Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ КУКУРУЗЫ IN VITRO

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ КУКУРУЗЫ IN VITRO"

А-зот

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А." ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи Хиккадуве Виданаралалаге Салия ДИАС

РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ КУКУРУЗЫ IN VITRO

Специальность 03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук .

МОСКВА 1994

с о л о есс сР

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии МСХА и в отделе биологии клетки и биотехнологии-ИФР РАН.

Научные руководители — д б и , акад РАСХН В. С. Ше-велуха, кандидат биологических наук, с н с Ю. И. Долгих.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, в н с В. В. Мазин, кандидат биологических наук, с н. с Г. В.-Рассадина.

Ведущее учреждение — Московский государственный университет, биологический факультет

■ * >1.®°

Защита состоится «©•¥■» апреля 1994 г. в /с на заседании специализированного ученого совета Д 120 35 07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К А. Тимирязева.

Адрес: 127550, г. Москва, ул Тимирязевская, 49, сектор л защиты диссертаций.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке МСХА.

Автореферат разослан « 1Ь » марта 1994 г

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биологических наук

А. С. Лосева

; Актуальность проблемы. Сочетание биотехнологических й традиционных методов селекции позволяет ускорить и облегчить получение новых сортов . сельскохозяйственных-, растений. Одна)«: применение методов клеточной; и генной инженерии часто . лимитируется невозможностью регенерировать растения из перспективных клеточных культур. У кукурузы высокая эффективность морфогенеза in vitro показана для нескольких линий, как правило,, не имеющих коммерческого значения, в то время как большинство практически ценных линий и гибридов имеют низкую способность к регенерации растений; . ^ . , -

Известно, что морфогенетический • потенциал культивируемых "клеток кукурузы определяется их генотипом, а также видом тканей, иэ' которых получен каллус; и условиями культивирования. Исходя их существования физиологической и генетической регуляции морфогенеза, - предложено два основных способаповышения частоты регенерации. Первый основан на эмпирическом подборе питательных сред и;условий выращивания,клеток i n v itro для каждого индивидуального генотипа Второй направлен на изменение генотипа растения, от которого получают культуру клеток.- Он предусматривает гибридизацию практически ценных, но низйоморфогенных линий с формами, обладающими высокой способностью к регенерации растений. Естественно, в этом случае требуется проведение серии возвратных скрещиваний с исходной родительской формой для сохранения генов, обуславливаете хозяйственную ценность линии. . - .

. Важно оценить, который иэ двух путей Может обеспечить максимальное число "регенерантов у широкого круга линий и гибридов кукурузы. ; »".;'; . "" -'; Г - '•','.' ■ '{. " -

Дели и задачи исследования. Целями данной работы было оценить вклад генотипа и физиологических факторов в регуляцию морфогенеза in vitro и рекомендовать оптимальную стратегию регенерации растений иэ культивируемых тканей кукурузы. . :

Для достижения поставленных целей было необходимо выполнить следующие задачи: - ,

1) выбрать линии кукурузы,. имеющие существенные генетические различия по способности к морфогенезу in vitro; \

- 2) сравнить роль 'генотипа, 'эпигенетического состояния экспланта и физиологических регуляторов в формировании эмбрио-генного каллуса; • •• . '- *. • ■ J .

3) оценить вклад генотипа, компонентов питательной среды и

' науч.'; Г. : л ■ £КА I ■ •,

Мосл. с..... . ^адомии I

Икв. ' " ' ■

условий культивирования в регуляцию регенерации растений из эмб-риогенного каллуса;

4) разработать практические рекомендации для повышения частоты регенерации у коммерческих линий и гибридов кукурузы

Научная новизна работы. Показано, что регуляция двух этапов морфогенеза - образования эмбриогенного каллуса и регенерации растений, осуществляется разными путями. На стадии индукции каллуса доминирующим является влияние генотипа, на стадии регенерации Солее значительную роль играет физиологическая регуляция. Впервые обнаружено, что препарат грибного происхождения эмистим является стимулятором морфогенеза у кукурузы.

Практическая ценность работы. Разработаны практические рекомендации для повышения регенерационной способности линий и гибридов кукурузы с низким морфогенетическим потенциалом

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на:

1) II Всероссийском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений", Пущино, 1993 г.;

2) научной конференции в ДОХА;

3) заседании кафедры сельскохозяйственной биотехнологии МОХА;

4) расширенном семинаре отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН.

Публикации. Па материалам диссертации опубликовано 2 работы.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литёратуры, экспериментальной части, включающей методический раздел, результаты и обсуждение, заключения и выводов. Материалы диссертации изложены на <38 страницах текста, содержат Ютаблиц,/3 рисунков и фотографий. Библиография содержит1йсто-адкков отечественной и зарубежной,литература

•ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1

работе были использованы 9 линий кукурузы, из них 6 амери-•канских: А188, А344, А654, У401, \Л), В73, и 3 линии селекции 'Краснодарского НИИ сельского хоаяйства: Гк26, Гн83 и Гн86. Все использованные линии характеризовались высокой степенью инбридинга (не менее 10 поколений самоопыления). В каждом опыте линия была представлена 6-10 растениями.

Растения выращивали в поле или в сосудах в теплице с режимом

25*2 С и 16-часовой длиной светового дня. Для получения семян делали самоопыление со строгой изоляцией мужских и женских"соцветий. •, ' • *'

•. » Получение и культивирование каллуса Каллус получали из незрелых зародышей, выделенных на 11-13 день после опыления. Если на растении было несколько початков, зародыши выделяли только из верхнего. Вычлененные зерновки стерилизовали О,IX раствором сулемы в Г течение 20 минут и затем трижды промывали стерильной дистиллированной водой. Зародыши, выделенные их верновок в лами-нар-боксе, помещали щитком вверх на агари8ованную среду в чашки ' Петри. . • Х..Х, ХХ,Х"-- - ' X X.

' Для индукции и поддержания , каллуса использовали среду Му-расиге-Скуга (МЗ) [МигазЫге, Бкоое,1962] с 500 мг/л гидролиза-га . казеина, 30 г/л сахарозы и 1 мг/л 2,4-Д (стандартная среда). В отдельных опытах среда содержала такяе 1? мг/л АгЫО,. или вместо 2,4-Д были добавлены 4 мг/л дикамбы . (3,6-дихлор-о-анисовая кислота) или 1 мкг/л эмистима (биостимулятор грибного происхождения)^-^!. ■ :■;.■'/■■"'.'' X,-- X"

Каллус пассировали каждые 3 недели,' используя в качестве мнокулята только эмбриогенный каллус. Клетки выращивали при температуре 26"с, влажности 70Х, освещенности 3000 лк при длине светового дня 16 часов. " ; ; -V-

Регенерация растений. Кусочки каллуса с зачатками побегов переносили на среду МЗ без гормонов. Укоренение развившихся лебегов проводили на среде без гормонов и витаминов, содержащей половинную концентрацию солей по МС. и-1 г/л сахарозы. Укоренившиеся растения переносили в почву.. '

Температурный стресс. Свеаеиэолированные зародыши инкубировали на стандартной среде при 37*С в течение 2 дней, затем чашки Петри с зародышами переносили в обычные условия культивирования.

Электростимуляция. Через каллус, • помещенный на^стандартную питательную среду в специальные ссюуды с. электродами, пропускали постоянный электрический ток силой 2 мкА непрерывно в течение месяца. Опыты „ проводили в трехкратной повторности, каждая пов-торность': включала по 15 инокулюмов на вариант. ,.'".■'•■.>;.'".

■ „ Цитологический анализ. Эмбриогенный каллус фиксировали в спирт-уксусной кислоте (3:1). Размеры клеток определяли под микроскопом на давлении* препаратах, окрашенных 2X ацеторсеином, с помощью окуляр- и объектмикрометра. У каадой линии анализировали

- 4 -

1500-2000 клеток. '

Статистическая обработка. В работе приведены средние величины между показателями отдельных растений или между повторностями со стандартной погрешностью. Достоверность разницы между вариантами определена по критерию Стьюдента (Рокицкнй, 1974).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Регуляция индукции эмбриогенного каллуса

Процесс морфогенеза в культуре тканей кукурузы можно разделить на два этапа: индукция эмбриогенного каллуса и регенерация растений ив звложившихся прозмбриональных структур.

В зависимости от генотипа исходного растения, стадии развития, состава питательной среды и условий культивирования, изолированные незрелые зародышы кукурузы в условиях in vitro образуют два типа каллуса: змбриогенный и неэмбриогенный [Green, Phillips. 19751.

Для оценки роли генотипа было взято 9 линий кукурузы и, после определения способности к образованию эмбриогенного каллуса, из них выбрано четыре, различающиеся в стандартных условиях по этому признаку. Доля эксплантов, формирующих змбриогенный каллус, составила для линии AI88 около 60Х (высокоэмбриогенная), для линии А344 - около 40Z (среднеэмбриогенная). для линии VD -около 20Х и для линии Гк26 - IX (низкоэмбриогенные).

Для определения роли физиологических факторов в регуляции каллусогенеза у выбранных линий анализировали влияние на частоту образования эмбриогенного каллуса состояния экспланта и компонентов питательной среда

I. г. Влияние эпигенетического и физиологического состояния

зкспланта

Каждая из использованных в работе линий была представлена несколькими растениями, л способность к образованию эмбриогенного каллуса учитывалась для каждого растения отдельно. Из одного початка высаживали от 30 до 100 зародышей. Показано, что индиви-

дуальные растения одной линии существенно различаются: внутрили-нейный полиморфоэм по . частоте каллусогенеза достигал Z5Z (Рис. 1). Лучшие растения менее эмбриогенной линии имели такой же морфогенетический потенциал, как худшие растения более эмбриогенной линии. Тем не'менее, средние эначения морфогенетического потенциала высоко-, средне- и низкоэмбриогенных линий существенно различались, статистическая обработка подтвердила достоверность этой разницы (Р<0,05). Частота образования эмбриогенного каллуса у линии Гк2б была так низка (менее 22), что не дала возможности оценить различия между индивидуальными растениями.

. Существование внутрилинейного полиморфизма по способности образовывать эмбриогенный* каллус отмечали и другие авторы [Bartkowiak, 19831. Скорее всего это связано не с генетическими .различиями, так как,тестированные линии были инбредными.. Кроме того, в наших экспериментах даже в пределах одного початка past ница в способности к формированию эмбриогенного каллуса у зародышей, изолированных из верхней, средней и нижней частой початка, достигала'. ЗОХ. . V ■ . Морфогенетический потенциал.клеток, их компетентность к индукции: внешними регуляторами,. , определяется эндогенным уровнем гормонов. , В то же время, известно, что содержание и соотношение гормонов быстро- меняется по мере развития зародыша СCarnes, Wright, 19883. •вероятно, индивидуальные!физиологические различия между: растениями,~ следствием которых является разная скорость развития зародышей на початке, могут быть причиной и неодинаковой спосбности к каллусогенезу. Учитывая существование внутрилинейного полимирфизма, следует для характеристики эмбриогенного потенциала той или иной линии анализировать не одно,а несколько растений. "..V. ' . •

Способность к.образованию эмбриогенного каллуса незрелыми зародышами зависит от стадии их развития. Если судить о стадии развития1 по размеру, тонаиболывей компетентностью к каллусоге-незу обладают зародыши длиной lrZ мм -. С Капо et. al., 1985]. Желая добитьсй максимальной реализации потенции.к морфогенезу у аьали-, зируемых генотипов, мы расширили исследуемый интервал, : однако зеЕродыши менее 1 мм, как правило, погибали при изоляции, а зародыши более 3 мм прорастали без образования каллуса. Для всех тестированных линий оптимальным было использование для каллусогенеэа зародышей размером 1,5 мм (Табл.1)» Выяснилось, что чем

Рис. i - ВаугрилинеЯный полиморфизм по частоте образования змбриогенвого каллуса

" * I

Эксшштов, образувда эмбриогенный <

каллус

80 1"

Индивидуальные растения

А188 А344 WD

ЙЯ Средний эмбриогенный потенциал линии

■ ' Г- ' ' - ■

I выше эмбриогенный потёнциал линии, тем шире интервал, внутри которого .незрелые зародыши могут образовывать эмбриогенный каллус. Так у линии А188 зародыши длиной от 1 до 2,5 мм формировали эмбриогенный каллус с приблизительно одинаковой частотой. У линии А344 оптимальный интервал сузился до 1-2 мм", • а у линии № - -использование зародышей больше или меньше 1,5 мм приводило к снижению эмбриогенного потенциала. \

Табл. 1. Влияние размера"зародыша на частоту„образования эмбриогенного каллуса '

Линия Размер •> Число Число зародышей, X зародышей,

зародыша посаженных . образовавших образовавших '. зародышей ' . эмбр. каллус эмбр.каллус

А188 3,0 . 54 • ■ ' . 17 .,.31

■ 2,5 47 23 48

2,0 Ч . 60 31 ' 51

1,5 • . 82 40 55

-' > • . 1,0 . 65 ; '. 32 Г 49

А344 2,5 •.'•■■"' 54 "; ' ' 12 18

2,0 167 65 25

1,5 183 47 ! . 32

1,0 . 64 17 • 24

V® 2,0 . 12 •/ 2 /7 16

V. 1,5 36 17 21

'т.о-. . 30 . - . ''16

, Полученные результаты позволяют сказать, что физиологическое^ состояние исходного эксплйнта сильно влияет на частоту образования морфогенного' каллуса: кукурузы. Однако в тех случаях, когда используются зародыши на оптимальной стадии развития^ на первый план выходят генетические различия мевду линиями. . *. ,

I .2 Влияние компонентов питательной среды

Наряду с физиологическим состоянием экспланта, большое значение для образования эмбриогенного каллуса имеют компоненты питательной среды, особенно фитогормоны. Поэтому каллусообразова-тельная способность исследуемых линий кукурузы была проверена на фоне сред с разными регуляторами роста: 2,4-Л. 2,4-Д + ингибитор физиологического действия этилена AgNOs, дикамба и эмистим.

Известно, что этилен является ограничивающим фактором при индукции эмбриогенного каллуса [SongJtad et al., 19883. Культивирование изолированных зародышей на среде с нитратом серебра по сравнению с вариантом, содержащим только 2,4-Д, примерно на 20Z повышало частоту образования эмбриогенного каллуса у линий А188 и А344. Для линии Гк2б среда с AgN03 была единственной, на которой удалось получить змбриогенный каллус. В то же время у линии WD отмечено лишь слабое недостоверное повышение морфогенети-ческого потенциала (Табл.2). Неодинаковая реакция генотипов на добавление в среду нитрата серебре, возможно, объяскяется различным уровнем синтеза этилена у исследуемых4 линий. Отсутствие реакции на AgNOs у линии WD, вероятно, указывает, что «е этилен является причиной низкого эмбриогенного потенциала данной линии.

Использование в питательных средах g качестве регулятора роста дикамбы позволило значительно расширить круг генотипов, способных к регенерации 'растений "из "культивируемых клеток [Duncan et al. ,19851. Однако_в наших опытах замена 2,4-Д на ди-камбу сказалась эффективной только для линии А344, которая сравнялась с линией А188 по'"частоте образования эмбриогенного каллуса. На морфогенётический потенциал низкоэмбриогенных линий дикамба не сказывала' положительного влияния (Табл. 2).

Эмистим ранее "не" использовался в качестве регулятора роста при индукции каЛ^уса кукурузы. Добавление его в питательные среды "¿ля лиййй А188 « А344 не привело к повышению частоты индукции о^бриогенйого каллуса (Табл.2).

'Результаты проведенных опытов показывают, что норма реакции генотипов проанализированных линий по признаку "формирование эмбриогенного каллуса" достаточно широка. Она позволяет, варьируя условия культивирования незрелых зародышей и состав питательной среды, повышать морфогенетический поте шлиал средне-эмориогенных

./ . - , - 9 - ; . ; ■

линий до уровня высокоэмбриогенных. Однако в отношении ниэкоэмб-

риогенных линий физиологическая регуляция не была эффективной.

, Табл.2, Влияние регуляторов роста на,частоту образования эмбри-огенного каллуса

Линия Регулятор . -Число Число зародышей, % зародышей, . роста ., посаженных образовавших . ' образовавших зародышей эмбр. каллус эмбр. каллус

> А188 2,4-Д ; • ., 74 45 • 60,8 ± 5,7

. 2,4-Д+АвМ0, - 75 • 62 • 82.6 ± 4,4

дикамба 99 62 62,6 ± 4,8

эмистим 39 13 > . 33,0 13.2

А344 2,4-Д 139 57 41,0 ± 4.1

^ 2,4-Д+АгЫС^ 131/ /. 81 ; 61,8 ± 4,2

дикамба 135 91 67.4 ± 4,0

эмистим 34 16 • * 47,5 ± 3,0

V® 2,4-Д 181 ' 42 23,2 ± 3,0

. Т. 2,4-Д+АгЫ0, ... 61 16 . • 26.2 ± 5,6

дикамба 29 7 • 24,1 ± 7.9

.. эмистим 48 10 20,3 Л 3.4

Гк26 2,4-Д . 45 О 0,0

; # 2,4-Д+АвЫ05 167 3 - • 1,8 * 1,0

дикамба 140 . / О 0,0

II. Регуляция регенерат* растем«* из эмбриогенного каддуса

- Эффективность регенерации растений не всегда положительно. } коррелирует с ; частотой образования эмбриогенного каллуса 1Иоуак еЪ а]. ,198Ш.Поэтому,необходимо сопоставить роль генотипа, эпигенотипических особенностей и физиологических- регуляторов на втором этапе морфогенеза, то есть на стадии регенерации растений ив проэмбриональных структур. Для анализа были взяты линии А188.

А344 и четко различающиеся по частоте индукции эмбриогенного каллуса.

II. 1. Влияние состояния экспланта.

Каллус, сформированный эксплантами каждого растения кукурузы. культивировали отдельно, что позволило оценить число регене-рантов, полученных от индивидуального донорного растения. Оказалось, что регенерационный потенциал каллуса от отдельных растений одной линии сильно различается. Число регенерантов, приходящееся на одно донорное растение, варьировало от 12 до 70 для линии А188, от 12 до 79 для линии А344 и от О до 15 для линии \й) (Рис.2). Различия по способности к регенерации между индивидуальными донорными растениями одной линии значительно превосходили межлинейные различия. В пределах одной линии большее число регенерантов, как правило, было получено от тех растений, которые продуцировали больше эмбриогенного каллуса. (Рис 2а) Однако, есЬй сравнивать число регенерантов, отнесенное к чисЛу зксПЛантов, сформировавших эмбриогенный каллус, такая коррекция отсутствуете Рис 26).

Из трех проанализированных линий наибольшей эффективностью регенерации обладала линия А344, которая бУла сфе-Щгёй по частоте каллусогенеза. Ранее высказывалось йре&озк$женйе о различных путях регуляции индукции эмбриогеннбго'каллуса дальнейшего развития эмбриоидов в растения СНоЙеез ët ¿1., 19851. Полученные

данные дают экспериментальное ЬоЙЬ^рШеНме этой гипотезы

|

Н.2. Влияние'койпоЬейтйв'нйга^еяьйоя среды

Дня ьъМв5гёйкй усаовий-, способствующих максимальной реализации регёнеращгсййгаго потенциала исследуемых линий кукурузы, рыли испытаны среды, содержащие физиологические регуляторы, уже применявшиеся при индукции эмбриогенного каллуса: АгИОз в сочетании с 2,4-Д, дикаыба и эмистим. Морфогенетическая реакция на АбШ3 и дикамбу зависела от генотипических особенностей. У линии А188 и А344 постоянное культивирование на среде с нитратом серебра приводило к снижению числа регенерантов. У линии '»О АегЫ05, наоборот, увеличивал количество регенерированных растений (Табл.3).

Рис. 2- Частота образования эмбриогенного каллуса и регене-- рации у индивидуальных донорных растений кукурузы.

2 Эксплантов.образующих Число растений

эмбриоген. каллус регенератов

А188 А344

1- Эмбриоген. каллус 2- Число растений

X Эксплантов,образующих Сррд Число [Чггенерчитон

эмбриоген. каллус на оксплонт

А188 А344 WD

1- Эмбриоген. каллус 2- Сред число реген. на эксплант

Табл. 3. Елиякие регуляторов роста на частоту регенерации растений , . из эмбриогенного каллуса

Линия Регулятор . Число Число Число■регенерантов

роста эксплантов регенерантов на эксплант

2,4-Д , 74 . , 56 ' " 1,26 * 0,06

А188 2,4-Д+АеШ5 75 .65 .1,06 ± 0,03 • '

Дикамба■ 99 , >. 103 ' ■' .; 1,68 * о,ю

- Эмистим 39 , ; 45 ■ :* : .: 3,50 ± 0,21

2,4-Д, 139 : 84 . 'л" ■„'■ 1,47 * 0,07 "

А344 2,4Г Д+АеШэ 131 108 . ; ; ' 1,33 * 0,06

• Дикамба 135 • 1зз 1,47 * 0,07 .

Эмистим 34 • 73 д 4,56 ± 0,69

2,4-Д 181 ' ' 19 " ' 0,48 * 0,01

№ 2,'4-Д+АдЫ03 61 ■•'•'■■,' .'. 24 • . 1,51: 0,11

Дикамба 29 . 12 ". ; 1,72 1. 0,20

Эмистим 48 26 2,71 ± 0,31

• у Применение дикамбы дало положительный эффект, также только -для линии Ш. Интересно, что дикамба не стимулировала индукцию эмбриогенного каллуса у этой линии. У линии А344 дикамба, напротив, усиливала каллусогенез, но не влияла на выход растений-регенерантов (Табл.3). Это-также свидетельствует о разных механизмах регуляции двух1' этапов морфогенеза: индукции эмбриогенного каллуса и регенерации растений. ■ ."■'"■;'.; .:.'• ';■ >..,■ :'..: ".' "

Применение таких регуляторов роста, как ДОО^и дикамба, позволило линии № по числу регенерантов на исходный : эксплант сравняться с высоко- и.среднеморфогённой линиями;А188 и А344 и даже немного опередить их. ," .

В отличие от нитрата серебра и дикамбы, эмистим стимулировал, регенерацию растений у всех проанализированных" линий, при этом частота регенерации возрастала в.2,5-5 раз по сравнению со стандартной ' средой (Табл.3). . ' ' ,

Согласно полученным результатам, , замена 2,4-Л 'другими .регуляторами роста сильно влияет на эффективность регенерации расте-

ний из эмбриогенного каллуса. Различия, обусловленные компонентами питательной среды, превосходят различия между генотипами.

11.3 Влияние температурного стресса

При индукции каллуса из незрелых зародышей фактором, уменьшающим частоту каллусогенеза и, следовательно, число расте-ний-регенерантов, является прорастание изолированных и помещенных на питательную среду зародышей. Мы предприняли попытку блокировать прорастание зародышей с помощью температурного стресса. Оказалось, что инкубация изолированных зародышей кукурузы линий А188 и А344 при 37*С не повысила частоту образования эмбриогенного каллуса. Однако полученный каллус обладал большим регенера-ционным потенциалом по сравнению с каллусом, образованным эксплантами, не прошедшими температурную обработку. Еелм в контроле было получено в среднем 1,26 и 1,47 растений на один зксплант, соответственно для линий А188 и А344, то после темге-ратурного стресса среднее число растений увеличилось до 2,40 и 2,76 на зксплант. Интересно, что температурный стресс подействовал не на индукцию каллуса, а на отстоящий во времени процесс регенерации растений. Возможно, часть зарорыыей погибла при 47*0 и поэтому не смогла принять участие в образовании каллуса. Одн I-ко выжившие зародыши с&эрмировали каглус с повышенным числом эм-бриогенных зон, которые в подходящих условиях дали начало большему числу растений-регенерантов. •

Использование температурной обработки не изменило соотношения двух тестированных генотипов по частоте регенерации- как и в контрольных условиях эмбриогенный каллус линии АЗ-К облад 1Л большим регенерационным потенциалом, чем аналогичный каллус линии А188.

П. 4. Цитологический анализ эмбриогенного каллуса

Для того, чтобы понять причины разной регенерационной способности линий А188, А344 и УО, был проведен цитологический анализ эмбриогенного каллуса.

Как выяснилось,каллус кукурузы состоит из клеток нескольких

. . 'л ' , • ;• .....

- 14"-V *://- ' V . л,

типов. Наряду с мелкими, овальными, с густой цитоплазмой клетками, отнесенными нами к меристематическому типу, присутствовали более крупные, ' вакуолизированные клетки и гигантские клетки вытянутой или округлой формы с большими вакуолями и крахмальными и жировыми включениями. Размеры клеток варьировали от 20 до 200 мкм. Для характеристики линий кукурузы мы разделили клетки по • размеру на три класса: мелкие. меристематические (менее 30 мкм), промежуточные по размеру клетки переходного от меристематическо-. го к паренхимному типу Сот 30 до 60 мкм) и крупные.клетки парен-химного типа (более 60 мкм). - :, . '■ «. . -. ^

Каллус линии А188 состоял,< в основном, из мелких клеток ме-ристематического типа, доля крупных клеток составляла менее 5Х. Каллус линии А344 включал больше крупных клеток (26Х) и меньше клеток меристематического типа (60,6%). У линии МЗ лишь половина каллусных клеток могла быть отнесена к меристематическому. типу и столько же клеток имело диаметр более 60 - мкм. Таким образом, несмотря на одинаковую морфологию эмбриогенного каллуса, ткани тестируемых линий различались по' клеточному составу. ■ ' ' , •*

Цитологический анализ выявил противоречие между долей ' ме-ристематических клеток в ■ каллусе и частотой"регенерации. Так каллус линии А188 содержит почти исключительно клетки меристематического типа, но по числу растений-регенерантов уступает, культивируемым тканям линии А344, у которой мелкие клетки составляют' только 607. от общего количества. Возможно, в.каллусе А188 формируется больше-проэмбриональных структур, ' но не все, они способны в данных условиях развиваться в растения.

Известно, что слабый-электрический ток, пропущенный через каллус, увеличивает частоту регенерации растений.- При этом ток действует только на компетентные к морфогенезу;клетки СКитлаев и др., 1993]. Поэтому можно было предположить, что электрообработка стимулирует к развитию . заблокированные проэмбриональные структуры в каллусе линии А188. .

.11.5. Влияние электрического тока.

Кусочки эмбриогенного. каллуса одинаковой массы подвергали действию электрического тока и в конце пассажа учитывали" индекс, роста каллуса и число образовавшихся побегов. У линии А188 число образовавшихся из каллуса,побегов, увеличилось под действием; тока"

в 2,6 раза У двух других линий стимуляция побегообразования не превышала 207. (Табл. 4). Эти данные подтверждают высказанное ра-

Табл. 4. Влияние электрического тока на рост каллуса и побегообразование

Линия Индекс роста каллуса Средн. число побегов на экспл.

контроль опыт X к контр, контроль опыт X к кочролю

А188 11,5 23,9 219 ¿, 24 1, ,20 2,83 261 £ 30

А344 8,8 25,6 265 х 31 1, ,98 2,25 119 17

V© 2,0 14,3 783 ± 109 1, ,93 1,45 118 1 8

нее предположение о существовании блока развития проэмбриональ-ных структур у линии А188. В каллусе А344 и Ю большинство про-эмбрио развивается в обычных условиях, поэтому электрообработка не вызвала усиления регенерации. Если сопоставить число растений- регенерантов у тестируемых линий после действия тока, когда их морфогенетический потенциал реализован полностью, с долей ме~ ристематических клеток в каллусе, будет получена прямая зависимость (Табл.5).

Обработка электрическим током, помимо стимуляции побегообразования, значительно усиливала рост каллуса. Масса эмбриогенного каллуса увеличивалась у линий А188 и А344 в 2-2,5 раза, а у линии УО - почти в 8 раз. Поскольку число регенерантов, которое может быть получено, часто бывает пропорционально массе эмбриогенного каллуса, 'ускорение роста культивируемых тканей может иметь большое значение для низкоэмбриогенных линий

II. 6. Жизнеспособность растений-регенерантов

Условия культивирования каллусных тканей и регенерации растений часто влияют на жизнеспособность растений-регенерантсв.

Табл.5. Доля „меристематических - клеток и частота регенерации та обработанного электрическим током каллуса кукурузы ' .

Линия Доля меристематических.' Среднее число побегов .

клеток, Z . . ' на эксплант ; .

А188 86,3 Ж 3,4 '" ". 2,83 ± 0,32

А344 60,0 ± 4,8 2,25*0.13 " , '

WD ".- 47,7 i 4,9 . 1,45 i 0.09

Поэтому выбор . наиболее -.эффективной системы регенерации должен основываться на количестве выживших после пересадки в почву, и нормально развивающихся растений, а не на '-данных лп vitro.:,;

По'30 растений, полученных из каллуса, выращенного в различ- . ных y^oBraxi переносили в почву и оценивали их выживаемость и, , морфологию. Выло определено, что регенеранты из каллуса, культи- : вировавшегося на среде с 2,4-Д, выдерживали пересадку в почву: - почти в 100% случаев. Использование сред с нитратом серебра, ди-: .; камбой и эмиетнмом, а также температурный стресс приводили к;■ , 'снижению жизнеспособности растений-регенерантов ..на 15-30Z (Табл. 6). Показатели выживаемости'были сходными у. трех анализируй . ' емых линий кукуруза; Все выжившие растения лмели нормальную морг фологию и успешно развивались.. • • ••

Из приведенных данных.видно,,. что культивирование каллуса на среде с эмистимом обеспечивает максимальный выход жизнеспособных растений для всех тестируемых линий кукурузы.. ; ' ; ■'-V/'л'-'•'' • "

Табл.6. Влияние условий выращивания каллуса на выживаемое!ь растений-регенерантов

Линия Вариант среды Ср. число Ср. число выживших Выживае-и условия куль- регенерантов в почве растений мость, X

тивирования_ на зксплант на зксплант

2,4-Д 1,26 1,26 100

2,4-Д + АеШ, 1,06 0.76 71

А188 Дикамба 1,68 1,46 87

Эмистим 3,50 3,03 86

Темп, стресс 2,40 1,67 ь9

Электр, ток 2,83 2,75 Э''

2,4-Д 1,47 1,43 97

2,4-Д + АеШ, 1.33 0.87 65

А344 Дикамба 1,47 1.02 69

Эмистим 4,56 3,68 «0

Теш» стресс 2,76 2,03 73

Электр, ток 3,20 2,72 85

2,4-Д 0,48 0.45 <34

2,4-Д АгЮ^ 1,51 1,00 66

Ш Дикамба 1,72 , 1,41 82

Эмистим 2,71 2.15 79

Темп, стресс 1,20 0,92 76

Электр, ток 1,83 1,75 04

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенный анализ роли генотипа и физиологических факторов

- 18 -

линий и гибридов. .- /

Основываясь на данных о значительном внутрилинейном полиморфизме по способности к регенерации,. следует брать экспланты для получения каллуса с возможно большего числа исходных растений...

Наилучшей средой для индукции каллуса является среда MC, содержащая в^ качестве регуляторов роста .2,4-Д и AgNOj.

В том случае, когда доля зародышей,, формирующих эмбриогенный каллус, выше 10Z, можно рассчитывать на получение, достаточного количества каллуса для проведения клеточной селекции и успешную регенерацию растений. Если морфогенетический потенциал линии меньше 10Х, вероятность.получить"каллус с достаточной регвнера-ционной способностью, используя физиологические - , регуляторы, очень мала Для таких генотипов кукурузы лучше.использовать гибридизацию с линиями-донорами высокой способности к морфогенезу In Vitro. V'У- * • Т' ' ^

Длительное сохранение каллусом- способности к регенерации растений обеспечивается частым субкультивированием и использованием в качестве инокулюма для следующего пассажа только эмбрио-генного каллуса- Воздействие ; слабым • электрическим током способствует росту эмбриогенного каллуса и может быть очень полезным для наращивания массы клеток низкоэмбриогенных линий.

Культивирование каллуса на среде • с эмистимом способствует получению наибольшего количество жизнеспособных растений-регене-рантов. •■•. ' ' . - '; .; - . -.; ':.- */•

Использование такой схемы, индукции, каллуса и регенерации растений позволяет получать в течение ;полугода на каждые' 100 изолированных зародышей промерно 250 растений для линии - AI88, 150 растений для линии А344 и 50 регенерантов для линии WD. Увеличение продолжительности культивирования каллуса дает возможность регенерировать дополнительное количество растений., . Л

' ■;-.• дВЫВОДЫ" .'■■ ' V у'-:.'; V. -у :"':у

1. При анализе регуляции морфогенеза в культуре ткани кукурузы in vitro показано, что на стадии индукции э»й5риогенного каллуса доминирующее влияние оказывает генотип.. На стадии формирования растений, из проэмбриональных. структур - большее значение имеет физиологическая регуляция. у ". * ■

2. Показано, что регенерационная способность зависит от Физиологического и эпигенетического состояния экспланта. Обнаружено, что индивидуальные растения одной инбредной линии различались по способности к индукции эмбриогенного каллуса в 1,3 раза, а по числу регенерантов на эксплант - в 10 раз.

3. Добавление нитрата серебра в среду для получения культуры клеток на 20% увеличивает частоту образования эмбриогенного каллуса у линий А188 и А344 с высоким и средним эмбриогеннм потенциалом, тогда как линия \ЛЗ с низкой способностью к каллусогенеэу оказались нечувствительной к физиологической регуляции.

4. Использование нового регулятора роста эмистима повысило частоту регенерации растений из эмбриогенного каллуса всех проанализированных линий кукурузы в 2-6 раз.

5. Слабый постоянный электрический ток стимулирует рост каллуса и морфогенез, при этом величина стимуляции зависит от гено-типических особенностей клеток.

1. Диас С., Долгих Ю. И., Шэвелуха а С. Взаимодействие генетической и физиологической регуляции морфогенеза в культуре тканей кукурузы in vitro. / Тезисы докладов II Всероссийского симпозиума "Бэвые методы биотехнологии растений", Пущино, 1993.

2. Диас С. , Долгих К1 И., Шамина 3. а , Шевелуха а С. Роль физиологических и генетических факторов в индукции эмбриогенного каллуса у разных линий кукурузы. / Доклады РАСХН, 1994. N 2.

Работы, опубликованных по теме диссертации

Объем !'/»

Зак 337

Тир №0

Типография Московской се-ьскохозяйствеиной академии имени К А Тимирязева ^"З^О, Москва И 550 Тимнразевская ул, 44