Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль кооперативного эффекта глюкокортикоидов и липопротеидов высокой плотности в активации хроматина печени крыс при стрессе

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль кооперативного эффекта глюкокортикоидов и липопротеидов высокой плотности в активации хроматина печени крыс при стрессе"

Б ОД

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК 3 ДПР '¡£03 СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи

Свечникова Ирина Григорьевна

РОЛЬ КООПЕРАТИВНОГО ЭФФЕКТА ГЖКОКОРТИКОИДОВ И ЛИШПРОТЕИДОВ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ В АКТИВАЦИИ ХРОМАТИНА ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ СТРЕССЕ.

03. 00. 04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1993

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии клетки Института биохимии СО РАМН.

Научный руководитель - академик РАМН, профессор Л. Е. Панин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Е а Дыгадо

кандидат биологических наук Т. К. Климентьева

Ведущая организация - Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита диссертации состоится 1993 г. в^часов

на заседании специализированного Ученого Совета К 001.37.01 Института биохимии СО РАМН по адресу: 630117 Новосибирск, ух Академика Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии СО РАМН

Автореферат разослан ¿¿-^£¿4993 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат медицинских наук ц . _ т- Г- Филатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов приспособления человека и животных к меняющимся условиям окружающей среды имеет первостепенное значение для современной биологии и медицины. В процессе адаптации организма к воздействию стрессорных факторов важным и необходимым условием является вовлечение генетического аппарата клеток в реакции, направленные на восстановление и поддержание гомеостаза. Это в первую очередь относится к печени. Однако, механизм активации хроматина в печени, связанный с усилением адаптивных биосинтетических и пролиферативных процессов, остается во многом не ясным. Несмотря на большой прогресс в изучении действия адаптивных гормонов, тонкие, интимные механизмы влияния их на геном не ясны. Обнаружены рецепторы стероидных гормонов и различные медиаторы действия пептидных гормонов и катехоламинов ( Sutherland, Rail, 1960; Beato, Fe i gel son, 1972; Litwack et al., 1973). Показана транслокация гормон-рецепторных комплексов в ядро и их взаимодействие с акцепторными участками хроматина ( Beato et al. , 1973 ). Однако, сама природа этих акцепторных участков, как и механизм дерепрессии определенных генов широко дискутируются.

Особый интерес в этом плане представляет изучение ядерных белков хроматина, и в частности, гистонов. Являясь белками основного характера, гистоны связываются с ДНК, образуя нуклеосо-мы - структурную основу хроматина - и репрессируют считывание матрицы РНК-полимеразой ( Huang, Bonner, 1962 ). Различные химические модификации гистонов, наблюдаемые в активном хроматине, дестабилизируют нуклеосомы и способствуют процессу транскрипции генов.

Особого внимания заслуживает изучение этих процессов в условиях функционального напряжения организма. В этом плане несомненное значение приобретают различные гормональные и метаболические факторы, которые оказывают свое регуляторное воздействие на генетический аппарат клетки, изменяя спектр ядерных белков. При стрессе происходит гормонально-метаболическая перестройка организма, заключающаяся в повышении продукции глюко-кортикоидов и катехоламинов, снижении содержания инсулина При

некоторых видах стресса показан сдвиг липопротеидцого спектра плазмы крови в сторону липопротеидов высокой плотности С ЛПБП ) ( Панин Л.Е., 1983 ). При атом в печени запускается синтез ключевых ферментов обмена аминокислот, глкконеогенеза, а также других белков, имеющих адаптивное значение. Липопротеиды высокой плотности,- глюкокортикоиды и катехоламины ( последние играют потенцирующую роль по отношению к первым двум физиологически активным соединениям ) кооперативным образом осуществляют индукцию синтеза глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы (Панин Л.Е. , "Филатова Т. Г., 1986), фосфознолпируваткарбоксикиназы, липопротеидов низкой и очень низкой плотности и, вероятно, многих других белков. Данный эффект получил свое подтверждение как на переживающих срезах печени, так и в опытах in vivo ( Панин Л. Е. , 1983-, Панин JLE., Маянская а,Е , 1987;.

Однако, механизм проявления кооперативного эффекта глюко-кортикоидов и ЛПВП на уровне индукции генов не изучен до конца. Не известно, каким образом осуществляется активация хроматина в условиях указанной эндокринно-метаболической перестройки организма, происходящей при стрессе.

Известно, что механизм действия гормонов в. тканях опосредован, как правило, рядом промежуточных мессенджеров, среди которых ведущее место принадлежит циклическим нуклеотидам. Однако, не исключено участие в регуляции и других посредников, модулирующих действие гормонов. К ним следует отнести и липопротеиды крови. В литературе обсуждается также возможность участия лизо-сомального аппарата клетки в механизме действия гормонов (Szego, 1974 ). Важное значение приобретают лизосомы в условиях функционального напряжения организма. В таких случаях лизосомы, кроме выполнения обычной для них функции, связанной с внутриклеточным пищеварением, выступают как модуляторы действия адаптивных гормонов. Однако, эта роль лизосом до сих пор остается мало изученной.

Дедь исследования. Изучить роль глюкокортикоидов и ЛПВП в активации хроматина при стрессе.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. В опытах in vivo на моделях интенсивной физической нагрузки и частичной гепатэктомии исследовать изменения матричной

активности хроматина.

2. Изучить влияние адаптивных гормонов и ЛПВП на матричную активность хроматина в переживающих срезах печени крыс.

3. Оценить вклад различных подклассов ЛПВП (ЛПЕГЕ и ЛПБПЗ) в активацию хроматина в условиях, моделирующих зндокринно-метаболические сдвиги при стрессе.

4. Исследовать роль лизосомального аппарата печени в развитии кооперативного эффекта гидрокортизона и ЛПВП на уровне хроматина.

5. Изучить изменение спектра гистоновых белков хроматина печени крыс при стрессе и в условиях in vitro, моделирующих усиление экспрессии генов.

Научная новизна. Раскрыт механизм кооперативного эффекта гидрокортизона и ЛПВП на активацию хроматина клеток печени в условиях, моделирующих гормонально-метаболические сдвиги при стрессе.

Показано, что главными составляющими кооперативного эффекта адаптивных гормонов и липопротеидов высокой плотности на хроматин являются гидрокортизон и ЛПВП. Адреналин вносит в этот эффект лишь незначительные изменения. Оба подкласса ЛПВП С ЛПВП2 и ЛПВПЗ ) принимает участие в формировании кооперативного эффекта.

Впервые показано, что механизмы активации хроматина под влиянием одного гидрокортизона и при совместном действии гидрокортизона и ЛПВП отличаются друг от друга. В первом случае наблюдается гораздо меньшая степень его активации, но возрастает сродство зонда акридинового оранжевого к ДНК Во втором случае константа связывания зонда с ДНК не меняется, но значительно возрастает эффективность связывания акридинового оранжевого с хроматином. По-видимому, оба воздействия направлены на разные участки хроматина.

Показано, что уже через 7 минут инкубации переживающих срезов печени с гидрокортизоном и меченными фяуоресцеинизотио-цианатом ЛПВП флуоресцентная метка появляется в ядерной фракции. Содержание основного белка ЛПВП апо-A-I в ядре в этих условиях также повышается.

Показана роль лизосомальной системы в реализации коопера-

- А -

тивного эффекта гидрокортизона и ЛПВП на хроматин клеток печени. Увеличение активности некоторых лизосомальных ферментов в ядре является необходимой предпосылкой усиления экспрессии генов. Впервые показано, что при инкубации срезов печени с гидрокортизоном и ЛПВП в присутствии ингибиторов протеиназ, бло-каторов интернализации и внутриклеточного перемещения кооперативный эффект, связанный с активацией хроматина и изменением спектра гистоновых белков, не проявляется.

Впервые выявлено, что общим в активации хроматина при физической нагрузке, частичной гепатзктомии и под влиянием кооперативного действия гидрокортизона и ЛПВП является протеолиз обогащенных лизином гистонов и ацетилирование гистонов, обогащенных аргинином, в частности, Н4.

Впервые показано, что изменения в спектре гистоновых белков хроматина под влиянием одного гидрокортизона и при совместном действии гидрокортизона и ЛПВП имеют как общие, так и различные черты. Общими чертами являются ацетилирование обогащенных аргинином гистонов, и в частности, Н4, а также убикви-тинизация Н2А. Отличие состоит в протеолизе обогащенных лизином гистонов ( Н1, JE А а Н2В ), а именно тех из изоформ, биосинтез которых поддерживается на базальном уровне на протяжении Бсего клеточного цикла, в условиях реализации кооперативного эффекта гидрокортизона и ЛПВП.

Теоретическое и практическое значение. Работа представляет собой экспериментальное изучение молекулярных механизмов активации хроматина клеток печени .и носит преимущественно теоретический характер. Выяснение регуляторной роли липопротеидов сыворотки крови ( кооперативный эффект липопротеидов и адаптивных гормонов) позволяет глубже понять механизмы активации хроматинь при стрессе, роль различных модификаций гистоновых белков и функцию лизосом в этом процессе.

Положения, выносимые на защиту:

1. Реализация кооперативного эффекта гидрокортизона и ЛПВП в печени крыс приводит к активации хроматина, что выражается е общем усилении его матричной активности. Оба подкласса ЛПВП С ЛПВП2 и ЛПВПЗ ) принимают участие в формировании кооперативного эффекта.

- Б -

2. Механизм активации хроматина под влиянием гидрокортизона и ЛПВП отличается от такового при воздействии одного гидрокортизона, Первый является лизосомозависимым и характеризуется повышением эффективности связывания АО с хроматином, а также резким усилением его матричной активности. Второй характеризуется повышением константы связывания АО с хроматином, но гораздо меньшей степенью его активации.

3. Кооперативный эффект гидрокортизона и ЛПВП на хроматин клеток печени сопровождается протеолиаом обогащенных лизином гистонов ( HI и Н2В ) и повышением содержания обогащенного аргинином гистона Н4.

4. Выявленные изменения в спектре гистоновых белков являются общими как в условиях активации хроматина in vivo ( при физической нагрузке на фоне введения продигиозана и при час- -тичной гепатэктомии ), так и при кооперативном воздействии гидрокортизона и ЛПВП на хроматин в условиях in vitro.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на V Всесоюзном биохимическом съезде ( Москва, 1986 ), III Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Структура и Функции лизо-сом" ( Тбилиси, 1986 ), X конференции молодых ученых "Синтез и исследование биологически активных соединений" г Рига, 1939 ), конференциях молодых ученых ( Новосибирск, 1985-, 1989 ).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем работы. Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста. Содержит введение, обзор литературы, главы, включающие материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы и список цитируемой литературы ( 85 отечественных и 204 иностранных источника ). Работа иллюстрирована 20 таблицами и 6 рисунками.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института биохимии СО РАМН по теме "Изучить механизмы липопротеидной регуляции внутриклеточного метаболизма при стрессе с целью разработки новых принципов управления и коррекции процессов адаптации и восстановления", N государственной регистрации темы 01.8.90.056645.

- 6 -

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований. Эксперименты проведены на 375 крысах самках линии Wistar.

В работе' использовались следующие экспериментальные модели и воздействия:

1. Физическая нагрузка как сильный, легко дозируемый стрес-сорный фактор, вызывающий широкий спектр специфических и неспецифических изменений в клетках всех тканей организма. Физическая нагрузка экспериментальных животных проводилась в интенсивном режиме, который заключался в однократном плавании крыс в аквариуме в течение 3,5 часов с грузом, составляющим 4Z от массы тела при температуре воды 32- 34' С.

2. Частичная гепатзктомия (ЧГЭ) использовалась для изучения молекулярных механизмов активации хроматина. Известно, что вслед за частичной гепатзктомией у крыс наблюдается репаратив-ная регенерация, которая сопровождается резким усилением процессов биосинтеза и функциональной активности оставшейся ткани. Операцию частичной гепатзктомии проводили по известному методу Higgins, Anderson ( 1931 ). Контролем служили ложнооперирован-ные животные.

3. Стимуляция системы мононуклеарных фагоцитов ( СМФ ) ли-пополисахаридом лродигиозаном использовалась для вьЬвления роли стромально-паренхиматозных взаимоотношений в активации хроматина печени при стрессе. Продигиозан вводился крысам в дозе 0,25 иг/кг внутрибрюшинно за 1 сутки до исследований.

4. Для выяснения механизмов активации хроматина при стрессе крысам за 1 час до плавания внутрибрюшинно вводили различные ингибиторы лизосомальных функций: для торможения транслокации лизосом к ядру - винбластин ( 0,1 мг/кг ), ингибитор тиоловых протеиназ - иодацетамид ("5 мг/кг ) и хлорохин ( 0,5 мг/кг ), повышающий pH внутри лизосом и тем самым ингибирующий лизосо-мальные протеиназы.

5. Штод переживающих срезов печени использовался с целью выяснения роли отдельных гормонов и липопротеидов высокой плотности ( ЛПВП ) сыворотки крови в активации хроматина. Преимущество данного метода заключается в том, что сохраняются все

- ? -

особенности межклеточных взаимоотношений, жизнеспособность основной массы клеток, интактноеть плазматических мембран и внутриклеточных структур.

Срезы печени инкубировали в Кребс-Рингер-бикарбонатном буфере ( рН 7,4 ), уравновешенном газовой средой (95Х 0г,5% С02), в водяной Сане при 37°С и постоянном покачивании. В среду инкубации добавляли гормоны и липопротеиды в конечных концентрациях: гидрокортизон - 3 х 10"вМ, адреналин - 10"6 М и ЛПВП - из расчета 0,2 мг белка на 1 мл среды. Следует отметить, что данные концентрации гормонов и липопротеидов соответствуют их содержанию в крови крыс при различных стрессорных воздействиях.

6. Для выяснения роли лизосомалькых фзрментов к срезам наряду с гормонами и ЛПВП добавляли различные лизосомальные ингибиторы: пепстатин ( 5 мкг/мд среды ), иодацетамид (0,5 мг/мл ), ингибитор трипсина из соевых бобов (1 мг/мл), а также блокаторы перемещения лизосом к ядру - винблаетин в конечной концентрации 10~*М и колхицин в концентрации 5 х 10~7М. Пепстатин предварительно суспендировали в ЛПВП и в таком виде вводили в среду инкубации.

В работе использовались следующие методы:

1. Выделение и очистку ядерной фракции из печени крыс проводили по методу Blobel, Potter, (1966) в градиенте плотности сахарозы. Степень очистки ядерной фракции проверяли при помощи световой микроскопии и определения активности маркерных ферментов внутриклеточных структур.

2. Матричную активность хроматина оценивали по эффективности связывания с ДНК флуоресцентного зонда акридинового оранжевого ( АО ) в суспензии ядер и по включению 5 Н-уридина в обп$1й пул РНК и лейцина в белок растворимой фракции. Молярную концентрацию мест связывания зонда с ДНК ( ) и константы связывания определяли по методу Владимирова, Добрецова ( 1980 ). Для этого проводили титрование постоянного количества зонда различными концентрациями ядер (в расчете на белок) и титрование постоянного количества ядер переменными концентрациями зонда. Измеряли флуоресценцию АО при длине волны 530 нм при помощи спектрофлуориметра MPF-4 "Hitachi" и строили графики титрования. Специфическая для связанного зонда флуоресценция АО при

данной длине волны отражает интеркаляцию красителя между парами оснований свободной от гистонов ДНК. Измеряли также флуоресценцию АО при длине волны 615 нм. Эта флуоресценция обязана своим происхождением комплексам АО с денатурированной, однонитевой ДНК, характерной для транскрилционно активного хроматина. Отношение интенсивностей флуоресценции при длине волны 615 нм и 530 нм (<*■) служит показателем активации биосинтетических процессов в клетке ( Карнаухов, 1978 ), а в ядерной фракции отражает степень дерепрессии генома.

3. Для оценки скорости биосинтеза суммарной РНК в среду инкубации к срезам добавляли. 3Н-уридин в количестве 1 мккюри/мл среды и для оценки скорости биосинтеза общего бедка - '*С-лейцин в том же количестве. После инкубации при 37*с в течение 2 часов срезы отмывали и гомогенизировали. Гомогеиат центрифугировали при 105 ООО g. В надосадке измеряли связанную с белком радиоактивность. Определение включения '5Н-уридияа в РНН производили в цельном гомогенате, обработанном таким же образом.

4. Ваделение гис.тонов осуществляли кислотной экстракцией очищенных ядер 0,5 N Н450^ и осаждением ацетоном.

5. Электрофорез гистонов проводили по методу Рапуim, Chalkley (1969) в модификации ( Zweidler, 1978; Bonner et al. , 1980).

6. Выделение липопротеидов сыворотки крови осуществляли методом изоплотностного ультрацентрифугирования ( Hatch, Lees, 1968 ).

7. Определение общей активности лизосомальных ферментов в гомогенате и очищенной ядерной фракции проводили после предварительной инкубации последних е присутствии 0,17. тритона Х-100.

Определение активности кислой фосфатазы осуществляли по методу De Duve et al. (1955). Количество неорганического фосфата, высвободившегося в результате ферментативной реакции, определяли по методу Fiske, Subbarow (1925).

Определение катепсина D производили по методу Баррета, Хита (1980).

Определение активности кислой ДНКззы осуществляли по методу Покровского, Арчакова ( 1968).

Определение активности ß-глюкозидазы, ß-галактозидазы, ка-

тепсинов В и Ь проводили по методу К1гзЬке еЬ а1. ( 1982 ), с использованием соответствующих флуорогенных субстратов.

8. Количественное определение апо-А-1-иммунореактивности в очищенной ядерной фракции выполнялось с помощью непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с использованием козьих антител против иммуноглобулинов кролика, меченных пероксидазой, в качестве вторичных.

Концентрацию белка определяли по методу Ьо^у еЬ а1. (1951).

Статистическую обработку результатов производили с применением ^критерия Съюдента (. Лакин, 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оценка матричной активности хроматина печени крыс при стрессе.

Флуоресцентное зондирование ядер печени крыс сразу после физической нагрузки показало, что эффективность связывания АО с ДНК значительно превышает данный показатель у интактных животных (табл.1). Увеличение интенсивности связывания АО с хроматином плававших крыс отражает происходящую при этом активацию хроматина, выражающуюся в демаскировке от белков новых участков ДНК. становящихся доступными для зонда.

Удобной моделью для изучения процессов активации хроматина служит репаративная регенерация печони, так как удаление части печени, помимо усиления нагрузки на оставшуюся долю, переводит большую часть гепатоцитов в 5-фазу клеточного цикла, и они начинают усиленный синтез ДНК. и гистонов. Таким образом, происходит синхронизация клеточного цикла гепатоцитов, позволяющая выявить закономерности активации хроматина. По нашим данным, через 6-9 часов после ЧГЭ связывание АО с хроматином выделенных ядер возрастает вдвое ( табл. 1 ).

Таким образом, мы наблюдали активацию хроматина печени как при интенсивной физической нагрузке, так и при репаративной регенерации печени после ЧГЭ. Можно заключить, что активация хроматина является универсальным явлением как при восстановитель-

Таблица 1

Эффективность связывания АО (п^ с хроматином в суспензии ядер, выделенных из печени крыс после интенсивной физической нагрузки и ЧГЭ ( мкмоль/г белка, М+т)

Яизическая I

нагрузка I ЧГЭ I

Контроль I Контроль

(интактные) 2,75+0,39 I (ложная операция) 5,34+0,57

Плавание ' 4,34+0,47* I ЧГЭ 10, §6+0,83** I

Примечание. Звездочками указаны достоверные отличия от соответствующего контроля: * - Р < 0,05; ** - Р < 0,01. Приведены средние данные по 6-9 животным.

ной, так и репаративной регенерации печени, обеспечивающим запуск генетической программы, направленной на обновление клеточных структур и усиление синтеза адаптивных белков.

Для выяснения механизмов активации хроматина при стрессе нами был применен метод переживающих срезов печени. Ранее было показано, что при некоторых видах стресса, в том числе при физической нагрузке, в крови повышается содержание глюкокортикои-дов и катехоламинов, происходит сдвиг липопротеидного спектра в сторону высокой плотности (.Панин, Поляков, 1976). Эти эндок-ринно-метаболические изменения были воспроизведены нами в условиях in vitro.

2. Исследование активации хроматина печени крыс в условиях инкубации переживающих срезов печени с адаптивными гормонами и ЛПВП.

При инкубации срезов печени с гидрокортизбном количество связавшегося с хроматином АО увеличилось незначительно, по сравнению с контролем ( табл. 2). Адреналин практически не влиял на связывание АО с ДНК. Добавление адреналина вместе с гидрокортизоном в среду инкубации также не отражалось на связыва-

нии АО с ДНК, как и добавление одних ЛПВП. И только совместное добавление в среду инкубации гидрокортизона, адреналина я ЛПЕП увеличивало эффективность связывания АО вдвое ( 2032 по отношению к контролю) ( табл. 2).

Таким образом, эффект совместного действия гидрокортизркз, адреналина и ЛПВП был неаддитивным и не воспроизводился ни одним из его компонентов в отдельности. В данном случае имеет место кооперативное действие гормонов и ЛПЕП на хроматин клеток печени.

Известно, что ЛПВП подразделяются на два подкласса - ЛПВП? и ЛПВГО. В связи'с этим представляло интерес установить како*

Таблица 2.

Молярная концентрация мест связывания АО и константы связывания в суспензии ядер, выделенных из переживающих срезов печени, инкубированных в присутствии гормонов и ЛПВП ( М+т )

опыта

Вид

Молярная концентрация мест связывания С мкмоль/г белка )

Константы

связывания

Контроль (без добавок) Гидрокортизон

7,02+0,54 (35) 8,89+0,99 (15) 6,51+1,14 (И)

Адреналин Гидрокортизон+

адреналин Гидрокортизон+ +адреналин+

5,05+1,97 (7)

+ ЛПВП Гидрокортизон+

14,31+1,13*** (6)

+ ЛПВП

13,76+1,68*** (25) (1,55+0,35) Х10 (22) 6,95+0,78 (6)

«

ЛПВП

Примечание. Звездочками обозначены достоверные отличия от контроля: * - Р < 0,01; *** - Р < 0,001. В скобках указано число экспериментов.

из подклассов ЛПВП оказывает влияние на активацию хроматина. Результаты флуоресцентного зондирования ядер из срезов печени, инкубированных в присутствии гидрокортизона, адреналина и одного из подклассов ЛПВП показали, что оба подкласса ЛПВП ( ЛПВП2 и ЛПВПЗ) способны активировать хроматин в присутствии глюкокор-тикоидов и катехоламинов ( табл. 3 ).

Последующие опыты показали, что инкубация срезов печени с ЛПВП и одним гидрокортизоном (без адреналина) давала практически такой же эффект, как к при совместном добавлении обоих гормонов ( табл.2 ). Таким образом, повышение связывающей способности хроматина определяется прежде всего кооперативным эффектом гидрокортизона и ЛПВП. Адреналин в этот механизм вносит лишь незначительные изменения.

Повышение эффективности связывания АО с хроматином говорит об активации последнего и, по-видимому, отражает усиление матричной активности ДНК. Для проверки этого предположения было проведено определение матричной активности ДНК радиоизотопным методом.

Скорость биосинтеза РНК в срезах печени, инкубируемых в присутствии гидрокортизона и ЛПВП оценивали по включению Н-ури-дина в общий пул РНК, а скорость биосинтеза белка - по включе-

Таблица 3

Молярная концентрация мест связывания АО в суспензии ядер, выделенных из переживающих срезов печени, инкубированных в присутствии гормонов и ЛПВП ( мкмоль/г белка, М+ш)

Контроль Гидрокортизон+ Гидрокортизон+

(без добавок) адреналин + ЛПВП2 адреналин + ЛПВПЗ

4,11+0,42

(18)

5,86+0,57* (21)

5,65+0,54* (15)

Примечание. Звездочкой указано достоверное отличие от контроля: * - Р < 0,05. В скобках указано число экспериментов.

•Я.

нию С-лейцина в цитозольный белок. Оба показателя под влиянием одного гормона достоверно увеличивались. Однако в случае кооперативного эффекта гидрокортизона и ЛПВП увеличение было значительно больпш, чем в случае одного гормона (. табл.4 ).

Полученные оценки степени активации хроматина при помощи Флуоресцентного зондирования и по включению радиоизотопной метки хорошо согласуются между собой.

Определение констант связывания АО с хроматином ядер, изолированных из срезов печени, проинкубированных в присутствии гидрокортизона и ЛПВП, выявило существенное различие в механизмах действия одного гидрокортизона и в его кооперативном варианте с ЛПВП. В первом случае константа была достоверно выше, по сравнению с контролем. Во втором - практически не отличалась от контроля ( табл. 2). Изменение сродства зонда к ДНК, возможно, отражает различия в конформации участков ДНК, связанных с АО. Это позволяет утверждать, что механизмы активации хроматина под влиянием одного гидрокортизона и при совместном воздействии гормона и ЛПВП разные и направлены на различные участки ДНК.

Таблица 4

изменение свиристи включения ^ н-уридина в РНК и "т С-лейцина s белок в переживающих срезах печени крыс под влиянием гидрокортизона и гидрокортизона с ЛПВП ( имп. • мин~*г белка""'')

Условия инкубации Включение 3Н-уридина Включение ^С-лейцина

в РНК в белок

Контроль 1860+157 1320+130

Гидрокортизон 2604+228* .1880+176*

Гидрокортизон+ЛПВП 3255+356** 2740+214**

ЛПВП - 1073+156

Примечание. Звездочками обозначены достоверные отличия от контроля: * - Р < 0.05; ** - Р < 0,01. Число опытов в каждой серии 10.

- 14 -

Ib показателю /lS30 оценивали концентрацию одноните-

вых матриц в ядрах печени крыс. Инкубация срезов печени с одним гидрокортизоном приводила к небольшому увеличению , разница с контролем недостоверна. Адреналин вызывал заметное увеличение количества однонигевых участков нуклеиновых кислот в ядре, вероятно, усиливая синтез РНК на уже работающих, открытых для считывания РНК-полимеразой, матрицах. Гидрокортизон и ЛПВП, добавленные к срезам одновременно, увеличивали количество однони-тевых матриц до 110%, по сравнению с контролем. Таким образом, кооперативный эффект гидрокортизона и ЛПВП включает в себя как повышение синтеза РНК, так и локальную денатурацию ДНК, необходимую для работы РНК-полимеразы. Отношение "красной" и "зеленой" флуоресценции (1е#/1 ¿зо) при добавлении в среду инкубации адаптивных гормонов и ЛПБП2 или ЛПВПЗ было практически одинаковым и достоверно выше, чем в контроле.

3. Изменение содержания ЛПВП и активности лизосомальных ферментов в ядеркой'фракции, выделенной из срезов печени, инкубированных в присутствии гидрокортизона и ЛПВП.

Апо-А-I является основным белком ЛПВП. Ранее было показано, что после делипидирования ЛПВП апобелки этой фракции оказывают не меньший регулирующий эффект на многие внутриклеточные процессы, а в ряде случаев и более выраженный, чем сами ЛПВП ( Панин, 1983). Было также показано, что во многих случаях регуля-торное Действие ЛПВП опосредуется лизосомальным Аппаратом печени ( Панин, Шян^кая, 1987). Однако, не был выяснен вопрос, попадают ли апопротеины или липопротеиды в ядро, или их действие связано с активацией лизосомальных протеиназ. Для выяснения этого вопроса была прослежена судьба липопротеидов в клетке, меченных тем или иным образом. Через 30 минут после введения меченных 3Н-бензпиреном ЛПВП крысам в хвостовую вену в очищенной ядерной фракции печени обнаружено 4.2Х всей радиоактивности, попавшей в клетку. В опытах in vitro на переживающих срезах печени нами показано, что уже через 7 минут инкубации с гидрокортизоном м ЛПВП, меченными ФИТЦ, в ядрах появляется специфическая флуоресценция. Анализ распределения флуоресценции по

-• !Б -

субклеточным фракциям я в цельном гомогенате показал, что в ядерной фракция сбнарузя:ьается но менее 4,5% меченных ФИТЦ попавших в клетку. С. помощью метода тИФА было поичраго, что ало-А- 1-кмиуноре-

"ктивность действительно прг;су:'ст:;ует ;-: ядрах печени и уведичи-..лется после инкубация срезсз лечони е гидрокортизоном и ЛПЕП ( табл. 5 ).

оно и рр» е-тги:::;:.; одного ^иэдюпортиаопэ. ге-Г-птно, за счет- ЛПВП, присутствующих в. ткани.

Таким образом можно заключить, что апопротеины или продукты их лимитированного протеолиза в комплексе с гидрокортизоном попадают в ядро. Однако эффект активации хроматина, его частичную допротеинизацию целесообразно связать с действием лизосомальных ферментов.

Определение общей й относительной удельной активности ( по отношению к цельному гомогевату ) кислой фоефзтазы а счидаяной

-'-г-"-':- г:..-'.....ллор'^й ¡^рэкцк;: '-¡г слезав печени крыс,

в :;о>50утс7н:и г;<дпоа.;:ги&одй и ¿ТГЗП выявило ' от;;;: лтолей '-.ч-реэ 30 минут инкубации. Одна-

к?, 1 ч:.с -П мииу-*' уу.к'/Сс^ум ¿ммивиисть ¡сксм," фэсфа-

Ес';ггагллас?> к исходному уровню. В актквностя других

Таблица С

Согг.ржкта шк-Л-1 в ядерной фракции из срезов печени крье, инкубированных в присутствии гидрокортизона и ЛШП ■ ( в мг/г белка )

:а;нтроль Гидрокортизон • Гидрокортизон+

(без добавок ) ЛПШ

О,17+0,03 0,54+0,17* 0,58+0,12**

(8) (12) (11) 100% 175,2+24,2% 219,0+23,4%

Примечание. Звездочками указаны достоверные отличия от контроля: * - Р < 0,05-, ** - Р < 0,01.

лизосомальных ферментов достоверных отличий нами не выявлено, '^ременное повышение активности некоторых лизосомальных ферментов в ядре в условиях активации ,хроматина отмечено и другими авторами С Бгего, 1984 ). Так, например* подобное повышение активности лизосомальных ферментов в ядре предшествовало индукции синтеза Г-б-ФДГ и др. ферментов углеводного обмена ( Мак, №11б, 1977).

4. Влияние лизосом на проявление кооперативного эффекта гормонов и ЛПБП.

Ранее было показано, что в условиях напряжения организма, вызванного физической нагрузкой, происходят выраженные изменения в вакуолярно-лизосомальной системе клеток печени ( Панин, Маянская, 1987). В связи с этим представляло интерес изучить роль лизосомальной системы клеток в реализации кооперативного эффекта глюкокортикоидов и ЛПЕП на уровне хроматина. Для этого нами был применен ингибиторный анализ в исследованиях на переживающих срезах печени крыс. Использовались следующие ингибиторы: винбластин и колхицин, тормозящие перемещение лизосом к ядру вследствие нарушения микротрубочкового аппарата; пепстатин -ингибитор карбоксильных протеиназ ( катепсина Б ); иодацетамид - ингибитор тиоловых протеиназ и ингибитор трипсина из соевых бобов для подавления активности сериновых протеиназ. Результаты экспериментов показали, что если к переживающим срезам наряду с гидрокортизоном и ЛПВП добавлялся один из ингибиторов, то эффективность связывания АО с хроматином практически оставалась на уровне контроля ( табл. б ).

Известно, что хроматин, в отличие от "голой" ДНК, обладает низкой способностью к связыванию АО ( Борисова, Минят, 1970). Авторы полагают, что снижение связывающей способности хроматина обусловлено экранированием ДНК хромосомными белками, в первую очередь, гистонами. Повышение эффективности связывания АО с хроматином при активации последнего и блокада этого эффекта ли-зосомальными ингибиторами, а также временное повышение активности лизосомальных ферментов в ядре позволяют предположить, что в этом процессе принимают участие лизосомальные протеиназы.

Таблица б

Молярная концентрация мест связывания АО в суспензии ядер, выделенных из переживающих срезов печени, инкубированных в присутствии гидрокортизона, ЛПВП и лизосомальных ингибиторов ( мкмоль/г белка, М+т)

Вид опыта Эффективность связывания АО

Контроль (без добавок) 7,02+0,54 (35)

Гидрокортизон+ ЛПВП 13,76+1,68 * (25)

Гидрокортизон+ЛПВП+ винбластин 7,15+1,14 (14)

Гидрокортизон+ЛПВП+ пепстагин 8,26+0,84 (10)

Гидрокортизон+ЛПВП+ иодацетамид 6,10+1,03 (10) Гидрокортизон+ЛПВП+соевый ингибитор

трипсина 5,93+1,04 (9)

Гидрокортизон+ЛПВП+ колхицин 7,59+1,48 (5)

Примечание. Звездочкой указано достоверное отличие от контроля: * - Р < 0,01. В скобках - число экспериментов.

способные к ограниченному протеолизу гистоновых белков ( Harvi-ma et al., 1988; Krueger, 1982; Chauviere, 1977; Watson, Moud-rianakrs, 1982; Lipmska, Klyszei jko-Stefanowicz. 1980 ). В связи с этим представляло интерес изучить спектр гистоновых белков при активации хроматина.

5. Изучение спектра гистоновых белков при физической нагрузке.

У интактных и подвергавшихся интенсивной физической нагрузке животных с помощью электрофореза в ПААГ нами были выявлены все основные фракции гистонов и некоторые их подфракции.

Значительных изменений в спектре гистонов при физической нагрузке не наблюдалось. Достоверно увеличивалось содержание суммарной фракции гистона Н4, возможно, за счет повышения содержания ацетилироваш-шх и димцетилированных форм Н4. которые имели тенденцию к повышению. Введение лизосомальных ингибиторов (вин-

бластина, иодацетамида, хлорохина ) не отразилось на изменении спектра гистоновых белков при плавании. Содержание гистона Н4 оставалось повышенным (рис. 1 о ).

Стимуляция СМФ продигиозаном вызывала характерные изменения в спектре гистоновых белков при плавании. Так, было обнаружено увеличение содержания продуктов протеолиза гистона Н1 (рис. 1 А). Содержание суммарной фракции гистонов Н2А+Н2В ( они не разделяются в данных условиях электрофореза ) достоверно снижалось на фоне выраженной тенденции к повышению продуктов протеолиза данной фракции, как по сравнению с интактными, так и плававшими животными ( рис. 1 С ). Ш полагаем, что это снижение связано с усилением протеолиза указанной фракции гистонов. Содержание гистона НЗ практически не изменялось ( рис.1 В ). Содержание суммарной фракции гистона Н4 снижалось при плавании на фоне проди-гиозана, по сравнению с обеими контрольными группами животных ( интактными и плававшими)( рис. 10). При этом содержание ди-ацетилированных форм Н4 еще более увеличивалось. Таким образом, • при стимуляции СМФ продигиозаном протеолиз гистоновых белков усиливался. Это может отражать повышение мощности общего .гидролитического пула печени, большой вклад в который вносят кислые гидролазы клеток Купфера.

6. Изучение спектра гистоновых белков при активации хроматина после ЧГЭ.

Связывание АО с хроматином- ядер, выделенных через 6-9 часов после ЧГЭ значительно возрастало. Следовательно, матрица ДНК для считывания РНК-полимеразой в этот период после операции была уже открыта В связи с этим изменения в спектре гистоновых белков следовало ожидать гораздо раньше. Мы остановились на 3 часах после ЧГЭ. В этот период в спектре гистонов были выявлены следующие изменения. Содержание суммарной фракции гистона Н4 было достоверно выше, по сравнению с ложнооперированными животными. При этом наблюдалось усиление ацетилирования гистона Н4. В отношении других гистонов изменений обнаружено не было. По-видимому, сама ложная операция ЧГЭ явилась весьма сильным стрес-сорным фактором для животных, что не позволило выявить в спект-

- 19 -

ре гистонов достоверные различия.

Спектр гистоновых белков печени крыс через 13 часов после ЧГЭ не отличался от такового у ложнооперкрованных тавотных. По-видимому, к этому времени основной синтез гистонов уже прошел, и они наработаны в эквимолярных количествах, необходимых для образования комплекса с ДНК. Это период относительного покоя в «¿-точном цикле. По сравнению с 3 часами после операции, в этот период наблюдалось снимание продуктов протеолиза гистона Н1 как после ЧГЭ, так и у ложнооперироеактХй ззжогша. Снижено также и 0„цвр«рнио пютсва КЗ чпсов после операции. В то же

время содержание суммарной фракции Н2А+Н2В повышено в 1,85 раза. Содержание гистона Н4 через 13 часов после операции достоверно снижено, по сравнению с периодом 3 часа после ЧГЭ. Особенно снижено содержание ацетшшровзнных форм Н4.

Таким образом, общий характер изменений в спектре гистоновых белков, происходящих в период активации хроматина через 3 часа после ЧГЭ, хорошо коррелирует с изменениям!, наступающими в ход^ актигашта хроматина при интенсивной физической нагрузке на i¡oHe введения продпгиозана.

V. Изменение спектра гистоновых белков в переживающих срезах печени криг под ы.ияш«м кооперативного эффекта глюкокорти-КОИДОВ и ЛПБП.

При инкубации срезов печени с гидрокортизоном и ЛПБП были сдавлены некоторые изменения в спектре гистонов. Обнаруженные изменения в целом согласуются с результатами опытов in vivo. Однако. вв<?д°н1ле г систему разделения пистонов неионного детергента тритона Х- LOO позволило выявить болыяум гетерогенность згиу. велиоь. Так, оыло идентифицировано 5 подракций гистона Н2А. Содержание убиквитинированной формы Я2А при инкубации срезов печени с гидрокортизоном значительно возрастало. При инкубации срезов с гидрокортизоном и ЛПБП содержание этой формы было сниженным, по сравнении с гидрокортизоном, но все же повышенным, по сравнению с контролем. При этом пепстатин и метиламин ( блокатор пнтернализацни комплекса гормон-ЛПВП) препятствовали повышению содержания уоиквитинированной формы Н2А.

Содержание основной подфракции Н2А. 1 было значительно ниже, по сравнению с гидрокортизоном. Применение метиламина повышало содержание Н2А. 1 до уровня, характерного для одного гидрокортизона.

В группе гистонов Н2В содержание суммарной фракции снижалось как при инкубации с гидрокортизоном, так и в их кооперативном варианте. При этом в последнем случае достоверно снижалась только подфракция H2R1. Этот результат может быть связан с протеолизом указанной подфракции гистона Н2В, на что указывает частичное уменьшение эффекта лизосомальными ингибиторами пепстатином, метиламином и иодацетамидом. Следует отметить, что синтез подфракции Н2В. 1 не ограничивается S-фазой клеточного цикла, что делает возможным протаолитическую регуляцию его содержания на протяжении всего клеточного цикла.

Аналогичные изменения касались таких подфракций гистона КЗ, как НЗ. 2 и НЗ. 3. Содержание гистона Н1 изменялось подобным образом.

Суммарная фракция гистона Н4 увеличивалась в условиях инкубации срезов печени с гидрокортизоном и ЛПВП. При этом увеличивались также ацетилированные формы Н4.

Итак, под влиянием кооперативного эффекта гидрокортизона и ЛПВП спектр гистонов претерпевает изменения, заключающиеся в усилении протеолиза богатых лизином гистонов и усилении ацети-лирования богатых аргинином гистонов. Наибольшие изменения при этом касаются минорных подфракций гистонов, синтез которых не скоррелирован с синтезом ДНК и происходит на протяжении всего клеточного цикла.

Таким образом, можно заключить, что глюкокортикоиды совместно с липопротеидами высокой плотности приводят к дерепрес-сии генома клеток печени кооперативным образом. Важная роль в реализации этого кооперативного эффекта принадлежит лизосомаль-ному аппарату печени. Протеолиз обогащенных лизином гистонов и ацетилирование обогащенных аргинином гистонов, в частности, Н4 являются необходимой предпосылкой активации хроматина.

- 21 -ВЫВОДЫ

1. При физической нагрузке и через 6-9 часов после частичкой гопатоктомии наблюдается активации хроматина печени, о чем свидетельствует повышение эффективности связывания с ним акридинового оранжевого.

?.. Кооперативный эффект гидрокортизона и липопротеидов вы- ■ соксй плотности проявляется в спасительной активации хроматина, которая выражается в повышении .эффективности связывания акридинового оранжевого с хроматином и усилении его матричной активности. Еиавганпай зффекг не яагяетоя аддитивным и не воспроизводится ни одним из компонентов по отдельности.

3. В формировании кооперативного эффекта гидрокортизона и ЛПВП, связанного с активацией хроматина, принимают участие оба подкласса липопротеидов высокой плотности ( ЛПВП2 и ЛПВПЗ ).

4. В процессе реализации кооперативного эффекта белковый компонент ЛПВП попадает в ядро. Содержание основного белка ЛПВП апо-A-I е ядре повышается при инкубации срезов печени с гидрокортизоном и ЛПВП.

5. Активация хроматина и изменение спектра гистоновых белков под влиянием гидрокортизона и ЛПВП реализуется при участии лизссомального аппарата клеток. В присутствии блокаторов интер-нализации, Бкутр;;;;летсч::сго перемещения органелл или ингибиторов лизосомальных протеиназ кооперативный эффект не проявляется.

6. При физической нагрузке на фоне стимуляции системы мо-понуклеарных фагоцитов продигиозаном наблюдается повышенный протеолиз гистоновых белков.

7. В условиях активации хроматина под влиянием гидрокортизона и ЛПВП происходит протеолиз обогащенных лизином гистонов

( Н1 и Н2В ), в первую очередь тех подфракций, синтез которых поддерживается на базальном уровне в течение всего клеточного цикла.

8. Обшим в механизме активации хроматина как в условиях in

vivo ( при физической нагрузке и частичной гепатэктомии ), так и под влиянием кооперативного воздействия гидрокортизона и ЛПВП является повышения содержания гистона Н4, и в частности, его ацетилированных форм.

- 22 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Соболева И. Г. Лизосомы и активация хроматина при стрессе // Актуальные вопросы патофизиологии: Тез. докл. ,региональной школы-конференции молодых ученых. - Новосибирск, 1985. - С. 35.

2. Маянская Н Н , Панин Л. Е., Соболева И. Г. Новые данные об участии лизосом в активации хроматина // Тез. V Всес. биохимического съезда. - М.: Наука, 1986. - Т. 2. - С. 282-283.

3. Свечникова И. Г., Панин Л. Е., Маянская Н Н Влияние ингибиторов лизосомальной функции на изменение спектра гистоновых белков при физической нагрузке у крыс // Структура и функции лизосом: Тез. докл. III Всес. симп. с международным участием (Тбилиси, 17-21 ноября 1986 г.). -.Москва, 1986. - С. 177-178.

4. Свечникова И. Г. К механизмам участия гидрокортизона и липопротеидов крови в регуляции активности хроматина // В сб. : Молодые ученые-медики - науке и практическому здравоохранению. Тез. докл. конф. молодых ученых СО АМН СССР. - Новосибирск, 1989. - С. 45-47.

5. Свечникова И. Г. Метод определения активности хроматина в суспензии ядер при помощи флуоресцентного зонда акридиновго ■ оранжевого // Синтез и исследование биологически активных соединений: Тез. X конф. молодых ученых. - Рига, 1989. - С. 90.

6., Панин JL Е., Свечникова И. Г., Маянская Н R Роль плазменных липопротеидов высокой плотности как модуляторов специфического гормонального эффекта гидрокортизона // Вопр. -мед. химии. - 1990. - Т. 36. - N. 3. - С. 60-62.

7. Свечникова И. Г. О кооперативной роли липопротеидов высокой плотности и глюкокортикоидных гормонов в стресс-реакции организма / В печати. Послано на Научную конференцию молодых ученых России " Здоровье и болезни человека на рубеже XXI века". - Москва, 1993.

tfUUü^

Зак. 55, тир. 100, печ.л. 1,5, формат 60x84/16

Тип. СО РАМН г. Новосибирск, 1993.

А

В

.X

Р7у. 1 "у/А .....ш 1 [//// 0// Щ Щ 1 ш ФЖй шщт $ЩШ 1'/'4у//'1\г///' ШШш штт

К 1 2 3 + 5

С В

к I I 3 + 5

Рис. 1. Относительное содержание некоторых фракций гис-тонов в печени крыс после интенсивной физической нагрузки: К -интактные животные; 1 - плавание 3,5 ч с грузом; 2 - винблас-тин; 3 - иодацетамид; 4 - хлорохин; 5 -продигиозан. А - продукты протеолиза гистона Н1; В - гистон НЗ; С - столбики со штриховкой - суммарная фракция гистонов Н2А+Н2В; сплошныэ столбики - продукты протеолиза этой фракции; Б - гистон Н4. Звездочками указаны достоверные отличия от контроля: * - Р < 0,05; ** - Р < 0,01; *** - р < 0,001. Приведены средние данные по 7-12 животным.