Регуляция экспрессии специфических белков печени и транскрипционных факторов в гепатокарциномах мышей

Черемнова, Оксана Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция экспрессии специфических белков печени и транскрипционных факторов в гепатокарциномах мышей
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция экспрессии специфических белков печени и транскрипционных факторов в гепатокарциномах мышей"

02-3 4124-3

На правах рукописи

ЧЕРЕПАНОВА ОКСАНА АЛЕКСАНДРОВНА

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ БЕЛКОВ ПЕЧЕНИ И ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ В ГЕПАТОКАРЦИНОМАХ МЫШЕЙ

специальность 03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2002

Работа выполнена на кафедре вирусологии Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова и в лаборатории Иммунохимии НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН им. Н.Н. Блохина

Научные руководители:

доктор биологических наук, академик РАН, профессор Абелев Г.И. кандидат биологических наук Лазаревич Н.Л.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Глушанкова H.A.

доктор биологических наук, профессор Гостимский С.А.

Ведущая организация:

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится «.<>3 2002 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 501.001.76 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, лабораторный корпус А, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан « ъ 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук / Калинина Н.О.

'■' :','л'!л'нПАЯ 1

О^ЩАЯхкрАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования,

Злокачественный рост клеток основан на автономной и неограниченной пролиферации клеточного клона, выходящего за пределы собственной ткани и способного к росту в негомологичных тканях. При этом опухоль представляет собой популяцию генетически нестабильных клеток, в которых происходит постоянное накопление мутаций, ведущих к эволюции опухоли в сторону более агрессивного фенотипа. Это явление, получившее название опухолевой прогрессии, является фундаментальным свойством опухолей различного происхождения, но всегда определяется свойствами исходной ткани, давшей начало опухоли.

Гепатокарцинома (ГК) - один из самых часто встречаемых раков в мире, лечение которого осложняется тем, что опухоли обычно образуются на базе хронических заболеваний печени. По эпидемиологическим данным, хронические инфекции вирусами HBV и HCV являются причиной до 80% ГК в мире.

Вирусные инфекции вызывают хронические воспаления печени, при которых в ткани высок уровень клеточной смерти и пролиферации. Это пренеоплаотическая стадия; при стимуляции, например, оксидативным стрессом или воспалительными цитокинами, происходит злокачественная трансформация клеток (Buendia et al., 2000).

Прогрессия ГК сопровождается снижением уровня дифференцировки, сопряженным с подавлением экспрессии ткане-специфических генов, увеличением скорости пролиферации клеток, утерей эпителиальной морфологии, приобретением инвазивности и способности к метастазированию. Однако карциномы часто сохраняют способность к ре-дифференцировке.

Возможность реверсии низко-дифференцированных гепатом к более дифференцированным была показана in vitro (Spath and Weiss, 1998) при экзогенной экспрессии гена гепатоцитарного ядерного фактора (HNF) 4а -специфичного для печени регулятора транскрипции.

Определяющую роль в регуляции экспрессии большинства генов, специфичных для печени, и в поддержании дифференцировочного статуса клеток играет соотношение в клетке уровней так называемых гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ), к которым относят несколько семейств регуляторных белков: HNF1, С/ЕВР, HNF3, HNF4 и HNF6. Тканевая специфичность экспрессии печень-специфических генов достигается, по-видимому, одновременным участием нескольких гепатоцитарных факторов в регуляции их транскрипции. Между

экспрессией ГЯФ существуют тесные связи, однако, иерархические отношения между представителями различных семейств факторов пока исследованы недостаточно полно.

В настоящей работе роль ГЯФ в прогрессии ГК исследована на созданной в НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН им. H.H. Блохина коллекции перевиваемых ГК мыши, полученных из химически индуцированных первичных опухолей. В эту коллекцию входят также две ГК единого происхождения, резко различающиеся по скорости роста и уровню дифференцировки: медленно-растущая дифференцированная ГК мыши (мГК) и одномоментно выщепившийся на раннем пассаже, по-видимому, в результате инактивации одного или немногих ключевых генов, быстро-растущий де-дифференцированный вариант (6ГК).

Мы предположили, что сравнение свойств мГК и 6ГК позволит идентифицировать генетические пути, определяющие основные свойства прогрессии ГК, и приступить к разработке новых подходов к нормализации злокачественного фенотипа, а также к диагностике ГК.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы была идентификация генов и выявление молекулярных механизмов, которые лежат в основе прогрессии и де-дифференцировки опухолей печени.

В рамках этой проблемы основное внимание было сосредоточено на определении роли гепатоцитарных транскрипционных факторов и неткане-специфических регуляторов, экспрессия которых изменяется в ходе прогрессии опухолей, и поиске путей реверсии злокачественного фенотипа.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:

• Провести сравнительную характеристику медленной и быстрой ГК мышей с целью идентификации генов, в экспрессии которых при скачкообразной профессии от мГК к 6ГК произошли существенные изменения.

• Охарактеризовать гены, экспрессия которых прямо или обратно коррелирует с уровнем дифференцировки при прогрессии.

• Проанализировать роль HNF4a в поддержании уровня дифференцировки, установлении эпителиального фенотипа и регуляции экспрессии гепато-специфических генов в ГК мышей in vitro.

Научная новизна и практическая ценность работы

Новизна исследования в первую очередь связана с использованием имеющихся в нашем распоряжении уникальных моделей: коллекции химически идуцированных ГК с различной скоростью роста и уровнем дифференцировки и системы ГК мышей единого происхождения (мГК и 6ГК), резко отличающихся по скорости роста, дифференцировочному статусу и морфологическим характеристикам, а также культуры клеток 6ГК (НЗЗ).

Это позволило методом полуколичественного ОТ-ПЦР впервые провести полный анализ спектров экспрессии ГЯФ, определяющих фенотип печени, при прогрессии ГК.

Наши результаты показали, что уровень транскрипции HNF4a, одного из ключевых гепато-специфических регуляторов, коррелирует с уровнем экспрессии маркеров дифференцировки и общим дифференцировочным статусом химически индуцированных ГК, о котором мы можем судить по морфологическим признакам. Ранее подобные исследования опухолей печени In vivo не проводились.

В работе впервые показано, что по сравнению с нормальной печенью, в ГК, сохраняющих высокий уровень дифференцировки, параллельно с ре-экспрессией онко-эмбрионального маркера a-фетопротеина (АФП) происходит активация транскрипции эмбриональной изоформы HNF4a7.

Нами показано, что при прогрессии произошли резкие изменения в экспрессии целого блока ГЯФ и других транскрипционных регуляторов. Значительно снижена экспрессия HNF1, vHNF1, C/EBPa, HNF4a, HNF3y и HNF6, ядерного рецептора FTF и энтодермального фактора GATA4 и активируется транскрипция ядерного рецептора COUP-TFI. Изменений в экспрессии ряда других транскрипционных факторов: С/ЕВРр, HNF3a, HNF3p, ядерного рецептора COUP-TFII, энтодермального фактора GATA 6 не произошло. Основные закономерности экспрессии ГЯФ, выявленные на этой модели, подтверждены на коллекции химически индуцированных ГК с различным уровнем дифференцировки.

Нами показано, что наряду со снижением уровня дифференцировки прогрессия от мГК к 6ГК сопровождается активацией онкогена с-тус и теломеразного комплекса.

При прогрессии ГК активируется экспрессия транскрипционного регулятора Snail - индуктора эпителиально-мезенхимального перехода.

При экзогенной экспрессии HNF4a в культуре клеток НЗЗ мы наблюдали частичное восстановление экспрессии гепато-специфических генов.

Впервые получены свидетельства того, что фактор HNF4a прямо или косвенно способен активировать экспрессию генов ГЯФ HNF6 и HNF4a7 и транскрипцию ядерного рецептора FTF. Таким образом, под воздействием экзогенной экспрессии HNF4a в культуре НЗЗ произошел сдвиг в сторону приобретения более дифференцированного гепато-специфического фенотипа.

Изучение возможностей реверсии опухолевого фенотипа и идентификация генов, участвующих в этом процессе, а также определение механизмов регуляции генов опухолевых маркеров относится к фундаментальным исследованиям природы опухолевого роста и имеет прямое отношение к разработке методов диагностики и биотерапии злокачественных опухолей. Повышение уровня дифференцировки в ГК может увеличить чувствительность опухоли к терапии.

Апробаций работы

Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры Вирусологии МГУ им. М.В. Ломоносова и лаборатории Иммунохимии НИИ Канцерогенеза РОНЦ им, H.H. Блохина РАМН 7 апреля 2001 года. Доклад по теме диссертации ("Экспрессия печень-специфических генов в новой модели быстро- и медленно-растущих гепатокарцином мышей") был признан лучшим на VI Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-99", секция "Биология", подсекция "Вирусология", Материалы исследований, представленных в работе, докладывались на международных конференциях: XXIX International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM) Meeting and VIII International Symposium "Biology and Clinical Usefulness of Tumor Markers", 2001; Rodolphe Brupbacher Foundation Fifth Scientific Symposium "Clinical and Basic Oncology: New Developments", 2001.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ

Структура и объем работы

Диссертация изложена на страницах машинописного текста (12 шрифт, полуторный интервал), содержит 13 рисунков, 4 таблицы. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Список литературы содержит 255 источников, в том числе 10 в отечественных рецензируемых изданиях.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Работа посвящена исследованию механизмов одноступенчатой прогрессии ГК мыши от высоко-дифференцированного (мГК) к низко-дифференцированному варианту (6ГК).

Коллекция перевиваемых ГК мыши была получена из первичных опухолей, индуцированных по стандартному протоколу инициация (диэтилнитрозамин) -промоция (фенобарбитал). Гепатомы перевивали мышам подкожно суспензией опухолевой ткани в культуральной среде. На третьем пассаже у одного из животных из одной из медленнорастущих опухолей с интервалом между пассажами 5-7 месяцев (мГК) выщепился быстрорастущий вариант 6ГК, требовавший перевивки каждые 2 недели (Энгельгардт и др., 2000). 6ГК отличается от мГК полной потерей клеточной полярности, резким уменьшением межклеточной и матричной адгезии, отсутствием некоторых маркеров дифференцировки и секретируемых сывороточных белков.

Благодаря ослаблению матриксных и межклеточных взаимодействий, 6ГК в отличие от мГК была легко переведена in vitro в культуру (НЗЗ), характеризующуюся слабой адгезией к субстрату и склонностью к трехмерному росту. Суспензию клеток из мГК стандартным двусгтупенчатым методом получить не удалось.

Экспрессия HNF4a коррелирует с уровнем дифференцировки ГК.

Методами Нозерн-блот гибридизации (Варга, 2002) и ОТ-ПЦР мы показали, что в мГК экспрессируются гены дифференцировочных маркеров (СА, ТТР, ТФН), и возобновляется (по сравнению с нормальной печенью взрослой мыши) экспрессия опухолевого маркера АФП. В результате прогрессии в 6ГК полностью исчезает экспрессия гепато-специфических маркеров дифференцировки (СА, ТТР), уровень экспрессии гена ТФН значительно снижается, но не исчезает полностью (Рис. 1). Другими словами, при прогрессии в 6ГК, помимо ускорения пролиферации и утраты эпителиальной морфологии происходит снижение уровня дифференцировки.

Наблюдаемое при прогрессии координированное падение экспрессии ткане-специфических генов может быть вызвано нарушением экспрессии факторов, ответственных за их регуляцию. Ключевыми факторами, определяющими фенотип печени, являются ГЯФ, включающие в себя 5 семейств: HNF1, С/ЕВР, HNF3, HNF4 и HNFS.

HNF4a является единственным из ГЯФ, для которого показана способность индуцировать как экспрессию некоторых гепато-специфических генов, так и

частичное восстановление эпителиального фенотипа in vitro (Spath and Weiss, 1998), что указывает на то, что посредством HNF4a может осуществляться координация процессов тканеспецифической экспрессии генов и эпителиального морфогенеза. Роль HNF4a в опухолевой прогрессии, и, в частности, при химическом гепатоканцерогенезе, остается пока невыясненной.

Результаты иммунохимической окраски, Нозерн-блот гибридизации (Варга, 2002) и ОТ-ПЦР показали, что при прогрессии ГК происходит подавление транскрипции HNF4a, что коррелирует как утратой экспрессии гепатоцитарных генов, так и со снижением общего уровня дифференцировки химически индуцированных гепатокарцином (Рис.1).

Рисунок 1. Падение экспрессии HNF4a и дифференцировочных маркеров печени при прогрессии ГК.

Результаты ОТ-ПЦР анализа со специфическими праймерами к CA, ТТР, ТФН и HNF4a. Для контроля количества РНК, взятой в реакцию, приведен ОТ-ПЦР с праймерами к HPRT и ß-актину, (печень нормальная печень взрослой мыши, мГК - медленная ГК, 6ГК - быстрая ГК, НЗЗ - культура клеток 6ГК, к (ОТ) -контроль ОТ-ПЦР без добавления обратной транскриптазы).

По-видимому, падение экспрессии гена HNF4a является важным событием при прогрессии от мГК к 6ГК. Получение экспериментальной модели перевиваемых мышиных ГК, различающихся по экспрессии гена HNF4a, дает возможность выяснить роль этого фактора в прогрессии опухолей, а также идентифицировать гены и регуляторные каскады, задействованные в прогрессии ГК.

При транскрипции гена HNF4a образуется несколько вариантов сплайсинга, в настоящее время известно восемь вариантов мРНК, из которых формы HNF4a1-a6 транскрибируются с промотора Р1 (они содержат экзон 1А), а

формы HNF4a7-a8 - с альтернативного промотора Р2, который находится на

5 С £ ¥ У.

с 2 ю х * ¿ÉtÊÊÊÊL

CA шШш-

ттр ШШш . '

ТФН

HNF4« '

HPRT ^^^^

ß-актин

расстоянии - 45.6 т.п.н. от Р1 и экзона 1А, они содержат полностью отличающийся экзон Ю (№к!1е'| ег а1., 1998).

■о ^

¥ ^ ¡¿яо 4 С ц с : в I <

НЫР4<х НЫР4а1

Рисунок 2. Экспрессия транскрипционных регуляторов в нормальной печени, мГК, 6ГК и НЗЗ. А) ОТ-ПЦР анализ со специфическими праймерами к НЫР4а (а1 и а7) и гена АФП. Б) Результаты ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к генам, экспрессия которых коррелирует с экспрессией НЫР4а: НЫР1, уН^1, Н^Зу, НЫРб, С/ЕВРа, 6АТА4, СОиРЛП, ЯТР. В) Результаты ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к генам, не связанных с экспрессией гена ЖР4а: С/ЕВРр, НЫРЗа, НЫРЗр, вАТАб, СОир-ТРН. В качестве контроля количества РНК, взятой в реакцию, приведен ОТ-ПЦР с праймерами к НРет и р-актину.

Мы провели сравнение уровней экспрессии двух групп изоформ HNF4a, экспрессирующихся с разных промоторов, в мГК и 6ГК. Обнаружено подавление уровня экспрессии HNF4a1-a6, экспрессия которых характерна для клеточных линий высокодифференцированных гепатом и для печени (Bailly et al., 2001), в 6ГК и НЗЗ по сравнению с мГК и печенью нормальной взрослой мыши.

Профиль экспрессии форм HNF4a7-a8, характерных для стволовых клеток и дедифференцированных гепатом (Nakhei et al., 1998), отличается и от экспрессии форм, транскрибирующихся с промотора Р1, и от общего уровня экспрессии гена HNF4a. В мГК показано значительное усиление экспрессии HNF4a7 по сравнению с нормальной печенью. В 6ГК и культуре клеток НЗЗ происходит падение экспрессии изоформ, транскрибирующихся с промотора Р2 (Рис. 2А).

Таким образом, в мГК по сравнению с нормальной печенью активируется экспрессия АФП и HNF4a7, а в 6ГК и НЗЗ исчезает как экспрессия HNF4a7, так и АФП. В то же время, в регуляторном районе гена АФП есть сайты связывания факторов HNF4a, vHNF1, HNF1, С/ЕВРа и FTF.

Изоформа HNF4a7 имеет сходный профиль экспрессии с АФП, что вместе с фактом существования сайтов связывания HNF4a в промоторе гена АФП и наблюдением, что HNF4a7 in vitro активирует экспрессию этого гена значительно эффективнее других форм, указывает на возможность регуляции транскрипции гена АФП путем изменения соотношения а1/а7 изоформ в клетке.

Изменение экспрессии ГЯФ и некоторых транскрипционных факторов при прогрессии ГК мышей.

In vitro де-дифференцировка опухолей гепатоцитарного происхождения часто сопровождается подавлением экспрессии некоторых ГЯФ (Cereghinl et al., 1988; Anastasiadis et al., 1999). Однако, систематических исследований полного спектра ГЯФ в опухолях печени in vivo не проводились.

Для изучения свойств прогрессии мы проанализировали уровни экспрессии ГЯФ в нормальной печени взрослой мыши, мГК, 6ГК и культуре клеток НЗЗ методом полуколичественного ОТ-ПЦР.

a. HNF1

Факторы HNF4a и HNF1 играют ключевую роль в гепато-специфической дифференцировке. Корреляция между уровнями экспрессии HNF4a и генов, специфичных для печени, четко описана в литературе. HNF4a является основным регулятором экспрессии гена HNF1 (Kuo et al., 1992).

Сайты связывания факторов семейства HNF1 обнаружены в регуляторных районах очень многих гепато-специфических генов. Делеция таких сайтов приводит к подавлению экспрессии этих генов (Tranche et al., 1990; Zhang et al., 1991; Song et al., 1998).

При прогрессии ГК происходит подавление уровня транскрипции гена HNF1 (Рис. 2Б). Это подавление осуществляется за счет падения экспрессии гена HNF4a в 6ГК и культуре клеток НЗЗ. При восстановлении экспрессии гена HNF4a происходит восстановление уровня транскрипции гена HNF1 (Рис. 5Б). Таким образом, именно экспрессия гена HNF4a определяет уровень транскрипции гена HNF1.

Экспрессия VHNF1, преобладающего в эмбриональной печени и дедифференцированных гепатомах (Cereghini et al., 1996), в мГК выявлена на более высоком уровне, чем в печени. В 6ГК и НЗЗ транскрипция гена vHNF1 существенно снижена (Рис. 2Б).

Вероятно, VHNF1 способен, по крайней мере в эмбриогенезе, влиять на уровень экспрессии гена HNF4a, так как инактивация гена vHNFi приводит к полной репрессии гена HNF4a (Coffinier et al., 1999). В мГК уровень транскрипции гена vHNF1 заметно выше, чем в печени, в 6ГК его экспрессия подавлена, а в НЗЗ мРНК VHNF1 выявляется при отсутствии транскрипции гена HNF4a (Рис.2Б),

Возможно, снижение уровня экспрессии VHNF1 в 6ГК и НЗЗ может привести к частичному подавлению транскрипции гена HNF4a, но наблюдаемая в НЗЗ экспрессия vHNF1 оказывается недостаточной для транскрипции HNF4a. По-видимому, VHNF1 не является фактором, обуславливающим полное подавление экспрессии HNF4a в 6ГК.

б. С/ЕВР

Нами проведено сравнение количества мРНК гена С/ЕВРа, экспрессия которого характерна для дифференцированных неделящихся гепатоцитов (Rana et al., 1995). Уровень транскрипции этого гена в мПС сравним с уровнем в нормальной печени мыши, в 6ГК и НЗЗ экспрессия С/ЕВРа значительно снижена (Рисунок 2Б),

Во всех образцах из мГК, 6ГК, печени нормальной мыши и в НЗЗ выявлены сравнимые уровни транскрипции гена С/ЕВРР, активирующегося при пролиферации гепатоцитов (Greenbaum et al., 1995) (Рисунок 2В).

в, HNF3

HNF3P - один из важнейших регуляторов раннего эмбрионального развития, необходимый для закладки печени, инактивация которого приводит к нарушению

формирования передней кишки. Во взрослой печени инактивация HNF3(3 не влияет на экспрессию генов HNF4a и HNF1 (Sund et al., 2000). При прогрессии ГК уровни транскрипции генов HNF3a и HNF30 не изменяются (Рис. 2В).

В 6ГК и культуре клеток НЗЗ подавлена транскрипция гена HNF3y (Рис. 2Б). Мы показали, что при восстановлении экспрессии гена HNF4a происходит активация экспрессии гена HNF3y (Рис. 5Б). По-видимому, в данной системе именно HNF4a определяет уровень транскрипции гена HNF3y.

г. HNF6

Экспрессия гена HNF6 выявлена в образцах РНК, полученных из печени мыши и мГК; в 6ГК и НЗЗ экспрессия этого гена подавлена (Рис. 2Б).

Известно, что в культуре гепатомы человека HepG2 фактор HNF4a может активировать, а С/ЕВРа - подавлять транскрипцию гена HNF6 (Lahuna et al., 2000). Экспрессия генов HNF6 и С/ЕВРа кореллирует с изменением уровня экспрессии гена HNF4a и, соответственно, со снижением уровня дифференцировки. Однако при ре-экспрессии гена HNF4a происходит восстановление экспрессии HNF6 (Рис. 5Б). Вероятно, влияние HNF4a на активность гена HNF6 в изучаемой системе существеннее, чем влияние С/ЕВРа.

Фактор HNF6 помимо способности активировать ген HNF4a, может влиять на экспрессию гена HNF3(3 (Samadani et al., 1996). Разницы в уровнях мРНК HNF3p при прогрессии ГК не выявлено, таким образом, в данной системе ГК утрата фактора HNF6 не оказывает определяющего влияния на уровень транскрипции гена HNF3p.

д. GATA

Помимо гепатоцитарных ядерных факторов, в формировании фенотипа печени участвуют ранние энтодермальные факторы GATA6 и GATA4.

Фактор GATA6, необходимый для экспрессии HNF4a в эмбрионе (Morrisey et al., 1998), транскрибируется во взрослой печени, мГК, 6ГК и культуре клеток НЗЗ на сходном уровне (Рис. 2В),

При прогрессии ГК уровень транскрипции гена GATA4, гена-мишени GATA6, четко коррелирует с уровнем мРНК гена HNF4a. Уровень мРНК GATA4 в мГК выше, чем в нормальной печени взрослой мыши. В 6ГК и в ее культуре экспрессия этого фактора подавлена (Рис. 2Б).

е. FTF

FTF - сиротский ядерный рецептор, который активирует ген АФП в эмбриональной печени (Bernier et al., 1993). Транскрипция гена FTF активируется HNF4ci, факторами GATA и FTF (Pare et al., 2001). В промоторах генов HNF3P,

HNF4a1 и HNF1a выявлены двойные сайты связывания FTF (Galameau et al., 1996).

Высокий уровнь мРНК гена FTF выявлен в образцах из мГК и нормальной печени мыши. В 6ГК и культуре НЗЗ экспрессия гена FTF полностью подавлена. Таким образом, экспрессия FTF четко коррелирует с экспрессией HNF4a (Рис. 2Б).

ж. COUP-TF

При прогрессии ГК наблюдается обратная корреляция между экспрессией HNF4a и уровнем транскрипции ядерного рецептора COUP-TFI. Уровень мРНК COUP-TFI в 6ГК и НЗЗ заметно повышен по сравнению с мГК и нормальной печенью (Рис. 2Б).

При восстановлении экспрессии гена HNF4a в трансфицированных клонах культуры НЗЗ экспрессия гена COUP-TFI значительно снижается (Рис. 55). Таким образом, впервые показана способность фактора HNF4a подавлять транскрипцию гена COUP-TFI.

Уровни транскрипции гена COUP-TFI1 в проанализированных образцах различаются незначительно и, вероятно, влияния на экспрессию других факторов в изучаемой системе ГК не оказывают (Рис. 2В).

По литературным данным, у мышей с делецией локуса hsdr-1 на седьмой хромосоме существенно снижена экспрессия генов HNF4a (2 хромосома, 94.0 сМ) и HNF1 (5 хромосома, 65.0 сМ) (Tonjes et al., 1992). Это указывает на существование на этой хромосоме генов, способных осуществлять регуляцию транскрипции гена HNF4a. При анализе геномных баз данных мы выяснили, что на седьмой хромосоме расположены локусы генов HNF3y (7 хромосома, 6.5 сМ) и COUP-TFII (7 хромосома, 33.0 сМ), все остальные исследованные нами гены расположены на других хромосомах. Этот факт свидетельствует о возможности регуляции экспрессии гена HNF4a факторами HNF3y и COUP-TFII. Однако экспрессия COUP-TFII при гепатоканцерогенезе не изменяется, а экспрессия гена HNF3y восстанавливается при экзогенной экспрессии гена HNF4a в трансфицированных клонах, чего не могло бы произойти при делеции гена HNF3y.

Таким образом, подавление транскрипции HNF4a при профессии ГК не может быть объяснено делецией генов HNF3y и COUP-TFII.

Поскольку произошедшая прогрессия была скачкообразной, а изменения, сопровождавшие ее, были чрезвычайно резкими, скорее всего, причиной прогрессии послужило качественное изменение в экспрессии неких ключевых регуляторов.

Эпителиальна-меэенхимальный переход при прогрессии ГК.

Произошедшие изменения морфологических свойств при прогрессии ГК можно определить как эпителиально-мезенхимальный переход (ЕМТ). Процессы ЕМТ происходят при малигнизации опухолей эпителиального происхождения. Одним из индукторов ЕМТ является транскрипционный регулятор Snail (Hemavathy et al„ 2000).

Нами показано, что профессия ГК сопровождается активацией гена Snail. Уровень транскрипции гена Е-кадхерина при прогрессии от мГК к 6ГК катастрофически снижается. Таким образом экспрессия гена Snail, который является репрессором гена Е-кадхерина, обратно коррелирует с его экспрессией в ГК при прогрессии. В клетке Е-кадхерин обеспечивает адгезию и латеральную полярность. В 6ГК происходит утрата полярности клеток и ослабление межклеточных контактов, что может являться следствием утраты Е-кадхерина при прогрессии ГК (Рис. 3).

м i ш

I £ £

S Ю X 1С

HNF4a Е-кадхерин р- катенин >

Snail ШШ

Рисунок 3. Транскрипция генов, влияющих на эпителиальные свойства гепатоцитов, при прогрессии ГК. Результаты ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к Snail, Е-кадхерину и р-катенину. В качестве контроля количества РНК, взятой в реакцию, приведен ОТ-ПЦР с праймерами к HPRT и р-актину.

р-актин ¡Щ/ф^ ■

Уровень экспрессии р-катенина при прогрессии ГК не изменяется. По данным Е.И.Кудрявцевой при имунохимическом окрашивании антителами к р-катенину ядерного окрашивания в 6ГК и НЗЗ не выявлено (Кудрявцева и др., 2001). Таким образом, несмотря на то, что нарушение пути передачи сигнала, связанного с р-катенином, является довольно частым событием при гепатоканцерогенезе, при рассматриваемой прогрессии ГК этот механизм, видимо, не был затронут (Рис. 3).

Таким образом, при профессии происходит одновременное падение уровня транскрипции гена HNF4a и индукция гена Snail. В дальнейшем мы планируем выяснить вопрос о существовании взаимосвязи экспрессией HNF4a и

транскрипционного регулятора Snail. Для этого необходимо выяснить, изменяется ли уровень мРНК гена Snail после восстановления экспрессии гена HNF4a в культуре НЗЗ (Рис. 3).

Индукция активности гена с-тус и активация теломвразного комплекса.

Активность теломеразы является маркером уровня пролиферации клеток. В подавляющем большинстве нормальных клеток человека за редким исключением активность теломеразы не проявляется. В ГК человека активность теломеразы заметно повышена в 85-90% случаев (Tahara etal., 1995).

При характеристике мГК и 6ГК нами показано, что наряду с увеличением скорости пролиферации в 6ГК и культуре клеток НЗЗ происходит активация теломеразного комплекса (Рис. 4А).

х —

92 ^ ч; СО О

S L £ « Ü

с £ IQ х ЪИ Ъ£

ШШвШШШшШшшШйШ

НЯНЯ»

c-myc

С 2 Ю X Ьй

Рисунок 4. Изменение активности теломеразы и транскрипции генов mTERT, c-myc и ODC при прогрессии ГК. А) Результаты TRAP-анализа экстрактов из нормальной печени, мГК, 6ГК и культуры клеток НЗЗ. Перед проведением TRAP-анализа экстракты выровнены по количеству белка. Б) Результаты ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к mTERT, c-myc и ODC. В качестве контроля количества РНК, взятой в реакцию, приведен ОТ-ПЦР с праймерами к HPRT.

c-myc - онкоген, вовлеченный в контроль клеточной пролиферации и дифференцировки, часто активированный в опухолях различного происхождения (Henriksson and Luscher, 1996).

c-myc непосредственно регулирует активность тепомеразы (Nugent et al., 1998) посредством индукции экспрессии гена каталитической субъединицы тепомеразы (TERT) (Lingner et al., 1997, Nakamura et al., 1997).

При прогрессии происходит активация гена c-myc. В 6ГК и НЗЗ активирована транскрипция генов mTERT и орнитин-декарбоксилазы (ODC). Так как эти гены являются непосредственными мишенями фактора c-myc, можно говорить о том, что индуцированный в 6ГК c-myc является функционально активным. Не исключено, что именно гипер-экспрессия онкогена c-myc явилась причиной прогрессии ГК (Рис. 4Б).

Таким образом, прогрессия от мГК к 6ГК сопровождается: / утратой морфологических признаков дифференцировки, а также подавлением

экспрессии генов - маркеров дифференцировки (СА, ТТР); / снижением уровня экспрессии HNF4a;

/ снижением уровня экспрессии генов HNF1, C/EBPa, HNF3y, HNF6, GATA4, FTF; ^ активацией экспрессии ядерного рецептора COUP-TFI, генов c-myc, mTERT и

транскрипционного регулятора Snail, s утратой эпителиального фенотипа, одной из характерных особенностей которого является падение экспрессии Е-кадхерина.

Восстановление экспрессии гена HNF4a.

Прогрессия ГК, наблюдаемая на данной модели, затрагивает фундаментальные свойства клеток гепатоцитарного происхождения.

Для проверки гипотезы о том, что именно снижение уровня экспрессии HNF4a стало причиной значительных фенотипических изменений, наблюдаемых в описываемой модели прогрессии ГК, мы поставили цель проанализировать последствия восстановления экспрессии гена HNF4a в культуре клеток 6ГК (Рис. 5А). Экспрессия HNF4a в стабильно трансфицированных клонах была подтверждена с помощью ОТ-ПЦР, однако она была значительно ниже, чем в мГК,

Утрата экспрессии HNF4a в 6ГК и НЗЗ сопровождается подавлением экспрессии ТФН, ТТР и СА. В клонах, трансфицированных HNF4a, мы наблюдали восстановление уровня экспрессии гена ТФН, восстановления экспрессии генов СА и ТТР не происходило. Это может быть связано с тем, что помимо сайтов

HNF1 и HNF4a для экспрессии гена ТТР важны сайты связывания факторов HNF3 и С/ЕВР, а для CA - еще сайт GATA4 (Cereghini, 1996; Locker, 2001).

Регуляцию экспрессии гена ТФН осуществляет белок HNF4a наряду с другими транс-активаторами С/ЕВРа, HNF3 и HNF1 (Sladek et al„ 1990). Снижение уровня экспрессии ТФН в 6ГК и его восстановление после трансфекции HNF4a указывает на то, что экспрессия гена ТФН зависит от HNF4a, но может происходить и в его отсутствие, видимо, за счет активации другими транскрипционными факторами, возможно HNF3ß и С/ЕВРа.

Таким образом, при восстановлении экспрессии HNF4a происходит частичное восстановление уровня дифференцировки.

_ £ LL V <? "? Р.

^ UL ц. п.. ¿г

LL-

ь-

оо ю О

Li. LL. LL ^

HNF4a HNF1

С/ЕВРа »ж«'»«*«®* HNF3Y I HNF6

COUP-TFI HPRT

«»* -wet* «■•»> 30 он

'» V- If

< V 27 ck

Рисунок 5. Восстановление экспрессии генов при экзогенной экспрессии HNF4a. k-FI - контрольная культура, FI-1, FI-3, FI-5 - трансфицированные клоны. А) OT-ПЦР с праймерами к HNF4a, HNF4a1 и HNF4a7. Б) Результаты OT-ПЦР со специфическими праймерами к HNF1, HNF3y, HNF6, FTF и COUP-TFI. Для контроля количества РНК, взятой в реакцию, приведен OT-ПЦР с праймерами к HPRT.

Восстановление экспрессии гепато-спвцифических

транскрипционных регуляторов.

Анализируя последствия восстановления экспрессии HNF4a в ГК, мы наблюдали значительное снижение уровня HNF4a во время длительного культивирования трансфицированных клонов. Это наблюдение говорит о существовании in vitro селекции в пользу клеток с пониженным уровнем экспрессии HNF4a и необходимости использовать только ранние пассажи клеток для изучения роли HNF4a в прогрессии ГК.

Необходимо отметить, что отсутствие ре-экспрессии какого-либо гена может быть объяснено как тем, что экзогенная экспрессия HNF4а не может восстановить его транскрипцию или для восстановления транскрипции необходима не только экспрессия трансгена, так и тем, что для восстановления транскрипции необходим более высокий и стабильный уровень экспрессии трансгена. Возможно, чувствительность метода ОТ-ПЦР недостаточна для определения полного спектра HNF4a - респонсивных генов.

Таким образом, приведенные данные соответствуют только однозначным результатам, которые удалось получить.

Под воздействием трансгена помимо восстановления экспрессии HNF4a мы наблюдали (Рис. 5Б):

• восстановление экспрессии HNF1a, HNF3y. Мы впервые получили свидетельства того, что HNF4a прямо или косвенно регулирует экспрессию генов HNF6 и HNF4a7.

• активацию транскрипция ядерного рецептора FTF (показано впервые).

» в нашей системе экспрессия HNF4a подавляет транскрипцию гена COUP-TFI. Это свидетельство того, что HNF4a может прямо или опосредованно регулировать активность COUP-TFI.

Для анализа универсальности закономерностей, выявленных в ходе исследования одноступенчатой прогрессии, мы воспользовались коллекцией перевиваемых мышиных ГК, которые можно условно разделить по скорости роста и уровню дифференцировки на медленнорастущие дифференцированные ГК (мвГК) и быстрорастущие низкодифференцированные ГК (бнГК).

Необходимо отметить четкую взаимосвязь экспрессии гена HNF4a и уровня дифференцировки ГК. При сравнении уровней экспрессии генов в мвГК и бнГК мы подтвердили следующие факты, выявленные при исследовании прогрессии ГК (Табл. 1):

Образцы | печень Гены НЫР4а НЫР4а1

вмГК

нбГК

НЫР4а7

НЫР1

__________Пояснения к таблице 2.

ЩЩ ген экслрессируется - отсутствие экспрессии гена норма экспрессии гена (печень взрослой мыши)

Перечень образцов ГКК, используемых в эксперименте:

мвГК:

1 — мГК (ВОР1 415) 2-Р1 326 3 - ОВР 235 $3

4- ОВР 268 510

5-РВЯ ?5

бнГК: 6 - 6ГК (ВЭР1 674) 7 - ОВР 265 <?8

8-ОВР 216 ¿45

9-02 378

10 - 371,372 ¿14

11 -Н36 0ВР 684 12-ВОР 666

Таблица 2. Экспрессия генов ГЯФ и транскрипционных факторов в опухолях коллекции перевиваемых ГК мышей. мвГК — медленнорастущие высокодифференцированные ГК, бнГК — быстрорастущие низкодифференцированные ГК, печень - нормальная печень взрослой мыши (результаты ОТ-ПЦР).

• экспрессия гена HNF4a7 индуцируется в мвГК по сравнению с печенью и

полностью подавлена в бнГК; » экспрессия гепатоцитарных ядерных факторов HNF1, VHNF1, C/EBPa, HNF4a1 и HNF3y; энтодермального фактора GATA4, ядерного рецептора FTF и маркера дифференцировки СА сохраняется в мвГК и полностью подавлена в бнГК;

» экспрессия HNF6 и энтодермального фактора GATA4 сохраняется в мвГК и

подавлена в части бнГК; » экспрессия транскрипционного регулятора COUP-TFI во всех бнГК активируется;

» в некоторых бнГК активируется ген Snail, подавленный во всех мвГК; « уровни мРНК С/ЕВРр, HNF3a, HNF3p, раннего энтодермального фактора GATA6, а также ядерного рецептора COUP-TFII не изменились (либо эти изменения не носят общего характера).

Показана способность HNF4a подавлять экспрессию фактора COUP-TFI. Это первое указание на то, что существует обратная корреляция между уровнем дифференцировки и экспрессией фактора COUP-TFI.

Фактор COUP-TFI в нормальной печени экспрессируется на низком уровне. Возможно, утрата гепато-специфических свойств при де-дифференцировке может происходить не только за счет подавления экспрессии гепато-специфических фаеторов, но и за счет активации регуляторов, не специфичных для печени. Такие факторы за счет репрессорных или конкурентных механизмов вносят свой вклад в утрату тканевой специфичности экспрессии.

По-видимому, гены, экспрессию которых мы не наблюдали в бнГК, потенциально могут являться причиной произошедшей прогрессии ГК мышей. По крайней мере, показано, что при прогрессии ГК целая группа генов регулируется координированно.

В то же время, гены, экспрессия которых практически не изменяется, имеют Н№4а-независимые пути регуляции и, по-видимому, их участие в прогрессии маловероятно.

Необходимо отметить, что исследуемая в этой работе прогрессия произошла в одной из мвГК, которая является частью системы перевиваемых опухолей. Таким образом, значимость модели, состоящей из мГК и

выицепившегося из нее в результате скачкообразной прогрессии варианта 6ГК, возрастает.

Помимо корреляции с уровнем дифференцировки, падение экспрессии НЫР4а в этом случае сопровождается прогрессией, «озлокачествлением» фенотипа ГК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Мы провели исследование молекулярных механизмов, которые отвечают за поддержание дифференцировочного статуса опухолей печени. Нарушение процессов дифференцировки - ее блокировка или искажение - является характерной особенностью опухолевого роста. ГК обладают двумя особенностями: снижением проявлений дифференцировки по мере развития опухоли и сохранением способности к ре-дифференцировке даже при внешней утрате признаков дифференцировки (Абелев, 2000).

Мы обнаружили, что при прогрессии ГК утрата дифференцировки и эпителиальных свойств коррелирует с исчезновением НЫР4а. Одновременно с этим при прогрессии ГК происходит координированное изменение спектра экспрессии целого блока ткане-специфических регуляторов. Ре-экспрессия Н№Р4а приводит к частичной реверсии де-дифференцированного фенотипа.

Репортерный вектор люциферазы под контролем регуляторного района гена НЫР4а в клетках НЗЗ неактивен, что свидетельствует о том, что причиной отсутствия мРНК НМР4а является подавление транскрипции гена, а не мутации в кодирующей области или в регуляторном районе гена (Н.Л. Лазаревич, неопубликованные данные). Все эти данные указывают на то, что именно изменения («поломка» гена - позитивного регулятора или, наоборот, активация репрессора) экспрессии гена, находящегося в пути передачи сигнала выше НЫР4а и прямо или косвенно регулирующего его транскрипцию, явились причиной прогрессии ГК. Описанная экспериментальная система представляется удобной моделью для идентификации такого фактора.

выводы

1. Впервые показано, что экспрессия HNF4a четко коррелирует с уровнем дифференцировки химически, индуцированных гепатокарцином мышей.

2. Впервые описана активация эмбриональных изоформ HNF4a в ГК, сохранивших ткане-специфические свойства. При прогрессии ГК и утрате гепато-специфической экспрессии транскрипция этих изоформ подавляется.

3. Исследованы свойства скачкообразной прогрессии от медленнорастущей высокодифференцированной гепатомы (мГК) к быстрорастущему дедифференцированному варианту (6ГК).

При прогрессии происходит:

• подавление экспрессии генов маркеров дифференцировки СА, ТТР, ТФН и онко-эмбрионального маркёра АФП,

» подавление экспрессии ГЯФ: HNF1, G/EBPa, HNF3y HNF4a и HNF6, ранних энтодермальных факторов GATA4 и GATA6 и ядерного рецептора FTF;

• индукция экспрессии ткане-специфического регулятора COUP-TFI;

• активация транскрипционного регулятора Snail;

» активация теломеразного комплекса;

• индукция экспрессии генов с-тус и его гена-мишени ODC;

• утрата эпителиальной морфологии, коррелирующая с подавлением экспрессии гена Е-кадхерина.

4. Выявленные закономерности подтверждены при исследовании коллекции мышиных гепатокарцином.

5. экзогенная экспрессия HNF4a в культуре нзз быстрорастущей дедифференцированной гепатомы восстанавливает:

• некоторые эпителиальные свойства;

• экспрессию некоторых гепато-специфических генов: HNF6, HNF3y, HNF4a7, ядерного рецептора FTF и подавляет транскрипцию гена COUP-TFI.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1 Е.В. Варга, О.А. Черемнова, Д.А. Овчинников, А.Ю. Шапигуэов, Е.И.

Кудрявцева, О.В. Морозова, Н.В. Энгельгардт и Н.Л. Лазаревич (2001). Экспрессия ткане-специфических генов при прогрессии гепатокарцином мыши. Генетика, 37(6):803-10.

2 О.А. Черемнова, Д.А. Овчинников, Е.В. Варга, Н.Л. Лазаревич (1998). Экспрессия печень-специфических генов в новой модели медленно-и быстрорастущих гепатокарцином». 6-Международная студенческая конференция "Ломоносов-99", Сборник тезисов конференции: Р15.

3 О.А. Cheremnova, E.V. Varga, D.A. Ovchinnikov, E.I. Kudrjavtseva, O.V. Morozova, N.V. Engelhardt and N.L. Lazarevich (2001). Association of mTERT and c-myc gene expression with hepatocarcinoma progression. XXIX International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM) Meeting and VIII International Symposium "Biology and Clinical Usefulness of Tumor Markers", Tumor Biology, p.56.

4 O.A. Cheremnova, E.V. Varga, E.I. Kudrjavtseva, O.V. Morozova, D.A. Ovchinnikov, A.Y. Shapiguzov, N.V. Engelhardt and N.L. Lazarevich (2001). Hepatocyte nuclear factors in hepatocarcinoma progression. Rodolphe Brupbacher Foundation Fifth Scientific Symposium "Clinical and Basic Oncology: New Developments", Abstract book, 18.

5 N. Lazarevich, O. Cheremnova, E. Varga, D. Ovchinnikov, D. Fleishman, E. Kudrjavtseva, O. Morozova, N. Engelhardt. Tumor progression of mouse transplantable hepatocarcinomas: analyses of biological properties and gene expression. (2002). FASEB Summer Research Conference, Abstract book, X-15.

6 D.A.Ovchinnikov, OACheremnova, E.V.Varga, E.I.Kudrjavtseva, O.V.Morozova, A.Y.Shapiguzov, N.V.Engelhardtand and N.L.Lazarevioh (2000). Effects of HNF4 reexpresslon on the differentiation status of fast-growing mouse hepatocarcinoma. "ELSO 2000 Meeting", Eropean Journal of Cell Biology; 79 (suppl. 52):177.

7 N. Lazarevich, O. Cheremnova, E. Varga, D. Ovchinnikov, E. Kudrjavtseva, O. Morozova, D. Fleichman, N. Engelhardt. Comparative analyses of main properties and gene expression during mouse HCC one-step progression. EACR-17 Meeting, Abstract book, OS-12.

8 E.V. Varga, O.A. Cheremnova, D.A. Ovchinnikov, E.I. Kudrjavtseva, O.V. Morozova, D.I. Fleichman, N.V. Engelhardt and N.L4: Lazarevich (2001). Steroid family nuclear receptor HNF4 expression increases differentiation level in a hepatocellular

Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия» Москва, Воробьевы горы, МГУ, 1 Гуманитрпый корпус. www.stprint.ni e-mail: zakaz@Stprint.ru, тел 939-3338 Заказ №219, тираж 100 экз. Подписано в печать 05,10.2002,

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Черемнова, Оксана Александровна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы Ю

Краткий обзор семейств гепатоцитарных ядерных факторов.

Семейство С/ЕВР. Ю

Семейство HNF

Супер-семейство ядерных рецепторов

Развитие печени

Семейство GATA

Развитие поджелудочной железы 33 Обобщение сведений о локализации и влиянии ГЯФ на гепато-специфическую экспрессию.

Обеспечение гепатоцитарного фенотипа - взаимная регуляция ГЯФ.

HNF4 - один из важнейших ГЯФ

Роль ГЯФ при регенерации и вирусной инфекции

Нарушения экспрессии ГЯФ

Гепатоцеллюлярные карциномы

ГЯФ при канцерогенезе

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция экспрессии специфических белков печени и транскрипционных факторов в гепатокарциномах мышей"

Актуальность исследования.

Вирусные инфекции вызывают хронические воспаления печени, при которых в ткани высок уровень клеточной смерти и пролиферации. Это пренеопластическая стадия; при стимуляции, например, оксидативным стрессом или воспалительными цитокинами, происходит злокачественная трансформация клеток (Buendia, 2000).

Прогрессия ГК сопровождается снижением уровня дифференцировки, сопряженным с подавлением экспрессии ткане-специфических генов, увеличением скорости пролиферации клеток, утратой эпителиальной морфологии, приобретением инвазивности и способности к метастазированию. Однако карциномы часто сохраняют способность к ре-дифференцировке.

Возможность реверсии низко-дифференцированных гепатом к более дифференцированным была показана in vitro (Spath and Weiss, 1998) при экзогенной экспрессии гена гепатоцитарного ядерного фактора (HNF) 4а - специфичного для печени регулятора транскрипции.

В настоящей работе роль ГЯФ в профессии ГК исследована на созданной в НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН коллекции перевиваемых ГК мыши, полученных из химически индуцированных первичных опухолей. В эту коллекцию входят также две ГК единого происхождения, резко различающиеся по скорости роста и уровню дифференцировки: медленно-растущая дифференцированная ГК мыши (мГК) и одномоментно выщепившийся из нее на раннем пассаже, по-видимому, в результате инактивации одного или немногих ключевых генов, быстро-растущий де-дифференцированный вариант (6ГК).

Цели и задачи исследования.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:

• Провести сравнительную характеристику медленной и быстрой ГК мышей с целью идентификации генов, в экспрессии которых при скачкообразной прогрессии от мГК к 6ГК произошли существенные изменения.

Научная новизна и практическая ценность работы

Нами показано, что при прогрессии произошли резкие изменения в экспрессии целого блока ГЯФ и других транскрипционных регуляторов. Значительно снижена экспрессия HNF1, vHNFl, C/EBPa, HNF4a, HNF3y и HNF6, ядерного рецептора FTF и энтодермального фактора GATA4 и активируется транскрипция ядерного рецептора COUP-TFI. Изменений в экспрессии ряда других транскрипционных факторов: С/ЕВРр, HNF3a, HNF3P, ядерного рецептора COUP-TFII, энтодермального фактора GATA 6 не произошло. Основные закономерности экспрессии ГЯФ, выявленные на этой модели, подтверждены на коллекции химически индуцированных ГК с различным уровнем дифференцировки.

При прогрессии ГК активируется экспрессия транскрипционного регулятора Snail -индуктора эпителиально-мезенхимального перехода.

Апробация работы

Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры Вирусологии МГУ им. М.В. Ломоносова и лаборатории Иммунохимии НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 7 апреля 2001 года. Доклад по теме диссертации ("Экспрессия печень-специфических генов в новой модели быстро- и медленно-растущих гепатокарцином мышей") был признан лучшим на VI Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-99", секция "Биология", подсекция "Вирусология". Материалы исследований, представленных в работе, докладывались на международных конференциях: XXIX International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM) Meeting and VIII International Symposium "Biology and Clinical Usefulness of Tumor Markers", 2001; Rodolphe Brupbacher Foundation Fifth Scientific Symposium "Clinical and Basic Oncology: New Developments", 2001.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем работы

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Черемнова, Оксана Александровна

выводы

1. Впервые показано, что экспрессия HNF4a четко коррелирует с уровнем дифференцировки химически индуцированных гепатокарцином мышей.

При прогрессии происходит:

• подавление экспрессии генов маркеров дифференцировки СА, ТТР, ТФН и онко-эмбрионального маркера АФП,

• подавление экспрессии ГЯФ: HNF1, C/EBPa, HNF3y HNF4a и HNF6, ранних энтодермальных факторов GATA4 и ядерного рецептора FTF;

• индукция экспрессии ткане-специфического регулятора COUP-TFI;

• активация транскрипционного регулятора Snail;

• активация теломеразного комплекса;

• индукция экспрессии генов с-тус и его гена-мишени ODC;

• утрата эпителиальной морфологии, коррелирующая с подавлением экспрессии гена Е-кадхерина.

4. Выявленные закономерности подтверждены при исследовании коллекции мышиных гепатокарцином.

5. Экзогенная экспрессия HNF4a в культуре НЗЗ быстрорастущей дедифференцированной гепатомы восстанавливает:

• некоторые эпителиальные свойства;

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Черемнова, Оксана Александровна, Москва

1. Абелев, Г.И. (2000). Механизмы дифференцировки и опухолевый рост. Биохимия 65(1): 127-138.

2. Варга, Е.В. (2002). ГЯФ и опухолевые маркеры при прогрессии гепатокарцином. Дисс. на соискание ученой степени канд. биол. наук., М.

3. Варга, Е.В., Черемнова, О.А. Овчинников, Д.А., Шапигузов, А. Кудрявцева. Е.И. Морозова, О.В., Энгельгардт, Н.В., Лазаревич, Н.Л. (2001). Экспрессия тканеспецифических генов при прогрессии гепатокарцином мыши. Генетика 37(6): 80310.

4. Копнин, Б.П. (2000). Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза. Биохимия 65(1): 5-33.

5. Кудрявцева, Е.И., Морозова, О.В., Рудинская, Т.Д., Энгельгардт, Н.В. (2001). Нарушение межклеточных контактов и взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом в быстрорастущей гепатокарциноме мышей. Архив Патологии 4: 33-37.

6. Куприна, Н.И. (1965). Органоспецифические антигены в печени и экспериментальных гепатомах. Дисс. на соискание ученой степени канд. биол. наук. М.

7. Урываева, И.В., Бродский, В. (1972). Особенности репродукции гепатоцитов при регенерации печени мыши. Цитология 14(10): 1219-28.

8. Урываева, И.В., Фактор, В.М. (1975). Фракция роста печени, ее состав по плоидности клеток и изменение при старении. Онтогенез 6(5): 458-465.

9. Энгельгардт, Н.В., Кудрявцева, Е.И., Морозова, О.В., Рудинская, Т.Д. (2000). Скачкообразная прогрессия перевиваемой гепатокарциномы мышей, сопряженная с утратой полярности клеток. Архив Патологии 62(3): 24-29

10. Abelev, G.I. (1965). Antigenic structure of chemically-induced hepatomas. Prog Exp Tumor Res 7: 104-57.

11. Abelev, G.I. (1993). Alpha-fetoprotein biology. Sov. Sci. Rev. D. Physicochem. Biol. 11: 85-109.

12. Abelev, G.I., Perova, S., Khramkova, N.I., Postnikova, Z.A., Irlin, I. (1963). Production of embrional alpha-globulin by the transplantable mouse hepatomas. Transplant. Bull 1: 174180.

13. Adjei, A.A. (2001). Blocking oncogenic Ras signaling for cancer therapy. J Natl Cancer Inst 93(14): 1062-74.

14. Amati, S., Land, Ph. (1994). Myc-Max-Mad: a transcription factor network controlling cell cycle progression, differentiation and death. Curr Opin Genet Dev. 4(1): 102-8.

15. Ang, S.L., Wierda, A., Wong, D., Stevens, K.A., Cascio, S., Rossant, J., Zaret, K.S. (1993). The formation and maintenance of the definitive endoderm lineage in the mouse: involvement of HNF3/forkhead proteins. Development 119(4): 1301-15.

16. Ayer, D. (1999). Histone deacetylases: transcriptional repression with SINers and NuRDs. Trends Cell Biol 9: 193-198.

17. Bach, I., Galcheva-Gargova, Z., Mattei, M.G., Simon-Chazottes, D., Guenet, J.L., Cereghini, S., Yaniv M. (1990). Cloning of human hepatic nuclear factor 1 (HNF1) and chromosomal localization of its gene in man and mouse. Genomics 8(1): 155-64.

18. Bach, I., Mattei, M.G., Cereghini, S., Yaniv M. (1991). Two members of an HNF1 homeoprotein family are expressed in human liver. Nucleic Acids Res 19(13): 3553-9.

19. Bach, I., Pontoglio, M., Yaniv M. (1992). Structure of the gene encoding hepatocyte nuclear factor 1 (HNF1). Nucleic Acids Res 20(16): 4199-204.

20. Bach, I., Yaniv M. (1993). More potent transcriptional activators or a transdominant inhibitor of the HNF1 homeoprotein family are generated by alternative RNA processing. EMBOJ 12(11): 4229-42.

21. Bailly, A., Torres-Padilla, M.E., Tinel, A.P., Weiss, M.C. (2001). An enhancer element 6 kb upstream of the mouse HNF4alphal promoter is activated by glucocorticoids and liver-enriched transcription factors. Nucleic Acids Res 29(17): 3495-505.

22. Batsche, E., Muchardt, C., Behrens, J., Hurst, H.C., Cremisi, C. (1998). RB and c-Myc activate expression of the E-cadherin gene in epithelial cells through interaction with transcription factor AP-2. Mol Cell Biol, 18(7):3647-58.

23. Baumhueter, S., Courtois, G., Crabtree G.R. (1988). A variant nuclear protein in dedifferentiated hepatoma cells binds to the same functional sequences in the beta fibrinogen gene promoter as HNF-1. EMBO J 7(8): 2485-93.

24. Baumhueter, S., Mendel, D.B., Conley, P.B., Kuo, C.J., Turk, C., Graves, M.K., Edwards, C.A., Courtois, G., Crabtree G.R. (1990). HNF-1 shares three sequence motifs with the POU domain proteins and is identical to LF-B1 and APF. Genes Dev 4(3): 372-9.

25. Bello-Fernandez C., Packham G., Cleveland JL. (1993). The ornithine decarboxylase gene is a transcriptional target of c-Myc. Proc Natl Acad Sci USA, 90(16): 7804-8.

26. Bergsland, E.K., Venook, A.P. (2000). Hepatocellular carcinoma. Curr Opin Oncol 12(4): 357-61.

27. Blumenfeld, M., Maury, M., Chouard, Т., Yaniv, M., Condamine, H. (1991). Hepatic nuclear factor 1 (HNF1) shows a wider distribution than products of its known target genes in developing mouse. Development 113: 589-599.

28. Bodnar, P.M., Kononenko, L.O. (1998). Glucobay in the therapy of patients with non-insulin-dependent diabetes mellitus. Lik Sprava, 3: 111-4.

29. Boj, S.F., Parrizas, M., Maestro, M.A., Ferrer, J. (2001). A transcription factor regulatory circuit in differentiated pancreatic cells. Proc Natl Acad Sci USA 98(25): 14481-6.

30. Bossard, P., Zaret, K. (1998). GATA transcription factors as potentiators of gut endoderm differentiation. Development 125: 4909-17.

31. Bracke, M.E., Van Roy, F.M., Mareel, M.M. (1996). The E-cadherin/catenin complex in invasion and metastasis. Curr Top Microbiol Immunol, 213 (1): 123-61.

32. Buchkovich, K.J., Greider, C.W. (1996). Telomerase regulation during entry into the cell cycle in normal human T cells. Mol Biol Cell, 7(9): 1443-54.

33. Buendia, M.A. (2000). Genetics of hepatocellular carcinoma. Semin Cancer Biol 10(3): 185-200.

34. Bulla, G.A., Fournier,. R.E.K., (1992). Selection of hepatoma cell variants deficient in alpha 1-antitrypsin gene expression. Somat. Cell. Mol. Genet., 18: 361- 370.

35. Bulla, G.A., Fournier, R.E. (1994). Genetic analysis of a transcriptional activation pathway by using hepatoma cell variants. Mol Cell Biol 14(11): 7086-94.

36. Carver, E.A., Jiang, R., Lan, Y., Oram, K.F., Gridley, T. (2001). The mouse snail gene encodes a key regulator of the epithelial-mesenchymal transition. Mol Cell Biol, 21(23): 8184-8.

37. Cascio, S., Zaret, K. (1991). Hepatocyte differentiation initiates during endodermal-mesenchymal interactions prior to liver formation. Development 113: 217-215.

38. Cereghini, S. (1996). Liver-enriched transcription factors and hepatocyte differentiation. FASEB J 10(2): 267-82.

39. Cereghini, S., Blumenfeld, M., Yaniv M. (1988). A liver-specific factor essential for albumin transcription differs between differentiated and dedifferentiated rat hepatoma cells. Genes Dev 2(8): 957-74.

40. Cereghini, S., Ott, M.O., Power, S., Maury M. (1992). Expression patterns of vHNFl and HNF1 homeoproteins in early postimplantation embryos suggest distinct and sequential developmental roles. Development 116(3): 783-97.

41. Chang, C.J., Chen, Y.L., Lee, S.C. (1998). Coactivator TIFlp interacts with transcription factor C/EBPp and glucocorticoid receptor to induse al-acid glycoprotein gene expression. Mol Cell Biol 18: 5880-87.

42. Chaya, D., Fougere-Deschatrette, C., Weiss, M.C. (1997). Liver-enriched transcription factors uncoupled from expression of hepatic functions in hepatoma cell lines. Mol Cell Biol, 17 (11): 6311-20.

43. Chen, M., Ou, J.H. (1995). Cell type-dependent regulation of the activity of the negative regulatory element of the hepatitis В virus core promoter. Virology 214(1): 198-206.

44. Chen, H.L., Wu, X.Z., Tong, H., Qureshi, I.A. (1997). Correlation between the Dynamic • Changes of Lipids and Phospholipases during Induced Hepatocarcinogenesis. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai), 29(5):489-94.

45. Chen, P.L., Riley, D.J., Chen, Y., Lee, W.H. (1996). Retinoblastoma protein positivly regulates terminal adiposyte differentiation through direct interaction with C/EBPs. Genes Dev. 10: 2794-2804.

46. Cirillo, L., Zaret, K. (1999). An early developmental transcription factor complex that is md ••'able on nucleosome core particles than on free DNA. Mol Cell 4: 961-969.

47. Ггк„ K.L., Halay, E.D., Lai, E., Burley S.K. (1993). Co-crystal structure of the HNFv.". \ .3/fork head DNA-recognition motif resembles histone H5. Nature 364(6436): 412-20.

48. Cockell, M., Stolarczyk, D., Frutinger, S., Hughes, G.J., Wellauer, P.K. (1995). Binding site HNF3- beta and gamma and pancreas transcription factor 1 are required for expression of the gene encoding pancreatic alfa-amylase. Moll Cell Biol, 15: 1933-41/

49. Coffinier, C., Thepot, D., Babinet, C., Yaniv, M., Barra J. (1999). Essential role for the homeoprotein vHNFl/HNFlbeta in visceral endoderm differentiation. Development 126(21): 4785-94.

50. Coffinier, C., Varra, J., Babinet, C., Yaniv, M. (1999a). Expression of the vHNFl/HNFlbeta homeoprotein gene during mouse organogenesis. Mech Dev 89(1-2): 211-13.

51. Cong, Y.S., Wen, J., Bacchetti, S. (1999). The human telomerase catalytic subunit hTERT: organization of the gene and characterization of the promoter. Hum Mol Genet, 8(1): 137-42.

52. Conneely, O.M., Kettelberger, D.M., Tsai, M.J., Schrader, W.T., O'Malley, B.W. (1989). The chicken progesterone receptor A and В isoforms are products of an alternate translation initiation event. J Biol Chem, 264(24): 14062-4.

53. Costa, R.H., Grayson, D.R., Jr. Darnell JE (1989). Multiple hepatocyte-enriched nuclear factors function in the regulation of transthyretin and alpha 1-antitrypsin genes. Mol Cell Biol 9(4): 1415-25.

54. Costa A, Pulido F, Rubio R, Cepeda C, Torralba M, Costa JR. (2002). Lipid changes in HIV-infected patients who started rescue therapy with an amprenavir/ritonavir-based highly active antiretroviral therapy. AIDS, 16(14): 1983-4.

55. Crowe, A.J., Sang, L., Li, K., Lee, K., Spear, В., Barton, M.C. (1999). Hepatocyte nuclear factor 3 relieves chrometin-mediated repression of the alpha-fetoprotein gene. J Biol Chem 274: 25113-25120.

56. Dabeva, M.D., Hurston, E., Sharitz, D.A. (1995). Transcription factor and liver-specific mRNA expression in facultative epithelial progenitor cells of liver and pancreas. Am J Pathol, 147(6): 1633-48.

57. DeSimone, V., L. De Magistris, D. Lazzaro, J. Gerstner, P. Monaci, A. Nicosia, R. Cortese (1991). LFB3, a heterodimer-forming homeoprotein of the LFB1 family, is expressed in specialized epithelia. Embo J 10(6): 1435-43.

58. Descombes, P., U. Schibler (1991). A liver-enriched transcriptional activator protein, LAP, and a transcriptional inhibitory protein, LIP, are translated from the same mRNA. Cell 67(3): 569-79.

59. Diehl, A.M. (1998). Roles of CCAAT/enhancer-binding proteins in regulation of liver regenerative growth. Journal Of Biological Chemistry 273(47): 30843-6.

60. Drewes, Т., Senkel, S., Holewa, В., Ryffel G.U. (1996). Human hepatocyte nuclear factor 4 isoforms are encoded by distinct and differentially expressed genes. Mol Cell Biol 16(3): 92531.

61. Duncan, S.A., Nagy, A., Chan, W. (1997). Murine gastrulation requires HNF-4 regulated gene expression in the visceral endoderm: tetraploid rescue of Hnf-4(-/-) embryos. Development 124(2): 279-87.

62. Duncan, S.A., Navas, M.A., Dufort, D., Rossant, J., Stoffel M. (1998). Regulation of a transcription factor network required for differentiation and metabolism. Science 281(5377): 692-5.

63. Edlund, M., Wikstrom, K., Toomik, R., Ek, P., Obrink, B. (1998). Characterization of protein kinase C-mediated phosphorylation of the short cytoplasmic domain isoform of C-CAM. FEBS, 425(1): 166-70.

64. Evans, R.M. (1988). The steroid and thyroid hormon receptor superfamily. Science, 240: 889-895.

65. Falvey, E., Marcacci, L., Schibler U. (1996). DNA-binding specificity of PAR and C/EBP leucine zipper proteins: a single amino acid substitution in the C/EBP DNA-binding domain confers PAR-like specificity to C/EBP. Biol Chem 377(12): 797-809.

66. Flodby, P., C. Barlow, H. Kylefjord, L. Ahrlund-Richter, K.G. Xanthopoulos (1996). Increased hepatic cell proliferation and lung abnormalities in mice deficient in CCAAT/enhancer binding protein alpha. J Biol Chem 271(40): 24753-60.

67. Frain, M., Swart, G., Monaci, P., Nicosia, A., Stampfli, S., Frank, R., Cortese R. (1989). The liver-specific transcription factor LF-B1 contains a highly diverged homeobox DNA binding domain. Cell 59(1): 145-57.

68. Friedman, A.D., Landshulz, W.H., McKnight, S.L. (1989). CCAAT/enhancer-binding protein activates the promoter of the serum albumin gene in cultured hepatoma cells. Genes Dev., 3: 1314-1322.

69. Fukuda-Taira, S. (1981). Hepatic induction in the avian embryo: specificity of reactive endoderm and inductive mesoderm. J Embryol Exp Morphol 63: 111-125.

70. Galarneau, L., Pare, J.F., Allard, D., Hamel, D., Levesque, L., Tugwood, J.D., Green, S., Belanger, L. (1996). The alpha 1-fetoprotein locus is activated by a nuclear receptor of the Drosophila FTZ-F1 family. Mol Cell Biol, 16(7):3853-65.

71. Garcia, A.D., Ostapchuk, P., and Hearing, P. (1993). Functional interaction of nuclear factors EF-C, HNF-4, and RXR alpha with hepatitis В virus enhancer I. J. Virol., 67: 3940-50.

72. Giroldi, L.A., Bringuier, P.P., de Weijert, M., Jansen, C., van Bokhoven, A., Schalken, J.A. (1997). Role of E boxes in the repression of E-cadherin expression. Biochem Biophys Res Commun, 241(2):453-8.

73. Greenbaum, L.E., Li, W., Cressman, D.E., Peng, Y., Ciliberto, G., Poli, V., Taub R. (1998). CCAAT enhancer- binding protein beta is required for normal hepatocyte proliferation in mice after partial hepatectomy. J Clin Invest 102(5): 996-1007.

74. Greider, C.W., Blackburn, E.H. (1985). Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell, 43(21):405-13

75. Greider, C.W., Blackburn, E.H. (1989). A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature, 337(6205):331 -7

76. Gregory, P., Horz, W. (1998). Life with nucleosomes: chromatin remodeling in gene regulation. Curr Opin Cell Biol 10: 339-345.

77. Gualdi, R., Bossard, P., Zheng, M., Hamada, Y., Coleman, J.R., Zaret, K.S. (1996). Hepatic specification of the gut endoderm in vitro: cell signaling and transcriptional control. Gene Dev 10: 1670-1682.

78. Hadzopoulou-Cladaras, M., Kistanova, E., Evagelopoulou, C., Zeng, S., Cladaras, C., Ladias, J.A. (1996). Functional domain of the HNF4. J. Biol. Chem. 272(1): 539-550.

79. Hall, A.J., Chuansumrit, A., Peake, I.R., Winship, P.R. (1994). A single base pair deletion in the promoter region of the factor IX gene is associated with haemophilia B. Thromb Haemost 72(6): 799-803.

80. Hall, R.K., Sladek, F.M., Granner D.K. (1995). The orphan receptors COUP-TF and HNF-4 serve as accessory factors required for induction of phosphoenolpyruvate carboxykinase gene transcription by glucocorticoids. Proc Natl Acad Sci U S A 92(2): 412-6.

81. Hann, H.W., Stahlhut, M.W., Rubin, R., Maddrey, W.C. (1992). Antitumor effect of deferoxamine on human hepatocellular carcinoma growing in athymic nude mice. Cancer, 70(8):2051-6.

82. Hanahan, D., Weinberg, R.A., (2000). The hallmarks of cancer. Cell 100(1): 57-70.

83. Harnish, D.C., Malik, S., Kilboume, E., Costa, R., Karathanasis S.K. (1996). Control of apolipoprotein Al gene expression through synergistic interactions between hepatocyte nuclear factors 3 and 4. J Biol Chem 271(23): 13621-8.

84. Hata, K. (1995). On the right track. The integrated IEC campaign succeeds in recruiting many acceptors in a fishing commune. Integration, 45:14-6.

85. Hatzis, P., Talianidis, I. (2001). Regulatory mechanisms controlling human hepatocyte nuclear factor 4alpha gene expression. Mol Cell Biol, 21(21): 7320-30.

86. Hayashi, Y., Wang, W., Ninomiya, Т., Nagano, H., Ohta, K., Itoh H. (1999). Liver enriched transcription factors and differentiation of hepatocellular carcinoma. Mol Pathol 52(1): 19-24.

87. Hayhurst, G.P., Lee, Y.H., Lambert, G., Ward, J.M., Gonzalez F.J. (2001). Hepatocyte nuclear factor 4alpha (nuclear receptor 2A1) is essential for maintenance of hepatic gene expression and lipid homeostasis. Mol Cell Biol 21(4): 1393-403.

88. Hemavathy, K., Ashraf, S.I., Ip, Y.T. (2000). Snail/slug family of repressors: slowly going into the fast lane of development and cancer. Gene, 257(1): 1-12.

89. Henderson, A.J., Calame, K.L. (1997). CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) sites are required for HTV-1 replication in primary macrophages but not CD4(+) T cells. Proc Natl Acad Sci USA 94(16): 8714-9.

90. Henriksson, M., Luscher, В. (1996). Proteins of the Мус network: essential regulators of cell growth and differentiation. Adv Cancer Res, 68:109-82

91. Hertz, R., Magenheim, J., Berrnan, I., Bar-Tana J. (1998). Fatty acyl-CoA thioesters are ligands of hepatic nuclear factor-4alpha. Nature 392(6675): 512-6.

92. Hibshoosh, H., Johnson, M., Weinstein, I.B. (1991). Effects of overexpression of ornithine decarboxylase (ODC) on growth control and oncogene-induced cell transformation. Oncogene, 6(5):739-43

93. Holewa, В., Pogge, E. (1996b). Transcriptional hierarchy in Xenopus embriogenesis: HNF4 is maternal factor involved in the developmental activation of the gene encoding the tissue specific transcription factor LFB1. Mech. Dev. 54: 45-57.

94. Jung, J., Zheng, M., Goldfarb, M., Zaret, K.S. (1999). Initiation of mammalian liver development from endoderm by fibroblast growth factors. Science 284: 1998-2003.

95. Kaestner, K.H., Hiemisch, H., Luckow, В., Schutz G. (1994). The HNF-3 gene family of transcription factors in mice: gene structure, cDNA sequence, and mRNA distribution. Genomics 20(3): 377-85.

96. Kaestner, K.H., Hiemisch, H., Schutz G. (1998). Targeted disruption of the gene encoding hepatocyte nuclear factor 3gamma results in reduced transcription of hepatocyte-specific genes. Mol Cell Biol 18(7): 4245-51.

97. Kaestner, K.H., Katz, J., Liu, Y., Drucker, D.J., Schutz G. (1999). Inactivation of the winged helix transcription factor HNF3alpha affects glucose homeostasis and islet glucagon gene expression in vivo. Genes Dev 13(4): 495-504.

98. Kaestner, K.H., Knochel, W., Martinez D.E. (2000). Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors. Genes Dev 14(2): 142-6.

99. Khramkova, N.I., Postnikova, Z.A., Abelev, G.I. (1963). Antigenic structure of mouse hepatomas Ш. A study of organospecific liver antigens in the hepatomas with the aid of specific antibodies. Neoplasma 10(2): 127-131.

100. Kritis, A.A., Ktistaki, E., Barda, D., Zannis, V.I., Talianidis, I. (1993). An indirect . negative autoregulatory mechanism involved in hepatocyte nuclear factor-1 gene expression. Nucleic Acids Res 21(25): 5882-9.

101. Ktistaki, E. (1995). Recruitment of hepatosyte nuclear factor 4 into specific intranuclear compartmens depends on tyrosin phosphorylation that affects its DNA-binding and transactivation potencial. Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 9876-80.

102. Krutovskikh, V.A., Oyamada, M., Yamasaki, H. (1991). Sequential changes of gap-junctional intercellular communications during multistage rat liver carcinogenesis: direct measurement of communication in vivo. Carcinogenesis 12(9): 1701-6.

103. Kuo, C.F., Xanthopoulos, K.G., Jr. Darnell J.E. (1990). Fetal and adult localization of C/EBP: evidence for combinatorial action of transcription factors in cell-specific gene expression. Development 109(2): 473-81.

104. Kuo, C.J., Conley, P.B., Chen, L., Sladek, F.M., Jr. Darnell JE, Crabtree G.R. (1992). A transcriptional hierarchy involved in mammalian cell-type specification. Nature 355(6359): 45761.

105. Magee, T.R., Cai, Y., El-Houseini, M.E., Locker, J., Wan, Y.J. (1998). Retinoic acid mediates down-regulation of the alpha-fetoprotein gene through decreased expression of hepatocyte nuclear factors. J Biol Chem 273(45): 30024-32.

106. McPherson, C.E., Shim, E.Y., Friedman, D.S., Zaret, K.S. (1993). An active tissue-specific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array. Cell 75(2): 387-98.

107. Mendel, D.B., Hansen, L.P., Graves, M.K., Conley, P.B., Crabtree G.R. (1991). HNF-1 alpha and HNF-1 beta (vHNF-1) share dimerization and homeo domains, but not activation domains, and form heterodimers in vitro. Genes Dev 5(6): 1042-56.

108. Michalopoulos, G.K., DeFrances, M.C. (1997). Liver regeneration. Science 276(5309):60.6.

109. Molkentin, J., Lin, Q., Duncan, S., Olson, E. (1997). Requirement of the transcription factor GATA4 for heart tube formation and ventral morphogenesis. Genes Dev. 11: 1061 -72.

110. Molkentin, J.D. (2000). The zinc finger-containing transcription factors GATA-4, -5, and -6. Ubiquitously expressed regulators of tissue-specific gene expression. J Biol Chem 275(50): 38949-52.

111. Moses, H.L., Yang, E.Y., Pietenpol, J.A. (1990). TGF-beta stimulation and inhibition of cell proliferation: new mechanistic insights. Cell, 63(2):245.

112. Morrisey, E.E., Ip, H.S., Lu, M.M., Parmacek, M.S. (1996). GATA-6: a zinc finger transcription factor that is expressed in multiple cell lineages derived from lateral mesoderm. Dev Biol 177(1): 309-22.

113. Morrisey, E.E., Tang, Z., Sigrist, K., Lu, M.M., Jiang, F., Ip, H.S., Parmacek, M.S. (1998). GATA6 regulates HNF4 and is required for differentiation of visceral endoderm in the mouse embryo. Genes Dev 12(22): 3579-90.

114. Mueller, C.R., Maire, P., Schibler U. (1990). DBP, a liver-enriched transcriptional activator, is expressed late in ontogeny and its tissue specificity is determined posttranscriptionally Cell 61(2): 279-91.

115. Mutoh, K., Wakuri, H., Liu, В., Seno, M., Taniguchi, K. (1998). Electron microscopic study of intercalated duct cells in the chicken pancreatic islet and effects of tolbutamide administration. Okajimas Folia Anat Jpn, 75(5): 231-7.

116. Nagao, Т., Ishida, Y., Yamazaki, K., Kondo, Y. (1995). Nucleolar organizer regions in hepatocellular carcinoma related to the cell cycle, cell proliferation and histologic grade. Pathol Res Pract, 191(10): 967-72.

117. Nagy, P., Bisgaard, H.C., Thorgeisson, S.S. (1994). Expression of hepatictranscription factor during liver development and oval cell differentiation. J. Cell. Biol. 126: 223-233.

118. Nakamura, Т., Akiyoshi, H., Shiota, G., Isono, M., Nakamura, K., Moriyama, M., Sato, K. (1999). Hepatoprotective action of adenovirus-transferred HNF-3gamma gene in acute liver injury caused by ССЦ. FEBS Lett 459(1): 1-4.

119. Nakhei, H., Lingott, A., Lemm, I., Ryffel G.U. (1998). An alternative splice variant of the tissue specific transcription factor HNF4alpha predominates in undifferentiated murine cell types. Nucleic Acids Res 26(2): 497-504.

120. Nerlov, C., Ziff, E.B (1994). Three levels of functional interaction determine the activity of CCAAT/enhancer binding protein-a on the serum albumin promoter. Genes Dev 8(3): 350-62.

121. Nerlov, C., Ziff, E.B (1995). CCAAT/enhancer binding protein-a amino acid motifs with dual TBP and TFEOB binding ability co-operate to activate transcription in both yeast and mammalian cells. EMBO J 14: 4318-28.

122. Nieto, M.A. (2002). The snail superfamily of zinc-finger transcription factors. Nat Rev Mol Cell Biol, 3(3): 155-66.

123. Nuclear Receptors Nomenclature Committee (1999). A unified nomenclature systems for the nuclear receptor superfamily. Cell 97: 161-3.

124. Ogden, S.K., Lee, K.C., Barton, M.C. (2000). Hepatitis В viral transactivator HBx alleviates p53-mediated repression of alpha-fetoprotein gene expression. J Biol Chem, 275(36): 27806-14.

125. Ogden, S.K., Lee, K.C., Wernke-Dollries, K., Stratton, S.A., Aronow, В., Barton, M.C. (2001). p53 targets chromatin structure alteration to repress alpha-fetoprotein gene expression. J Biol Chem, 276(45): 42057-62.

126. Ott, M.O., Rey-Campos, J., Cereghini, S., Yaniv M. (1991). vHNFl is expressed in epithelial cells of distinct embryonic origin during development and precedes HNF1 expression. MechDev 36(1-2): 47-58.

127. Osada, Т., Sakamoto, M., Ino, Y., Iwamatsu, A., Matsuno, Y., Muto, Т., Hirohashi, S. (1996). E-cadherin is involved in the intrahepatic metastasis of hepatocellular carcinoma. Hepatology, 24(6): 1460-7.

128. Pani, L., Quian, X.B., Clevidence, D., Costa R.H. (1992b). The restricted promoter activity of the liver transcription factor hepatocyte nuclear factor 3 beta involves a cell-specific factor and positive autoactivation. Mol Cell Biol 12(2): 552-62.

129. Philippe, J., Morel, C., Prezioso V.R. (1994). Glucagon gene expression is negatively regulated by hepatocyte nuclear factor 3 beta. Mol Cell Biol 14(5): 3514-23.

130. Pierreux, C.E., Stafford, J., Demonte, D., Scott, D.K., Vandenhaute, J., O'Brien, R.M., Granner, D.K., Rousseau, G.G., Lemaigre, F.P. (1999). Antiglucocorticoid activity of hepatocyte nuclear factor-6. Proc Natl Acad Sci USA, 96(16): 8961-6.

131. Pontoglio, M., Faust, D.M., Doyen, A., Yaniv, M., Weiss M.C. (1997). Hepatocyte nuclear factor lalpha gene inactivation impairs chromatin remodeling and demethylation of the phenylalanine hydroxylase gene. Mol Cell Biol 17(9): 4948-56.

132. Power, S.C., Cereghini, S. (1996).Positive regulation of the vHNFl promoter by the orphan receptors COUP-TFl/ЕагЗ and COUP-TFII/ArpI. Mol Cell Biol 16(3): 778-91.

133. Qian, X., Costa R.H. (1995). Analysis of hepatocyte nuclear factor-3 beta protein domains required for transcriptional activation and nuclear targeting. Nucleic Acids Res 23(7): 1184-91.

134. Qiu, Y., Krishnan, V., Pereira, F.A., Tsai, S.Y., Tsai, M.J. (1996). Chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factors and their regulation. J Steroid Biochem Mol Biol 56(1-6 Spec No): 81-5.

135. Rana, В., Y. Xie, D. Mischoulon, N.L. Bucher, S.R. Farmer (1995). The DNA binding activity of C/EBP transcription factor is regulated in the G1 phase of the hepatocyte cell cycle. J Biol Chem 270(30): 18123-32.

136. Raney, A.K., Zhang, P., McLachlan, A. (1995). Regulation of transcription from the hepatitis В virus large surface antigen promoter by hepatocyte nuclear factor 3. J Virol 69(6): 3265-72.

137. Rey-Campos, J., Chouard, Т., Yaniv, M., Cereghini S. (1991). vHNFl is a homeoprotein that activates transcription and forms heterodimers with HNF1. EMBO J 10(6): 1445-57.

138. Ryffel B. (1996). Gene knockout mice as investigative tools in pathophysiology. Int J Exp Pathol, 77(4): 125-41.

139. Ryffel, G.U. (2001). Mutations in the human genes encoding the transcription factors of the hepatocyte nuclear factor (HNF)l and HNF4 families: functional and pathological consequences. J Mol Endocrinol 27(1): 11-29.

140. Samadani, U., Costa R.H. (1996). The transcriptional activator hepatocyte nuclear factor 6 regulates liver gene expression. Mol Cell Biol 16(11): 6273-84.

141. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY., Cold Spring Harbor laboratory.

142. Sasaki, H., Hogan, B.L. (1993). Differential expression of multiple fork head related genes during gastrulation and axial pattern formation in the mouse embryo. Development 118(1): 47-59.

143. SchaefFer, E., Guillou, F., Part, D., Zakin M.M. (1993). A different combination of . transcription factors modulates the expression of the human transferrin promoter in liver and Sertoli cells. J Biol Chem 268(31): 23399-408.

144. Sel, S., Ebert, Т., Ryffel, G.U., Drewes, T. (1996). Human renal cell carcinogenesis is accompanied by a coordinate loss of the tissue specific transcription factors HNF4 alpha and HNF1 alpha. Cancer Lett 101(2): 205-10.

145. Shen, C.N., Slack, J.M., Tosh, D. (2000). Molecular basis of transdifferentiation of pancreas to liver. Nat Cell Biol 2(12): 879-87.

146. Shiota, G., Okano, J., Kawasaki, H., Kawamoto, Т., Nakamura, T. (1995). Serum hepatocyte growth factor levels in liver diseases: clinical implications. Hepatology 21(1): 10612.

147. Sladek, F.M., Zhong, W.M., Lai, E., Jr. Darnell JE (1990). Liver-enriched transcription factor HNF-4 is a novel member of the steroid hormone receptor superfamily. Genes Dev 4(12B): 2353-65.

148. Soutoglou, E., Papafotiou, G., Katrakili, N., Talianidis, 1. (2000). Transcriptional activation by hepatocyte nuclear factor-1 requires synergism between multiple coactivator proteins. J Biol Chem, 275(17): 12515-20.

149. Spath, G.F., Weiss, M.C. (1997). Hepatocyte nuclear factor 4 expression overcomes repression of the hepatic phenotype in dedifferentiated hepatoma cells. Mol Cell Biol 17(4): 1913-22.

150. Spath, G.F., Weiss, M.C. (1998). Hepatocyte nuclear factor 4 provokes expression of epithelial marker genes, acting as a morphogen in dedifferentiated hepatoma cells. J Cell Biol 140(4): 935-46.

151. Stoffel, M., Duncan S.A. (1997). The maturity-onset diabetes of the young (MODY1) transcription factor HNF4alpha regulates expression of genes required for glucose transport and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A 94(24): 13209-14.

152. Sund, N.J., Ang, S.L., Sackett, S.D., Shen, W., Daigle, N., Magnuson, M.A., Kaestner, K.H. (2000). Hepatocyte nuclear factor 3beta (Foxa2) is dispensable for maintaining the differentiated state of the adult hepatocyte. Mol Cell Biol 20(14): 5175-83.

153. Taipale, J., Keski-Oja, J. (1997). Growth factors in the extracellular matrix. FASEB J 11(1): 51-9.

154. Tahara, H., Kuniyasu, H., Yokozaki, H., Yasui, W., Shay, J.W., Ide, Т., Tahara, E. ' (1995). Telomerase activity in preneoplastic and neoplastic gastric and colorectal lesions. Clin Cancer Res, 1(11): 1245-51.

155. Takiguchi, M. (1998). The C/EBP family of transcription factors in the liver and other organs. Int L Exp Pathol 79: 369-391.

156. Tang, F.Y., Meydani, M. (2001). Green tea catechins and vitamin E inhibit angiogenesis of human microvascular endothelial cells through suppression of IL-8 production. Nutr Cancer, 41(1-2): 119-25.

157. Taraviras, S., Monaghan, A.P., Schutz, G., Kelsey G. (1994). Characterization of the mouse HNF-4 gene and its expression during mouse embryogenesis. Mech Dev 48(2): 67-79.

158. Taylor, D.G., Haumbenwallner, S., Leff, T. (1996). Characterization of a DN-HNF4. Nucleic Acids Res. 24:2930- 2935.

159. Tian, J.M., Schibler U. (1991). Tissue-specific expression of the gene encoding hepatocyte nuclear factor 1 may involve hepatocyte nuclear factor 4. Genes Dev 5(12A): 222534.

160. Tilghman, S.M., Belayew, A. (1982). Transcriptional control of the murine albumin/alpha-fetoprotein locus during development. Proc Natl Acad Sci USA, 79(17): 5254-7.

161. Timchenko, N.A., M. Wilde, G.J. Darlington (1999). C/EBPa regulates formation of S-phase-specific E2F-pl07 complexes in livers of newborn mice. Mol Cell Biol 19(4): 2936-45.

162. Timchenko, N.A., Harris, Т.Е., Wilde, M (1997). CCAAT/enhancer binding protein a regulates p21 protein and hepatocyte proliferation in newborn mice. Mol Cell Biol 17: 7252-61.

163. Toniatti, C., Monaci, P., Nicosia, A., Cortese, R., Ciliberto G. (1993). A bipartite activation domain is responsible for the activity of transcription factor HNF1/LFB1 in cells of hepatic and nonhepatic origin. DNA Cell Biol 12(3): 199-208.

164. Tonjes, R.R., Xanthopoulos, K.G., Darnell, J.E., Jr. Paul D. (1992). Transcriptional control in hepatocytes of normal and cHCoS albino deletion mice. EMBO J., 11: 127-33.

165. Torchia, J., Rose, D.W., Inostroza, J., Kamei, Y., Westin, S., Glass, C.K., Rosenfeld, M.G. (1997). The transcriptional co-activator p/CIP binds СВР and mediates nuclear-receptor function. Nature, 387(6634): 677-84.

166. Torres-Padilla, M.E., Fougere-Deschatrette, C., Weiss, M.C. (2001). Expression of HNF4alpha isoforms in mouse liver development is regulated by sequential promoter usage and constitutive 3' end splicing. Mech Dev, 109(2): 183-93.

167. Tranche, F., Rollier, A., Herbomel, P., Bach, I., Cereghini, S., Weiss, M., Yaniv M. (1990). Anatomy of the rat albumin promoter. Mol Biol Med 7(2): 173-85.

168. Tranche, F., and Yaniv,. M. (1992). HNF-1, a homeoprotein member of the hepatic transcription regulatory network. BioEssays, 14: 579-587.

169. Tsai, L.C., Hung, M.W., Yuan, C.C., Chao, P.L., Jiang, S.Y., Chang, G.G., Chang, T.C. (1997). Effects of tamoxifen and retinoic acid on cell growth and c-myc gene expression in human breast and cervical cancer cells. Anticancer Res, 17(6D): 4557-62.

170. Vaisse, C., Kim, J., Espinosa, R. 3rd, Le Beau, M.M., Stoffel, M. (1997). Pancreatic islet expression studies and polymorphic DNA markers in the genes encoding hepatocyte nuclear factor-3alpha, -3beta, -3gamma, -4gamma, and -6. Diabetes, 46(8): 1364-7.

171. Viollet, В., Kahn, A. and Raymondejean, M. (1997). Protein kinase A-dependent phosphorylation modulates DNA-binding activity of HNF4. Mol. Cell. Biol. 17: 4208-19.

172. Volpes, R., van den Oord, J.J., Desmet, V.J. (1993). Integrins as differential cell lineage markers of primary liver tumors. Am J Pathol 142(5): 1483-92.

173. Wang, В., Cai, S.R., Gao, C., Sladek, F.M., Ponder, K.P. (2001). Lipopolysaccharide results in a marked decrease in hepatocyte nuclear factor 4 alpha in rat liver. Hepatology, 34(5): 979-89.

174. Wang, N.D., MJ. Finegold, A. Bradley, C.N. Ou, S.V. Abdelsayed, M.D. Wilde, L.R. Taylor, D.R. Wilson, G.J. Darlington (1995). Impaired energy homeostasis in C/EBP alpha knockout mice. Science 269(5227): 1108-12.

175. Wang, W., Hayashi, Y., Ninomiya, Т., Ohta, K., Nakabayashi, H., Tamaoki, Т., Itoh, H. (1998). Expression of HNF-1 alpha and HNF-1 beta in various histological differentiations of hepatocellular carcinoma. J Pathol 184(3): 272-8.

176. Wang, W.X., Li, M., Wu, X., Wang, Y., Li, Z.P. (1998). HNF1 is critical for the liver-specific function of HBV enhancer II. Res Virol 149(2): 99-108.

177. Wegner, M., Cao, Z., Rosenfeld M.G. (1992). Calcium-regulated phosphorylation within the leucine zipper of C/EBPp. Science 256(5055): 370-3.

178. Weigel, D., Jurgens, G., Kuttner, F., Seifert, E., Jackie H. (1990). The homeotic gene fork . head encodes a nuclear protein and is expressed in the terminal regions of the Drosophila embryo. Cell 57(4): 645-58.

179. Weinberg, R.A. (2002). Cancer Biology and Therapy: the road ahead. Cancer Biol Ther,1(1): 3.

180. Weinstein, D.C., Ruiz i Altaba, A., Chen, W.S., Hoodless, P., Prezioso, V.R., Jessell, T.M,. Jr. Darnell JE. (1994). The winged-helix transcription factor HNF-3 beta is required for notochord development in the mouse embryo. Cell 78(4): 575-88.

181. Welm, A.L., Timchenko, N.A., Darlington, G.J. (1999). C/EBPa regulates generation of C/EBPp isoforms through activation of specific proteolytic cleavage. Mol Cell Biol 19: 16951704.

182. Wick, M., Zubov, D., Hagen, G. (1999). Genomic organization and promoter characterization of the gene encoding the human telomerase reverse transcriptase (hTERT). Gene, 232(1): 97-106.

183. Williams, S.C., Baer, M., Dillner, A.J., Johnson, P.F. (1995). CRP2 (C/EBPJ3) contains a bipartite regulatory domain that controls transcriptional activation, DNA binding and cell specificity. EMBO J14: 3170-83.

184. Wogan, G.N. (2000). Impacts of chemicals on liver cancer risk. Semin Cancer Biol 10(3): 201-10.

185. Workman, J.L., Kingston, R.E., (1998). Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annu Rev Biochem, 67: 545-79.

186. Wu, K.L., Gannon, M., Peshavaria, M. (1997). HNF3p is involved in pancreatic P-cell-specific transcription of the pdx-1 gene. Moll Cell Biol 17: 6002-13.

187. Xanthopoulos, K.G., Mirkovitch J. (1993). Gene regulation in rodent hepatocytes during development, differentiation and disease. Eur J Biochem 216(2): 353-60.

188. Xu, L., Hui, L., Wang, S., Gong, J., Jin, Y., Wang, Y., Ji, Y., Wu, X., Han, Z., Hu, G. (2001). Expression profiling suggested a regulatory role of liver-enriched transcription factors in human hepatocellular carcinoma. Cancer Res 61(7): 3176-81.

189. Yu, X., Mertz, J.E. (2001). Differential regulation of the pre-C and pregenomic promoters of human hepatitis В virus by members of the nuclear receptor superfamily. J Virol 71(12): 9366-74.

190. Zaret, K. (1998). Early liver differentiation: genetic potentiation and multilevel growth control. Curr Opin Genet Dev 8(5): 526-31.

191. Zaret, K. (1999). Developmental competence of the gut endoderm: genetic potentiation by GATA and HNF3/fork head proteins. Dev Biol 209: 1-10.

192. Zhong, W., Mirkovitch, J., Jr. Darnell JE. (1994). Tissue-specific regulation of mouse hepatocyte nuclear factor 4 expression. Mol Cell Biol 14(11): 7276-84.

Информация о работе

Черемнова, Оксана Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2002
ВАК 03.00.06

Диссертация

Регуляция экспрессии специфических белков печени и транскрипционных факторов в гепатокарциномах мышей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы