Резистентность опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах

Фадеев, Роман Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Резистентность опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Резистентность опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах"

На правах рукописи

ФАДЕЕВ РОМАН СЕРГЕЕВИЧ

РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК К Т11А1Ь-ИНДУЦИРОВАННОМУ АПОПТОЗУ В КОНФЛЮЕНТНЫХ КУЛЬТУРАХ

Специальность 03.01.02-Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 2 НОЯ 1Ш

Пущино 2012

005055483

Работа выполнена в Лаборатории тканевой инженерии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, г. Пущино.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор физико-математических наук, профессор

Акатов Владимир Семенович

кандидат биологических наук Чеканов Алексей Владимирович

доктор биологических наук Корыстов Юрий Николаевич

(зав. лаб. окислительного стресса ИТЭБ РАН)

доктор биологических наук, профессор Новоселов Владимир Иванович (ИБК РАН)

Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Москва)

Защита диссертации состоится « О^» р&кА^рЛ—_2012 г.

в на заседании совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на

соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук, созданном на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан« (И » 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного /////¡л /-7

совета, кандидат физ.-мат. наук сССс-С-ц- Ланина Н. Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Онкологические заболевания занимают второе место в мире по смертности после сердечно-сосудистых патологий. Недостаточная эффективность лечения онкологических заболеваний обусловлена в первую очередь отсутствием избирательного действия существующих противоопухолевых препаратов, недостаточно эффективным проникновением противоопухолевых субстанций в опухолевую ткань и возникновением, при определенных условиях, резистентности опухолевых клеток к повреждающим воздействиям.

Возникновение резистентности опухолевых клеток к действию химиотерапевтических препаратов связывают, в основном, с внутриклеточными механизмами активации и/или повышенной экспрессии белков-транспортеров суперсемейства ABC (Р-гликопротеина (Pgp), MRP1-MRP-5, BCRP и LPR), осуществляющих выведение ксенобиотиков различного происхождения из клетки (Gottesman et al., 2002). С другой стороны, известно повышение резистентности опухолевых клеток к различным повреждающим воздействиям в двумерных (конфлюентные монослойные культуры распластанных клеток) и трехмерных (сфероиды) многоклеточных образованиях в условиях in vitro, отражающее резистентность клеток в опухолевой паренхиме к действию химиотерапевтических препаратов (Chitcholtan et al., 2012), окислительного стресса (Акатов и др., 2000), гипертермии (Khoei et al., 2004), радиации (Zou et al., 2010). Это говорит об общности механизмов повышения резистентности опухолевых клеток к различным повреждающим воздействиям в плотных многоклеточных образованиях. Механизм такой резистентности до сих пор остается не выясненным.

В настоящее время одним из наиболее перспективных подходов противоопухолевой терапии является потенциальное применение рекомбинантных белков, созданных на основе цитокина TRAIL (TNF alpha Related Apoptosis Inducing Ligand). Цнгокин TRAIL является интегральным мембранным белком, относящимся к семейству фактора некроза опухолей, который обнаруживается у NK-клеток, а также части дендритных клеток (Ashkenazi et а!., 2008). Уникальной особенностью цитокина TRAIL является его способность избирательно индуцировать апоптоз в опухолевых клетках, связываясь со специфическими рецепторами клеточной гибели (DR4, DR5) на внешней поверхности цитоплазматической мембраны, и при этом не повреждать нормальные клетки организма (Gonzalvez et al., 2010). В то же время известно, что не все опухолевые клетки чувствительны к TRAIL-индуцированному апоптозу. В литературе указывается, что около 50% исследованных линий опухолевых клеток обладают конститутивной резистентностью к действию цитокина TRAIL, подобно нормальным клеткам. Это связывают как с изменением структуры рецепторов DR4, DR5 или с повышенной экспрессией рецепторов ловушек (DcRl и DcR2), так и с конститутивной активностью внутриклеточных сигнальных путей ответственных за выживание клеток (Johnstone et а!., 2008). Однако, до сих пор, остается неизвестным, способны ли чувствительные к действию TRAIL опухолевые клетки приобретать

резистентность к TRAIL-индуцированному апоптозу в зависимости от условий околоклеточного микроокружения, в частности, в плотных многоклеточных структурах, таких как конфлюентные культуры. Ответ на этот вопрос имеет большое теоретической значение для биологии клетки, а также принципиально важен для создания на основе рекомбинантных белков TRAIL эффективных препаратов для противоопухолевой терапии.

Целью работы является изучение резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучение резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в зависимости от плотности клеточных культур;

2. Исследование резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в зависимости от пролиферативной активности клеток;

3. Изучение резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в зависимости от адгезии клеток и параметров околоклеточной среды;

4. Выяснение механизма резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу и оценка возможности ее подавления.

Новизна работы. В работе впервые показано, что в условиях конфлюентной культуры опухолевые клетки способны приобретать резистентность к TRAIL-индуцированному апоптозу. Формирование приобретенной TRAIL-резистентности показано не только для конфлюентных культур зависимых от прикрепления опухолевых клеток эпителиального и мезенхимального происхождения, но и для независимых от прикрепления (суспензионных) клеток лейкоцитарного происхождения в многоклеточных агрегатах. Обнаружено, что повышение резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах осуществляется на фоне снижения пролиферативной активности клеток, однако значительная часть резистентных клеток может оставаться в клеточном цикле.

Установлено, что механизмы конфлюентной резистентности опухолевых клеток различного происхождения могут отличаться. Конфлюентная TRAIL-резистентность опухолевых клеток может осуществляться с привлечением тирозин-киназных рецепторов некоторых ростовых факторов (IGF и EGF, но не PDGF) и реализоваться через внутриклеточные сигнальные пути, связанные с протеин киназами PI3K, Akt (РКВ).

Установлена возможность подавления конфлюентной TRAIL-резистентности путем нетоксичного воздействия на внутриклеточные молекулярные мишени.

Практическая значимость. Показана возможность подавления резистентности опухолевых клеток к TRAIL- индуцированному апоптозу в плотных многоклеточных структурах при использовании в нетоксичных концентрациях таргетных противоопухолевых препаратов, действующих на мишени внутриклеточных сигнальных путей. Это представляет интерес для разработки на основе рекомбинантных белков TRAIL и таргетных

ингибиторов приобретенной TRAIL-резистентности новых противоопухолевых препаратов, вызывающих гибель опухолевых клеток, подавляющих их резистентность и при этом нетоксичных для клеток здоровых тканей и организма в целом.

Апробация. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011), IV Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов, «Симбиоз» (Воронеж, 2011), Международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ» (Москва, 2011, 2012), Конференции Экспериментальная и теоретическая биофизика '10, 11, 12 (Пущино, 2010, 2011, 2012), Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронауки для медицины и психологии» (Судак, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 6 статей в журналах рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из ведения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах, содержит

3JL рисунков и / таблиц. Список цитируемой литературы включает ЛИ источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение рекомбинантного белка izTRAIL

Последовательность синтетического изолейцинового зиппера (1ЕККША)4 (RMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGE) (Suzuki et al., 1998) была синтезирована de novo. Синтез гена izTRAIL проводили, как описано в (Ganten et al., 2006). Полученный ген был клонирован в плазмидный вектор pETlOl (Novagen, USA). Штамм Е. coli BL21(DE3) трансформировали полученным экспрессирующим вектором pETlOl/izTRAIL. Экспрессия белка проводилась в среде ТВ в течение 12 часов при 18°С. Экстракцию белка из клеточной биомассы, ренатурацию белка, хромаггографическую очистку белка выполняли так, как описано в работе (Фадеев и др., 2012). Чистоту полученного белка определяли с использованием SDS-PAGE и окрашиванием Coomassie blue.

Культура клеток

В работе использовали клетки эпидермоидной карциномы гортани человека (линия НЕр-2), эпидермоидной карциномы кожи человека (линия А431), немелкоклеточного рака легкого человека (линия А549), карциномы яичника человека (линия OVCAR-3), карциномы шейки матки человека (линия HeLa), карциномы молочной железы человека (линия MCF-7), миелобластного лейкоза человека (линия К562), моноцитарного лейкоза человека (линия ТНР-1). Клетки были получены из Всероссийской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Нормальные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека (МККМ) предоставлены фирмой «Биолог» (Санкт-Петербург). Культуру нормальных диплоидных фибробластов человека (HF) получали

из участков кожи внутренней поверхности предплечья методом эксплангов (Фадеев и др., 2012). Время удвоения числа клеток в используемых растущих культурах составлял около 20 ч. Рост числа клеток в культурах начинался через 18-20 часов после посева.

Оценка цитотокси чности

Для анализа цитотоксичности клетки из растущих культур высевали в 96-луночные культуральные планшеты. Цитотоксичность оценивали по отношению количества живых клеток в опытных и контрольных (необработанных токсическими агентами) культурах через 24 ч после добавления агентов. Для определения количества живых клеток культуры окрашивали кристаллическим фиолетовым с последующим фотометрированием (Nomizu et al., 1995). Жизнеспособность клеток оценивали также по окраске трипановым синим.

Морфологический флуоресцентный метод определения апоптотических клеток

Наличие аберрантного распределения хроматина, указывающего на апоптотический тип гибели клеток, оценивали методом флуоресцентной микроскопии, одновременно окрашивая клетки флуоресцентными зондами Hoechst 33342 и этидиум бромидом (Акатов и др., 2000).

Анализ митотической активности в клеточных культурах

Число митотических клеток в культурах определяли с помощью флуоресцентной микроскопии, используя прижизненное окрашивание флуоресцентным ядерными красителем Hoechst 33342 (Акатов и др., 2000). Митотические клетки выявляли по распределению хроматина, характерному для метафазы, анафазы, телофазы и цитокинеза.

К¡6 7p-GFP репортерная система

Для выявления пролиферируюпщх клеток, находящихся в клеточном цикле (вне фазы покоя), использовали Ki67p-GFP репортерную систему, любезно предоставленную доктором А. Замбон (Департамент фармакологии, Университет Калифорнии, США) (Zambón, 2010).

Трансфекция клеток

Для трансфекции клеток линии А431 плазмидным вектором Ki67p-GFP, был использован Lipofectamin 2000, следуя рекомендациям производителя. Селекцию клеток проводили на среде содержащей 10мкг/мл бласгнцидина. Отбор GFP-позитивных клонов осуществляли, используя флуоресцентный микроскопа Leica DM 6000 (Германия).

Проточная цитофлуориметрия

Для анализа распределения клеток по содержанию ДНК использовали проточный цитометр (PARTEC Ш, Германия). Распределение клеток A431/Ki67p-GFP по интенсивности флуоресценции GFP определяли прижизненно после открепления и суспендирования клеток, используя канал FL 1 (510-530нм) проточного цитометра PARTEC III.

Анализ содержания кислорода в среде культивирования клеток

Концентрацию кислорода в среде культивирования измеряли, используя электрод Кларка закрытого типа.

Статистический анализ

Результаты исследований представлены в виде среднего ± т, где т -стандартная ошибка среднего. Достоверность отличия выборок

экспериментальных данных, а также средних значений оценивали с помощью критерия Уилкоксона для выборок с попарно-связанными вариантами, либо критерия Уитни-Манна для независимых выборок. Все эксперименты проводились не менее чем в трех повторах (п > 3).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Избирательность апоптоз-индуцирующего действия рекомбинантного белка izTRAIL на опухолевые клетки.

Исследовали токсическое действие рекомбинантного белка izTRAIL на растущие опухолевые и нормальные клетки человека in vitro. Добавление izTRAIL в концентрации до 20 мкг/мл в культуру мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (МККМ) и диплоидных фибробластов человека через 24 часа после посева плотностью 5x103 клеток/см2 и 8x103 клеток/см2 соответственно не вызывало гибели клеток

Рис. 1.

Рекомбинантный белок

izTRAIL избирательно

оказывает токсическое

действие на клетки опухолевого происхождения (НЕр-2, А549, HeLa, MCF-7 и OVCAR-3), не повреждая нормальные (фибробласгы, МККМ). По оси абсцисс -концентрация izTRAIL, нг/мл; по оси ординат - отношение числа живых клеток в опытных и контрольных (без добавок) культурах через 24 часа после добавления izTRAIL, %.

Количество клеток в опытных культурах составляло 98±5% в сравнении с контролем. Добавление белка izTRAIL в концентрации до 1,5 мкг/мл в культуры опухолевых клеток линий НЕр-2, А549, HELA, MCF-7 и OVCAR-3 через 24 часа после посева 1,5х104 клеток/см2 уменьшало количество живых клеток относительно контроля до 10±2%, 11±3%, 13±4%, 5±3%, 0% соответственно (рис.1). Через 2 ч после добавления izTRAIL в большинстве клеток (70-80%) наблюдалось аберрантное распределение хроматина, указывающее на апоптотический тип гибели (Рис.2). Эти результаты свидетельствуют об избирательном апоптоз-индуцирующем действии использованного в работе рекомбинантного белка izTRAIL на опухолевые клетки.

Необходимо отметить, что активность разработанного нами рекомбинантного белка izTRAIL находится на уровне лучших коммерчески доступных зарубежных аналогов, таких как izTRAIL и superkiller TRAIL фирмы Amgen, и значительно (более чем в 200 раз) превосходит эти

Концентрация izTRAIL, нг/мл

аналоги по растворимости. Сочетание высокой активности и растворимости принципиально важно для потенциального применения белков TRAIL в противоопухолевой терапии.

Следует также подчеркнуть, что используемый в работе рекомбинантный белок izTRAIL значительно (в 200 и более раз для разных линий клеток) активнее рекомбинантного белка rhApo2L/TRAIL, созданного на основе внеклеточного домена цитокина TRAIL (аа 114-281) без дополнительной стабилизации его тримерной формы посредством применения зипперов и/или других модификаций. Согласно нашим данным, izTRAIL вызывает гибель 50% клеток НЕр-2 при 8 нг/мл, а белок rfiApo2L/TRAIL, вызывает гибель 60% клеток при 1,6 мкг/мл.

Рис. 2. Мшфофогографии клеток НЕр2 через 24 часа после посева плотностью ЗхЮ4. клеток/см^ до добавления рекомбинантного бежа izTRAIL (а) и через 4 ч после добавления 100 нг/ш1 izTRAIL (б). Окраска клеток ядерными красителями Hoechst 33342 (проникает в живые клетки) и этидиум бромидом (не проникает в живые клетки). Аберрантное распределение хроматина (показано стрелками) указывает на апоптоз. X 200

Таким образом, используемый в представленной работе рекомбинантный белок ¡гТКА1Т индуцирует апоптотическую гибель опухолевых клеток при концентрациях 1-10 нг/мл и не вызывает гибель нормальных клеток человека даже при концентрациях 20 мкг/мл.

2. Повышение резистентности опухолевых клеток к ТЯАП-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах.

В результате выполненной работы было установлено значительное повышение резистентности опухолевых клеток к действию рекомбинантного белка ¡гТИАП^ по мере увеличения плотности клеточной культуры, На рис. 3 представлены результаты изучения цитотоксического действия 1гТ11А1Т при его добавлении к клеткам НЕр-2 сразу после посева плотностью ЗхЮ4 клеток/см2, а также через 24 и 72 ч после посева. При добавлении белка ¡гТКАП, сразу после посева клеток (0 ч) величина 1С50 (концентрация белка при которой количество клеток в опьгге уменьшалось до 50 процентов в сравнении с контролем) составляло 4±1 нг/ мл ¡гТКАИ,, а при концентрации белка 50-100 нг/мл и более наблюдалась гибель всех

клеток. При добавлении ¡г'ПЪУЬ через 24 часа после посева обнаружено, что часть клеток культуры была нечувствительна к аиоптоз-индуцирующему действию белка. Это выражается в том, что 12% клеток оставались живыми независимо от повышения концентрации ¡гТЯАП. от 30 нг/мл до 1,5 мкг/мл (плато на рис.За, 24 ч). При этом величина 1С50 белка кП1А1Ь для клеток, сохранивших чувствительность к ггТЯАГЬ (определяется по уменьшению количества живых клеток от 100% до плато), составляет 9±1 нг/мл. При добавлении белка ¡гПШЬ через 72 ч после посева, когда культура имела вид монослоя прилегающих друг к другу клеток («слившийся монослой», конфлюент), обнаружено, что процент клеток нечувствительных к кТНАД, (плато при 200 нг/мл белка и больше, рис.За) составляет 50±4%, а величина 1С50 белка ¡гТЯАИ. для субпопуляции чувствительных к нему клеток увеличилась до 30±5 нг/мл.

Рис. 3. Увеличение резистентности опухолевых клеток НЕр-2 по ходу роста культуры, посеянной плотностью 3x10 клеток/см2 (а) и при увеличении плотности посева этих клеток (белок добавляли через 24 часа после посева) (б). 0 ч - сразу после посева суспензии клеток, 24 ч - культура низкой плотности клеток, 72 ч - конфлюентный монослой (культура высокой плотности клеток).

Отличия величины 1С50 и доли клеток чувствительных к алоптозу, между культурами клеток НЕр-2 сразу после посева (0 ч), через 24 ч и 72 ч достоверны (р<0,05). Таким образом, в конфлюентной культуре клеток линии НЕр-2 около 50% всех клеток становятся резистентными к действию ¡гтаАГЬ вплоть до концентрации 1,5 мкг/мл.

Дополнительным подтверждением зависимости ТЯА1Ь-резистептности опухолевых клеток от плотности клеточных культур являются данные о гибели клеток НЕр-2 при добавлении рекомбинантного белка 1г"тА1Ь через 24 ч после посева клеток с различной плотностью (рис.Зб). Из представленных на рис. 36 результатов видно, что процент клеток, резистентных к белку ¡гТЯАП, при высоких концентрациях белка (плато при 50-200 нг/мл белка и более), при высокой плотности посева культур (6x104 и 1,2х105клеток/см2) составлял 25±2%, а при более низкой (1,5х104, ЗхЮ4, клеток/см2) - 12±3%. Указанные проценты резистентных к кТЯАЕЬ клеток при низких и высоких плотностях культур достоверно отличались (р<0.05). При плотности посева 105 и 2x10 клеток/см2 после 24 часов культивирования формировался конфлюентный монослой

распластанных клеток. Из рис. 36 видно, что при возрастании плотности посева также происходит увеличение 1С50 белка для той части популяции, которая оставалась чувствительной к белку ¡гТЯАИ,. На рис. 4 представлен вид культур клеток НЕр 2 через сутки после посева различной плотностью и после 72 ч культивирования.

Рис. 4.

Микрофотографии культуры клеток НЕр-2 через 24 ч после их посева в концентрации 1,5х104 (а), 3x104 (б), 1,2x105 (в) клеток/см2, и через 72 ч посева плотностью ЗхЮ4 клеток/см2 (г). Увеличение 200.

Наибольший эффект повышения резистентности в конфлюентных культурах обнаружен для опухолевых клеток линии А431. На рис. 5 представлены данные о цитотоксическом действия белка 1?ТКА1Ь при его добавлении в культуру клеток А431 сразу после посева плотностью 3x10 клеток/см2, а также через 24 и 96 ч после посева. При добавлении белка ¡гТКА1Ь сразу после посева клеток (0 ч) величина 1С50 белка составляла 6±2 нг/мл, а при концентрации белка 50-200 нг/мл и более, 95% клеток были погибшими. Через 24 часа после посева 20% клеток приобретали резистентность к действию ¡гТЮМЬ (появление плато на рис.5 при высоких концентрациях белка), а величина 1С50 белка izTRA.IL для клеток, сохранивших чувствительность к кШАП., увеличилась до 15±3 нг/мл. В конфлюентной культуре через 96 часов после посева все клетки становились резистентными к рекомбинантному белку ¡2'ША1Ь вплоть до

Рис. 5. Зависимость гибели клеток А431 от концентрации

рекомбинантного белка иШАГЬ по ходу роста культуры и увеличения ее плотности. 0ч - сразу после посева суспензии клеток, 24 ч - разреженная культура распластанных клеток, 96 ч -конфлюентный монослой.

концентрации белка 1,5 мкг/мл (рис.5).

0.1 1 10 100

Концентрация ¡гТКАИ., нг/мл

Значительное увеличение резистентности к апоптоз-индуцирующему действию белка izTRAIL было обнаружено для всех использованных в работе зависимых от прикрепления опухолевых клеток, включая клеточные линии, полученные из карцином человека (А549, OVCAR-3, HeLa), а также из фибросаркомы человека (НТ-1080).

Наряду с повышением резистентности опухолевых клеток в конфлюентной культуре к апоптоз-индуцирующему действию белка izTRAIL, выявлено сходное повышение резистентности к токсическому действию неспецифического индуктора окислительного стресса пероксида водорода и химиотерпевтического препарата дихлордиаминоплатины, что показано на рис.6 на примере клеток НЕр-2.

10 100 1000 Концентрация Н2О2, мкМ

0.1 1 10 100 Концентрация ДДП, мкМ

Рис. 6. Повышение резистентности опухолевых клеток НЕр-2 в конфлюенпшх культурах (72 ч) к действию перекиси водорода (а) и дихлордиаминоплатины (б). Клетки высевали плотностью 50 тысяч клеток /см2. Через 24 ч клетки начинали расти, а через 72 ч культура имела вид конфлюентного монослоя.

Величина 1С50 для пероксида водорода в культурах с низкой плотностью (через 24 ч после посева ЗхЮ4 клеток/см2) составляла 100±20 мкМ, а в конфлюентных культурах (через 72 ч после посева ЗхЮ4 клеток/см2) 1С50 равнялась 920±130 мкМ (возрастание резистентности в 10 раз, рис.ба). Величина 1С50 для дихлородиаминплатины в культурах низкой плотности (24 ч) и в конфлюентных культурах (72 ч) составляла 3±1 мкМ и 60±8 мкМ соответственно (возрастание резистентности в 20 раз, рис.66).

Полученные результаты указывают на общность феномена конфлюентной резистентности опухолевых клеток для различных воздействий, включая неспецифические противоопухолевые препараты, окислительный стресс и рецептор-опосредованная индукция алоптоза.

а Ё й

К 1

Рис. 7. Увеличение резистентности опухолевых клеток ТНР-1 при увеличении их концентрации (А), и отсутствие подобного эффекта в культуре опухолевых клеток К 562 (Б). Белок izTRAIL добавляли через 24 часа после посева клеток в различной плотности.

Выясняли, способны ли приобретать резистентность к белку izTRAIL опухолевые клетки, которые растут в культуре, не распластываясь на внеклеточном матриксе. Обнаружили, что по мере увеличения концентрации клеток моноцитарного лейкоза человека ТНР-1, которые формируют агрегаты не прикрепляясь и не распластываясь на внеклеточном матриксе, резистентность клеток значительно возрастает (рис.7А). В отличие от этого, при увеличении концентрации клеток миелобластного лейкоза человека (линия К562), которые не распластываются на внеклеточном матриксе и не образуют агрегатов, не обнаружено достоверного увеличения резистентности клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу.

Таким образом, обнаружена способность клеток лейкоза человека приобретать резистентность к TRAIL-индуцированному апоптозу в суспензионных культурах, содержащих многоклеточные агрегаты.

3. Выяснение связи TRAIL- резистентности опухолевых клеток в конфлюентных культурах с пролиферацией клеток

В научной литературе существует представление о том, что опухолевые клетки становятся резистентными к повреждающим воздействиям в результате торможения пролиферации, перехода клеток в непролиферативное состояние (GO) (Jedema I et al., 2004). В работе выясняли, связь конфлюентной резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу с торможением или подавлением клеточной пролиферации. Для этого оценивали распределение клеток НЕр-2 и А431 по фазам клеточного цикла и митотическую активность через 24 часа после посева и в резистентных конфлюентных культурах. Кроме этого косвенно оценивали активность гена Ki67, маркера пролиферирующих клеток (Zambón, 2010), в конфлюентных и не конфлюентных культурах, используя для этого репортерную систему Ki67p-GFP в клетках А431.

■ 17 тысда кпеток'см^

■ 68 тькзн клвтокКл2

■ 272 тысячи клеток/см^

i 10 100 1000 Концентрация IzTRAIL, нг/мп

1 10 100 1000 Юэнцвтрадоя izTRAIL, кг/мл

17TbowicnenoK/ai2 68 тысяч ввтоАм2 272 тыош клетайм2

Количество клеток НЕр-2 в Б фазе клеточного цикла после 24 ч культивирования составляло 22,0±1,8 % (рис.8а), а в резистентных конфлюентных культурах клеток линии НЕр-2 через 72 ч после посева уменьшалось до 10,1±2,0% (рис.8б).

Флуоресценция (ДНК)

200

Флуоресценция (ДНК)

5 фаза 30,411,2%

Флуоресценция ДНК

в фаза 25,411,0%

МО МО вО

Флуоресценция ДНК

500 >0Ю

Рис. 8. Распределение клеток НЕр-2 (а,б) и А431 (в,г) по ДНК через 24 часа после посева (а,в) и в конфлюентных культура через 72 ч (б) и 96 ч (г) после посева.

Процент митотических клеток НЕр-2 через 24 часа культивирования составлял 7,3±1,1%, а через 72 ч - 4,5±0,7% (отличие достоверно, р<0.05). Таким образом, повышение резистентности клеток к Т11А1Ь-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах НЕр-2 коррелирует со снижением пролиферативной активности клеток.

Количество клеток А431 в Б фазе клеточного цикла после 24 ч культивирования составляло 30,4±1,2% (рис.8в), а в резистентных конфлюентных культурах клеток А431 через 96 ч после посева уменьшалось до 25,4±1,0%. (рис.8г). Процент митотических клеток А431 после 24 часов культивирования составлял 8,7±1,5%, а после 96 ч он уменьшился до 0,25±0,1% (различие достоверно, р<0,05). Таким образом, повышение резистентности клеток к ТЯА1Ь-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах А431 с одной стороны коррелирует со снижением пролиферативной активности (уменьшение % митотических клеток), однако значительная часть Т11А1Ь-резистентных клеток остается в й-фазе клеточного цикла. Тот факт, что значительная часть клеток А431 в резистентной к иТКАГЬ конфлюентной культуре находится в клеточном

цикле, подтверждается данными, полученными с применением репортерной системы Ki67p-GFP. Такая система позволяет выявлять пролиферирующие клетки, находящиеся в Gl/S/02/М-фазах клеточного цикла по экспрессии репортерного белка GFP, находящейся под контролем проксимального промотера гена Ki-67. При этом уменьшение интенсивности флуоресценции GFP указывает на понижение активности проксимального промотера гена Ki-67 и, соответственно, на снижение пролиферативной активности клеток (Zambón, 2010). Клетки A431/Ki67p-GFP имели такую же чувствительность к izTRAIL в редкой культуре (через 24 ч после посева) и резистентность в конфлюентной культуре, как и клетки А431 «дикого» типа (не трансфецированные репортерным вектором). На рис. 9 представлены гистограммы распределения клеток А431/Ki67p-GFP по интенсивности флуоресценции GFP через 24 и 96 ч после посева.

На гистограммах видны две субпопуляции клеток, интенсивность флуоресценции GFP в которых отличается в среднем в десять раз. Согласно полученным данным доля клеток с низкой интенсивностью флуоресценции GFP (не пролиферирующие клетки) через 24 ч после посева составляла 12,0±0,5%, а в конфлюентных культурах - 31,0±1,5% (рис. 9). Эти результаты также указывают с одной стороны на корреляцию повышения резистентности клеток в конфлюентных культурах с подавлением пролиферативной активности, а с другой стороны на то, что опухолевые клетки способны приобретать TRAIL-резистентность, находясь в клеточном цикле.

Флуоресценция вРР Флуоресценция йРР

Рис. 9. Распределение клеток А431/Кл67р-С-КР по флюоресценции белка ОРР через 24 часа после посева (а) и в конфлюентных культура через 96 ч после посева (б).

Обнаруженное сочетание подавления митотической активности (с 8,7 до 0,25%) с нахождением значительной части (около 70 %) клеток А431 в фазах й1, 8 и 02 клеточного цикла, в условиях конфлюентной культуры, вызывает вопрос, что это за состояние клеток, и для ответа на него требуется отдельное исследование.

Таким образом, установлено, что в Т11А1Ь-резистентных конфлюентных культурах происходит снижение пролиферативной активности клеток, но в тоже время значительная часть клеток остается в клеточном цикле.

4. Роль адгезии опухолевых клеток и околоклеточного микроокружения в формировании резистентности к ТЯА1Ь-индуцированному апоптозу

Основными причинами конфлюентной резистентности клеток к повреждающим воздействиям в литературе рассматриваются либо межклеточные контакты, либо неблагоприятное для клеток изменение околоклеточной среды (ацидоз, гипоксия и др.), возникающее в плотных культурах вследствие диффузионных ограничений массопереноса (Магигоу ег а1., 2003).

Выясняли роль межклеточной адгезии и адгезии клеток к внеклеточному матриксу в повышении резистентности клеток к ТЯА1Ь-опосредованному апоптозу.

Открепление клеток НЕр-2 конфлюентных культур от подложки в течение 10 мин посредством трипсина и ЭДТА с последующим суспендированием полностью подавляет их резистентность к действию ¡гТЛАИ. (0 часов на рис. 10). Аналогичное изменение обнаружено и для клеток А431.

Через 6 часов от момента посева все клетки НЕр-2 были распластанными, но повышения резистентности клеток к действию ¡гТВА1Ь не выявлялось (отсутствие субпопуляции резистентных клеток) (рис.10). Субпопуляция резистентных клеток появляется только через 24 часа от момента посева (12%±2%), а величина 1С50 для нерезистентной субпопуляции в это время составляет 9±1 нг/мл.

Рисунок 10. Кинетика изменения чувствительности опухолевых клеток НЕр-2 к рекомбинантному белку кШАГЬ в первые сутки после посева плотностью 33 тысячи клеток/см2.

Концентрация ¡гТИАИ., нг/мл

Известно, что в конфлюентных культурах околоклеточная среда может значительно отличаться (ацидоз, гипоксия и др.) от среды вдали от клеток вследствие диффузионных ограничений массопереноса (Ака1оу й а!., 1984), что может индуцировать резистентность клеток как адаптивный ответ на ухудшение условий околоклеточного микроокружения. В связи с этим выясняли, насколько условия околоклеточной среды опухолевых клеток в конфлюентных культурах могут влиять на возникновение у них резистентности к Т11А1Ь-индуцированному апоптозу. Для этого сравнивали действие ¡гТЛАП. на клетки А431 в культурах низкой и высокой плотности, без перемешивания и с перемешиванием культуральной среды на шейкере. Обнаружили, что независимо от перемешивания, клетки были

чувствительны к действию izTRAIL через 24 часа после посева плотностью З.ЗхКЛ'см2, и их резистентность к TRAIL- индуцированному апоптозу значительно возрастала в конфлюентных культурах (рис. 11).

Рис. 11. Клетки А431 приобретают

резистентность к действию рекобинантного белка izTRAIL в условиях перемешивания среды также как и без перемешивания. На

графике представлена выживаемость клеток через 24 часа после добавления 100 нг/мл izTRAIL. В качестве контроля использовали культуры без добавления izTRAIL.

В условиях перемешивания значение pH среды и концентрация кислорода составляли 7.08 и 150 мкМ 02 соответственно, и, таким образом, в этих условиях не наблюдалось ацидоза и гипоксии в среде около клеток.

Это указывает на то, что резистентность клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах может осуществляться при физиологических условиях околоклеточной среды.

Таким образом, нарушение межклеточных контактов, а также контакта с подложкой при откреплении клеток конфлюентных культур в течение 510 мин подавляет резистентность клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу. Распластывание клеток и формирование фокальных контактов клеток с подложкой недостаточны для повышения резистентности клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу. Конфлюентная резистентность может приобретаться опухолевыми клетками в благоприятной для роста околоклеточной среде. В совокупности эти результаты указывают на то, что причиной резистентности опухолевых клеток в конфлюэнтных культурах к TRAIL-индуцированному апоптозу являются межклеточные контакты.

5. Роль внутриклеточных сигнальных путей в формировании TRAIL-резистентности опухолевых клеток в конфлюентных культурах

Выясняли роль различных внутриклеточных сигнальных путей в формировании конфлюентной TRAIL - резистентности опухолевых клеток. С этой целью изучали влияние на конфлюентную резистентность ингибиторов протеинкиназ, принимающих участие в основных внутриклеточных сигнальных путях выживания клеток, включая фосфотидилинозитол-3-киназу (PI3K), протеинкиназу В (Akt), протеинкиназу Raf, янус-киназу (Jak), протеинкиназу А (РкА), протеинкиназу С(РкС), киназу фокальной адгезии (FAK).

100

24 часа 96 часов

аГ

40 ■

20 ■

перемешивание без перемешивания

Обнаружено, что добавление ингибитора PI3K (Wortmannin) в конфлюентную культуру клеток НЕр-2 уменьшает число резистентных к действию izTRAIL клеток в 2 раза с 50±4% до 25±3%, но не вызывает существенного изменение величины IC50 белка для субпопуляции клеток чувствительных к izTRAIL (рис.12а). Сходные результаты получены при использовании ингибитора известного фактора выживаемости клеток киназы Akt/PKB (Akt 1,2 inhibitor), который также уменьшал число резистентных к действию izTRAIL клеток, без изменения IC50 белка для субпопуляции чувствительных к izTRAIL клеток (рис.126). Ингибитор протеянкиназы Raf (Raf Kinase Inhibitor V) менее эффективно, чем ингибиторы PI3K и Akt, снижает число резистентных к действию izTRAIL клеток (до 34±3%), как и ингибитор PkA (KT 5720) (до 39±5%), без изменения IC50 белка для субпопуляции чувствительных к izTRAIL клеток (рис.12а,б). Комбинация ингибиторов PI3K и протеинкиназы Raf практические полностью подавляла конфлюентную TRAIL-резистентность клеток НЕр-2 (снижение резистентной субпопуляции клеток до 7±1%) без изменения величины IC50 белка для субпопуляции клеток чувствительных к izTRAIL (рис. 12а). Ингибиторы киназы фокальной адгезии FAK (Focal adhesion kinase inhibitor II), а также киназ Jak (AG 490), PkC (Calphostin C) не подавляли конфлюентную TRAIL-резистентность клеток НЕр-2.

Для клеток А431, в отличие от клеток НЕр-2, все указанные выше ингибиторы не уменьшали конфлюентную TRAIL-резистентность.

Рис. 12. Влияние ингибиторов различных протеинкиназ внутриклеточных сигнальных путей на конфлюентную резистентность клеток НЕр-2.

Оценивали также вклад рецепторов ростовых факторов в формировании резистентности опухолевых клеток к действию ¡гТИАЛ. в конфлюенгных культурах. Для этого конфлюентную культуру клеток НЕр-2 инкубировали в среде без сыворотки с 10 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина БСА (контроль без сыворотки), с добавлением 50 нг/мл эпидермального фактора роста (ЕОР), 50 нг/мл тромбоцитарного фактора роста (РОСР), 50 нг/мл фактора роста эндотелия сосудов (УЕОР) и 10 мкг/мл инсулина.

В конфлюентных культурах клетки линии НЕр2 в бессывороточной среде становятся чувствительными к действию ¡гТЯА1Ь, о чем свидетельствует уменьшение доли резистентной субпопуляции клеток от 50±5%, до 5±2%, без существенного изменения величины 1С50 для ¡гТЕ<А[Ь

1 10 100 Концентрация IzTRAIL, нг/мл

IzTRAIL

IzTRAIL + и иг. PI3K IzTRAIL + ииг. Raf IzTRAIL + инг. PI3K + инг. Raf

(рис. 13а), а добавление сыворотки немедленно (минуты) восстанавливает резистентность. Добавление в бессывороточную среду по отдельности эпидермального фактора роста (ЕОР) и инсулина в концентрации 10 мкг/мл, при которой он инициирует сигнальный каскад через рецепторы инсулино-подобных факторов роста ЮР1 и ЮР2, приводит к увеличению субпопуляции таА1Ь-резистентных клеток до 25±5% и 15±4%, соответственно, без изменения 1С50. Добавление комбинации инсулина и ЕОР в бессывороточную среду увеличивает количество ТКА1Ь-резистентных клеток до 41±5% (рис.136), и также без изменения 1С50 белка ¡гПШЪ. Применение инсулина в бессывороточной среде в физиологических концентрациях (10-100нг/мл) не увеличивало TRA.1L-резистентность конфлюентных культур клеток НЕр-2.

о во

S <

s«

£ I

si i'

• Контроль (с сыв.)

• Контроль (баз сыв.)

■ Контроль (без сыв.)

• Контроль (без сыв.)+EGF

• Кокгроль (без сыв.)+Инсулин

■ Контроль (без сыв. j+EGF+Инсул!

Концентрация izTRAIL, нг/мл

Концентрация IzTRAIL, нг/ил

Рис. 13. Подавление конфлюентной ТЯА1 [.-резистентности клеток НЕр-2 в среде без сыворотки (а), восстановление конфлюентной резистентности клеток НЕр-2 в бессывороточной среде ростовым фактором ЕОР и инсулином (б), и отсутствие такого эффекта при добавлении ростовых факторов РЭОР и УЕОР.

Тромбоцитарный фактор роста (PDGF ВВ) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) также не увеличивали долю резистентных клеток в бессывороточной среде.

Для клеток А431, в отличие от клеток НЕр-2, удаление сыворотки из среды культивирования не уменьшало конфлюентную TRAIL-резистентность.

Полученные результаты указывают на то, что механизм конфлюентной резистентности в опухолевых клетках разного происхождения может быть различным. В частности, повышение TRAIL-резисгентности клеток карциномы гортани человека, линия НЕр-2, в конфлюентных культурах осуществляется с привлечением некоторых тирозин-киназных рецепторов ростовых факторов (IGF и EGF, но не PDGF) и реализуется через внутриклеточные сигнальные пути, связанные с киназами PI3K, Akt (РКВ), в меньшей степени с кнназами Raf, РКА, и совсем не связано с киназой фокальной адгезии (FAK), а также с киназами Jak и РКС. В отличие от этого механизм конфлюентной резистентности клеток карциномы кожи, линия А431, согласно полученным данным не связан ни с указанными киназами, ни с тирозинкиназными рецепторами ростовых факторов.

6. Подавление конфлюентной резистентности опухолевых клеток к ТМА 11-и ндуцированному апоптозу мультикиназным ингибитором сорафенибом и ингибитором гистондеацетилазы БАНА.

В работе выясняли возможность подавления конфлюентной ТЯА1Ь-резистентности опухолевых клеток различного происхождения посредством мультикиназного ингибитора сорафениба (препарат «Нексавар») и ингибитора гистондеацетилазы субероиланилидом гидроксамовой кислоты (8АНА, препарат «Вориностат»).

Ингибитор гистондеацетилазы 8АНА и мультикиназный ингибитор сорафениб в нетоксичной концентрации (до 10 мкМ) эффективно, дозозависимым образом, подавляли конфлюентную резистентность опухолевых клеток. Для конфлюентных культур клеток А431 величина 1С50 белка ¡гТИАП, в сочетании с 5 мкМ БАНА составляла 2,(Н О,5 нг/мл, а в сочетании с 5 мкМ сорафениба - 8±2 нг/мл (рис. 14а). Для этих клеток БАНА более эффективно подавлял конфлюентную Т11А1Ь-резистентность, чем сорафениб, и клетки становились более чувствительными к кТКАГЬ, чем суспендированные клетки без добавления БАНА (рис.5). В культуре клеток НЕр-2 8АНА и сорафениб в равной степени эффективно подавляли конфлюентную Т1*АИ,-резистентность (рис.146), и величина 1С50 составляла 1±0,4 нг/мл и 2±0,4 нг/мл соответственно (отличие недостоверно).

1 100

8 ео

S 60

»5

1f О 40

5 prt

б во

ае

S 40

■ I2TRAL - izTRAL + 5 мкМ сорафениб

■ IZTRAIL»5MKMSAHA

- irTRAlL

• tzTRAtL+5 мкМ с

• izTRAll*5 мкМ SAHA

Концентрация IzTRAlL, нг/мл

10 100 Концентрация I2TRAIL. нг/мл

Рис. 14. Подавление конфлюентной TRAIL-резистентности клеток А 431 (а) и НЕр-2 (б) при добавлении 5 мкМ мультикиназного ингибитора сорафениб и 5 мкМ ингибитора гистондеацетилазы SAHA.

Аналогичные результаты были получены для других линий опухолевых клеток, в том числе для клеток фибросаркомы НТ-1080.

Таким образом, применение сорафениба и SAHA, которые в настоящее время используются как таргетные препараты в противоопухолевой терапии, способно эффективно подавлять конфлюентную резистентность опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу. Это создает основу для повышения эффективности потенциального применения рекомбинангных белков TRAIL путем их сочетания с таргетными препаратами в нетоксичной концентрации, позволяя сохранять нетоксичность бинарной комбинации izTRAIL + ингибитор конфлюентной TRAIL-резистентности в целом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты указывают на общность явления конфлюентной резистентности клеток к различным повреждающим воздействиям, включая не только ксенобиотики (химиотерапевтические препараты), окислительный стресс, о чем свидетельствуют данные литературы, но и обнаруженную в ходе выполнения работы конфлюентную резистентность к TRAIL-индуцированному алоптозу. Резистентность опухолевых клеток к инициации апоптоза через рецепторы лиганда TRAIL указывает на то, что такая резистентность связана не с белками, выводящими ксенобиотики из клеток (белки множественной лекарственной устойчивости Pgp, MRP1-MRP5 и др.), а с внутриклеточными сигнальными путями, ответственными за выживаемость клеток. Существенным моментом является также то, что TRAIL-резистентность могут приобретать и клетки лейкоза человека в многоклеточных агрегатах. Эта результаты представляют интерес не только с научной точки зрения для понимания молекулярных механизмов резистентного состояния клеток в патологии, но и для лечения злокачественных заболеваний.

В настоящее время нет ясного понимания причины возникновения резистентности опухолевых клеток в конфлюентных культурах. Основными предположениями можно назвать участие межклеточных контактов, либо специфических факторов околоклеточного микроокружения, таких как ацидоз и гипоксия, возникающих непосредственно около клеток вследствие диффузионного ограничения массопереноса в конфлюентных культурах. В ответ на эти факторы можно ожидать адаптивное неспецифическое повышение резистентности опухолевых клеток. Однако в наших исследованиях было установлено, что конфлюентная TRAIL-резистентность может возникать в условиях благоприятной для роста клеток околоклеточной среды. Совокупность полученных в работе результатов указывает, что причиной резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному алоптозу являются межклеточные контакты. Вопрос о том, какие межклеточные контакты индуцируют резистентность опухолевых клеток к повреждающим воздействиям, и каким образом это осуществляется, остается открытым и требует дальнейших исследований.

Другой важный вопрос, рассмотренный в диссертации, состоит в том, связана ли конфлюентная резистентность опухолевых клеток с подавлением клеточной пролиферации. Представленные в работе результаты указывают на связь конфлюентной TRAJL-резистенгности с угнетением пролиферации клеток. Однако, согласно полученным данным, опухолевые клетки могут приобретать резистентность, оставаясь в клеточном цикле, в частности в S и G1 фазах. Вопрос о том, что это за состояние опухолевых клеток, при котором митотическая активность подавлена, а клетки остаются в цикле, остается открытым, и для ответа на него требуются дополнительные исследования.

Выполненный в работе анализ роли в конфлюентной TRAIL-резистентности опухолевых клеток основных, ответственных за выживание протеинкиназ внутриклеточных сигнальных путей показал, что механизмы резистентности клеток разного происхождения могут быть различными, что

может отражать специфику трансформации клеток в опухолях. Например, в клетках карциномы гортани человека механизм конфлюентной TRAIL-резистентности реализуется с участием тирозинкиназных рецепторов, внутриклеточных протеинкиназ PI3K, Akt, Raf, РКА (рис. 15), которые указывают на реализацию механизма через ингибирование Bad, супрессора антиапоптотических белков Вс1-2 и Bcl-xL, и проапоптотического белка Вах, олигомеризация которого в комплексе с рядом других белков во внешней мембране митохондрий обеспечивает выход в цитозоль проапоптогических белков SMAC, CytC и др., что необходимо для активации эффекторных каспаз 3, 6, 7 и запуска апоптоза.

TRAIL редаптор Интегрняовый рецептор Тирочиикштаныйршептор

Рис. 15. Роль сигнальных протеинкиназ в механизме конфлюентной ТЯ-МЬ-резистентности опухолевых клеток НЕр2. Светлые фигуры -проапоптотические белки, темные — антиапоптотические белки, маленькие круги на темных фигурах - использованные в работе ингибиторы, прерывистые стрелки - неактивированные, и сплошные стрелки - активированные сигнальные пути конфлюентной ШАП .-резистентности клеток НЕр-2

В то же время в работе обнаружено, что в клетках карциномы кожи человека, линия А431, механизм конфлюентной ТКА1Ь-резистентности не связан с указанными протеинкиназами. Это указывает на необходимость учитывать специфику опухолей при разработке методов подавления конфлюентной резистентности опухолевых клеток.

Подавление конфлюентной резистентности опухолевых клеток НЕр-2 к ТЯА1Ь-индуцированному апоптозу путем применения ингибиторов

внутриклеточных сигнальных протеинкиназ в нетоксичных концентрациях, свидетельствует о возможности создания комплексных субстанций, которые способны подавлять резистентность опухолевых клеток и избирательно вызывать их гибель, не оказывая токсичного действия на клетки здоровых тканей.

ВЫВОДЫ

1. Опухолевые клетки человека эпителиального и мезенхимального происхождения способны приобретать резистентность к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах. Клетки лейкоза человека способны приобретать резистентность к TRAIL-индуцированному апоптозу в многоклеточных агрегатах.

2. Резистентность опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах возникает на фоне подавления пролиферативной активности, и при этом значительная часть резистентных клеток может оставаться в клеточном цикле.

3. Полученные результаты указывают на то, что причиной резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах являются межклеточные контакты.

4. Механизмы резистентности опухолевых клеток разного происхождения к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах могут значительно отличаться и включать активацию рецепторов ростовых факторов и протеинкиназ внутриклеточных сигнальных путей, таких как PI3K, Akt (РКВ), Raft РКА.

5. Резистентность опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах может подавляться путем нетоксичного воздействия на внутриклеточные молекулярные мишени.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Р.С. Фадеев, А.В. Чеканов, Н.В. Долгих, B.C. Акатов. Повышение резистентности опухолевых клеток линии А431 к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах // Биофизика, 2012, том 57, вып. 4, с. 649-654.

2. Р.С. Фадеев, А.В. Чеканов, Н.В. Долгих, B.C. Акатов. Мультикиназный ингибитор сорафениб и ингибитор гистондеацетилазы субероиланилидгидроксамовая кислота подавляют конфлюентную резистентность опухолевых клеток к рекомбинантному белку izTRAIL // Биофизика, 2012, Том 57, Вып. 4, с. 655-661.

3. Р.С. Фадеев, А.В. Чеканов, Н.В. Долгих, B.C. Акатов. Резистентность опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах // Биологические мембраны, 2012, Том 29, Вып. 6, с. 433-441.

4. Н.В. Долгих, Р.С. Фадеев, А.В. Чеканов, B.C. Акатов. Сравнительное изучение цитотоксического действия противоопухолевого белка TRAIL и его модифицированной формы in vitro // Вестник ВГУ, серия: Химия. Биология. Фармация, 2012, № 1, с. 84-89.

5. Knyazeva EL, Grishchenko VM, Fadeev RS, Akatov VS, Permyakov SE, Permyakov EA. Who is Mr. HAMLET? Interaction of human alpha-lactalbumin with monomelic oleic acid. // Biochemistry, 2008, V. 47(49), p. 13127-37.

6. Permyakov SE, Knyazeva EL, Khasanova LM, Fadeev RS, Zhadan AP, Roche-Hakansson H, ffikansson AP, Akatov VS, Permyakov EA. Oleic acid is a key cytotoxic component of HAMLET-like complexes. // Biol. Chem., 2012, V. 393(1-2), p. 85-92.

Тезисы:

1. Фадеев P.C., Чеканов A.B., Акатов B.C. Изучение зависимой от клеточной адгезии резистентности опухолевых клеток к повреждающему действию цитокина TRAIL in vitro // Экспериментальная и теоретическая биофизика' 10. Труды конференции / Под ред. Г.Р. Иваницкого. - Пущино: Фотон-век, 2010. - 36с.

2. Фадеев Р.С., Чеканов А.В., Акатов B.C. Изучение резистентности опухолевых клеток к действию цитокина TRAIL // Сборник тезисов 15 международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - 2011, стр. 207.

3. Фадеев Р.С., Чеканов А.В., Фадеева И.С., Акатов B.C. Перспективы применения высокоселективного человеческого противоопухолевого цитокина TRAIL для лечения злокачественных новообразований мозга // Материалы Седьмого Международного Междисциплинарного Конгресса «Нейронауха для медицины и психологии», Судак, Крым, Украина, 3-13 июня 2011 года.

4. Долгих Н.В., Фадеев Р.С., Чеканов А.В. Специфичность сенситизации опухолевых клеток различного происхождения к повреждающему действию противоракового рекомбинантного белка т-

TRAIL // Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-ЗОН», М.: МАКС Пресс, 2011. - ISBN 978-5-317-03634-8

5. Долгих Н.В., Фадеев P.C., Чеканов A.B., Акатов B.C. Изучение цитотоксического действия противоракового цитокина TRAIL и его модифицированной формы in vitro // Сборник тезисов 15 международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». -2011, стр. 191.

6. Долгих Н.В., Фадеев Р.С, Чеканов А.В.Сравнительное изучение противоопухолевого действия рекомбинантного цитокина TRAIL/Apo2L и его модифицированной формы на линиях опухолевых клеток // Материалы IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов, Воронеж, 23-27 мая 2011 г. : в 2 т. Воронежский государственный университет, Всероссийская биологическая ассоциация «Симбиоз Россия». - Воронеж: Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета, 2011.

7. Долгих Н.В., Фадеев P.C., Чеканов A.B., Акатов B.C. Специфичность сенситизации опухолевых клеток различного происхождения к цитотоксическому действию противоопухолевого рекомбинантного бежа m-TRAIL // Экспериментальная и теоретическая биофизика '11. Труды конференции / Под ред. Г.Р. Иваницкого. - Пущино: Фотон-век, 2011. - 24с. - ил.

8. Долгах Н.В., Фадеев P.C., Чеканов A.B., Акатов B.C. Резистентность опухолевых клеток к повреждающему действию рекомбинантного белка izTRAIL в плотных конфликтных культурах Н Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2012» / Отв. ред. А.И. Андреев, A.B. Андриянов, ЕЛ. Антипов, К.К. Андреев, М.В. Чистякова. М.: МАКС Пресс, 2012.

9. Долгих Н.В., Фадеев P.C., Чеканов A.B., Акатов B.C. Подавление резистентности опухолевых клеток к противораковому рекомбинантному белку mTRAIL таргетными препаратами в нетоксичных концентрациях // Сборник тезисов 16 международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - 2012, стр. 411.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и пауки РФ в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» (Госконтракг № 16.512.11.2261) и ВП «Развитие научного потенциала высшей школы» 2012-2014 гг. (Проект №4.3887.2011) с использованием приборов ЦКП ИТЭБ РАН и ЦКП ИБК РАН.

Типография ООО «Фотон-век», ИНН 5039008988 г.Пущино, Московская область тел. (4967) 73-94-32 Ьеото1@гатЫвг. ги

Подписано в печать 24.10.2012 Формат 60 х 90 /16 Тираж 80 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фадеев, Роман Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Цитокин Apo2L/TRAIL.

1.1.1 Apo2L/TRAIL лиганд.

1.1.2 Рецепторы к TRAIL/Apo2L.

1.1.3 Основной сигнальный путь TRAIL.

1.1.4 Альтернативный сигнальный путь TRAIL.

1.1.4.1 Активация NF-kB сигнального пути.

1.1.4.2 Активация PI3K-Akt сигнального пути.

1.1.4.3 Активация МАРК сигнального пути.

1.1.5 Резистентность опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу.

1.1.5.1 Сигнальные пути, принимающие участие в подавлении TRAIL-индуцированного апоптоза.

1.1.5.1.1 NF-kB сигнальный путь.

1.1.5.1.2 Akt/PKB сигнальный путь.

1.1.5.1.3 МАРК сигнальный путь.

1.1.5.1.4 mTOR сигнальный путь.

1.1.5.1.5 c-FLIPHIAPS.

1.1.5.1.6 GSK3a-GSK3(3 сигнальный путь.

1.1.6 Цитокин TRAIL как терапевтический препарат.

1.2 Приобретенная резистентность опухолевых клеток.

1.2.1 Резистентность опухолевых клеток в конфлюентных культурах

1.2.2 Резистентность опухолевых клеток в многоклеточных агрегатах. 39 1.2.2.1 Механизмы резистентности опухолевых клеток в многоклеточных агрегатах.

1.2.2.1.1 Механизмы опосредованные контактными взаимодействиями клеток.

1.2.2.1.2 Механизмы опосредованные ограничениями транспорта веществ в многоклеточных агрегатах.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Материалы.

2.2 Получение рекомбинантного белка izTRAIL.

2.3 Культура клеток.

2.4 Получение культуры нормальных диплоидных фибробластов человека

2.5 Оценка цитотоксичности.

2.6 Морфологический флуоресцентный анализ апоптоза.

2.7 Анализ митотической активности.

2.8 Ki67p-GFP репортерная система.

2.9 Трансфекция клеток.

2.10 Проточная цитофлуориметрия.

2.11 Анализ содержания кислорода в среде культивирования клеток.

2.12 Статистический анализ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

3.1 Избирательность апоптоз-индуцирующего действия рекомбинантного белка izTRAIL на опухолевые клетки.

3.2 Повышение резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах.

3.3 Выяснение связи TRAIL- резистентности опухолевых клеток в конфлюентных культурах с пролиферацией клеток.

3.4 Роль адгезии опухолевых клеток и околоклеточного микроокружения в формировании резистентности к TRAIL-индуцированному апоптозу.

3.5 Роль внутриклеточных сигнальных путей в формировании TRAIL-резистентности опухолевых клеток в конфлюентных культурах.

3.6 Подавление конфлюентной резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу мультикиназным ингибитором сорафенибом и ингибитором гистондиацетилазы SAHA.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Резистентность опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах"

Онкологические заболевания занимают второе место в мире по смертности после сердечно-сосудистых патологий. Недостаточная эффективность лечения онкологических заболеваний обусловлена в первую очередь отсутствием избирательного действия существующих противоопухолевых препаратов, недостаточно эффективным проникновением противоопухолевых субстанций в опухолевую ткань и возникновением при определенных условиях резистентности опухолевых клеток к повреждающим воздействиям. Возникновение резистентности опухолевых клеток к действию химиотерапевтических препаратов связывают, в первую очередь, с внутриклеточными механизмами активации и/или повышенной экспрессии белков-транспортеров суперсемейства ABC (Р-гликопротеина (Pgp), MRP1-MRP-5, BCRP и LPR), осуществляющих выведение ксенобиотиков различного происхождения из клетки (Gottesman et al., 2002). С другой стороны, известно повышение резистентности опухолевых клеток к различным повреждающим воздействиям в двумерных (конфлюентные культуры распластанных клеток) и трехмерных (сфероиды) многоклеточных образованиях в условиях in vitro, отражающее резистентность клеток в опухолевой паренхиме к действию химиотерапевтических препаратов (Chitcholtan et al., 2012), окислительного стресса (Акатов и др., 2003), гипертермии (Olive et al., 1985), радиации (Dertinger et al., 1975). Это говорит об общности механизмов повышения резистентности опухолевых клеток к различным повреждающим воздействиям в плотных многоклеточных образованиях. Механизм такой резистентности до сих пор остается не выясненным. В настоящее время одним из наиболее перспективных подходов противоопухолевой терапии является потенциальное применение рекомбинантных белков, созданных на основе цитокина TRAIL (TNF alpha Related Apoptisis Inducing Ligand).

Цитокин TRAIL является интегральным мембранным белком, относящихся к семейству фактора некроза опухолей, который обнаруживается у NK-клеток, а также у части дендритных клеток (Ashkenazi A. et al., 2008). Уникальной особенностью цитокина TRAIL является его способность избирательно индуцировать апоптоз в опухолевых клетках, связываясь со специфическими рецепторами клеточной гибели (DR4, DR5) на внешней поверхности цитоплазматической мембраны, и при этом не повреждать нормальные клетки организма (Gonzalvez F. et al., 2010). В то же время известно, что не все опухолевые клетки чувствительны к TRAIL-индуцированному апоптозу. В литературе указывается, что около 50% исследованных линий опухолевых клеток обладают конститутивной резистентностью к действию цитокина TRAIL, подобно нормальным клеткам. Это связывают как с изменением структуры рецепторов DR4, DR5, так и с повышенной экспрессией рецепторов ловушек (DcRl и DcR2), либо с конститутивной активностью внутриклеточных сигнальных путей, ответственных за выживание клеток (Johnstone et al., 2008). Однако, до сих пор, остается неизвестно, способны ли чувствительные к действию TRAIL опухолевые клетки приобретать резистентность к TRAIL-индуцированному апоптозу в зависимости от условий околоклеточного микроокружения, в частности, в плотных многоклеточных структурах, таких как конфлюэнтные культуры. Ответ на этот вопрос имеет большое теоретическое значение для биологии клетки, а также принципиально важен для создания на основе рекомбинантных белков TRAIL эффективных препаратов для противоопухолевой терапии.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

2. Исследование резистентности опухолевых клеток к Т11А1Ь-индуцированному апоптозу в зависимости от пролиферативной активности клеток;

3. Изучение резистентности опухолевых клеток к Т11А1Ь-индуцированному апоптозу в зависимости от адгезии клеток и параметров околоклеточной среды;

4. Выяснение механизма резистентности опухолевых клеток к Т11А1Ь-индуцированному апоптозу и оценка возможности ее подавления.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Фадеев, Роман Сергеевич

выводы

ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА РАБОТЫ

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» (Госконтракт № 16.512.11.2261) и ВП «Развитие научного потенциала высшей школы» 2012-2014 гг. (Проект № 4.3887.2011) с использованием приборов ЦКП ИТЭБ РАН и ЦКП ИБК РАН.

БЛАГОДАРНОСТИ

Считаю приятным долгом выразить огромную благодарность своему научному руководителю д.ф.-м.н. профессору Владимиру Семеновичу Акатову за диссертационное руководство, неоценимую помощь в науке и жизни, постоянную поддержку, терпение и бесценную помощь в кристаллизации научных идей.

Выражаю глубокую благодарность научному руководителю работы к.б.н. Алексею Владимировичу Чеканову за внимание к работе, ценные указания и активное содействие в проведении исследований, а также сотрудникам лаборатории Ирине Сергеевне Фадеевой и Надежде Владимировне Долгих за искреннюю помощь, непрерывное содействие и постоянное внимание к работе.

Автор с глубокой признательностью выражает персональную благодарность Андрею Александровичу Кудрявцеву, Надежде Федоровне Даниной и Тамаре Николаевне Буданцевой за неоценимую поддержку на всех этапах работы, а также сотрудникам ИБП РАН Сергею Евгеньевичу и Евгению Анатольевичу Пермяковым, Екатерине Юрьевне Князевой и Валерию Мефодьевичу Грищенко, сотрудникам ИБК РАН Валерию Александровичу Яшину, Олегу Сергеевичу Моренкову, Веронике Валерьевне Врублевской, Станиславу Сергеевичу Колесникову за активное содействие и помощь при проведении исследований.

Автор также выражает признательность коллегам Марине Евгеньевне и Валерию Владимировичу Соловьевым, Ирине Денисовне Пшикиной, Юрию Викторовичу Шаталину, Виктории Сергеевне Шубиной, Алексею Георгиевичу Круглову, Анне Борисовне Никифоровой, Вере Викторовне. Тепловой, Валентине Петровне Лавровской, Анне Дмитриевне Окуневой,

Сергею Геннадьевичу Левину и Александру Геннадьевичу Бобылеву за плодотворное сотрудничество и дружеское участие при проведении работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты указывают на общность явления конфлюентной резистентности клеток к различным повреждающим воздействиям, включая не только ксенобиотики (химиотерапевтические препараты), окислительный стресс, о чем свидетельствуют данные литературы, но и обнаруженную в ходе выполнения работы конфлюентную резистентность к TRAIL-индуцированному апоптозу. Резистентность опухолевых клеток к инициации апоптоза через рецепторы лиганда TRAIL указывает на то, что такая резистентность связана не с белками, выводящими ксенобиотики из клеток (белки множественной лекарственной устойчивости Pgp, MRP1-MRP5 и др.), а с внутриклеточными сигнальными путями, ответственными за выживаемость клеток. Существенным моментом является также то, что TRAIL-резистентность могут приобретать и клетки лейкоза человека в многоклеточных агрегатах. Эти результаты представляют интерес не только с научной точки зрения для понимания молекулярных механизмов резистентного состояния клеток в патологии, но и для лечения злокачественных заболеваний.

85 причиной резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу являются межклеточные контакты. Вопрос о том, какие межклеточные контакты индуцируют резистентность опухолевых клеток к повреждающим воздействиям, и каким образом это осуществляется, остается открытым и требует дальнейших исследований.

Другой важный вопрос, рассмотренный в диссертации, состоит в том, связана ли конфлюентная резистентность опухолевых клеток с подавлением клеточной пролиферации. Представленные в работе результаты указывают на связь конфлюентной TRAIL-резистентности с угнетением пролиферации клеток. Однако, согласно полученным данным, опухолевые клетки могут приобретать резистентность, оставаясь в клеточном цикле, в частности в S и Gl фазах. Вопрос о том, что это за состояние опухолевых клеток, при котором митотическая активность подавлена, а клетки пребывают в клеточном цикле, остается открытым, и для ответа на него требуются дополнительные исследования.

Выполненный в работе анализ роли в конфлюентной TRAIL-резистентности опухолевых клеток основных ответственных за выживание протеинкиназ внутриклеточных сигнальных путей показал, что механизмы резистентности клеток разного происхождения могут быть различными, что может отражать специфику трансформации клеток в опухолях. Например, в клетках карциномы гортани человека механизм конфлюентной TRAIL-резистентности реализуется с участием тирозинкиназных рецепторов, внутриклеточных протеинкиназ PI3K, Akt, Raf, РКА (Рисунок 32), которые указывают на реализацию механизма через ингибирование Bad, супрессора антиапоптотических белков Вс1-2 и Bcl-xL, и проапоптотического белка Вах, олигомеризация которого в комплексе с рядом других белков во внешней мембране митохондрий обеспечивает выход в цитозоль проапоптотических белков SMAC, CytC и др., что необходимо для активации эффекторных каспаз 3, 6, 7 и запуска апоптоза. оосссбосеооооссса »ееееееоосееоосессе хооссссссссосососса оооосооеееооооош хсооосессоое * хоосеооооеос

Рисунок 32 - Роль протеинкиназ в механизме конфлюентной Т11А1Ь-резистентности опухолевых клеток НЕр2 Зеленые фигуры - проапоптотические белки, синие - антиапоптотические белки, маленькие круги на синих фигурах - использованные в работе ингибиторы, стрелки -активация, Т - линии ингибирование, красные Т-линии - сигнальные пути, активированные при конфлюентной Т11А1Ь-резистентности клеток НЕр-2

В то же время в работе обнаружено, что в клетках карциномы кожи человека, линия А431, механизм конфлюентной ТКА1Ь-резистентности не связан с указанными протеинкиназами. Это показывает необходимость учитывать специфику опухолей при разработке методов подавления конфлюентной резистентности опухолевых клеток.

Подавление конфлюентной резистентности опухолевых клеток НЕр-2 к ТБ1А1Ь-индуцированному апоптозу путем применения ингибиторов внутриклеточных сигнальных киназ в нетоксичных концентрациях, свидетельствует о возможности создания комплексных субстанций, которые способны подавлять резистентность опухолевых клеток и избирательно вызывать их гибель, не оказывая токсичного действия на клетки здоровых тканей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фадеев, Роман Сергеевич, Пущино

1. Акатов B.C., Соловьева М.Е., Лещенко В.В., Теплова В.В. Окислительный стресс в клетках карциномы гортани человека НЕР-2 в результате действия сочетания витаминов В12Ь и С // Бюлл. эксп. биол. мед. 2003, Т. 136, №9, с. 318-321.

2. Akatov V.S., Lezhnev E.I., Vexler A.M., Kublik L.N. Low pH value of pericellular medium as a factor limiting cell proliferation in dense cultures // Exp Cell Res., 1985, V. 160(2), p. 412-8.

3. Almasan A., Ashkenazi A. Apo2L/TRAIL: apoptosis signaling, biology, and potential for cancer therapy // Cytokine Growth Factor Rev., 2003, V. 14(3-4), p. 337-348.

4. Anderson M., Warr J.R. Expression of verapamil hypersensitivity in multidrug-resistant cells grown as multicellular spheroids // Cancer Chemother Pharmacol., 1990, V. 26, p. 151-154.

5. Almasan A., Ashkenazi A. Apo2L/TRAIL: apoptosis signaling, biology, and potential for cancer therapy // Cytokine Growth Factor Rev., 2003, V.14, p. 337-348.

6. Aza-Blanc P., Cooper C. L., Wagner K., Batalov S., Deveraux Q. L., Cooke M. P. Identification of modulators of TRAIL-induced apoptosis via RNAi-based phenotypic screening // Mol. Cell., 2003, V. 12, p. 627-637.

7. Baader E., Toloczko A. et al. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-mediated proliferation of tumor cells with receptor-proximal apoptosis defects // Cancer Res., 2005, V. 65(17), p. 7888-7895.

8. Bates R.C., Lincz L.F., Burns G.F. Involvement of integrins in cell survival // Cancer Metastasis Rev., 1995, V. 14, p. 191-203.

9. Bates R.C., Buret A., van Helden D.F. et al. Apoptosis induced byinhibition of intercellular contact // J. Cell Biol., 1994, V. 125, p. 403-15.94

10. Begg A.C., Shrieve D.C., Smith K.A. et al. Effects of hypoxia, pH, and growth stage on cell killing in Chinese hamster V79 cells in vitro by activated cyclophosphamide // Cancer Res., 1985, V. 45, p. 3454-9.

11. Bichay T.J., Inch W.R. Resistance of V79 multicell spheroids to mitoxantrone: drug uptake and cytotoxicity // Cancer Drug Deliv., 1987, V. 4, p. 201-11.

12. Bockbrader K.M., Tan M., Sun Y. A small molecule Smac-mimic compound induces apoptosis and sensitizes TRAIL- and etoposide-induced apoptosis in breast cancer cells // Oncogene. 2005, V. 24, p. 7381-7388.

13. Bodmer J.L., Meier P. et al. Cysteine 230 is essential for the structure and activity of the cytotoxic ligand TRAIL // J. Biol. Chem., 2000, V. 275(27), p. 20632-20637.

14. Calatozzolo C., Gelati M., Ciusani E., Sciacca F.L., Polio B., Cajola L., Marras C., Silvani A., Vitellaro, Zuccarello L., Croci D., Boiardi A., Salmaggi

15. A. 2005. Expression of drug resistance proteins Pgp, MRP1, MRP3, MRP5 and GSTpi in human glioma // J. Neurooncol., V. 74, p. 113-121.

16. Carlsson J., Daniel-Szolgay E., Frykholm G. et al. Homogeneous penetration but heterogeneous binding of antibodies to carcinoembryonic antigen in human colon carcinoma HT-29 spheroids // Cancer Immunol. Immunother., 1989, V. 30, p. 269-76.

17. Cha S.S., Kim M.S. et al. A resolution crystal structure of human TRAIL, a cytokine with selective antitumor activity // Immunity, 1999, V. 11(2), p. 253-261.

18. Chaudhary P.M., Eby M., Jasmin A., Bookwalter A., Murray J., Hood L. Death receptor 5, a new member of the TNFR family, and DR4 induce FADD-dependent apoptosis and activate the NF-kappaB pathway // Immunity. 1997, V. 7, p. 821-830.

19. Chen X., Kandasamy K., Srivastava R. K. Differential roles of RelA (p65) and c-Rel subunits of nuclear factor kappa B in tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand signaling // Cancer Res., 2003, V. 63, p. 1059— 1066.

20. Chitcholtan K., Sykes P.H., Evans J.J. The resistance of intracellular mediators to doxorubicin and cisplatin are distinct in 3D and 2D endometrial cancer // J. Transl. Med., 2012, V. 10, p. 38.

21. Chun M.H. Plasmin induces the formation of multicellular spheroids of breast cancer cells // Cancer Lett., 1997, V. 117, p. 51-6.

22. Daniel P.T., Wieder T. et al. The kiss of death: promises and failures of death receptors and ligands in cancer therapy // Leukemia, 2001, V. 15(7), p. 1022-1032.

23. D'Arpa P., Beardmore C. and Liu L.F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons // Cancer Res., 1990, V. 50, p. 6919-6924.

24. Degli-Esposti M.A., Dougall W.C. et al. The novel receptor TRAIL-R4 induces NF-kappaB and protects against TRAIL-mediated apoptosis, yet retains an incomplete death domain // Immunity, 1997, V. 7(6), p. 813-820.

25. Degli-Esposti M.A., Smolak P.J. et al. Cloning and characterization of TRAIL-R3, a novel member of the emerging TRAIL receptor family // J. Exp. Med., 1997, V. 186(7), p. 1165-1170.

26. Dertinger H., Lucke H.C. A comparative study of post-irradiation growth kinetics of spheroids and monolayers // Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med., 1975, V. 28, p. 255-65.

27. Dimanche-Boitrel M.T., Micheau O., Hammann A. et al. Contribution of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27KIPl to the confluence-dependent resistance of HT29 human colon carcinoma cells // Int. J. Cancer, 1998, V. 77, p. 796-802.

28. Dimanche-Boitrel M.T., Garrido C., Chauffert B. Kinetic resistance to anticancer agents // Cytotechnology, 1993, V. 12, p. 347-56.

29. Du C., Fang M., Li Y., Li L., Wang X. Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition // Cell. 2000, V. 102, p. 33-42.

30. Durand R E., Sutherland R.M. Effects of intercellular contact on repair of radiation damage // Exp. Cell Res., 1972, V. 71 p.75-80.

31. Durand R.E. Radioprotection by WR-2721 in vitro at low oxygen tensions: implications for its mechanisms of action // Br. J. Cancer, 1983, V. 47, p. 387-92.

32. Durand R.E. Cellular oxygen utilization and radiation response of V79 spheroids // Adv. Exp. Med. Biol., 1983, V. 159, p. 419-34.

33. Durand R.E. Synergism of cisplatin and mitomycin C in sensitive and resistant cell subpopulations of a tumor model // Int. J. Cancer., 1989, V. 44, p. 911-7.

34. Durand R.E. Chemosensitivity testing in V79 spheroids: drug delivery and cellular microenvironment // J. Natl. Cancer Inst., 1986, V. 77, p. 247-52.

35. Durand R.E. Distribution and activity of antineoplastic drugs in a tumor model // J. Natl. Cancer Inst., 1989, V. 81, p. 146-52.

36. Ehrhardt H., Fulda S., Schmid I., Hiscott J., Debatin K. M., Jeremias I. TRAIL induced survival and proliferation in cancer cells resistant towards TRAIL-induced apoptosis mediated by NF-kappaB // Oncogene. 2003, V. 22, p. 3842-3852.

37. Ehrlich P.H., Moustafa Z.A., Archinal-Mattheis A.E. et al. The reversal of multidrug resistance in multicellular tumor spheroids by SDZ PSC 833 //Anticancer. Res., 1997, V. 17, p. 129-33.

38. El-Zawahry A., McKillop J., Voelkel-Johnson C. Doxorubicin increases the effectiveness of Apo2L/TRAIL for tumor growth inhibition of prostate cancer xenografts // BMC Cancer., 2005, V. 5, p. 2.

39. Erlichman C., Wu A. Resistance of MGH-U1 bladder cancer spheroids to vincristine // Anticancer. Res., 1992, V. 12, p. 1233-6.

40. Erlichman C., Vidgen D., Wu A. Cytotoxicity of cisplatin and cisdiammine-l,l-cyclobutane dicarboxylate in MGH-U1 cells grown as monolayers, spheroids, and xenografts // J. Natl. Cancer Inst., 1985, V. 75, p. 499505.

41. Emery J. G., McDonnell P. et al. Osteoprotegerin is a receptor for the cytotoxic ligand TRAIL // J. Biol. Chem., 1998, V. 273(23), p. 14363-14367.

42. Fisher M. J., Virmani A. K. et al. Nucleotide substitution in the ectodomain of trail receptor DR4 is associated with lung cancer and head and neck cancer// Clin. Cancer Res., 2001, V. 7(6), p. 1688-1697.

43. Falschlehner C., Emmerich C. H., Gerlach B., Walczak H. TRAIL signalling: decisions between life and death // Int. J. Biochem. Cell Biol., 2007, V. 39, p. 1462-1475.

44. Frank C., Weber K.J., Fritz P. et al. Increased dose-rate effect in V79-multicellular aggregates (spheroids). Relation to initial DNA lesions and repair // Radiother. Oncol., 1993, V. 26, p. 264-70.

45. Frankel A., Buckman R., Kerbel R.S. Abrogation of taxol-induced G2-M arrest and apoptosis in human ovarian cancer cells grown as multicellular tumor spheroids // Cancer Res., 1997, V. 57, p. 2388-93.

46. Frese S., Pirnia F., Miescher D., Krajewski S., Borner M. M., Reed J. C., Schmid R. A. PG490-mediated sensitization of lung cancer cells to Apo2L/TRAIL-induced apoptosis requires activation of ERK2 // Oncogene, 2003, V. 22, p. 5427-5435.

47. Fujita N., Kataoka S., Naito M. et al. Suppression of Tlymphoma cell apoptosis by monoclonal antibodies raised against cell surface adhesion molecules // Cancer Res., 1993, V. 53, p. 5022-7.

48. Ganten T.M., Koschny R., Haas T.L., Sykora J., Li-Weber M., Herzer K., Walczak H. Proteasome inhibition sensitizes hepatocellular carcinoma cells, but not human hepatocytes, to TRAIL // Hepatology, 2005, V. 42, p. 588-597.

49. Garrido C., Ottavi P., Fromentin A., Hammann A., Arrigo A.P., Chauffert B. and Mehlen P. HSP27 as a mediator of confluence-dependent resistance to cell death induced by anticancer drugs // Cancer Res., 1997, V. 57, p. 2661-2667.

50. Garrido C., Chauffert B., Pinard D. et al. Circumvention of confluence-dependent resistance in a human multi-drug-resistant colon-cancer cell line // Int. J. Cancer., 1995, V. 61, p. 873-9.

51. Chen C., Wei Y., Hummel M., Hoffmann T.K., Gross M., Kaufmann A.M., Albers A.E. Evidence for epithelial-mesenchymal transition in cancer stem cells of head and neck squamous cell carcinoma // PLoS One, 2011, V. 6(1), el6466.

52. Glimelius B., Norling B., Nederman T. et al. Extracellular matrices in multicellular spheroids of human glioma origin: increased incorporation of proteoglycans and fibronectin as compared to monolayer cultures // APMIS, 1988, V. 96, p. 433-44.

53. Goldwasser F., Shimizu T., Jackman J., Hoki Y., O'Connor P.M., Kohn K.W. and Pommier Y. Correlations between S and G2 arrest and the cytotoxicity of camptothecin in human colon cancer cells // Cancer Res., 1996, V. 56, p. 4430-4437.

54. Gonzalvez F., Ashkenazi A. New insights into apoptosis signaling by Apo2L/TRAIL // Oncogene, 2010, V. 29(34), p. 4752-4765.

55. Haji-Karim M, Carlsson J. Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin. Cancer Res 1978;38:1457-64.

56. Hambek M, Werner C, Baghi M, Gstottner W, Knecht R. Prestimulation of head and neck cancer cells with growth factors enhances treatment efficacy // Anticancer Res., 2006, V. 26(2A), p. 1091-1095.

57. Hauptmann S, Denkert C, Lohrke H, et al. Integrin expression on colorectal tumor cells growing as monolayers, as multicellular tumor spheroids, or in nude mice // Int. J. Cancer, 1995, V. 61, p. 819-25.

58. Huot J., Gaetan R., Lambert H., Chretien P. and Landry J. Increased survival after treatments with anticancer agents of Chinese hamster cells expressing the human Mr 27,000 heat shock protein // Cancer Res., 1991, V. 51, p. 5245-5252.

59. Hymowitz S.G., O'Connell M. P. et al. A unique zinc-binding site revealed by a high-resolution X-ray structure of homotrimeric Apo2L/TRAIL // Biochemistry, 2000, V. 39(4), p. 633-640.

60. Hymowitz S.G., Christinger H.W., Fuh G., Ultsch M., O'Connell M., Kelley R. F., Ashkenazi A., de Vos A. M. Triggering cell death: the crystal structure of Apo2L/TRAIL in a complex with death receptor 5 // Mol. Cell., 1999, V. 4, p. 563-571.

61. Inch W.R., McCredie J.A., Sutherland R.M. Growth of nodular carcinomas in rodents compared with multi-cell spheroids in tissue culture // Growth, 1970, V. 34, p. 271-82.

62. Irmler M., Thome M., Hahne M., Schneider P., Hofmann K., Steiner V., Bodmer J. L., Schroter M., Burns K., Mattmann C., Rimoldi D., French L. E., Tschopp J. Inhibition of death receptor signals by cellular FLIP // Nature, 1997, V. 388, p. 190-195.

63. Ishimura N., Isomoto H., Bronk S. F., Gores G. J. Trail induces cell migration and invasion in apoptosis-resistant cholangiocarcinoma cells // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 2006, V. 290, p. 129-136.

64. Johnstone R.W., Frew A.J. et al. The TRAIL apoptotic pathway in cancer onset, progression and therapy // Nat. Rev. Cancer, 2008, V. 8(10), p. 782798.

65. Kaaijk P., Troost D., de Boer O.J. et al. Daunorubicin and doxorubicin but not BCNU have deleterious effects on organotypic multicellular spheroids of gliomas // Br. J. Cancer, 1996, V. 74, p. 187-93.

66. Kataoka S., Naito M., Fujita N. et al. Control of apoptosis and growth of malignant T lymphoma cells by lymph node stromal cells // Exp. Cell Res., 1993, V. 207, p. 271-6.

67. Kayagaki N., Yamaguchi N. et al. Expression and function of TNF-related apoptosis-inducing ligand on murine activated NK cells // J. Immunol., 1999, V. 163(4), p. 1906-1913.

68. Kerr DJ, Wheldon TE, Kerr AM, et al. In vitro chemosensitivity testing using the multicellular tumor spheroid model // Cancer Drug Deliv., 1987, V. 4, p. 63-74.

69. Kerr D.J., Wheldon T.E., Hydns S. et al. Cytotoxic drug penetration studies in multicellular tumour spheroids // Xenobiotica, 1988, V. 18, p. 641-8.

70. Kim K.M., Lee Y.J. Amiloride augments TRAIL-induced apoptotic death by inhibiting phosphorylation of kinases and phosphatases associated with the P13K-Akt pathway // Oncogene, 2005, V. 24, p. 355-366.

71. Kim S.H., Kim K. et al. Death induction by recombinant native TRAIL and its prevention by a caspase 9 inhibitor in primary human esophageal epithelial cells // J. Biol. Chem., 2004, V. 279(38), p. 40044-40052.

72. Kim K., Fisher M. J. et al. Molecular determinants of response to TRAIL in killing of normal and cancer cells // Clin. Cancer Res., 2000, V. 6(2), p. 335-346.

73. Kim J.W., Ho W.J., Wu B.M. The role of the 3D environment in hypoxia-induced drug and apoptosis resistance // Anticancer Res., 2011, V. 31, p. 3237-3245

74. Khanbolooki S., Nawrocki S. T. et al. Nuclear factor-kappaB maintains TRAIL resistance in human pancreatic cancer cells // Mol. Cancer Ther., 2006, V. 5(9), p. 2251-2260.

75. Kobayashi H., Man S., Kapitain S.J., Teicher B.A. and Kerbel R.S. Acquired multicellular resistance to alkylating agents in cancer // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, V. 199390, p. 3294-3298

76. Lagneaux L., Gillet N., Stamatopoulos B., Delforge A., Dejeneffe M.,

77. Lawrence D., Shahrokh Z., et al. Differential hepatocyte toxicity of recombinant Apo2L/TRAIL versions // Nat. Med., 2001, V. 7(4), p. 383-385.

78. Levine A.J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division // Cell, 1997, V. 88, p. 323-331.

79. Ley R., Ewings K.E., Hadfield K., Cook S.J. Regulatory phosphorylation of Bim: sorting out the ERK from the JNK // Cell Death Differ., 2005, V. 12(8), p. 1008-14.

80. Li L., Thomas R. M., Suzuki H., De Brabander J. K., Wang X., Harran P. G. A small molecule Smac mimic potentiates TRAIL- and TNFalpha-mediated cell death // Science, 2004, V. 305, p. 1471-1474.

81. Luo J.L., Maeda S., Hsu L. C., Yagita H., Karin M. Inhibition of NF-kappaB in cancer cells converts inflammation- induced tumor growth mediated by TNFalpha to TRAIL-mediated tumor regression // Cancer Cell., 2004, V. 6, p. 297-305.

82. Luo C., MacPhail S.H., Dougherty G.J. et al. Radiation response of connexin43-transfected cells in relation to the 'contact effect' // Exp. Cell Res., 1997, V. 234, p. 225-32.

83. MacFarlane M., Inoue S., Kohlhaas S. L., Majid A., Harper N., Kennedy D. B., Dyer M. J., Cohen G. M. Chronic lymphocytic leukemic cells exhibit apoptotic signaling via TRAIL-R1 // Cell Death Differ., 2005, V. 12, p. 773-782.

84. Manning B.D., Cantley L.C. AKT/PKB signaling: navigating downstream // Cell. 2007, V. 129, p. 1261-1274.

85. Mattern J., Kallinowski F., Herfarth C. et al. Association of resistance-related protein expression with poor vascularization and low levels of oxygen in human rectal cancer // Int. J. Cancer., 1996, V. 67, p. 20-23.

86. Morales J.C., Ruiz-Magana M.J., Ruiz-Ruiz C. Regulation of the resistance to TRAIL-induced apoptosis in human primary T lymphocytes: role of NF-kappaB inhibition // Mol Immunol., 2007, V. 44, p. 2587-2597.

87. Morgan D.O. Principles of CDK regulation // Nature, 1995, p. 374, p. 131-134.

88. Morales J.C., Ruiz-Magana M.J. et al. Regulation of the resistance to TRAIL-induced apoptosis in human primary T lymphocytes: role of NF-kappaB inhibition // Mol. Immunol., 2007, V. 44(10), p. 2587-2597.

89. Murphy B.J., Laderoute K.R., Chin R.J. et al. Metallothionein IIA is up-regulated by hypoxia in human A431 squamous carcinoma cells // Cancer Res., 1994, V. 54, p. 5808-10.

90. Nakayama K. Mice lacking p27(Kipl) display increased body size, multiple organ hyperplasia, retinal dysplasia and pituitary tumors // Cell, 1996, V. 85, p. 707-720.

91. Nederman T., Carlsson J. Penetration and binding of vinblastine and 5-fluorouracil in cellular spheroids // Cancer Chemother. Pharmacol., 1984, V. 13, p. 131-135.

92. Nederman T., Carlsson J., Kuoppa K. Penetration of substances into tumour tissue. Model studies using saccharides, thymidine and thymidine-5%-triphosphate in cellular spheroids // Cancer Chemother. Pharmacol., 1988, V. 22, p. 21-25.

93. Nederman T., Carlsson J., Malmqvist M. Penetration of substances into tumor tissue a methodological study on cellular spheroids // In Vitro, 1981, V. 17, p. 290-298.

94. Nederman T. Effects of vinblastine and 5-fluorouracil on human glioma and thyroid cancer cell monolayers and spheroids // Cancer Res., 1984, V. 44, p. 254-258.

95. Nicolai H., Steinbach P., Knuechel-Clarke R. et al. Proliferation of tumor spheroids after shock-wave treatment // J. Cancer. Res. Clin. Oncol., 1994, V. 120, p. 438-41.

96. Ohtsuka T., Buchsbaum D., Oliver P., Makhija S., Kimberly R., Zhou T. Synergistic induction of tumor cell apoptosis by death receptor antibody and chemotherapy agent through JNK/p38 and mitochondrial death pathway // Oncogene, 2003, V.22, p.2034-2044.

97. Olive P.L., Banath J.P. Multicell spheroid response to drugs predicted with the comet assay // Cancer Res., 1997, V. 57, p. 5528-33.

98. Olive P.L., Banath J.P., Evans H.H. Cell killing and DNA damage by etoposide in Chinese hamster V79 monolayers and spheroids: influence of growth kinetics, growth environment and DNA packaging // Br. J. Cancer, 1993, V. 67, p. 522-30.

99. Olive P.L., Durand R.E., Banath J.P. et al. Etoposide sensitivity and topoisomerase II activity in Chinese hamster V79 monolayers and small spheroids // Int. J. Radiat. Biol., 1991, V. 60, p. 453-66.

100. Olive P.L., Durand R.E. Drug and radiation resistance in spheroids: cell contact and kinetics // Cancer Metastasis Rev., 1994, V. 13, p. 121-38.

101. Omura M., Torigoe S., Kubota N. SN-38, a metabolite of the camptothecin derivative CPT-11, potentiates the cytotoxic effect of radiation in human colon adenocarcinoma cells grown as spheroids // Radiother. Oncol., 1997, V. 43, p. 197-201.

102. Ovcharenko D., Kelnar K., Johnson C., Leng N., Brown D. Genome-scale microRNA and small interfering RNA screens identify small RNA modulators of TRAIL-induced apoptosis pathway // Cancer Res., 2007, V. 67, p. 10782-10788.

103. Ozoren N., Fisher M. J., et al. Homozygous deletion of the death receptor DR4 gene in a nasopharyngeal cancer cell line is associated with TRAIL resistance // Int. J. Oncol., 2000, V. 16(5), p. 917-925.

104. Pai S.I., Wu G.S. et al. Rare loss-of-function mutation of a death receptor gene in head and neck cancer // Cancer Res., 1998, V. 58(16), p. 35133518.

105. Pan G., O'Rourke K., et al. The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL // Science, 1997, V. 276(5309), p. 111-113

106. Panner A., James C. D., Berger M. S., Pieper R. O. mTOR controls FLIPS translation and TRAIL sensitivity in glioblastoma multiforme cells // Mol. Cell Biol., 2005, V. 25, p. 8809-8823.

107. Paulovich A.G., Toczyski D.P. and Hartwell L.H. When checkpoints fail //Cell, 1997, V. 88, p. 315-321.

108. Pe'er J., Shweiki D., Itin A. et al. Hypoxia-induced expression of vascular endothelial growth factor by retinal cells is a common factor in neovascularizing ocular diseases // Lab. Invest., 1995, V. 72, p. 638-45.

109. Petersen S.L., Wang L., Yalcin-Chin A., Li L., Peyton M., Minna J., Harran P., Wang X. Autocrine TNFalpha signaling renders human cancer cells susceptible to Smac-mimetic-induced apoptosis // Cancer Cell, 2007, V. 12, p. 445-456.

110. Phillips R.M., de la Cruz A., Traver R.D. et al. Increased activity and expression of NAD(P)H:quinone acceptor oxidoreductase in confluent cell cultures and within multicellular spheroids // Cancer Res., 1994, V. 54, p. 3766-71.

111. Pitti R.M., Marsters S.A. et al. Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family // J. Biol. Chem., 1996, V. 271(22), p. 12687-12690.

112. Polyak K., Lee M.H., Erdjument-Bromage H., Koff A., Roberts J.M., Tempst P., Massague J. Cloning of p27Kipl, a cyclin-dependent kinase inhibitorand a potential mediator of extracellular antimitogenic signals // Cell, August 1994, V. 78(1), p. 59-66.

113. Raff M.C. Social controls on cell survival and cell death // Nature, 1992, V. 356, p. 397-400.

114. Ravi R., Bedi G. C., Engstrom L. W., Zeng Q., Mookerjee B., Gelinas

115. C., Fuchs E. J., Bedi A. Regulation of death receptor expression and TRAIL/Apo2L-induced apoptosis by NF-kappaB // Nat. Cell Biol., 2001, V. 3, p. 409-416.

116. Ray S., Almasan A. Apoptosis induction in prostate cancer cells and xenografts by combined treatment with Apo2 ligand/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand and CPT-11 // Cancer Res., 2003, V. 63, p. 4713-4723.

117. Reddy N.M., Lange C.S. Serum, trypsin, and cell shape but not cell-to-cell contact influence the X-ray sensitivity of Chinese hamster V79 cells in monolayers and in spheroids // Radiat Res., 1991, V. 127, p. 30-35.

118. Ricci M.S., Jin Z., Dews M., Yu D., Thomas-Tikhonenko A., Dicker

119. D. T., El-Deiry W. S. Direct repression of FLIP expression by c-myc is a major determinant of TRAIL sensitivity // Mol. Cell Biol., 2004, V. 24, p. 8541-8555.

120. Richards E.H., Hickey E., Weber L. and Master J.R. Effect ofoverexpression of the small heat shock protein HSP27 on the heat and drugsensitivities of human testis tumor cells // Cancer Res., 1996, V. 56, p. 2446-2451.no

121. Rokhlin O.W., Taghiyev A.F., Guseva N.V., Glover R.A., Chumakov P.M., Kravchenko J.E., Cohen M.B. Androgen regulates apoptosis induced by TNFR family ligands via multiple signaling pathways in LNCaP // Oncogene, 2005? V. 24(45), p. 6773-6784.

122. Rosato R.R., Dai Y., Almenara J.A., Maggio S.C., Grant S. Potent antileukemic interactions between flavopiridol and TRAIL/Apo2L involve flavopiridol-mediated XIAP downregulation // Leukemia, 2004, V. 18, p. 17801788.

123. Rottmann S., Wang Y., Nasoff M., Deveraux Q. L., Quon K. C. A TRAIL receptor-dependent synthetic lethal relationship between MYC activation and GSK3beta/FBW7 loss of function // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2005, V. 102, p. 15195-15200.

124. Roue G., Perez-Galan P., Lopez-Guerra M., Villamor N., Campo E., Colomer D. Selective inhibition of IkappaB kinase sensitizes mantle cell lymphoma B cells to TRAIL by decreasing cellular FLIP level // J. Immunol., 2007, V. 178, p. 1923-1930.

125. Safa A.R., Day T.W., Wu C.H. Cellular FLICE-like inhibitory protein (C-FLIP): a novel target for cancer therapy // Curr. Cancer Drug Targets, 2008, V. 8, p. 37-46.

126. Sakata K., Kwok T.T., Murphy B.J. et al. Hypoxia-induced drug resistance: comparison to P-glycoprotein-associated drug resistance // Br. J. Cancer, 1991, V. 64, p. 809-14.

127. Saotome K., Morita H., Umeda M. Cytotoxicity test with simplified crystal violet staining method using microtitre plates and its application to injection drugs // Toxicol. In Vitro, 1989, V. 3, p. 317-321.

128. Schneider P., Thome M., Burns K., Bodmer J. L., Hofmann K., Kataoka T., Holler N., Tschopp J. TRAIL receptors 1 (DR4) and 2 (DR5) signal FADD-dependent apoptosis and activate NF-kappaB // Immunity, 1997, V. 7, p. 831-836.

129. Shankar S., Chen X., Srivastava R. K. Effects of sequential treatments with chemotherapeutic drugs followed by TRAIL on prostate cancer in vitro and in vivo // Prostate, 2005, V. 62, p. 165-186.

130. Sherr C.J. and Roberts J.M. Inhibitors of mammalians G1 cyclin-dependent kinases // Genes Dev., 1995, V. 9, p. 1149-1163.

131. Shin M.S., Kim H.S. et al. Mutations of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor 1 (TRAIL-R1) and receptor 2 (TRAIL-R2) genes in metastatic breast cancers // Cancer Res., 2001, V. 61(13), p. 4942-4946.

132. Shweiki D., Neeman M., Itin A. et al. Induction of vascular endothelial growth factor expression by hypoxia and by glucose deficiency in multicell spheroids: implications for tumor angiogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, V. 92, p. 768-72.

133. Siegmund D., Klose S., Zhou D., Baumann B., Roder C., Kalthoff H., Wajant H., Trauzold A. Role of caspases in CD95L- and TRAIL-induced non-apoptotic signalling in pancreatic tumour cells // Cell Signal., 2007, V. 19, p. 1172-1184.

134. Skladanowski A., Plisov S.Y., Konopa J. et al. Inhibition of DNA topoisomerase II by imidazoacridinones, new antineoplastic agents with strong activity against solid tumors // Mol. Pharmacol., 1996, Y. 49, p. 772-80.

135. Solovieva M.E., Solovyev V.V., Kudryavtsev A.A., Trizna Y.A., Akatov V.S. Vitamin B12b enhances the cytotoxicity of dithiothreitol // Free Radic. Biol. Med., 2008, V. 44(10), p. 1846-56.

136. Song J.J., Lee Y. J. Differential cleavage of Mstl by caspase-7/-3 is responsible for TRAIL-induced activation of the MAPK superfamily // Cell Signal., 2008, V. 20, p. 892-906.

137. St Croix B., Rak J.W., Kapitain S. et al. Reversal by hyaluronidase of adhesion-dependent multicellular drug resistance in mammary carcinoma cells // J. Natl. Cancer Inst., 1996, V. 88, p. 1285-96.

138. St Croix B., Kerbel R.S. Cell adhesion and drug resistance in cancer // Curr Opin. Oncol., 1997, V. 9, p. 549-56.

139. St Croix B.S., Florenes V.A., Rak J.W., Flanangan M., Bhattacharya N., Slingerland J.M. and Kerbel R.S. Impact of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27Kipl on resistance of tumor cells to anticancer agents // Nature Med., 1996, V. 2, p. 1204-1210.

140. Sutherland R.M., Sordat B., Bamat J. et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma // Cancer Res., 1986, V. 46, p. 5320-9.

141. Suzuki K., Hiroaki H., Kohda D., Tanaka T. An isoleucine zipper peptide forms a native-like triple stranded coiled coil in solution // Protein Eng., 1998, V. 11(11), p. 1051-1055.

142. Takeda K., Hayakawa Y., et al. Involvement of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in surveillance of tumor metastasis by liver natural killer cells //Nat. Med., 2001, V. 7(1), p. 94-100.

143. Vanoosten R.L., Moore J.M., Ludwig A.T., Griffith T.S. Depsipeptide (FR901228) enhances the cytotoxic activity of TRAIL by redistributing TRAIL receptor to membrane lipid rafts // Mol. Ther., 2005, V. 11, p. 542-552.

144. Vaux D.L., Silke J. IAPs, RINGs and ubiquitylation // Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2005, V. 6, p. 287-297.

145. Vogler M., Durr K., Jovanovic M., Debatin K. M., Fulda S. Regulation of TRAIL-induced apoptosis by XIAP in pancreatic carcinoma cells // Oncogene, 2007, V. 26, p. 248-257.

146. Vucic D., Fairbrother W.J. The inhibitor of apoptosis proteins as therapeutic targets in cancer // Clin. Cancer Res., 2007, V. 13, p. 5995-6000.

147. Wagner K.W., Punnoose E.A. et al. Death-receptor O-glycosylation controls tumor-cell sensitivity to the proapoptotic ligand Apo2L/TRAIL // Nat. Med., 2007, V. 13(9), p. 1070-1077.

148. Wajant H. Targeting the FLICE Inhibitory Protein (FLIP) in cancer therapy // Mol. Interv., 2003, V. 3, p. 124-127.

149. Walczak H., Degli-Esposti M. A. et al. TRAIL-R2: a novel apoptosis-mediating receptor for TRAIL // EMBO J., 1997, V. 16(17), p. 53865397.

150. Waleh N.S., Brody M.D., Knapp M.A. et al. Mapping of the vascular endothelial growth factor-producing hypoxic cells in multicellular tumor spheroids using a hypoxia-specific marker // Cancer Res., 1995, V. 55, p. 6222-6226.

151. Wang S. The promise of cancer therapeutics targeting the TNF-related apoptosis-inducing ligand and TRAIL receptor pathway // Oncogene, 2008, V. 27(48), p. 6207-6215.

152. Wang Y., Engels I.H., Knee D. A., Nasoff M., Deveraux Q. L., Quon K. C. Synthetic lethal targeting of MYC by activation of the DR5 death receptor pathway // Cancer Cell, 2004, V. 5, p. 501-512.

153. Watanabe M., Suzuki K., Kodama S. et al. Normal human cells at confluence get heat resistance by efficient accumulation of hsp72 in nucleus // Carcinogenesis, 1995, V. 16, p. 2373-80.

154. Weinberg R.A. E2F and cell proliferation: a world turned upside down Cell, 1996, V. 85, p. 457-459.

155. West C.M., Moore J.V. Flow cytometric analysis of intracellular hematoporphyrin derivative in human tumor cells and multicellular spheroids // Photochem. Photobiol., 1989, V. 50, p. 665-669.

156. Wigle J.C., Sutherland R.M. Increased thermoresistance developed during growth of small multicellular spheroids // J. Cell Physiol., 1985, V. 122, p. 281-9.

157. Wiley S.R., Schooley K. et al. Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis // Immunity, 1995, V. 3(6), p. 673-682.

158. Yuhas J.M., Li A.P., Martinez A.O. et al. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids // Cancer Res., 1977, V. 37, p. 3639-3643.

159. Zambon A.C. Use of the Ki67 promoter to label cell cycle entry in living cells // Cytometry A, 2010, V. 77, p. 564-70.

160. Zauli G., Sancilio S., Cataldi A., Sabatini N., Bosco D., Di Pietro R. PI-3K/Akt and NF-kappaB/IkappaBalpha pathways are activated in Jurkat T cells in response to TRAIL treatment // J. Cell Physiol., 2005, V. 202, p. 900-911.

161. Zhang H.G., Wang J., Yang X., Hsu H. C., Mountz J.D. Regulation of apoptosis proteins in cancer cells by ubiquitin // Oncogene, 2004, V. 23, p. 20092015.

162. Zhang X.D., Borrow J.M., Zhang X.Y., Nguyen T., Hersey P. Activation of ERK1/2 protects melanoma cells from TRAIL-induced apoptosis by inhibiting Smac/DIABLO release from mitochondria // Oncogene, 2003, V. 22, p. 2869-2881.

Информация о работе

Фадеев, Роман Сергеевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2012
ВАК 03.01.02

Диссертация

Резистентность опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы