Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Реализация действия пролактина на мейоз ооцитов коров
ВАК РФ 03.00.15, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Реализация действия пролактина на мейоз ооцитов коров"
на правах рукописи
ООЗ166832
СКОТТИ ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА
РЕАЛИЗАЦИЯ ДЕЙСТВИЯ ПРОЛАКТИНА НА МЕЙОЗ ООЦИТОВ КОРОВ
03.00.15, - генетика
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Д 6 ^Р 1Ш
Санкт-Петербург - Пушкин 2008 г.
Работа выполнена в лаборатории биологии развития ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Россельхозакадемии
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор Татьяна Ивановна Кузьмина
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук
Свиридов Б.Е. (ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН),
доктор медицинских наук, профессор,
Никитин А.И. (Балтийский институт репродуктологаи
человека)
Ведущее учреждение: Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины
Защита диссертации состоится Ckv\2QQg года
в U_часов на заседании диссертационного совета Д.006.013.01 по
защите диссертаций на соискание степени кандидата биологических наук при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных по адресу: 196601, Санкт-Петербург - Пушкин, Московское шоссе 55-а. Факс:(812)465 99 89 spbvniigen@mail .ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН
Автореферат разослан « с)-^ » ■ 2008 года.
Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Г.Н.Сердюк
I. Общая характеристика работы Актуальность проблемы. В настоящее время методы клеточных репродуктивных технологий, в основе которых лежит базовый способ дозревания ооцитов in vitro, такие, как трансплантация эмбрионов, клонирование, трансгенез, получение эмбриональных стволовых клеток были разработаны и совершенствуются благодаря научным разработкам в области исследования механизмов регуляции фолликулогенеза и созревания ооцитов Вопрос о приобретении яйцеклеткой, созревшей m vitro, компетентности к оплодотворению и дальнейшему развитию эмбрионов сохраняет свою актуальность В процессе завершения мейоза вне организма важную роль играет система культивирования Введение в среды для культивирования различных гормонов и биологически активных веществ позволяет выявлять характер их воздействия на хроматин соматических клеток фолликула и гамет, оценивать их способность к оплодотворению и дальнейшему формированию эмбрионов Ведущая роль фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов в регуляции фолликуло- и оогенеза твердо установлена В то же время, возможная роль пролактина (ПРЛ) в механизмах формирования биологически полноценной яйцеклетки недостаточно ясна Рядом авторов обнаружено, что пролактин оказывает стимулирующий эффект на созревание ооцитов (Lindner et al, 1988, Chang et al, 1998, Wise et al, 1987, Кузьмина и др , 2001) Выявлено, что качество ооцитов, полученных от суперовулированных телок коррелирует с увеличенным содержанием в фолликулах ПРЛ (Wise et al, 1994) Добавление ПРЛ в среду культивирования ооцитов благоприятно влияет при оплодотворении in vitro на выход полноценных эмбрионов на стадии бластоцисты (Kanitz et al, 1996, Torner et al ,1996) В литературе представлены данные об экспрессии мРНК рецепторов пролактина в ооцитах и ранних эмбрионах мышей, а также в овариальных клетках овец, что указывает на возможность прямого воздействия пролактина на формирование зрелой яйцеклетки (Picazo et al, 2004, Kia-pekou et al, 2005)
В этой связи, вопрос о механизмах действия пролактина на мейоз ооцитов и путях их реализации становится актуальной проблемой генетических основ репродуктивной биологии
Диссертационная работа выполнена в соответствии с программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ на 2006-2010 годы 06 01 03 - Исследовать молекулярно-генетические, биохимические, цитологические и эмбриологические процессы, лежащие в основе трансгенеза, создать генноинженерные конструкции и разработать способы, повышающие эффективность биоинженерных технологий получения животных с заданными свойствами № гос регистрации 15070 7815014664 06 8 001 0.
Цели и задачи исследований. Цель настоящей работы -исследование механизмов реализации эффектов пролактина на мейоз
ооцитов при их созревании, оплодотворении и развитии доимплантационных эмбрионов in vitro
В соответствии с поставленной целью в работе решались следующие задачи
1 Сравнить степень чувствительности овариальных клеток из фолликулов разного диаметра к воздействию пролактина, с учетом
- стадии мейоза ооцитов,
- степени экспансии клеток кумулюса,
- уровня пикнозов в кумулюсе,
- оплодотворяемости ооцитов,
- развития доимплантационных эмбрионов,
2 Охарактеризовать влияние пролактина на кинетику мейоза в ооцитах коров из фолликулов разного диаметра,
3 Изучить характер действия пролактина на активацию киназы гистонов HI и митогенактивируемых протеинкиназ (MAP киназ) в процессе созревания ооцитов коров in vitro,
4 Выявить эффекты дибутирил-цАМФ (дбцАМФ) на завершение мейоза в ооцитах, созревших в присутствии пролактина, их оплодотворение и развитие эмбрионов,
5 Проанализировать роль цАМФ/протеинкиназа А - зависимого сигнального пути в реализации действия ПРЛ на созревание окруженных кумулюсом ооцитов коров
Научная новизна. Впервые выявлено и охарактеризовано влияние пролактина на кинетику мейоза в ооцитах, выделенных из фолликулов коров разного диаметра
Впервые показано вовлечение в процессы реализации эффектов пролакшна на мейоз ооцитов m vitro киназы гистонов HI и MAP киназы
Впервые идентифицирован характер действия дбцАМФ на завершение мейоза в ооцитах, созревших в присутствии ПРЛ, дальнейшее их оплодотворение и развитие эмбрионов
Впервые получены данные, свидетельствующие о возможном участии цАМФ- зависимого внутриклеточного пути в опосредовании действия ПРЛ на ооцит-кумулюсные комплексы коров
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретически обоснована модель реализации действия пролактина на созревание коровьих яйцеклеток Выявлено, что характер влияния пролактина на созревание ооцитов коров, их способность к оплодотворению и дальнейшее развитие эмбрионов зависит от диаметра исходного фолликула, то есть от степени дифференцировки фолликулярных клеток Обнаружено пролонгирующее действие ПРЛ на процесс мейоза ооцитов, которое, вероятно, способствует синхронизации ядерно-цитоплазматического созревания и обуславливает приобретение яйцеклетками компетентности к оплодотворению Полученные результаты дополняют имеющиеся представления о внутриклеточных сигнальных путях реализации эффектов пролактина m vitro на мейоз в ооцитах коров Наши экспериментальные
данные доказывают, что действие гормона может осуществляться через разные сигнальные пути, в том числе и через цАМФ-зависимый путь, по крайней мере частично, как на уровне синтеза и распада цАМФ, так и через регуляцию активностей MAP киназ и киназы гистонов HI Анализ результатов исследований по выявлению эффектов пролактина и теофиллина на ооцит и его кумулюс свидетельствует о сопряжении сигнального каскада, индуцированного ПРЛ, в ооцит-кумулюсных комплексах коров, и цАМФ-зависимого внутриклеточного пути Экспериментальные данные позволяют предположить, что запуск определенного сигнального каскада ПРЛ в ооцит-кумулюсном комплексе зависит от стадии фолликулярного созревания, соответственно, степени зрелости яйцеклетки Практическая ценность работы представлена разработкой системы дозревания ооцитов из фолликулов диаметром 3-5, 58 мм на основе использования 50 нг/мл ПРЛ, позволяющей повышать выход биологически полноценных яйцеклеток и эмбрионов коров Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и одобрены на ежегодных аспирантских сессиях и отчетах ГНУ ВНИИГРЖ Россельхозакадемии, на Международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» Пущино (2005, 2007 годы), «Клеточное ядро» Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург, 2007 Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 2 - в журнале, входящем в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Минобрнауки России Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, методов и результатов исследований, их обсуждения, выводов, практических предложений, списка использованной при написании диссертации литературы, включающего 215 источников, в том числе 194 на иностранном языке Диссертация изложена на 125 страницах, включает 7 таблиц, 21 рисунок Положения, выносимые на защиту:
1 Эффекты пролактина на соматические клетки овариальных фолликулов коров и ооцит при мейотическом созревании яйцеклетки in vitro носят комплексный характер и зависят от диаметра фолликула
2 MAP киназы (ERK1 и ERK2) и киназа гистонов HI опосредуют эффект пролактина на динамику ядерного созревания ооцитов коров in vitro
3 цАМФ/протеинкиназа А - зависимый сигнальный путь вовлекается в реализацию действия ПРЛ на мейоз ооцитов коров in vitro
4 Использование пролактина (50 нг/мл) при экстракорпоральном дозревании ооцитов, выделенных из фолликулов диаметром 5-8 мм обеспечивает высокий выход эмбрионов на стадиях поздней морулы, бластоцисты (52,6% против 25% в контроле, Р < 0,05)
2. Материал и методы исследований Исследования были выполнены согласно представленной структурно-логической схеме экспериментов (рис 1) Материалом для исследований служили ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) из антральных фолликулов коров и половозрелых телок
черно-пестрой породы, убшых на мясокомбинате Санкт-Петербурга Яичники без видимых признаков патологии, находящиеся на стадии фолликулярного роста, или с развитым желтым телом доставляли в лабораторию в термосе при температуре 30-35°С в течение 1,5-2ч после овариэктомии ОКК выделяли аспирацией фолликулов, промывали 3 раза в среде ТС-199 ("Sigma", США), содержащей 10% фетальной сыворотки (ФБС) и 50 мкг/мл гентамицина Для экспериментов отбирали ооциты с гомогенной цитоплазмой, равномерной по ширине зоной пеллюцида, окруженные многослойным компактным кумулюсом Культивирование ОКК проводили в среде ТС-199 с 10% ФБС, 0,55 mi/мл лактата кальция ("Serva", Германия), 0,23 мг/мл пирувата натрия ("Serva", Германия), 1,27 мг/мл HEPES-буфера («Merck», Германия) и 50 мкг/мл гентамицина под минеральным маслом («Sigma») В среду с опытными группами вносили гипофизарный бычий ПРЛ (активность 20,0 МЕ/мг, Институт эндокринологии, Москва) в концентрации 50 нг/мл, теофиллин (ТФ) (5мМ, ICN, США) В отборе концентраций руководствовались данными, полученными ранее в лаборатории биологии развития (Kuzmma et al, 1999) Статус хроматина ОКК и эмбрионов оценивали по методу Тарковского (Tarkowski, 1966) Оплодотворение ооцитов и культивирование эмбрионов проводили по методу Парриша (Parrish et al, 1986) Анализ активности киназы гистонов HI и MAP киназ осуществляли в соответствии с методом Мотлика и соавторов (Motlik et al, 1996) Ооциты (по 10 клеток на образец) промывали 4 раза в фосфатном буферном растворе (ФБР), переносили в пробирки, содержащие 3 мкл ФБР, и замораживали при -70 °С После размораживания добавляли 4 мкл буфера А (15 мМ паранитрофенилфосфат, 60 мМ Р-глицерофосфаг, 15 мМ EGTA, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 0 25 мМ Na3V04, 60 мкг/мл лейпептина и 60 мкг/мл апротинина) Содержимое пробирок перемешивали на вортексе и центрифугировали при 10000 g в течение 15 сек Реакцию инициировали, добавляя 5 мкл буфера Б (25 мМ Хепес, рН 7,2, 5 мМ паранитрофенилфосфат, 60 мМ Р-глицерофосфат, 25 мМ MgCb, 15 мМ ЭДI А, 0,1 мМ EGTA, 20 мкМ ингибитор цАМФ-зависимой протеинкиназы (Sigma, Германия), 60 мкг/мл лейпептина и 60 мкг/мл апротинина), 600 мкМ АТФ, 2 мг/мл гистона HI (Boehringer, Германия) в случае измерения активности киназы гистонов HI и 600 мкМ АТФ, 3 mi/мл MAP (миелин основной белок) при измерении активности MAP киназ и 500 мкКи/мл [32Р]-АТФ (Amersham, Германия) Через 30 мин инкубации при 30 °С реакцию прекращали, добавляя 15 мкл 2-х кратного ФБР Образцы инкубировали в течение 3 мин при 95 °С и разделяли на 15 %-ном SDS PAGE геле Гели окрашивали Кумасси синим R250 (Serva, Германия), высушивали и подвергали авторадиографии и денситометрии Измеренную киназную активность выражали в процентах от максимального уровня активности киназы гистонов HI и MAP киназ Иммуноблотгинг с антителами к р44 (ERK1) и р42 (ERK2) проводили, учитывая, что
б
активность миелинсвязывающей протеин киназы (МВР) отражает активность MAP киназ. Ооциты отмывали 5 раз в среде, свободной от белков (PBS), лизировали в Юмкл в буфере SDS с 5% 2-меркаптоэтанола и хранили отдельно при -80° С до электрофореза. Образцы разделяли на 9% SDS PAGE геле (доля бисакриламида в сепарационном слое - 100:1). Сепарированные белки перемещали на мембраны Immobilon-P (Millipore, Eschborn,Germany) в tank-buffer аппарате (200 мА, 1 час). Блоты инкубировали при комнатной температуре в 10 % Teleost желатине (Sigma), растворенном в 0,05 % Tween-20 Tris-буфферном физиологическом растворе, pH 7,4 (TTBS) в течение часа до обработки ERK1 антителом (Santa Cruz, sc-94, 1:1000 в TTBS), полученным против иммуноглобулинов кролика, сконъюгированные с пероксидазой хрена (Amersham, 1:5000 в TIBS). После интенсивного отмыва (>1 часа, > 5 повторностей) блоты подвергали процедуре ECL хемилюминесценции согласно инструкциям производителя (Amersham). Для сравнения результатов, полученных в опытных и контрольных группах, использовали критерий у2 (Лакин, 1990) с помощью статистической программы Sigma Stat. Достоверность различия сравниваемых средних значений оценивали при трех уровнях значимости:
Рис. 1. Структурно-логическая схема экспериментов 3. Результаты собственных исследований 3.1. Влияние пролактина на созревание ооцитов, выделенных из фолликулов разного диаметра. Известно, что концентрация ПРЛ в организме млекопитающих по мере роста фолликулов возрастает. Повышение уровня ПРЛ в фолликулярной жидкости (ФЖ) наблюдается на стадии фолликулярного роста до наступления овуляции, когда отмечается резкое падение уровня гормона в зрелых фолликулах (Henderson et al., 1982; Subramanian et al., 1988). Увеличение концентрации ПРЛ в ФЖ созревающего фолликула указывает на важную роль гормона в пролиферации, дифференцировке фолликулярных клеток и созревании
ооцитов Исходя из этих данных, нами были исследованы эффекты ПРЛ на способность ооцитов к созреванию, оплодотворению и развитию доимплантационных эмбрионов из фолликулов разного диаметра Наибольшее число созревших ооцитов при культивировании в отсутствии гормонального воздействия отмечалось в группе клеток, выделенных из фолликулов диаметром 3-5 мм В данной группе число ооцитов, находящихся на стадии метафазы II составляло 81,6%, что достоверно выше значения данного показателя в группе клеток, выделенных из фолликулов менее 3 мм (Р<0,05), где процент ооцитов, достигших продвинутых стадий ядерного созревания равнялся 46,6% (таблица 1) Между группами ОКК из фолликулов диаметром 3-5 и 5-8 мм не было выявлено статистически достоверных различий по числу ооцитов, достигших стадии метафазы II Полученные результаты свидетельствуют о высокой компетентности к развитию ооцитов, выделенных из фолликулов диаметром 3-5 и 5-8 мм по сравнению с ооцитами, выделенными из фолликулов диаметром менее 3 мм При внесении ПРЛ в среду культивирования отмечалась тевденция к увеличению числа ооцитов, находящихся на стадии метафазы II, извлеченных из фолликулов диаметром менее 3 мм и 5-8 мм В то же время эффект ПРЛ на уровень созревания ооцйтов, выделенных из фолликулов диаметром 3-5 мм, отсутствует Это указывает на то, что действие ПРЛ на ядерное созревание и последующее развитие эмбрионов m vitro зависит от размера фолликула При осеменении ооцитов, созревших in vitro, наивысший уровень оплодотворяемости был отмечен в группе ОКК, выделенных из фолликулов диаметром 5-8 мм (70%), а самый низкий - в группе ооцитов, выделенных из фолликулов менее 3 мм, где доля оплодотворившихся яйцеклеток составляла 61,7 % При развитии эмбрионов, полученных из ооцитов фолликулов малого диаметра, был отмечен и самый низкий уровень образования морул и бластоцист ПРЛ не оказывал влияние на оплодотворяемость ооцитов, выделенных из всех групп фолликулов Однако, отмечались различия в действии гормона на формирование морул и бластоцист из ооцитов фолликулов разного диаметра Так, ПРЛ не влиял на уровень развития эмбрионов до стадии морулы или бластоцисты из ооцитов фолликулов диаметром 3-5 мм и менее Змм При этом ПРЛ оказывал положительное влияние на развитие морул и бластоцист из ооцитов, выделенных из фолликулов диаметром 5-8 мм Полученные результаты показывают, что характер действия ПРЛ на созревание ооцитов коров, их способность к оплодотворению и дальнейшее развитие эмбрионов зависит от диаметра исходного фолликула, то есть от степени дифференцировки фолликулярных клеток
3.2, Деструктивные процессы в клетках кумулюса ооцитов при их культивировании в средах с пролактнном. Созревание ооцита in vitro -это результат взаимодействия ооцита с окружающими его клетками кумулюса (Eppig, 2001) При проведении экспериментов по выявлению уровня пикнозов в кумулюсе при культивировании ооцитов in vitro из
фолликулов разного диаметра с ПРЛ и без него показано, что наибольший уровень дегенерированных кумулюсных клеток характерен для группы ОКК, выделенных из фолликулов диаметром менее 3 мм (29,6%) После 24 часов культивирования отмечено повышение пикнотического индекса во всех исследуемых группах Внесение ПРЛ в среду при культивировании в течение 24 часов значительно снижает число пикнотических ядер в ОКК, выделенных из фолликулов диаметром 3-5 мм (5,7 % против 25 %, Р< 0,01) В целом полученные результаты свидетельствуют о том, что ПРЛ снижает уровень клеток с пикнотическими ядрами в кумулюсе, способствуя, таким образом, увеличению числа кумулюсных клеток, которые являются продуцентами эстрадиола Эстрадиол, в свою очередь, способствует образованию фактора промоции созревания Вероятно, ПРЛ, увеличивая число жизнеспособных кумулюсных клеток, способствует приобретению ооцитами компетенции к созреванию in vitro и дальнейшему оплодотворению
Таблица 1 Влияние пролактина на созревание ооцитов, выделенных из фолликулов разного диаметра, оплодотворяемость и развитие эмбрионов коров in vitro (п ооцитов - 153, п оплодотворившихся клеток - 238, п
раздробившихся - 214, п морул и бластоцист - 78, 3 повторности)
диа метр фол ли- кула (мм) концентр алия ПРЛ (кг/мл) %(п) созревания (число клеток на стадии метафазы П) %(п) оплодотворившихся клеток %(п) раздробивших ся клеток %(п) морул/ бластоцист (7-ой день)
50 62,1 (18/29) 67,7 (42/62) 64,5 (40/62) 12,9 (8/62)с
<3 0 46,6 (14/30)" 61,7 (37/60) 36,7 (34/60) 13,3 (8/60)
3-5 50 81,6 (34/42) 62,9(56/89) 49,4 (44/89) 23,6(21/89)"
0 81,6 (31/38)" 64,0 (48/75) 58,7 (44/75) 21,3 (16/75)
50 85,7 (6/7) 68,4(13/19) 68,4 (13/19) 52,6 (10/19)е
5-8 0 74,1 (5/7) 70,0 (42/60) 65,0 (39/60) 25 (15/60)'
Достоверность различия сравниваемых значений а'b Р<0,01,с'1 Р<0,05, 4 с Р<0,05,с е Р<0,05
3.3. Влияние пролаюгина на кинетику мейоза в ооцитах коров in vitro.
С целью выявления характера действия ПРЛ на ядерное созревание ооцитов были проведены эксперименты по изучению влияния гормона на кинетику мейоза in vitro Обнаружено, что реинициация мейоза происходила через 6 часов, стадии метафазы I ооциты достигали через 8,118,24, анафазы I - 13,45-14,95, ранней телофазы I - 15,62-15,99, поздней телофазы I - 17,62-17,96 и метафазы II - 21,48-22,99 часов от начала культивирования (таблица 2) Анализ данных экспериментов показал, что время завершения ядерного созревания ооцитов возрастает (Р<0,01) при увеличении диаметра фолликулов ПРЛ тормозил мейоз в ооцитах, выделенных из разных фолликулов, на различных стадиях ядерного созревания Так, внесение гормона в среду культивирования вызывало
замедление перехода от метафазы I к анафазе I в ооцитах из фолликулов диаметром 2-3 мм В отсутствии ПРИ анафаза I наступала через 13,45±0,72, а при воздействии гормона - через 16,07±0,82 часов, Р<0,05 ПРЛ способствует увеличению продолжительности метафазы I от 5,34 до 8,10 часов, Р<0,05 При созревании ооцитов из фолликулов диаметром 4-5 мм, тормозящее влияние гормона было обнаружено при переходе от ранней к поздней телофазе I, а также от поздней телофазы I к метафазе II Время от начала культивирования ооцитов из фолликулов диаметром 4-5 мм до стадии поздней телофазы I возрастало от 17,96±0,77 до 20,28±0,79 (Р=0,09), до стадии метафазы II ог 22,99±1,04 до 25,91±0,95 (Р=0,01) Сравнительный анализ средней продолжительности различных стадий мейоза показал сходные результаты (таблица 3) Так, в присутствии ПРЛ наблюдалась пролонгация стадии метафазы I в ооцитах из фолликулов диаметром 2-3 мм и стадии телофазы I в ооцитах из фолликулов диаметром 4-5 мм Выявленное пролонгирующее действие ПРЛ на процесс мейоза ооцитов, вероятно, способствует синхронизации ядерно-цшоплазматического созревания яйцеклетки Возможно, наблюдаемые эффекты являются следствием взаимодействий ооцита с клетками кумулюса в присутствии пролактина
Таблица 2 Эффект бычьего пролактина (50 нг/мл) на кинетику мейоза ооцитов коров, выделенных из фолликулов разного диаметра __(п ооцитов - 686, 3 повторности)__
Диаме Экспери Чис Время от начала созревания ооцитов до стадии мейоза t50 , ч
менталь ло Диакинез Метафаза I Анафаза I Тслофаза I Телофаза I Метафаза II
ная оод ранняя поздняя
фол- группа НТО
ликул в
ов
(мм)
2-3 контроль 172 6,12 ±0,44 8,11 ±0,29а 13,45 ± 0,72° 15,62 ±0,77 17,62 ± 0,84е 21,48 ±0,978
2-3 омыт 165 6,56 ± 0,46 7,97 ± 0,27' 16,07 ±0,82d 17,36 ±0,83 18,60 ±0,87 23,20 ± 1,11
4-5 контроль 177 5,73 ± 0,52 8,24 ± 0,26 14,95 ± 0,65 15,99 + 0,69 17,96 ± 0,77е 22,99 ±1,048
4-5 опыт 172 6,82 ± 0,47 8,87 + 0,23ь 16,39 + 0,67d 16,78 ±0,69 20,28 ± 0,79f 25,91 ±0,95"
1' общее Р=0,42 Р-0,05 Р=0,02 Р=0,39 Р=0,09 Р-0,01
*150 - время, при котором ооциты с 50 %-ной вероятностью находятся на данной стадии мейоза или завершили ее Разные буквы показывают достоверные различия между средними значениями (Р<0,05, критерий Контроль ТС 199+10% ФБС, Опыт ТС199+10% ФБС+50нг/мл пролактина
Таблица 3 Продолжительность стадий мейоза при культивировании ооцитов коров из фолликулов разного диаметра в присутствии пролактина ___(50 нг/мл) (п ооцитов - 686,3 повторности)_
Диаметр Экспери- Число Средняя продолжительность стадии мейоза At50', ч
фолликулов (мм) ментальная группа ооди тов Диакинез Метафаза I Анафаза I Телофаза I (ранняя + поздняя) Телофаза I ПОЗДНЯЯ
2-3 контроль 172 1,99 ±0,38 5,34 ± 0,83" 2,17 ± 0,56е 5,86 ±0,9 Iе 3,86 ±0,81
2-3 опыт 165 1,41 ±0,33 8,10± 0,95ь 1,29 ±0,49 5,84 ± 0,95е 4,60 ± 0,88
4-5 4-5 контроль опыт 177 172 2,51 ±0,40 2,05 + 0,37 6,71 ±0,71 7,52 ±0,67 1,04 ±0,40 0,39 ± 0,25d 7,00 ± 0,92е 9,13 ± 1,00' 5,03 ± 0,86 5,63 ± 0,98
Р общее Р=0,31 Р=0,22 Р=0,01 Р=0,04 Р=0,58
*At50 - интервал времени между началом двух последовательных стадий мейоза Разные буквы показывают достоверные различия между средними значениями (Р<0,05, критерий %2) Контроль ТС 199+10% ФБС, Опыт ТС 199+10% ФБС+50нг/мл пролактина
3.4. Активация киназы гистонов HI в процессе созревания ооцитов коров in vitro в присутствии пролактина. Реинициация мейоза регулируется фактором, промотирующим созревание (MPF) Активность MPF оценивают по уровню активности киназы гистонов HI Поэтому параллельно с исследованием влияния ПРЛ на кинетику мейоза были изучены изменения активности киназы гистонов HI в процессе созревания ооцитов коров in vitro Полученные результаты показали, что характер изменений активности киназы зависел от диаметра исходных фолликулов Так, в ооцитах из фолликулов диаметром 2-3 мм активность киназы возрастала к 6 ч культивирования (рис 2а), что соответствует времени реинициации мейоза, и достигала максимума между 12 и 14 ч (стадия метафазы I), а затем снижалась к 18 ч (поздняя телофаза I), и вновь возрастала к 24 ч созревания (метафаза И) - второй пик При культивировании ооцитов из фолликулов диаметром 4-5 мм повышение активности киназы гистонов HI отмечается позднее (между 8 и 10 ч), что соответствует стадии метафазы I (рис 2Ь) Между 10 и 12 ч наблюдалось быстрое снижение активности киназы, однако, к 24 часам культивирования наблюдалось повторное возрастание киназной активности Между ооцитами всех исследуемых групп через 6 ч (Р<0,05), 12 ч (Р<0,001) и 14 ч созревания (Р<0,001) были обнаружены достоверные различия в активности киназы гистонов HI (рис 2) В ооцитах из фолликулов диаметром 2-3 мм на 6, 12 и 14 часов созревания активность киназы гистонов HI выше, чем в ооцитах из фолликулов диаметром 4-5 мм Результаты указывают на то, что 6, 12 и 14 часов созревания являются критическими точками мейоза При добавлении ПРЛ (50 нг/мл) активация киназы гистонов HI в ооцитах как из малых, так и больших фолликулов происходила позже и была менее значительной, чем в контроле Ингибирующее влияние ПРЛ на киназную
активность было выражено значительнее в ооцитах из фолликулов диаметром 2-3 мм, в которых гормональный эффект проявлялся через 6 ч (Р<0,01), 10 ч (Р<0,05), 12 ч (Р<0,05) и 14 ч (Р<0,001) культивирования В группе ооцитов из фолликулов диаметром 4-5 мм достоверное различие между контрольной и опытной группой было обнаружено только через 8 ч созревания ооцитов (Р<0,001) Анализ полученных данных свидетельствует о том, что снижение активности киназы гистонов HI на ранних стадиях мейоза предшествует пролонгации завершения ядерного созревания ооцитов коров Результаты исследований также показывают, что в ооцитах из фолликулов диаметром 2-3 мм, в которых торможение мейоза под действием ПРЛ происходило на более ранней стадии (метафазе I), ингибирующее влияние гормона на активность киназы гистонов HI наблюдается раньше, чем в ооцитах из более зрелых фолликулов 3.5. Влияние пролактина на активацию MAP кнназ при созревании ооцитов коров in vitro. Известно, что во время созревания ооцитов мпекопитающих происходит активация MAP киназ (Hajnal and Berset, 2002) Сообщается, что их активация необходима для запуска фактора, промотирующего созревание (MPF), активация которого в свою очередь индуцирует разрыв зародышевого пузырька, что позволяет ооциту вступать в М-фазу первого мейотического цикла Одним из эффектом ПРЛ является активация белок-активирующего комплекса (АР-1), который играет основную роль во многих клеточных процессах, в том числе в пролиферации и дифференцировке клеток (Gutzman et al, 2004) MAP киназы, фосфорилируя АР-1, играют важную роль в трансдукции экстраклеточных сигналов в клетке для регуляции различных метаболических процессов (Nebreda and Ferby, 2000) MAP киназы - это большое семейство киназ, которое включает в себя c-Jun N-концевые киназы, р38 MAP киназы и ERK киназы В литературе имеются данные, указывающие, что ПРЛ передает свой сигнал в клетке через каскад MAP киназ, в частности ERK1 и ERK2 В связи с этим, нами было исследовано влияние ПРЛ на изменения активности ERK1 и ERK2 при созревании ооцитов В наших экспериментах активация MAP киназ происходила около 6 часов после начала созревания ооцитов (рис 3) После этого периода активность киназ достигала своего максимального значения приблизительно от 8 до 12 часов, что соответствует стадии метафазы I Активность MAP киназ оставалась неизменной до метафазы II и снижалась между 14 и 18 часами культивирования, и затем достигала свой второй максимум на 22-24 часа (метафаза II) Однако, между ооцитами, выделенными из фолликулов разного диаметра, наблюдались отличия по уровням активности MAP киназ Так, было обнаружено, что полная активация MAP киназ в ооцитах из фолликулов диаметром 4-5 мм происходит через 12 часов как в группах клеток, культивированных с ПРЛ, гак и без него (рис За) Тогда как киназы в ооцитах из фолликулов диаметром 2-Змм активируются только частично на данный период
культивирования, а полностью - примерно только через 18 часов от начала культивирования (рис. ЗЬ).
При действии ПРЛ отмечалось пролонгирование мейоза в ооцитах, выделенных как из малых, так и больших фолликулов (р<0,05). Наблюдалось повышение активности MAP киназ на 6 час культивирования как в ооцитах, инкубированных в присутствии ПРЛ, так и без гормона. Однако, после 6 часов в ооцитах, подвергшихся воздействию ПРЛ, активность киназ снижалась (р<0,05). Затем, через 8 часов от начала культивирования вновь отмечалось повышение активности MAP киназ в ооцитах, инкубированных в присутствии ПРЛ, выделенных как из больших, так и малых фолликулов. Отмечены некоторые различия активностей MAP киназ в ооцитах из фолликулов разного диаметра после действия ПРЛ в течение 14 часов культивирования. Так, в ооцитах из больших фолликулов ПРЛ снижал активность киназы на 14 часов культивирования, а в ооцитах, выделенных из малых фолликулов, наоборот, повышал. На 24 часа наблюдалась противоположная картина: активность MAP киназ при воздействии гормона возрастала в ооцитах из больших фолликулов, но снижалась в ооцитах из малых фолликулов. Механизм, посредством которого ПРЛ вызывает изменения в динамике мейотической прогрессии, до сих пор не ясен. По-видимому, ПРЛ замедляет процесс мейоза, снижая активность MAP киназ, участвующих в его реинициации. Возможно, ПРЛ опосредует свои эффекты через кумулюсные клетки, стимулируя секрецию вещества, ингибирующего созревание ооцитов, снижая активность протеин-киназ. Существуют экспериментальные данные, показывающие, что ПРЛ опосредует ингибирующее действие посредством выделения Са2+ из внутриклеточных депо (Kubelka et al., 1995). Мобилизация Са2+ может являться причиной инактивации киназы гистонов HI и MAP киназ. Это, по-видимому, обуславливает снижение активностей протеинкиназ при воздействии ПРЛ.
Время культивирования, ч Время культивирования, ч
Рис. 2. Влияние lilJJi на изменение активности киназы гистонов HI при созревании in vitro ооцитов коров из фолликулов диаметром 2-3 (а) и 4-5 мм (б), п ооцитов - 150, 3 повторности. Достоверность различия сравниваемых значений: *Р<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001 по сравнению с контролем (критерий %2).
3.6. Влияние теофиллина и пролактииа на созревание ооцитов коров. С
целью изучения цАМФ-зависимых внутриклеточных механизмов в опосредовании действия ПРЛ на созревание были проведены эксперименты по выявлению характера эффектов теофиллина (ТФ), ингибитора фосфодиэстераз - ферментов, отвечающих за деградацию цАМФ, на мейоз ооцитов коров in vitro. Для исследования влияния ПРЛ и ТФ на реинициацию мейоза ооцитов коров ОКК культивировали в течение 6 часов (таблица 4). В результате экспериментов было обнаружено, что добавление ТФ в среду созревания приводит к значительному повышению доли ооцитов, находящихся на стадии диплотены, по сравнению с контролем (95,3 % против 60,0%, Р<0,001). Тормозящее действие ТФ на реинициацию мейоза ооцитов не наблюдалось при культивировании ОКК в присутствии ПРЛ и ТФ. Одновременное внесение в среду ТФ и ПРЛ приводило к статистически достоверному снижению числа ооцитов на стадии диплотены (до 76,9 %) по сравнению с группой ОКК, инкубируемых в присутствии только одного ТФ (Р<0,05).
контрол I—bPRL
б 8 10 12 14 18 24 28
Время культивирования, ч
Время культивирования, ч
Рис. 3. Влияние IIPJI на изменение активности МАР-киназ при созревании in vitro ооцитов коров из фолликулов диаметром 4-5 мм (а) и 2-3 мм (б), п ооцитов - 150, 3 повторности. Достоверность различия сравниваемых значений: Р<0,05, Р<0,01, Р<0,001 по сравнению с контролем (критерий %2).
Таблица 4. Влияние пролактина и теофиллина на реинициацию мейоза в ооцитах коров (время культивирования - 6 часов) (п ооцитов - 160, 3
повторности).
группа Число ОКК п (%) ооцитов на стадиях
Диплотена Диакинез-Метафаза1
К 40 24 (60)а 16 (40)
К+50нг/мл ПРЛ 38 25 (65,8) 13 (34,2)
К+5мМ ТФ 43 41 (95,3)ь 2 (4,7)
К+5мМТФ+50нг/млПРЛ 39 30 (76,9)с 9(23,1)
К - ТС 199+10% ФБС Достоверность различия сравниваемых значений а'ь Р < 0,001,ь с Р < 0,05
При культивировании ОКК коров в течение 24 часов сохраняется тормозящее влияние ТФ на ядерное созревание ооцитов (таблица 5) Так, доля ооцитов, находящихся на стадии телофазы I или метафазы II, составляла только 12,5 % в этих условиях, тогда как в контроле она достигала 62,7 % (Р<0,001)
Таблица 5 Влияние пролактина и теофиллина на ядерное созревание ооцитов коров (время культивирования - 24 часа) (п ооцитов - 225, 3
повторности)
Группа Число ОКК п (%) ооцитов на стадиях
Диплотена Диакинез-Анафаза Телофаза-МетафазаП
К 54 4(7,8) 15 (29,4) 32 (62,7)"
К+50нг/мл ПРЛ 52 6(11,5) 6(11,5) 40 (76,9)"
К+5мМТФ 56 3 (5,4) 46 (82,1) 7 (12,5)с
К+5мМТФ+50нг/млПРЛ 63 1 (1,6) 39 (61,9) 23 (36,5)"
К - ГС 199+10% ФБС Достоверность различия сравниваемых значений Р < 0,001,с,<1 Р < 0,01,МР< 0,001
Внесение ПРЛ в среду с ТФ обусловливало достоверное повышение доли ооциюв, достигших завершающие стадии созревания (до 36,5 %, Р<0,01) Однако, в эгой группе уровень созревших ооцитов был достоверно ниже, чем в группе с одним ПРЛ (36,5 % против 76,9 %, Р<0,001) Таким образом, показано, что ПРЛ подавлял ингибирующее влияние ТФ на ядерное созревание ооцитов, однако супрессивный эффект ПРЛ не был полным Морфологический анализ ОКК после 24 часов культивирования показал, что ТФ и ПРЛ оказывают влияние на степень экспансии кумулюса Таблица 6 Морфофункционалыюе состояние клеток кумулюса в ооцит-кумулюсных комплексах в присутствии пролактина и/или теофиллина (п ОКК - 243, время культивирования - 24 часа)
Iруппа Число п (%) ооцитов с различной степенью
ОКК экспансии кумулюса
высокая средняя низкая
К 64 22 (34,4)а 35 (54,7) 7 (Ю,9)е
К+50нг/мл ПРЛ 60 29 (48,3)" 25 (41,7) 6(10)'
К+5мМТФ 60 2 (3,3)° 33 (55) 25 (41,7)8
К+5мМТФ+50нг/мл ПРЛ 59 10(16,9)" 34 (57,6) 15 (25,4)п
К - 1С 199+10% ФБС Достоверность различий сравниваемых значений ^ Р<0,001,е'8 Р < 0,001, м Р < 0,001,Р < 0,05,Р < 0,05
В присутствии ТФ доля ОКК с высокой степенью экспансии кумулюса снижалась (с 34,4 % до 3,3 %, Р<0,001) (габлица 6) При одновременном внесении в среду ТФ и ПРЛ отмечено увеличение процента ОКК с высокой степенью экспансии клеток кумулюса (до 16,9 %) по сравнению с группой ОКК, обработанных ТФ (Р<0,05) Однако, процент
этих ОКК был достоверно ниже, чем в среде с одним ПРЛ (Р<0,001) Полученные данные показывают, что ПРЛ может тормозить ингибирующее действие ТФ на экспансию кумулюса в ОКК коров in vitro.
Известно, что высокая внутриклеточная концентрация цАМФ, повышающего активность протеинкиназы А, обусловливает ингибирование реинициации мейоза ооцитов у млекопитающих, в том числе у коров (Conti et al, 2002). В нашем исследовании было показано, что добавление производных цАМФ в среду культивирования ОКК связано с полным или кратковременным блокированием возобновления мейоза. Кроме того, экспансия клеток кумулюса у мышей также регулируется цАМФ-зависимыми внутриклеточными механизмами (Ochsner et al, 2003) ТФ, являясь ингибитором фосфодиэстераз, подавляет деградацию цАМФ в клетках и, следовательно, повышает его внутриклеточную концентрацию Поэтому ТФ в концентрации 5 мМ кратковременно тормозил реинициациию мейоза, а также ингибировал ядерное созревание ооцитов и экспансию кумулюса. При этом ПРЛ (50 нг/мл) частично подавлял выявленное ингибирующее влияние ТФ на созревание ОКК коров Полученные данные свидетельствуют о том, что одним из эффектов ПРЛ на ОКК, по-видимому, является снижение внутриклеточной концентрации цАМФ путем активации фосфодиэстераз, или ингибирование активности протеинкиназы А Такое действие ПРЛ могло бы быть результатом пересечения сигнального каскада, индуцированного гормоном в ОКК, и цАМФ/протеинкиназа А-зависимого внутриклеточного пути 3.7. Влияние цАМФ на созревание ооцитов и развитие доимплантационных эмбрионов коров in vitro. Для исследования влияния цАМФ на реинициацию мейоза и созревание ооцитов коров m vitro ОКК инкубировали в среде с добавлением 50 нг/мл ПРЛ и 1 мМ дбцАМФ Время инкубации клеток составляло 6 и 24 часа, затем клетки отмывали от дбцАМФ После чего ОКК культивировали в среде ТС 199 с добавлением 20% бычьей фетальной сыворотки В результате экспериментов было выявлено тормозящее влияние дбцАМФ на созревание ооцитов коров Было обнаружено, что время инкубации в среде с содержанием дбцАМФ влияет на уровень созревания ооцитов В группе ОКК, подвергавшихся воздействию дбцАМФ в течение 24 часов, отмечали достоверное снижение числа ооцитов на стадии метафазы II по сравнению с контролем (18,3 % против 62,5% и 28,3% против 86,7% соответственно, Р<0,05) и экспериментальной группой ОКК, инкубированных в среде с дбцАМФ в течение 6 часов (18,3 % против 56,0% и 28,3% против 76,0%, Р<0,05) (таблица 7)
Отмечено, что при обработке дбцАМФ в течение 24 часов снижение доли ооцитов на стадии метафазы II более выражено, чем при инкубации в среде с дбцАМФ в течение 6 часов Уровень созревания ооцитов не имел достоверных различий с контролем в случае менее продолжительного воздействия дбцАМФ, поскольку тормозящее влияние цАМФ снималось через 6 часов инкубации. Однако, при воздействии дбцАМФ в течение 24
часов не наблюдается полнот о торможения мейоза и остановки созревания, что указывает на возможность преодоления ингибирующего эффекта цАМФ на ядерное созревание В работе В11ос1еаи е1 а1 показано, что высокие концентрации цАМФ в клетке повышают активность фосфодиэстераз, участвующих в деградации цАМФ (ВПоёеаи е1 а1, 1993) Таким образом, происходит снижение уровня цАМФ, что приводит к снятию блока мейоза
Данные исследования также показывают, что, вероятно, присутствие ПРЛ в средах экспериментальных групп ОКК обусловливало снижение уровня цАМФ в клетках, поэтому не отмечено полной остановки мейоза в ооцитах коров Наблюдаемые факты свидетельствуют о возможном участии цАМФ в реализации регуляторного влияния ПРЛ на процессы созревания ооцитов вне организма
Таблица 7 Эффект ПРЛ и дбцАМФ на созревание и способность к развитии коровьих ооцитов, созревших in vitro (п ооцитов - 82, n __осемененных ооцитов - 459, 3 повторности)___
система культивирования п ооцитов % ооцитов на стадии метафазы II (ранней) % ооцитов на стадии метафазы И(всего) | п осемененных 1 ооцитов % оплодотво рившихся клеток % морул, бласто- цист
К+50нг/мл ПРЛ 29 62,5а± 7,7 86,7а± 6,6 145 78,5а± 2,2 25,1а± 2,2
К+5 Онг/м лГГР Л+1 мМ дбцАМФ (6 ч) 25 56,0а± 11,6 76,0а± 7,4 161 61,8 "±5,0 13,5Ь± 1,3
К+50нг/млПР Л+1 мМ дбцАМФ(24 ч) 28 18,3" ±7,4 28,3Ь-Ы0,4 153 56,4Ь± 5,7 5,2ь ± 1,0
К - ТС 199+20% ФБС
Достоверность различий сравниваемых значений а'с Р<0,05 3.8. Эффекты дбцАМФ на оплодотворяемость ооцитов и развитие эмбрионов. Так как условия созревания ооцитов in vitro имеют огромное значение в оплодотворяемости и способности к дальнейшему развитию эмбрионов, нами было изучено влияние дбцАМФ и ПРЛ на оплодотворяемость ооцитов и выход эмбрионов на стадии морулы и бластоцисты В данном эксперименте всего было осемененно 459 ооцитов, созревших в трех системах культивирования в присутствии только ПРЛ в среде созревания, а также с предварительной обработкой дбцАМФ в течение 6 и 24 часов Доля оплодотворившихся яйцеклеток, созревших в культуральной среде с добавлением ПРЛ, составила 78,5% Отмечено достоверное снижение числа оплодотворившихся ооцитов, подвергнутых предварительной обработке дбцАМФ в течение 6 и 24 часов, по сравнению с контролем (61,8% и 56,4% против 78,5% соответственно, Р < 0,05) (таблица 7) Доля ооцитов, достигших стадии метафазы И при предварительной обработке дбцАМФ в течение 6 часов составляла
76±7,4%, а при воздействии дбцАМФ в течение 24 часов - 28,3±10,4% Процент оплодотворившихся ооцитов в первой группе ОКК составлял 61,8±5,0, а во второй - 56,4±5,7 Полученные результаты свидетельствуют о том, что дбцАМФ не тормозит полностью мейоз, ингибирующий эффект данного агента был не полный и кратковременный Возможно, что ПРЛ снижал концентрацию дбцАМФ, как это было показано в наших экспериментах по изучению совместного влияния ПРЛ и ТФ, ингибитора фосфодиэстераз на ядерное созревание ооцитов коров in vitro Таким образом, результаты экспериментов показывают, что в условиях исследованной нами системы дозревания ооцитов ш vitro ПРЛ оказывает положительное действие на завершение мейотического созревание ооцитов коров, способность ооцитов к оплодотворению и дальнейшему развитию эмбрионов, что является одним из маркеров завершения цитоплазматического созревания яйцеклетки Предварительная обработка дбцАМФ в течение 6 и 24 часов оказывала негативное влияние на оплодотворяемость ооцитов и дальнейшее развитие эмбрионов Однако тормозящее влияние повышенной концентрации дбцАМФ в среде культивирования было не полным, возможно, в результате снижения пролактином внутриклеточного уровня цАМФ
ВЫВОДЫ
1 ПРЛ тормозит ядерное созревание ооцитов из фолликулов диаметром 2-Змм и 4-5 мм (Р<0,05) на разных стадиях мейоза Внесение ПРЛ в среду культивирования приводило к замедлению перехода от метафазы I к анафазе I в ооцитах из фолликулов диаметром 2-3 мм (13,45±0,72 против 16,07±0,82) При созревании ооцитов из фолликулов диаметром 4-5 мм тормозящее влияние гормона было обнаружено при переходе от ранней к поздней телофазе I (17,96±0,77 против 20,28±0,79), а также от поздней телофазы I к метафазе II (22,99±1,04 против 25,91±0,95)
2 Показан высокий выход эмбрионов на стадиях морулы и бластоцисты, выделенных из фолликулов диаметром от 5 до 8 мм и созревших в средах с 50 нг/мл ПРЛ (52,6% против 25% в контроле, Р <0,05)
3 Преобразование хроматина при созревании ооцитов коров in vitro сопряжено с изменением активности киназы гистонов HI Снижение активности киназы гистонов HI под влиянием ПРЛ в начале культивирования ооцитов обуславливает торможение их ядерного созревания
4 Ингибирующее влияние пролактина на активацию MAP киназ приводило к торможению мейотического созревания ооцитов коров m vitro, особенно на ранних стадиях (диплотена, диакинез)
5 Теофиллин оказывает ингибирующее действие на реинициацию мейоза, ядерное созревание и экспансию кумулюса в ооцит-кумулюсных комплексах коров, при этом повышается доля ооцитов на стадии диплотены (95,3 % против 60,0% в контроле, Р<0,001),
снижается число ооцитов, достигших стадии телофазы и мстафазы II (12,5% против 62,7 % в контроле, Р<0,001), уменьшается процент ооцитов с высокой степенью экспансии кумулюса (3,3% против 34,4% в контроле, Р<0,001) 6 Пролактин частично подавляет блокирующие эффекты теофиллина на созревание ОКК коров, что выражается в снижении числа ооцитов на стадии диплотены ( 76,9%, против 95,3%, Р<0,05) после 6 часового культивирования с ТФ и ПРЛ и увеличении доли ооцитов, достигших стадии телофазы и метафазы II (36,5% против 12,5% Р<0,01) после 24 часов культивирования, при одновременном увеличении числа ОКК с высокой степенью экспансии кумулюса (16,9% против 3,3%, Р<0,05) 7. дбцАМФ ингибирует достижение ооцитами стадии метафазы II (28,3±10,4 против 86,7±6,6 Р<0,05) при культивировании ооцитов с пролактином в течение 24 часов 8 Обнаружено, чго дбцАМФ оказывает ингибирующее действие на способность ооцитов к оплодотворению и развитию доимплантационных эмбрионов В группах ооцитов, преинкубированных с дбцАМФ и ПРЛ в течение 6 или 24 часов выход оплодотворенных клеток составил 61,8±5,0 и 56,4±5,7 против 78,5±2,2, Р<0,05, а процент морул и бластоцист - 13,5±1,3 и 5,2±1,0 против 25,1±2,2 в контроле, Р<0,05
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1 При получении эмбрионов in vitro для их применения в клеточных технологиях репродукции (трансплантация эмбрионов, клонирование, трансгенез) с целью повышения качества зрелой яйцеклетки использовать для культивирования ооциты из фолликулов диаметром 3-5, 5-8 мм Дозревание яйцеклеток проводить в ТС-199, 10% фетальной бычьей сыворотки с добавлением 50 нг/мл бычьего пролактина
2 Результаты исследований могут быть использованы научными сотрудниками, аспирантами и студентами ветеринарных, сельскохозяйственных, медицинских ВУЗов, НИИ и специалистами биотехцентров, для научных исследований и практического применения
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1 Кузьмина Т И Эффект пролактина на апоптоз в соматических и половых клетках овариальных фолликулов коров / Альм X , Торнер X, Скотти О С, Мурза Г В // Межд Конф «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» Пущино, июнь — 2007 - С 319322
2 Кузьмина ТИ Влияние пролактина на статус хроматина в ооцит-кумулюсных комплексах коров, выделенных их фолликулов разного диаметра при созревании in vitro / Альм X , Торнер X, Скотти О С , Кибирдина ТВ// Цитология - 2007 - Т 49 - №9 - С 763-764
3 Лебедева И Ю, Скотти О С , Кузьмина Т И Созревание ооцит-кумулюсных комплексов коров в присутствии теофиллина и пролактина // Сб науч трудов ГНУ ВНИИГРЖ «Селекционно-
генетические методы повышения продуктивности с/х животных» С -Петербург -2006 -№2 -С 211-217
4 Лебедева И Ю, Скотти О С, Кузьмина Т И Модуляция пролактином ингибирующего действия теофиллина на созревание ооцит-кумулюсных комплексов коров in vitro // Цитология - 2006 -Т48 -№12 -С 1010-1015
5 Лебедева И Ю, Скотти О С, Кузьмина Т И Участие цАМФ-зависимого внутриклеточного механизма в реализации действия пролактина на ооцит-кумулюсные комплексы коров // Междконф «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» Пущино, июнь 2005 -С. 314-317
6 Скотти О С Действие пролактина на блок мейоза ооцитов коров, вызванный теофиллином // Бюллетень ГНУ ВНИИГРЖ, С -Петербург -2006 -выпуск 149 -С 6-8
Подписано в печать 17 03 2008 г Формат 60 х 84 1/16 Бумага офсетная Объем 1 печ л Тираж 100 экз Заказ № Л СЛ
Отпечатано на ризографе ГНУ СЗНИИМЭСХ
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Скотти, Ольга Сергеевна
ВВЕДЕНИЕ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Роль пролактина в репродукции млекопитающих.
1.1.1. Структура молекулы пролактина (общие сведения).
I ' I '
1.1.2. Биологические функции пролактина.
1.1.3. Гормональная регуляция фолликулогенеза и мейоза ооцитов коров.
1.1.4. Участие пролактина в апоптозе и пролиферации клеток в процессе фолликулогенеза.
1.2. Внутриклеточные механизмы реализации эффектов гипофизарных гормонов на созревание яйцеклетки.
1.2.1. Характеристика рецепторов к гипофизарным гормонам на овариальных клетках.
1.2.2. Современные представления о механизмах реализации эффектов пролактина на фолликулярные клетки.
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Материал исследований.
2.2. Методы исследований.
2.2.1. Выделение и морфологическая оценка ооцит-кумулюсных комплексов.
2.2.2. Культивирование ооцит-кумулюсных комплексов.
2.2.3. Культивирование клеток гранулезы.
2.2.4. Цитогенетический анализ.
2.2.5. Определение уровня пикнозов в кумулюсных клетках.
2.2.6. Анализ активности киназы гистонов HI.
2.2.7. Определение активности MAP киназ.
2.2.8. Получение клеток эпителия яйцевода.
2.2.9. Оплодотворение ооцитов.
2.2.10. Статистическая обработка полученных данных.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1. Исследование влияния пролактина на созревание ооцитов, выделенных из фолликулов разного диаметра.
3.2. Деструктивные процессы в кумулюсе ооцит-кумулюсных комплексов при культивировании в средах с пролактином.
3.3. Культивирование доимплантационных эмбрионов в средах с пролактином.
3.4. Влияние пролактина на кинетику мейоза в ооцитах коров.
3.5. Активация киназы гистонов HI в процессе созревания ооцитов коров in vitro в средах с добавлением пролактина.
3.6. Влияние пролактина на активацию MAP киназ в динамике мейоза ооцитов коров in vitro.
3.7. Роль цАМФ-зависимых внутри клеточных механизмов, опосредующих действия пролактина.
3.7.1. Влияние теофиллина и пролактина на созревание ооцитов коров in vitro.
3.7.2. Эффект дбцАМФ на созревание ооцитов коров in vitro.
3.7.3. Оплодотворяемость ооцитов и развитие эмбрионов в культуральных средах с добавлением дбцАМФ.
ОБСУЖДЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Реализация действия пролактина на мейоз ооцитов коров"
Актуальность темы
Современные методы репродуктивных технологий, в основе которых лежит базовый способ дозревания ооцитов in vitro, такие, как трансплантация эмбрионов, клонирование, трансгенез, получение эмбриональных стволовых клеток были разработаны' и интенсифицируются благодаря научным разработкам в области исследования механизмов регуляции, фолликуло- и оогенеза. Несмотря на то, что достижения эмбриотехнологий в последние годы убедительно доказывают возможность использования особей, полученных путем клонирования или- трансгенеза в животноводстве, фармакологии и в медицине, эффективность этих технологий низкая. По прежнему актуальным остается вопрос о приобретении яйцеклеткой, созревшей in vitro, компетентности к оплодотворению и дальнейшему развитию эмбрионов. Процесс завершения мейоза вне организма зависит от многих факторов, среди которых немаловажную роль играют система культивирования'. За1 последние 30 лет исследователями проделана' большая работа по оптимизации моделей дозревания ооцитов. В работах использовались модели интрафолликулярного культивирования [20], культивирование на стенках фолликулов [21], среды, кондиционированные клетками гранулезы [127, 128] и т.д. Использование клеточных элементов фолликулов обеспечивало повышение уровня созревших клеток и выхода эмбрионов. Введение в среды для культивирования различных гормонов и биологически активных веществ позволяет выявлять характер их воздействия на состояние хроматина соматических клеток фолликула и гамет, оценивать проспективность их потенции к оплодотворению и дальнейшему формированию эмбрионов. В настоящее время ведущая роль гипофизарных гормонов: фолликулостимулирующего и лютеинизирующего в регуляции фолликуло- и оогенеза твердо установлена. В то же время, возможная роль пролактина, еще одного гипофизарного гормона в механизмах формирования биологически полноценной яйцеклетки недостаточно ясна. Рядом авторов установлено, что пролактин оказывает стимулирующий эффект на созревание ооцитов [132, 52, 205]. Обнаружено, что качество ооцитов, полученных от суперовулированных телок коррелирует с увеличенным содержанием в фолликулах пролактина [205]. Установлено, что пролактин, добавленный в культуральную среду в процессе созревания ооцитов благоприятно влияет в дальнейшем при оплодотворении in vitro на выход полноценных эмбрионов на стадии бластоцисты [13, 196]. Показано, что гомозиготные самки мышей с инактивированным геном для лактогенного рецептора бесплодны, вследствие многочисленных репродуктивных аномалий, включая овуляцию, увеличение количества не возобновивших мейоз ооцитов, понижение оплодотворяемости яйцеклеток и их способности, к дальнейшему развитию [42]. Полученные недавно данные об экспрессии мРНК рецепторов пролактина в ооцитах и ранних эмбрионах мышей, а также в овариальных клетках овец указывают на возможность прямого воздействия пролактина на формирование зрелой яйцеклетки [165, 118].
В этой связи, вопрос о механизмах действия пролактина на мейоз и возможных путей реализации становится актуальной проблемой генетических основ репродуктивной биологии. *
Цель настоящей работы
Исследовать механизмы реализации эффектов пролактина на мейоз ооцитов при их созревании in vitro и вовлечение в эти процессы соматических клеток фолликулов.
В работе решались следующие конкретные задачи:
1.Сравнить степень чувствительности овариальных клеток из фолликулов-разного диаметра к воздействию пролактина, с учетом: - стадии мейоза ооцитов; -степени экспансии клеток кумулюса; -уровня пикнозов в кумулюсе; -оплодотворяемости ооцитов;
-развития доимплантационных эмбрионов;
2.Охарактеризовать влияние пролактина на кинетику мейоза в ооцитах коров из фолликулов разного диаметра;
3. Изучить действия пролактина на активацию киназы гистонов HI и MAP киназ ERK1 и ERK2 в процессе созревания ооцитов коров in vitro;
4. Выявить эффекты дбцАМФ на завершение мейоза в ооцитах, созревших в присутствии пролактина, их оплодотворение и развитие эмбрионов;
5. Проанализировать роль цАМФ/протеинкиназа А-зависимого сигнального пути в реализации действия ПРЛ на созревание окруженных кумулюсом ооцитов коров.
Научная новизна
Впервые с использованием модели вне фолликулярного дозревания ооцитов, выделенных из фолликулов различного диаметра, проведен комплексный анализ эффектов бычьего пролактина на ' мейотические преобразования хромосом, статус хроматина кумулюса, развитие преимплантационных эмбрионов коров.
Проанализирована кинетика мейоза в ооцитах овариальных фолликулов коров разного диаметра, прокультивированных в присутствии пролактина.
Показано вовлечение в процессы реализации эффектов пролактина на мейоз ооцитов in vitro киназы гистонов HI и MAP киназ.
Идентифицирован характер действия дбцАМФ* на завершение мейоза ооцитах, созревших в присутствии пролактина, дальнейшее их оплодотворение и развитие эмбрионов. Получены данные, свидетельствующие о возможном участии цАМФ* зависимого внутриклеточного пути в опосредовании действия пролактина на ооцит-кумулюсные комплексы коров.
Теоретическая и практическая значимость работы Теоретически обоснована модель опосредованного клетками кумулюса характера действия пролактина на созревание коровьих яйцеклеток. Выявлено, что характер влияния пролактина на созревание ооцитов коров, их способность к оплодотворению и дальнейшее развитие эмбрионов зависит от диаметра исходного фолликула, то есть от степени дифференцировки фолликулярных клеток. Наблюдаемое пролонгируещее действие ПРЛ на процесс мейоза ооцитов, вероятно, способствует синхронизации ядерного цитоплазматического созревания. Полученные результаты дополняют имеющиеся представления о внутриклеточных сигнальных путях реализации эффектов пролактина in vitro на мейоз в ооцитах коров. Наши экспериментальные данные доказывают, что действие гормона может осуществляться через разные сигнальные пути, в том числе и через цАМФ-зависимый путь, по крайней мере частично, как на уровне синтеза и распада цАМФ, так и через регуляцию активностей MAP киназы и киназы гистонов HI. Анализ данных исследований по выявлению эффектов пролактина и теофиллина на ооцит и его кумулюс свидетельствуют о сопряжении сигнального каскада, индуцированного ПРЛ в ооцит-кумулюсных. комплексах коров, и цАМФ-зависимого внутриклеточного пути.
Результаты экспериментов позволяют предположить, что запуск определенного сигнального каскада пролактином в ооцит-кумулюсном комплексе зависит от стадии фолликулярного созревания, соответственно, степени зрелости яйцеклетки.
Практическая ценность работы представлена разработкой системы дозревания ооцитов, выделенных из фолликулов диаметром 5-8 мм, на основе использования 50 нг/мл прола, позволяющая повышать выход биологически полноценной яйцеклетки и эмбрионов коров. Апробация работы
Материалы диссертации были доложены и одобрены на ежегодных аспирантских сессиях и отчетах ГНУ ВНИИГРЖ Россельхозакдемии, представлены на Международных конференциях. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» Пущино (2005, 2007 годы), «Клеточное ядро». Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург, 2007.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе в журнале «Цитология». Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследований, их обсуждения, выводов, предложений, списка использованной при написании диссертации литературы, включающего 215 источников, в том числе 194 на иностранном языке. Диссертация изложена на 125 страницах, включает 7 таблиц, 21 рисунок.
Заключение Диссертация по теме "Генетика", Скотти, Ольга Сергеевна
ВЫВОДЫ
1. Исследована кинетика завершающих стадий мейоза в ооцитах коров, выделенных из фолликулов диаметром 2-Змм и 4-5 мм в присутствии пролактина. Пролактин тормозил ядерное созревание ооцитов из фолликулов обеих категорий (Р<0,05), однако этот эффект был выявлен на разных стадиях мейоза. Внесение ПРЛ в' среду культивирования приводило к замедлению перехода от метафазы I к анафазе I в ооцитах из фолликулов диаметром 2-3 мм (13,45±0,72 против 16,07±0,82). При созревании ооцитов из фолликулов диаметром 4-5 мм» тормозящее влияние гормона было обнаружено при переходе от ранней к поздней телофазе L(17,96±0,77 против 20,28±0,79), а также от поздней телофазы I к метафазе II (22,99±1,04 против 25,91±0,95).
2. Установлено, что уровень пикноза, в кумулюсных клетках зависит от диаметра фолликула. Наибольший, пикнотический индекс был отмечен в ооцит-кумулюсных комплексах, выделенных из фолликулов диаметром менее 3 мм (29,6%, Р<0,05).
3. Показан высокий выход эмбрионов на стадиях морулы и бластоцисты, выделенных из фолликулов диаметром 5-8 мм, при культивировании в средах с добавлением 50 нг/мл пролактина (52,6% против 25% в контроле, Р < 0,05).
4. Изменение активности киназы гистонов HI сопутствует преобразованию хроматина при созревании ооцитов коров in vitro. Снижение активности киназы гистонов HI под влиянием пролактина на ранних стадиях культивирования ооцитов предшествует пролонгации завершения их ядерного созревания.
5. Отмечены изменения активности MAP киназ в зависимости от мейотических преобразований хромосом при культивировании ооцит-кумулюсных комплексов in vitro. Вывлено ингибирующее влияние пролактина на активацию MAP киназ при ядерном созревании ооцитов коров in vitro. Замедленный процесс мейотического созревания сопровождался снижением активности MAP киназ, особенно на ранних стадиях дозревания ооцитов (Диплотена, диакинез).
6. Теофиллин оказывает ингибирующее действие на реинициацию мейоза, ядерное созревание и экспансию кумулюса в ооцит-кумулюсных комплексах коров. Добавление ТФ в среду созревания приводит к повышению доли ооцитов, находящихся на стадии диплотены (95,3 % против 60,0% в контроле, Р<0,001), снижению числа ооцитов, достигших стадии телофазы и метафазы II (12,5% против 62,7 % в контроле, Р<0.001), уменьшению процента ооцитов с высокой степенью экспансии кумулюса (3,3% против 34,4% в контроле, Р<0,001).
7. Пролактин частично подавляет блокирующие эффекты теофиллина на созревание ОКК коров, что выражается в снижении числа ооцитов на стадии диплотены ( 76,9%», против 95,3%, Р<0,05) после 6 часового культивирования с ТФ и ПРЛ и увеличении доли ооцитов, достигших стадии телофазы и метафазы II (36.5% против 12,5% Р<0,01.) после 24 часов культивирования, при одновременном увеличении числа ОКК с высокой степенью экспансии кумулюса ( 16,9% против 3,3%, Р<0,05).
8. дбцАМФ оказывал ингибирующее влияние на достижение ооцитами стадии метафазы II (28,3±10,4 против 86,7±6,6 Р<0,05) при культивировании ооцитов с пролактином в течение 24 часов.
9. Обнаружено, что дбцАМФ оказывает ингибирующее действие на оплодотворение ооцитов и развитие доимплантационных эмбрионов. В группах ооцитов, преинкубированных с дбцАМФ и ПРЛ в течение 6 или 24 часов выход оплодотворенных клеток составил 61,8±5,0 и 56,4±5,7 против 78,5±2,2, Р<0.05, а процент морул и бластоцист - 13,5±1,3 и 5,2±1,0 против 25,1±2,2 в контроле, Р<0,05.
101
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Скотти, Ольга Сергеевна, Санкт-Петербург-Пушкин
1. Василенко К.П., Бурова Е.Б., Антонов В.Г., Никольский H.H. Окисленный глутатион вызывает активацию рецептора эпидермального фактора роста и MAP киназ ERK 1,2 // Цитология. — 2006. Т.48. - № 6. — С. 499-507.
2. Воробьева O.A. Факторы роста — новые регуляторы репродукции // Цитология. 1989. - Т. 31. №10. - С. 1139-1157.
3. Воробьева O.A. Регуляция ингибирования и реинициации мейоза ооцитов млекопитающих // Цитология. 1990. - Т.32. - №5. - С. 422-437.
4. Вундер П.А. Принцип плюс-минус взаимодействия и регуляция пролактиновой функции гипофиза // Успехи совр. Биологии. 1991. — Т.111. - №2.-С. 288-301.
5. Вундер П.А. О механизмах тормозного и стимулирующего влияния женского полового гормона на секрецию гонадотропинов // Успехи совр. Биологии. 1992. - Т. 112. - №. - С.609-626.
6. Денисенко В.Ю., Кузьмина Т.И. Участие протеинкиназы С в регуляции стимулированного пролактином освобождения Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней // Цитология. — 2002. № 44(6). — С. 551-554.
7. Денисенко В.Ю., Кузьмина Т.И., Федосков Е.Д. Участие ионов кальция и протеинкиназы С в ответе клеток гранулезы на пролактин // Цитология. 1999. - т.41 - № 3/4 - С. 285.
8. Дыбан А. П. Раннее развитие млекопитающих. — М.: Наука. 1988. -228с.
9. Карш Ф.Д., Линкольн Д.У., Линкольн Дж.А. и др. Гормональная регуляция размножения у млекопитающих. М.: Мир. - 1987. - 305с.
10. Кузьмина Т.И. Оценка генетической полноценности ооцитов коров при их культивировании вне организма // Автореф.дис.канд.биол.наук. — Ленинград. -1983.-С.21.
11. Кузьмина Т.И., Лебедева И.Ю., Торнер X., Альм X. Эффекты пролактина в различных системах культивирования на созревание ооцитов коров и их способность к дальнейшему развитию // Онтогенез. 2001. - № 32 (2).-С. 140-147.
12. Кузьмина Т.И., Шагиахметова Г. Модернизация систем дозревания ооцитов коров для интенсификации технологии оплодотворения in vitro // Доклады РАСХН. 1995. -№4. - С. 5-27.
13. Лебедев В.А. Факторы, регулирующие реализацию эффектов соматотропина и пролактина на фолликулогенез у коров //
14. Автореф.дис.канд.биол.наук.-С.-П.-Пушкин. 2000. - С. 24.
15. Лебедева И.Ю. Влияние пролактина на фолликулогенез и мейоз ооцитов коров // Автореф.дис.канд.биол.наук.-С.-П.-Пушкин. — 1995. — С.20.t
16. Лебедева И.Ю., Лебедев В.А., Кузьмина Т.И. Характеристикасоматотропин- и пролактинсвязывающих участков на клетках гранулезыtкоров при использовании гомологичных гормонов // Биохимия. — 2001. № 66(9).-С. 1188-1194".
17. Михаелян Х.Г. Блок и реинициация мейоза в ооцитах коров in vitro // Дисс. канд.биол.наук.-С.-П.-Пушкин. 1988. - С. 111.
18. Никитин А.И., Воробьева О. А. Факторы регуляции дифференцировки соматических клеток фолликулов яичников млекопитающих // Цитология. 1988. - Т.ЗО. - №10. - С. 1151-1171.
19. Свиридов Б.Е. Закономерности роста фолликулов и созревания ооцитов коров в яичниках при культивировании in vitro // Автореф.дис.докт.биол.наук. С.-П.-Пушкин. - 1991. - С.36.
20. Шагиахметова Г.А. Влияние тканевой культуры фолликулов на мейотическое созревание и оплодотворение in vitro ооцитов коров // Автореф. Дис. к.б.н.СПб-Пушкин. 1992. - С. 17.
21. Abdel-Meguid S.S., Shieh H.S., Smith W.W., Dayringer H.E., Violand B.N. and Bentle L.A. Three-dimensional structure of a genetically engineered variant of porcine growth hormone // Proc Natl Acad Sci USA — 1987. — V. 84. P. 6434-6437.
22. Accorsi P.A., Pacioni В., Pezzi C., Forni M. Role of prolactin, growth hormone and insulin-like growth factor 1 in mammary gland involution in the dairy cow//J.Dairy Sci.-2002.-V.85.-P. 507-513.
23. Adams G.P., Matteri R.L., Kastelic J.P. et al. Association between surges of follicle-stimulating hormone and the emergence of follicular waves in heifers // J. Reprod. Fertil. 1992. - V. 94. - P. 177-188.
24. Ain R, Dai G., Dunmore J.H., Godwin A.R. and Soares -M.J. A prolactin -family paralog regulates reproductive adaptations to a physilogical stressor // PNAS. 2004. - V. 101. -N. 47. — P/ 16543-16548.i
25. Al-Sakkaf K.A., Dobson P.R. and Brown B.L. Prolactin induced tyrosine phosphorylation of p59fyn may mediate phosphatidylinositol 3-kinase activation in Nb2 cells. // J Mol Endocrinol. 1997. - V. 19. - P. 347-350.i
26. Ali S, Ali S. Recruitment of the proteintyrosine phosphatase SHP-2 to the C-terminal tyrosine of the prolactin receptor and to the adaptor protein Gab2 // J Biol Chem. 2000. - V. 275. - P. 39073-39080.
27. Aoki N, Matsuda T. A cytosolic protein-tyrosine phosphatase PTP1B specifically dephosphorylates and deactivates prolactin-activated STAT5a and STAT5b. //J Biol Chem. — 2000. — V. 275.-P. 39718 -39726.
28. Baeuerle P.A. Pro-inflammatory signaling: last pieces in the.-NFkappaB puzzle. // Curr Biol. 1998.- V. 8. - P. R19-R22.
29. Bakowska J.C. and Morrell J.L. Atlas of the neurons that express mRNA t for the long form of the prolactin receptor in the forebrain of the female rat // J Comp Neurol. 1997. - V. 386. - P. 161-177.
30. Bazan J.E. Haemopoietic receptors and helical cytokines // Immunol. Today. 1990,-V. 11.-P. 350-354.
31. Bazan J.E. Structural design and molecular evolution of a cytokine receptor superfamily // Proc Natl Acad Sci USA 1990. - V. 87. - P:6934-6938.
32. Bergeron JJM, Resch L., Rachubinski R., Patel B.A. and Poster B.I. Effect of colchicine on internalization of prolactin in the female rat liver: an in vivo autoradiographic study // J Cell Biol. 1983. - V. 96. - P. 875-886.
33. Berlanga J.J., Fresno Vara J.A., Martin-Perez J. and Garcia Ruiz J.P. Prolactin receptor associated with c-src kinase in rat liver. //Mol Endocrinol. — 1995.- V.9.-P. 1461-1467.
34. Berlanga JJ, Gualillo O, Buteau H, Applanat M, Kelly PA, Edery M. Prolactin activates tyrosyl phosphorylation of insulin receptor substrate 1 and phosphatidylinositol-3-OH kinase // J Biol Chem. 1997. - V. 272. - P.2050 -2052.
35. Berthon P., Kelly P.A. and Jiane J.D. Water-soluble prolactin receptors from porcine mammary gland // Proc Soc Exp Biol Med. 1987. - V. 184. -P. 300-306.
36. Berwaer M., Martial J.A. and Davis J.R. Characterization of an up-stream promoter directing extrapituitary expression of the human- prolactin gene // Mol Endocrinol. 1994. -V. 8. - P. 635-642.
37. Besnard N., Home E.A.L., Whitehead S.A. Prolactin and. lipopolysaccharide treatment increased apoptosis and atresia in rat ovarian follicles//Actaphysiol. Scand.-2001. V. 172.-P. 17-25.
38. Bilodeau-Goeseels S. Effects of phosphodiesterase inhibitors on spontaneous nuclear maturation and cAMP concentration in bovine oocytes // Theriogenology. 2003. -V. 60. - P. 1679-1690.
39. Bolander F.F. Jr. Regulation of prolactin receptor glycosylation and its role in receptor location // Mol Cell Endocrinol. 1999. - V. 149. - P. 85-92.
40. Bole-Fey sot C, Goffin V, Edeiy M, Binart N, Kelly PA. Prolactin (PRL) and its receptor: actions, signal transduction pathways and phenotypes observed in PRL receptor knockout mice // Endocr Rev. 1998. - 19. - P. 225-268.
41. Bowen J.M., Keyes P.L., Warren J.S. and Towson D.H. • Prolactin-induced regression of the rat corpus luteum: expression of monocyte chemoattractant protein-1 and invasion of macrophages // Biol Reprod. — 1996. — V. 54.-P. 1120-1127.
42. Brockman JL, Schroeder MD, Schuler LA. Prolactin activates the cyclin D1 promoter via the JAK2- STAT pathway // Mol Endocrinol. 2002. -V. 16. -P. 774 -784.
43. Buckley A.R., Crowe P.D. and Russell D.H. Rapid activation of proteinkinase C in isolated rat liver nuclei by prolactin, a known hepatic mitogen // Proc Natl Acad Sci USA. 1988. - V 85. - P. 8649-8653.
44. Buckley A.R., Rao Y-P., Buckley D.J. and Gout P.W. Prolactin-induced phosphorylation and nuclear translocation of MAP kinase in Nb2 lymphoma cells // Biochem Biophys Res Commun. 1994. - V. 204. - P. 1158-1164.
45. Campbell G.S., Argetsinger L.S., Ihle J.N., Kelly P.A., Rillema J.A. and Carter-Su C. Activation of JAK2 tyrosine kinase by prolactin receptors in Nb2 cells and mouse mammary gland explants // Proc Natl Acad Sci USA. — 1994. -V. 91.-P. 5232-5236.
46. Canbay E., Norman M., Kilic E., Goffin V. and Zachary I. Prolactin stimulates the JAK2 and focal adhesion kinase pathways in human breast carcinoma T47-D cells // Biochem. J. 1997. - V. 324. - P. 231-236.
47. Carter-Su C. and Smit L.S. Signaling via JAK tyrosine kinases: growth hormone receptor as a model system. // Recent Prog Horm Res. — 1998. — V. 53. -P. 61-82.
48. Chang L, Karin M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. // Nature.-2001.-V. 410.-P. 37-40.
49. Chang W.P., Ye Y. and Clevenger C.V. Stoichiometric structure function analysis of the prolactin receptor signaling domain by receptor chimeras //Mol Cell Biol. 1998. -V. 18. - P. 896-905.
50. Channing C.P., Anderson L.D., Hoover D.J. et al. The role of thenonsteroidal regulators in control of oocyte and follicular maturation // Recenti
51. Progr. Hormone Res. 1982.-V. 38.-P. 331-408.
52. Channing C.P., Evans V.W. Stimalatory effect of ovine prolactin upon cultured porcine granulose cell secretion of inhibitory activity of oocyte maturation//Endocrinology. 1982.-V. lll.-N. 5.-P. 1746-1748.
53. Chen J.C., Lin J-H., Wu L-S., Tsai Y-F., Su T.H., Chen C.J. and Chenj
54. T.J. Luteotropic roles of prolactin in early pregnant hamsters // Biology of reproduction. 2002. - V.67. - P.8-13.
55. Chen Z., Gibson T.B., Robinson F., Silvestro L., Pearson G., Xu B., Wright A., Vanderbilt C. and Cobb M.H. MAP kinases // Chem.Rev. 2001. -N. 101. - P. 2449-2476.
56. Clarke D.L. and Linzer DIH. Changes in prolactin receptor- expression during pregnancy in the mouse ovary // Endocrinology. 1993. - V. 133. - P. 224-232.
57. Clevenger CV, Altmann SW, Prystowsky MB. Requirement of nuclear prolactin for interleukin-2-stimulated proliferation of T lymphocytes. // Science. 1991.-V. 253.-P. 77-79.
58. Clevenger C.V., Furth P.A., Hankinson S.E., Schuler L.A. The role of Prolactin in Mammary Carcinoma. // Endocr. Rev. — 2003. V. 24(1). - P. 1-27.
59. Clevenger CV, Medaglia MV. The protein tyrosine kinase p59fyn is associated with prolactin receptor and is activated by prolactin stimulation of T-lymphocytes // Mol Endocrinol. 1994. - V. 8 - P. 674 - 681.
60. Clevenger C.V., Torigoe T. and Reed J.C. Prolactin induces rapid phosphorylation and activation of prolactin receptor-associated RAF-1 kinase in a T-cell line // J Biol Chem. 1994. - V. 269. - P. 5559-5565.
61. Collas P., Sullivan E.J., Barnes F.L. Histone HI kinase activity in bovine oocytes following calcium stimulation // Mol. Reprod. Dev. 1993. - V. 34. - P. 224-231.
62. Conti M., Andersen C.B., Richard F., Mehats C., Chun S-Y., Horner K.,i
63. Jin C., Tsafriri A. Role of cyclic nucleotide signaling in oocyte maturation // Molecular and Cellular Endocrinology. 2002. -V. 187. - P. 153-159.
64. Cocke N.E., Coit D., Shine J., Baxter J.D. and Martial J.A. Human prolactin cDNA structural analysis and evolutionary comparisons. // J Biol Chem. 1981. - V. 256. - P. 4007-4016.
65. Das R, Vonderhaar BK. Activation of raf-1 MEK, and MAP kinase in prolactin responsive mammary cells // Breast Cancer Res Treat. 1996. - V.40. -P. 141-149.
66. Das R, Vonderhaar BK. Involvement of SHC, GRB2, SOS and RAS in prolactin signal transduction in mammary epithelial cells // Oncogene. 1996. — V. 13.-P. 1139-1145.
67. Das R. and Vonderhaar B.K. Transduction of prolactin's (PRL) growth signal through both long and short forms of the PRL receptor II Mol Endocrinol. 1995.-V. 9.-P. 1750-1759.
68. DaSilva L, Howard OMZ, Rui H, Kirken RA, Farrar WL. Growth signaling and JAK2 association mediated by membrane-proximal cytoplasmic regions of prolactin receptors // J Biol Chem. 1994. - V. 269. - P. 1826718270.
69. Davis J.A. and Linzer DIH. Expression of multiple forms of the prolactin receptor in mouse liver // Mol Endocrinol. 1989. - V. 3. - P. 674-680.
70. De Vos A.M., Ultsch M., and Kossiakoff A.A. Human growth hormone and extracellular domain of its receptor: crystal structure of the complex // Science. 1992. -V. 255. - P. 306-312.
71. Decker T, Kovarik P. Serine phosphorylation of STATs // Oncogene. — 2000. V. 19. - P. 2628 -2637.
72. Driancourt M.A. Follicular dynamics in sheep and cattle // Theriogenology. 1991. - V. 35. - P. 55-79.
73. Echternkamp S.E., Spicer L.J., Gregory K.E. et al. Concentrations of insulin-like growth factor I in blood and ovarian follicular fluid of cattle selected for twins // Biol. Reprod. 1990. - V. 43. - P. 8-14.
74. Eppig J.J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals // Reproduction. 2001. - V.122. - P. 829-838.
75. Erwin R.A., Kirken R.A., Malabarba M.G., Farrar W.L. and Rui H. Prolactin activates Ras via signaling proteins SHC, growth factor receptor bound 2, and son of sevenless // Endocrinology. 1995. - V. 136. - P. 3512- 3518.
76. Ferrag F., Goffin V., Buteau H. and Kelly P.A. Immune function of prolactin (PRL) and signal transduction by PRL/GH/cytokine receptors: specificity, redundancy and lessons from chimaeras // Cytokines Cell Mol Ther. 1997.-Y. 3.-P. 197-213.
77. Ferrag F., Pezet A., Chiarenza A., Buteau H., Nelson B.H., Goffin Y. and Kelly P.A. Homodimerization of IL-2 receptor beta chain is necessary and sufficient to activate Jak2 and downstream signaling pathways // FEBS Lett. — 1998.-V. 421.-P. 32-36.
78. Finidory J. and Kelly P.A. Cytokine receptor signalling through two novel families of transducer molecules: Janus kinases and signal transducers and' activators of transcription // J Endocrinol. 1995. - V. 147. - P. 11-23.
79. Fortune J.E. Ovarian follicular growth and development in mammals // Biol. Reprod. 1994. - V. 50. - P. 225-232.
80. Frank SJ, Yi W, Zhao Y, Goldsmith JF, Gilliland G, Jiang J, Sakai I, Kraft AS. Regions of the JAK2 tyrosine kinase required for coupling-to the growth hormone receptor // J Biol Chem. 1995. - V. 270. - P. 14776-14785.
81. Freeman M.E. The neuroendocrine control of the ovarian cycle of the rat // The Physiology of Reproduction, edited by Knobil E and Neill JD. New York: Raven. 1994.-P. 613-658.
82. Freemark M., Driscoll P., Maaskant R., Petryk A. and Kelly P.A. Ontogenesis of prolactin receptors in the human fetus in early gestation // J.Clin.Invest. 1997.-V.99.-P. 1107-1117.
83. Fresno Vara J.A., Carretero M.V., Geronimo H., Ballmer-Hofer K. And Martin-Perez J. Stimulation of c-Src by prolactin is independent of Jak2 // Biochem.J. 2000. - V. 345. - P. 17-24.
84. Fresno Vara J.A., Caceres M.A.D., Silva A. and Martin-Perez J. Src family kinases are required for prolactin induction of cell proliferation // Molecular Biology of the Cell. -2001. -V. 12. P. 2171-2183.
85. Gao J, Horseman ND. Prolactin-independent modulation of the ß-casein response element by Erk2 MAP kinase // Cell Signal. 1999. -V. 11 - P. 205210.
86. Gisselbrecht S. The CIS/SOCS proteins: a family of cytokine-inducible regulators of signaling // Eur Cytokine Netw. 1999. - V. 10. - P.463-470.
87. Goffin V., Ferrag F. and Kelly P:A. Molecular aspects of prolactin and growth hormone receptors. In: //Advances in Molecular and Cellular Endocrinology, edited by LeRoith D. London: JAI. 1998. - P. 1-33.
88. Goffin V., Binart N., Touraine P., Kelly P.A. Prolactin: the new biology of an old hormone // Annu. Rev. Physiol. 2002. - V.64. - P. 47-67.
89. Goodman A.L., Descalzi C.D., Johnson D.K., Hodgen G.D. Composite pattern of circulating LH, FSH, estradiol and progesterone during the menstrual cycle in cynomolgus monkeys // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1977. — V. 155. — P. 479-481.
90. Gougeon A. Dynamics of human follicular growth. A morphologic perspective // The ovary / Ed. by Adashi E.Y., Leung P.C.K. New York: Raven Press. - 1993. - P. 21-39.
91. Gouilleux F., Wakao H., Mündt M. and Groner B. Prolactin induces phosphorylation of Tyr694 of Stat5 (MGF), a prerequisite for DNA binding and induction of transcription // The EMBO Journal. 1994. - V. 13. - N. 18. - P. 4361-4369. :
92. Grosdemouge I., Bachelot A., Lucas A., Baran N., Kelly P.A. and Binart N. Effects of deletion of the prolactin receptor on ovarian gene expression // Reproductive Biology and Endocrinology. 2003. - Vol.1. -N. 12. - P. 16.
93. Guraja S. Biology of ovarian follicles in mammals // Berlin — Heidelberg, Springer. Verlag. - 1985. - P.320.
94. Gutzman J.H., Rugowski D.E., Schroeder M.D., Waiters J.J. and Schuler L.A. Multiple kinase cascades mediate prolactin signals to activating Protein-1 in breast cancer cells // Mol.Endocrinol. 2004. - V. 18. - N. 12. - P. 30643075.
95. Hajnal A. and Berset T. The C.elegans MAPK phosphatase LIP-1 is required for G2/M meiotic arrest of developing oocytes // The EMBO Jornal. — 2002. Vol.21.-N 16.-P. 4317-4326
96. Helman D, Sandowski Y, Cohen Y, Matsumoto A, Yoshimura A, Merchav S, Gertler A. Cytokineinducible SH2 protein (CIS3) and JAK2 binding protein (JAB) abolish prolactin receptor-mediated STAT5 signaling. // FEBS Lett. 1998,-V. 441. - P. 287-291.
97. Henderson K., McNeilly A., Swanston I. Gonadotrophin and steroid concentration in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size // J.Reprod.Fertil. 1982. - V.65, N 2. - P. 467-473.
98. Hinrichs K. Manipulation of oocyte maturation in vitro // Arch. Anim. Breed. 1996. - V.39, Special issue. - P.43-50.
99. Hirshfield A.N. Development of follicles in the mammalian ovary // Internal;. Rev. Cytol. 1991. -V. 124. -P.43-101.
100. Hu Z.Z., Zhuang L., Meng J. and Dufau M.L. Transcriptional regulation of the generic promoter III of the rat prolactin receptor gene by C/EBPbeta and Spl // J Biol Chem. 1998. - V. 273. - P. 26225-26235.
101. Hu Z, Meng J, Dufau ML. Isolation and characterization of two novel forms of the human prolactin receptor generated by alternative splicing of a newly identified exon 11 // J Biol Chem. 2001. - V. 276. - P. 41086 -41094.
102. Hunter M.G. Oocyte maturation and ovum quality in pigs // Reviews of Reproduction. 2000. - V. 5. - P. 122-130:
103. Ihle J.M., Witthuhn B.A., Quelle F.W., Yamamoto K., Theirfelder W.E., Kreider B. and Silvennoinen O. Signalling by the cytokine receptor superfamily: Jaks and Stats // Trends Biochem Sci. 1994. - V. 19. - P. 222-227.
104. Kanitz W., Torner H., Aim H., Kuzmina T., Becker F. Aspects of in vitro production of cattle embryons // J.Physiology and Pharm. 1996. - V.47. — N2. -suppl. 2. - P. 55-70.
105. Karabulut A.K. and Pratten M.K. Species-specificity of growth-promoting effects of prolactin during rat embryogenesis // J.Anat. 1998. -V.192. - P.l-12.
106. Kazansky AV, Kabotyanski EB, Wsyzomierski SL, Mancini MA, Rosen JM. Differential effects of prolactin and src/abl kinases on the nuclear translocation of STAT5B and STAT5A // J Biol Chem. 1999. - V. 274. - P. 22484-22492.
107. Keefer C.L., Stice S.L., Maki-Laurila M. Bovine embryo development in vitro: effect of in vitro maturation conditions on fertilization and blastocyst development // Theriogenology. 1991. - V. 3 5. - N 1. - P. 223.
108. Kelly P.A., Djiane J., Postel-Vinay M-C, and Edery M. The prolactin/ growth hormone receptor family //Endocr Rev. 1991. -V. 12. - P. 235-251.
109. Kline JB, Roehrs H, Clevenger CV. Functional characterization of the intermediate isoform of the human prolactin receptor // J Biol Chem. 1999. — V. 274.-P. 35461-35468.
110. Kline JB, Rycyzyn MA, Clevenger CV. Characterization of a novel and functional human prolactin receptor isoform (ASlPRLr) containing only one fibronectin-like domain // Mol Endocrinol. 2002. - V. 16. - P. 2310 -2322.
111. Kline JB, Clevenger CV. Identification and characterization of the prolactin-binding protein (PRLBP) in human serum and milk //J Biol Chem. -2001. V. 276. - P. 24760 -24766.
112. Kohno M. and Pouyssegur J. Pharmacological inhibitors of the ERK signaling pathway: application as anticancer drugs // Prog. Cell Cycle Res. -2003.-V. 5.-P. 219-224.
113. Krasnow J.S., Hickey G.L., Richards J.S. Regulation of aromatase messenger RNA and estradiol biosynthesis in rat ovarian granulosa and luteal cells by prolactin // Mol. Endocrinol. 1990. - V.4. - P. 13-21.
114. Kubelka M., Rimkevicova Z., Guerrier P., Motlik J. Inhibition of protein synthesis affects histone HI kinase, but not chromosome condensation activity, during the first meiotic division of pig oocutes // Mol. Reprod. Dev. 1995. - N 41.-P. 63-69.
115. Kuranaga E., Kanuka H., Bannai M., Suzuki M., Nishihara M. and
116. Takahashi M. Fas/Fas ligand system in prolactin-induced apoptosis in rat corpus luteum: possible role of luteal immune cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. -V. 260. - P. 167-173.
117. Kuzmina T.I., Denisenko V. Yu. Dynamics of Ca oscillation during the maturation of bovine oocytes and the development of embryos in vitro // J. Physiology and Pharm. 1996. - v.47. -N 2. - suppl.2. - P. 155.
118. Kuzmina T.I., Lebedeva I. Yu., Torner H. et al. Effects of prolactin on intracellular stored calcium in the course of bovine oocyte maturation in vitro // Theriogenology. — 1999. — V. 51.-P. 1363-1374.
119. Lebrun J-J., Ali S., Ullrich A. and Kelly P.A. Proline-rich sequencemediated JAK2 association to the prolactin receptor is required but not sufficient for signal transduction // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 1066410670.
120. Lerant A. and Freeman M.E. Ovarian steroids differentially regulate the expression of PRL-R in neuroendocrine dopaminergic neuron populations: a double label confocal microscopic study // Brain Res. 1998. - V. 802. - P. 141-154.
121. Lesueur L., Edery M., Ali S., Paly J., Kelly P.A. and Djiane J. Comparison of long and short forms of the prolactin receptor on prolactin-induced milk protein gene transcription // Proc Natl Acad Sci USA. 1991. - V. 88.-P. 824-828.
122. Lindner Ch., Lichtenberg V., Westhof G. et al. Endocrine parameters of human follicular fluid and fertilization capacity of oocytes // Hormone and Metab. Res. 1988. - V.20 - N 4. - P. 243-246.
123. Llovera M, Pichard C, Bernichtein S, Jeay S, Touraine P, Kelly PA, Goffin V. Human prolactin (hPRL) antagonists inhibit hPRL-activated signaling pathways involved in breast cancer cell proliferation // Oncogene. 2000. - V. 19.-P. 4695-4705.
124. Lobie PE, Mertani H, Morel G, Marales-Bustos O, Norstedt G, Waters MJ. Receptor-mediated nuclear translocation of growth hormone // J Biol Chem.- 1994. V. 269. - P. 21330 -21339.
125. Lu J-C, Scott P, Strous GJ, Schuler LA. Multiple internalization motifs differentially used by prolactin receptor isoforms mediate similar endocytic pathways // Mol Endocrinol. 2002. - V. 16. - P. 2515-2527.
126. Lussier J.G., Matton P., Dufour J.J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow // J. Reprod. Fertil. 1987. - V. 81. - P. 301-307.
127. Mayers M.A. and Sirard M-A. Effect of Type 3 and Type 4 Phosphodiesterase inhibitors on the maintenance of bovine oocytes in meiotic arrest// Biology of reproduction. 2002. - V.66. - P. 180-184.
128. McNatty K.P., Gibb M., Dobson C. et al. Changes in the concentration of gonadotrophic and steroidal hormones in the antral fluid of ovarian follicles throughout the oestrous cycle of the sheep // Austral.J.Biol.Sci. 1981. - V.34, N l.-P. 67-80.
129. Meng L, Lin L, Zhang H, Nassiri M, Morales AR, Nadji M. Multiple mutations of the p53 gene in human mammary carcinoma // Mutat Res DNA Repair. 1999. -V. 435. - P. 263-269.
130. Mihm M., Diskin M.G., Roche J.F. Regulation of follicle wave growth in cattle // Reprod. Dom. Anim. 1996. - V. 31. - P. 531-538.
131. Monniaux D., Huet C., Besnard N. et al. Follicular growth and ovarian dynamics in mammals // J. Reprod. Fertil. 1997. - V. 51. - P. 3-23.
132. Motlik J., Sutovsky P., Kalous J., Kubelka M., Moos J., Schultz RM. Co-culture with pig membrana granulosa cells modulates the activity of cdc2 and MAP kinase in maturing cattle oocytes // Zygote. 1996. — N.5. — P. 1-12.
133. Munabi A., Copelman M., Merig M. The effects of prolactin on rat ovarian function// Steroids. 1984. - V.43,N 6. - P. 631-637.
134. Nagano M. and Kelly P.A. Tissue distribution and regulation of rat prolactin receptor gene expression. Quantitative analysis by polymerase chain reaction // TBiol Chem. 1994. - V. 269. - P. 13337-13345.
135. Nagano M. and Kelly P.A. Absence of a putative ATP/GTP binding site in the rat prolactin receptor // Biochem Biophys Res Commun. 1992. — V. 183. -P. 610-618.
136. Nebreda A.R. and Ferby I. Regulation of the meiotic cell cycle in oocytes // Curr. Opin. Cell. Biol. 2000. - V. 12. - P. 666-675.
137. Nevalainen M.T., Valve E.M., Ingleton P.M., Nurmi M., Martikainen P.M. and Harkonen P.L. Prolactin and prolactin receptors are expressed and functiong in human prostate // J. Clin. Invest. 1997. - V. 99. - P. 618-627.
138. Nilsson J., Bjursell G. and Kannius-Janson M. Nuclear Jak2 and transcription factor NF1-C2: a novel mechanism of prolactin signaling inmammary epithelial cells // Molecular and Cellular Biology. 2006. - V. 26. — N. 15.-P. 5663-5674.
139. Nishimoto S. and Nishida E. MAPK signalling: ERK5 versus ERK1/2 // EMBO reports. 2006. - Vol.7. - N. 8. - P. 782-786.
140. Ochsner S.A., Day A.J., Rugg M.S., Breyer R.M., Gomer R.H., Richards J.S. Disrupted function of tumor necrosis factor-alpha-stimulated gene 6 blocks cumulus cell-oocyte complex expansion // Endocrinology. 2003. - V.144. —1. P.4376-4384.t
141. Owerbach D., Rutter W.J., Cooke N.E., Martial J.A. The prolactin gene is located on chromosome 6 in humans // Science. — 1981. V. 212. - P. 815-816.
142. Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., Leibfried-Rutledge E.S. et al. Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen // Theriogenology. 1986. - V.25. -P.591.
143. Pavlok A., Lucas-Hahn A., Niemann H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antralfollicles // Mol. Reprod. Dev. 1992. - V. 31. - P. 63-67.
144. Pearson G, Robinson F, Beers GT, Xu BE, Karandikar M, Berman K, Cobb MH. Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: regulation and physiological functions // Endocr Rev. 2001. - V. 22. - P. 153-183.
145. Perks C.M., Newcomb P.V., Grohmann M., Wright R.J., Mason H.D. and Holly J.M. Prolactin acts as a potent survival factor against C2-ceramideinduced apoptosis in human granulosa cells // Human Reproduction. 2003. -V.18. -N.12. - P. 2672-2677.
146. Pezet A, Favre H, Kelly PA, Edery M. Inhibition and restoration of prolactin signal transduction by suppressors of cytokine signaling // J Biol Chem. 1999. - V. 274. - P. 24497-24502.
147. Pezet A, Buteau H, Kelly PA, Edery M. The last proline of box 1 is essential for association with JAK2 and functional activation of the prolactin receptor // Mol Cell Endocrinol. 1997. - V. 129. - P. 199 -208.
148. Pezet A, Ferrag F, Kelly PA, Edery M. Tyrosine docking sites of the rat prolactin receptor required for association and activation Stat5 // J Biol Chem. — 1997. V. 272. - P. 25043-25050.
149. Picazo R.A., Garcia Ruiz J.P., Santiago Moreno J., Gonzalez de Bulnes
150. A., Muñoz J., Silván G., Lorenzo P.L. and Illira J.C. Cellular localization and changes in expression of prolactin receptor isoforms in sheep ovary throughout the estrous cycle // Reproduction. 2004. -N. 128. - P. 545-553.
151. Piccoletti R., Maroni P., Bendinelli P. and Bernelli-Zazzera A. Rapid stimulation of mitogen-activated protein kinase of rat liver by prolactin // Biochem J. 1994. - V. 303. - P. 429-433.
152. Postel-Vinay M-C, Belair L., Kayser C., Kelly P.A. and Djiane J. Identification of prolactin and growth hormone binding proteins in rabbit milk // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. - P. 6687-6690.
153. Prevarskaya N.B., Skryma R.N., Vacher P., Daniel N., Djiane J. and Dufy
154. B. Role of tyrosine phosphorylation in potassium channel activation. Functional association with prolactin receptor and JAK2 tyrosine kinase // J Biol Chem. — 1995. V. 270. - P. 24292-24299.
155. Rane SG, Reddy EP. Janus kinases: components of multiple signaling pathways // Oncogene. 2000. - 19. - P. 5662-5679.
156. Rao Y-P, Buckley DJ, Olson MD, Buckley AR. Nuclear translocation of prolactin: Collaboration of tyrosine kinase and protein kinase C activation in rat Nb2 node lymphoma cells // J Cell Physiol. 1995. - V. 163. - P. 266 -276.
157. Ratovondrahona D., Fournier B., Odessa M.F. and Dufy B. Prolactin stimulation of phosphoinositide metabolism in CHO cells stably expressing the PRL receptor // Biochem Biophys Res Commun. 1998. - V. 243. - P. 127130.
158. Richard F.J., Sirard M.A. Effect of follicular cells on maturation. I. Effects of follicular hemisections on bovine oocyte maturation in vitro II Biol. Reprod.- 1996.-V. 54.-P. 16-21.
159. Rillema J.A., Campbell G.S., Lawson D.M. and Carter-Su C. Evidence for a rapid stimulation of tyrosine kinase activity by prolactin in Nb2 rat lymphoma cells. //Endocrinology. 1992. -V. 131. - P. 973-975.
160. Roovers K, Assoian RK. Integrating the MAP kinase signal into the G1 phase cell cycle machinery // Bioessays. 2000. - V. 22. - P. 818-826.
161. Rouillier P., Matton P., Guilbault L. et al. Influence of a dominant follicle on atresia and estradiol release by ovarian follicles during superovulation in cattle // Theriogenology. 1990. - V. 33. - P. 313.
162. Roux P.P. and Blenis J. ERK and p38 MAPK-activated protein kinasesA a family of protein kinases with diverse biologycal functions // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2004. - Vol. 68. - N.2. - P. 320-344.
163. Roymans D, Siegers H. Phosphatidylinositol 3-kinases in tumor progression. // Eur J Biochem. 2001. - V. 268. - P. 487-498.
164. Rui H, Lebrun J-J, Kirken RA, Kelly PA, Farrar WL. JAK2 activation and cell proliferation induced by antibody-mediated prolactin receptor dimerization // Endocrinology. 1994. - V. 135. - P. 1299 -1306.
165. Rycyzyn MA, Clevenger CV. The intranuclear prolactin/cyclophilin B complex as a transcriptional inducer. // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. - V. 99.-P. 6790 -6795.
166. Rycyzyn MA, Reilly SC, O'Malley K, Clevenger CV. Role of cyclophilin B in PRL signal transduction and nuclear retrotrans-location. // Mol Endocrinol 2000.-V. 14.-P. 1175-1186.
167. Schroeder M.D., Symowicz J., Schuler L.A. Prolactin modulates cell cycle regulators in mammary tumor epithelial cells // Mol.Endocrinol. — 2002. — N.16.-P. 45-57.
168. Schroeder M.D., Brockman J.L., Walker A.M., Schuler L.A.Inhibition of PRL-induced proliferative signals in breast cancer cells by a molecular mimic of phosphorylated PRL, S179D-PRL // Endocrynology. 2003. - N 144. - P. 5300-5307.
169. Schwertfeger KL, Hunter S, Heasley LE, Levresse V, Leon RP, DeGregori J, Anderson SM. Prolactin stimulates activation of c-jun N-terminal kinase (JNK). // Mol Endocrinol. 2000. - V. 14. - P. 1592- 1602.
170. Sinha Y.N. Structural variants of prolactin: occurrence and physiological significance // Endocr. Rev. 1995. - V. 16. - P. 354-369.
171. Sirard M.A., First N.L. In vitro inhibition of oocyte nuclear maturation in the bovine // Biol. Reprod. 1988. - V.39. - P. 229-234.
172. Sirard M.A., Florman H.M., Leibfried-Rutledge M.L., Barnes F.L., Sims L., First N.L. Timing of nuclear progression and protein synthesis necessary for meiotic maturation of bovine oocytes // Biol. Reprod. 1989. -N 40. - P. 12571263.
173. Soares M.J. The prolactin and growth hormone families: Pregnancy-specific hormones/cytokines at the maternal-fetal interface // Reproduction Biology and Endocrinology. -2004. -V. 2:51. -P.15.
174. Sorensen P. and Sheffield L.G. Involvement of c-src in beta-casein expression by mammary epithelial cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1997.-V. 241.-P. 710-713.
175. Stoecklin E., Wissler M., Moriggl R. and Groner B. Specific DNA binding of Stat5, but not of glucocorticoid receptor, is required for their functional cooperation in the regulation of gene transcription //Mol Cell Biol, — 1997.-V. 17.-P. 6708-6716.
176. Subramanian M.G., Sacco A.G., Moghissi K.S. et al. Human follicular fluid. Prolactin is biologically active and ovum fertilization correlates with estradiol concentration // J.Vitro Fertil. 1988. - V. 5, N 3. - P. 129-133.
177. Sunderland S.J., Crowe M.A., Boland M.P. et al. Selection, dominance and atresia of follicles during the oestrous cycle of heifers // J. Reprod. Fertil. -1994.-V. 101.-P. 547-555.
178. Toker A. Protein kinases as mediators of phosphoinositide 3-kinase signaling // Mol Pharmacol. 2000. - V. 57. - P. 652-658.
179. Tomic S., Chughtai N., Ali S. SOCS-1,-2,-3: selective targets and functions downstream of the prolactin receptor // Mol Cell Endocrinol. — 1999. — V. 158.-P. 45-54.
180. Torner H., Aim H., Kuzmina T., Lohrke B., Viergutz T. Effect of bovine prolactin on in vitro maturation of bovine cumulus oocyte complexes // 13th Int Cong. Anim. Reprod. Sydney, Australia. 1996. - V. 2. - P. 10.
181. Truong A.T., Duez C., Belayew A., Renard A., Pictet R., Bell G.I. and Martial J. A. Isolation and characterization of the human prolactin gene // EMBO J. 1984. -V. 3. - P. 429-437.
182. Turzillo A.M., Fortune J.E. Suppression of the secondary FSH surge with bovine follicular fluid is associated with delayed ovarian follicular development in heifers // J. Reprod. Fertil. 1990. - V. 89. - P. 643-653.
183. Vantaggiato C., Formentini I., Bondanza A., Bonini C., Naldini L. And Brambilla R. ERK1 and ERK2 mitogen-activated protein kinases affect Ras-dependent cell signaling differentially // Journal of Biology. 2006. - Vol. 5. -N.14.
184. Veldhuis J.D., Klase P.A., Hammond J.M. Divergent effects, of prolactin upon steroidogenesis by porcine granulose cells in vitro: influence of cytodifferentiation // Endocrinology. 1980. - V. 107. - N. 1. - P. 42-46.
185. Vincent V, Goffin V, Rozakis-Adcock M, Mornon JP, Kelly PA. Identification of cytoplasmic motifs required for short prolactin receptor internalization // J Biol Chem. 1997. - V. 272. - P. 7062-7068.
186. Wallis M. Mechanism of action of prolactin // Hormones and their actions. Pt.2.-Amsterdam etc.: Elsevier. - 1988. - P. 295-319.
187. Wang C., Hsueh A.J.W., Erickson G.F. Induction of functional prolactin receptors by follicle-stimulating hormone in rat granulosa cells in vivo and in vitro//J. Biol. Chem. 1979.-V. 254.-P. 11330-11336.
188. Wood A.W. and Van Der Kraak G.J. Apoptosis and ovarian function: novel perspectives from the teleosts // Biology of Reproduction. 2001. - N.64. -P. 264-271.
189. Yan L., Carr J., Ashby P.R., Murry-Tait V., Thompson- C. and Arthur JSC. Knockout of ERK5 causes multiple defects in placental and embrionic development // BMC Developmental Biology. 2003. - Vol.3. -N. 11. - P.21.
190. Yasukawa H, Sasaki A, Yoshimura A. Negative regulation of cytokine signaling pathways // Annu Rev Immunol. 2000. - V. 18. - P. 143-164.
191. Yu-Lee LY, Luo GY, Book ML, Morris SM. Lactogenic hormone signal transduction // Biol Reprod. 1998. - V. 58. - P. 295-301.
192. Zeleznik A.J. Dynamics of'primate follicular growth. A physiologic perspective // The Ovary / Ed. by Adashi E.Y., Leung P.C.K. New York: Raven Press. - 1993. - P. 41-55.
193. Zeleznik A.J., Kubik C.J. Ovarian responses in macaques to pulsatile infusion of follicle-stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone: increased sensitivity of the maturing follicle to FSH // Endocrinology. — 1986. — V. 119.-P. 2025-2032.
-
Скотти, Ольга Сергеевна
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург-Пушкин, 2008
-
ВАК 03.00.15
- РЕАЛИЗАЦИЯ ДЕЙСТВИЯ ПРОЛАКТИНА НА МЕЙОЗ ООЦИТОВ КОРОВ
- Механизмы внутриклеточной сигнализации при реинициации мейоза в ооцитах сельскохозяйственных животных
- Мейотические преобразования хромосом при культивировании ооцитов коров с клетками гранулезы
- Молекулярные и цитологические аспекты участия пролактина в регуляции созревания ооцитов коров
- Влияние пролактина на фолликулогенез и мейоз ооцитов коров
