Экспрессия эпиаллелей генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности, и тканеспецифичных генов в межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках

Баттулин, Нариман Рашитович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспрессия эпиаллелей генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности, и тканеспецифичных генов в межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия эпиаллелей генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности, и тканеспецифичных генов в межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках"

003494ООО

ЭКСПРЕССИЯ ЭПИАЛЛЕЛЕЙ ГЕНОВ ОСТ4 И А'АШС, ОТВЕТСТВЕННЫХ ЗА ПОДДЕРЖАНИЕ ПЛЮРИПОТЕНТНОСТИ, И ТКАНЕСПЕЦИФИЧНЫХ ГЕНОВ В МЕЖВИДОВЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТКАХ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2010

2 5 т?

003494558

Работа выполнена в лаборатории генетики развития Учреждения Российской академии наук Институт цитологии и генетики сибирского отделения РАН. г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Серов О.Л.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Дымшиц Г.М.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук. Лебедев И.Н.

НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН, г. Томск

Ведущее учреждение:

Институт общей генетики РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится «_7_» л-прел а 2010 года на утреннем заседании диссертационного совета ДШ5.ВИЯ1 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: проспект акад. Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090. тел/факс: (383)3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

■у

Автореферат разослан « » ^^ ^^ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Восстановление плюрипотентности в

дифференцированных клетках и связанные с ним процессы репрограммирования генома являются одними из актуальных проблем современной биологии. Исследования, посвяшенные данной проблеме, помимо прикладных аспектов, таких как получение иммуносовместимых клеток для трансплантологического лечения различных заболеваний, тесно связаны с другими фундаментальными проблемами биологии (регуляция дифференциальной активности генов, регуляция процессов индивидуального развития и др.). В нормальном развитии эмбриональные клетки при дифференцировке теряют свой изначальный высокий потенциал - плюрипотентность. в результате чего специализированные клетки лишены способности к превращению в другие типы клеток. Долгое время считалось, что утрата плюрипотентности необратима, однако, в опытах на амфибиях и млекопитающих было показано, что ядра дифференцированных клеток, взятых у взрослого животного, после пересадки в энуклеированные ооциты способны обеспечить полное развитие организма (Di Berardino, Orr. 1992: Wilmut et al.. 1997). Эти данные показали, что ядра некоторых дифференцированных клеток могут быть репрограммированны цитоплазматическими факторами ооцита. На сегодняшний день, помимо метода переноса ядер, существует еще два метода репрограммирования клеток взрослого организма. Это метод слияния эмбриональных стволовых (ЭС) и дифференцированных клеток (Matveeva et al.. 1998: Tada et al.. 2003: Cowan et al.. 2005) и метод получения индуцированных плюрипотентных стволовых (ИПС) клеток, основанный на эктопической экспрессии небольшого числа транскрипционных факторов в культуре соматических клеток (Takahashi. Yamanaka. 2006: Wernig et al.. 2007). Каждый из методов экспериментального репрограммирования клеток имеет свои преимущества и ограничения. Исследование молекулярных механизмов репрограммирования в гибридных клетках предоставляет более широкие возможности, нежели метод переноса ядер в энуклеированные ооциты. поскольку имеется возможность собрать достаточное для анализа количество материала. В отличие от получения ИПС клеток, ЭС клетки при слиянии содержат все необходимые для правильного репрограммирования факторы, в том числе и неидентифицированные. Однако после объединения геномов родительских клеток в ядре гибридной клетки, становится сложно следить за изменениями генной активности и эпигенетических модификаций геномов плюрипотентной и дифференцированной клеток.

et al, 2002). При слиянии ЭС клеток человека с фибробластами человека, также отмечается высокий уровень плюрипотентности гибридных клеток, сходный с потенциалом родительских ЭС клеток (Cowan et al., 2005). Высокий потенциал эмбриональных стволовых гибридных клеток подразумевает доминирование плюрипотентности - ключевого свойства ЭС клеток. Тот факт, что в гибридах типа ЭС клетка - дифференцированная клетка проявляются лишь свойства плюрипотентного партнера. предполагает репрограммирование генома соматического партнера. Однако прямых доказательств этого на сегодняшний день не так много. Свидетельства репрограммирования эпиаллелей соматического партнера (эпиаллелями называются аллели, дифференциальная активность которых обусловлена различием эпигенетических модификаций, приобретенных в процессе индивидуального развития) были найдены в гибридах, полученных от слияния ЭС клеток Mus musculus domesticus и тимоцитов M. musculus molossinus (Tada et al.. 2001: Tada et al. 2003; Hatano et al.. 2005).

В исследованиях последних лет были определены транскрипционные факторы, ответственные за поддержание плюрипотентности ЭС клеток и клеток ранних эмбрионов млекопитающих. В настоящее время считается, что ключевыми звеньями сложной генной сети, регулирующей плюрипотентный статус, являются гены Oct4. Kanog и Sox2 (Chambers. Smith, 2004). Показано, что эти гены играют важную роль и в процессах репрограммирования соматических клеток (Takahashi. Yamanaka. 2006: Takahashi et al.. 2007). Поэтому большое внимание уделяется изучению процессов, сопровождающих реактивацию «генов плюрипотентности». таких как Oct4 и Nanog. при репрограммировании геномов дифференцированных клеток. Важная роль в регуляции активности этих генов отводится эпигенетическим модификациям генома, таким как метилирование ДНК и модификации гистонов.

Необходимым условием репрограммирования генома является не только активация «генов плюрипотентности». но также и подавление активности тканеспецифичных генов, активных в дифференцированных клетках. К такой категории генов, экспрессия которых характерна для всех типов дифференцированных клеток, относится ген белка ядерной ламины - lamin А'С (.Lmna) (Constantinescu et al.. 2006). На сегодняшний день не опубликовано работ, в которых исследовалась бы экспрессия этого гена в процессе репрограммирования дифференцированных клеток.

В связи с необходимостью различать аллели родительских геномов при исследовании процессов репрограммирования. особый интерес представляют межвидовые гибридные клетки. В лаборатории генетики развития Института цитологии и генетики СО РАН были получены межвидовые гибриды от слияния плюрипотентных ЭС клеток Mus musculus и спленоцитов близкого вида мыши M caroli. Полученные клоны гибридных клеток, кариотип которых детально описан (Matveeva et al, 2005; Пристяжнюк и др., 2005), имеют фенотип и ростовые характеристики, сходные с ЭС клетками. Межвидовая вариабельность гомологичных- последовательностей ДНК позволяет надежно различать аллели плюрипотентного и соматического партнеров в гибридных клетках. Благодаря этому появилась возможность изучения молекулярных механизмов

репрограммирования генома соматической клетки и интерпретации полученных данных с учетом хромосомного состава гибридных клеток и присутствием хромосом соматического партнера.

Цели и задачи исследования. Цель работы заключалась в оценке репрограммирования генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности, а также гена Lmna, экспрессия которого характерна для всех типов дифференцированных клеток, в межвидовых гибридных клетках, полученных слиянием ЭС клеток Mus musculus и спленоцитов Mus caroli. А также в оценке репрограммирования тканеспецифичных генов при дифференцировке гибридных клеток в составе химерного животного. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить первичную структуру фрагментов генов Oct4 и Nanog M. caroli и провести поиск видоспецифичных сайтов узнавания рестриктаз. позволяющих различать видовую принадлежность транскриптов этих генов в гибридных клетках.

2. Исследовать экспрессию эпиаллелей генов Oct4, Nanog спленоцита в межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках.

3. Определить первичную структуру 5'-регуляторных областей генов Oct-I. Nanog и Lmna M. caroli.

4. Провести сравнительный анализ метилирования э'-регуляторных областей эпиаллелей генов Oct4. Nanog и Lmna в межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках.

5. Провести сравнительный анализ метилирования 5'-регуляторной области эпиаллелей гена Oct4 при дифференцировке эмбриональных стволовых гибридных клеток в условиях in vivo (формирование тератом).

6. Оценить экспрессию тканеспецифичных генов с аллелей соматического партнера в тканях химер, полученных введением эмбриональных стволовых гибридных клеток в бластоцисты мышей линии C57BL.

Научная новизна.

1. В работе впервые проведено детальное исследование уровня метилирования 5'-регуляторных областей родительских аллелей генов Oct4 и Nanog в эмбриональных стволовых гибридных клетках. Показано, что реактивация эпиаллелей соматического партнера генов Oct4 и Nanog сопровождается деметилированием их 5'-регуляторных областей.

2. Впервые исследовано метилирование 5'-регуляторной области гена Oct4 в тератомах, развившихся из эмбриональных стволовых гибридных клеток. Показано. что диффернцировка гибридных клеток сопровождается гиперметилированием 5'-регуляторной области гена ОсЫ. уровни метилирования родительских аллелей не различаются.

3. Получены новые данные о метилировании 5'-регуляторной области гена Lmna в ЭС клетках и фибробластах мыши. Показано, что метилирование района от

-300 п.н. до -94 п.н. гена Lmna (относительно первого кодона) поддерживается на одном уровне вне зависимости от того, находится ли ген в активном или репрессированном состоянии.

4. В работе впервые проведена оценка экспрессии тканеспецифичных генов соматического партнера в тканях химер, полученных введением эмбриональных стволовых гибридных клеток в бластоцисты мышей. Показано, что репрограммированные гены соматического партнера экспрессируются тканеспецифичным образом в органах химерного животного.

Положения, выносимые на защиту. В клонах гибридных клеток, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток М. musculus со спленоцитами М. caroli. происходит репрограммирование генов Oct4 и Nanog. признаками которого являются реактивация эпиаллелей спленоцита генов Oct4 и Nanog и деметилирование их 5'-регуляторных областей.

Дифференцировка гибридных клеток в тератомах сопровождается гиперметилированием 5'-регуляторной области гена Oct4. причем уровни метилирования эпиаллелей спленоцита и ЭС клетки не имеют существенных различий.

Репрограммирование гена Lmna в гибридных клетках сопровождается подавляением экспрессии эпиаллеля Lmna спленоцита. причем это подавление не связано с изменением метилирования 5"-регуляторной области гена Lmna.

Эпиаллель гена Des спленоцита экспрессируется тканеспецифичным образом в тонком кишечнике химерной мыши, полученной введением гибридных клеток клона НМС29-3 в бластоцисты мышей линии C57BL.

Практическая значимость. Результаты данной работы расширяют наши знания о процессах репрограммирования и используются при чтении курса «Генетика развития» в Новосибирском государственном университете.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на XLIV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск. 2006 г.). на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск. 2007 г.). на международной конференции lst Annual World Congress of Regenerative Medicine and Stern Cells (Фошань. Китай. 2008 г.). на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва. 2009 г.).

По теме диссертации опубликованы 3 работы. Две - в рецензируемых зарубежных журналах и одна - в рецензируемом отечественном журнале.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения. 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 103-х страницах, иллюстрирована 18-ю рисунками и содержит 4 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовались:

- ЭС клетки линии НМ-1, любезно предоставленные доктором Мелтоном. Великобритания.

- Двадцать независимых межвидовых гибридных клонов серии НМС, полученных от слияния клеток линии НМ-1 мыши М. musculus и спленоцитов М. caroli (Серов и др., 2003). Серия гибридных клеток была получена Н.М. Матвеевой в лаборатории генетики развития ИЦиГ СО РАН.

Суммарную РНК. а также ДНК из клеточных культур выделяли с использованием TRIzol Reagent (Life Technology, США), согласно рекомендациям производителя. Для очистки образцов РНК выделенных с помощью Trizol Reagent от контаминации ДНК использовали набор реагентов TURBO DNA-free (Ambion). РНК из органов химерных мышей (печень, почка, легкое, сердце, икроножная мышца, мозг, тонкий кишечник) выделяли с использованием SV Total RNA Isolation System (Promega, США). Для синтеза кДНК использовали набор реактивов Reverse Transcription Svstem (Promega, США).

Определение нуклеотидной последовательности проводили согласно протоколу ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems. Perkin-Elmer Corporation). Образцы анализировали в Центре Коллективного Пользования «Секвенирование ДНК» СО РАН.

Для бисульфитной обработки геномной ДНК использовался набор реактивов EpiTect Bisulfite Kit (Q1AGEN). Для наработки продукта ПЦР при использовании в качестве матрицы модифицированной бисульфитной обработкой ДНК применяли метод ПЦР с вложенными праймерами (Nested-PCR).

Для субклонирования продуктов Nested-PCR использовался набор реактивов pGEM-T Easy Vector System (Promega. США). После трансформации клеток £. coli, клонированные фрагменты индивидуальных клонов амплифицировали в ПЦР и затем секвенировали.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Экспрессия генов - молекулярных маркеров плюрипотентности Oct4 и Nanog в гибридных клетках

Транскрипционные факторы Oct4 и Nanog являются ключевыми элементами системы регуляции плюрипотентного статуса клеток. Поэтому важной характеристикой любой культуры плюрипотентных клеток является активность генов ОсЫ и Nanog. В данной работе методом ОТ-ПЦР мы исследовали экспрессию генов ОсЫ и Nanog в эмбриональных стволовых гибридных клетках серии НМС (рис. 1 ). Было показано, что все 20 клонов серии НМС позитивны по экспрессии ОсЫ и Nanog (Vasilkova et ai. 2007; Battulin et al.. 2009). В качестве внутреннего контроля ОТ-ПЦР использовалась экспрессия гена «домашнего хозяйства» бета-актина (Actb).

Экспрессия молекулярного маркера дифференцированных клеток гена Lmna в гибридных клетках

Эмбриональные стволовые гибридные клетки образуются при слиянии ЭС и дифференцированных клеток. Каждый из исходных клеточных типов имеет свою генетическую программу, свой неповторимый профиль генной экспрессии. В качестве маркера плюрипотентного состояния ЭС клеток традиционно используется активность генов Oct4 и Nanog. тогда как до последнего времени не было общепринятого генетического маркера дифференцированного состояния клеток. В 2006 году в качестве такого маркера было предложено использовать активность гена Lmna (Constantinescu et а!.. 2006). Этот ген неактивен в плюрипотентных клетках, таких как ЭС клетки, но экспрессируется в

дифференцированных клетках, например, в фибробластах и спленоцитах (рис. 1). С помощью метода ОТ-ПЦР мы исследовали активность гена Ьтпа в гибридных клетках серии НМС. Проведенный анализ показал, что уровень экспрессии Ьтпа в гибридных клетках сопоставим с уровнем экспрессии в ЭС клетках и значительно снижен, по сравнению с таковым в дифференцированных клетках - фибробластах и спленоцитах (рис. 1).

1 2 4 6 15 21 ЭС ЭФ С

Ыапод

!~тпа

Рис ] Результаты ОТ-ПЦР анализа экспрессии генов ОсЫ. \anog. 1гппа и АсгЬ в ЭС клетках НМ-) (ЭС). эмбриональных фибробластах (ЭФ), спленоцитах (С) н гибридных клонах серии НМС (числами указаны номера клонов)

Поиск аллель-специфичных сайтов рестрикции для идентификации транскриптов разного родительского происхождения

Для исследования профиля активности генов в гибридных клетках были выбраны гены, экспрессирующиеся в родительских клетках альтернативным образом. Ос14 и \anog активны в ЭС клетках, а в спленоцитах нет. ген ¿тгса активен в спленоцитах. а в ЭС неактивен (рис. 1). Однако результаты ОТ-ПЦР анализа, приведенные выше, не позволяют ответить на важный вопрос: участвует ли геном спленоцита в экспрессии «генов плюрипотентности» или. иными словами, репрограммируется ли геном дифференцированной клетки при образовании гибридных клеток? Для ответа на этот вопрос необходимо надежно различать транскрипты генов ЭС клетки и спленоцита в гибридных клетках.

Для идентификации транскриптов родительских аллелей генов ОШ и А'anog был использован рестрикционный полиморфизм между аллелями родительских видов. Для поиска аллель-специфичных сайтов была определена первичная структура фрагментов генов Осг4 и Nanog М. сагоИ. При сравнении с гомологичными последовательностями М. тизсиЫь были выявлены видоспецифичные сайты рестрикции. Таким образом, найденные аллель-специфичные различия родительских аллелей Ос<4 и .\:a>юg позволили нам надежно дискриминировать транскрипты спленоцита Щ. сагоН) и ЭС клетки (М. тивЫт). поскольку после обработки продуктов ОТ-ПЦР соответствующей рестриктазой аллели легко различить по разной подвижности при электрофорезе. Тем самым можно сравнить экспрессию «плюрипотентного» и «дифференцированного» аллелей в гибридных клетках.

Нуклеотидные последовательности участков генов М. сагоН зарегистрированы в ОепВапк (табл. 1).

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности М. сагоИ зарегистрированые в йепВапк._________

Район GenBankX» Район GenBank JV»

фрагмент ОсЫ М. caroh DQ250732 5' область гена ОсЫ М. сагоН EF166066

фрагмент Nanog М. caroli DQ250731 5' область гена Ыапо% М. сагоН EF166065

фрагмент Lmna М. caroli . DQ218139 5' область гена Ьтпа М. сагоН EF166064

Экспрессия родительских аллелей гена Оп4 и .\anog в гибридных клетках

Проведенный ОТ-ПЦР ПДРФ (полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов) анализ показал, что во всех 13 клонах гибридных клеток серии НМС. содержащих хромосому 17 М. сагоЧ (в этой хромосоме локализуется ген ОсЫ). активны как аллель ЭС клетки, так и аллель спленоцита (рис. 2). Таким образом, показано, что в эмбриональных гибридных клетках ген ОсЫ спленоцита. ранее не активный, реактивируется, а активность данного гена ЭС клетки сохраняется.

313 ПН -►

254 пн*

Рис. 2 Результаты ОТ-ПЦР анализа экспрессии аллелей Л/, саго!; и М ти$си1ш гена ОсЫ в гибридных клетках серии НМС и ЭС клетках НМ-1 (ЭС) Присутствие фрагмента размером 313 п.н. соответствует транскрипту аллеля М. тшси!и$. а 254 п.н - аллеля № саго1г Клон НМС15 не содержит хромосом}' 17 М. сагоЪ и потому транскрипт ОсЫ М сагой в нем не выявляется

Аналогичные результаты были получены при ОТ-ПЦР ПДРФ анализе экспрессии гена .\anog в гибридных клетках серии НМС (рис. 3). Аллель гена .\anog спленоцита был активен во всех 13 клонах, содержащих хромосом} 6 М. сагоН (в этой хромосоме локализуется ген Nanog). что свидетельствует о реактивации гена l\anog спленоцита в гибридных клетках. Тогда как экспрессия аллеля гена .\anog ЭС клетки при образовании гибридных клеток не изменяется, поскольку этот аллель был активен в родительской линии ЭС клеток и остается активным в гибридных клетках (рис. 3).

НМС1 НМС2 НМС4 НМС6 НМС15 НМС21 НМ-1

148 пн 101 пн

Рис 3. Результаты ОТ-ПЦР анализа экспрессии аллелей М. сагоН и М. тизси1ш гена Л'опо^ в гибридных клетках серии НМС и ЭС клетках НМ-1 (ЭС) Присутствие фрагмента размером 101 п.н. соответствует транскрипту аллеля М. тшси/из. а 148 п.н - аллеля М. саго/г В клоне НМС15 не выявлены транскрипты аллеля М. сагоИ. поскольку в нем отсутствует хромосома 6 М. сагоН.

Определение последовательности 5'-регуляторных областей генов Od4, Nanog и Lmna M. caroli

Для того чтобы исследовать эпигенетические изменения сопровождающие реактивацию генов Oct4 и Nanog при репрограммировании, мы оценивали метилирование 5'-регуляторных областей этих генов в гибридных клетках. Широкомасштабное секвенирование генома M. caroli не проводилось, в отличие от генома M. musculus, и потому при анализе метилирования нам было необходимо определить последовательности интересующих нас районов. Последовательности определяли путем амплификации при помощи ПЦР с последующим секвенированием. По результатам анализа удалось определить последовательности размером 333 п.н. гена Nanog. 575 п.н. гена Oct4 и 453 п.н. гена Lmna А/. caroli. Нуклеотидные последовательности были зарегистрированы в GenBank (табл. 1). В результате выравнивания полученных последовательностей с гомологичными последовательностями А/, musculus при помощи программы DNA assist 1.0 удалось локализовать участки 5'-регуляторной области генов М. caroli относительно предполагаемого старта трансляции: (-324;+4) для гена Nanog. (-631 >27) для гена Oci4. (-495:+42) для гена Lmna. В результате выравнивания последовательностей удалось выявить межвидовые различия и участки гомологии, которые использовались в дальнейшем для подбора праймеров для метода бисульфитного секвенирования.

Анализ профилей метилирования 5'-регуляторной области гена Ос14 в ЭС клетках и спленоцитах

Уровень метилирования ДНК исследовали методом бисульфитного секвенирования (Clark et al.. 1994). Из множества существующих методик оценки метилирования ДНК метод бисульфитного секвенирования был выбран потому, что это единственная методика, позволяющая количественно оценить метилирование нескольких аллелей, одновременно присутствующих в образце. Кроме того, в отличие от других методик результатом исследования является не просто усредненный процент метилирования конкретного CpG динуклеотида в образце, но набор профилей метилирования протяженного участка ДНК. отображающий всё разнообразие вариантов его метилированиия существующих в образце. За все эти преимущества бисульфитное секвенирование часто образно называют «золотым стандартом» исследований метилирования ДНК.

Результаты анализа профилей метилирования 5'-регуляторной области гена Oct4 в родительских клетках: ЭС клетках линии НМ-1 M. musculus и спленоцитах M. caroli. представлены на рисунке 4. Было показано, что 12 CpG дуплетов (от -470 п.н. до -110 п.н., относительно старта трансляции) в ЭС клетках гипометилированы (1±1% из анализированных CpG дуплетов были метилированы) (рис. 4). В спленоцитах M. caroli наблюдалась противоположная ситуация, 11 CpG дуплетов (от -458 п.н. до -111 п.н., относительно старта трансляции) в 5' области гена Oct4 были гиперметилированы, то есть 83±3% из анализированных CpG дуплетов были метилированы (рис. 4). Поскольку ген Oct4 активен в ЭС клетках и неактивен в дифференцированных клетках, то полученный результат подтверждает связь между метилированием выбранного участка 5'-регуляторной области и активностью гена.

А 0с'4,

М. тиэсиШз—О-О-О—ОЭ-С-О-ССЮ-О .....

с- О) Ч» О «ХО> Ю^ о

» 7 7 7 5 ОсЫ >

М. сагоН

Б ЭС клетки спленоциты

М. тивси1из (1±1%) М. сагоН (83±3%)

Рис 4 Анализ 5"-регуляторной области гена Ос1-1. А - схема 5"-регуляторной области гена ОсЫ Изогнутой стрелкой отмечена позиция старта транскрипции, указаны позиции Срв луплетов (обозначены кружками) относительно старта трансляции. Б - результаты анализа метилирования 5'-регуляторной области ОсЫ в ЭС клетках и спленоцитах. в скобках указан процент метилированных сайтов ± стандартная ошибка Белыми кружками обозначены неметилированные сайты, черными - метилированные

Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Ос/4 в эмбриональных стволовых гибридных клетках

Профили метилирования 5'-регуляторной области гена ОсГ4 анализировались в клонах гибридных клеток НМС1. НМС2. НМС6. НМС21 и НМС28 (рис. 5). НМС29 и НМС56 (рис. 6). Поскольку последовательность 5'-области гена Ос/4 \ М. тюсиШ и М. сагоН имеет различия (рис. 4А). метод бисульфитного секвенирования позволяет раздельно исследовать метилирование аллелей родительских видов. Было показано, что во всех анализированных клонах уровень метилирования эпиаллелей 5"-регуляторной области Оа4 ЭС клеток и спленоцитов не отличается. В тоже время, уровень метилирования 5'-регуляторной области Ос14 в разных клонах меняется от полностью деметилированного (0%) в клоне НМС2. до частично метилированного (примерно 25%) в клоне НМС6. Таким образом, было показано, что в исследованных клонах гибридных клеток уровень метилирования эпиаллелей 5'-регуляторной области Оа4 существенно не отличается, и соответствует уровню метилирования в ЭС клетках, в тоже время отличается от такового в спленоцитах.

Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Ос/4 в тератомах, полученных из эмбриональных стволовых гибридных клеток

Выше не раз подчеркивалось, что реактивация «генов плюрипотентности» - это важный этап процесса репрограммирования и получения плюрипотентных клеток. Однако по определению, плюрипотентными называются клетки, способные дифференцироваться во все типы клеток взрослого организма. Поэтому не менее важным является и процесс подавления активности «генов плюрипотентности». таких как Ос14. при дифференцировке клеток. Известно, что экспрессия гена Оа4 препятствует дифференцировке клеток (№\уа еГ а/.,

2000), более того, его эктопическая экспрессия в клетках взрослого организма может быть связана с опухолевым перерождением клеток (Monk. Holding. 2001). Поэтому мы исследовали изменение активности гена Oct4 и метилирование его 5'-регуляторной области при индуцированной in vivo дифференцировке гибридных клеток.

НМС1 НМС2 НМС6

(9±2%, 6±2%) (0%, 0%) (25±4%, 23±4%)

Рис. 5. Профили метилирования 5"-регуляторной области гена Ocl4 в клонах эмбриональных стволовых гибридных клеток HMCl. НМС2. НМС6. НМС21 и НМС28; в скобках указан процент метилированных сайтов ± стандартная ошибка (для аллелей ЭС клетки, для аллелей спленоиита) Белыми кружкам« обозначены неметилированкые сайты, черными -метилированные. Для кажлого клона отмечены атлели ЭС клеток (tí. musculus) и спленоцита (tí. caroli).

На рис. 6 представлены результаты анализа уровня метилирования 5"-регуляторной области гена Oct4 в двух тератомах, полученных подкожным введением клеток клонов НМС29 и НМС56 иммунодефицитным мышам nude. Полученные результаты говорят том. что процесс дифференцировки гибридных клеток in vivo сопровождается гиперметилированием 5'-регуляторной области гена Oct4. Важно отметить, что уровень метилирования эпиаллелей существенно не отличается, то есть гиперметилирование затрагивает как аллель «плюрипотентного». так и реактивированного «соматического» аллеля (рис. 6).

НМС56 (241%. 5+2%)

НМС29 (131:3%. 5±2%)

<хх>-со—о

НМС56 тератома (64+4%, 61±5%)

-СО-0—о-оо—о—о -о-оо—о—о

НМС29 тератома (53+5%, 48+4%)

Рис. 6. Профили метилирования 5'-регуляторной области гена ОсЫ в клонах эмбриональных стволовых гибридных клеток НМС56 и НМС29. а также тератомах полученных из этих клонов; в скобках указан процент метилированных сайтов ± стандартная ошибка (для аллелей ЭС клетки, для аллелей спленоцита). Белыми кружками обозначены неметилированные сайты, черными - метилированные. Для каждого клона отмечены аллели ЭС клеток (М. тизсиЫв) и спленоцита (И. сагоН).

Анализ профилей метилирования 5'-регуляторной области гена N0110° в ЭС клетках и спленоцнтах

Анализ метилирования пяти Срв дуплетов (от -30] п.н. до -142 п.н.. относительно старта трансляции, рис. 7) 5'-регуляторной области гена Капоg в ЭС клетках М. тжсипоказал, что все они неметилированны. Уровень метилирования гомологичного района (от -306 п.н. до -142 п.н.. относительно старта трансляции) в спленоцитах М. сагоН составил 24±5%. Также для сравнения был определен уровень метилирования указанного района в другом типе дифференцированных клеток — фибробластах М. тиясиЫ. уровень метилирования в них составил 69±6% (рис. 7). Таким образом, хотя уровень метилирования 5'-регуляторной области Nanog выше в клетках, в которых ген Nanog неактивен (спленоциты и фибробласты), не наблюдается четкой связи между его активностью и метилированием выбранного участка гена. Это хорошо видно из рисунка 7. примерно половина анализированных аллелей в спленоцитах неметилирована, несмотря на то. что ген Nanog в этих клетках не экспрессируется.

М. ти5си1ив-СО-

Шпод

-со-

М. сагой

§ о »1 г«

ЭС клетки М. тивсиШз (0%) а>

'Ыапод '

ЭФМ

М. тивсиЫ (69±6%)

С*—— —с

_ *

-Ш- —•

спленоциты М. сага// (24±5%)

СП-о-со

а>-

сс>-а>-

-со -со -со -со -со -со -ее -со -со

-со -со -о» -с»

Рис. 7. Анализ метилирования 5'-регуляторной области гена А - схема

5 -регуляторной области гена Л'аио£. Изогнутой стрелкой отмечена позиция старта транскрипции, указаны позиции Срб дуплетов (обозначены кружками) относительно старта трансляции К - результаты анализа метилирования 5'-регуляторной области Капо£ в ЭС клетках, фибробластах и спленоцитах: в скобках указан процент метилированных сайтов ± стандартная ошибка. Белыми кружками обозначены неметилированные сайты, черными -метилированные.

Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Nanog в эмбриональных стволовых гибридных клетках

На рисунке 8 представлены результаты анализа метилирования 5"-регуляторной области гена Nanog в эмбриональных стволовых гибридных клетках НМС1. НМС2. НМС6. НМС21 и НМС28. Установлено, что уровень метилирования эпиаллелей Nanog не отличается во всех исследованных гибридных клетках. Кроме того, за исключением клона НМС6 уровень метилирования 5'-регуляторной области Nanog в гибридных клетках сопоставим с уровнем метилирования 5" области гена Kanog в ЭС клетках, но не спленоцитах.

Анализ профилей метилирования 5'-регуляторной области гена Ьтпа в ЭС клетках, фибробластах и эмбриональных стволовых гибридных

клетках

5"-регуляторная область гена Ьтпа мало изучена и. на сегодняшний день, нет данных о влиянии метилирования этого участка на экспрессию гена. Для анализа метилирования был выбран участок 5" области от -495 п.н. до +42 гена Ьтпа. прилежащий к старт)' трансляции. Проведенное бисульфитное секвенирование выбранного участка показало, что данный район неметилирован как в ЭС клетках, так и в дифференцированных клетках (рис. 9). Сходные результаты были получены при исследовании гибридных клонов НМС1 и НМС2 (рис. 9). Полученные данные свидетельствуют о том. что метилирование данного участка 5'-регуляторной области гена Ьтпа в анализированных типах клеток не отражает его активность. То есть неактивное состояние гена в плюрипотентных клетках закрепляется какими-то иными эпигенетическими механизмами, не

связанными с метилированием выбранного участка 5'-регуляторной области гена Lmna.

НМС1 НМС2 НМС6

(4±2%,7±3% ) (2±2%,1±1%) , (21±5%,18±5% ) со-

Рис. 8. Профили метилирования промоторной области гена Л'anog в клонах эмбриональных стволовых гибридных клеток НМС1. НМС2. НМС6. НМС21 и НМС28, в скобках указан процент метилированных сайтов ± стандартная ошибка (для аллелей ЭС клетки, для аллелей спленоцита). Белыми кружками обозначены неметилированные сайты, черными -метилированные. Для каждого клона отмечены аллели ЭС клеток (М. тизсиЫз) и слленоиита (Л/ саогИ).

НМС21 (3±2%,1±1«»

НМС28 (13±5%,16±4% )

со-со-со-о-

Экспрессия тканеспецифичных генов соматического партнера в тканях взрослых химер

Для того чтобы оценить потенциал репрограммированного генома, мы попытались ответить на вопрос участвует ли репрограммированный геном соматического партнера в экспрессии тканеспецифичных генов в тканях взрослых химер. Химерные животные были получены Кизиловой Е.А. путем введения клеток клона НМС29 в полость реципиентной бластоцисты линии C57BL. Для проведения такого анализа из базы данных BioGPS (http://biogps.gnf.org) были выбраны гены, экспрессирующиеся преимущественно в одном органе или ткани: Alb (активен в печени), Bdh2 (в почках), Ager (в легком), Des (в мышечной ткани), Neflt (в нейронах) и Cdx2 (в тонком

кишечнике). После отбора генов-кандидатов были подобраны праймеры для амплификации фрагментов этих генов. Далее была определена первичная структура амплифицированных фрагментов этих генов у М. сагоИ.

Lmna

—О-НСО-ОХУ-ООЗП—

(СИО ^J-f^*- CVOïCN^'^ OOïC> to'«г'Ч- cv OO^C!

ЭС клеки M.musculus (3±2%)

О-ŒD-COO-CXXD

О-CE3-ОХЬОООЗО

■CED-OCD-O-OCCD

<rn-cxD-o<сса

<2D-OCO-*-COZ>

■ссо-сакнос

ЭФМ M.musculus (3+2%)

-ссо-co-oocro

-cm-OCD-O-CXXD

-CDD-OCD-O-CCCD

-ar>-OCO-O-OKD

-ода-co-o-ccro

-cœ-oa>o-cccD

-CDD-COO-CXXD

-ax>-oco-occcd

-CCO-CCO-+-QXD

-CCD-ОвЭ—Ф-СОЗЭ

HMC1 (1+1%, 0%)

-СЮ-CXD-0-CX3D

-en-caxxxxD

-cœ-cco-o-axD

-aas-oco-ooood

-coo-cco-o-axD

■что——ao-xxm -an-CCD-OOCCD

-CSD-ССОЧХХЕО

—cco-cco-o-axD

-СЛЬ-—CKMXXXD

-CCC>-OOO-O-COCD

-CSD cco-oooco -CCD COXKXXD -CCO-OCXKXXD

-033-OCD-O-OXO

-ОЗЭ——OCO-CKXXO -coo-оахьооаэ

-CCD-OCD-O-CCCD

-ссо-caXHXOs

-CCO-OCD-O-CXXD

HMC2 (1+1%, 0%)

-CCO——OCO-O-COCD -CCO-OCCMXXXD

-cco-ccd-cxxxd

-OÛO——CCO-CKXXD

-cco—caxxxxo

-CCO-CCO—O-CCCO

-COO-CO-O-OOCD

-CCD-CCD-O-CCCD

-as-oœ-o-ссаз

-ОЗЭ-CCD-O-aXO

-ao-OO»~ooccd

-COO-CCO-CKXXD

-CCD-COXXCCD

-CCD-ОЗЭ-О-aXD

-CED-Cœ-O-CXXD

-cœ-coo-cccE

—ОЭЭ-OOXMXCD

-CCO-OCO-O-CŒ

-ал-cco-o-ckxd

-его—озхххаэ -OTO-OCD-O-COD

Рис. 9 Анализ метилирования 5'-регуляторной области гена Lmna А - схема 5'-регуляторной области гена Lmna Изогнутой стрелкой отмечена позиция старта транскрипции, указаны позиции CpG дуплетов (обозначены кружками) относительно старта трансляции. Б - результаты анализа метилирования промотора Lmna в ЭС клетках, фибробластах и гибридных клонах НМС1 и НМС2; в скобках указан процент метилированных сайтов ± стандартная ошибка. Белыми кружками обозначены неметилированные сайты, черными - метилированные

На рисунке 10 представлены результаты ОТ-ПЦР анализа генов Alb, Bdh2, Ager. Des. h'cfli и Cdx2 у химерного животного № 6-17 в печени, почке, легком, икроножной мышце, мозге и тонком кишечнике. Видно, что каждый ген преимущественно активен в одном из органов, а Des экспрессируется в поперечнополосатой мускулатуре икроножной мышцы и гладкой мускулатуре кишечника. Для того, чтобы определить участвует ли геном соматического партнера в экспрессии тканеспецифичных генов в тканях химер, была определена первичная структура амплифицированных фрагментов генов Alb, Bdh2. Ager, Des, Nefli и Cdx2, представленных на рисунке 10. Однако на полученных секвенограммах не было обнаружено транскриптов, характерных

для соответствующих генов М. сагоИ. Чувствительность этого метода

оценивается примерно в 30%. то есть с его помощью можно обнаружить

минорную последовательность в образце, содержащем две аллельные

последовательности, если ее концентрация не меньше 30% от доминирующей

последовательности.

Пе По

Рис. 10. Результаты ОТ-ПЦР анализа генов Alb. Bdh2. Ager. Des. Ne/h. Cdx2 и Actb в органах химерной мыши К»6-17. полученной введением клеток субклона НМС29-3 в полость бластоиисты. Пе -печень. По - почка. JI - легкое. Мы -мышца. Mo - мозг. К - кишка

Чувствительность метода ПЦР-ПДРФ выше и оценивается примерно в J-10%. потому было принято решение применить его для дискриминации транскриптов родительских аллелей генов Alb. Bdh2. Ager. Des. Nefh. CcL\2 и Actb у химерных животных. Для того чтобы сформировать видоспецифичные сайты рестрикции для генов Alb и Bdh2. были подобраны праймеры с введением одного некомплементарного основания. Мы не обнаружили транскрипты генов Alb и Bdh2 M. caroli в печени и почке химеры №6-17.

Для того чтобы применить метод ПЦР с видоспецифичными праймерами. были выбраны гены Des и NetЬ. поскольку из генов, выбранных для данного исследования, последовательности именно этих генов имеют наибольшие различия у M. musculus и M. caroli. ОТ-ПЦР анализ гена Nefh в головном мозге и гена Des в икроножной мышце и кишечнике у химеры №6-17 показал, что в головном мозге отсутствуют транскрипты специфичные для Nefh M. caroli. тогда как с использованием видоспецифичных праймеров на ген Des удалось добиться амплификации в образцах икроножной мышце и кишечнике химеры №6-17. Амплифицированные фрагменты были отсеквенированы. показано, что данный фрагмент гена Des является транскриптом M. caroli. Таким образом, было показано, что тканеспецифический ген Des M. caroli активируется при дифференцировке гибридных клеток в кишечнике химер.

ВЫВОДЫ

1. Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в межвидовых гибридных клетках, полученных слиянием ЭС клеток M. musculus и спленоцитов M. caroli. показал, что эпиаллели генов Oct4 и Nanog спленоцита реактивируются, что является одним из признаков процесса репрограммирования генома спленоцита.

2. Реактивация эпиаллелей генов Oct4 и Nanog спленоцита в эмбриональных стволовых гибридных клетках сопровождается деметилированием 5'-регуляторной области этих генов до уровня, характерного для

5'-регуляторной области Ocl4 и Nanog в ЭС клетках. Полученные данные свидетельствуют о том, что репрограммирование генома дифференцированной клетки сопровождается изменением эпигенетического статуса генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности.

3. При дифференцировке эмбриональных стволовых гибридных клеток в тератомах, образовавшихся в местах введения гибридных клеток иммунодефицитным мышам, происходит гиперметилирование 5"-регуляторной области гена Oct4. причем уровни метилирования эпиаллелей спленоцита и ЭС клетки не имели существенных различий.

4. Исследование экспрессии гена Lmna, а также уровня метилирования его 5"-регуляторной области в ЭС клетках, фибробластах и эмбриональных гибридных клетках показало, что экспрессия эпиаллеля гена Lmna спленоцита подавляется в гибридных клетках, причем это подавление не связано с изменением метилирования 5'-регуляторной области гена Lmna.

5. Исследование экспрессии тканеспецифичных генов Alb. Bdh2. Ager. Des. Ne)Ъ и Cdx2 в органах взрослой химерной мыши, полученной введением гибридных клеток клона НМС29-3 в бластоцисты мышей линии C57BL. показало. что эпиаллель гена Des спленоцита экспрессируется тканеспецифичным образом в тонком кишечнике химерной .мыши. Активность эпиаллелей генов Alb. Bdh2. Ager. Nefli и Cdx2 спленоцита не была выявлена, по-видимому. из-за невысокой доли потомков гибридных клеток в органах химерной мыши.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕ MF. ДИССЕРТАЦИИ.

1. Пузаков М.В.. Баттулин Н.Р.. Темирова С.А.. Матвеева Н.М.. Сердюкова H.A.. Графодатский A.C.. Серов О .Л. Анализ экспрессии родительских аллелей Xist и С1а в межвидовых эмбриональных гибридных клетках в условиях индуцированной in vitro инактивации Х-хромосом. // Онтогенез. 2007. T. 38. № 2. С. 1-8.

2. Vasilkova A.A.. Kizilova H.A.. Puzakov M.V.. Shilov A.G.. Zhelezova А.1.. Golubitsa A.N., Battulin N.R.. Vedernikov V.E.. Menzorov A.G.. Matveeva N.M.. Serov O.L. Dominant manifestation of pluripotency in embryonic stem cell hybrids with various numbers of somatic chromosomes. // Mol. Reprod. Dev. 2007 V.74(8). P.941-951.

3. Battulin N.R.. Pristyazhnvuk I.E.. Matveeva N.M.. Fishman V.S.. Vasilkova A.A.. Serov O.L. Allelic expression and DNA methylation profiles of promoters at the parental Oct4 and Nanog genes in Mus musculus ES ceMMus caroli spienocyte hybrid cells. // Cell Tissue Res. 2009 V.337 P. 439-448. DOI 10.1007/s00441-009-0835-5

4. Баттулин H.P.. Пузаков M.B. Анализ экспрессии родительских аллелей генов Nanog, Oct-4. Gla, Xist и Lmna в межвидовых гибридных клетках. // Материалы XLIV Международной научной студенческой конференции. Биология. Новосиб. гос. университет. Новосибирск. 2006. С. 112.

5. Василькова A.A., Кизилова Е.А.. Пузаков М.В.. Баттулин Н.Р.. Шилов А.Г.. Железова А.И., Голубица А.Н., Мензоров А.Г., Матвеева Н.М.. Серов O.J1. Полное доминирование эмбрионального генома в гибридных клетках индуцирует восстановление потенций (репрограммирование) дифференцированных клеток. // Материалы международной конференции «Фундаментальные науки -биотехнологии и медицине», Новосибирск, 2006. С. 16.

6. Пузаков М.В., Баттулин Н.Р., Серов О.Л. Изучение репрограммирования Х-хромосом спленоцитов в геноме эмбриональных гибридных клеток. // Цитология, 2006, Т. 48, № 9. С. 795.

7. Vasilkova А.А., Kizilova Н.А., Puzakov M.V., Shilov A.G., ZheJezova A.I., Goiubitsa A.N., Battulin N.R., Menzorov A.G., Matveeva N.M., Serov O.L. Developmental potential of embryonic stem cell hybrids does not depend on numbers of somatic chromosomes. // Proceedings of international scientific-practical interdisciplinary workshop "New technology in medicine and experimental biology" "IW + SDC'07", Pattaya-Bangkok, Thailand, 26 February - 08 March, 2007. P. 19.

8. Баттулин H.P., Юдина K.B., Пристяжнкж И.Е., Серов O.JI. Влияние соотношения гомеолопгчных хромосом на репрограммирование генов Nanog, Oct-4 и Lmna в межвидовых эмбриональных гибридных клетках. // Цитология, 2007, Т.49, №9. С. 714.

9. Юдина К.В., Баттулин Н.Р., Серов O.JI. Репрограммирование генов Nanog, Oct-4 и Lmna в межвидовых эмбриональных гибридных клетках. // Сборник-материалов международной молодежной научно-методической конференции "Проблемы молекулярной и клеточной биологии" 10-12 мая 2007 г., г.Томск, С. 193.

10. Василькова А.А., Кизилова Е.А., Пузаков М.В., Баттулин Н.Р., Шилов А.Г., Железова А.И., Голубица А.Н., Мензоров А.Г., Матвеева Н.М., Серов ОЛ. Полное доминирование эмбрионального генома в гибридных клетках индуцирует восстановление потенций (репрограммирование) дифференцированных клеток. // International conference "Basic Science for Biotechnology and Medicine" September 3 -7,2006, Novosibirsk, Russia, P. 16.

11. Nariman Battulin, N. Matveeva, O. Serov EXPRESSION AND METHYLATION STATUS OF PARENTAL ALLELES AT THE OCT4 AND NANOG LOCI IN Mus musculus ES - Mus caroli SPLENOCYTE CELL HYBRIDS. // Abstracts of papers presented at the LXXIII Cold Spring Harbor Symposium on Quantative Biologe CONTROL & REGULATION OF STEM CELLS May 28 - June 2, 2008, New York, USA, P. 20

12. Nariman R. Battulin, Inna E. Pristyazhnyuk, Natalia M. Matveeva and Oleg L. Serov Expression and methylation status of parental alleles at the Oct4 and Nanog loci in ES-splenocyte hybrid cell clones with different ratio of parental chromosomes. // BIT Life Sciences Iя Annual World Congress of Regenerative Medicine and Stem Cells December 2-4,2008, Foshan, China, P.139.

13. H.P. Баттулин, B.C. Фишман, H.M. Матвеева, ОJI. Серов Изменение метилирования ДНК при репрограммировании соматического генома в гибридных клетках. // V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, 21-27 июня 2009, Москва, С. 336.

14. O.JI. Серов, А.А. Круглова, Н.М. Матвеева, М.А. Гридина, Е.А. Кизилова, Н.Р. Баттулин Ранние стадии перепрограммирования фибробластов в гетеро- и синкарионах и при индукции в них плюрипотентности с помощью трансфекции векторами экспрессируюпщми Oct4ISox2 и NanoglLin28. II Тезисы докладов и сообщений, представленных на Всероссийский симпозиум по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий (Санкт-Петербург, 12-14 октября 2009 г.) Цитология, 2009, Т.51, №9. С. 785.

Подписано к печати 24.02.2010

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. л. 1. Уч. изд. 07.

Тираж 100 экз. Заказ 11.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Баттулин, Нариман Рашитович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Плюрипотенгность клеток и репрограммирование

1.2. Репрограммирование в нормальном развитии млекопитающих

1.2.1. Репрограммирование в раннем развитии млекопитающих

1.2.2. Репрограммирование в гаметогенезе

1.3. Методы экспериментального репрограммирования генома

1.3.1.Репрограммирование генома соматических клеток с помощью переноса соматических ядер в энуклеированные ооциты

1.3.2. Репрограммирование генома соматических клеток при образовании ИПС клеток

1.3.3. Репрограммирование генома при слиянии соматических и плюрипотентных клеток

1.3.3.1. Гибридные клетки типа клетка эмбриональной карциномы - соматическая клетка

1.3.3.2. Гибридные клетки типа эмбриональная терминальная клетка - соматическая клетка

1.3.3.3. Гибридные клетки типа эмбриональная стволовая клетка — соматическая клетка

1.4. Репрограммирование генома в гибридных клетках

1.5. Транскрипционные факторы — ключевые регуляторы плюрипотентного статуса клеток

1.6. Lamin А/С

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Клетки и клеточные линии

2.2. Выделение ДНК

2.3. Работа с РНК

2.3.1. Выделение РНК

2.3.2. Обработка РНК ДНКазой

2.3.3. Синтез кДНК

2.4. Полимеразная цепная реакция

2.5. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.6. Определение нуклеотидной последовательности ДНК

2.7. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.8. Бисульфитное секвенирование ДНК

2.8.1 Бисульфитная модификация ДНК

2.8.2. ПЦР с вложенными праймерами

2.8.3. Субклонирование фрагментов ДНК

2.9. Микробиологические методы

2.9.1. Приготовление компетентных клеток E.coli

2.9.2. Трансформация компетентных клеток E.coli

2.10. Выделение фрагментов ДНК из гелей

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Экспрессия генов - молекулярных маркеров плюрипотентности Oct! и Nanog в гибридных клетках

3.2. Экспрессия молекулярного маркера дифференцированных клеток гена Lmna в гибридных клетках

3.3. Поиск аллель-специфичных сайтов рестрикции для дискриминации транскриптов разного родительского происхождения

3.4. Экспрессия родительских аллелей гена Oct4 и Nanog в гибридных клетках

3.6. Определение последовательности 5'-регуляторных областей генов Oct4, Nanog и Lmna М. caroli

3.7. Анализ профилей метилирования 5'-регуляторной области гена Oct4 в ЭС клетках и спленоцитах

3.8. Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Oct4 в эмбриональных стволовых гибридных клетках

3.9. Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Oct4 в тератомах, полученных из эмбриональных стволовых гибридных клеток

3.10. Анализ профилей метилирования 5'-регуляторной области гена Nanog в ЭС клетках и спленоцитах

3.11. Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Nanog в эмбриональных стволовых гибридных клетках

3.12. Анализ профилей метилирования 5'-регуляторной области гена Lmna в ЭС клетках, фибробластах и эмбриональных стволовых гибридных клетках

3.13. Экспрессия тканеспецифичных генов соматического партнера в тканях взрослых химер

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессия эпиаллелей генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности, и тканеспецифичных генов в межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках"

Актуальность. Восстановление плюрипотентности в дифференцированных клетках и связанные с ним процессы репрограммирования генома являются одними из актуальных проблем современной биологии. Исследования, посвященные данной проблеме, помимо прикладных аспектов, таких как получение иммуносовместимых клеток для трансплантологического лечения различных заболеваний, тесно связаны с другими фундаментальными проблемами биологии (регуляция дифференциальной активности генов, регуляция процессов индивидуального развития и др.). В нормальном развитии эмбриональные клетки при дифференцировке теряют свой изначальный высокий потенциал - плюрипотентность, в результате чего специализированные клетки лишены способности к превращению в другие типы клеток. Долгое время считалось, что утрата плюрипотентности необратима, однако в опытах на амфибиях и млекопитающих было показано, что ядра дифференцированных клеток, взятых у взрослого животного, после пересадки в энуклеированные ооциты способны обеспечить полное развитие организма (Di Berardino, Orr, 1992; Wilmut et al, 1997; Wakayama et al, 1998). Эти данные показали, что ядра некоторых дифференцированных клеток могут быть репрограммированны цитоплазматическими факторами ооцита. На сегодняшний день, помимо метода переноса ядер, существует еще два метода репрограммирования клеток взрослого организма. Это метод слияния эмбриональных стволовых (ЭС) и дифференцированных клеток (Matveeva et al., 1998; Tada et al., 2003; Cowan et al., 2005; Ambrosi et al, 2007) и метод получения индуцированных плюрипотентных стволовых (ИПС) клеток, основанный на эктопической экспрессии небольшого числа транскрипционных факторов в культуре соматических клеток (Takahashi, Yamanaka, 2006; Maherali et al, 2007; Okita et al, 2007; Wernig et al, 2007). Обе технологии показали высокую эффективность репрограммирования геномов многих типов дифференцированных клеток от фибробластов до В- и Т-лимфоцитов (Hong et al., 2009). Каждый из методов экспериментального репрограммирования клеток имеет свои преимущества и ограничения. Исследование молекулярных механизмов репрограммирования в гибридных клетках предоставляет более широкие возможности, нежели метод переноса ядер в энуклеированные ооциты, поскольку имеется возможность собрать достаточное для анализа количество материала. В отличие от получения ИПС клеток, ЭС клетки при слиянии содержат все необходимые для правильного репрограммирования факторы, в том числе и неидентифицированные. Однако после объединения геномов родительских клеток в ядре гибридной клетки, становится сложно следить за изменениями генной активности и эпигенетических модификаций геномов плюрипотентной и дифференцированной клеток.

Попытка использовать ЭС клетки для репрограммирования генома дифференцированных клеток была впервые предпринята в 1996 году. С этой целью плюрипотентные ЭС клетки мыши были слиты со спленоцитами, клетками селезенки, взрослого животного. Полученные в этом эксперименте клеточные гибриды обладали плюрипотентными свойствами, сопоставимыми со свойствами ЭС клеток (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al, 1998). Позднее эти данные получили подтверждение при анализе гибридов, полученных от слияния ЭС клеток с тимоцитами (Tada et al., 2001; Tada et al, 2003), незрелыми клетками-предшественниками гемопоэза (Terada et al., 2002) и нейрогенеза (Ying et al., 2002). При слиянии ЭС клеток человека с фибробластами человека, также отмечается высокий уровень плюрипотентности гибридных клеток, сходный с потенциалом родительских ЭС клеток (Cowan et al., 2005). Высокий потенциал эмбриональных стволовых гибридных клеток подразумевает доминирование плюрипотентности - ключевого свойства ЭС клеток. Тот факт, что в гибридах типа ЭС клетка - дифференцированная клетка проявляются лишь свойства плюрипотентного партнера, предполагает репрограммирование генома соматического партнера. Однако прямых доказательств этого на сегодняшний день не так много. Свидетельства репрограммирования эпиаллелей соматического партнера (эпиаллелями называются аллели, дифференциальная активность которых обусловлена различием эпигенетических модификаций, приобретенных в процессе индивидуального развития) были найдены в гибридах, полученных от слияния ЭС клеток Mus musculus domesticus и тимоцитов М. musculus molossinus (Tada et al., 2001; Tada et al, 2003; Hatano et al, 2005). Указанием на масштабное репрограммирование генома соматического партнера могут служить данные, полученные с помощью полногеномного анализа транскрипции в гибридных клетках типа ЭС клетка -фибробласт (Cowan et al., 2005; Ambrosi et al, 2007). В этих работах было показано, что по профилю генной активности гибридные клетки сильно отличаются от фибробластов, но имеют сходство с ЭС клетками. Тем не менее, в этих исследованиях отсутствуют прямые доказательства репрограммирования соматического генома в гибридных клетках, поскольку авторы не имели возможности различать аллели разного родительского происхождения.

В исследованиях последних лет были определены транскрипционные факторы, ответственные за поддержание плюрипотентности ЭС клеток и клеток ранних эмбрионов млекопитающих. В настоящее время считается, что ключевыми звеньями сложной генной сети, регулирующей плюрипотентный статус, являются гены Oct4, Nanog и Sox2 (Chambers, Smith, 2004). Показано, что эти гены играют важную роль и в процессах репрограммирования соматических клеток (Takahashi, Yamanaka, 2006; Takahashi et al, 2007), так эктопической экспрессии фактора Oct4 достаточно для превращения нервной клетки в плюрипотентную (Kim et ah, 2009), а неполная реактивация гена Oct4 соматического ядра приводит к гибели клонированных эмбрионов мыши на ранних стадиях развития (Yamazaki et al, 2006). Поэтому большое внимание уделяется изучению процессов, сопровождающих реактивацию «генов плюрипотентности», таких как Oct4 и Nanog, при репрограммировании геномов дифференцированных клеток. Важная роль в регуляции активности этих генов отводится эпигенетическим модификациям генома, таким как метилирование ДНК и модификации гистонов.

Необходимым условием репрограммирования генома является не только активация «генов плюрипотентности», но также и подавление активности тканеспецифичных генов, активных в дифференцированных клетках. К такой категории генов, экспрессия которых характерна для всех типов дифференцированных клеток, относится ген белка ядерной ламины - lamin А/С (Lmna) (Constantinescu et al., 2006). На сегодняшний день не опубликовано работ, в которых исследовалась бы экспрессия этого гена в процессе репрограммирования дифференцированных клеток.

В связи с необходимостью различать аллели родительских геномов при исследовании процессов репрограммирования, особый интерес представляют межвидовые гибридные клетки. В лаборатории генетики развития Института цитологии и генетики СО РАН были получены межвидовые гибриды от слияния плюрипотентных ЭС клеток Mus musculus и спленоцитов близкого вида мыши М. caroli. Полученныеклоны гибридных клеток, кариотип которых детально описан (Matveeva et al., 2005; Пристяжнюк и др., 2005), имеют фенотип и ростовые характеристики, сходные с ЭС клетками. Межвидовая вариабельность гомологичных последовательностей ДНК позволяет надежно различать аллели плюрипотентного и соматического партнеров в гибридных клетках. Благодаря этому появилась возможность изучения молекулярных механизмов репрограммирования генома соматической клетки и интерпретации полученных данных в соответствии с общим хромосомным составом гибридных клеток и присутствием хромосом соматического партнера.

Цели и задачи исследования

Цель работы заключалась в оценке репрограммирования генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности, а также гена Lmna, экспрессия которого характерна всех типов дифференцированных клеток, в межвидовых гибридных клетках, полученных слиянием ЭС клеток Mus musculus и спленоцитов Mus caroli. А также в оценке репрограммирования тканеспецифичных генов при дифференцировке гибридных клеток в составе химерного животного.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить первичную структуру фрагментов генов Oct4 и Nanog М. caroli и провести поиск видоспецифичных сайтов узнавания рестриктаз, позволяющих различать видовую принадлежность транскриптов этих генов в гибридных клетках.

3. Определить первичную структуру 5'-регуляторных областей генов Oct4, Nanog и Lmna М. caroli.

4. Провести сравнительный анализ метилирования 5-регуляторных областей эпиаллелей генов Oct4, Nanog и Lmna в межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках.

5. Провести сравнительный анализ метилирования 5-регуляторной области эпиаллелей гена Oct4 при дифференцировке эмбриональных стволовых гибридных клеток в условиях in vivo (формирование тератом).

Научная новизна.

2. Впервые исследовано метилирование 5'-регуляторной области гена Oct4 в тератомах, развившихся из эмбриональных стволовых гибридных клеток. Показано, что диффернцировка гибридных клеток сопровождается гиперметилированием 5-регуляторной области гена Oct4, уровни метилирования родительских аллелей не различаются.

3. Получены новые данные о метилировании 5'-ре1уляторной области гена Lmna в ЭС клетках и фибробластах мыши. Показано, что метилирование района от -300 п.н. до -94 п.н. гена Lmna (относительно первого кодона) поддерживается на одном уровне вне зависимости от того, находится ли ген в активном или репрессированном состоянии.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на XLIV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2006 г.), на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск, 2007 г.), на международной конференции 1st Annual World Congress of Regenerative Medicine and Stem Cells (Фошань, Китай, 2008 г.), на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009 г.).

По теме диссертации опубликованы 3 работы. Две - в рецензируемых зарубежных журналах и одна — в рецензируемом отечественном журнале.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. В работе использованы: гибридные клетки серии НМС, полученные Н.М. Матвеевой, тератомы, полученные А.А. Васильковой, и химерная мышь № 6-17, полученная Е.А. Кизиловой.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 103-х страницах, иллюстрирована 18-ю рисунками и содержит 4 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Баттулин, Нариман Рашитович

ВЫВОДЫ

1. Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в межвидовых гибридных клетках, полученных слиянием ЭС клеток М. musculus и спленоцитов М. caroli, показал, что эпиаллели генов Oct4 и Nanog спленоцита реактивируются, что является одним из признаков процесса репрограммирования генома спленоцита.

2. Реактивация эпиаллелей генов Oct4 и Nanog спленоцита в эмбриональных стволовых гибридных клетках сопроволсдается деметилированием 5'-регуляторной области этих генов до уровня, характерного для 5'-регуляторной области Oct4 и Nanog в ЭС клетках. Полученные данные свидетельствуют о том, что репрограммирование генома дифференцированной клетки сопровождается изменением эпигенетического статуса генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности.

3. При дифференцировке эмбриональных стволовых гибридных в тератомах, образовавшихся в местах введения гибридных клеток иммунодефицитным мышам, происходит гиперметилирование 5'-регуляторпой области гена Oct4, причем уровни метилирования эпиаллелей спленоцита и ЭС клетки не имели существенных различий.

4. Исследование экспрессии гена Lmna, а также уровня метилирования его 5'-регуляторной области в ЭС клетках, фибробластах и эмбриональных гибридных клетках показало, что экспрессия эпиаллеля гена Lmna спленоцита подавляется в гибридных клетках, причем это подавление не связано с изменением метилирования 5'-регуляторной области тепа Lmna.

5. Исследование экспрессии тканеспецифичных генов Alb, Bdh2, Ager, Des, Nefh и Cdx2 в органах взрослой химерной мыши, полученной введениемгибридных клеток клона НМС29-3 в бластоцисты мышей линии C57BL, показало, что эпиаллель гена Des спленоцита экспрессируется тканеспецифичным образом в тонком кишечнике химерной мыши. Активность эпиаллелей генов Alb, Bdh2, Ager, Nefh и Cdx2 спленоцита не была выявлена, по-видимому, из-за невысокой доли потомков гибридных клеток в органах химерной мыши.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Баттулин, Нариман Рашитович, Новосибирск

1. Матвеева Н.М., Шилов А.Г., Байбородин С.И., Филимоненко В.В., Ролинская И.В., Серов O.JI. Гибриды между эмбриональными и соматическими клетками мыши сохраняют плюрипотентность // Докл. РАН. 1996. V. 249. № 1. Р. 129132.

2. Пристяжнюк И.Е., Темирова С.А., Мензоров А.Г, Круглова А.А., Матвеева Н.М., Серов O.JI. Видимая и «скрытая» сегрегация родительских хромосом в эмбриональных стволовых гибридных клетках // Онтогенез. 2005. Y. 36. № 2. Р. 150-157.

3. Пузаков М.В. Оценка плюрипотентности клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток и спленоцитов мыши : автореферат дис. кандидата биологических наук : 03.00.15. М.: 2007. С.

4. Jakob Н., Boon Т., Gaillard J., Nicolas J., Jacob F. Teratocarcinoma of the mouse: isolation, culture and properties of pluripotential cells. // Ann. Microbiol. (Paris). 1973. V. 124. № 3. P. 269-282.

5. Ambrosi D.J., Tanasijevic В., Kaur A., Obergfell C., O'Neill R.J., Krueger W., Rasmussen T.P. Genome-wide reprogramming in hybrids of somatic cells and embiyonic stem cells // Stem Cells. 2007. V. 25. № 5. P. 1104-1113.

6. Andrews P.W., Goodfellow P.N. Antigen expression by somatic cell hybrids of a murine embryonal carcinoma cell with thymocytes and L cells // Somatic Cell Genet. 1980. V. 6. №2. P. 271-284.

7. Aoi Т., Yae К., Nakagawa M., Ichisaka Т., Okita K.5 Takahashi К., Chiba Т., Yamanaka S. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells // Science. 2008. V. 321. № 5889. P. 699-702.

8. Artzt K., Jacobs-Cohen R.J., DiMeo A., Alton A.K., Darlington G. Reexpression of a T/t-complex antigen (tl2) in thymocyte x embryonal carcinoma cell hybrids // Somatic Cell Genet. 1981. V. 7. № 4. P. 423-434.

9. Atsumi Т., Shirayoshi Y., Takeichi M., Okada T.S. Nullipotent teratocarcinoma cells acquire the pluripotency for differentiation by fusion with somatic cells // Differentiation. 1982. V. 23. № 1. P. 83-86.

10. Avilion A.A., Nicolis S.K., Pevny L.H., Perez L., Vivian N., Lovell-Badge R. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function // Genes Dev. 2003. V. 17. № 1. p. 126-140.

11. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory // Genes Dev. 2002. V. 16. № 1. P. 6-21.

12. Briggs R., King T.J. Transplantation of Living Nuclei From Blastula Cells into Enucleated Frogs' Eggs // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1952. V. 38. № 5. P. 455463.

13. Caiafa P., Zampieri M. DNA methylation and chromatin structure: the puzzling CpG islands // J Cell Biochem. 2005. Y. 94. № 2. P. 257-265.

14. Campbell K.H., Alberio R., Choi I., Fisher P., Kelly R.D., Lee J.H., Maalouf W. Cloning: eight years after Dolly // Reprod. Domest. Anim. 2005. V. 40. № 4. P. 256268.

15. Campbell K.H., McWhir J., Ritchie W.A., Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line //Nature. 1996. V. 380. № 6569. P. 64-66.

16. Chambers I., Colby D., Robertson M., Nichols J., Lee S., Tweedie S., Smith A. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells // Ceil. 2003. V. 113. № 5. P. 643-655.

17. Chambers I., Smith A. Self-renewal of teratocarcinoma and embryonic stem cells // Oncogene. 2004. V. 23. № 43. P. 7150-7160.

18. Chapman V., Forrester L., Sanford J., Hastie N., Rossant J. Cell lineage-specific undermethylation of mouse repetitive DNA//Nature. 1984. V. 307. № 5948. P. 284286.

19. Clark S.J., Harrison J., Paul C.L., Frommer M. High sensitivity mapping of methylated cytosines // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. № 15. P. 2990-2997.

20. Constantinescu D., Gray H.L., Sammak P.J., Schatten G.P., Csoka A.B. Lamin А/С expression is a marker of mouse and human embryonic stem cell differentiation // Stem Cells. 2006. V. 24. № 1. P. 177-185.

21. Cowan C.A., Atienza J., Melton D.A., Eggan K. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells // Science. 2005. V. 309. № 5739. P. 1369-1373.

22. Darr H., Mayshar Y., Benvenisty N. Overexpression of NANOG in human ES cells enables feeder-free growth while inducing primitive ectoderm features // Development. 2006. V. 133. № 6. P. 1193-1201.

23. Davis R.L., Weintraub H., Lassar A.B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts // Cell. 1987. V. 51. № 6. P. 987-1000.

24. Di Berardino M.A., Orr N.H. Genomic potential of erythroid and leukocytic cells of Rana pipiens analyzed by nuclear transfer into diplotene and maturing oocytes // Differentiation. 1992. V. 50. № 1. P. 1-13.

25. Do J.T., Scholer H.R. Comparison of neurosphere cells with cumulus cells after fusion with embryonic stem cells: reprogramming potential // Reprod. Fertil. Dev. 2005. V. 17. № 1-2. P. 143-149.

26. Do J.T., Scholer H.R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells // Stem Cells. 2004. V. 22. № 6. P. 941-949.

27. Eggan K., Baldwin K., Tackett M., Osborne J., Gogos J., Chess A., Axel R., Jaenisch R. Mice cloned from olfactory sensory neurons // Nature. 2004. V. 428. № 6978. P. 44-49.

28. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos // Nature. 1981. V. 292. № 5819. P. 154-156.

29. Farthing C.R., Ficz G., Ng R.K., Chan C.F., Andrews S., Dean W., Hemberger M., Reik W. Global mapping of DNA methylation in mouse promoters reveals epigenetic reprogramming of pluripotency genes // PLoS Genet. 2008. V. 4. № 6. P. elOOOl 16.

30. Forejt J., Gregorova S., Dohnal K., Nosek J. Gene expression of differentiated parent in teratocarcinoma cell hybrids. Repression or reprogramming? // Cell Differ. 1984. V. 15. № 2-4. P. 229-234.

31. Fry C.J., Peterson C.L. Chromatin remodeling enzymes: who's on first? // Curr Biol. 2001. V. 11. № 5. P. R185-197.

32. Fujimori Т., Kurotaki Y., Miyazaki J., Nabeshima Y. Analysis of cell lineage in two-and four-cell mouse embryos // Development. 2003. V. 130. № 21. P. 5113-5122.

33. Fulka H., Mrazek M., Tepla.O., Fulka J., Jr. DNA methylation pattern in human zygotes and developing embryos // Reproduction. 2004. V. 128. № 6. P. 703-708.

34. Gidekel S., Bergman Y. A unique developmental pattern of Oct-3/4 DNA methylation is controlled by a cis-demodification element // J Biol Chem. 2002. V. 277. № 37. P. 34521-34530.

35. Gurdon J.B. The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles // J. Embryol. Exp. Morphol. 1962. V. 10. № P. 622-640.

36. Hajkova P., Erhardt S., Lane N., Haaf Т., El-Maarri O., Reik W., Walter J., Surani M.A. Epigenetic reprogramming in mouse primordial germ cells // Mech Dev. 2002. V. 117. № 1-2. P. 15-23.

37. Hanna L.A., Foreman R.K., Tarasenko I.A., Kessler D.S., Labosky P.A. Requirement for Foxd3 in maintaining pluripotent cells of the early mouse embryo // Genes Dev. 2002. V. 16. № 20. P. 2650-2661.

38. Hansis C., Grifo J.A., Krey L.C. Oct-4 expression in inner cell mass and trophectoderm of human blastocysts // Mol Hum Reprod. 2000. V. 6. № 11. P. 9991004.

39. Harborth J., Elbashir S.M., Bechert K., Tuschl Т., Weber K. Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs // J Cell Sci. 2001. V. 114. № Pt 24. P. 4557-4565.

40. Hart A.H., Hartley L., Ibrahim M., Robb L. Identification, cloning and expression analysis of the pluripotency promoting Nanog genes in mouse and human // Dev Dyn. 2004. V. 230. № 1. P. 187-198.

41. Hatano S.Y., Tada M., Kimura H., Yamaguchi S., Kono Т., Nakano Т., Suemori H., Nakatsuji N., Tada T. Pluripotential competence of cells associated with Nanog activity // Mech Dev. 2005. V. 122. № 1. P. 67-79.

42. Hattori N., Imao Y., Nishino K., Ohgane J., Yagi S., Tanaka S., Shiota K. Epigenetic regulation of Nanog gene in embryonic stem and trophoblast stem cells // Genes Cells. 2007. V. 12. № 3. P. 387-396.

43. Hattori N., Nishino К., Ко Y.G., Ohgane J., Tanaka S., Shiota K. Epigenetic control of mouse Oct-4 gene expression in embryonic stem cells and trophoblast stem cells // J Biol Chem. 2004. V. 279. № 17. P. 17063-17069.

44. Hay D.C., Sutherland L., Clark J., Burdon T. Oct-4 knockdown induces similar patterns of endoderm and trophoblast differentiation markers in human and mouse embryonic stem cells // Stem Cells. 2004. V. 22. № 2. P. 225-235.

45. Hochedlinger K., Jaenisch R. Monoclonal mice generated by nuclear transfer from mature В and T donor cells // Nature. 2002. V. 415. № 6875. P. 1035-1038.

46. Hong H., Takahashi K., Ichisaka Т., Aoi Т., Kanagawa O., Nakagawa M., Okita K., Yamanaka S. Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway // Nature. 2009. V. 460. № 7259. P. 1132-1135.

47. Howell C.Y., Bestor Т.Н., Ding F., Latham K.E., Mertineit C., Trasler J.M., Chaillet J.R. Genomic imprinting disrupted by a maternal effect mutation in the Dnmtl gene // Cell. 2001. V. 104. № 6. P. 829-838.

48. Howlett S.K., Reik W. Methylation levels of maternal and paternal genomes during preimplantation development//Development. 1991. V. 113. № l.P. 119-127.

49. Huangfu D., Osafune K., Maehr R., Guo W., Eijkelenboom A., Chen S., Muhlestein W., Melton D.A. Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2 // Nat Biotechnol. 2008. V. 26. № 11. P. 1269-1275.

50. Illmensee K., Mintz B. Totipotency and normal differentiation of single teratocarcinoma cells cloned by injection into blastocysts // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1976. V. 73. № 2. P. 549-553.

51. Inoue К., Wakao H., Ogonukl N., Miki H., Seino K., Nambu-Wakao R., Noda S., Miyoshi H., Koseki H., Taniguchi M., Ogura A. Generation of cloned mice by direct nuclear transfer from natural killer T cells // Curr. Biol. 2005. V. 15. № 12. P. 11141118.

52. Jaenisch R., Bird A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals // Nat Genet. 2003. V. 33 Suppl. № P. 245-254.

53. Johnson M.H., McConnell J.M. Lineage allocation and cell polarity during mouse embryogenesis // Semin Cell Dev Biol. 2004. V. 15. № 5. P. 583-597.

54. Kehler J., Tolkunova E., Koschorz В., Pesce M., Gentile L., Boiani M., Lomeli H., Nagy A., McLaughlin K.J., Scholer H.R., Tomilin A. Oct4 is required for primordial germ cell survival // EMBO Rep. 2004. V. 5. № 11. P. 1078-1083.

55. Kimura H., Tada M., Nakatsuji N., Tada T. Histone code modifications on pluripotential nuclei of reprogrammed somatic cells // Mol Cell Biol. 2004. V. 24. № 13. P. 5710-5720.

56. Kirchhof N., Carnwath J.W., Lemme E., Anastassiadis K., Scholer H., Niemann H. Expression pattern of Oct-4 in preimplantation embryos of different species // Biol Reprod. 2000. V. 63. № 6. P. 1698-1705.

57. Kleinsmith L.J., Pierce G.B.," Jr. Multipotentiality of Single Embryonal Carcinoma Cells // Cancer Res. 1964. V. 24. № P. 1544-1551.

58. Kohda Т., Inoue К., Ogonuki N., Miki H., Naruse M., Kaneko-Ishino Т., Ogura A., Ishino F. Variation in gene expression and aberrantly regulated chromosome regions in cloned mice // Biol. Reprod. 2005. V. 73. № 6. P. 1302-1311.

59. Lachner M., O'Sullivan R.J., Jenuwein T. An epigenetic road map for histone lysine methylation // J Cell Sci. 2003. V. 116. № Pt 11. P. 2117-2124.

60. Laiosa C.V., Stadtfeld M., Xie H., de Andres-Aguayo L., Graf T. Reprogramming of committed T cell progenitors to macrophages and dendritic cells by C/EBP alpha and PU.l transcription factors // Immunity. 2006. V. 25. № 5. P. 731-744.

61. Lammerding J., Schulze P.C., Takahashi Т., Kozlov S., Sullivan Т., Kamm R.D., Stewart C.L., Lee R.T. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction // J Clin Invest. 2004. V. 113. № 3. P. 370-378.

62. Lane N., Dean W., Erhardt S., Hajkova P., Surani A., Walter J., Reik W. Resistance of IAPs to methylation reprogramming may provide a mechanism for epigenetic inheritance in the mouse // Genesis. 2003. V. 35. № 2. P. 88-93.

63. Lee J., Inoue K., Ono R., Ogonuki N., Kohda Т., Kaneko-Ishino Т., Ogura A., Ishino F. Erasing genomic imprinting memory in mouse clone embryos produced from day 11.5 primordial germ cells //Development. 2002. V. 129. № 8. P. 1807-1817.

64. Li J., Ishii Т., Feinstein P., Mombaerts P. Odorant receptor gene choice is reset by nuclear transfer from mouse olfactory sensory neurons // Nature. 2004. V. 428. № 6981. P. 393-399.

65. Lowry W.E., Richter L., Yachechko R., Pyle A.D., Tchieu J., Sridharan R., Clark А.Т., Plath K. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts // Proc Natl Acad Sci USA. 2008. V. 105. № 8. P. 2883-2888.

66. Mali P., Ye Z., Hommond H.H., Yu X., Lin J., Chen G., Zou J., Cheng L. Improved efficiency and pace of generating induced pluripotent stem cells from human adult and fetal fibroblasts // Stem Cells. 2008. V. 26. № 8. P. 1998-2005.

67. Marikawa Y., Fujita T.C., Al'arcon V.B. Heterogeneous DNA methylation status of the regulatory element of the mouse Oct4 gene in adult somatic cell population // Cloning Stem Cells. 2005. V. 7. № 1. P. 8-16.

68. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1981. V. 78. № 12. P. 7634-7638.

69. Matsui Y., Zsebo K., Hogan B.L. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture // Cell. 1992. V. 70. № 5. P. 841-847.

70. Matveeva N.M., Pristyazhnyuk I.E., Temirova S.A., Menzorov A.G., Vasilkova A., Shilov A.G., Smith A., Serov O.L. Unequal segregation of parental chromosomes in embryonic stem cell hybrids // Mol Reprod Dev. 2005. V. 71. № 3. P. 305-314.

71. Mayer W., Niveleau A., Walter J., Fundele R., Haaf T. Demethylation of the zygotic paternal genome //Nature. 2000. V. 403. № 6769. P. 501-502.

72. McBurney M.W., Featherstone M.S., Kaplan H. Activation of teratocarcinoma-derived hemoglobin genes in teratocarcinoma-Friend cell hybrids // Cell. 1978. V. 15. №4. P. 1323-1330. .

73. Memili E., First N.L. Zygotic and embryonic gene expression in cow: a review of timing and mechanisms of early gene expression as compared with other species // Zygote. 2000. V. 8. № 1. P. 87-96.

74. Miller R.A., Ruddle F.H. Pluripotent teratocarcinoma-thymus somatic cell hybrids // Cell. 1976. V. 9. № 1. P. 45-55.

75. Miller R.A., Ruddle F.H. Properties of teratocarcinoma-thymus somatic cell hybrids // Somatic Cell Genet. 1977. V. 3. № 3. P. 247-261.

76. Mitalipov S.M., Kuo H.C., Hennebold J.D., Wolf D.P. Oct-4 expression in pluripotent cells of the rhesus monkey // Biol Reprod. 2003. V. 69. № 6. P. 17851792.

77. Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H., Segawa K., Murakami M., Takahashi K., Maruyama M., Maeda M., Yamanaka S. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells // Cell. 2003. V. 113. № 5. P. 631-642.

78. Monk M., Holding C. Human embryonic genes re-expressed in cancer cells // Oncogene. 2001. V. 20. № 56. P. 8085-8091.

79. Moreira P.N., Robl J.M., Collas P. Architectural defects in pronuclei of mouse nuclear transplant embryos // J. Cell Sci. 2003. V. 116. № Pt 18. P. 3713-3720.

80. Nichols J., Zevnik В., Anastassiadis K., Niwa H., Klewe-Nebenius D., Chambers I., Scholer H., Smith A. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4 // Cell. 1998. V. 95. № 3. P. 379-391.

81. Niwa H., Miyazaki J., Smith A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells // Nat Genet. 2000. V. 24. № 4. P. 372-376.

82. Nordhoff V., Hubner K., Bauer A., Orlova I., Malapetsa A., Scholer H.R. Comparative analysis of human, bovine, and murine Oct-4 upstream promoter sequences // Mamm Genome. 2001. V. 12. № 4. P. 309-317.

83. Nutt S.L., Heavey В., Rolink A.G., Busslinger M. Commitment to the B-lymphoid lineage depends on the transcription factor Pax5 // Nature. 1999. V. 401. № 6753. P. 556-562.

84. Okamoto I., Otte 'A.P., Allis ;C.D., Reinberg D., Heard E. Epigenetic dynamics of imprinted X inactivation during early mouse development // Science. 2004. V. 303. № 5658. P. 644-649.

85. Okita K., Ichisaka Т., Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells // Nature. 2007. V. 448. № 7151. P. 313-317.

86. Olek A., Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint // Nat Genet. 1997. V. 17. № 3. P. 275-276.

87. Ovitt C.E., Scholer H.R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo //Mol HumReprod. 1998. V. 4. № 11. P. 1021-1031.

88. Park I.H., Arora N., Huo H., Maherali N., Ahfeldt Т., Shimamura A., Lensch M.W., Cowan C., Hochedlinger K., Daley G.Q. Disease-specific induced pluripotent stem cells // Cell. 2008. V. 134. № 5. P. 877-886.

89. Pells S., Di Domenico A.I., Gallagher E.J., McWhir J. Multipotentiality of neuronal cells after spontaneous fusion with embryonic stem cells and nuclear reprogramming in vitro // Cloning Stem Cells. 2002. V. 4. № 4. P. 331-338.

90. Pesce M., Anastassiadis K., Scholer H.R. Oct-4: lessons of totipotency from embryonic stem cells // Cells Tissues Organs. 1999. V. 165. № 3-4. P. 144-152.

91. Reik W., Santos F., Mitsuya K., Morgan H., Dean W. Epigenetic asymmetry in the mammalian zygote and early embiyo: relationship to lineage commitment? // Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. 2003. V. 358. № 1436. P. 1403-1409; discussion 1409.

92. Reik W., Walter J. Evolution of imprinting mechanisms: the battle of the sexes begins in the zygote //Nat Genet. 2001. V. 27. № 3. P. 255-256.

93. Rollins R.A., Haghighi F., Edwards J.R., Das R., Zhang M.Q., Ju J., Bestor Т.Н. Large-scale structure of genomic methylation patterns // Genome Res. 2006. V. 16. №2. P. 157-163.

94. Rougier N., Bourc'his D., Gomes D.M., Niveleau A., Plachot M., Paldi A., Viegas-Pequignot E. Chromosome methylation patterns during mammalian preimplantation development// Genes Dev. 1998. V. 12. № 14. P. 2108-2113.

95. Rousset J.P., Bucchini D., Jami J. Hybrids between F9 nullipotent teratocarcinoma and thymus cells produce multidifferentiated tumors in mice // Dev. Biol. 1983. V. 96. №2. P. 331-336.

96. Rousset J.P., Dubois P., Lasserre C., Aviles D., Fellous M., Jami J. Phenotype and surface antigens of mouse teratocarcinoma x fibroblast cell hybrids // Somatic Cell Genet. 1979. V. 5. № 6. P. 739-752.

97. Santos F., Hendrich В., Reik W., Dean W. Dynamic reprogramming of DNA methylation in the.early mouse embryo // Dev Biol. 2002. V. 241. № 1. P. 172-182.

98. Schaap G.H., Devilee P., van Klaveren P., Jongkind J.F. Gene expression in flow sorted mouse teratocarcinoma X human fibroblast heterokaryons // Differentiation. 1984. V. 26. № 2. P. 127-133.

99. Scholer H.R. Octamania: the POU factors in murine development // Trends Genet. 1991. V. 7. № 10. P. 323-329.

100. Senda S., Wakayama Т., Yamazaki Y., Ohgane J., Hattori N., Tanaka S., Yanagimachi R., Shiota K. Skewed X-inactivation in cloned mice II Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 321. № 1. P. 38-44.

101. Serov O.L., Zhdanova N.S., Pack S.D., Lavrentieva M.V., Shilov A.G., Rivkin M.I., Matyakhina L.D., Draber P., Kerkis A.Y., Rogozin I.B., et al. The mink X chromosome: organization and inactivation// Prog. Clin. Biol. Res. 1990. V. 344. № P. 589-618.

102. Shiota K. DNA methylation profiles of CpG islands for cellular differentiation and development in mammals // Cytogenet Genome Res. 2004. V. 105. № 2-4. P. 325334.

103. Smith A.G. Embryo-derived stem cells: of mice and men // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2001. V. 17. № P. 435-462.

104. Stadtfeld M., Brennand K., Hochedlinger K. Reprogramming of pancreatic beta cells into induced pluripotent stem cells // Curr Biol. 2008. V. 18. № 12. P. 890-894.

105. Sumi Т., Tsuneyoshi N., Nakatsuji N., Suemori H. Apoptosis and differentiation of human embryonic stem cells induced by sustained activation of c-Myc // Oncogene. 2007. V. 26. № 38. P. 5564-5576.

106. Szabo P.E., Hubner К., Scholer H., Mann J.R. Allele-specific expression of imprinted genes in mouse migratory primordial germ cells // Mech Dev. 2002. V. 115. № 1-2. P. 157-160.

107. Tada M., Morizane A., Kimura H., Kawasaki H., Ainscough J.F., Sasai Y., Nakatsuji N., Tada T. Pluripotency of reprogrammed somatic genomes in embryonic stem hybrid cells // Dev. Dyn. 2003. V. 227. № 4. P. 504-510.

108. Tada M., Tada Т., Lefebvre L., Barton S.C., Surani M.A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells // EMBO J. 1997. V. 16. № 21. P. 6510-6520.

109. Tada M., Takahama Y., Abe K., Nakatsuji N., Tada T. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells // Curr. Biol. 2001. V. 11. № 19. P.1553-1558.

110. Takagi N. De novo X-chromosome inactivation in somatic hybrid cells between the XO mouse embryQnal carcinoma cell and XY rat lymphocyte // Exp. Cell Res. 1983. V. 145. № 2. P. 397-404.

111. Takagi N. Requirement of mitoses for the reversal of X-inactivation in cell hybrids between murine embryonal carcinoma cells and normal female thymocytes // Exp. Cell Res. 1988. V. 175. № 2. P. 363-375.

112. Takagi N. Variable X chromosome inactivation patterns in near-tetraploid murine EC x somatic cell hybrid cells differentiated in vitro // Genetica. 1993. V. 88. № 2-3. P. 107-117.

113. Takagi N., Yoshida M.A., Sugawara O., Sasaki M. Reversal of X-inactivation in female mouse somatic cells hybridized with murine teratocarcinoma stem cells in vitro // Cell. 1983. V. 34. № 3. P. 1053-1062.

114. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., Narita M., Ichisaka Т., Tomoda K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors // Cell. 2007. V. 131. № 5. P. 861-872.

115. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors // Cell. 2006. V. 126. № 4. P. 663-676.

116. Terada N., Hamazaki Т., Oka M., Hoki M., Mastalerz D.M., Nakano Y., Meyer E.M., Morel L., Petersen B.E., Scott E.W. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion //Nature. 2002. V. 416. № 6880. P. 542-545.

117. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marshall V.S. Jones J.M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998. V. 282. № 5391. P. 1145-1147.

118. Utikal J., Polo J.M., StadtfelcLM., Maherali N., Kulalert W., Walsh R.M., Khalil A., Rheinwald J.G., Hochedlinger K. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells // Nature. 2009. V. 460. № 7259. P. 11451148.

119. Wakayama Т., Perry A.C., Zuccotti M., Johnson K.R., Yanagimachi R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei // Nature. 1998. V. 394. № 6691. P. 369-374.

120. Wang R.Y., Gehrke C.W., Ehrlich M. Comparison of bisulfite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues // Nucleic Acids Res. 1980. V. 8. № 20. P. 4777-4790.

121. Wang S.H., Tsai M.S., Chiang M.F., Li H. A novel NK-type homeobox gene, ENK (early embryo specific NK), preferentially expressed in embryonic stem cells // Gene Expr Patterns. 2003. V. 3. № 1. P. 99-103.

122. Weber M., Hellmann I., Stadler M.B., Ramos L., Paabo S., Rebhan M., Schubeler D. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome // Nat Genet. 2007. V. 39. № 4. P. 457-466.

123. Wernig M., Meissner A., Foreman R., Brambrink Т., Ku M., Hochedlinger K., Bernstein B.E., Jaenisch R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state //Nature. 2007. V. 448. № 7151. P. 318-324.

124. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J., Kind A.J., Campbell K.H. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells // Nature. 1997. V. 385. № 6619. P. 810-813.

125. Xie H., Ye M., Feng R., Graf T. Stepwise reprogramming of В cells into macrophages // Cell. 2004. V. 117. № 5. p. 663-676.

126. Yamanaka S. Elite and stochastic models for induced pluripotent stem cell generation //Nature. 2009. V. 460. № 7251. P. 49-52.

127. Yamazaki Y., Fujita T.C., Low E.W., Alarcon V.B., Yanagimachi R., Marikawa Y. Gradual DNA demethylation of the Oct4 promoter in cloned mouse embryos // Mol Reprod Dev. 2006. V. 73. № 2. P. 180-188.

128. Yasuda S.Y., Tsuneyoshi N., Sumi Т., Hasegawa K., Tada Т., Nakatsuji N., Suemori H. NANOG maintains self-renewal of primate ES cells in the absence of a feeder layer // Genes Cells. 2006. V. 11. № 9. P. 1115-1123.

129. Yeom Y.I., Fuhrmann G., Ovitt C.E., Brehm A., Ohbo K., Gross M., Hubner K., Scholer H.R. Germline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells //Development. 1996. V. 122. № 3. P. 881-894.

130. Ying Q.L., Nichols J., Evans E.P., Smith A.G. Changing potency by spontaneous fusion //Nature. 2002. V. 416. № 6880. P. 545-548.

131. Yu J., Vodyanik M.A., He P., Slukvin, П, Thomson J.A. Human embryonic stem cells reprogram myeloid precursors following cell-cell fusion // Stem Cells. 2006. V. 24. № 1. p. 168-176.

132. Yu J., Vodyanik M.A., Smuga-Otto K., Antosiewicz-Bourget J., Frane J.L., Tian S., Nie J., JonsdottirG.A., Ruotti V., Stewart R., Slukvin, П, Thomson J.A. Induced10

133. Zhou Q., Brown J., Kanarek A., Rajagopal J., Melton D.A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells // Nature. 2008. V. 455. № 7213. P. 627632.

Информация о работе

Баттулин, Нариман Рашитович
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2010
ВАК 03.02.07

Диссертация

Экспрессия эпиаллелей генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности, и тканеспецифичных генов в межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы