеифашш ки,-.юрода Ш. лп.ш »Kc-inri.Hjx,- много д< юг л./,и.и :ii) и урпшш дыхании к инфицированном к.кчкс (И).

Ю ... . 20 .. .30

Расстояние от поверхности, мкм Рис. 13. Потоки диффузии 02 и ЬЬ02 в инфицированной клетке

Lb02 был па расстоянии 2,3 мкм от газового пространства при 15°С и на расстоянии 4,4 мкм при 25°С.

Необходимо заметить, что при величинах Oi, заданных в области от 0,5 до 20 нМ 02, предсказанные величины FOLavg (от 0,05 до 0,65) были близки к величинам FOL, которые были измерены методом оксиметрни клубенька в активно фиксирующих азот клубеньках бобовых (Denison, Layzell, 1991). Тем самым можно отметить, что данные, полученные нами с помощью математического моделирования, соответствуют экспериментальным данным.

Наши опыты с клубеньками сои показали, что на FOL сильно влияет температура. В соевых клубеньках, выдержанных при 15°С, величины FOL были намного выше (0,65+0,06) чем в клубеньках, выдержанных при 25°С (0,27+0,03). Чтобы выяснить, насколько вызываемые температурой изменения сопротивления диффузии 02 могут быть приняты во внимание для учета изменений в физических и биохимических процессах в связи с необходимостью физиологической рефляции сопротивления диффузии, мы пропели модельные исследования случаев, которые дают величину FOLavg «• 0,27 при 25°С и 0,65 при 15°С.

Модель предсказывает, что при измеренных уровнях FOL уровень дыхания инфицированной клетки при 15°С будет 87% от уровня при 25°С, несмотря на то, что средняя концентрация кислорода в инфицированной клетке в 11 раз выше при 15°С (839 нМ), чем при 25"С (77 пМ).

Интересно отметить, что когд: Ol была рассчитана непосредственно ил измеренной FOL при 25 и 15"С, используя стандартное уравнение оксиметрни, эта величина Ol была слегка ниже при 25 и заметно ниже при 15°С, чем величины Oi, рассчитанные с помощью модели Тумфорта для тех же самых значений FOL. Причшюи зтого различия является то, что прямой расчет Oi из измеренной FOL допускал, что FOL одинакова на протяжении всей ннфицнровашюй клетки, п то время как модель Тумфорга предполагает большие градиенты FOL вплоть до LI), насыщенного кислородом (т.е. FOL=l), около газовых пространств. Следовательно, модель предсказывает, что большая часть свободного кислорода н к .и .кс локализована в относительно .маленьком обьеме. непосредственно примыкающем к межклеточным газовым пространствам, И средняя концентрация мкморпда и инфицированной к.'кчке зиачнилыт выше концентрации в щ-иrjn- Поскольку болмшшемю (ммгропдои локали ювано и цппрс 'инфицированных к.кток

(Bergersen, Goodchild, 1973), "типичный" бактероид скорее всего будет находится при Oi, которая намного ниже, чем средняя концентрация кислорода в инфицированной клетке, рассчитанная из модели Тумфорта, возможно более соответствующей Oi, рассчитанной прямо из измеренной FOL. Тем самым оба расчета Oi могут быть физиологически уместны.

Было также рассчитано, что концентрация кислорода в межклеточном газовом пространстве (Os) при 15°С в 3,4 раза выше (470 мкМ) чем при 25°С (140 мкМ). Эта более высокая Os и более низкое дыхание инфицированной клетки при 15°С согласуется с предсказанием о в 12 раз более высоком сопротивлении к диффузии кислорода при 15°С (4,48 с/мм) чем при 25°С (0,369 с/мм). На основании полученных данных кажется, что, как минимум, часть наблюдаемого увеличения сопротивления клубенька к диффузии кислорода при понижении температуры (Kuzma, Layzell, 1994, Weisz, Sinclair, 1988) может быть просто результатом влияния температуры на параметры, влияющих на диффузию кислорода.

Сопротивление кортикального барьера диффузии.

Модель инфицированной клетки, описанная выше, была использована для

предсказания концентрации кислорода в газовой фазе в центральной зоне (Os), которая существовала бы в клубеньках, имеющих уровни FOLavg, эквивалентные таковым, измеренным методом оксиметрии клубенька при 15 и 25°С. Эти значения Os были использованы в кортикальной модели диффузии кислорода, основанной на законе диффузии Фика, для расчета сопротивления кортикального -барьера диффузии (Sheehy et al., 1983, Minchin et.al., 1986). Уравнение 3: _

о - 0e-0s

^CDB ~ p

где Oe является концентрацией кислорода в газовой фазе ризосферы и F является потоком кислорода через кортикальный барьер диффузии.

Эта модель предполагает, что через радиус центральной зоны нет градиента Os или, если градиент существует, то величина этого градиента незначительна по сравнен: t с величиной градиента через кортикальный барьер диффузии.

Величины F в уравнении 3 были "чссчитаны из уровней выделения COj, измеренных, в клубеньках сои путем газового обмена, приведенных к уровням потребления кислорода центральной зоной клубенька (Layzell et al., 1988).

Величина сопротивления кортикального барьера диффузии была рассчитана для барьера диффузии с двумя типами физических свойств, которые требовали двух моделей. "Модель закрытой норы" рассматривает диффузионный барьер как протяженный водный барьер, глубина которого может различаеться. Глубина барьера L рассчитывается но уравнению 4;,

L = Rcpb

где йог является растворимостью кислорода в цитоплазме клетки по отношению к с

воздуху и D02 является коеффициентом диффузии кислорода в цитоплазме клетки (Gaito et al„ 1989).

Альтернативная "модель открытой поры " рассматривает барьер диффузии как протяженный водный барьер с фиксированной глубиной (150 мкМ), но в котором варьирует доля его площади поверхности (ß), которая занята ра; киыю-ориснтиропаниыми каналами, заполненными воздухом. Для нахождения ß используется уравнение 5:

R ; l_

где Do2 " коеффицнент диффузии кислорода в воздухе (Gaito et al., 1989).

Влнянис температуры на сопротивление кортикального барьера диффузии-

Было показано, что (физические параметры, изменение которых с температурой влияет на диффузию кислорода, влияют и на сопротивление кортикального барьера диффузии (Redl)).

Величины Redl) были определены из уравнения 3, с использованием рассчитанных значений 1; и величин Os, определенных для 25 или 15°С и модели инфицированной клетки. Redl) оказалось н 2,4 раза выше при 15"С (555 с мм), чем при 2~>' С (232 с мм). Величины Os, использованные н :>тнх расчетах (от И0 до 170 чкМ О.) сильно отличались от внешних концентраций кнгло|х>да (от 8-150 до 87.">0 мкМ). моному различия и Os мало влияло на различия, наблюдаемые н предсказанных ие.шчппах Redl) Точнее, ра пичня н Rull» при .тух кчмераг. p.ix

были почти исключительно связаны с различиями в уровнях дыхания при этих температурах.

Чтобы определить, может ли влияние температуры на физические свойства диффузии кислорода объяснять оцененные различия в Rcdb при 25 и 15°С, кортикальному барьеру диффузии были приданы физические свойства как модели закрытой поры, так и модели открытой поры. Как видно из уравнений "4 и 5, на эти модели влияют температурно-зависимые параметры диффузии кислорода.

Показано, что влияние этих физических параметров на Rcdb будет зависеть от структуры кортикального барьера диффузии. В случае структуры закрытой поры физические параметры диффузии кислорода будут препятствовать (на 2,6 %) увеличению сопротивления при 15°С по сравнению с 25°С. Это связано с тем, что растворимость кислорода в воде возрастает при понижении температуры и это более чем компенсирует сопутствующее понижение коэффициента диффузии кислорода в воде.

Наоборот, если кортикальный барьер диффузии имеет структуру открытой поры, физические параметры диффузии кислорода будут способствовать (на 7,7%) увеличению сопротивления при 15°С по сравнению с 25°С. Это молено связать с фактом, что со структурой открытой поры большая часть диффузии кислорода вдет через газовые поры и сопротивление диффузии будет больше определяться коэффициентом диффузии кислорода в воздухе (который ниже при 15, чем при 25°С), чем растворимостью кислорода в воде.

В обоих случаях влияние исследованных физических параметров на Rcdb является небольшим (меньше 8%) и не может объяснить влияние температуры на сопротивление кортикального барьера диффузии. То есть мы можем сделать вывод, что кортикальный барьер диффузии является физиологически, а не физически регулируемым.

Сравнение Rcdb и Rie (сопротивление инфицированной клетки).

Установленные величины Rcdb (232 и 555 с/мм при 25 и 15°С соответственно), были в 629 и 124 раза выше, чем величины Rie, рассчитанные для" тех же температур. Поэтому, даже хотя Rie в 12 раз выше при 15, чем при 25°С, 3io изменение в сопротивлении дает лишь небольшой вклад в общее сопротивление ' клчбенька к. диффузии кислорода. Результаты моделирования показывают, что кора i..i\ бемька является местом главного контроля сопротивления клубенька к диффузии

кислопода. Инфицированная клетка дает не более \% от общей величины сопротивления. Тем не менее инфицированные клетки могут играть важную роль в тонкой регуляции их концентрации кислорода и уровня метаболизма. Например, модель инфицированной клетки показывает, что эти клетки могут быть способны стабилизировать свою концентрацию кислорода и уровень метаболизма в ответ на большие изменения и в концентрации кислорода в пространстве и в температуре клубенька.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании полученных результатов и с учетом литературных данных мы можем описать последовательность изменения кислородных условий в различных зонах клубенька с учетом всех этапов регуляции этих условий. Первое и основное снижение парциального давления кислорода. происходит при пере1 .ченни физиологического барьера газовой диффузии, находящегося во внутреннем кортексе, независимо от того, какую структуру (открытой или закрытой поры) он имеет в данный момент. Однако концентрация кислорода во внешней зоне инфицированной клетки, примыкающей к межклеточным газовым пространствам, становится равной не 10 нМ, как предполагалось ранее, а, возможно, несколько мкМ. Дальнейшее понижение концентрации кислорода происходит уже в самой инфицированной клетке. В связи с этим в инфицированной клетке существует градиент как концентрации кислорода, так и доли оксигеиированиого легоглобина. Указанная выше концентрация кислорода около 10 нМ достигается лишь в центральной, бактероидной зоне инфицированной клетки (Рис. 14). В этой зоне кислород поступает к бактероидам (точнее, к симбносомам - образованиям, включающим как сами бактероиды, так и окружающие их перибактсронднос пространство и псрибактсрондную мембрану) в связанном с легоглобииом состоянии, причем возможность легоглобина выполнять эту свою функцию обеспечивается взаимодействием различных процессов с его участием. В первую очередь ело. от отметить процесс ферментативного восстановления легоглобина, катализируемый метлегоглобипредуктазой, поскольку легоглобин способен снязывать кнсло|х)д лишь и воссстанонлеином состоянии. Благодаря согласованному протеканию н<ех

Инфицированные клетки.

Внешняя кора

[02]. •! 10 мМ4

1 мМ ЮОмкМ

10 мкМ 1 мкМ

100 нМ ЮнМ-

1 нМ

Рис. 14. Изменеяиие концентрации кислорода при его движении из ризосферы к а ямошиш (__). (-----)- прежние представления.

упомячутых процессов в клубеньках поддерживаются кислородные условия, оптимальные для процесса симбиотической фиксации азота.

ВЫВОДЫ

1. Впервые получена в гомогенном состоянии метлегоглобинредуктаза цитозоля клубеньков люпина. Фермент является флавопротскдом с молекулярной массой 62 ООО Да. Наибольшее сродство метлегоглобинредуктаза проявляет к легоглобнну. Метлегоглобинредуктаза является белком растительного происхождения, но не является нодулином. Метлегоглобинредуктаза цитозоля клубеньков сои по свойствам аналогична ферменту из клубеньков люпина, за исключением молекулярной массы, которая для редуктазы нз сон равна 95 ООО Да.

2. Изучено взаимодействие между процессами с участием легоглобина, предложена схема такого взаимодействия. Показано, что фермента гивное восстановление является для легоглобина основным. Установлено, что ферментативное восстановление легоглобина может проходить как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Впервые описан процесс спонтанной деоксигенации легоглобина, предложена его возможная роль в клубеньках in vivo.

3. Из бактероидов клубеньков люпина и бактерий Bradyrhiiobium lupini впервые выделен и получен в гомогенном состоянии фермент, обладающий метлегоглобинредуктазной активность' . Фермент является флатпротеидом с молекулярной массой 85 ООО Да. Показано наличие аналогичных редуктаз в некоторых других бактериях.

4. Впервые проведена экспрессия гена легоглобина I люпина в клетках Е. coli. Продуктом экспрессии явился нормальный гем-содержащий физиологически активный легоглобин, идентичный легоглобину клубеньков люпина.

5. Определено сродство легоглобина сои к кислороду при физиологических температурах 15:25°С. Установлено, что сродство увеличивается при понижении температуры. Показано, ' что изменение доли окенгеннрованного легоглобина и концентрации кислорода в инфнциронаниых клетках при изменении температуры коррелирует с изменением сродства легоглобина к кислороду.

6. Проведено математическое моделирование 'кислородных услоыт и целом клубеньке с одновременным использованием моделей, ониемнлюшпх как ситуацию и

ситуацию в инфицированной клетке, так и функционирование кортикального барьера диффузии. Подтверждена гипотеза, что кортикальный барьер газовой диффузии понижает кон ;нтрацию кислорода до более высокой величины, чем предполагалось ранее, а окончательное уменьшение происходит уже в самой инфицированеной клетке. Показано, что хотя доля инфицированной клетки в общем понижении концентрации кислорода составляет не более 1%, она важна для тонкой регуляции последнего этапа.

По материалам диссертации опубликовано 64 печатных работа. Основное содержание отражено в следующих публикациях:

1. Мелик-Саркисян С.С., Баширова Н.Ф., Топунов А.Ф. Метлегоглобинредуктаза и ее роль в азотфиксации. // В кн.: IV Всесоюзный биохимический сгезд. Тез. науч. сообщ. М.: Наука. 1979. Т. 1. С.259.

2. Топунов А.Ф., Мелик-Саркисян С.С., Лысенко Л.А., Карпиленко Т.П., Кретович В.Л. Метлегоглобинредуктаза клубеньков люпина. Некоторые свойства. // Биохимия. 1980. Т.45. N П. С.2053-2058.

3. Тихомирова А.И., Мелик-Саркисян С.С., Топунов А.Ф., Лысенко Л.А., Кретович В.Л. Флавиновые оксидоредуктазы клубеньков люпина. // Прикл. биохим. и микроб ¡32. Т.18. N 1. С.125-131.

4. Топунов Мелик-Саркисян С.С., Лысенко Л.А., Кретович В.Л.. Свойства метлегоглобинредуктазы клубеньков люпина. // Биохимия. 1982. Т.47. N 3. С.442-445.

5. Kretovich W.L., Melik-Sarkissyan S.S., Bashirova N.F. Topunov A.F. Enzymatic reduction of leghemoglobin in lupin nodules. // J. Appl. Biochem. 1982. V.4. Ы 2. P.209-217.

6. Топунов А.Ф., Тихомирова А.И., Лысенко Л.А. Метлегоглобинредуктаза клубеньков люпина. //В кн.: Биологическая фиксация молекулярного азота. Ки^в: Наукова думка. 1983. С.177-179.

7 Topunov A.F., Golubeva L I-, Aseeva K.B., Kretovich W

Met leghemoglobin reductase of lupin and --oybean nodules. // In: 16th Meeting of •

Federation of European Biochemical Societies. Abstracts. Moscow. 1984. P.236.

8. Topunov A.F., Golubeva L.I. Metleghemoglobln reductase - the enzyme which reduces oxidized leghemoglobin. // In: Plant Metabolism Regulation. Sofia. 1984. P.178-181.

9. Топунов А.Ф., Голубева Л.И., Сварадж К., Кретович В.Л. Метлегоглобинредуктаза и цитохром-с-редуктаза клубеньков сои. // Доклады АН СССР. 1985. Т.281. N5. С. 1258-1261.

10. Топунов А.Ф., Голубева Л.И., Асеева К.Б. Метлегоглобинредуктаза и ферментативное восстановление легоглобина в клубеньках бобовых. // В кн.: V Всесоюзный биохимический съезд. Тез. стевд. сообщ. М.: Наука. 1986. С.341-342.

11. Сварадж К., Топунов А.Ф., Голубева Л.И., Кретович В.Л. Влияние водного стресса на ферментативное восстановление легоглобина в клубеньках сои. // Физиол. растений. 1986. Т.ЗЗ. N 3. С.87-92.

12. Топунов А.Ф., Голубева Л.И., Осокян П.Л., Осокина М.В., Кретович

B.Л. Исследование с использованием ЭВМ процесса ферментативного восстановления легоглобина. // Докл. АН СССР. 1986. Т.289. N 1. С.236-239.

13. Голубева Л.И., Топунов А.Ф., Талызин В.В., Кретович В.Л. Взаимодействие метлегоглобинредуктазы шггозоля клубеньков люпина с кислородпереносящими гемопротеидами. // Докл. АН СССР. 1987. Т.294. N 6.

C. 1489-1492.

14. Топунов А.Ф. Легоглобин - кислородпереносящий гемопротеид клубеньков бобовых. // В кн.: »-готи науки и техники. Сер. Биологическая химия. М.: ВИНИТИ. 1987. Т.23. С.119-149.

15. Топунов А.Ф., Талызин В.В., Чекасииа Е.В., Кретович В.Л. Метлегоглобинредуктазная активность бактерий Rhiiobium, выращенных в свободной культуре. // Докл. АН СССР. 1987. Т.296. N 6. С.1501-1504.

16. Кретович В.Л., Топунов А.Ф. Ферментативное восстановление фитоглобина. // В кн.: В.Л.Кретович. Усвоение и метаболизм азота у растений. М.: Наука. 1987, С.78-85.

17. Талыми В.В., Топунов А.Ф.. Баширова Н.Ф., Кретович В.Л. Бактериальные редуктазы, восстанавливающие кислородиерсносяшис гемонротсилы. // Докл. АН СССР. 1988. Т.ЗОЗ. N 4. С. 1011-1012.

18. Голубева Л.И., Топунов А.Ф., Гончарова С.С., Асеева К.Б., Кретович В.Л. Получение и свойства гомогенного препарата метлегоглобинредуктазы цитозоля клубеньков люпина. // Биохимия. 1988. Т.53. N 10. С.1712-1717.

19. Topunov A.F., Talyzin V.V., Golubeva L.L, Kretovich W.L. Leghemoglobin and its reduction in lupin root nodules. // In: Proc. 5th international Lupin Conference. Poznan: PWRiL. 1988. P.651-654.

20. Топунов А.Ф. Влияние нитратов на состояние легоглобина в клубеньках бобовыл. // В кн.: Тез. докл. Всесоюз. конф. "Экологические проблемы накопления нитратов в окружающей среде". Пущино. 1989. С.114.

21. Топунов А.Ф., Голубева Л.И. Редуктазы, восстанавливающие кислородпереносящие гемопротеиды: гемоглобин, тютлобин и легоглобин. // В mi • Успехи биологической химии. М.: Наука. 1989. Т.ЗО. С.239-252.

22. Баширова Н.Ф., Топунов А.Ф., Талызин В.В., Кретович В.Л. Деоксигенация легоглобина и ее возможная роль в регуляции кислородного режима и клубеньках бобовых. // Дохл. АН СССР. 1990. Т.310. N5. С.1249-1252.

23. Топунов А.Ф., Шибяк-Стружицка У., Монджак Ц.Дж., Талызин В.В., Легоцкий А.Б., Кретович В.Л. Метлегоглобинредуктаза цитоголя клубеньков люпина является белком растительного происхождения, но не является нодулином. // Докл. АН СССР. 1990. Т.311. N5. С.1265-1267.

24. Тонунов А.Ф., Жабаева М.У., Кретович В.Л. Схема функционирования фитоглобина в клубеньках бобовых. Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН. М. 1992. (Рук. деп. в ВИНИТИ 09.04.92 N 1211-В92 Дел.). С.1-10.

25. Taly; 1 V., Bashirova N., Topunov A. Reductases of Bradyrhizobium bacteria and bacteroids reducing oxygen-binding hemoproteins. // In: VIII Eastern Europ'-Symp. on Biological Nitrogen Fixation. Nitrogenfix-92. Abstracts. Saratov. 1992. P.54.

26. Bashirova N., Talyzin V., Topunov A. Deoxygenation of leghemoglobin and its possible role in symbiotic nitrogen-fixing system of legume plants. // In: VIII Eastern Europe Symp. on Biological Nitrogen Fixation. Nitrogenfix-92. Abstracts. Saratov. 1992. P.54.

Sikorski M.M., Topunov A.F., Domaradzka A., Strozycki P. Ekspr. ja . sekweucji kodujacej genu leghemoglobiny I z Lupinus luteus (L.) var. Ventus w ukladzie bakterijnym pod kontrola,promotora T7 RNA Polimerazy. // In: XXIX Zjazd

Polsk'-go towarzystwa biochemicznego. Streszczenle refer, i komunik. zjazdowych. Wroclaw. 1993. S.295.

28. Topunov A.F., Sikorskl M.M., Gavel O.Yu., Legocki A.B. A molecular approach to the study of the role of leghemoglobin in nodules. // In: Proc. Canad. Soc. Plant Physiol. Kingston. 1993. V.37. N 1. Abst.37.

29. Топуиоа А.Ф. Функционирование фнтоглобина в клубеньках бобовых и регуляция кислородного режима. // Прикл. Биохим. и Ми,.робиол. 1994. Т.ЗО. N 1. С.5-20.

30. Sikorskl М.М., Topunov A.F., Szlagowska А.Е., Swiderski M.R., Str&ycki P.M., Vorgias C.E., Wilson K.S., Legocki A.B. Expression of leghemoglobin cDNA's of Lupinus luteus in Escherichia coli and purification of the recombinant proteins. // In: Proc. 1st European Nitrogen Fixation Conference. Szeged: Officina Press. 1994. P.341.

31. Гопунов А.Ф. Легоглобин и его роль в регуляции кислородного режима в азотфиксирующих клубеньках бобовых. // Биохимия. 1995. Т.60. N 1. С.66 .4.

32. Kuzma М.М., Topunov А.F., Layzell D.B. Effects of temperature on infected cell concentration and adenylate levels in attached soybean nodules. // Plant Physiol. 1995. V.107. N4. P.1209-1216.

33. Talyzin V.V., Bashirova N.F., Chekasina E.V., Topunov A.F. Reductases from nodule bacteria and bacteroids, capable of reducing leghemoglobin. // In: X Intern. Congress on Biological Nitrogen Fixation. Abstracts volume. S-Pb. 1995. Abstr.384.

34. Bashirova N.F., Talyzin V.V., Topunov A.F. Deoxygenation of leghemoglobin without bacteroids and its possible role in supporting of oxygen concentration in bacteroid zone of lupine nodules. // In: X Intern. Congress on Biological Nitrogen Fixation. Abstracts volume. S-Pb. 1995. Abstr.385.

35. Sikorski M.M., Topunov A.F., Strozycki P., Vorgias C.E., Wilson K.S., Legocki A.B. Cloning and expression of plant leghemoglobin cDNA of Lupinus ¡ulcus in Escherichia coli and purification of the recombinant protein. // Plant Sei. 1995. V.108. N I. P. 109-117.

36. Topunov A.F., Kuzma M.M., Thumfort P.P., Atkins C.A.. by/ell D.H. Effects of temperature on leghemoglobin functioning and oxygen conditions in nodules // In: Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications. Dordrecht et al ■ Kluwer Acad. Р11Ы. 1995. P.603.

37. Kuzma M.M., Topunov A.F., Thumfort P.P., Atkins C.A., Layzell D.B. Temperature effects on the resistance to 02 diffusion in soybean nodules. // Physiologia Plantarum. 1996. (in press).

Утверждено к печати Институтом биохимии им.А.Н.Баха Российской Академии Наук

Подписано в печать 11 апреля 1996 г. Формат 60x84 1/16 Объем 3 п.л.

Тираж 100 экз. - Цена договорная Заказ N12

Участок оперативной полиграфии Института этнологии и антропологии 117334 Москва, Ленинский проспект, 32А

Информация о работе

Топунов, Алексей Федорович
доктора биологических наук
Москва, 1996
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Функционирование легоглобина и регуляция кислородного режима в клубеньках бобовых ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Функционирование легоглобина и регуляция кислородного режима в клубеньках бобовых"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функционирование легоглобина и регуляция кислородного режима в клубеньках бобовых
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия