Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Репрограммирование клеток дермальной папиллы волосяного фолликула человека до плюрипотентного состояния

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Репрограммирование клеток дермальной папиллы волосяного фолликула человека до плюрипотентного состояния"

На правах рукописи

МУЧКАЕВА Ирина Алексеевна

РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ КЛЕТОК ДЕРМАЛЬНОЙ ПАПИЛЛЫ ВОЛОСЯНОГО ФОЛЛИКУЛА ЧЕЛОВЕКА ДО ПЛЮРИПОТЕНТНОГО

СОСТОЯНИЯ

Специальность 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

автореферат 2 8 НОЯ 2013

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2013

005540165

005540165

Работа выполнена в лаборатории проблем клеточной пролиферации ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук,

ВАСИЛЬЕВ Андрей Валентинович ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

ЛАГАРЬКОВА Мария Андреевна ФГБУН Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук место работы, зав. лабораторией генетических основ клеточных технологий

кандидат биологических наук

РУБИНА Ксения Андреевна

МГУ им. М.В. Ломоносова, ст.н.с. лаборатории

адаптационной медицины

Ведущая организация: ФГБУ Научно-исследовательский институт

морфологии человека Российской академии медицинских наук

Защита состоится «17» декабря 2013 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119234, г. Москва, ул. Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет МГУ, ауд. М-1. Факс: 8(495)939-17-46; e-mail: dis_kalsov@mail.ru

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «*^">> ноября 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета^ /

кандидат биологических наук ¡¿_______E.H. Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) является актуальным направлением исследований в области клеточной биологии и регенеративной медицины. Проблема плюрипотентных клеток тесно связана с пониманием механизмов индивидуального развития и регенерации тканей. Получение новых линий иПСК из разных источников открывает широкие возможности использования их в фундаментальных и прикладных медико-биологических исследованиях. Линии иПСК могут быть использованы при моделировании многих заболеваний и тестировании новых лекарственных средств. Эффективность образования иПСК очень низка, поэтому в настоящее время идет поиск таких типов клеток, которые могут быть репрограммированы более эффективно, а полученные иПСК будут обладать способностью дифференцироваться в заданном направлении. Опубликовано большое количество работ, посвященных поиску новых типов клеток, которые можно использовать для репрограммирования. К моменту начала нашего исследования, нам не были известны опубликованные работы по репрограммированию клеток дермальной папиллы (ДП) волосяного фолликула человека. Клетки ДП являются уникальным объектом исследований. Они играют ведущую роль в формировании волосяного фолликула и регуляции цикла его роста, а также являются резервуаром мультипотентных стволовых клеток. Мы посчитали интересным использовать клетки ДП в качестве альтернативного источника иПСК. Принимая во внимание мультипотентный статус клеток ДП, мы предположили, что эффективность репрограммирования клеток ДП, в одних и тех же условиях, будет выше, чем эффективность репрограммирования классического объекта — дермальных фибробластов. Для увеличения эффективности репрограммирования мы культивировали клетки в присутствии ингибитора гистоновых деацетилаз - вальпроевой кислоты (Medvedev et al ., 2011) в условиях физиологического уровня (5%) содержания кислорода (Warren et al., 2010).

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в получении иПСК из клеток ДП фолосяного фолликула человека. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

• Репрограммировать клетки ДП человека посредством трансфекции генами транскрипционных факторов Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус. Выделить репрограммированные до плюрипотентного состояния клоны иПСК - ДП.

• Исследовать недифференцированный статус полученных иПСК - ДП.

• Проверить плюрипотентный статус иПСК - ДП in vitro и подобрать условия для направленной дифференцировки иПСК - ДП.

• Проверить плюрипотентный статус полученных иПСК - ДП в экспериментах in vivo.

Научная новизна и практическая значимость работы. В работе впервые показана возможность получения иПСК из клеток дермальной папиллы (ДП) волосяного фолликула человека при использовании лентивирусной доставки транскрипционных факторов - Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус в присутствии ингибитора гистоновых деацетилаз — вальпроевой кислоты при инкубации в условиях физиологического содержания кислорода (5%). Было определено, что эффективность репрограммирования при использовании данного подхода для клеток ДП составила 0,03%, тогда как в работе Higgins и сотр. (Higgins et. al., 2012) по данной тематике эффективность составляла 0,02%. В работе впервые применен метод селекции репрограммированных клеток из культуры ДП человека, основанный на прижизненном иммуномечении против поверхностного антигена ПСК - Тга-1-60. С помощью различных методов охарактеризован плюрипотентный статус полученных иПСК - ДП. Впервые разработаны протоколы направленной дифференцировки иПСК — ДП. Показано, что полученные нами иПСК - ДП обладают способностью дифференцироваться in vitro в нейро-, остео- и гепатоцитарном направлении. Было выяснено, что полученная нами культура иПСК — ДП обладает большим потенциалом к дифференцировке в гепатоцитарном направлении, чем иПСК, полученные из фибробластов. Полученные данные свидетельствуют о преспективности использования иПСК — ДП для решения возможных медицинских задач, в том числе для тестирования лекарственных средств. Результаты, полученные в данном исследовании, могут быть полезны для оптимизации протоколов дифференцировки плюрипотентных клеток и для понимания механизмов, работающих в раннем развитии.

Апробация рботы. Результаты диссертационной работы были представлены на конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2010, 2011, 2012 гг.); на международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 24 мая 2012); на международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2013» (Москва, 8-13 апреля 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 1 патент на изобретение, статей в журналах, соответствующих перечню ВАК - 3, тезисов докладов и материалов конференций - 6.

Личное участие автора. Работа выполнена непосредственно автором. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных результатов.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 118 страницах, содержит 18 рисунков, 5 таблиц и состоит из следующих разделов: ведения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 141 цитируемый источник.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клеточные культуры. В работе были использованы следующие культуры клеток: линия фибробластов кожи взрослого человека, иммортализовнная с помощью лентивирусной конструкции, содержащей ген каталитического компонента теломеразы человека hTERT (pLA-CMV-hTERT) - 1608ИТ была любезно предоставлены Е.Е. Егоровым (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарда РАН); первичные культуры клеток ДП волосяного фолликула человека; эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) человека линии hESM05, любезно предоставленные М.А. Лагарьковой (Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН); первичная культура эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ).

Получение клонов иПСК - ДП и иПСК - 1608hT и их культивирование. 0,5 млн. клеток ДП на третьем пассаже или 1608hT в чашке Петри диаметром 60 мм инфицировали ночь лентивирусными векторами, кодирующими гены плюрипотентного состояния клеток ОСТ4, SOX2, KLF4, c-MYC при MOI = 5 в среде для культивирования клеток ДП и 1608hT соответственно при 37°С в атмосфере 5% С02 и 5%02. Смену среды производили через день при добавлении к ней химических соединений, увеличивающих эффективность репрограммирования, 2мМ вальпроевой (Sigma) и 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты (Sigma). Через 7 дней среду заменяли на среду для плюрипотентных стволовых клеток mTeSR™ 1 (STEMCELL Technologies). Среду меняли каждый день. Пересевы клеток на первых пассажах производили механически на митотически неактивные МЭФ до начала контактирования между собой колоний, а затем на пластик, покрытый матригелем (BD Biosciences). Первый пересев клеток производили на чашку Петри диаметром 100 мм и отменяли упомянутые выше добавки. Через 2-3 недели после пассирования, селектировали клоны иПСК по поверхностному маркеру плюрипотентных клеток (ПСК) - Тга-1-60 с помощью прижизненного иммуномечения и механическим отбором положительных клонов. Полученные иПСК растили в среде mTeSR™ 1 (STEMCELL Technologies) при 37°С в атмосфере 5% С02 и 5%02. Криоконсервацию производили в среде mFreSR® (STEMCELL Technologies), хранение осуществляли в парах жидкого азота при температуре — 196°С.

Проверку наличия теломеразы в клетках проводили с помощью TRAPEZE® XL Telomerase Detection Kit (Millipore). Для иммуноцитохимического анализа окрашенные флуоресцентной меткой препараты исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus 1X51 (Olympus). Проточную цитофлуориметрию осуществляли с помощью проточного цитофлуориметра Cell Lab Quanta™ SC (Beckman Coulter). Выявление активности щелочной фосфатазы проводили с помощью набора NBT/BCID (Roche). Тотальную РНК выделяли с помощью Quick-RNA™ MiniPrep (Zymo Research). ОТ-ПЦР-реакция проводилась с помощью амплификатора фирмы Bio-Rad. Для проведения ПЦР в реальном времени амплификация проводилась согласно следующей программе: 95°С - 10 мин, далее 40 циклов, состоящих из двух этапов 95°С - 15 сек, 60°С - 1

мин. с помощью прибора «7500 Real-Time PCR System» (Applied Biosystems). Эмбриоидные тельца получали в висячей капле и растили в суспензии без прикрепления клеток к пластику в Ultra Low Adhesion Plates (Corning). Иммуногистохимические препараты исследовали с помощью Keyence BZ-9000E (Кеуепсе). Для теста на тератомообразование использовали иммунодифицитных мышей линии Nude.

Направленная дифференцировка иПСК in vitro. Для диффренцировки использовали как кусочки эмбриоидных телец, так и недифференцированные клетки (кластеры, занимающие 10 — 20% от площади культуральной чашки). Подлинность дифференцировок подтверждалась иммуноцитохимически. Для индукции остеогенной дифференцировки клекти культивировали в среде DMEM/F12 с пониженным содержанием глюкозы (ПанЭко) с добавлением 10% FBS (Gibco), 2мМ глутамина (ПанЭко), 0,1 ¡iM дексаметазона (Sigma-Aldrich), 10 mM ß-глицерофосфата (Sigma-Aldrich), 50 |iM аскорбат-2-фосфата 50ЕД/мл пенициллина/50 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко). Остеогенез детектировали выявлением остеонектина и остеопонтина. Дифференцировку клеток в гепатоцитарном направлении проводили в индукционной среде, содержащей DMEM/F12 (Gibco), 10% FBS (Gibco), 2мМ глутамин (ПанЭко), 10 нг/мл HGF (Invitrogen), 10 нг/мл EGF (PeproTech), 20 нг/мл ВМР2 (R&D), 0,03тМ никотинамид. В первые 2—3 дня для индукции развития энтодермальной программы при дифференцировки из клеток (а не из ЭТ) в среду был добавлен активин А (R&D) в концентрации 100 нг/мл. После отмены активина А в среду добавляли 30 нг/мл FGF4 (Invitrogen). По достижении клетками 80% от площади поверхности культуральной чашки отменяли FGF4 и ВМР2 и на 5-7 дней культивировали с 10 нг/мл онкостатином М (R&D) и 0,1 цМ дексаметазоном (Sigma-Aldrich). После пассирования в среду добавляли добавку IX В27 (Gibco) еще на 7-10 дней. Подлинность гепатоцитарной дифференцировки определяли по экспрессии Foxa2, HNF4a, а-фетопротеина (АФП), цитокератина18 (СК18), альбумина. Для индукции нейральной дифференцировки в среду DMEM/F12 (Gibco), 3% FBS (Gibco), IX NEAA (Gibco), IX GlutaMAX (Gibco), 50ЕД/мл пенициллин/ 50 мкг/мл стрептомицин (ПанЭко) на 7 дней был добавлен 20 нг/мл Noggin и 20 нг/мл FGF2. Затем клетки культивировали в присутствии IX В27 (Gibco), после 7 дней добавляли 10 нг/мл BDNF и 10 нг/мл NGFß и продолжали культивировать еще 7-14 дней. С помощью ИЦХ определяли экспрессию маркеров глии (GFAP, CNPase) и клеток нейронального ряда (Proxl, нестин, даблкортин, р III тубулин, NSE, ТН).

Статистическая обработка данных. Статистическая обработка результатов проводилась в программе MS Excel. При обработке результатов оценивали значение средней величины, стандартное отклонение. При оценке достоверности различий показателей использовали t-критерий Стьюдента. Различия считали статистически достоверными, если уровень значимости был р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

По многим морфологическим и метаболитическим критериям иПСК подобны ЭСК. В работе мы сравнивали полученные иПСК с эталоном плюрипотентности -линией ЭСК.

Инфицирование, выделение и культивирование иПСК.

Репрограммирование связано с изменением судьбы клеток, которое на начальных этапах сопровождается изменениями размера, формы, организации цитоскелета и рецепторов. Определением того, что в трансфицированных клетках начался процесс репрограммирования, может служить появление клеток, визуально отличающихся от исходной культуры. На 8-е сутки после лентивирусной трансфекции культуры клеток ДП мы наблюдали появление первых колоний клеток с измененной морфологией (Рис. 1), что говорит о мезенхимо-эпителиальном переходе, который является одной из характеристик репрограммирования (1л й а1., 2010). Со временем колонии увеличивались в размерах и образовывались новые. Практически все колонии имели ЭСК-подобную морфологию и четкие очертания. По морфологическим характеристикам полученные нами клоны практически не отличались между собой. Клетки, образующие колонии, подобно ЭСК, характеризовались высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением (Рис. 1).

Рис. 1. Получение первых клонов репрограммированных клеток. Морфология: (а) исходной культуры ДП человека; (б) репрограммированных клеток ДП на 8 сут после инфицирования; (в) репрограммированных клеток ДП на 11 сут после инфицирования; (г) исходной культуры 1608ЬТ; (д) репрограммированных клеток ДП на 10 сут после инфицирования; (е) репрограммированных клеток ДП на 17 сут после инфицирования. Масштабный отрезок 200 мкм.

Следующей задачей было отделение полностью репрограммированных клонов от частично репрограммированных. Для упрощения работы при отделении полностью репрограммированных иПСК на 21-ые сутки после инфицирования мы провели прижизненное иммуномечение против поверхностного антигена Тга-1-60, который является одним из маркеров плюрипотентных клеток (УеЬегке1 а!., 2011), после чего механически отобрали Тга-1-60 + колонии. Исходя из того, что репрограммирование до плюрипотентного состояния является многоступенчатым процессом, окрашивание по Тга-1-60 было выбрано нами потому, что при приобретении клетками плюрипотентного статуса экспрессия этого маркера появляется на более поздних стадиях репрограммирования.

Подтверждение недифференцированного состояния полученных иПСК. Щелочная фосфатаза, маркер плюрипотентных и стволовых клеток, экспрессируется в интактных клетках ДП и является индикатором индукционной способности дермальной папиллы. На 6-ом пассаже (3 пассажа до инфицирования «коктейлем Яманаки» +3 пассажа после инфицирования) мы детектировали в выделенном клоне иПСК — ДП экспрессию щелочной фосфатазы (Рис. 26, 2г), в то время как в исходной культуре ДП (Рис. 2а) на таком же пассаже этот фермент экспрессировали единичные клетки. В иПСК, полученных из дермальных фибробластов, щелочная фосфатаза также детектировалась (Рис. 2в, 2д).

Выделенные колонии были положительны по щелочной фосфатазе и при длительном культивировании (Рис. 2г, Рис. 2д) мы детектировали в иПСК данный фермент. Затем, с помощью иммуноцитохимического окрашивания было выяснено, что исследуемые колонии репрограммированных клеток экспрессировали транскрипционные факторы плюрипотентности: ОСТ4, БОХ2, ТЧАЫОО (Рис. За), а также поверхностные антигены ББЕА-З, 88ЕА-4, Тга-1-60, Тга-1-81 (Рис. 36). Для дальнейшей работы мы выбрали по одному клону иПСК, полученному из клеток ДП и 1608ЬТ, обозначив их как иПСК — ДП и иПСК -1608ЬТ соответственно.

Рис. 2. Окрашивание на субстрат щелочной фосфатазы. (а)

материнские клетки ДП (пассаж 6), (б) иПСК- ДП (пассаж 6), (в) иПСК - 1608ЬТ (пассаж 6), (г) иПСК -ДП (пассаж 12), (д) иПСК- 1608ЬТ (пассаж 12); (г, д) фотографии Зсм. чашки Петри.

Рис. 3. Иммунофлуоресцентное окрашивание иПСК- ДП (слева) и иПСК- 1608ИТ (справа) против (а) Ос14, 8ох2, №по§, и (б) ЗБЕАЗ, 85ЕА4, Тга-1-60, Тга-1-81. Ядра клеток докрашены БАР! (синий). Масштабный отрезок 200 мкм.

III 1 III I .11

01 «ч «4КК-ДП *ПСШ*н К* а/1 »4 шпсл-п иГС*-*ч

Уроииь »спрмгии

Уровень >«с.ч>»сг<л» КМ

¡Н ..I

Фромме. мгпр«ссин Е801

У|>ОЯ*и» (кспрксми 0"РА1 Уришяь квлртиш ОНМТЗ

«Г: ■ |! ■ «| • .

1..!-■ : I.. Ь I..

Рис. 6. Результаты ПЦР в реальном времени уровней экспрессии генов ОСТ4, 50X2, АШОв. ТЕЯТ. К1Р4. Ш28,ОРРА4. ОМАШ для клеток ДП. 16081тТ (ФЧ). иПСК - ДП.

ЭТ нестин десмин АФП

Рис. 7. Иммунофлуоресцентное окрашивание криосрезов эмбриоидных телец (ЭТ). В ЭТ из всех трех источников ПСК выявляются маркеры эктодермы (нестин), мезодермы (десмин), энтодермы (АФП).Ядра докрашены ОАР1 (синий). Масштабный отрезок 200

:.гг- ' -г м ■ ( .1 • ' * 1, ят'к 3

•л' й, В ' - . , . 1 • » " * * » Г . ••'■¿■и • ЧШй . ш

' ; . ГШ Д ш* * 1 -я . * Чл ■ в 4 * .

Рис. 8. (а, в, д, ж, и) Дифференцировка иПСК- ДП и (б, г, е, з, к) иПСК- 1608ИТ в гепатоцитарном направлении. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток антителами против (а, б) Роха2, (в, г) РГЫР4а, (д, е) АФП, (ж, з) СК18, (и, к) альбумина. Ядра докрашены ОАР1 (синий). Масштабный отрезок 200 мкм.

Рис. 9. Дифференцировка иПСК в остеогенном направлении. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток, дифференциронных из: иПСК- ДП против (а) остеопонтина и (б) остеонектина; иПСК- 1608ИТ против (в) остеопонтина и (г) остеонектина. Ядра докрашены ЭАР1 (синий).

Рис. 10. Дифференцировка иПСК - ДП в нейральном направлении. Ядра докрашены ОАР1 (синий). Масштабный отрезок 100 мкм.

Рис. 11. иПСК - 1608ЬТ после дифференцировки в нейральном направлении. Ядра докрашены ОАР1 (синий). Масштабный отрезок 200 мкм.

Рис. 12. Образование тератом из иПСК - ДП. Фотографии (а) реципиентной мыши спустя 6 нед. после введения иПСК - ДП (стрелкой указана тератома) и (б) вырезанной тератомы. Фотогрфии парафиновых срезов тератом, окрашенных: гематоксилином и эозином (в - г): (в) железистый эпителий, (г, д) нейроэктодерма (нейроэпителиальные трубочки и розетки указаны стрелками), (е) хрящевая ткань; антителами (ж - м) против: (ж) виментина, (з) нестина, (и) пан СК, (к) СК8, (л) СЮ 8, (м) АФП.

Однако данные иммуноцитохимического окрашивания не отражают количественной характеристики особенностей полученных нами клонов иПСК. Поэтому, для определения процентного содержания иПСК в культуре, экспрессирующих перечисленные выше поверхностные маркеры плюрипотентности, мы использовали метод проточной цитофлуориметрии. По 88ЕА4 практически все иПСК - ДП были положительны (99,24%), в то время как для 81,04% популяции иПСК- 1608ИТ экспрессировали этот антиген. Тга-1-60 экспрессировали 78,36% иПСК- ДП и 84,57% иПСК- 1608ЬТ. Тга-1-81 экспрессировали 67,39% иПСК- ДП и 86,03% иПСК- 1608ИТ. Больше половины популяции иПСК - ДП (54,72%) и 14,2% иПСК- 1608ЬТ были положительны по ББЕАЗ. Как видно из приведенных данных, при репрограммировании не все клетки клона начинают экспрессировать антиегены плюрипотентного статуса ББЕАЗ, 88ЕА4, Тга-1-60, Тга-1-81, однако, доля этих клеток велика (от 53 до 99%-ов). Результаты исследования показали, что отобранные нами репрограммированные иПСК экспрессируют БЗЕАЗ, 85ЕА4, Тга-1-60, Тга-1-81, которые практически не детектируются в материнских культурах ДП и фибробластов 1608ЬТ. Так как исходные клетки не экспрессируют рассматриваемые маркеры плюрипотентности, а полученные нами клоны иПСК положительны по ним, очевидно, что обе культуры иПСК подверглись репрограммированию.

Мы определили, что среднее время удвоения популяции клеток иПСК-ДП составило 25 часов, иПСК-1608ЬТ — 20 часов. Таким образом, полученные клоны иПСК показывали сходную с ЭСК кинетику роста (среднее время удвоения популяции ЭСК состовляло 25 часов).

Еще одним условием репрограммирования до плюрипотентного состояния является реактивация теломеразы в клетках. Известно, что в соматических клетках теломераза не активна, а при репрограммировании происходит ее реактивация. Теломераза обладает активностью обратной транскриптазы, удлиняющей теломерные участки клетки. С помощью ТИАР-ГИДР анализа мы выяснили (Рис. 4), что в полученных нами иПСК теломераза активна.

В материнской культуре ДП этот фермент не активен. Следовательно, в иПСК- ДП произошла реактивация теломеразы в процессе репрограммирования, подобно истинным иПСК. В дополнение мы проверили, что в материнской культуре фибробластов1608ИТ, иммортализованных геном каталитического компонента теломеразы, теломераза работает и в иПСК- 1608ИТ ее активность также детектируется (Рис. 4).

1 г 3 4 5 б 7

щ N * 1 Тсломерные Повторы ,,_ Внутренний контроль

^^ "-«Шь--^лль.ви., ||||'| иПи

Рис. 4. Реактивация теломеразы в иПСК. Теломераза активна в образцах на дорожках, в которых детектируются дополнительные полосы соответствующие теломерным повторам (1, 3, 6). Дорожкам соответствуют следующие образцы: (1, 5) - 1608ЬТ и ДП исходные культуры, (3, 6) - иПСК- 1608ЬТ и иПСК- ДП соответственно, (2, 4, 7) -1608ИТ, иПСК- 1608ЬТ, иПСК- ДП соответственно, прогретые до инактивации теломеразы, выступают в качестве контроля метода.

Используя ОТ-ПЦР анализ, мы обнаружили наличие в культурах иПСК транскриптов генов (Nanog, Ос14, 8ох2, Тс^П, ваЬгЬЗ, Esgl, Яех1, Брра4,

Сс10), которые работают в раннем развитии и являются генами - маркерами плюрипотентных клеток (Рис. 5).

В исходной культуре ДП транскрипты исследуемых генов не детектировались. В исходной культуре 160811Т они тоже практически не детектировались. Однако мы определили, что исходная культура 1608ИТ была положительна по (Рис. 5), в отличие от исходной культуры ДП,

отрицательной по всем исследуемым генам, в том числе и по Esgl. Известно, что Esgl экспрессируется в предимплантационном эмбрионе, терминальных стволовых клетках и ЭСК. Наличие транскриптов этого гена в клетках 1608ЬТ, скорее всего, указывает на активацию гена Esgl под действием ТЕЯТ.

Рис. 5. Экспрессия генов раннего развития (названия справа) по данным ОТ-ПЦР. Дорожкам соответствуют

следующие образцы: ДП (1), иПСК- ДП (2), 1608ЬТ (3), иПСК- 1608ЬТ (4), ЭСК (5). В качестве контроля количества матрицы был использован ген САРБН. Для контроля праймеров использовали

культуру ЭСК человека.

...........1 2 -3 4 .5 1

|

И1И1|1 1 1

ДгУ д ЯШ!рЙ# | | шквдар 1

' «Щ®«§ !

■мкг~. „ ■исзсг яаряй |

|

рИШШрМИМ»»«»^.1»!».....« ....... ЯЯВДВЙ 1 МЮОМв 1

Таким образом, можно заключить, что в полученных нами линиях иПСК (иПСК -ДП и иПСК - 1608ЬТ) произошли изменения работы генома, которые проявляются в появлении транскрипции генов Ос14, Бох2, Тс1§А, ОаЬгЬЗ, Еб£1, Яех1,

Fgf4, Брра4, GdfЗ, в отличие от материнских культур клеток ДП и 1608ЬТ, в которых мы практически не обнаруживали транскриптов исследуемых генов. Наличие положтельных сигналов в обоих клонах иПСК указывает на активацию перечисленных генов при репрограммировании.

Чтобы выявить индивидуальные особенности той или иной культуры, мы использовали метод ПЦР в реальном времени (Рис. 6).Мы сравнили уровни экспрессии исследуемых генов, ассоциированых с ранним развитием (Nanog, Ой4, 8ох2, ТеЛ, К1Г4, Ып28, Esgl, Брра4, Опт13). Несмотря на то, что нам удалось определить некоторые особенности исследуемых клеточных культур, уровни экспрессии практически всех исследуемых генов в полученных иПСК были сопоставимы с таковыми в ЭСК и отличались от профиля экспрессии по исследуемым генам от материнских клеток. Таким образом, с помощью метода количественного ПЦР мы показали, что полученные иПСК - ДП и иПСК — 1608ЬТ более походят друг на друга и ЭСК, и отличаются от не репрограммированных клеток ДП и 1608ИТ.

Следовательно, полученные нами репрограммированные клетки по проверенным характеристикам отвечают критериям недифференцированного статуса, и в то же время несколько отличаются между собой, но близки по свойствам к ЭСК больше, чем к исходным культурам клеток. Для дальнейшей характеристики нам необходимо было проверить дифференцировочный потенциал полученных иПСК.

Исследование дифференцировочного потенциала иПСК. Из иПСК нами были получены эмбриоидные тельца (ЭТ), которые в лабораторных условиях способны воспроизводить первые этапы эмбриогенеза (Рис. 7). Они представляют собой самоорганизующиеся округлые цистические агрегаты. В ЭТ из иПСК - ДП и иПСК - 1608ЬТ, подобно ЭТ, образованным из ЭСК, мы детектировали белки эктодермы (нестин), мезодермы (десмин) и энтодермы (АФП) (Рис. 7). Благодаря способности к дифференировке в лабораторных условиях ПСК могут быть использованы для изучения процессов раннего развития и направленной дифференцировки клеток в те или иные ткани. Мы подобрали условия для того, чтобы полученные иПСК давали начало производным экто - (нейро-дифференцировка), мезо - (остеогенная дифференцировка) и энтодермы (гепатоцитарная дифференцировка). Клетки культивировали в индукционных средах как описано в разделе «Материалы и методы».

Дифференцировку в гепатоциторном направлении (Рис. 8) проводили в течение 3-5 нед., после чего в иПСК - ДП появлялась экспрессия ядерных транскрипционных факторов Роха2 (маркер дефинитивной энтодермы) и 1ЖР4а (маркер экстра эмбрионльной энтодермы), которая не детектировалась после

дифференцировки иПСК - 1608ИТ. Однако мы наблюдали слабую экспрессию АФП, что, скорее всего, указывает на коммитирование в гепатобласт, в гепато — иПСК - 1608hT (Рис. 8е) и более выраженную — в культуре гепато — иПСК — ДП (Рис. 8д). Эпителиальный маркер СК18, характеризующий приобретение дифференцированного статуса, который предполагает гепато- спецификацию клеток, появлялся только в культуре гепато - иПСК — ДП (Рис. 8ж), а в клетках гепато - иПСК - 1608hT (Рис. 8з) экспрессия его не наблюдалась. Экспрессия альбумина, свойственная зрелым гепатоцитам была выражена сильнее в культуре гепато - иПСК - ДП (Рис. 8и), чем в культуре гепато - иПСК - 1608hT (Рис. 8к). Из приведенных данных можно сделать вывод, что культура иПСК - ДП обладает большим потенциалом к гепатоцитарной дифференцировке, чем иПСК - 1608hT.

Спустя 2 — 3 нед. после индукции остеогенной дифференцировки (Рис 9) мы детектировали в обеих культурах белки внеклеточного матрикса остеопонтина (Рис. 9а, 9в) и остеонектина (Рис. 96, 9г). Они являются марекерами остеобластов и принимают участие в минерализации кости.

Дифференцировку в нейальном направлении (Рис. 10, 11) проводили в течение 3 — 5 нед. С помощью иммуноцитохимического окрашивания, мы обнаружили, что обе культуры нейро- иПСК экспрессировали Proxl, который, возможно, играет фундаментальную роль в развитии ЦНС, принимая участие в регуляции экспрессии и развития постмитотических недифференцированных предшественников нейронов. Обе культуры были положительны по маркеру НСК нестину, и образовывали сплетения клеток с длинными отростками, положительными по маркерим незрелых нейронов даблкортину (DC) и р III тубулину и окрашивались на меркер зрелых нейронов нейрон-специфическую енолазу (NSE). Полученные после дифференцировки нейро — иПСК - ДП хоть и были положительны по маркеру дофаминергических нейронов ТН, однако, окрашивание было не столь специфическим, как в культуре нейро — иПСК — 1608hT (окрашивание клеток с длинными отростками). Спустя месяц после индукции дифференцировки мы также детектировали маркеры глиальных клеток CNPase и GFAP в нейро - иПСК - ДП и GFAP в культуре нейро - иПСК - 1608hT. В двух исследуемых культурах нами было замечено, что количество клеток, положительных по маркерам глии значительно меньше, чем по нейрональным маркерам, что, скорее всего, говорит о том, что используемый нами протокол дифференцировки в большей степени подходит для нейрональной дифференцировки, чем для глиальной. Таким образом, изменяя состав среды, можно исследовать процессы дифференцировки клеток.

Дифференцировка полученных иПСК /и vivo. Одним из достоверных тестов, доказывающих плюрипотентность клеток является их способность образовывать тератому после введения бестимусным мышам. Тератома представляет собой опухоль, состоящую из нескольких типов тканей, производного обычно трех основных зародышевых листков, присутствие которых

не свойственно тем органам или анатомическим областям организма, в которых развивается опухоль. Спустя 4-6 нед. на месте инъекции недифференцированных иПСК-ДП, как и иПСК-1608ЬТ, мы наблюдали образование тератом (Рис. 12а, 126). В каждой группе было по 4 бестимусных мыши. От каждого животного была получена опухоль. В полученных тератомах обнаруживались структуры экто-, мезо- и энтодермального происхождения. На гистологических препаратах выделялись обширные участки железистого эпителия (Рис. 12в). Железистые структуры занимали большую часть объема опухоли. Также на препаратах местами определяли хрящевую ткань (Рис. 12е), кроме того, обнаруживали примитивные нейроэктодермальные розетки и трубочки (Рис. 12в). Выявлялись участки незрелой нервной ткани, состоящие из мелких гиперхромных клеток с узким ободком цитоплазмы. С помощью иммуногистохимического окрашивания мы подтвердили подлинность получения тератом из иПСК - ДП, в препаратах выявлялись виментин-богатые участки, располагающиеся в тканях между протоками (Рис. 12ж). Нестин обнаруживался в структурах, напоминающих нейроэктодермальные розетки и трубочки (Рис. 12з). Мы наблюдали большое количество железистых структур, в которых определяли пан цитокератин, цитокератин 8, цитокератин 18 и альфафетопротеин (Рис. 12 и - м).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе мы получили и охарактеризовали иПСК из клеток дермальной папиллы (ДП) волосяного фолликула человека. Так как к моменту начала нашего исследования, опубликованных работ по репрограммированию клеток ДП человека не было, нам показалось интересным и перспективным для дальнейших исследований репрограммировать эти клетки до плюрипотентного состояния. Мы исследовали репрограммирование клеток ДП человека в сравнении с другим компонентом кожи - дермальными фибробластами, которые являются хорошо известным источником иПСК. В связи с экспрессией клетками ДП ряда транскрипционных факторов, необходимых для репрограммирования, мы предположили большую эффективность клеток ДП по сравнению с фибробластами. Таким образом, инфицируя дифференцированные клетки взрослого человека стандартным набором лентивирусных конструкций, кодирующих гены Ой4, Бох2, К1Г4 и с-Мус, при добавлении химического соединения - вальпроевой кислоты в условиях физиологичного уровня кислорода (5%) нам удалось изменить судьбу этих клеток. После селекции, используя различные подходы, описанные в разделе «Материалы и матоды», мы подтвердили плюрипотентный статус полученных клеток. Мы определили, что эффективность репрограммирования клеток ДП была = 0,03%, а фибробластов линии 160811Т ~ 0,01%. Таким образом, мы подтвердили наше предположение о предпочтительности использования клеток ДП в отличие от дермальных фибробластов для получения иПСК ввиду большей эффективности их

репрограммирования. В приорететной работе Higgins и сотр. (Higgins et. al., 2012) эффективность репрограммирования клеток ДП человека составила ~ 0,02%. Возможно, разница в 0,01% может быть связана с тем, что мы репрограммировали клетки в условиях 5% содержания кислорода и при добавлении на ранних этапах вальпроевой кислоты, тогда как Higgins и сотр. (Higgins et. al., 2012) - нет. Так как в литературе рассматривается спонтанная дифференцировка иПСК-ДП, нам показалось интересным разработать некоторые протоколы дифференцировки полученных клеток в заданном направлении, которые могут быть полезны для понимания механизмов развития и оптимизации протоколов дифференцировок ПСК. Оказалось, что полученная нами культура иПСК из ДП (иПСК - ДП) обладает более выраженным потенциалом к дифференцировке в гепатоцитарном направлении, чем иПСК, полученные из фибробластов. Таким образом, данный опыт может быть полезным при моделировании болезней печени. Из работы очевидно, что для возможных медицинских целей предпочтительнее использовать иПСК - ДП, чем иПСК - 1608hT. В заключение мы показали, что полученные нами иПСК - ДП обладают способностью к дифференцировке в клетки трех зародышевых листков in vivo и образуют тератому в бестимусном животном-реципиенте, в которой преобладают энтодермальные структуры железистого эпителия.

Выводы

1. При помощи трансфекции лентивирусными конструкциями, кодирующими гены репрограммирующих факторов Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус из клеток культуры дермальной папиллы (ДП) человека была получена культура индуцированных плюрипотентных стволовых клеток иПСК-ДП.

2. Впервые показано, что при добавлении вальпроевой кислоты в условиях физиологического уровня кислорода (5%) эффективность репрограммирования клеток ДП составила = 0,03%.

3. Полученные иПСК — ДП отвечают критериям плюрипотентности по морфо-функциональным характеристикам. Фенотип иПСК - ДП схож с фенотипом ЭСК и существенно отличается от фенотипа материнских клеток ДП.

4. Полученная культура иПСК-ДП обладает способностью к направленной дифференцировке в клетки трех зародышевых листков in vitro; в остеогенном, гепатоцитарном и нейральном направлениях.

5. иПСК-ДП способны дифференцироваться in vivo; давая начало тератоме, в которой преобладают структуры железистого эпителия.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи:

1. Дашинимаев Э.Б., Мучкаева И.А., Файзуллин P.P., Егоров Е.Е., Акимов С.С., Терских В.В., Васильев A.B., Кирпичников М.П. 2012. Индукция теломеразной активности увеличивает эффективность репрограммирования

фибробластов кожи человека. // Вестник Московского университета, серия 16: Биология.. №1. С. 8 - 14.

2. Мучкаева И.А., Дашинимаев Э.Б., Терских В.В., Суханов Ю.В., Васильев A.B. 2012. Молекулярные механизмы индуцированной плюрипотентности. // Акта Натура. Т. 4. № 1. С. 12-23.

3. Дашинимаев Э.Б., Чжан Мэн, Файзуллин P.P., Мучкаева И.А., Терских В.В., Суханов Ю.В., Васильев A.B., 2012. Индукция теломеразной активности вызванная введением синтезированной in vitro модифицированной мРНК гена hTERT. // Молекулярная медицина. №6. С.46 - 51.

Патент на изобретение

№ 2492233, заявка № 2012142244/10 от 04.10.2013. Дашинимаев Э.Б., Мучкаева И.А., Васильев A.B., Терских В.В., Вишнякова Х.С. Способ получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов с синдромом Дауна.

Тезисы конференций:

1. Мучкаева И.А. Экспериментальные подходы к репрограммированию соматических клеток в условиях in vitro. VI Конференция молодых ученых ИБР РАН, Москва. 16 - 17 декабря 2010. Онтогенез. 2011. Т. 42. № 5. С. 327 -328.

2. Мучкаева И.А. Репрограммирование стволовых клеток амниотической жидкости человека до плюрипотентного состояния. VII Конференция молодых ученых ИБР РАН, Москва. 12 - 13 декабря 2011. Онтогенез. 2012. Т. 43. №. 4. С. 241.

3. Мучкаева И.А., Дашинимаев Э.Б., Давыдова Д.А., Терских В.В., Васильев A.B. Получение иПСК из клеток амниотической жидкости человека. Международная конференция «Биология - наука XXI века», Москва. 24 мая 2012. Сборник тезисов конференции. С. 619.

4. Артюхов A.C., Мучкаева И.А., Дашинимаев Э.Б. Дифференцированные в нейральном направлении ИПС клетки с синдромом Дауна как модель болезни Альцгеймера. 55-ая Научная конференция МФТИ, Долгопрудный. 19 - 25 ноября 2012. Сборник тезисов конференции. С. 98 - 99.

5. Мучкаева И.А., Дашинимаев Э.Б., Артюхов A.C., Васильев A.B. Репрограммирование клеток дермальной папиллы человека до плюрипотентного состояния. VIII Школа-конференция молодых ученых, Москва. 29 - 30 ноября 2012. Онтогенез. 2013. Т. 44. № 4. С. 231 - 232.

6. Мучкаева И.А., Артюхов A.C., Дашинимаев Э.Б., Васильев A.B. Получение иПСК из клеток дермальной папиллы волосяного фолликула человека. Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2013», Москва. 8-13 апреля 2013. Сборник тезисов конференции. С. 15.

Заказ № 47-Р/11/2013 Подписано в печать 13.11.13 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; е-тай:info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мучкаева, Ирина Алексеевна, Москва

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Биологический факультет

04201365707 На правах рукописи

Мучкаева Ирина Алексеевна

РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ КЛЕТОК ДЕРМАЛЬНОЙ ПАПИЛЛЫ ВОЛОСЯНОГО ФОЛЛИКУЛА ЧЕЛОВЕКА ДО ПЛЮРИПОТЕНТНОГО

СОСТОЯНИЯ

Специальность 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н. А.В. Васильев

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.............................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................5

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................9

1.1. Молекулярные механизмы индуцированной плюрипотентности........................9

1.1.1. Ауторегуляторная петля. Баланс между и с-Мус. Влияние локуса 1пк4/А1*...........................................................................................................................9

1.1.2. Эпигенетическая регуляция экспрессии генов в плюрипотентных стволовых клетках.......................................................................................................11

1.1.3. Роль микроРНК в поддержании плюрипотентности.....................................13

1.1.4. Влияние старения и иммортализации клеток на репрограммирование.......14

1.1.5. Сложность, ступенчатость и стохастичность процесса индукции плюрипотентности......................................................................................................16

1.2. Методы репрограммирования соматических клеток............................................18

1.2.1. Новые способы репрограммированирования соматических клеток до плюрипотентного состояния......................................................................................18

1.2.2. Использование малых молекул при репрограммировании...........................22

1.2.3. Прямое репрограммирование соматических клеток......................................24

1.3. Различия между иПСК и ЭСК. Эпигенетическая «память» иПСК.....................26

1.4. Перспективы использования иПСК в терапии......................................................29

1.4.1. Подходы к клиническому применению иПСК...............................................31

I.5. Общая характеристика клеток дермальной папиллы........................................33

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................................................35

II. 1. МАТЕРИАЛЫ.........................................................................................................35

II. 1.1. Химические реактивы......................................................................................35

II. 1.2. Клеточные культуры........................................................................................35

11.2. МЕТОДЫ.................................................................................................................36

П.2. 1. Выделение и культивирование эмбриональных фибробластов мыши......36

П.2. 2. Приготовление фидерного слоя МЭФ...........................................................36

П.2.3. Выделение и культивирование клеток дермальной папиллы человека......37

11.2.4. Культивирование фибробластов человека.....................................................38

11.2.5. Культивирование плюрипотентных стволовых клеток человека...............38

П.2.6. Репрограммирование клеток ДП и 160811Т....................................................39

П.2.5. Отбор Тга-1 -60+ клонов...................................................................................40

11.2.7. Тест на активность теломеразы в клетках.....................................................40

П.2.8. Иммуноцитохимическое исследование..........................................................41

11.2.9. Проточная цитофлуориметрия........................................................................44

11.2.10. Выявление активности щелочной фосфатазы.............................................45

11.2.11. Получение и культивирование эмбриоидных телец...................................45

И.2.12. Приготовление срезов эмбриоидных телец и их окрашивание.................46

11.2.13. Направленная дифференцировка иПСК in vitro..........................................46

11.2.14. Выделение тотальной РНК из клеток...........................................................47

11.2.15. Синтез кДНК и ОТ - ПЦР (обратная транскрипция совмещенная с

полимеразной цепной реакцией)...............................................................................48

II.2.15.1. Полимеразная цепная реакция...................................................................48

11.2.16. ПЦР в реальном времени...............................................................................50

11.2.17. Кариотипировние............................................................................................51

11.2.18. Тест на тератомообразование........................................................................52

11.2.19. Иммуногистохимия........................................................................................53

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ........................................................................54

III. 1. Инфицирование клеток ДП человека..................................................................54

111.2. Выделение и культивирование иПСК.................................................................56

111.3. Подтверждение плюрипотентного статуса полученных иПСК.......................62

111.3.1. Иммуноцитохимический анализ....................................................................62

111.3.2. Проточная цитофлуориметрия.......................................................................64

111.3.3. Пролиферативная активность иПСК.............................................................68

111.3.4. Цитогенетический анализ...............................................................................70

111.3.5. Определение теломеразной активности.......................................................72

III.3.5. ОТ-ПЦР анализ................................................................................................74

III.3.1. ПЦР в реальном времени................................................................................76

III.4 Исследование дифференцировочного потенциала иПСК - ДП и иПСК -1608hT..............................................................................................................................80

111.4.1. Дифференцировка полученных иПСК in vitro. Образование эмбриоидных телец..............................................................................................................................80

111.4.2. Дифференцировка иПСК in vitro в остеогенном направлении...................82

111.4.3. Дифференцировка иПСК in vitro в гепатоцитарном направлении............84

111.4.4. Дифференцировка иПСК in vitro в нейральном направлении....................86

111.4.5. Дифференцировка иПСК in vivo....................................................................89

III. 5. Эффективность репрограммирования полученных иПСК................................94

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................................................................................96

ВЫВОДЫ.......................................................................................................................99

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................100

БЛАГОДАРНОСТИ....................................................................................................118

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЭСК - эмбриональные стволовые клетки

иПСК - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

ПСК - плюрипотентные стволовые клетки

ДП - дермальная папилла

МЭФ - эмбриональные фибробласты мыши

НСК - нейральные стволовые клетки

1608ИТ - линия фибробластов кожи человека, теломеризованных геном hTERT ЭТ - эмбриоидные тельца

иПСК - ДП - иПСК, полученные в результате репрограммирования клеток ДП иПСК - 1608hT - иПСК, полученные в результате репрограммирования 1608ИТ VPA - вальпроевая кислота, 2-пропилвалериановая кислота KMOS - набор транскрипционных факторов Klf4, с-Мус, Oct4, Sox2 миРНК, miR - микроРНК

siRNA - малые интерферирующие PHK(small interfering RNA)

FBS - фетальная бычья сыворотка (fetal bovine serum)

DAPI - 4,6-диамидино-2-фенилиндол (4,6-diamidino-2-phenylindole)

7-AAD - 7-миноактиномицин Д (7-Aminoactinomycin D)

АФП - альфафетопротеин

CK - цитокератин

FGF -фактор роста фибробластов (fibroblast growth factor)

HGF - фактор роста гепатоцитов (hepatocyte growth factor)

EGF - эпидермальный фактор роста (epidermal growth factor)

BMP - костный морфогенетический белок (bone morphogenetic protein)

ВВЕДЕНИЕ

Плюрипотентные стволовые клетки способны к самообновлению и к генерации всех клеточных типов трех зародышевых листков. До недавнего времени источником плюрипотентных стволовых клеток служили культуры, полученные из клеток внутренней массы бластоцисты: эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) (Evans, Kaufman, 1981; Thomson et al., 1998). Однако сам метод получения ЭСК был связан со многими практическими и этическими проблемами, которые исключали возможность клинического применения ЭСК. В связи с этим мировое научное сообщество продолжало заниматься активным поиском приемлемого метода получения клеток, подобных ЭСК по характеристикам. Определенные успехи были достигнуты в 1997 г., когда Wilmut и соавт. репрограммировали соматические клетки молочной железы, посредством переноса их ядер в ооциты второго деления мейоза (somatic cell nuclear transfer, SCNT) овцы (Wilmut et al., 1997; Wakayama et al., 1998; Campbell et al., 1996). В 2001 г. Tada и соавт. достигли подобного результата путем слияния тимоцитов мыши с ЭСК (Tada et al., 2001). Однако техническую сложность и низкую воспроизводимость этих методов устранить не удавалось. Все попытки применения данных методик для клеток приматов оказались тщетными.

Основываясь на накопленных данных, исследователи Takahashi и Yamanaka в 2006 г. предположили, что неоплодотворенная яйцеклетка и ЭСК содержат факторы, определяющие плюрипотентность (Takahashi, Yamanaka, 2006). В своих работах, выполненных на фибробластах мыши (Takahashi, Yamanaka, 2006), а затем и на клетках человека (Takahashi et al., 2007), они описали способ введения генов, играющих большую роль в раннем развитии, при помощи лентивирусных конструкций. Удалось показать, что эктопическая экспрессия генов всего четырех транскрипционных факторов Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус (позже названных

«каноническим» набором генов KMOS, или «коктейлем Яманаки») достаточна для репрограммирования фибробластов до плюрипотентного состояния. Полученные таким образом клетки были названы индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (иПСК, induced pluripotent stem cells), а явление репрограммирования до плюрипотентного состояния - индуцированной плюрипотентностью. иПСК сходны с ЭСК по многим характеристикам, включая профили экспрессии генов, морфологию, теломеразную активность, характер метилирования ДНК и модификации гистонов. Кроме того, иПСК способны генерировать клетки тканей трех зародышевых листков in vitro, они формируют зрелые тератомы после инъекции мышам с иммунодефицитом. На основе иПСК удалось получить химерных животных, среди потомков которых были и полученные из репрограммированных клеток (Wernig et al., 2007; Okita et al., 2007). К сегодняшнему дню опубликовано большое количество работ, в которых сообщается о получении иПСК человека при помощи различных методов (Yu et al., 2007). Для потенциального клинического применения разработаны способы репрограммирования клеток, более эффективные и безопасные, чем трансфекция вирусных векторов (Park et al., 2008). Получены иПСК от пациентов с различными наследственными заболеваниями (Park et al., 2008; Soldner et al., 2009). Существуют две обширные области исследований, связанных с репрограммированием клеток: фундаментальные исследования клеточной пластичности, генетических механизмов, лежащих в основе раннего развития организма и неоплазий; и технологии репрограммирования соматических клеток с целью проведения заместительной клеточной терапии (Но et al., 2011). Клеточные технологии с использованием иПСК способны предоставлять пациент-специфические линии клеток, в том числе от носителей наследственных заболеваний. Такие линии можно использовать при моделировании различных заболеваний и испытании новых лекарственных средств.

К моменту начала нашего исследования, опубликованных работ по репрограммированию клеток ДП волосяного фолликула человека не было. Многими

авторами подтверждено, что для успешного репрограммирвания соматических клеток до плюрипотентнотого состояния, необходимо вызвать экспрессию четырех транскрипционных факторов Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус в них. Higgins и сотр. (Higgins et. al., 2010) было показано, что при культивировании в клетках ДП человека начинают экспрессироваться Klf4 и с-Мус, тогда как в интактной ДП они не детекутируются, a Sox2 (Higgins et. al., 2012), наоборот, экспрессируется в интактной ДП, но не в культуре (хотя этими авторами двумя годами ранее отвергался данный факт (Higgins et. al., 2010). Принимая во внимание эти неоднозначные сведения, нам показалось интересным использовать клетки ДП в качестве альтернативного источника иПСК, а также проверить эффективность процесса репрограммирования. Мы предположили, что экспрессия в материнских клетках как минимум двух (Klf4 и с-Мус), а, возможно, и трех факторов репрограммирования (Sox2, Klf4 и с-Мус) будет способствовать репрограммированию клеток ДП. Для увеличения эффективности в экспериментах мы культивировали клетки при добавлении деметилирующего агента - вальпроевой кислоты (Medvedev et al., 2011) в условиях физиологического уровня содержания кислорода 5% (Warren et al., 2010). Таким образом, задача настоящего исследования состояла в получении иПСК из клеток ДП человека и оценки эффективности репрограммирования при подобранных условиях, а также многосторонняя характеристика полученных иПСК.

Цель настоящей работы заключалась в получении иПСК из клеток ДП волосяного фолликула человека.

Задачи:

• Репрограммировать клетки ДП человека посредством трансфекции генами транскрипционных факторов Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус. Выделить репрограммированные до плюрипотентного состояния клоны иПСК - ДП.

• Исследовать недифференцированный статус полученных иПСК - ДП.

• Проверить плюрипотентный статус иПСК - ДП in vitro и подобрать условия для направленной дифференцировки иПСК - ДП.

• Проверить плюрипотентный статус полученных иПСК - ДП в экспериментах in vivo.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярные механизмы индуцированной плюрипотентности

1.1.1. Ауторегуляторная петля. Баланс между КЖ и с-Мус. Влияние локуса

1пк4/АгГ

В настоящее время имеется много данных в пользу того, что плюрипотентность регулируется тремя транскрипционными факторами - Ос14, 8ох2 и Капо§ (№\уа, 2007). Показано (ЬоЬ е! а1., 2007; Воуег & а1., 2005), что факторы Ос14, Бох2 и Капо§ совместно активируют промоторы и собственных генов, и генов друг друга, образуя тем самым ауторегуляторную петлю. Существуют данные, указывающие на то, что ауторегуляторная петля усиливает стабильность экспрессии генов плюрипотентности (ЯовепГеИ е1 а1., 2002; А1оп, 2007). Рассматриваемые три фактора способны также запускать и регулировать каскады генов (до нескольких сотен) как транскрипционно активных, так и неактивных. Экспрессия генов Ом4, Бох2 и Nanog является основой транскрипционной сети, которая обеспечивает плюрипотентность ЭСК, усиливая транскрипцию генов плюрипотентности и, в то же время, подавляя активность генов, связанных с дифференцировкой и развитием (Нуз1ор е1 а1., 2005; Кигоёа е1 а1., 2005; КосИа е1 а1., 2005).

В своих пионерских работах ТакаЬаэЫ и Уашапака, начав с анализа 24 генов, в конечном итоге выяснили, что для перехода клеток в плюрипотентное состояние достаточно четырех генов - Ос14, 8ох2, К1/4 и с-Мус. Если первые два относятся к мастер-генам плюрипотентности, то выбор последних двух генов обусловлен иными

причинами. Транскрипционный фактор с-Мус, как известно, увеличивает темпы пролиферации (Seoane et al., 2002), что критически важно для успешного репрограммирования (Utikal et al., 2009). Вместе с тем гиперэкспрессия этого гена сказывается на повышении уровня белка р53. В некоторых работах показано, что экспрессия Klf4, с одной стороны, вызывает повышение уровня белка р21 (ингибитора циклин-зависимых киназ) (Rodda et al., 2005), что приводит к угнетению пролиферации, а с другой стороны, понижает уровень р53 в клетке, что положительно сказывается на уменьшении риска апоптоза (Rowland et al., 2005). Также имеются данные о том, что р53 ингибирует зависимые от актвации Klf4 эпителиальные гены. Было обнаружено, что р53 находится в обратной зависимости (негативной корреляцией) от эпителиального маркера Е-Кадгерина (Broch et al., 2012). Так как мезенхимно-эпителиальный переход является этапом процесса репрограммирования фибробластов (Li et al., 2010; Ono et al., 2012;), то активация p53 препятствует этому процессу. Таким образом, можно предположить, что с-Мус и Klf4 действуют разнонаправленно и взаимно дополняют друг друга. Следовательно, для успеха репрограммирования важен баланс экспрессии этих двух генов (Scheper, Copray, 2009).

Одной из важных характеристик плюрипотентных стволовых клеток является ингибирование локуса Ink4/Arf, который содержит гены Cdknla и Cdkn2b, кодирующие три сильных опухолевых супрессора - р16 (Ink4a), р19 {Arf), р15 {1пк4Ъ). В клетках мыши именно ген Arf активирует р53 и р21, в то время как в клетках человека эти функции в основном берет на себя ген 1пк4а. Показано (Li et al., 2009), что в иПСК, как и в ЭСК, локус Ink4/Arf полностью подавлен при помощи эпигенетических меток домена «бивалента» (появление репрессирующих НЗК27теЗ модификаций гистонов), однако он может вновь активироваться при дифференцировке клеток. Oct4, Sox2, Klf4 совместно подавляют данный локус, что способствует усиленной генерации иПСК, увеличивая как кинетику

репрограммирования, так и количество колоний иПСК. Также стоит отметить, что некоторые исследователи напрямую связывают активацию локуса Ink4/Arf с общим старением организма. Следовательно, сложнее репрограммировать клетки от пожилого донора, нежели от молодого. Подавление локуса Ink4/Arf в этом случае может значительно увеличить эффективность и скорость репрограммирования (Utikal et al., 2009).

1.1.2. Эпигенетическая регуляция экспрессии генов в плюрипотентных стволовых

клетках

ЭСК обладают несколькими эпигенетическими характеристиками, которые отличают их от дифференцированных клеток. Например, ключевые гены плюрипотентности Oct4 и Nanog деметилированы в ЭСК и могут активно транскрибироваться, в то время как дифференцировка приводит к подавлению этих генов посредством метилирования ДНК de novo. Интересно, что метки метилирования удаляю