Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль фитогормонов и актинового цитоскелета в регуляции гравитропизма у арабидопсиса

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Роль фитогормонов и актинового цитоскелета в регуляции гравитропизма у арабидопсиса"

На правах рукописи

ПОЖВАНОВ Григорий Александрович

РОЛЬ ФИТОГОРМОНОВ И АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА В РЕГУЛЯЦИИ ГРАВИТРОПИЗМА У АРАБИДОПСИСА

03.01.05 — «Физиология и биохимия растений»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 2 НОЯ 2012

Санкт-Петербург - 2012

005055624

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет» (СПбГУ).

Научный руководитель

Официальные оппоненты

Ведущая организация

доктор биологических наук, профессор Медведев Сергей Семёнович

Романов Георгий Александрович

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской академии наук, заведующий лабораторией

Муравник Людмила Евгеньевна

кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук, старший научный сотрудник

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского»

Защита состоится «5» декабря 2012 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 002.211.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Ботаническом институте им. В.Л. Комарова Российской академии наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 2. Тел. (812) 372-54-16, факс (812) 372-54-43, e-mail: yudina_bin@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения науки Ботанического института им. В.Л. Комарова Российской академии наук.

Автореферат разослан » ноября 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

О. С. Юдина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Понимание физиологических и молекулярных основ становления полярности высших растений является одной из фундаментальных проблем биологии растений. Полярность можно определить как асимметрию в организации и физиологических функциях растительного организма (Медведев, 2004). Растения приобретают полярную организацию на самых ранних стадиях развития: точка проникновения спермия определяет ризоидальный полюс зиготы фукуса (Hable, Hart, 2010), а зародыш арабидопси-са уже на стадии 2-х клеток проявляет асимметрию в распределении фитогормо-иа ауксина (Berleth et al., 2004). С этого момента и на протяжении всего онтогенеза растения, находясь на Земле, испытывают воздействие силы тяжести, модуль и вектор которой постоянны. Сила тяжести задаёт ось полярности наземных и подземных органов растения, а ростовая реакция на изменение положения органа в пространстве — гравитропизм - регулируется ауксином при участии системы его транспорта и цитоскелета. Предполагается, что в регуляции гравитропизма также могут принимать участие и другие фитогормоны - цито-кинины, этилен (Карпенко и др., 1993; Aloni et al., 2006). За прошедшие 10 лет достигнут значительный прогресс в изучении роли переносчиков ауксина семейства PIN в регуляции гравитропизма арабидопсиса (Muday, Murphy, 2002; Kleine-Vehn et al, 2006; Robert, Friml, 2009; Viaene et al., 2012). Выяснилось, что локализация переносчиков PIN на цитоплазматической мембране клеток задаёт направление полярного транспорта ауксина в кончике корня, а при грави-стимуляции перемещение PIN3 на нижнюю мембрану клеток колумеллы индуцирует латеральный градиент концентрации ИУК в области апикальной меристемы корня (Friml et al., 2002). Кроме того, с использованием ингибиторов актинового цитоскелета было показано, что микрофиламенты актина необходимы для рециркуляции белков PIN и, таким образом, вовлечены в регуляцию гравитропической реакции (Muday, 2000). Для исследования актинового цитоскелета были созданы трансгенные конструкции, позволяющие визуализировать микрофиламенты in vivo (Sheahan ét al., 2004). Было показано, что актиновый цитоскелет важен на самой ранней стадии гравитропической реакции (Baluäka, Hasenstein, 1997; Hou et al., 2003; Morita, 2010; Nakamura et al., 2011), а позднее его организация находится под влиянием ауксина (Nick et al., 2009). Тем не менее, остаётся неясным, какое значение для гравитропической реакции имеет специфическая организация актинового цитоскелета, может ли актиновый цитоскелет определять направление транспорта ИУК при гравистимуляции, и какое участие в регуляции гравитропизма принимает стрессовый гормон этилен.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было изучение роли фитогормонов и актинового цитоскелета в регуляции гравитропической реакции корней арабидопсиса.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1. Провести сравнительный анализ развития гравитропического изгиба корней арабидопсиса дикого типа и трансгенных растений GFP-/ABD2.

2. Разработать метод количественного анализа ИУК на гистологических препаратах трансгенных растений арабидопсиса ОИ5::Си8.

3. Охарактеризовать параметры латерального перераспределения ауксина в корнях арабидопсиса при гравистимуляции.

4. Оценить влияние этилена на гравитропическую реакцию корней арабидопсиса.

5. Исследовать изменения организации актинового цитоскелета при гравистимуляции корней арабидопсиса.

Научная новизна диссертационной работы. Впервые с использованием трансгенных растений 0РР-/АВ02, позволяющих прижизненно визуализировать микрофиламенты, показано, что гравистимуляция корней АгаЫ(1ор$1з ¡ИаНапа вызывает реорганизацию актинового цитоскелета в зоне растяжения корня. Продемонстрировано, что при гравистимуляции происходит снижение доли аксиально ориентированных микрофиламентов, а доля актиновых микро-филаментов, ориентация которых сонаправлена вектору силы тяжести, увеличивается в 3—4 раза.

Для оценки морфологии актиновых микрофиламентов, визуализированных с помощью родамин-фаллоидина, предложен индекс искривлённости. Показано, что после 15 мин гравистимуляции индекс искривлённости микрофиламентов актина в стеле корней арабидопсиса возрастает в 2 раза.

Разработан оригинальный метод количественной оценки фитогормона ауксина на гистологических препаратах арабидопсиса ОК5:: С£75". Впервые проведён количественный анализ латерального перераспределения ауксина в зоне растяжения корня арабидопсиса, и с его помощью установлено, что при гравистимуляции в нижней части корня происходит увеличение концентрации ИУК в 2-3 раза

Впервые показано, что при гравистимуляции этилен не влияет на грави-рецепцию и трансдукцию сигнала в корнях растений дикого типа, а у трансгенных растений GF^>-^ÍB£)2 тормозит развитие гравитропической реакции как на этапе рецепции и трансдукции сигнала, так и на этапе ростового ответа.

Научно-практическое значенне. Полученные в диссертационной работе данные расширяют представления о клеточных и гормональных механизмах регуляции гравитропической реакции в корне арабидопсиса. В работе предложен метод оценки концентрации ауксина, который может быть использован при определении других фитогормонов, для которых доступны вШ-репортерные генетические конструкции. Оригинальные данные о влиянии этилена на гравитропическую реакцию корней трансгенных растений арабидопсиса (ЗРР-/АВ02 могут быть востребованы при изучении актин-связывающих белков и важны для понимания физиологии трансгенного растения.

Апробация работы. Результаты работы были представлены в виде устных докладов на VI съезде Общества физиологов растений России в Сыктывкаре (18-24.06.2007), конференции молодых учёных „Биология - наука XXI века" в Пущино, Россия (29.10-2.11.2007), III Всероссийском симпозиуме

„Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности" в Москве, Россия (18.10-21.10.2010), международной конференции „Физиология растений - фундамент&чьная основа экологии и инновационных биотехнологий", VII съезде Общества физиологов растений России в Нижнем Новгороде (4-10.07.2011) и симпозиуме „Plant Biology in Space" в рамках FESPB 2012 во Фрайбурге, Германия (29.07-3.08.2012), а также в виде стендовых докладов на конференциях FESPB 2008 в Тампере, Финляндия (1722.08.2008), IPGSA 2010 в Таррагоне, Испания (28.06-2.07.2010) и FESPB 2010 в Валенсии, Испания (4-10.07.2010).

Поддержка исследования. Работа была выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ №№ 08-04-00566-а „Взаимодействие Са-потоков и редокс-реакций в клеточных стенках в гормональной регуляции роста растений", 11-04-00701-а „Роль фитогормонов, цитоскелета и активных форм кислорода в регуляции роста клеток растяжением и трансдукции гравитационного сигнала" (руководитель грантов — проф., д.б.н. С.С.Медведев), персональных грантов Правительства Санкт-Петербурга №№ 2.6/22-04/004, 2.6/16-05/219-А и гранта ООО ОПТЭК в 2012 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи, из них одна в рецензируемом журнале из списка ВАК, 8 тезисов, и приняты к публикации 2 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах текста, иллюстрирована 32 рисунками (из них 8 в приложении) и состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (196 источников, в т.ч. 183 на иностранных языках) и приложения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования, условия выращивання и гравистимуляция растений. Объектом исследования служили 7-суточные проростки Arabidopsis thaliana (L.) Heynh дикого типа (экотип Columbia-0) и трансгенные растения DR5::GUS и GFP-/ABD2 (Ulmasov et al., 1997; Sheahan et al., 2004). В растениях DR5::GUS экспрессия репортера GUS находится под контролем ауксин-чувствительного промотора DR5, что позволяет выявлять распределение ауксина в ткани с помощью гистохимической реакции. . Растения арабидопсиса GFP-/ABD2 конститутивно экспрессируют GFP, слитый со вторым актин-связывающим доменом фимбрина 1 арабидопсиса (fABD2), что позволяет визуализировать актиновый цитоскелет in vivo. Растения выращивали в стерильных условиях в вертикально ориентированных чашках Петри на среде Мурасиге - Скуга (МС/2, 1% сахароза, 0,7% агарозы) при 16-часовом фотопериоде и температуре 20°С в климатической камере MLR-351. Для изучения зависимости плотности GUS-зависимого окрашивания от концентрации ИУК в питательную среду добавляли раствор ИУК до конечной концентрации 10~6, 10"7 или 10"8М. Для изучения организации актиновых микрофиламентов за 24 часа до проведения эксперимента проростки переносили на стерильные покровные стёкла, на которых в верхней и нижней части размещали по 2 стеклянных

спейсера толщиной 0,11 мм, и закрывали нейлоновой микропористой газопроницаемой мембраной (поры 0,2 цм). Полость между стёклами заполняли средой МС/2 без агарозы, стёкла размещали вертикально при 100% влажности. Выращивание растений на стёклах позволяет сохранить ориентацию растения относительно стекла и минимизировать механические воздействия на цитоскелет. Гравитропическую реакцию индуцировали путём поворота чашек Петри на 90° в вертикальной плоскости.

Визуализация активности GUS и анализ цифровых изображений GUS-зависимого окрашивания. Активность глюкуронидазы в растениях DR5::GUS визуализировали с помощью окрашивания с X-Gluc в 50 мМ Na-фосфатном буфере (pH 7,0, 1 мМ X-Gluc, 0,5 мМ ферро- и 0,5 мМ феррицианид калия, 0,5% Тритон Х-100 и 2 мМ EDTA) при 37°С в течение 24 ч после 2-х мин вакуумной инфильтрации. Препараты фиксировали в течение 1 мин в 2% глутаральдегиде и заключали в глицерин. Цифровые микрофотографии GUS-зависимого окрашивания получали с помощью фотокамеры Canon EOS 40D, установленной на микроскоп Биолам Р-16. Использовали идентичные для каждой серии опытов настройки: ISO 100, Tv 1/200 с, формат JPEG sRGB 8-бит. Перевод цифровых единиц в физические единицы длины производили по микрофотографиям шкалы объект-микрометра. Изображения анализировали в ImageJ и Adobe Photoshop в цветовой модели RGB, площадь исследуемых тканей корня определяли в ImageJ. Цветовую информацию получали в Photoshop инструментом Color Sampler с усреднением по области 5x5 точек и переносили в Excel (Пожванов, Медведев, 2008).

Определение содержания ИУК в корне методом ГХ/МС. В работе использовали вариант метаболомного анализа с получением ТМС-производных. Фиксацию и экстракцию метаболитов проводили в метаноле при 6°С. В качестве внутреннего стандарта использовали ванилин. Дериватизацию проводили с BSTFA при 100°С в течение 25 мин. Анализ проводили на газовом хроматографе - масс-спектрометре Agilent 6850 GC / 5975В VL MSD на капиллярной колонке DB-5HT, контролируя постоянство газового потока при линейном повышении температуры. Пробу вводили в режиме импульсной ин-жекции без деления потока. Детекцию проводили в режиме мониторинга отдельных ионов (SIM): 194 m/z (ванилин-ТМС), 202 m/z и 319 m/z (ИУК-2ТМС). Хроматограммы обрабатывали в Agilent MSD ChemStation. Концентрацию ИУК рассчитывали в Excel, исходя из предположения о линейной зависимости между отношением площадей пиков и концентраций ИУК и внутреннего стандарта.

Расчёт концентрации ИУК в тканях корня. Входными данными служили значения яркости в канале R цифрового изображения и данные об абсолютном содержании ауксина в 1-см отрезке кончика корня, полученные методом ГХ/МС. Оптическую плотность GUS-зависимого окрашивания в канале R рассчитывали в точке цифрового изображения как DR = -lg(Ä//f0), где Ä0 - яркость фона. Содержание ИУК оценивали по формуле вида Сиук = aD r + bDR + с, где a,b,c- параметры квадратичной регрессии.

Визуализация и анализ организации актинового цитоскелета.

Актиновый цитоскелет в растениях DR5::GUS окрашивали родамин-фаллоиди-ном после фиксации параформальдегидом. Растворы готовили на основе актин-стабилизирующего буфера (АСБ, 50 мМ PIPES, 5 мМ EGTA, 5 мМ MgS04, pH 6,9). Проростки на стёклах фиксировали в течение 60 мин в 1,5% пара-формальдегиде в АСБ, pH 7, и трёхкратно обрабатывали в АСБ с 1 % Тритон X-100 и 5% ДМСО в течение 5 мин для пермеабилизации. Окрашивание проводили в темноте в течение 30 мин с 0,18 цМ родамин-фаллоидина в АСБ. После трёх 5-мин отмывок в АСБ удаляли спейсеры и анализировали препарат при помощи прямого конфокального микроскопа Leica TCS SPE (объектив 40х, NA 1,15; лазер 532 нм). Актиновый цитоскелет в растениях GFP-/ABD2 визуализировали in vivo при помощи инвертированного конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM 710 (объектив 40х, C-Apochromat, NA 1,2; лазер 488 нм). Обработку конфокальных изображений проводили в ПО Leica LAS AF, Carl Zeiss ZEN 2009, 2011. Суммарные проекции оптических срезов в зоне растяжения в центральной части и в области коры корня анализировали визуально и в Adobe Photoshop. Для описания морфологии актиновых микрофиламентов использовали индекс искривлённости: /curv. = (£naxiai) / (£/irad¡ai)> где «axial и /7radiai - число пересечений актиновых микрофиламентов с аксиальными и радиальными линиями сетки соответственно. Микрофиламенты актина классифицировали как аксиальные, наклонные или поперечные, если угол между ними и осью корня составлял соответственно 0-22.5°, 22.5-67.5° и 67.5-90°. На гистограммах показана встречаемость в конфокальных изображениях аксиально, наклонно и поперечно ориентированных микрофиламентов.

Определение скорости роста корня и угла гравитропи ческого изгиба корней проростков арабидопсиса проводили по изображениям, полученным с фотокамер Canon PowerShot G9, смонтированных на роботизированной установке Zaber. С её помощью фотокамеры позиционировали против чашек Петри с растениями и производили съёмку с интервалом 6 мин. В ImageJ измеряли длину корня / и угол гравитропического изгиба а гравистимулирован-ных растений. В каждом варианте подсчитывали / и а для 8-40 индивидуальных проростков. Для изучения влияния этилена на скорость роста корня и угол гравитропического изгиба в чашках Петри с растениями размещали ватный тампон, содержащий 1 мл 7 мМ водного раствора (pH 7) этилен-продуцента этефона. Объёмная концентрация этилена в атмосфере чашки Петри составляла до 2000 рргп.

Статистическая обработка результатов. Эксперименты проводили как минимум в трёхкратной биологической повторности. Значимость различий оценивали по критерию Стьюдента (р<0,05). В работе обсуждаются только статистически значимые различия. На рисунках приведены типичные микрофотографии.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние гравистимуляции и этилена на рост корней растений Со1-0 и GFP-/ABD2

На первом этапе работы было проведено сравнение скорости роста в длину и развития гравитропического изгиба у растений дикого типа (Со1-0) и трансгенных растений GFP-/ABD2. Оказалось, что скорость роста корня трансгенных растений (0,24 мм/ч) снижена на 17% по сравнению с растениями дикого типа (0,29 мм/ч). Прирост корня в растениях GFP-/ABD2 достигал величины, равной приросту корней растений дикого типа на 30-45 мин позже (рис. 1). Следует отметить, что в первые 20-60 мин от начала наблюдения у трансгенных растений скорость роста была ниже, чем в последующем. Это означает, что растения GFP-/ABD2 чувствительны к перемещению в установку, где производили серийную съёмку. Вероятно, эта повышенная чувствительность к механическим воздействиям опосредована актиновым цитоскелетом и требует специальных условий выращивания для наблюдения микрофиламентов in vivo.

Обработка этиленом в концентрации до 2000 рргп в течение 3 ч приводила к торможению роста корня как растений дикого типа, так и трансгенных растений GFP-/ABD2 на 41% и 33% соответственно (рис. 1, рис. 4; видео: http://goo.gl/qF7Zc; таблица 1). Достоверных различий в скорости роста вертикально ориентированных корней растений дикого типа и GFP-/ABD2, обработанных этиленом, не наблюдалось. После поворота на 90° в поле силы тяжести скорость роста трансгенных растений (0,25 мм/ч) также была ниже (на 19%), чем у растений дикого типа (0,31 мм/ч). Обработка этиленом в концентрации до 2000 ррш в течение 3 ч до гравистимуляции приводила к торможению роста корня как у растений дикого типа (на 19%), так и у GFP-fABD2 (на 44%; рис. 2, таблица 1). Таким образом, обработка этиленом приводила к снижению скорости роста гравистимулированных растений дикого типа до уровня нормально растущих трансгенных растений GFP-/ABD2. Ингибирующий эффект этилена на трансгенные растения было более выраженным при гравистимуляции, нежели при их нахождении в вертикальном положении.

Таблица 1. Влияние этилена на скорость роста корней (мм/ч) вертикально ориентированных и гравистимулированных проростков арабидопсиса Со1-0 и СГР-/АВБ2 при гравистимуляции и обработке этиленом (3 ч).

Вариант Вертикальное положение Гравистимуляция

Со1-0 GFP-fABD2 Со1-0 GFP-fABD2

Контроль 0,290 ±0,024 0,239 ±0,018 0,313 ±0,021 0,254 ±0,016

Этилен (2000 ррш, 3 ч) 0,169 ±0,027 0,155 ±0,019 0,249 ±0,016 0,142 ±0,021

Гравистимуляцию осуществляли путём поворота чашек Петри с растениями на 90° относительно вектора силы тяжести.

Рис. 1. Влияние этилена на рост корней вертикально ориентированных АгаЫс1ор$1.ч /ИаНапа дикого типа (Со1-0) и трансгенных растений О РР-/Л В О 2 (п=10).

Рис. 2. Влияние этилена на рост корней гравистимулированных (поворотом на 90°) ЛгаЬ'и1ор.ч1.<; (ИаЦапа дикого типа (Со1-0) и трансгенных растений СЬ'Р-/ЛВ02 (п=10).

Сравнительный анализ влияния обработки этиленом на развитие грави-тропического изгиба корней растений дикого типа и GFP-/ABD2 показал, что у растений Со1-0, обработанных этиленом, угол гравитропического изгиба не отличался от контрольных, либо в первые 30 мин гравистимуляции развивался быстрее. Поскольку при обработке этиленом у растений Со1-0 наблюдали торможение роста корня в длину (рис. 2), а развитие ростовой реакции, оцениваемое по углу гравитропического изгиба (рис. 3), происходило так же, как в контрольном варианте, можно сделать вывод о том, что этилен ускоряет развитие гравитропической реакции в растениях дикого типа. У гравистимули-рованных растений GFP-/ABD2 в первые 30 мин угол гравитропического изгиба не отличался от угла изгиба растений дикого типа, но затем наблюдали замедление ростовой реакции на 60-120 мин по сравнению с растениями дикого типа. При обработке растений GFP-/ABD2 этиленом наблюдали торможение гравитропической реакции в течение всего времени наблюдения (рис. 3). По-видимому, в трансгенных растениях наличие химерного белка GFP-ÍABD2, взаимодействующего с актиновым цитоскелетом, не влияет на этап грави-рецепции и трансдукции сигнала в проростках, ориентированных вертикально. Однако при обработке этиленом присутствие белка GFP-ÍABD2 приводит к торможению развития гравитропической реакции как на этапе рецепции и трансдукции сигнала, так и на этапе ответной ростовой реакции.

Литературные данные свидетельствуют о том, что этилен может являться положительным регулятором гравитропизма у кукурузы: обработка салициловой кислотой — специфическим ингибитором синтеза этилена из АЦК — приводила к торможению гравитропического ответа колеоптилей кукурузы (Lee et al., 1990; Медведев, Маркова, 1991). Из настоящей работы следует, что влияние этилена на гравитропическую реакцию корня различается у растений дикого типа и трансгенных растений GFP-/ABD2: у растений дикого типа этилен подавляет рост корня и не влияет на угол гравитропического изгиба, а у GFP-fABD2 тормозит и рост, и гравитропический изгиб. Вероятно, конститутивная экспрессия трансгенного белка, взаимодействующего с актином, затрудняет связывание других белков с актиновым цитоскелетом, среди которых могут быть белки, опосредующие эффект этилена.

2. Изучение роли ауксина в регуляции гравитропизма

Стандартная методика метаболитного профайлинга не позволяет обнаружить ауксин в ткани. После оптимизации условий анализа в режиме SIM (202, 319 m/z) стало возможным зарегистрировать производные ИУК в количестве от 1,3 х 10~15 г в образце. 7-суточный проросток трансгенного A. thaliana DR5::GUS содержал в среднем 15,9 ± 1,0 пг свободной ИУК на мг сырой массы растения. С учётом содержания ИУК в отрезках корней А. thaliana DR5::GUS, определенного методом ГХ/МС, формула для оценки концентрации ИУК по гистохимическому окрашиванию приобрела вид: С„ук = 242,01/)R2 + 12,447Z)r - 0,2675 х10"15 моль/цм2

Рис. 3. Влияние этилена на развитие гравитропического изгиба (в град.) корней ЛгаЫс1ор$1.1 ?каИапа дикого типа (Со1-0) и трансгенных растений СРР-/АВ02 после поворота на 90° в поле силы тяжести (п=10).

Рис. 4. Развитие гравитропического изгиба корней проростков Лгаб/й'орда ЛаПапа дикого типа (Со1-0) и трансгенных растений СРР-/АВЬ2 в течение 60 мин после обработки этиленом. Слева - вертикально растущие проростки, справа — гравистимуля-ция. Стрелками отмечено положение кончика корпя в начале эксперимента. Масштабная линейка 1 см.

смонтированное видео (12 ч в 30 с видео) доступно по адресу: http://goo.gl/qF7Zc (МР4, 50,27 Мб).

С использованием предложенного нами метода оценки содержания ИУК на гистологических препаратах были определены параметры латерального перераспределения ауксина, которое реализуется при гравистимуляции корней растений арабидопсиса в течение 90 мин. В растениях, расположенных вертикально, содержание ИУК было равномерным и составляло около 1,0 -г-1,5 х 10~14 моль/рм2 (рис 5а, 6а). После гравистимуляции содержание ИУК в апикальной меристеме и зоне растяжения корня составляло в верхней части около 1,8 х 10~14 моль/цм2 и 0,8 х 10~14 моль/цм2 соответственно, а в нижней части корня в области апикальной меристемы достигало 6,5 х 10~14 моль/цм2, в зоне растяжения - 4,7 х ю~14 моль/цм2 (рис. 56, 66).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при переориентации растений арабидопсиса в поле силы тяжести в течение 90 мин в зоне апикальной меристемы корня и зоны растяжения формируется латеральный градиент концентрации ауксина. Концентрация этого фитогормона в нижней части корня в 2-3 раза превышает концентрацию в верхней части корня. Это приводит к ингибированию роста растяжением в нижней части гравистимулированных корней и обеспечивает ростовой изгиб в сторону действия силы тяжести. В нашей работе латеральное перераспределение ИУК, визуализируемое с помощью GUS-зависимого окрашивания, в силу времени развития не может соответствовать этапу трансдукции гравитационного сигнала. Мы предполагаем, что латеральный градиент ИУК, наблюдаемый после гравистимуляции, необходим для регуляции ростового ответа.

3. Изучение роли актинового цитоскелета в регуляции гравитропизма

С применением широко используемого метода визуализации актинового цитоскелета с помощью окрашивания родамин-фаллоидином (Van Gestel, Verbelen, 2001) в вертикально ориентированных растениях микрофиламенты F-актина были выявлены в центральной части апикальной меристемы корня и в стеле в зоне растяжения. В клетках апикальной меристемы корня микрофиламенты актина были ориентированы в различных направлениях, не демонстрируя чёткой организации, характерной для клеток стелы (рис. 7). В зоне растяжения актиновый цитоскелет был представлен преимущественно толстыми пучками микрофиламентов, которые имели преимущественно аксиальную ориентацию. Доля наклонно ориентированных микрофиламентов, направленных к латеральной поверхности плазматической мембраны клеток, была незначительной (рис. 7). Актиновый цитоскелет в клетках коры корня не был выявлен. Для оценки морфологии актинового цитоскелета использовали индекс искривлённости микрофиламентов. В зоне растяжения индекс искривлённости микрофиламентов возрастал более чем вдвое после 15-30 мин гравистимуляции и затем снижался, приближаясь к контрольному уровню (рис. 8). Поскольку родамин-фаллоидин позволил выявить актиновый цитоскелет только в стеле, но не в коре и ризодерме, в дальнейшем мы использовали растения арабидопсиса, трансформированные генетической конструкцией GFP-/ABD2, позволяющей визуализировать актиновые микрофиламенты прижизненно без необходимости фиксации и длительной обработки перед наблюдением.

Рис. 6. Содержание ИУК в апикальной меристеме и зоне растяжения корня А. вгаНапа ОК5::ОШ в норме и при гравистимуляции. (а) - содержание ИУК в вертикально ориентированном корне (контроль) в зоне растяжения; (б) - содержание ИУК в гравистимули-рованном в течение 90 мин корне арабидопсиса. На врезках схематично показан кончик корня и положение профилей концентрации ИУК в зоне растяжения (А-Б) и в апикальной меристеме (В-Г), стрелкой отмечено направление вектора силы тяжести.

Рис. 7. Организация актинового цитоскелета в апикальной меристеме и в зоне растяжения корня А ЛаНапа 0Я5::0118 в вертикально растущем корне (контроль) и после 15, 30, 60 и 120 мин гравистимуляции путём поворота чашек Петри с растениями на 90°. Окрашивание родамин-фаллоидином после фиксации параформальдегидом. Приведены суммарные проекции 56 оптических срезов. Масштабные отрезки 50 цм.

к

0 ГО

1 X

о

«А

т

5

О

120 мин

контроль 15 мин

30 мин

60 мин

Рис. 8. Индекс искривлённости актиновых микрофиламентов в зоне растяжения гравистимулированных корней А. ¡каИапа ОР5::Ои!5.

В кончике корня растений СРР-/АВ02 актиновый цитоскелет был выявлен во всех исследованных типах клеток от апикальной меристемы до зоны растяжения. В вертикально ориентированных корнях (контроль) микро-филаменты в клетках стелы были организованы в толстые пучки, ориентированные преимущественно аксиально (рис. 10, а, б). В коре корня и в ризодерме актиновый цитоскелет был представлен более тонкими нитями, расположенными параллельно оси корня или наклонно.

Следует отметить, что помещение проростка на предметный стол микроскопа также является гравистимуляцией. Поэтому необходимо было выяснить, как эта процедура будет влиять на организацию актинового цитоскелета. На рис. 9 приведены оптические срезы, полученные с 5-мин интервалом и проходящие через стелу и кору корня в зоне растяжения в растениях СРР-/АВ02. Первые видимые перестройки актинового цитоскелета и появление новых микрофиламентов наблюдали не ранее, чем через 20 мин после помещения проростка арабидопсиса на предметный стол конфокального микроскопа. Этого времени достаточно, чтобы зарегистрировать серию из 10-15 оптических срезов для визуализации актинового цитоскелета и избежать появления в г-серии микрофиламентов, изменение ориентации которых обусловлено гравистимуляцией в новом направлении (рис. 9). Кроме того, данные о динамике актинового цитоскелета свидетельствуют о том, что при гравистимуляции корней проростков СРР-/АВ02 реорганизация актинового цитоскелета происходит позже, чем у растений, не синтезирующих трансгенный актин-связывающий белок. При помощи окрашивания родамин-фаллоидином наблюдали изменения в структуре актинового цитоскелета через 15 мин после начала гравистимуляции.

В дальнейшем изучали реорганизацию актинового цитоскелета при гравистимуляции путём поворота в вертикальной плоскости чашек Петри с растениями на стёклах на 90° относительно вектора силы тяжести. После гравистимуляции проростков СРР-/АВ02 в течение 30 мин в коре корня

наблюдали появление микрофиламентов актина, ориентированных наклонно (рис. 10, в, г) и поперечно (перпендикулярно оси органа, рис. 10, в). Микрофиламенты в стеле были ориентированы преимущественно аксиально.

Рис. 9. Изменения организации актинового цитоскелета в зоне растяжения корня А. ЛаНапа СРР-/АВй2 при гравистимуляции, обусловленной размещением растений на предметном столе конфокального микроскопа.

Рамками обозначена область в коре корня, в которой к 20-й мин гравистимуляции выявлены вновь образовавшиеся микрофиламенты актина. Стрелками указаны наклонно и поперечно ориентированные микрофиламенты.

Приведены суммарные проекции 7-9 оптических срезов. Масштабные отрезки 50 цм.

После 60 мин гравистимуляции в зоне растяжения корней растений С/7'-/АВй2 наблюдали дальнейшее увеличение доли наклонно и поперечно ориентированных микрофиламентов (рис. 10, д, е). Доля аксиально ориентированных микрофиламентов снижалась приблизительно в два раза (рис. 10, в, г) по сравнению с контролем (рис. 10, б), тогда как доля наклонно и

поперечно ориентированных микрофиламентов увеличивалась в 1,5 и 3-4 раза соответственно. Существенное увеличение доли поперечно ориентированных микрофиламентов означает, что при гравистимуляции происходит сборка преимущественно таких микрофиламентов, направление которых параллельно вектору силы тяжести.

Рис. 10. Реорганизация актинового цитоскелета в зоне растяжения корня А. вюНапа йРР-/А£Ю2 при гравистимуляции путём поворота в вертикальной плоскости чашек Петри с растениями на стёклах на 90е относительно вектора силы тяжести.

а, б - контроль; в, г - гравистимуляция 30 мин; д, е - гравистимуляция 60 мин; а, в, д -кора корня; б, г, д - стела. Цифрами обозначены: 1 - аксиально, 2 - наклонно, и 3 -поперечно ориентированные микрофиламенты. Микрофиламенты визуализированы прижизненно с помощью конструкции СРР-[АВ02. Приведены суммарные проекции 7-9 оптических срезов. Масштабные отрезки 50 цм.

а

■ 30

5

.................я..................

аксиальные

наклонные

поперечные Микрофиламенты « актина

наклонные в

поперечные Микрофиламенты актина

Рис. 11. Количественная характеристика реорганизации актиновых микрофиламентов в гравистимулированных корнях арабидопсиса GFP-/ABD2: а — контроль, б -гравистимуляция 60 мин, верхняя часть, в - гравистимуляция 60 мин, нижняя часть корня.

В отличие от метода окрашивания актинового цитоскелета с родамин-фаллоидином, использование трансгенных растений GFP-/ABD2 позволяет выявлять микрофиламенты актина в разных типах клеток (рис. 10). Растения, несущие данную конструкцию, не имеют нарушений физиологии, присущих слиянию GFP с актин-связывающим белком талином (GFP-mTn) или же двойному слиянию GFP-ABD2-GFP (Sheahan et al., 2004; Voigt et al., 2005, Wang et al., 2008). Дополнительное преимущество визуализации микрофиламентов с использованием конструкции GFP-/ABD2 заключается в отсутствии необходимости процедур фиксации и отмывки растительного материала, которые могли бы повлиять на организацию актинового цитоскелета. Всё это позволяет распространить на растения дикого типа данные об реорганизации актинового цитоскелета при гравистимуляции, полученные на растениях GFP-fABD2, учитывая, однако, меньшую скорость роста трансгенных растений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате выполненного исследования впервые установлено, что изменение положения корня арабидопсиса в пространстве приводит к реорганизации актинового цитоскелета в зоне растяжения корня после 20 мин гравистимуляции. Наиболее выраженные изменения наблюдали после 3060 мин, в течение которых в раза увеличивалась доля поперечно ориентированных микрофиламентов, сонаправленных вектору силы тяжести. Учитывая время, в течение которого происходит реорганизация микрофиламентов в зоне растяжения, можно сделать вывод о том, что выявленная нами реорганизация актинового цитоскелета относится к позднему этапу трансдукции гравитационного сигнала и ростовой реакции корня. Эти факты указывают на то, что актиновый цитоскелет имеет непосредственное отношение к развитию гравитропической реакции. По-видимому, для гравирецепции и трансдукции сигнала достаточно микрофиламентов, уже имеющихся в клетках.

Разработанный нами метод оценки концентрации ауксина на гистологических препаратах позволил измерить латеральный градиент концентрации ИУК, развивающийся при гравистимуляции (90 мин) в зоне растяжения корня арабидопсиса. Оказалось, что содержание ИУК в нижней части корня увеличивается в 2-3 раза. Поэтому мы предполагаем, что реорганизация актинового цитоскелета в зоне растяжения способствует поддержанию латерального градиента ИУК, задающего асимметричный рост корня.

Показано, что фитогормон этилен оказывает модулирующее действие на гравитропическую реакцию. У растений дикого типа этилен ускоряет развитие гравитропической реакции. У трансгенных растений GFP-/ABD2, используемых для визуализации актинового цитоскелета, этилен приводит к торможению роста корня в длину и развития гравитропического изгиба.

Подводя итог настоящей работе, можно предложить следующую последовательность событий, инициированных переориентацией корня в поле силы тяжести (гравистимуляцией). На этапе рецепции и трансдукции гравитационного сигнала гравистимуляция вызывает седиментацию статолитов в направлении вектора силы тяжести (Blancaflor et al., 1998) и формирование первичного латерального градиента ИУК в кончике корня благодаря PIN3-зависимому транспорту ауксина в корневом чехлике (Friml etal., 2002; Ottenschlager etal., 2003; Band etal., 2012). На данном этапе актиновый цитоскелет является негативным регулятором гравитропической реакции, поскольку тормозит взаимодействие статолитов и механорецепторов (Morita, 2010).

В ходе трансдукции гравитационного сигнала и начала ответной ростовой реакции происходит реорганизация актинового цитоскелета в зоне растяжения корня. На этом этапе актиновый цитоскелет является позитивным регулятором, так как способствует формированию „транспортного канала" для передвижения ауксина на нижнюю часть гравистимулированного корня. Формирование латерального градиента ИУК при этом обеспечивается за счёт

перемещения переносчиков ауксина PIN2 на нижнюю часть клеток в коре корпя, что обусловливает транспорт ИУК в латеральном направлении в зоне растяжения корня (Abas étal., 2006). На третьем (заключительном) этапе гравитропической реакции накопление ауксина в нижней части корня приводит к торможению роста клеток и формированию ростового изгиба.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод количественной оценки содержания ИУК на гистологических препаратах трансгенных растений арабидопсиса DR5::GUS.

2. Установлено, что при гравистимуляции поворотом на 90° относительно вектора силы тяжести в кончике корня формируется латеральный градиент ауксина, характеризующийся перепадом концентрации в 2-3 раза. При этом содержание ИУК в нижней части апикальной меристемы и зоны растяжения корня составляет около 5,5*10~14 моль/рм2, а в верхней части -от 0,8 до 1,8 хЮ"14 моль/рм2.

3. Окрашивание актинового цитоскелета с помощью родамин-фаллоидина выявляет только толстые микрофиламенты актина в стеле корней арабидопсиса. После 15 мин гравистимуляции индекс искривлённости актиновых микрофиламентов в стеле в зоне растяжения корня увеличивался в 2 раза, после чего снижался, возвращаясь к первоначальному уровню.

4. Использование растений арабидопсиса, трансформированных конструкцией GFP-/ABD2, позволяет выявлять актиновый цитоскелет во всех клетках кончика корня. В вертикально ориентированных корнях в клетках стелы микрофиламенты организованы в толстые пучки, ориентированные преимущественно аксиально. В коре корня и ризодерме актиновый цитоскелет представлен более тонкими нитями, расположенными параллельно или наклонно относительно оси корня.

5. После 30-60 мин гравистимуляции проростков GFP-/ABD2 происходит снижение доли аксиально ориентированных микрофиламентов актина при одновременном увеличении доли наклонных и поперечных микрофиламентов.

6. Обработка этиленом в концентрации 2000 ррш вызывает подавление гравитропической реакции. При этом наблюдается снижение скорости роста и уменьшение угла гравитропического изгиба.

7. Предложена последовательность взаимодействия ауксина и актинового цитоскелета в регуляции гравитропической реакции в корне арабидопсиса.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Пожванов Г.А., Медведев С.С. Метод количественной оценки содержания ауксина по гистохимическому окрашиванию на активность GUS под контролем ауксин-чувствительного промотора // Физиология растений. 2008. Т. 55, №. 5. С. 786-792.

2. Пожванов Г.А., Суслов Д.В., Медведев С.С. Реорганизация актинового цитоскелета при гравистимуляции корней растений арабидопсиса // Труды Томского государственного университета. 2010. Vol. Т. С. 305-308.

Тезисы конференций:

1. Медведев С.С., |Катоп АЛО], Шарова Е.И., Маркова И.В., Пожванов Г.А., Билова Т.Е., Аврутина О.В., Суслов М.В. Роль ауксина, кальция и клеточной стенки в процессах морфогенетического паттернирования тканей и органов растительного организма // VI Съезд Общества физиологов растений России «Современная физиология растений: от молекул до экосистем». Материалы докладов. Сыктывкар, Россия. 18-24 июня 2007, Коми НЦ УрО РАН. 2007. 327-329.

2. Пожванов Г.А. Количественная оценка содержания фитогормона ИУК по гистохимическому окрашиванию на GUS-активность // 11-я международная пущинская школа-конференция молодых учёных. Материалы докладов. Пущино, Россия. 29 октября - 2 ноября 2007, ПНЦ РАН. 2007. С. 213-214.

3. Pozhvanov G.A. Quantitative estimation of IAA content based on histochemical staining of GUS-activity // FESPB 2008 Congress. 18-22 August 2008, Tampere, Finland. Physiologia Plantarum 133, 2008. P06-045.

4. Pozhvanov G., Shavarda A., Medvedev S. Quantitative auxin measurement in Arabidopsis roots with combined GC/MS and cytochemistry // International Plant Growth Substances Association Conference 2010. 28 June - 2 July 2010, Tarragona, Spain. 2010. PS05-06.

5. Pozhvanov G., Medvedev S. Polar IAA transport during Arabidopsis root gravitropism: quantitative analysis with cytochemistry and GC/MS // FESPB 2010 Congress. 4-9 July 2010, Valencia, Spain. P06-004.

6. Пожванов Г.А., Суслов Д.В., Медведев С.С. Актнновый цитоскелет и транспорт ИУК в гравитропической реакции корней трансгенных растений Arabidopsis thaliana DRSr.GUS и fABD2:GFP II III Всероссийский симпозиум «Физиология трансгенного растения и фундаментальные проблемы биобезопасности». Материалы докладов. Москва, Россия, 18-21 октября 2010. С. 65.

7. Пожванов Г.А., Суслов Д.В., Медведев С.С. Перестройки актинового цитоскелета в ходе гравитропической реакции корней арабидопсиса // VII Съезд Общества физиологов растений России «Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и Международная научная школа «Инновации в биологии для развития

биоиндустрии сельскохозяйственной продукции». Материалы докладов. Нижний Новгород, Россия. 4-10 июля 2011, Издательство НГУ. С. 567. 8. Pozhvanov G.A., Suslov D.V., Shavarda A.L., Medvedev S.S. Arabidopsis root gravitropism is directed by IAA redistribution and subséquent actin cytoskeleton rearrangement II FESPB 2012 Congress, Plant Biology in Space Satellite Symposium. 29 July - 3 August 2012, Frieburg, Germany. P. 227.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АСБ — актин-стабилизирующий буфер

А ЦК— 1-аминоциклопропан-1-карбоновая кислота, предшественник этилена

ГХ/МС — газовая хроматография - масс-спектрометрия

ИУК — индол-3-уксусная кислота, ауксин

МС/2 — среда Мурасиге-Скуга

ТМС — триметилсилильный фрагмент, -Si(CH3)3

BSTFA — бис-триметилсилилтрифторацетамид

Col-0 — Columbia-O, растения арабидопсиса дикого типа

DR5 — синтетический ауксин-чувствительный промотор

EDTA — этилендиаминтетраукусная кислота

EGTA — этиленгликоль-бис[бета-аминоэтиловый эфир^Ы,N,N',N'-TeTpa-уксусная кислота

fABD2 — второй (С-концевой) актин-связывающий домен фимбрина 1 арабидопсиса

GFP — зелёный флуоресцентный белок

GFP-/ABD2 — генетическая конструкция для визуализации актинового цитоскелета, в которой GFP слит с актин-связывающим белком GUS — p-D-глюкуронидаза

PIN — семейство белков-переносчиков ауксина, обеспечивающих выход ИУК из клетки

PIPES — пиперазиндиэтансульфоновая кислота

RGB — цифровая модель представления цвета, в которой информация представлена данными о яркости в каждом из 3-х каналов: красном, зелёном и синем X-Gluc — 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-0-глюкопиранозид

Подписано в печать «30» октября 2012 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ № 3110.

Типография «Восстания — 1» 191036, Санкт-Петербург, ул. Восстания, д. 1.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пожванов, Григорий Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Модели и механизм гравитропической реакции.

1.2. Роль фитогормонов в регуляции гравитропической реакции.

1.2.1. Ауксин, механизм полярного транспорта и мембранные переносчики.

1.2.2. Механизм рецепции ауксина и регуляция роста клеток растяжением.

1.2.3. Роль цитокининов в регуляции роста корня и гравитропизма.

1.2.4. Роль этилена в регуляции роста корня и гравитропизма.

1.3. Цитоскелет и везикулярный транспорт в регуляции гравитропизма.

1.3.1. Организация и регуляция структуры актинового цитоскелета.

1.3.2. Актиновый цитоскелет и процесс полярного транспорта ИУК.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Условия выращивания растений.

2.3. Гравистимуляция растений.

2.4. Визуализация активности GUS.

2.5. Анализ цифровых изображений GUS-зависимого окрашивания.

2.6. Определение содержания ИУК в корне методом газовой хроматографии -масс-спектрометрии.

2.6.1. Экстракция метаболитов и пробоподготовка.

2.6.2. Хроматографический анализ метаболитных экстрактов и расчёт содержания ИУК.

2.7. Расчёт концентрации ИУК в тканях корня.

2.8. Визуализация актинового цитоскелета в растениях DR5::GUS.

2.9. Визуализация актинового цитоскелета in vivo в растениях GFP-/ABD2.

2.10. Анализ организации актинового цитоскелета.

2.11. Определение скорости роста корня и угла гравитропического изгиба.

2.12. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Влияние гравистимуляции и этилена на рост корней растений Со1-0 и GFP-fABD2.

3.2. Изучение роли ауксина в регуляции гравитропизма.

3.2.1. Анализ содержания ИУК в ткани растения.

3.2.2. Латеральный градиент ауксина в гравистимулированных корнях арабидопсиса.

3.3. Изучение роли актинового цитоскелета в регуляции гравитропизма.

3.3.1. Реорганизация актинового цитоскелета в корнях растений^, thaliana DR5::GUS при гравистимуляции.

3.3.2. Реорганизация актинового цитоскелета в корнях растений A. thaliana GFP-/ABD2 при гравистимуляции.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль фитогормонов и актинового цитоскелета в регуляции гравитропизма у арабидопсиса"

Актуальность проблемы. Понимание физиологических и молекулярных основ становления полярности высших растений является одной из фундаментальных проблем биологии растений. Полярность можно определить как асимметрию в организации и физиологических функциях растительного организма (Медведев, 2004). Растения приобретают полярную организацию на самых ранних стадиях развития: точка проникновения спермия определяет ризоидальный полюс зиготы фукуса (Hable, Hart, 2010), а зародыш арабидопси-са уже на стадии 2-х клеток проявляет асимметрию в распределении фито-гормона ауксина (Berleth et al., 2004). С этого момента и на протяжении всего онтогенеза растения, находясь на Земле, испытывают воздействие силы тяжести, модуль и вектор которой постоянны. Сила тяжести задаёт ось полярности наземных и подземных органов растения, а ростовая реакция на изменение положения органа в пространстве - гравитропизм - регулируется ауксином при участии системы его транспорта и цитоскелета. Предполагается, что в регуляции гравитропизма также могут принимать участие и другие фитогормоны — цитокинины, этилен (Карпенко и др., 1993; Aloni et al., 2006). За прошедшие 10 лет достигнут значительный прогресс в изучении роли переносчиков ауксина семейства PIN в регуляции гравитропизма арабидопсиса (Muday, Murphy, 2002; Friml et al., 2002; Boutté et al., 2006; Kleine-Vehn et al., 2006; Teale et al., 2006; Robert, Friml, 2009; Viaene et al., 2012). Выяснилось, что локализация переносчиков PIN на цитоплазматической мембране клеток задаёт направление полярного транспорта ауксина в кончике корня, а при гравистимуляции перемещение PIN3 на нижнюю мембрану клеток колумеллы индуцирует латеральный градиент концентрации ИУК в области апикальной меристемы корня (Friml et al., 2002). Кроме того, с использованием ингибиторов актинового цитоскелета было показано, что микрофиламенты актина необходимы для рециркуляции белков PIN и, таким образом, вовлечены в регуляцию гравитропической реакции (Staves et al., 1997; Muday, 2000). Для исследования актино-вого цитоскелета были созданы трансгенные конструкции, позволяющие прижизненно визуализировать микрофиламенты (Kost et al., 1998; Sheahan et al., 2004). Было показано, что актиновый цитоскелет важен на самой ранней стадии гравитропической реакции (Baluska, Hasenstein, 1997; Yamamoto, Kiss, 2002; Hou etal., 2003; Morita, 2010; Nakamura etal., 2011), а позднее его организация находится под влиянием ауксина (Nick et al., 2009). Тем не менее, остаётся неясным, какое значение для гравитропической реакции имеет организация актинового цитоскелета, может ли актиновый цитоскелет определять направление транспорта ИУК при гравистимуляции, и какое участие в регуляции гравитропизма принимает стрессовый гормон этилен.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было изучение роли фитогормонов и актинового цитоскелета в регуляции гравитропической реакции корней арабидопсиса.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

I t * 1 i ; ' t f

1. Провести. сравнительный( анализ развития гравитропйческого изгиба корней арабидопсиса дикого типа и трансгенных растений GFP-/ABD2.

2. Разработать метод количественного анализа ИУК на гистологических препаратах трансгенных растений арабидопсиса DR5::GUS.

3. Охарактеризовать параметры латерального перераспределения ауксина в корнях арабидопсиса при гравистимуляции.

4. Оценить влияние этилена на гравитропическую реакцию корней арабидопсиса.

5. Исследовать изменения организации актинового цитоскелета при гравистимуляции корней арабидопсиса.

Научная новизна работы. Для оценки морфологии актиновых микро-филаментов, визуализированных с помощью родамин-фаллоидина, предложен индекс искривлённости. Показано, что после 15 мин гравистимуляции индекс искривлённости микрофиламенты актина в стеле корней арабидопсиса возрастает в 2 раза.

Впервые с использованием трансгенных растений ОГР-/АВ02, позволяющих прижизненно визуализировать микрофиламенты, показано, что грави-стимуляция корней АгаЫс1ор$1$ ЛаИапа вызывает реорганизацию актинового цитоскелета в зоне растяжения корня. Продемонстрировано, что при гравистимуляции происходит снижение доли аксиально ориентированных микрофиламентов, а доля актиновых микрофиламентов, ориентация которых сонаправлена вектору силы тяжести, увеличивается в 3-4 раза.

Разработан оригинальный метод количественной оценки фитогормона ауксина на гистологических препаратах арабидопсиса ОЯ5::СиБ. Впервые проведён количественный анализ латерального перераспределения ауксина в зоне растяжения корня арабидопсиса, и с его помощью установлено, что при гравистимуляции в нижней части корня происходит увеличение концентрации ИУК в 2-3 раза.

Впервые показано, что при гравистимуляции этилен не влияет на гравирецепцию и трансдукцию сигнала в корнях растении дикого типа, а у . трансгенных растений СРР-/АВ02 тормозит развитие гравитропической реакции как на этапе рецепции и трансдукции сигнала, так и на этапе ростового ответа.

Теоретическая и практическая значимость результатов исследования. Полученные в диссертационной работе данные расширяют представления о клеточных и гормональных механизмах регуляции гравитропической реакции в корне арабидопсиса. В работе предложен метод оценки концентрации ауксина, который может быть использован при определении других фитогормонов, для которых доступны ОЦБ-репортерные генетические конструкции. Оригинальные данные о влиянии этилена на гравитропическую реакцию корней трансгенных растений арабидопсиса СГР-/А1Ю2 могут быть востребованы при изучении актин-связывающих белков и важны для понимания физиологии трансгенного растения.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены в виде устных докладов на VI съезде Общества физиологов растений России в Сыктывкаре (18-24.06.2007), конференции молодых учёных „Биология - наука XXI века" в Пущино, Россия (29.10-2.11.2007), III Всероссийском симпозиуме „Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности" в Москве, Россия (18.10-21.10.2010), международной конференции „Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий", VII съезде Общества физиологов растений России в Нижнем Новгороде (4— 10.07.2011) и симпозиуме „Plant Biology in Space" в рамках FESPB 2012 во Фрайбурге, Германия (29.07-3.08.2012), а также в виде стендовых докладов на конференциях FESPB 2008 в Тампере, Финляндия (17-22.08.2008), IPGSA 2010 в Таррагоне, Испания (28.06-2.07.2010), FESPB 2010 в Валенсии, Испания (410.07.2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи, из них одна в рецензируемом журнале из списка ВАК, 8 тезисов, и приняты к публикации 2 статьи в рецензируемых журналах.

Поддержка исследования. Работа была выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ №№ 08-04-00566-а „Взаимодействие Са-потоков и редокс-реакций в клеточных стенках в гормональной регуляции роста растений", 11-04-00701-а „Роль фитогормонов, цитоскелета и активных форм кислорода в регуляции роста клеток растяжением и трансдукции гравитационного сигнала" (руководитель грантов - проф., д.б.н. С.С.Медведев), персональных грантов Правительства Санкт-Петербурга №№ 2.6/22-04/004, 2.6/16-05/219-А и гранта ООО ОПТЭК в 2012 г.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Пожванов, Григорий Александрович

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод количественной оценки содержания ИУК на гистологических препаратах трансгенных растений арабидопсиса ВЯ5::Си8.

2. Установлено, что при гравистимуляции поворотом на 90° относительно вектора силы тяжести в кончике корня формируется латеральный градиент ауксина, характеризующийся перепадом концентрации в 2-3 раза. При этом содержание ИУК в нижней части апикальной меристемы и зоны растяжения корня составляет около 5,5x10-14 моль/рм2, а в верхней части - от 0,8 до 1,8 хЮ~14 моль/рм2.

3. Окрашивание актинового цитоскелета с помощью родамин-фаллоидина выявляет только толстые микрофиламенты актина в стеле корней арабидопсиса. После 15 мин гравистимуляции индекс искривлённости актиновых микрофиламентов в стеле в зоне растяжения корня увеличивался в 2 раза, после чего снижался, возвращаясь к первоначальному уровню.

4. Использование растений, арабидопсиса, трансформированных! > конструкцией СРР-/АВВ2, позволяет выявлять актиновый цитоскелет во всех клетках кончика корня. В вертикально ориентированных корнях в клетках стелы микрофиламенты организованы в толстые пучки, ориентированные преимущественно аксиально. В коре корня и ризодерме актиновый цитоскелет представлен более тонкими нитями, расположенными параллельно или наклонно относительно оси корня.

5. После 30-60 мин гравистимуляции проростков С¥Р^АВВ2 происходит снижение доли аксиально ориентированных микрофиламентов актина при одновременном увеличении доли наклонных и поперечных микрофиламентов.

6. Обработка этиленом в концентрации 2000 ррш вызывает подавление гравитропической реакции. При этом наблюдается снижение скорости роста и уменьшение угла гравитропического изгиба.

7. Предложена последовательность взаимодействия ауксина и актинового цитоскелета в регуляции гравитропической реакции в корне арабидопсиса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Хорошо известно (Morita, 2010), что актин может принимать участие в гравитропической реакции на всех её этапах: рецепции механического сигнала, возникающего при гравистимуляции, трансдукции гравитационного сигнала и реализации ростовой реакции - гравитропического изгиба. В ряде работ была описана негативная роль актинового цитоскелета на этапе гравирецепции (Yamamoto, Kiss, 2002; Driss-Ecole et al., 2003; Hou et al., 2003; Nakamura et al., 2011): обработка латрункулином Б, вызывающим деполимеризацию актиновых микрофиламентов, увеличивала угол гравитропического изгиба корней арабидопсиса. Это означает, что в норме актиновый цитоскелет препятствует чрезмерно быстрой седиментации статолитов (Morita, 2010).

Исследование перестроек актинового цитоскелета в первые секунды после переориентации в поле силы тяжести сопряжено с техническими трудностями (Nakamura, 2011). Поэтому, в силу методических ограничений, в настоящей работе исследовали реорганизацию актинового цитоскелета в течение 5-60 мин после начала гравистимуляции. Этот временной период может соответствовать как этапу трансдукции гравитационного стимула (ещё нет видимых изменений в направлении роста корня), так и начальному этапу развития ростового изгиба. Этап трансдукции гравитационного стимула к настоящему времени мало изучен (Morita, Tasaka, 2004; Morita, 2010), однако, известно, что он завершается формированием латерального градиента ауксина, накапливающегося в нижней части гравистимулированного корня (Friml et al., 2002; Aloni et al., 2006; Пожванов, Медведев, 2008; Band et al., 2012). Показано, что градиент ИУК в корне арабидопсиса формируется благодаря активности асимметрично локализованных белков-переносчиков семейства PIN, транспортирующих ауксин из цитоплазмы в межклеточное пространство (Muday, 2000; Geldner etal., 2001; Friml etal., 2002). Переносчики PIN равномерно распределяются в плазмалемме после синтеза de novo, однако, вскоре приобретают асимметричное распределение благодаря селективному удалению из определенных участков мембраны путем эндоцитоза, зависимого от актинового цитоскелета (Geldner et al., 2001; Nick et al., 2009; Rahman et al., 2010). Таким образом, можно предположить, что специфическая организация актинового цитоскелета и его перестройка после гравистимуляции будет определять локализацию белков PIN и направление полярного транспорта ИУК.

Недавно стало известно, что первичное перераспределение ИУК в трансгенных растениях арабидопсиса DII-Venus происходит в пределах 5 мин после начала гравистимуляции (Band et al., 2012). Следовательно, перестройки актина, наблюдаемые в нашей работе через 15-60 мин после гравистимуляции, не могут участвовать в развитии латерального градиента ИУК за счет влияния на везикулярный транспорт переносчиков ауксина. Возможно, что на этапе трансдукции сигнала достаточно уже имеющейся сети микрофиламентов и ее реорганизация не требуется для рециркуляции белков-переносчиков ИУК из семейства PIN. С другой стороны, показано, что перемещение транспортёра ' , 4 - ' * I / >i . . Л ib и-ч", i i >ll'b, , . U 11 hi » ' Mlí

PIN2 на, . латеральную сторону клеток í коры в , зоне1 растяжения' гравистимулированных корней арабидопсиса происходит в течение 90 мин благодаря работе везикулярного транспорта (Abas et al., 2006). Эти данные согласуются с нашими наблюдениями характера реорганизации актинового цитоскелета: увеличивается доля микрофиламентов, сонаправленных вектору силы тяжести. Мы предполагаем, что эти процессы, происходящие после этапа трансдукции гравитационного сигнала и первичного перераспределения ауксина, способствуют поддержанию латерального градиента концентрации ИУК в зоне растяжения, помогая реализовать ростовую реакцию и сформировать гравитропический изгиб - процесс, проходящий в течение нескольких часов.

Существуют данные, свидетельствующие в пользу взаимосвязи транспорта ауксина и организации актиновых филаментов. Так, в работе Waller и коллег, выполненной на колеоптилях кукурузы, была предложена модель, согласно которой ауксин в повышенной концентрации приводит к дополнительной сборке актиновых микрофиламентов в пучки в периферической зоне клеток, что направляет к поверхности клеток целый набор белков, обеспечивающих сигналинг и транспорт ИУК (Waller et al., 2002). Позднее было продемонстрировано, что в клетках риса сверхэкспрессия актин-связывающего белка талина приводила к повышению частоты сборки актина в толстые пучки микрофиламентов, и, как следствие, снижению их динамики, торможению осевого транспорта ауксина и ослаблению гравитропической реакции (Nick etal., 2009). Однако экзогенное внесение ИУК или 1-НУК восстанавливало гравитропизм и процесс полярного транспорта ауксина. Вероятно, между организацией актинового цитоскелета и транспортом ауксина существует обратная связь, обеспечивающая поддержку полярного транспорта ауксина в латеральном направлении в процессе развития гравитропической реакции.

I Ч ^ I

1 Подводя итог 1 обсуждению роли актина, на основе временных < характеристик перестроек актиновых микрофиламентов после гравистимуляции можно сделать вывод об их возможном участии в базовом механизме роста растяжением, который опосредует развитие гравитропического изгиба. Это предположение согласуется с литературными данными о роли актинового цитоскелета в механизме растяжения клеток корня арабидопсиса (Rahman et al., 2007). Кроме того, нельзя исключать роль реорганизации актинового цитоскелета в поддержке латерального градиента концентрации ИУК за счёт специфической локализации переносчиков ауксина в коре корня.

Результаты наших исследований указывают, что актиновый цитоскелет имеет непосредственное отношение к развитию гравитропической реакции. Нами впервые установлено, что изменение положения корня в пространстве приводит к реорганизации актинового цитоскелета в зоне растяжения корня после 20 мин гравистимуляции. Наиболее выраженные изменения наблюдали после 30-60 мин, при которых в 3—4 раза увеличивалась доля поперечно ориентированных микрофиламентов, сонаправленных вектору силы тяжести. Учитывая время, в течение которого происходит реорганизация микрофиламентов в зоне растяжения, можно сделать вывод о том, что выявленная нами реорганизация актинового цитоскелета относится к позднему этапу трансдукции гравитационного сигнала и к физиологическому ответу корня. Мы предполагаем, что реорганизация актинового цитоскелета в зоне растяжения корня способствует поддержанию латерального градиента ИУК, задающего асимметричный рост корня, а для гравирецепции и трансдукции сигнала достаточно микрофиламентов, уже имеющихся в клетках. Показано, что фитогормон этилен оказывает модулирующее действие на

I I . , : , л1 ,л ■ , м . / 1 л л „м '* • 1,. л , " 1 гравитропическую реакцию: он тормозит рост корня в длину, но не влияет на угол гравитропического изгиба у растений дикого типа. В данной работе впервые выявлено, что у трансгенных растений СРР-/А1Ю2, используемых для визуализации актинового цитоскелета, этилен ингибирует и рост, и развитие изгиба, однако, механизм этого ингибирования остаётся неясен.

Полученные в нашей работе и литературные данные, посвященные анализу роли ауксина и актинового цитоскелета в регуляции гравитропической реакции арабидопсиса, позволяют предложить следующий ход (последовательность) событий (рис. 24), инициированных переориентацией корня в поле силы тяжести (гравистимуляцией):

1. На этапе рецепции и трансдукции гравитационного сигнала гравистимуляция вызывает седиментацию статолитов в направлении вектора силы тяжести (Blancaflor et al., 1998) и формирование первичного латерального градиента ИУК в кончике корня благодаря PIN3-зависимому транспорту ауксина в корневом чехлике (Friml et al., 2002; Ottenschlager et al., 2003; Band etal., 2012). На этом этапе актиновый цитоскелет является негативным регулятором гравитропической реакции, поскольку тормозит взаимодействие статолитов и механорецепторов (Morita, 2010);

2. На этапе трансдукции гравитационного сигнала и начала ответной ростовой реакции происходит реорганизация актинового цитоскелета в зоне растяжения корня. На этом этапе актиновый цитоскелет является позитивным регулятором, так как способствует формированию „транспортного канала" (см. стр. 41-42) для передвижения ауксина на нижнюю часть гравистимулированного корня. Формирование латерального градиента ИУК на этом этапе обеспечивается за счёт перемещения переносчиков ауксина PIN2 на нижнюю часть клеток в коре корня, что обусловливает транспорт ИУК в латеральном направлении в зоне растяжения корня (Abas et al., 2006);

3. На третьем (заключительном) этапе гравитропической реакции накопление ауксина в нижней части корня приводит к торможению роста клеток и формированию ростового изгиба. этапы гравитропическои реакции

РЕЦЕПЦИЯ гравитационного стимула

ТРАНСДУКЦИЯ сигнала

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ ОТВЕТ асимметричный рост корн*} актинозыи цигоскелет ингибирует стимулирует стимулирует (реорганизация)

ИУК стимулирует передача сигнала от сгатоцито«) стимулирует поддерживает асимметричнь и рос)

Рис. 24. Последовательность взаимодействия ауксина и актинового цитоскелета в регуляции гравитропической реакции в корне арабидопсиса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пожванов, Григорий Александрович, Санкт-Петербург

1. Зверева С.Д., Романов Г.А. Репортерные гены для генетической инженерии растений: характеристика и методы тестирования // Физиология растений. 2000. Т. 47, №. 3. С. 479-488.

2. Клячко Н.Л. Актиновый цитоскелет и форма растительной клетки // Физиология растений. 2004. Т. 51, №. 6. С. 918-925.

3. Ломин С.Н., Кривошеев Д.М., Стеклов М.Ю., Осолодкин Д.И., Романов Г.А. Свойства рецепторов и особенности сигналинга цитокининов // Acta Naturae. 2012. Т. 4, №. 3. С. 20-34.

4. Медведев С.С. Механизмы формирования и физиологическая роль полярности в растениях // Физиология растений. 2012. Т. 59, №. 4. С. 543-556.

5. Медведев С.С. Физиология растений. Санкт-Петербург: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2004. 336 С.

6. Медведев С.С., Шарова Е.И. Биология развития растений. Т. I. Начала биологии развития растений. Фитогормоны. Санкт-Петербург: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2011. 253 С.

7. Медведев С.С., Батов А.Ю., Мошков A.B., Маркова И.В. Роль ионных каналов в трансдукции ауксинового сигнала // Физиология растений. 1999. Т. 46, №. 5. С. 620-625.

8. Медведев С.С., Маркова И.В. Участие салициловой кислоты в гравитропизме у растений // Доклады Академии наук СССР. 1991. Т. 316, №. 4. С. 1014-1016.

9. Нелюбов Д.H. Качественныя измЪнешя геотропизма. Часть I. Наблюдешя над вл1яшемъ газообразныхъ примЪсей лабораторнаго воздуха на рость // Записки Императорской Академш Наукъ. Санкт-Петербург, 1913. Т. 31, №. 3. С. 1-162.

10. Пожванов Г.А., Суслов Д.В., Медведев С.С. Реорганизация актинового цитоскелета при гравистимуляции корней растений арабидопсиса // Труды Томского государственного университета. 2010. Vol. Т. С. 305308.

11. Пожванов Г.А., Медведев С.С. Метод количественной оценки содержания ауксина по гистохимическому окрашиванию на активность GUS под контролем ауксин-чувствительного промотора // Физиология растений. 2008. Т. 55, №. 5. С. 786-792.

12. Романов Г.А. Как цитокинины действуют на клетку // Физиология растений. 2009. Т. 56, №. 2. С. 295-319.

13. Aloni R., Langhans M., Aloni E., Dreieicher E., Ullrich C. Root-synthesized cytokinin in Arabidopsis is distributed in the shoot by the transpiration stream // Journal of Experimental Botany. 2005. Vol. 56, No. 416. P. 1535.

14. Aloni R., Langhans M., Aloni E., Ullrich C. Role of cytokinin in the regulation of root gravitropism // Planta. 2004. Vol. 220, No. 1. P. 177-182.

15. Alonso J.M., Stepanova A.N. The ethylene signaling pathway. // Science. 2004. Vol. 306, No. 5701. P. 1513-1515.

16. Aoyama T., Oka A. Cytokinin signal transduction in plant cells // Journal of Plant Research. 2003. Vol. 116, No. 3. P. 221-231.

17. Baluska F., Barlow P., Baskin T., Chen R., Feldman L., Forde B., Geisler M., Jernstedt J., Menzel D., Muday G. What is apical and what is basal in plant root development? // Trends in Plant Science. 2005. Vol. 10, No. 9. P. 409411.

18. Baluska F., Jasik J., Edelmann H.G., Salajova T., Volkmann D. Latrunculin B-induced plant dwarfism: Plant cell elongation is F-actin-dependent. // Developmental Biology. 2001. Vol. 231, No. 1. P. 113-124.

19. Baluska F., Hasenstein K. Root cytoskeleton: its role in perception of and ' response to gravity //-Planta. 1997. Vol. 203. P. 69-78. ' 1' ('" /

20. Bannigan A., Baskin T. Directional cell expansion turning toward actin // Current Opinion in Plant Biology. 2005. Vol. 8, No. 6. P. 619-624.

21. Bartel B. Auxin biosynthesis // Annual Review of Plant Biology. 1997. Vol. 48, No. l.P. 51-66.

22. Baskin T., Peret B., Baluska F., Benfey P., Bennett M., Forde B., Gilroy S., Helariutta Y., Hepler P., Leyser O. Shootward and rootward: peak terminology for plant polarity // Trends in Plant Science. 2010. Vol. 15, No. 11. P. 593-594.

23. Benjamins R., Ampudia C.S.G., Hooykaas P.J., Offringa R. PINOID-Mediated Signaling Involves Calcium-Binding Proteins // Plant Physiology. 2003. Vol. 132, No. 3. P. 1623-1630.

24. Benkova E., Michniewicz M., Sauer M., Teichmann T., Seifertova D., Jiirgens G., Friml J. Local, efflux-dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation // Cell. 2003. Vol. 115, No. 5. P. 591-602.

25. Bennett M.J., Marchant A., Green H.G., May S.T., Ward S.P., Millner P.A., Walker A.R., Schulz B., Feldmann K.A. Arabidopsis A UX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism. // Science. 1996. Vol. 273, No. 5277. P. 948-950. '

26. Berken A., Thomas C., Wittinghofer A. A new family of RhoGEFs activates the Rop molecular switch in plants // Nature. 2005. Vol. 436, No. 7054. P. 1176-1180.

27. Berleth T., Krogan N., Scarpella E. Auxin signals turning genes on and turning cells around // Current Opinion in Plant Biology. 2004. Vol. 7, No. 5. P. 553-563.

28. Blancaflor E., Wang Y., Motes C. Organization and function of the actin cytoskeleton in developing root cells // International review of cytology. 2006. Vol. 252. P. 219-264.

29. Blancaflor E.B., Fasano J.M., Gilroy S. Mapping the functional roles of cap cells in the response of Arabidopsis primary roots to gravity. // Plant Physiology. 1998. Vol. 116, No. 1. P. 213-222.

30. Blanchoin L., Boujemaa-Paterski R., Henty J.L., Khurana P., Staiger C.J. Actin dynamics in plant cells: a team effort from multiple proteins orchestrates this very fast-paced game // Current Opinion in Plant Biology. 2010. Vol. 13, No. 6. P. 714-723.

31. Boutte Y., Crosnier M.-T., Carraro N., Traas J., Satiat-Jeunemaitre B. The plasma membrane recycling pathway and cell polarity in plants: studies on PIN proteins. // Journal of Cell Science. 2006. Vol. 119, No. Pt 7. P. 12551265.

32. Brown D., Rashotte A., Murphy A., Normanly J., Tague B., Peer W., Taiz L., Muday G. Flavonoids act as negative regulators of auxin transport in vivo in Arabidopsis // Plant Physiology. 2001. Vol. 126, No. 2. P. 524-535.

33. Buer C.S., Sukumar P., Muday G.K. Ethylene modulates flavonoid accumulation and gravitropic responses in roots of Arabidopsis. // Plant Physiology. 2006. Vol. 140, No. 4. P. 1384-1396.

34. Castle A.L., Fiehn O., Kaddurah-Daouk R., Lindon J.C. Metabolomics Standards Workshop and the development of international standards for reporting metabolomics experimental results // Briefings in Bioinformatics. 2006. Vol. 7, No. 2. P. 159-165.

35. Chang C. Ethylene signaling: the MAPK module has finally landed // Trends in Plant Science. 2003. Vol. 8, No. 8. P. 365-368.

36. Chen J.-G., Ullah H., Young J.C., Sussman M.R., Jones A.M. ABP1 is required for organized cell elongation and division in Arabidopsis embryogenesis. // Genes & Development. 2001. Vol. 15, No. 7. P. 902-911.

37. Cleland R.E., Rayle D.L. Auxin, H+-excretion and cell elongation // Botanical Magazine. 1978. No. l.P. 125-139.

38. D'Agostino I., Deruere J., Kieber J. Characterization of the response of the Arabidopsis response regulator gene family to cytokinin // Plant Physiology. 2000. Vol. 124, No. 4. P. 1706.

39. Dharmasiri N., Dharmasiri S., Estelle M. The F-box protein TIR1 is an auxin receptor //Nature. 2005. Vol. 435, No. 7041. P. 441-445.1' I

40. Driss-Ecole D., Lefranc A., Perbal G. A polarized cell: the root statocyte // Physiologia Plantarum. 2003. Vol. 118, No. 3. P. 305-312.

41. Du C., Chong K. ARF-GTPase activating protein mediates auxin influx carrier AUX1 early endosome trafficking to regulate auxin dependent plant development // Plant Signaling & Behavior. 2011. Vol. 6, No. 11. P. 16441646.

42. Edlund, Eklof, Sundberg, Moritz, Sandberg. A Microscale Technique for Gas Chromatography-Mass Spectrometry Measurements of Picogram Amounts of Indole-3-Acetic Acid in Plant Tissues. // Plant Physiology. 1995. Vol. 108, No. 3. P. 1043-1047.

43. Era A., Tominaga M., Ebine K., Awai C., Saito C., Ishizaki K., Yamato K.T., Kohchi T., Nakano A., Ueda T. Application of Lifeact Reveals F-Actin

44. Dynamics in Arabidopsis thaliana and the Liverwort, Marchantia polymorpha // Plant and Cell Physiology. 2009. Vol. 50, No. 6. P. 1041-1048.

45. Estelle M. Plant tropisms: the ins and outs of auxin // Current Biology. 1996. Vol. 6, No. 12. P. 1589-1591.

46. Evans M.L., Moore R., Hasenstein K.H. How roots respond to gravity. // Scientific American. 1986. Vol. 255, No. 6. P. 112-119.

47. Firn R., Wagstaff C., Digby J. The use of mutants to probe models of gravitropism // Journal of Experimental Botany. 2000. Vol. 51, No. 349. P. 1323-1340.

48. Friedman W.E., Moore R.C., Purugganan M.D. The evolution of plant development. // American Journal of Botany. 2004. Vol. 91, No. 10. P. 17261741.

49. Friml J., Wisniewska J., Benkova E., Mendgen K., Palme K. Lateral relocation of auxin efflux regulator PIN3 mediates tropism in Arabidopsis // Nature. 2002. P. 806-809.

50. Friml J., Benkova E., Blilou I., Wisniewska J., Hamann T., Ljung K., Woody S., Sandberg G., Scheres B., Jiirgens G., Palme K. AtPIN4 mediates sink-driven auxin gradients and root patterning in Arabidopsis. // Cell. 2002. Vol. 108, No. 5. P. 661-673.

51. Gälweiler L., Guan C., Müller A., Wisman E., Mendgen K., Yephremov A., Palme K. Regulation of polar auxin transport by AtPINl in Arabidopsis vascular tissue // Science. 1998. Vol. 282, No. 5397. P. 2226-2230.

52. Gehring C.A., McConchie R.M., Venis M.A., Parish R.W. Auxin-binding-protein antibodies and peptides influence stomatal opening and alter cytoplasmic pH // Planta. 1998. Vol. 205, No. 4. P. 581-586.

53. Geldner N., Friml J., Stierhof Y.D., Jürgens G., Palme K. Auxin transport inhibitors block PIN1 cycling and vesicle trafficking // Nature. 2001. Vol. 413, No. 6854. P. 425—427.

54. Van Gestel K., Le J., Verbelen J. A comparison of F-actin labeling methods for light microscopy in different plant specimens: multiple techniques supplement each other // Micron. 2001. Vol. 32, No. 6. P. 571-578.

55. Gray W.M., Kepinski S., Rouse D., Leyser O., Estelle M. Auxin regulates SCF(TIR1 )-dependent degradation of AUX/IAA proteins. //Nature. 2001. Vol. 414, No. 6861. P. 271-276.

56. Grebe M., Xu J., Möbius W., Ueda T., Nakano A., Geuze HJ., Rook M.B., Scheres B. Arabidopsis Sterol Endocytosis Involves Actin-Mediated Trafficking via ARA6-Positive Early Endosomes // Current Biology. 2003. Vol. 13, No. 16. P. 1378-1387.

57. Guan C., Rosen E., Boonsirichai K., Poff K., Masson P. The ARG1-LIKE2 gene of Arabidopsis functions in a gravity signal transduction pathway that is genetically distinct from the PGM pathway // Plant Physiology. 2003. Vol. 133, No. l.P. 100.

58. Hable W.E., Hart P.E. Signaling mechanisms in the establishment of plant and fiicoid algal polarity // Molecular Reproduction and Development. 2010. Vol. 77, No. 9. P. 751-758.

59. Harrison B.R., Masson P.H. ARL2, ARG1 and PIN3 define a gravity signal transduction pathway in root statocytes // The Plant Journal. 2007. Vol. 53, No. 2. P. 380-392.

60. Hayashi K., Tan X., Zheng N., Hatate T., Kimura Y., Kepinski S., Nozaki H. Small-molecule agonists and antagonists of F-box protein-substrate interactions in auxin perception and signaling // PNAS. 2008. Vol. 105, No. 14. P. 5632.

61. Higaki T., Sano T., Hasezawa S. Actin microfilament dynamics and actin side-binding proteins in plants // Current Opinion in Plant Biology. 2007. Vol. 10, No. 6. P. 549-556.

62. Holweg C.L. Living markers for actin block myosin-dependent motility of plant organelles and auxin // Cell Motility and the Cytoskeleton. 2007. Vol. 64, No. 2. P. 69-81.

63. Hothorn M., Dabi T., Chory J. Structural basis for cytokinin recognition by Arabidopsis thaliana histidine kinase 4. // Nature Chemical Biology. 2011. Vol. 7, No. 11. P. 766-768.

64. Hou G., Mohamalawari D., Blancaflor E. Enhanced gravitropism of roots with a disrupted cap actin cytoskeleton // Plant Physiology. 2003. Vol. 131, No. 3. P.1360-1373.

65. Hussey P., Ketelaar T., Deeks M. Control of the actin cytoskeleton in plant cell growth // Annual Review of Plant Biology. 2006. Vol. 57, No. 1. P. 109.

66. Ishikawa H., Evans M.L. The role of the distal elongation zone in the response of maize roots to auxin and gravity. // Plant Physiology. 1993. Vol. 102, No. 4. P. 1203-1210.

67. Jacobs M., Rubery P.H. Naturally occurring auxin transport regulators. // Science. 1988. Vol. 241, No. 4863. P. 346-349.

68. Jones A.M., Im K.H., Savka M.A., Wu M.J., DeWitt N.G., Shillito R., Binns A.N. Auxin-dependent cell expansion mediated by overexpressed auxin-binding protein 1 // Science. 1998. Vol. 282. P. 1114-1117.

69. Jones A.M., Herman E.M. KDEL-Containing Auxin-Binding Protein Is Secreted to the Plasma Membrane and Cell Wall. // Plant Physiology. 1993. Vol. 101, No. 2. P. 595-606.

70. Kandasamy M.K., Gilliland L.U., McKinney E.C., Meagher R.B. One plant actin isovariant, ACT7, is induced by auxin and required for normal callus formation. // The Plant Cell. 2001. Vol. 13, No. 7. P. 1541-1554.

71. Kepinski S., Leyser O. The Arabidopsis F-box protein TIR1 is an auxin receptor //Nature. 2005. Vol. 435. P. 446-451.

72. Ketelaar T., Faivre-Moskalenko C., Esseling J., de Ruijter N., Grierson C., Dogterom M., Emons A. Positioning of nuclei in Arabidopsis root hairs: an actin-regulated process of tip growth // The Plant Cell. 2002. Vol. 14, No. 11. P. 2941-2955.

73. Ketelaar T., Emons A. The cytoskeleton in plant cell growth: lessons from root hairs //New Phytologist. 2001. Vol. 152, No. 3. P. 409-418.

74. Ketelaar T., Allwood E.G., Anthony R., Voigt B., Menzel D., Hussey P.J. The Actin-Interacting Protein AIP1 Is Essential for Actin Organization and Plant Development // Current Biology. 2004. Vol. 14, No. 2. P. 145-149.

75. Kiss J.Z., Katembe W.J., Edelmann R.E. Gravitropism and development of wild-type and starch-deficient mutants of Arabidopsis during spaceflight. // Physiologia Plantarum. 1998. Vol. 102, No. 4. P. 493-502.

76. Klahre U., Friederich E., Kost B., Louvard D., Chua N.H. Villin-like actin-binding proteins are expressed ubiquitously in Arabidopsis. // Plant Physiology. 2000. Vol. 122, No. 1. P. 35^7.

77. Kleine-Vehn J., Langowski L., Wisniewska J., Dhonukshe P., Brewer P.B., Friml J. Cellular and Molecular Requirements for Polar PIN Targeting and Transcytosis in Plants // Molecular Plant. 2008. Vol. 1, No. 6. P. 1056-1066.

78. Kleine-Vehn J., Dhonukshe P., Swarup R., Bennett M., Friml J. Subcellular Trafficking of the Arabidopsis Auxin Influx Carrier AUX1 Uses a Novel Pathway Distinct from PIN1 // The Plant Cell. 2006. Vol. 18, No. 11. P. 31713181.

79. Kopka J., Fernie A., Weckwerth W., Gibon Y., Stitt M. Metabolite profiling in plant biology: platforms and destinations. // Genome Biology. 2004. Vol. 5, No. 6. P. 109-109. • ' v' 1 1 ' . 1 * " ' ' ' ' ' > V'i

80. Kost B., Spielhofer P., Chua N. A GFP mouse talin fusion protein labels plant actin filamentsin vivo and visualizes the actin cytoskeleton in growing pollen tubes // The Plant Journal. 1998. Vol. 16, No. 3. P. 393-401.

81. Kushwah S., Jones A.M., Laxmi A. Cytokinin Interplay with Ethylene, Auxin, and Glucose Signaling Controls Arabidopsis Seedling Root Directional Growth // Plant Physiology. 2011. Vol. 156, No. 4. P. 1851-1866.

82. Kushwah S., Jones A.M., Laxmi A. Cytokinin-induced root growth involves actin filament reorganization // Plant Signaling & Behavior. 2011. Vol. 6, No. 11. P. 1848-1850.

83. Lee J.S., Chang W-K, Evans M.L. Effects of ethylene on the kinetics of curvature and auxin redistribution in gravistimulated roots of Zea mays. II Plant Physiology. 1990. Vol. 94. P. 1770-1775.

84. Lee J.S., Mulkey T.J., Evans M.L. Reversible loss of gravitropic sensitivity in maize roots after tip application of calcium chelators. // Science. 1983. Vol. 220, No. 4604. P. 1375-1376.

85. Lewis D.R., Muday G.K. Measurement of auxin transport in Arabidopsis thaliana II Nature Protocols. 2009. Vol. 4, No. 4. P. 437^51.

86. Leyser O. Plant hormones: Ins and outs of auxin transport // Current Biology. 1999. Vol. 9, No. 1. P. R8-R10.

87. Li H., Shen J.-J., Zheng Z.-L., Lin Y., Yang Z. The Rop GTPase switch controls multiple developmental processes in Arabidopsis. // Plant Physiology. 2001. Vol. 126, No. 2. P. 670-684.

88. Li L., Xu J., Xu Z.-H., Xue H.-W. Brassinosteroids stimulate plant tropisms through modulation of polar auxin transport in Brassica and Arabidopsis. II The Plant Cell. 2005. Vol. 17, No. 10. P. 2738-2753. , <

89. Lisec J., Schauer N., Kopka J., Willmitzer L., Fernie A.R. Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants. // Nature Protocols. 2006. Vol. 1, No. 1. P. 387-396.

90. Lôbler M., Klambt D. Auxin-binding protein from coleoptile membranes of corn (Zea mays L.). I. Purification by immunological methods and characterization. // Journal of Biological Chemistry. 1985. Vol. 260, No. 17. P. 9848-9853.

91. Luschnig C. Auxin transport: ABC proteins join the club // Trends in Plant Science. 2002. Vol. 7, No. 8. P. 329-332.

92. Mâhônen A.P., Bonke M., Kauppinen L., Riikonen M., Benfey P.N., Helariutta Y. A novel two-component hybrid molecule regulates vascularmorphogenesis of the Arabidopsis root. 11 Genes & Development. 2000. Vol. 14, No. 23. P. 2938-2943.

93. Mathur J. Cell shape development in plants // Trends in Plant Science. 2004. Vol. 9, No. 12. P. 583-590.

94. Mathur J. The ARP2/3 complex: giving plant cells a leading edge // Bioessays. 2005. Vol. 27, No. 4. P. 377-387.

95. Meagher R., Fechheimer M. The Arabidopsis cytoskeletal genome // The Arabidopsis Book. 2003. Vol. 2, No. 1. P. 1-26.

96. Menzel D. Chasing coiled coils: intermediate filaments in plants // Acta Botanica. 1993. Vol. 106, No. 4. P. 294-300.

97. Muday G.K., Murphy A.S. An emerging model of auxin transport regulation // The Plant Cell. 2002. Vol. 14, No. 2. P. 293.

98. Muday G.K., DeLong A. Polar auxin transport: controlling where and how much 11 Trends in Plant Science. 2001. Vol. 6, No. 11. P. 535-542.

99. Muday G.K. Maintenance of asymmetric cellular localization of an auxin transport protein through interaction with the actin cytoskeleton // Journal of Plant Growth Regulation. 2000. Vol. 19, No. 4. P. 385-396.

100. Muller A., Guan C., Galweiler L., Tanzler P., Huijser P., Marchant A., Parry G., Bennett M., Wisman E., Palme K. AtPIN2 defines a locus of Arabidopsis for root gravitropism control // The EMBO Journal. 1998. Vol. 17, No. 23. P. 6903-6911.

101. Muller B., Sheen J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis // Nature. 2008. Vol. 453, No. 7198. P. 1094-1097.

102. Murashige T., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures // Physiologia Plantarum. 1962. Vol. 15, No. 3. P. 473-497.

103. Nakamura M., Toyota M., Tasaka M., Morita M.T. An Arabidopsis E3 Ligase, SHOOT GRAVITROPISM9, Modulates the Interaction between Statoliths and F-Actin in Gravity Sensing // The Plant Cell. 2011. Vol. 23, No. 5. P. 18301848.

104. Napier R.M., David K.M., Perrot-Rechenmann C. A short history of auxin-binding proteins. // Plant Molecular Biology. 2002. Vol. 49, No. 3-4. P. 339348.

105. Nick P., Han M.-J., An G. Auxin Stimulates Its Own Transport by Shaping Actin Filaments // Plant Physiology. 2009. Vol. 151, No. 1. P. 155-167.

106. Noh B., Murphy A.S., Spalding E.P. Multidrug resistance-like genes of Arabidopsis required for auxin transport and auxin-mediated development. // The Plant Cell. 2001. Vol. 13, No. 11. P. 2441-2454.

107. Normanly J., Bartel B. Redundancy as a way of life-IAA metabolism // Current Opinion in Plant Biology. 1999. Vol. 2, No. 3. P. 207-213.

108. Ostin A., Kowalyczk M., Bhalerao R.P., Sandberg G. Metabolism of indole-3-acetic acid in Arabidopsis // Plant Physiology. 1998. Vol. 118, No. 1. P. 285.

109. Palme K., Hesse T., Campos N., Garbers C., Yanofsky M.F., Schell J. Molecular analysis of an auxin binding protein gene located on chromosome 4 of Arabidopsis. // The Plant Cell. 1992. Vol. 4, No. 2. P. 193-201.

110. Palmieri M., Kiss J. Disruption of the F-actin cytoskeleton limits statolith movement in Arabidopsis hypocotyls // Journal of Experimental Botany. 2005. Vol.'56^ No! 419. P. 2539. ' '' ' ,

111. Paponov I., Teale W., Trebar M., Blilou I., Palme K. The PIN auxin efflux facilitators: evolutionary and functional perspectives // Trends in Plant Science. 2005. Vol. 10, No. 4. P. 170-177.

112. Paradez A., Wright A., Ehrhardt D.W. Microtubule cortical array organization and plant cell morphogenesis // Current Opinion in Plant Biology. 2006. Vol. 9, No. 6. P. 571-578.

113. Peer W.A., Murphy A.S. Flavonoids and auxin transport: modulators or regulators? // Trends in Plant Science. 2007. Vol. 12, No. 12. P. 556-563.

114. Perbal G., Jeune B., Lefranc A., Carnero-Diaz E., Driss-Ecole D. The dose-response curve of the gravitropic reaction: a re analysis // Physiologia Plantarum. 2002. Vol. 114, No. 3. P. 336-342.

115. Pesacreta T.C., Carley W.W., Webb W.W., Parthasarathy M.V. F-actin in conifer roots // PNAS. 1982. Vol. 79, No. 9. P. 2898-2901.

116. Pickett F.B., Wilson A.K., Estelle M. The auxl Mutation of Arabidopsis Confers Both Auxin and Ethylene Resistance. // Plant Physiology. 1990. Vol. 94, No. 3. P. 1462-1466.

117. Rahman A., Bannigan A., Sulaman W., Pechter P., Blancaflor E.B., Baskin T.I. Auxin, actin and growth of the Arabidopsis thaliana primary root // The Plant Journal. 2007. Vol. 50, No. 3. P. 514-528.

118. Raven J.A. Transport of indoleacetic acid in plant cells in relation to pH and electrical potential gradients, ans its significance for polar IAA transport // New Phytologist. 1975. Vol. 74. P. 163-172.

119. Ribnicky D.M., Cooke T.J., Cohen J.D. A microtechnique for the analysis of free and conjugated indole-3-acetic acid in milligram amounts of plant tissue using a benchtop gas chromatograph-mass spectrometer // Planta. 1997. Vol. 204,No. l.P. 1-7.

120. Robert H.S., Friml J. Auxin and other signals on the move in plants. // Nature Chemical Biology. 2009. Vol. 5, No. 5. P. 325.

121. Roberts I.N., Lloyd C.W., Roberts K. Ethylene-induced microtubule reorientations: mediation by helical arrays // Planta. 1985. Vol. 164, No. 4. P. 439-447.

122. Romanov G.A., Kieber J.J., Schmiilling T. A rapid cytokinin response assay in Arabidopsis indicates a role for phospholipase D in cytokinin signalling // FEBS letters. 2002. Vol. 515, No. 1-3. P. 39-43.

123. Rubery P.H., Sheldrake A.R. Carrier-mediated auxin transport // Planta. 1974. Vol. 118, No. 2. P. 101-121.

124. Sack F.D., Suyemoto M.M., Leopold A.C. Amyloplast sedimentation and organelle saltation in living corn columella cells // American Journal of Botany. 1986. Vol. 73, No. 12. P. 1692-1698.

125. Saito C., Morita M.T., Kato T., Tasaka M. Amyloplasts and vacuolar membrane dynamics in the living graviperceptive cell of the Arabidopsis inflorescence stem. // The Plant Cell. 2005. Vol. 17, No. 2. P. 548-558.

126. Samaj J., Chaffey N., Tirlapur U., Jasik J., Hlavacka A., Cui Z., Volkmann D., Menzel D., Baluska F. Actin and myosin VIII in plant cell-cell channels // Cell-Cell Channels. Springer, 2006. P. 119-134.

127. Sedbrook J.C., Chen R., Masson P.H. ARG1 (altered response to gravity) encodes a DnaJ-like protein that potentially interacts with the cytoskeleton // PNAS. 1999. Vol. 96, No. 3. P. 1140.

128. Shevchenko G.V., Kalinina Y.M., Kordyum E.L. Interrelation between microtubules and microfilaments in the elongation zone of Arabidopsis root under clinorotation // Advances in Space Research. 2007. Vol. 39, No. 7. P. 1171-1175.

129. Smertenko A.P., Deeks M.J., Hussey P.J. Strategies of actin reorganisation in plant cells // Journal of Cell Science. 2010. Vol. 123, No. 17. P. 3029-3029.

130. Staiger C.J., Gibbon B.C., Kovar D.R., Zonia L.E. Profilin and actin-depolymerizing factor: modulators of actin organization in plants // Trends in Plant Science. 1997. Vol. 2, No. 7. P. 275-281.

131. Staves M.P., Wayne R., Leopold A.C. Cytochalasin D does not inhibit gravitropism in roots. // American Journal of Botany. 1997. Vol. 84, No. 11. P. 1530-1535.

132. Steinmann T., Geldner N., Grebe M., Mangold S., Jackson C., Paris S., Galweiler L., Palme K., Jtirgens G. Coordinated polar localization of auxin efflux carrier PIN1 by GNOM ARF GEF // Science. 1999. Vol. 286, No. 5438. P. 316.

133. Swarup K., Benkova E., Swarup R., Casimiro I., Peret B., Yang Y., Parry G., Nielsen E., De Smet I., Vanneste S. The auxin influx carrier LAX3 promotes lateral root emergence // Nature Cell Biology. 2008. Vol. 10, No. 8. P. 946954.

134. Tan X., Calderon-Villalobos L.I.A., Sharon M., Zheng C., Robinson C.V., Estelle M., Zheng N. Mechanism of auxin perception by the TIR1 ubiquitin ligase //Nature. 2007. Vol. 446, No. 7136. P. 640-645.

135. Teale W.D., Paponov I.A., Palme K. Auxin in action: signalling, transport and the control of plant growth and development // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2006. Vol. 7, No. 11. P. 847-859.

136. Thimann K.V. On the Nature of Inhibitions Caused by Auxin // American Journal of Botany. 1937. Vol. 24, No. 7. P. 407^12.

137. Timmers A.C.J., Niebel A., Balague C., Dagkesamanskaya A. Differential localisation of GFP fusions to cytoskeleton-binding proteins in animal, plant, and yeast cells // Protoplasma. 2002. Vol. 220, No. 1. P. 69-78.

138. Ulmasov T., Murfett J., Hagen G., Guilfoyle T. Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic1 auxin response elements // The Plant Cell. 1997. Vol. 9, No. 11. P. 1963-1971.

139. Valster A.H., Hepler P.K., Chernoff J. Plant GTPases: the Rhos in bloom. // Trends in Cell Biology. 2000. Vol. 10, No. 4. P. 141-146.

140. Valster A.H., Pierson E.S., Valenta R., Hepler P.K., Emons A.M.C. Probing the plant actin cytoskeleton during cytokinesis and interphase by profllin microinjection // The Plant Cell. 1997. Vol. 9, No. 10. P. 1815-1824.

141. Verbelen J.-P., Cnodder T.D., Le J., Vissenberg K., Baluska F. The Root Apex of Arabidopsis thaliana Consists of Four Distinct Zones of Growth Activities // Plant Signaling & Behavior. 2006. Vol. 1, No. 6. P. 296-304.

142. Vernoud V., Horton A.C., Yang Z., Nielsen E. Analysis of the small GTPase gene superfamily of Arabidopsis. // Plant Physiology. 2003. Vol. 131, No. 3. P. 1191-1208.

143. Viaene T., Delwiche C.F., Rensing S.A., Friml J. Origin and evolution of PIN auxin transporters in the green lineage // Trends in Plant Science. Elsevier Ltd, 2012. P. 1-6.

144. Waller F., Riemann M., Nick P. A role for actin-driven secretion in auxin-induced growth. // Protoplasma. 2002. Vol. 219, No. 1-2. P. 72-81.

145. Werner T., Schmulling T. Cytokinin action in plant development // Current Opinion in Plant Biology. 2009. Vol. 12, No. 5. P. 527-538.

146. Werner T., Motyka V., Strnad M., Schmulling T. Regulation of plant growth by cytokinin // PNAS. 2001. Vol. 98, No. 18. P. 10487.

147. Woo E.-J., Marshall J., Bauly J., Chen J.-G., Venis M., Napier R.M., Pickersgill R.W. Crystal structure of auxin-binding protein 1 in complex with auxin // The EMBO Journal. 2002. Vol. 21, No. 12. P. 2877-2885.

148. Wulfetange K., Lomin S.N., Romanov G.A., Stolz A., Heyl A., Schmulling T. The Cytokinin Receptors of Arabidopsis Are Located Mainly to the Endoplasmic Reticulum // Plant Physiology. 2011. Vol. 156, No. 4. P. 18081818.

149. Xu J., Scheres B. Cell polarity: ROPing the ends together // Current Opinion in Plant Biology. 2005. Vol. 8, No. 6. P. 613-618.

150. Yamamoto K., Kiss J.Z. Disruption of the actin cytoskeleton results in the promotion of gravitropism in inflorescence stems and hypocotyls of Arabidopsis // Plant Physiology. 2002. Vol. 128, No. 2. P. 669-681.

151. Yoo S.-D., Cho Y., Sheen J. Emerging connections in the ethylene signaling network // Trends in Plant Science. 2009. Vol. 14, No. 5. P. 270-279.

152. Zazimalovâ E., Krecek P., Skûpa P., Hoyerovâ K., Petrâsek J. Polar transport of the plant hormone auxin the role of PIN-FORMED (PIN) proteins // Cellular and Molecular Life Sciences. 2007. Vol. 64, No. 13. P. 1621-1637.