Молекулярные и цитологические аспекты участия пролактина в регуляции созревания ооцитов коров

Мормышев, Александр Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные и цитологические аспекты участия пролактина в регуляции созревания ооцитов коров
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные и цитологические аспекты участия пролактина в регуляции созревания ооцитов коров"

На правой рукописи

МОРМЫШЕВ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ

□□3488134

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ УЧАСТИЯ ПРОЛАКТИНА В РЕГУЛЯЦИИ СОЗРЕВАНИЯ ООЦИТОВ КОРОВ

Специальности: 03.00.23 - БИОТЕХНОЛОГИЯ, 03.00.13 - ФИЗИОЛОГИЯ

1 О ДЕК 2009

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы - 2009

003488134

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства РАСХН».

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Защита диссертации состоится «2И » декабря 2009 года, в 10.00 часов, на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д006.013.01 при Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства РАСХН».

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровицы, ГНУ ВНИИЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИЖ.

Автореферат разослан ««б^» ноября 2009 г.

Зиновьева Наталия Анатольевна; кандидат биологических наук Лебедева Ирина Юрьевна.

Калашникова Любовь Александровна; доктор биологических наук, профессор Фомичев Юрий Павлович.

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Российская академия менеджмента в

животноводстве».

В.П. Губанова

1. Общая харастеристика работы

Актуальность темы. Методы экстракорпорального созревания и оплодотворения ооцитов сельскохозяйственных животных широко используются в биотехнологии для целей клеточной инженерии, а также получения эмбрионов, пригодных для трансплантации. Разработанные к настоящему времени технологии культивирования и оплодотворения in vitro ооцитов коров позволяют получить достаточно высокий выход морул и бластоцист (до 30-45 %), однако многие проблемы, связанные с их жизнеспособностью остаются нерешенными (Капе, 2003). Основными лимитирующими факторами при получении эмбрионов являются качество исходной популяции ооцитов и их способность к дальнейшему развитию, приобретенная в процессе экстракорпорального созревания. Последний фактор в высокой степени зависит от состава системы культивирования ооцитов и поэтому является объектом направленного воздействия (Nagai, 2001; Sirard, 2001). Развитие новых технологий, таких как клонирование и получение эмбриональных стволовых клеток, которые основаны на использовании созревших in vitro ооцитов, повышает значимость исследований, ориентированных на дальнейшую модернизацию систем созревания. Это свидетельствует о необходимости целенаправленного поиска физиологически уместных биологически активных веществ, способных специфически воздействовать на ооцит и повышать его компетенцию к дальнейшему развитию. Одним из таких потенциальных стимуляторов является гипофизарный гормон про-лактин (ПРЛ), играющий исключительно важную роль в регуляции репродукции млекопитающих, что подтверждается данными о бесплодии самок мышей с инак-тивированным геном для рецептора ПРЛ (Bole-Feysot et al., 1998). Показано также, что в некоторых системах культивирования ооцит-кумулюсных комплексов коров ПРЛ может оказывать стимулирующее влияние на потенцию яйцеклеток к дальнейшему развитию (Кузьмина и др., 2001). Это указывает на возможность практического использования данного гормона с целью совершенствования технологии получения эмбрионов крупного рогатого скота. Однако успешное применение ПРЛ в биотехнологической практике невозможно без глубокого понимания механизмов его участия в регуляции формирования зрелых яйцеклеток. Это обусловливает необходимость детального изучения процессов, связанных с реализацией гормонального влияния на ооциты и кумулюсные клетки.

Как известно, гонадотропные гормоны - фолликулостимулирующий и лю-теинизирующий - играют ключевую роль в контроле овариальной функции млекопитающих. Также установлено, что основным вторичным посредником в механизмах передачи сигналов гонадотропных гормонов в фолликулярные клетки является циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), который выполняет центральную роль в регуляции мейоза ооцитов (Mattioli, 1994; Conti et al., 2002). Одна из функций ПРЛ заключается в модуляции регуляторного действия гонадотропных гормонов на функциональную активность фолликулярных клеток, однако механизм этого модулирующего влияния до сих пор не ясен (Krasnow et al., 1990). В связи этим исследование взаимодействия сигнальных путей, активируемых гонадотропными гормонами, в первую очередь, цАМФ-зависимого пути, и пролактином в ооцит-кумулюсных комплексах, имеет актуальное значение для понимания фундаментальных механизмов, лежащих в основе регуляции овариальной функции, в том числе созревания ооцитов.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы - идентифицировать молекулярные и клеточные пути влияния ПРЛ на созревание ооцит-кумулюсных

комплексов коров и на этой основе модернизировать систему культивирования ооцитов для получения in vitro эмбрионов крупного рогатого скота.

В соответствии с вышеуказанной целью были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ экспрессии мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ в ооцитах и окружающих их клетках кумулюса.

2. Изучить влияние ПРЛ на цАМФ-зависимый механизм регуляции мейоза в ооцитах.

3. Исследовать участие клеток кумулюса в реализации эффектов ПРЛ на ядерное созревание ооцитов.

4. Охарактеризовать роль протеинкиназы С в проведении сигналов ПРЛ в ооциты.

5. Сравнить индивидуальное и совместное действие ПРЛ и цАМФ-повышающих реагентов на морфофункциональное состояние клеток кумулюса.

6. Изучить влияние ПРЛ в присутствии гонадотропных гормонов на созревание окруженных клетками кумулюса и денудированных ооцитов, их оплодотво-ряемость и способность к развитию до стадии бластоцисты.

Научная новизна. При выполнении диссертационной работы впервые выявлена экспрессия мРНК длинной и короткой формы рецептора ПРЛ в ооцитах и клетках кумулюса коров и показано функционирование как прямого, так и опосредованного кумулюсом пути проведения сигнала ПРЛ в ооциты. Впервые детально исследовано взаимодействие сигнальных каскадов, активируемых цАМФ и пролак-тином в ооцитах и клетках кумулюса коров, и обнаружено различие участков сопряжения этих каскадов в половых и соматических клетках фолликулов. Выполненная работа является первым исследованием, в котором получены данные о зависимости характера влияния ПРЛ на мейоз от уровня цАМФ в ооцитах.

Праю-ическая значимость работы. Модернизирована система созревания in vitro ооцит-кумулюсных комплексов из фолликулов диаметром 2-8 мм посредством одновременного введения в среду гонадотропных гормонов и ПРЛ (50 нг/мл), обусловливающая повышение качества цитоплазматического созревания ооцитов и эффективности получения эмбрионов крупного рогатого скота. Основные положения, выносимые на защиту.

• У коров функционируют два разных пути проведения сигнала ПРЛ в ооциты: прямой и опосредованный клетками кумулюса.

• Характер влияния ПРЛ на ядерное созревание ооцитов зависит от внутриклеточного уровня цАМФ.

• ПРЛ оказывает модулирующее действие на цАМФ-зависимый механизм регуляции мейоза в ооцитах коров.

• Модификация среды культивирования ооцит-кумулюсных комплексов, содержащей гонадотропные гормоны, введением ПРЛ (50 нг/мл) позволяет оптимизировать условия созревания ооцитов коров и повысить последующий выход эмбрионов на стадии бластоцисты.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных научных конференциях: «Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных», Дубровицы, 2007; «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии», Дубровицы, 2008; «Новые аспекты биотехнологии репродукции животных», Санкт-Петербург, 2008; на конферен-

циях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖа, 2007,2008.

Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них 2 - в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 131 страницах, содержит 10 таблиц и 17 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений. Список литературы включает 258 источников, в том числе 232 на иностранном языке.

2. Материалы и методы исследований

Работу выполняли в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВНИИЖ Россельхозакадемии. Исследования проводили согласно схеме, представленной на рисунке 1.

Рис. 1. Общая схема исследований.

Объектом исследований служили ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) и клетки гранулезы (КГ) из антральных фолликулов, а также желтое тело яичников коров и половозрелых телок. Яичники без видимых признаков патологии доставляли в лабораторию в термосе при температуре 30-35 °С в течение 1,5-2 ч после ова-риэктомии животных на мясокомбинате. Все манипуляции с клетками и тканями проводили в асептических условиях при использовании стерильных растворов.

КГ выделяли аспирацией содержимого морфологически нормальных фолликулов диаметром 2-5 мм и центрифугировали при 300 g в течение 10 мин. Клеточный осадок 2 раза отмывали путем центрифугирования в фосфатном буферном растворе (ФБР) при 300 £ в течение 10 мин. Доля живых клеток в использованной

суспензии составляла не менее 70 % (окрашивание 0,1 %-ным раствором трипано-вого синего). ОКК выделяли путем аспирации или рассечения стенки фолликулов диаметром 2-8 мм и промывали 3 раза в среде ТС-199, содержащей 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 10 мкг/мл гепарина, 0,2 мМ пирувата натрия и 50 мкг/мл гентамицина В промывочную среду для ОКК, предназначенных для последующего оплодотворения, добавляли изобутилметилксантин до конечной концентрации 0,5 мМ. Для экспериментов отбирали ооциты округлой формы, с гомогенной цитоплазмой, равномерной по ширине зоной пеллюцида, окруженные многослойным компактным кумулюсом. Диссоциацию клеток кумулюса (КК) проводили путем обработки ОКК коллагеназой II (2 мг/мл) в течение 25 мин при 37 °С. Ооциты, предназначенные для ОТ-ПЦР, промывали 3 раза в ФБР. КК отмывали 2 раза путем центрифугирования в ФБР при 300 g в течение 10 мин. Конечную концентрацию КК подсчитывали в камере Горяева. Ооциты, клетки кумулюса и грану-лезы хранили в растворе EverFresh, стабилизирующем РНК, при -20°С. Все манипуляции с желтым телом проводили на льду. Для исследований использовали яичники с развитым желтым телом, которое нарезали на мелкие кусочки, промывали 3 раза в холодном (4°С) ФБР, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С.

Анализ экспрессии мРНК выполняли методом обратной транскрипции, совмещенной с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Синтез комплементарной ДНК (кДНК) осуществляли на матрице тотальной РНК (тотРНК). Для получения тотРНК использовали (1-2)х106 КГ или КК, 70-100 ооцитов или 25-50 мг ткани желтого тела. Выделение РНК осуществляли с применением реактива TRI Reagent (Sigma) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Образцы тотРНК хранили в 75 %-ном этаноле при -70°С. Процедуру синтеза первой цепи кДНК выполняли с помощью набора RevertAid Н Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) согласно инструкции фирмы-производителя при использовании случайных 6-мерных праймеров (0,2 мкг на пробу). ПЦР проводили в инкубационной смеси объемом 15 мкл, содержащей однократный буфер для Taq-полимерэзы, 200 мкМ dNTP, 1 ед.акт. Taq-полимеразы, 1,5 мМ MgCI2 и 2 мкл смеси реакции ОТ или воды (отрицательный контроль). В пробы добавляли по 5 пМ прямого и обратного праймеров для амплификации кДНК длинной и короткой изоформы рецептора ПРЛ (табл. 1) или ß-актина быка (Degen et al., 1983). Амплификацию кДНК рецептора ПРЛ проводили в следующем режиме: 95 °С 30 с, 54 °С 30 с, 72 °С 90 с, 40 циклов. Для ß-актина были использованы следующие условия амплификации: 95 °С 30 с, 60 °С 30 с, 72 "С 90 с, 40 циклов. В случае ооцитов был применен метод ПЦР с внутренними праймерами (nested PCR). Первый раунд ПЦР проводили в соответствии с вышеописанной методикой. Во втором раунде ПЦР в реакционную смесь вносили I мкл амплификата, полученного в ходе первого раунда для длинной или короткой изоформы рецептора ПРЛ (вместо продуктов реакции ОТ), и по 9 пМ прямого и обратного праймеров (табл. 1). Амплификацию проводили в течение 30 циклов в вышеуказанном режиме. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 2 %-ном агарозном геле.

Культивирование ОКК и денудированных ооцитов (ДО) проводили при температуре 38,5°С в атмосфере с 5% С02 и 90%-ной влажностью. Время инкубации составляло 6 ч (ОКК), 8 ч (ДО) или 24 ч (ОКК и ДО). В качестве контроля использовали среду ТС-199, содержащую 10 % ФБС, 0.55 мг/мл лактата кальция, 0.23 мг/мл пирувата натрия и 50 мкг/мл гентамицина. В опытных группах в среду вносили дибутирил цАМФ (дбцАМФ: 0,5; 1 или 2 мМ), форсколин (ФК: 5, 10 или 20

мкМ), бычий ПРЛ (50 нг/мл; 20 МЕ/мг), калпостин С (КП; 100 нМ) или одновременно дбцАМФ, ФК, ПРЛ и КП в различных сочетаниях. В серии экспериментов по оплодотворению ооцитов ОКК и ДО культивировали в среде DMEM, содержащей 15 ME/мл препарата Suigonan Vet (10 ME/мл сывороточного гонадотропина жеребых кобыл и 5 ME/мл человеческого XT), 1 мг/мл глюкозы, 1 мМ пирувата натрия, 4 мМ глутамина, 5 % эстральной сыворотки коров и 50 мкг/мл гентамицина. Среда в опытных группах содержала дополнительно 50 нг/мл ПРЛ. В конце 24-часового периода культивирования ОКК оценивали морфологически на основании известных критериев степени экспансии кумулюса (CaJder et al., 2001). После оценки ОКК клетки кумулюса фиксировали смесью метанола и уксусной кислоты (3:1) и окрашивали азуром-эозином. Наличие деструктивных изменений в клетках оценивали на основании морфологических критериев, разработанных ранее для клеток гранулезы, подвергающихся апоптозу (Jolly et al., 1997). Кроме того, были идентифицированы кумулюсные клетки с морфологическими признаками, характерными для митоза. На каждом препарате было оценено не менее 1000 клеток. Оплодотворение ооцитов и культивирование эмбрионов проводили по методу Парриша (Раг-rish et al., 1986). Через 48 ч после осеменения определяли долю раздробившихся яйцеклеток. Для мониторинга за развитием эмбрионов на 5-й и 8-й день после осеменения оценивали, соответственно, выход морул и бластоцист. Для цитогенетиче-ского исследования ядерного материала ооцитов, зигот и эмбрионов готовили сухо-воздушные препараты по методу Тарковского (Tarkowski, 1966). Состояние хроматина в ооцитах оценивали в соответствии с критериями, описанными ранее (Эрнст и др., 1979, 1980). На цитогенетических препаратах эмбрионов подсчитывали число ядер для подтверждения стадии их развития.

Эксперименты по культивированию ОКК и ДО, а также их оплодотворению были выполнены в 4-5 независимых повторностях. Данные обрабатывали методом X2 или двухфакторным дисперсионным анализом при помощи программы SigmaStat. Достоверность различия сравниваемых значений оценивали с использованием критерия х2 или Тьюки, при этом был принят уровень значимости Р < 0,05.

3. Результаты собственных исследований

Во всех экспериментах по культивированию ОКК и ДО коров был использован бычий ПРЛ в концентрации 50 нг/мл, в которой он стимулировал завершение ядерного созревания ооцитов in vitro и их способность к дальнейшему развитию (Кузьмина и др., 2001).

3.1. Анализ экспрессии мРНК длинной и короткой изоформы рецептора пролактина в ооцитах и клетках кумулюса коров. Для выявления возможных путей проведения сигнала ПРЛ в ооциты коров была проанализирована экспрессия мРНК двух альтернативных изоформ гормонального рецептора в ооцитах и окружающих их клетках кумулюса. Длинная изоформа рецептора ПРЛ ответственна за проведение его сигнала в клетки-мишени (Jabbour, Kelly, 1997). С короткой изо-формой рецептора ПРЛ связывают негативную регуляцию активности длинной изоформы, а также тканеспецифические сигналы (Смирнова, Богорад, 2004). Анализ экспрессии мРНК длинной и короткой изоформы рецептора ПРЛ в овариаль-ных клетках коров был выполнен методом ОТ-ПЦР при использовании соответствующих праймеров (табл. 1). В случае клеток кумулюса в качестве положительного контроля были взяты клетки гранулезы, содержащие рецепторы ПРЛ (Лебедева и др., 2001). а также желтое тело, в котором показана экспрессия мРНК обеих аль-

тернативных изоформ этого рецептора (Shibaya et al., 2006). При использовании праймеров для длинной и короткой изоформы рецептора ПРЛ на матрице тотальной РНК для всех типов исследованных клеток были получены амплифицирован-ные фрагменты длиной 347 и 250 пар нуклеотидных оснований (п.о.), что соответствовало ожидаемым значениям (рис. 2 и табл. 1). Для повышения выхода продуктов амплификации вследствие небольшого количества выделяемых ооцитов был применен метод ПЦР с внутренними праймерами (гнездовая ПЦР; табл. 1). Во втором раунде ПЦР был использован амплификат, полученный в ходе первого раунда отдельно для длинной или короткой изоформы рецептора. В качестве позитивного контроля были использованы клетки гранулезы, в которых ранее была показана экспрессия обеих альтернативных изоформ мРНК (рис. 2). В ходе двух раундов ПЦР во всех случаях были выявлены продукты амплификации ожидаемого размера 172 п.о. (рис. 3), что подтверждало наличие экспрессии мРНК длинной и короткой изоформы рецептора ПРЛ в ооцитах.

Результаты ОТ-ПЦР свидетельствуют о том, что обе изоформы рецептора ПРЛ участвуют в контроле проведения гормонального сигнала в ОКК. Кроме того, данные указывают на наличие двух путей реализации влияния ПРЛ на ооциты: I) опосредованного, через рецепторы в клетках кумулюса, участвующих в регуляции созревания ооцита, и 2) прямого, через взаимодействие с рецепторами, экспресси-рующимися в самих ооцитах.

Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидов для амплификации кДНК __длинной и короткой изоформы рецептора ПРЛ_^

Изоформа рецептора ПРЛ Прямой праймер Обратный праймер Длина фрагментов (п.о.)

Первый раунд ПЦР

Длинная 5'-CAAGCCAGACCATGGATACT-3' 5'-GCTGGTCCTCACAGTCATCT-3' 347

Короткая 5'-GCGAGAAGGCTGTGATATCT-3' 250

Второй раунд ПЦР (ПЦР с внутренними праймерами)

Длинная и короткая 5'-TGACTTCCCAGTGAAGGACA-3' S'-CTCCAGCAGATGAACATCAA -3' 172

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

I- 600 h 200

Рис. 2. ОТ-ПЦР-анализ экспрессии мРНК длинной и короткой изоформы рецептора ПРЛ в овариальных клетках.

Дорожки-. 1-3 - ПЦР-продукты, соответствующие длинной изоформе рецептора ПРЛ; 4-6 - ПЦР-продукты, соответствующие короткой изоформе рецептора ПРЛ; 7-9 - ПЦР-продукты, соответствующие (3-актину; 10 - ОТ-ПЦР, отрицательный контроль; 11 - ПЦР, отрицательный контроль; 12 - маркеры длины в п.о.; 1, 4, 7 -клетки гранулезы; 2, 5, 8 - клетки кумулюса; 3, 6, 9 - желтое тело.

Рис. 3. Анализ экспрессии мРНК длинной изоформы рецептора ПРЛ в ооцитах коров при использовании ОТ-ПЦР с внутренними праймерами (гнездовая ПЦР). Дорожки-. 1 - маркеры длины в п.о.; 2, 3 - ПЦР-продукт второго раунда, полученный при использовании амплификата, соответствующего длинной изоформе рецептора ПРЛ; 4, 5 - ПЦР-продукт второго раунда, полученный при использовании амплификата, соответствующего короткой изоформе рецептора ПРЛ; 6 - ОТ-ПЦР, отрицательный контроль; 7 - ПЦР, отрицательный контроль; 2, 4 - клетки грануле-зы (позитивный контроль); 3,5- ооциты.

3.2. Характеристика влияния пролактина in vitro на цАМФ-зависимый механизм регуляции мейоза ооцитов коров. Циклический АМФ является одним из ключевых регуляторов созревания ооцитов млекопитающих, а также вторичным посредником в механизме передачи сигналов гонадотропных гормонов в фолликулярные клетки (Mattioli, 1994; Conti et al., 2002). Для активации цАМФ-зависимого механизма регуляции мейоза в среду созревания ОКК вносили дибутирил цАМФ (дбцАМФ), который способен эффективно проникать в клетки. В качестве второго цАМФ-повышающего реагента был использован активатор аделилатциклазы фор-сколин (ФК), поскольку он повышает концентрацию этого нуклеотида как в ОКК, так и в ДО коров (Bilodeau-Goeseels et al., 2007).

3.2.1. Оценка концентрационной зависимости ингибиторных эффектов дибутирил цАМФ и форсколина на ядерное созревание ооцитов. При проведении экспериментов по культивированию ОКК было установлено, что в концентрации 1 и 2 мМ дбцАМФ понижает долю ооцитов, достигших завершающих стадий мейоза с 62,7±6,3 % до 41,5±6,8 % и 41,3±7,3 %, соответственно (Р < 0,05). При этом он не влиял на частоту дегенерации хромосом в ооцитах. В дальнейших исследованиях дбцАМФ был использован в минимальной концентрации (1 мМ), при которой достигалось достоверное ингибирование завершения ядерного созревания ооцитов. В экспериментах по культивированию ДО было обнаружено, что доля ооцитов, достигших стадий телофазы I (TI) или метафазы II (МП), снижается в присутствии 20 мкМ ФК с 71,4±7,6 % до 44,4±8,3 % (Р< 0,05). Внесение в среду 5 и 10 мкМ активатора аденилатциклазы не приводило к уменьшению относительного числа созревших клеток. В тоже время частота встречаемости ооцитов с признаками дегенерации ядерного материала не различалась между исследованными группами. Поэтому в дальнейшем для ингибирования мейоза ФК был использован в концентрации 20 мкМ.

3.2.2. Анализ ядерного созревания ооцитов в присутствии пролактина и цАМФ-повышающих реагентов.

3.2.2.1. Культивирование ооцит-кумулюсных комплексов. При культивирова-

нии ОКК в течение 24 ч в среде, содержащей дбцАМФ, было выявлено уменьшение (Р < 0,05) доли ооцитов, достигших стадий Т1 или МП, по сравнению с контрольной группой (табл. 2). ПРЛ повышал (Р < 0,05) выход созревших клеток в 1,3 раза в контрольной среде и в 1,6 раза в присутствии дбцАМФ. Таким образом, в последнем случае гормональный эффект был более значительным.

Таблица 2. Влияние ПРЛ (50 нг/мл) на ядерное созревание ооцитов при культивировании ОКК коров в отсутствие и в присутствии 1 мМ дбцАМФ __(время культивирования - 24 ч)_

Экспериментальная группа Число исследованных ооцитов Число (%) ооцитов на стадиях мейоза:

Дп Дк + М1 AI TI+MII

Контроль* 73 10 (13,7±4,0) 18 (24,7±5,0) 1 (1,4±1,4) 44 (60,3±5,7)а

50 нг/мл ПРЛ 78 5 (6,4±2,8) 12 (15,4±4,1) 1 (1,3±1,3) 60 (76,9±4,8)ь

1 мМ дбцАМФ 58 13 (22,4±5,5) 17 (29,3±6,0) 5 (8,6±3,7) 23 (39,7±6,4)с

50 нг/мл ПРЛ + 1 мМ дбцАМФ 60 9 (15,0±4,6) 10 (16,7±4,8) 3 (5,0±2,8) 38 (63,3±6,2)d

"Среда ТС-199, содержащая 10 % ФБС, число экспериментов - 4. "•ЪР < 0,05; ас/> < 0,05; ЬсР < 0,001; с4Р < 0,05 (критерий х2).

Таблица 3. Влияние ПРЛ (50 нг/мл) на ядерное созревание ооцитов при культивировании ОКК коров в отсутствие и в присутствии 20 мкМ ФК __(время культивирования - 24 ч)_

Экспериментальная группа Число исследованных ооцитов Число (%) ооцитов на стадиях мейоза:

Дп Дк + Ml AI TI+MII

Контроль* 101 17 (16,8±3,7) 17 (16,8±3,7) 5 (5,0±2,2) 62 (61,4±4,8)'

50 нг/мл ПРЛ 95 6 (6,3±2,5)е 16 (16,8±3,8) 1(1,1±1,1) 72 (75,8±4,4)ь

20 мкМ ФК 77 22 (28,6±5,1)' 15 (19,5±4,5) 5 (6,5±2,8) 35 (45,5±5,7)с

50 нг/мл ПРЛ + 20 мкМ ФК 62 5 (8,1±3,5)е 11 (17,7±4,8) 2 (3,2±2,2) 44 (71,0±5,8)(|

*Среда ТС-199, содержащая 10 % ФБС, число экспериментов - 5. < 0,05; icP < 0,05; ь 7> < 0,001; cdP <0,01; с1Р < 0,01 (критерий х2).

Во второй серии экспериментов было исследовано совместное действие ПРЛ и ФК на завершение ядерного созревания ооцитов, окруженных кумулюсом. Внесение 20 мкМ ФК в контрольную среду приводило к уменьшению (Р < 0,05) доли ооцитов, достигших стадий TI или МИ через 24 ч культивирования ОКК (табл. 3). В то же время ПРЛ увеличивал относительное число созревших клеток и в отсутствие (Р < 0,05) и в присутствии ФК (Р < 0,01). При этом в среде с ФК стимулирующее влияние гормона усиливалось, что приводило к повышению доли клеток, достигших завершающих стадий мейоза, до таковой в отсутствие ФК. Кроме того, в группах, содержащих ПРЛ, частота встречаемости ооцитов на стадии диплотены (Дп) была ниже (Р < 0,01), чем в группе, созревшей в присутствии одного ФК.

Таким образом, ПРЛ подавляет in vitro ингибирующее влияние цАМФ-повышающих реагентов на завершение ядерного созревания ооцитов, окруженных клетками кумулюса. При этом в присутствии ФК гормон понижает долю ооцитов,

блокированных на стадии Дп.

3.2.2.2. Культивирование денудированных оститов. На втором этапе исследований был проведен сравнительный анализ влияния ПРЛ и ФК на ядерное созревание ДО. Лишенные кумулюса ооциты имели высокую потенцию к ядерному созреванию, при этом доля клеток, достигших стадий Т] или МП через 24 ч культивирования, составляла в контроле 80,2 % (табл. 4). При культивировании ДО в присутствии ФК было обнаружено снижение относительного числа клеток на завершающих стадиях мейоза по сравнению с контролем (Р < 0,01). Хотя ПРЛ не влиял на завершение ядерного созревания ДО в контрольной среде, он повышал выход созревших ооцитов до уровня контроля в среде, содержащей ФК (Р < 0,05).

Таблица 4. Влияние ПРЛ (50 нг/мл) на завершение ядерного созревания ооцитов при культивировании ДО коров в отсутствие и в присутствии 20 мкМ ФК

(время культивирования - 24 ч)

Экспериментальная группа Число исследованных ооцитов Число (%) ооцитов на стадиях мейоза:

Дп Дк + М1 А1 Т1+МН

Контроль* 81 7 (8,6±3,1) 7 (8,6±3,1) 2 (2,5±1,7) 65 (80,2±4,4)а

50 нг/мл ПРЛ 67 8 (11,9±4,0) 7 (10,4±3,7) 2 (3,0±2,1) 50 (74,6±5,3)"

20 мкМ ФК 95 17 (17,9±3,9) 12 (12,6±3,4) 12(12,6±3,4) 54 (56,8±5,1)с

50 нг/мл ПРЛ + 20 мкМ ФК 56 7 (12,5±4,4) 3 (5,4±3,0) 4(7,1±3,4) 42 (75,0±5,8)°

*Среда ТС-199, содержащая 10 % ФБС, число экспериментов - 5. *СР <0,01; Ь'СР < 0,05 (критерий х2).

В целом, результаты экспериментов выявили прямое супрессирующее влияние ПРЛ на мейоз-тормозящее действие ФК при культивировании ооцитов, лишенных кумулюсных клеток. Они также показали, что для реализации стимулирующего эффекта ПРЛ на завершение ядерного созревания ооцитов в отсутствие ФК необходимы клетки кумулюса.

3.23. Изучение совместного влияния пролактина и цАМФ-повышающих реагентов на рекнициацию мейоза.

3.2.3.1. Сравнительное исследование возобновления мейоза в денудированных и окруженных кумулюсом ооиитах. Через 6 ч культивирования ОКК в контрольной среде 56,1 ± 6,6 % ооцитов реинициировали мейоз. Доля клеток, остающихся на стадии Дп, значительно повышалась (Р < 0,001) в присутствии 1 мМ дбцАМФ (рис.

4). ПРЛ не влиял на способность ооцитов возобновлять мейоз в контрольной среде, тогда как его добавление в среду с дбцАМФ приводило к уменьшению (Р < 0,001) относительного числа ооцитов на стадии Дп до такового в контроле. Для изучения влияния ПРЛ и ФК на реинициацию мейоза в ДО культивирование проводили в течение 8 ч, поскольку через 6 ч инкубации практически все клетки в контрольной группе еще находились на стадии Дп. Было обнаружено, что в среде с ФК доля ооцитов, не возобновивших мейоз, в 2 раза выше (Р < 0,001), чем в контроле (рис.

5). ПРЛ также тормозил (Р < 0,05) возобновление мейоза ДО в контрольной среде, но менее значительно (в 1,5 раза). Напротив, внесение гормона в среду, содержащую ФК, обусловливало уменьшение относительного числа ооцитов на стадии Дп СР < 0,05).

□ О нг/мл ПРЛ

Контроль дбцАМФ

Среда культивирования ОКК

Рис. 4. Влияние ПРЛ (50 нг/мл) на реинициацию мейоза ооцитов при культивировании ОКК коров в отсутствие и в присутствии 1 мМ дбцАМФ. Время культивирования -6 ч. Контроль: среда ТС-199, содержащая 10 % ФБС. Число экспериментов: п = 4. В скобках указано число исследованных ооцитов. КСР < 0,001; 6с/> < 0,01 (критерий у.2).

DO нг/мл ПРЛ

П иг/шп ПРП

Контроль ФК

Среда культивирования ДО

Рис. 5. Влияние ПРЛ (50 нг/мл) на реинициацию мейоза ооцитов при культивировании ДО коров в отсутствие и в присутствии 20 мкМ форсколина (ФК). Время культивирования -8 ч. Контроль: среда ТС-199, содержащая 10 % ФБС. Число экспериментов: п = 5. В скобках указано число исследованных ооцитов. кЬР < 0,05; VP < 0,001, сАР < 0,05 (критерий Х2)-

Таким образом, ПРЛ подавляет in vitro ингибирующее действие цАМФ-повышающих реагентов на реинициацию мейоза независимо от наличия клеток кумулюса, сопряженных с ооцитом. Напротив, при базальном уровне цАМФ ПРЛ оказывает тормозящее действие на возобновление мейоза в ДО и не влияет на этот процесс в окруженных кумулюсом ооцитах.

3.2.3.2. Анализ участия протеинкиназы С в реализации мейоз-регупирующего

действия пролактина. В этой серии экспериментов было исследовано действие калпостина (КП), неселективного ингибитора протеинкиназы С, на реинициацию мейоза в ДО в присутствии ПРЛ и ФК. Как известно, протеинкиназа С является вторичными мессенджером при передаче сигнала ПРЛ во многие клетки-мишени (Во1е-Реу5о1 е! а!., 1998). КП был использован в концентрации 100 нМ, поскольку при 50 нМ он на 50 % ингибирует активность протеинкиназы С в клетках. КП не влиял на долю ооцитов, остающихся на стадии Дп через 8 ч культивирования, ни в контрольной среде, ни в среде с ПРЛ (рис. 6). Мейоз-тормозящий эффект ПРЛ был даже более выражен в присутствии ингибитора протеинкиназы С. ПРЛ в 2 раза повышал долю ооцитов на стадии Дп в среде с КП (Р < 0,001), тогда как эта доля возрастала лишь в 1,6 раза в контрольной среде (Р < 0,05). Тем не менее, КП подавлял мейоз-ингибирующее действие ФК (Р < 0,01), понижая долю ооцитов, находящихся на стадии Дп, до таковой в контрольной среде без ФК.

100

сг 80 -

60 -

20 -

Контроль КП

ФК

ФК+КП

ПРЛ ПРЛ+КП

Среда культивирования ДО Рис. 6. Влияние ПРЛ (50 нг/мл), форсколина (ФК, 20 мкМ) и калпостина (КП, 100 нМ) на реинициацию мейоза ооцитов при культивировании ДО коров. Время культивирования -8 ч. Контроль: среда ТС-199, содержащая 10 % ФБС. Число экспериментов: п = 4. В скобках указано число исследованных ооцитов. %ЬР < 0,01; *-сР < 0,05; < 0,001 (критерий %2)-

Полученные данные показывают, что КП и ПРЛ оказывают однонаправленное влияние на мейоз-тормозящее действие ФК в ооцитах, лишенных кумулюса. Кроме того, КП не блокирует мейоз-ингибирующий эффект ПРЛ на ДО в контрольной среде. Следовательно, активация протеинкиназы С не опосредует ни стимулирующий, ни ингибирующий эффекты ПРЛ на мейоз ооцитов коров.

3.3. Морфофункциональная характеристика соматических клеток при культивировании ооцит-кумулюсных комплексов в среде, содержащей про-лактин и цАМФ-повышающие реагенты. Ранее было показано, что у млекопитающих цАМФ-зависимые внутриклеточные механизмы также вовлечены в регуляцию экспансии и пролиферации кумулюса (УапйегЬуёеп, 1993; 8с1ше1г е! а1., 1996). Поэтому в этом разделе исследований была проведена морфологическая оценка состояния кумулюса и определены уровень пролиферативной активности и степень дегенерации кумулюсных клеток при культивировании ОКК коров в присутствии ПРЛ и дбцАМФ или ФК.

Было установлено, что экспансия кумулюса, сопутствующая ядерному созреванию ооцитов, зависит от наличия дбцАМФ в среде культивирования. При внесении циклического нуклеотида в контрольную среду доля ОКК с высокой степенью разрыхления кумулюса повышалась более, чем в 2 раза (Р < 0,001), тогда как доля ОКК со средней степенью разрыхления понижалась в 3 раза (Я < 0,001) (табл. 5). ПРЛ не влиял существенно на экспансию кумулюса в отсутствие дбцАМФ. Напротив, гормон снижал выход ОКК с высокой степенью разрыхления кумулюса (Р< 0,05) и повышал выход ОКК со средней степенью разрыхления (Р < 0,05) в среде, содержащей дбцАМФ. Вместе с тем в этой экспериментальной группе доля ОКК с высокой и средней степенью экспансии кумулюса не достигала таковой в контроле (по крайней мере, Р < 0,05).

Таблица 5. Экспансия кумулюса при культивировании ОКК коров в средах

с дбцАМФ и ПРЛ в течение 24 ч*

Среда культивирования Число исследованных ОКК Число (%) ОКК с различной степенью экспансии кумулюса

Высокой Средней Низкой

Контроль* 75 27 (36,0 ±5,5)" 41 (54,7 ± 5,1)° 7 (9,3 ± 3,4)

50 нг/мл ПРЛ 76 39 (51,3 ±5,7)" 33 (43,4 ±5,7)' 4 (5,3 ±2,6)

1 мМ дбцАМФ 80 65 (81,3 ±4,4)° 14 (17,5 ±4,2)8 1 (1,3 ± 1,3)

1 мМ дбцАМФ + 50 нг/мл ПРЛ 73 46 (63,0 ± 5,7)" 25 (34,2 ± 5,6)" 2 (2,7 ± 1,9)

*Среда ТС-199, содержащая 10 % ФБС, число экспериментов - 4.

**Р < 0,001; ^Р < 0,01; ЬсР < 0,001; сАР < 0,05; егР < 0,001; 1гР < 0,001; < 0,05;

еМР < 0,05 (критерий х2).

Таблица 6. Экспансия кумулюса при культивировании ОКК коров в средах

с ФК и ПРЛ в течение 24 ч*

Среда культивирования Число исследованных ОКК Число (%) ОКК с различной степенью экспансии кумулюса

Высокой Средней Низкой

Контроль** 67 27 (40,3 ± 6,0)" 35 (52,2 ±6,1)" 5 (7,5 ± 3,2)

50 нг/мл ПРЛ 69 36 (52,2 ± 6,0)ь 29 (42,0 ±5,9) 4 (5,8 ±2,8)

20 мкМ ФК 70 50(71,4±5,4)с 20 (28,6 ± 5,4)е 0

20 мкМ ФК + 50 нг/мл ПРЛ 68 36 (52,9 ±6,1)" 29 (42,6 ±6,0) 3(4,4 ±2,5)

*Среда ТС-199, содержащая 10 % ФБС, число экспериментов- 4. < 0,001; Ь сР < 0,05; ^Р < 0,05 (критерий х2)-

Активатор аденилатциклазы ФК, как и дбцАМФ, усиливал экспансию куму-люсных клеток, окружающих ооциты, хотя менее значительно (табл. 6). В присутствии ФК выход ОКК с высокой степенью разрыхления кумулюса возрастал в 1,8 раза (Р < 0,001), а выход ОКК со средней степенью разрыхления снижался в 1,8 раза (Р < 0,05). Внесение ПРЛ в среду с ФК обусловливало уменьшение доли ОКК с высокой степенью кумулюсной экспансии (Р < 0,05). Кроме того, доля ОКК со средней степенью экспансии в этой экспериментальной группе не отличалась от таковой в контроле и группе с одним ПРЛ.

При использовании метода дисперсионного анализа было обнаружено взаимно независимое влияние ПРЛ и дбцАМФ на пролиферативную активность куму-

люсных клеток (Р < 0,001). При культивировании ОКК ПРЛ повышал (Р < 0,001) процент клеток в стадии митоза как в отсутствие, так и в присутствии дбцАМФ (табл. 7). В свою очередь, дбцАМФ уменьшал (Я < 0,01) долю митотических клеток и в контрольной среде и в среде с ПРЛ. Степень дегенерации кумулюса зависела от наличия ПРЛ в среде культивирования (Р < 0,001) и взаимодействия гормона с дбцАМФ (Я < 0,01). Внесение ПРЛ в контрольную среду приводило к снижению (Р < 0,001) процента кумулюспых клеток с признаками дегенерации ядерного материала (табл. 7). Хотя один дбцАМФ не влиял на деструктивные процессы в клетках кумулюса, он ингибировал тормозящий эффект ПРЛ, повышая относительное число клеток с дегенеративными изменениями (Р < 0,01).

Таблица 7. Морфофункциональное состояние клеток кумулюса при

культивировании в средах с дбцАМФ и ПРЛ в течение 24 ч

Среда культивирования Число экспериментов % клеток в стадии митоза (х±т) % клеток с признаками дегенерации ядерного материала (х±ш)

Контроль* 4 3,28 ± 0,20* 8,06 ±0,41°

50 нг/мл ПРЛ 4 5,42 ± 0,28ь 4,74 ± 0,3 lf

1 мМ дбцАМФ 4 1,76 ± 0,16е 7,00 ± 0,19s

1 мМ дбцАМФ + 50 нг/мл ПРЛ 4 3,98 ± 0,3 ld 6,77 ± 0,46h

* Среда ТС-199, содержащая 10 % ФБС.

'■ЬР < 0,001; 'СР <0,01; Ь4Р <0,01; с4Р < 0,001; °*Р < 0,001; ГвР <0,01; ,hP < 0,01 (критерий Тьюки).

В целом, результаты морфофункциональной характеристики окружающих ооциты соматических клеток свидетельствуют о взаимодействии сигнальных каскадов, индуцированных ПРЛ и цАМФ, в клетках кумулюса. При этом расположение участка сопряжения данных каскадов относительно участков, ответственных за различные эффекты ПРЛ и цАМФ, по-видимому, определяет реализацию этих эффектов в кумулюсных клетках.

3.4. Оценка оплодотворяемости и способности к развитию ооцитов, созревших in vitro в присутствии гонадотропных гормонов и пролактина. Согласно данным, полученным в лаборатории биологии развития ВНИИГРЖ, влияние ПРЛ на компетенцию ооцитов к дальнейшему развитию зависит от состава системы созревания in vitro. При совместном культивировании ОКК и клеток гра-нулезы в среде, не содержащей гонадотропные гормоны, было показано стимулирующее влияние ПРЛ на последующий выход морул и бластоцист, что указывало на паракринный характер гормонального эффекта (Кузьмина и др., 2001). В отсутствие клеток гранулезы позитивное действие ПРЛ на способность ооцитов к развитию было выявлено только при использовании ОКК из фолликулов диаметром 5-8 мм (Скотги, 2008), которые составляют лишь небольшую часть овариальных фолликулов, пригодных для биотехнологических целей. Поэтому на завершающем этапе наших исследований была изучена возможность реализации прямого (не опосредованного КГ) действия ПРЛ на потенциал к развитию ооцитов из фолликулов диаметром 2-8 мм, которые обычно используются в репродуктивных клеточных технологиях. С этой целью влияние ПРЛ было охарактеризовано при культивиро-

вании ооцитов в присутствии гонадотропных гормонов после синхронизации реи-нициации мейоза путем предварительной обработки клеток изобутилметилксанти-ном, неселективным ингибитором фосфодиэстераз, повышающим уровень цАМФ в ооцитах. Для выяснения роли клеток кумулюса' в реализации влияния ПРЛ был проведен сравнительный анализ созревания, оплодотворяемости и способности к развитию ооцитов, окруженных клетками кумулюса и лишенных этих клеток.

Таблица 8. Влияние ПРЛ in vitro на ядерное созревание и способность к дальнейшему развитию ооцитов коров, культивируемых в присутствии _ гонадотропных гормонов (4 эксперимента)_i_

Ис- Экспери- %(п) % (п) оп- %(п) %(п) % (п) бла- % (п) бла-

точник менталь- ооцитов лодотво- раздро- морул, стоцист, стоцист

ооци- ная группа на стадиях рившихся бившихся 5-й день по- 8-й день по- от числа

тов ТГ-МП клеток клеток сле осемене- сле осемене- полученных

ния ния эмбрионов

ОКК Контроль* 94,0 ± 3,4А 78,2 ±5,6® 68,4 ± 4,7 25,5 ± 4,4 13,3 ±3,4 19,4 ±4,8

(47/50) (43/55) (67/98)" (25/98) (13/98) (13/67)

50 нг/мл 93,8 ± 3,5 81,7 ±5,0 81,7 ±3,8* 51,0 ±4,9*** 35,6 ±4,7*** 43,5 ±5,4**

ПРЛ (45/48) (49/60) (85/104)' (53/104) (37/104) (37/85)

ДО Контроль" 85,7 ±4,7 80,4 ± 5,3е 47,1 ±4,9° 0 0 0

(48/56) (45/56) (49/104)ь

50 нг/мл 83,6 ± 5,0 80,0 ± 5,4е 52,9 ± 4,9Р 1,0 ± 1,0 0 0

ПРЛ (46/55) (44/55) (54/102)d (1/102)

"Среда ДМЕМ, содержащая 10 МЕ/мл сывороточного гонадотропина жеребых кобыл, 5 МЕ/мл человеческого ХГ и 5 % эстральной сыворотки коров. *Р<0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001 по сравнению с контролем (критерий х2). кЪР <0,01; сЛР < 0,001; ЛВР < 0,05; < 0,001; Е РР < 0,01 (критерий х2)-

В экспериментах по культивированию ОКК в присутствии гонадотропных гормонов большая часть ооцитов (94,0 %) достигала стадий Т1 или МП (табл. 8). В этих условиях ПРЛ не влиял на выход созревших клеток. Также не было обнаружено достоверного различия в доле оплодотворившихся ооцитов между контрольной и опытной группой. Внесение ПРЛ в среду созревания ооцитов приводило к повышению (Р < 0,05) относительного числа раздробившихся клеток. Влияние ПРЛ на дальнейшее развитие эмбрионов было еще более значительным. Относительное число ооцитов, развившихся до стадии морулы на 5-й день после осеменения, было в 2 раза выше после созревания ОКК в среде с ПРЛ, чем в контрольной среде (Р < 0,001). На 8-й день после осеменения это различие сохранялось. Культивирование ОКК в присутствии ПРЛ обусловливало последующее повышение доли бластоцист от общего числа осемененных ооцитов с 13,3 % до 35,6 % (Р < 0,001). Кроме того, процент бластоцист от числа полученных эмбрионов был более, чем в 2 раза, выше в группе, созревшей с ПРЛ, по сравнению с контролем (Р < 0,01). При культивировании ДО не было обнаружено достоверных различий в доле ооцитов, достигших стадий Т1 или МП, между контрольной и опытной группами (табл. 8). При этом выход созревших клеток не отличался значительно от такового после культивирования ОКК. ПРЛ не оказывал никакого влияния и на потенцию ДО к оплодотворению, которая была сходна с потенцией ооцитов, окруженных кумулю-сом. Доля ооцитов, раздробившихся на 2-й день после осеменения, также не зави-

села от присутствия ПРЛ в среде созревания. Вместе с тем на этой стадии развития выход эмбрионов, полученных из ДО, был значительно ниже выхода эмбрионов, полученных из ОКК, как в контрольной (Р < 0,01), так и в опытной группе (Р < 0,001). Кроме того, в обеих группах процент раздробившихся клеток был существенно ниже, чем процент оплодотворившихся клеток (по крайней мере, Р < 0,01). В контрольной группе развитие эмбрионов, полученных после оплодотворения ДО, до стадии бластоцисты не происходило, что согласуется с данными ряда других исследователей (АШб й а1. 2003; 1кес1а е1 а1., 2006). Также не было выявлено влияния ПРЛ при созревании ДО на последующий выход бластоцист.

Результаты проведенного исследования показывают, что при культивировании ОКК из фолликулов диаметром 2-8 мм в присутствии гонадотропных гормонов ПРЛ оказывает стимулирующее влияние на способность ооцитов к дальнейшему развитию. Это позитивное действие гормона не связано с ядерным созреванием ооцитов, проявляется на стадии дробления и усиливается в процессе развития эмбрионов. Кроме того, для его реализации не требуется присутствия гранулезных клеток. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о стимулирующем влиянии ПРЛ в присутствии гонадотропных гормонов на цитоплазматическое созревание ооцитов. Это влияние лактогенного гормона опосредуется клетками кумулюса, которые необходимы для приобретения ооцитами компетенции к дальнейшему развитию.

ВЫВОДЫ

1. В ооцитах и клетках кумулюса коров присутствует мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ, что свидетельствует об участии обеих изоформ в проведении гормонального сигнала в ооцит-кумулюсные комплексы и указывает на наличие двух путей реализации влияния ПРЛ на ооциты: опосредованного, через рецепторы в клетках кумулюса, и прямого, через взаимодействие с рецепторами в самих ооцитах.

2. ПРЛ оказывает модулирующее действие на цАМФ-зависимый механизм регуляции мейоза в ооцитах коров, которое не зависит от наличия клеток кумулюса. Внесение ПРЛ в среду культивирования ооцит-кумулюсных комплексов, содержащую дбцАМФ, обусловливает снижение доли ооцитов, остающихся на стадии диплотены через 6 ч инкубации (с 76,2 % до 42,9 %, Р < 0,001), и повышение доли ооцитов, достигших стадии телофазы I или метафазы II через 24 ч (с 39,7 % до 63,3 %, Р < 0,05). ПРЛ также ингибирует тормозящее влияние форсколина на реи-нициацию мейоза в денудированных ооцитах (46,4 % против 64,7 % ооцитов в стадии диплотены, Р < 0,05) и завершение ядерного созревания денудированных ооцитов (75,0 % против 56,8 % созревших ооцитов, Р < 0,05).

3. Характер регуляторного влияния ПРЛ на ядерное созревание ооцитов в отсутствие цАМФ-повышающих реагентов зависит от их сопряжения с клетками кумулюса. Кумулюсные клетки необходимы для реализации стимулирующего эффекта гормона на завершение ядерного созревания ооцитов (76,9 % против 60,3 % в контроле, Р < 0,05). Напротив, ПРЛ оказывает тормозящее действие на возобновление мейоза только в отсутствие клеток кумулюса (50,7 % против 32,9 % ооцитов в стадии диплотены, Р < 0,05).

4. Активация протеинкиназы С не обусловливает ни стимулирующее (в присутствии форсколина), ни ингибирующее влияние ПРЛ на реинициацию мейоза в ооцитах, лишенных клеток кумулюса.

5. Морфофункциональное состояние окружающих ооциты клеток кумулюса в присутствии ПРЛ и цАМФ-повышающих реагентов определяется взаимодействием индуцированных ими внутриклеточных сигнальных каскадов. ПРЛ ингибирует стимулирующее влияние дбцАМФ и форсколина на экспансию кумулюсных клеток, уменьшая выход ооцит-кумулюсных комплексов с высокой степенью разрыхления кумулюса (с 81,3 % до 63,0 %, Р < 0,05 и с 71,4 % до 52,9 %, Р < 0,05). В свою очередь, дбцАМФ подавляет тормозящее действие ПРЛ на деструктивные процессы в кумулюсе, увеличивая относительное число клеток с признаками дегенерации ядерного материала (с 4,74±0,31 % до 6,77±0,46 %, Р < 0,01). Напротив, разнонаправленное влияние ПРЛ и дбцАМФ на пролиферативную активность клеток кумулюса является взаимно независимым.

6. Внесение ПРЛ в среду культивирования ОКК из фолликулов диаметром 28 мм, содержащую гонадотропные гормоны, не влияет на относительное число созревших и оплодотворенных ооцитов, но обусловливает последующее повышение выхода эмбрионов на стадии бластоцисты (35,6 % против 13,3 % в контроле, Р < 0,001). Это стимулирующее влияние ПРЛ опосредуется клетками кумулюса, которые необходимы для приобретения ооцитами компетенции к дальнейшему развитию.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. С целью повышения эффективности получения in vitro эмбрионов крупного рогатого скота рекомендуем культивировать ооцит-кумулюсные комплексы из фолликулов диаметром 2-8 мм в среде созревания, содержащей одновременно гонадотропные гормоны и 50 нг/мл бычьего ПРЛ.

2. Материалы диссертации могут быть использованы в учебных курсах по физиологии и биотехнологии воспроизводства сельскохозяйственных животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лебедева, И.Ю. Взаимодействие сигнальных каскадов, индуцированных цАМФ и пролактином в ооцит-кумулюсных комплексах коров / Лебедева И.Ю., Сингина Г.Н., Волкова H.A., Мормышев А.Н., Голубев А.К., Зиновьева H.A. // Цитология. - 2008. - Т. 50. - №8. - С. 734-742.

2. Лебедева, И.Ю. Взаимодействие пролактина и форсколина при созревании in vitro денудированных и окруженных кумулюсом ооцитов коров / Лебедева И.Ю. Сингина Г.Н., Мормышев А.Н., Шатайло О.Л // Международный вестник ветеринарии. - 2008. - № 3. - С. 50.

3. Мормышев, А.Н. Рецепторные и пост-рецепторные пути проведения сигнала пролактина в клетки кумулюса ооцитов коров / Мормышев А.Н., Лебедева И.Ю., Волкова H.A. и др. // Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных: межд. научно-практич. конференция. - Дубровицы, 2007. - С. 148-149.

4. Лебедева, И.Ю. Влияние пролактина на цАМФ-зависимый механизм регуляции мейоза ооцитов коров / Лебедева И.Ю, Сингина Г.Н., Мормышев А.Н. и др. // Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных: межд. научно-практич. конференция. - Дубровицы, 2007.-С. 146-147.

5. Лебедева, И.Ю. Способность к развитию после оплодотворения ооцитов коров, созревших in vitro в присутствии гонадотропных гормонов и пролактина / Лебедева И.Ю., Мормышев А.Н. // Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: 7 межд. науч. конференция. - Дубровицы, 2008.-С. 170-172.

Издательство ВНИИ животноводства 142132, Московская обл., Подольский р-н, п. Дубровицы Тел. (8 - 4967)65-15-97

Сдано в набор 19.11.2009. Подписано в печать 20.11.2009 _Заказ №31. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз._

Отпечатано в типографии ВНИИ животноводства

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мормышев, Александр Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Созревание ооцитов в яичниках млекопитающих

1.1.1. Ранние стадии оогенеза и поддержание блока мейоза

1.1.2. Созревание овариальных фолликулов, сопряженное с 14 ростом ооцитов

1.1.3. Ядерно-цитоплазматические изменения при созревании 17 ооцитов

1.1.4. Молекулярные факторы, регулирующие реинициацию мейоза

1.1.5. Взаимодействие ооцита и соматических клеток фолликула

1.2. Гормональный контроль созревания ооцитов млекопитающих

1.2.1. Ключевая роль гонадотропных гормонов в регуляции 25 завершающих стадий фолликуло- и оогенеза

1.2.2. Регуляторное влияние пролактина на функциональную 29 активность половых и соматических клеток антральных фолликулов

1.3. Механизмы реализации действия пролактина на клетки-мишени

1.3.1. Характеристика рецептора пролактина

1.3.2. Внутриклеточные пути передачи сигнала пролактина

1.4. Современные технологии культивирования и оплодотворения 39 in vitro ооцитов коров

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материалы

2.1.1. Объект исследования

2.1.2. Реактивы и оборудование

2.2. Методы исследований 48 2.2.1. Выделение клеток гранулезы и их подготовка для ОТ-ПЦР

2.2.2. Выделение желтого тела

2.2.3. Выделение и морфологическая оценка ооцит-кумулюсных 49 комплексов

2.2.4. Изоляция денудированных ооцитов и клеток кумулюса

2.2.5. Анализ экспрессии мРНК длинной и короткой изоформы 50 рецептора пролактина

2.2.5.1. Выделение тотальной РНК из овариальных клеток

2.2.5.2. Синтез первой цепи комплементарной ДНК

2.2.5.3. Метод полимеразной цепной реакции

2.2.6. Культивирование ооцит-кумулюсных комплексов и 54 денудированных ооцитов

2.2.7. Морфофункциональная характеристика клеток кумулюса

2.2.8. Оплодотворение ооцитов и культивирование эмбрионов

2.2.9. Цитогенетический анализ ооцитов, зигот и эмбрионов

2.2.10. Статистическая обработка данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Анализ экспрессии мРНК длинной и короткой изоформы 59 рецептора пролактина в ооцитах и клетках кумулюса коров

3.2. Характеристика влияния пролактина in vitro на цАМФ- 63 зависимый механизм регуляции мейоза ооцитов коров

3.2.1. Оценка концентрационной зависимости ингибиторных 63 эффектов дибутирил цАМФ и форсколина на ядерное созревание ооцитов

3.2.2. Анализ ядерного созревания ооцитов в присутствии 65 пролактина и цАМФ-повышающих реагентов

3.2.2.1. Культивирование ооцит-кумулюсных комплексов

3.2.2.2. Культивирование денудированных ооцитов

3.2.3. Изучение совместного влияния пролактина и цАМФ- 75 повышающих реагентов на реинициацию мейоза

3.2.3.1. Сравнительное исследование возобновления мейоза в денудированных и окруженных кумулюсом ооцитах

3.2.3.2. Анализ участия протеинкиназы С в реализации мейоз-регулирующего действия пролактина

3.3. Морфофункциональная характеристика соматических клеток при культивировании ооцит-кумулюсных комплексов в среде, содержащей пролактин и цАМФ-повышающие реагенты

3.4. Оценка оплодотворяемости и способности к развитию ооцитов, созревших in vitro в присутствии гонадотропных гормонов и пролактина

4. ОБСУЖДЕНИЕ ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AI - анафаза I

БСА - бычий сывороточный альбумин дбцАМФ - дибутирильное производное цАМФ Дк - диакинез

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота dNTP - дезоксинуклеотидтрифосфаты ДО - денудированные ооциты Дп - диплотена кДНК - комплементарная ДНК

КП - калпостин

КРС - крупный рогатый скот

ЛГ - лютеинизирующий гормон

Ml - метафаза I

МП - метафаза II

ОКК - ооцит-кумулюсные комплексы

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция, совмещенная с полимеразной цепной реакцией

ПКА - протеинкиназа А ПКС - протеинкиназа С п.о. - пары оснований ПРЛ - прол актин

ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота

ТАЕ - трис-ацетат-ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота)

TI - тело фаза I тотРНК - тотальная РНК

ФБР - фосфатный буферный раствор

ФБС - фетальная бычья сыворотка

ФК - форсколин

ФПС - фактор промоции созревания ФСГ - фолликулостимулирующий гормон ХГ - хорионический гонадотропин цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные и цитологические аспекты участия пролактина в регуляции созревания ооцитов коров"

Актуальность темы

Методы экстракорпорального созревания и оплодотворения ооцитов сельскохозяйственных животных широко используются в биотехнологии для целей клеточной инженерии, а также получения эмбрионов, пригодных для трансплантации. Разработанные к настоящему времени технологии культивирования и оплодотворения in vitro ооцитов коров позволяют получить достаточно высокий выход морул и бластоцист (до 30-45 %), однако многие проблемы, связанные с их жизнеспособностью остаются нерешенными [131]. Основными лимитирующими факторами при получении эмбрионов являются качество исходной популяции ооцитов и их способность к дальнейшему развитию, приобретенная в процессе экстракорпорального созревания. Последний фактор в высокой степени зависит от состава системы культивирования ооцитов и поэтому является объектом направленного воздействия [178, 221]. Развитие новых технологий, таких как клонирование и получение эмбриональных стволовых клеток, которые основаны на использовании созревших in vitro ооцитов, повышает значимость исследований, ориентированных на дальнейшую модернизацию систем созревания. Это свидетельствует о необходимости целенаправленного поиска физиологически уместных биологически активных веществ, способных специфически воздействовать на ооцит и повышать его компетенцию к дальнейшему развитию. Одним из таких потенциальных стимуляторов является гипофизарный гормон пролактин (ПРЛ), играющий исключительно важную роль в регуляции репродукции млекопитающих, что подтверждается данными о бесплодии самок мышей с инакти-вированным геном для рецептора ПРЛ [47]. Показано также, что в некоторых системах культивирования ооцит-кумулюсиых комплексов коров ПРЛ может оказывать стимулирующее влияние на потенцию яйцеклеток к дальнейшему развитию [13]. Это указывает на возможность практического использования данного гормона с целью совершенствования технологии получения эмбрионов крупного рогатого скота. Однако успешное применение ПРЛ в биотехнологической практике невозможно без глубокого понимания механизмов его участия в регуляции формирования зрелых яйцеклеток. Это обусловливает необходимость детального изучения процессов, связанных с реализацией гормонального влияния на ооциты и кумулюсные клетки.

Как известно, гонадотропные гормоны - фолликулостимулирующий и лютеинизирующий - играют ключевую роль в контроле овариальной функции млекопитающих. Также установлено, что основным вторичным посредником в механизмах передачи сигналов гонадотропных гормонов в фолликулярные клетки является циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), который выполняет центральную роль в регуляции мейоза ооцитов [65, 158]. Одна из функций ПРЛ заключается в модуляции регуляторного действия гонадотропных гормонов на функциональную активность фолликулярных клеток, однако механизм этого модулирующего влияния до сих пор не ясен [140]. В связи этим исследование взаимодействия сигнальных путей, активируемых гонадо-тропными гормонами, в первую очередь, цАМФ-зависимого пути, и пролак-тином в ооцит-кумулюсных комплексах, имеет актуальное значение для понимания фундаментальных механизмов, лежащих в основе регуляции овариальной функции, в том числе созревания ооцитов.

Цель и задачи исследований

Цель настоящей работы - идентифицировать молекулярные и клеточные пути влияния ПРЛ на созревание ооцит-кумулюсных комплексов коров и на этой основе модернизировать систему культивирования ооцитов для получения in vitro эмбрионов крупного рогатого скота.

В соответствии с вышеуказанной целью были поставлены следующие задачи:

2. Изучить влияние ПРЛ на цАМФ-зависимый механизм регуляции мейоза в ооцитах.

3. Исследовать участие клеток кумулюса в реализации эффектов ПРЛ на ядерное созревание ооцитов.

4. Охарактеризовать роль протеинкиназы С в проведении сигналов ПРЛ в ооциты.

6. Изучить влияние ПРЛ в присутствии гонадотропных гормонов на созревание окруженных клетками кумулюса и денудированных ооцитов, их оп-лодотворяемость и способность к развитию до стадии бластоцисты.

Научная новизна

При выполнении диссертационной работы впервые выявлена экспрессия мРНК длинной и короткой формы рецептора ПРЛ в ооцитах и клетках кумулюса коров и показано функционирование как прямого, так и опосредованного кумулюсом пути проведения сигнала ПРЛ в ооциты. Впервые детально исследовано взаимодействие сигнальных каскадов, активируемых цАМФ и пролактином в ооцитах и клетках кумулюса коров, и обнаружено различие участков сопряжения этих каскадов в половых и соматических клетках фолликулов. Выполненная работа является первым исследованием, в котором получены данные о зависимости характера влияния ПРЛ на мейоз от уровня цАМФ в ооцитах.

Практическая значимость работы

Модернизирована система созревания in vitro ооцит-кумулюсных комплексов из фолликулов диаметром 2-8 мм посредством одновременного введения в среду гонадотропных гормонов и ПРЛ (50 нг/мл), обусловливающая повышение качества цитоплазматического созревания ооцитов и эффективности получения эмбрионов крупного рогатого скота.

Основные положения, выносимые на защиту

• Характер влияния ПРЛ на ядерное созревание ооцитов зависит от внутриклеточного уровня цАМФ. • ПРЛ оказывает модулирующее действие на цАМФ-зависимый механизм регуляции мейоза в ооцитах коров.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международных научных конференциях: «Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных», Дубровицы, 2007; «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии», Дубровицы, 2008; «Новые аспекты биотехнологии репродукции животных», Санкт-Петербург, 2008; на конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖа, 2007, 2008.

Публикации результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них 2 -в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 131 страницах, содержит 10 таблиц и 17 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений. Список литературы включает 258 источников, в том числе 232 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Мормышев, Александр Николаевич

ВЫВОДЫ

1. В ооцитах и клетках кумулюса коров присутствует мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ, что свидетельствует об участии обеих изоформ в проведении гормонального сигнала в ооцит-кумулюсные комплексы и указывает на наличие двух путей реализации влияния ПРЛ на ооци-ты: опосредованного, через рецепторы в клетках кумулюса, и прямого, через взаимодействие с рецепторами в самих ооцитах.

2. ПРЛ оказывает модулирующее действие на цАМФ-зависимый механизм регуляции мейоза в ооцитах коров, которое не зависит от наличия клеток кумулюса. Внесение ПРЛ в среду культивирования ооцит-кумулюсных комплексов, содержащую дбцАМФ, обусловливает снижение доли ооцитов, остающихся на стадии диплотены через 6 ч инкубации (с 76,2 % до 42,9 %, Р < 0,001), и повышение доли ооцитов, достигших стадии телофазы I или метафазы II через 24 ч (с 39,7 % до 63,3 %, Р < 0,05). ПРЛ также ингибирует тормозящее влияние форсколина на реинициацию мейоза в денудированных ооцитах (46,4 % против 64,7 % ооцитов в стадии диплотены, Р < 0,05) и завершение ядерного созревания денудированных ооцитов (75,0 % против 56,8 % созревших ооцитов, Р < 0,05).

6. Внесение ПРЛ в среду культивирования ОКК из фолликулов диаметром 2-8 мм, содержащую гонадотропные гормоны, не влияет на относительное число созревших и оплодотворенных ооцитов, но обусловливает последующее повышение выхода эмбрионов на стадии бластоцисты (35,6 % против 13,3 % в контроле, Р < 0,001). Это стимулирующее влияние ПРЛ опосредуется клетками кумулюса, которые необходимы для приобретения ооцитами компетенции к дальнейшему развитию.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мормышев, Александр Николаевич, п. Дубровицы Московской обл.

1. Восток, К. Мейотические хромосомы / К. Босток, Э. Сампер // Хромосомы эукариотической клетки. М.: Мир, 1981. - С. 349-350.

2. Голубев, А.К. Методические рекомендации по культивированию ооцитов и фолликулов коров I А.К. Голубев, Б.П. Завертяев, Т.И. Кузьмина и др. Л.: ВНИИРГЖ, 1989. - 35 с.

3. Дыбан, А.П. Раннее развитие млекопитающих / А.П. Дыбан. М.: Наука, 1988.-228 с.

4. Дыбан, А.П. Оогенез млекопитающих / А.П. Дыбан, B.C. Баранов // Современные проблемы оогенеза. М.: Наука, 1977. - С. 200-239.

5. Евдонин, А.Л. Белки семейства STAT: роль в проведении клеточного сигнала /А.Л. Евдонин//Цитология. 1998.-Т. 40, № 12.-С. 1053-1062.

6. Карш, Ф.Д. Гормональная регуляция размножения у млекопитающих / Ф.Д. Карш, Д.У. Линкольн, Д.А. Линкольн и др.; под ред. К. Остина, Р. Шорта; пер. с англ. В.Л. Быкова, М.С. Морозовой. М.: Мир, 1987. - 305 с.

7. Коток, Т. Влияние периовуляторного дисбаланса пролактина на экспрессию рецепторов пролактина в клетках яичника крысы / Т. Коток, Р.Л. Богорад, А.Н. Смирнов и др. // Онтогенез. 2000. - Т. 31, № 2. - С. 144-151.

8. Кузьмина, Т.И. Цитогенетические и биохимические аспекты мейоза и оплодотворения ооцитов коров in vitro: дис. . докт. биол. наук: 03.00.15: защищена 17.05.1993 / Кузьмина Татьяна Ивановна. СПб-Пушкин, 1993. -247 с.

9. Кузьмина, Т.И. Оптимизация системы экстракорпорального созревания ооцитов коров с целью получения эмбрионов / Т.И. Кузьмина, А.К. Голубев, Т.А. Гойло, С.В. Ткаченко // С.-х. биология. 1993. - № 6. - С.46-52.

10. Кузьмина, Т.И. Модернизация систем дозревания ооцитов коров для повышения эффективности технологии оплодотворения in vitro / Т.И. Кузьмина, Г.А. Шагиахметова // Доклады Россельхозакадемии. 1995. - № 4. - С. 25-27.

11. Кузьмина, Т.И. Возможность созревания и оплодотворения ооцитов in vitro / Т.И. Кузьмина // Зоотехния. 2000. - № 11. - С. 28-31.

12. Кузьмина, Т.И. Эффекты пролактина в различных системах культивирования на созревание ооцитов коров и их способность к дальнейшему развитию / Т.И. Кузьмина, И.Ю. Лебедева, X. Торнер, X. Альм // Онтогенез. -2001. Т. 32, № 2. - С. 140-147.

13. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М.: Высш. шк., 1990. - 352 с.

14. Лебедева, И.Ю. Лактогенные рецепторы на клетках гранулезы коров / И.Ю. Лебедева, В.А. Лебедев, В.А. Федосимов, Т.И. Кузьмина // Биохимия. 1994. - Т. 59, № 7. - С. 1062-1066.

15. Лебедева, И.Ю. Влияние пролактина на синтез ДНК в культивируемых клетках гранулезы коров / И.Ю. Лебедева, Т.И. Кузьмина, Т.А. Гойло // Цитология. 1995. - Т. 37, № 3. - С. 220-226.

16. Лебедева, И.Ю. Взаимная модуляция регуляторного действия пролактина и соматотропина на синтез ДНК в клетках гранулезы коров / И.Ю. Лебедева, Т.И. Кузьмина, В.А. Лебедев, Т.А. Гойло // Цитология. 2000. - Т. 42, № 5. - С. 468-472.

17. Лебедева, И.Ю. Характеристика соматотропин- и пролактинсвязы-вающих участков на клетках гранулезы коров при использовании гомологичных гормонов / И.Ю. Лебедева, В.А. Лебедев, Т.И. Кузьмина // Биохимия. -2001.-Т. 66, Вып. 9.-С. 1188-1194.

18. Лебедева, И.Ю. Влияние соматотропина, пролактина и инсулина на клетки гранулезы из атретических фолликулов коров / И.Ю. Лебедева, Т.И. Кузьмина, Т.В. Кибардина и др. // Росс, физиол. журн. им. И.М.Сеченова. -2004.-Т. 90, № 10.-С. 1281-1288.

19. Лебедева, И.Ю. Участие клеток гранулезы в опосредовании действия пролактина и соматотропина на ооцит-кумулюсные комплексы коров in vitro / И.Ю. Лебедева, Т.В. Кибардина, Т.И. Кузьмина // Цитология. 2005. -Т. 47, № 10.-С. 882-888.

20. Лебедева, И.Ю. Модуляция пролактином ингибирующего влияния теофиллина на созревание ооцит-кумулюсных комплексов коров in vitro / И.Ю. Лебедева, О.С. Скотта, Т.И. Кузьмина // Цитология. 2006. - Т. 48, № 12.-С. 1010-1015.

21. Скотги, О.С. Реализация действия пролактина на мейоз ооцитов коров: автореф. дис.канд. биол. наук: 03.00.15: защищена 25.04.2008 / Скотги Ольга Сергеевна. СПб-Пушкин, 2008. 20 с.

22. Смирнова, О.В. Короткие формы мембранных рецепторов: образование и роль в проведении гормонального сигнала / О.В. Смирнова, Р.Л. Бо-горад // Биохимия. 2004. - Т. 69, Вып. 4. - С. 437-452.

23. Смирнова, О.В. Механизмы дискриминации физиологических эффектов пролактина на печень на уровне рецепторного звена гепатоцитов и холангиоцитов / О.В. Смирнова, Р.Л. Богорад // Росс, физиол. журн. им. И.М.Сеченова. -2005. Т. 91, № 2. - С. 184-194.

24. Эрнст, Л.К. Культивирование фолликулярных ооцитов коров / Л.К. Эрнст, А.Л. Янушка, Б.Е. Свиридов и др. // Докл. ВАСХНИЛ. 1979. - № 4. -С. 27-28.

25. Эрнст, Л.К. Нарушение мейоза при культивировании ооцитов коров / Л.К. Эрнст, Б.Е. Свиридов, Л.Д. Галиева и др. // Цитология. 1980. - Т. 22, № 4. - С. 475-477.

26. Adashi, E.Y. The potential role of interleukin-1 in the ovulatory process: an evolving hypothesis / E.Y. Adashi // Mol. Cell. Endocrinol. 1998. -V. 140.-P. 77-81.

27. Aktas, H. Maintenance of bovine oocytes in prophase of meiosis I by high cAMPJi / H. Aktas, M.B. Wheeler, C.F.Jr. Rosenkrans et al. // J. Reprod. Fertil. 1995. - V. 105. - P. 227-235.

28. Aktas, H. Meiotic state of bovine oocytes is regulated by interactions between cAMP, cumulus, and granulosa / H. Aktas, M.L. Leibfried-Rutledge, N.L. First // Mol. Reprod. Dev. 2003. - V. 65. - P. 336-343.

29. Albertini, D.F. Regulation of meiotic maturation in the mammalian oocytes: interplay between exogenous cues and the microtubule cytoskeleton / D.F. Albertini // Bioessays. 1992. - V. 14. - P. 97-103.

30. Avazeri, N. Regulation of spontaneous meiosis resumption in mouse oocytes by various conventional PKC isozymes depends on cellular compartmentali-zation / N. Avazeri, A.M. Courtot, B. Lefevre // J. Cell Sci. 2004. - V. 117. - P. 4969-4978.

31. Ayoub, M.A. Inhibitory effect of bovine follicular fluid on in vitro maturation of bovine oocytes / M.A. Ayoub, A.G. Hunter // J. Dairy Sci. 1993. - V. 76.-P. 95-100.

32. Bachelot, A. Reproductive role of prolactin / A. Bachelot, N. Binart // Reproduction. 2007. - V. 133. - P. 361-369.

33. Baltar, A.E. Bovine cumulus/oocyte complex: quantification of LH/hCG receptors / A.E. Baltar, M.A. Oliveira, M.T. Catanho // Mol. Reprod. Dev. 2000. -V. 55.-P. 433-437.

34. Bartke, A. Role of growth hormone and prolactin in the control of reproduction: What are we learning from transgenic and knock-out animals? / A. Bartke // Steroids. 1999. - V. 64. - P. 598-604.

35. Bell, R.M. Protein kinase С activation by diacylglycerol second messengers / R.M. Bell // Cell. 1986. - V. 45. - P. 631-632.

36. Berlanga, J.J. Prolactin activates tyrosyl phosphorylation of insulin receptor substrate 1 and phosphatidylinositol-3-ОН kinase / J.J. Berlanga, O. Gualil-lo, H. Buteau et al. // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 2050-2052.

37. Bevers, M.M. The role of prolactin during the oestrous cycle in cattle / M.M. Bevers, S.J. Dieleman, T.A. Kruip // Tijdschr. Diergeneeskd. 1988. - V. 113.-P. 1227-1236.

38. Bilodeau, S. The effect of adenylate cyclase stimulation on meiotic resumption and cyclic AMP content of zona-free and cumulus-enclosed bovine oocytes in vitro / S. Bilodeau, M.A. Fortier, M.A. Sirard // J. Reprod. Fertil. 1993. -V. 97.-P. 5-11.

39. Bilodeau-Goeseels, S. Effects of phosphodiesterase inhibitors on spontaneous nuclear maturation and cAMP concentrations in bovine oocytes / S. Bilodeau-Goeseels // Theriogenology. 2003. - V. 60. - P. 1679-1690.

40. Bilodeau-Goeseels, S. Effects of adenosine monophosphate-activated kinase activators on bovine oocyte nuclear maturation in vitro / S. Bilodeau-Goeseels, M. Sasseville, C. Guillemette, F.J. Richard // Mol. Reprod. Dev. 2007. -V. 74.-P. 1021-1034.

41. Binart, N. A short form of the prolactin (PRL) receptor is able to rescue mammopoiesis in heterozygous PRL receptor mice / N. Binart, P. Imbert-Bollore, N. Baran et al. // Mol. Endocrinol. 2003. - V. 17. - P. 1066-1074.

42. Blondin, P. Manipulation of follicular development to produce develop-mentally competent bovine oocytes / P. Blondin, D. Bousquet, H. Twagiramungu et al. // Biol. Reprod. 2002. - V. 66. - P. 38-43.

43. Bole-Feysot, C. Prolactin (PRL) and its receptor: actions, signal transduction pathways and phenotypes observed in PRL receptor knockout mice / C. Bole-Feysot, V. Goffin, M. Edery et al. // Endocr. Rev. 1998. - V. 19. - P. 225

44. Bos, J.L. Epac: a new cAMP target and new avenues in cAMP research / J.L. Bos // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003. - V. 4. - P. 733-738.

45. Bo wen, J.M. Downregulation of long-form prolactin receptor mRNA during prolactin-induced luteal regression / J.M. Bowen, C.M Telleria, R. Towns, P.L. Keyes // Eur. J. Endocrinol. 2000. - V. 143. - P. 285-292.

46. Braw-Tal, R. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle growth in the bovine ovary / R. Braw-Tal, S. Yossefi // J. Reprod. Fertil. 1997. -V. 109.-P. 165-171.

47. Brunet, S. Cytoskeleton and cell cycle control during meiotic maturation of the mouse oocyte: integrating time and space/ S. Brunet, B. Maro // Reproduction.-2005. V. 130.-P. 801-811.

48. Buccione, R. FSH-induced expansion of the mouse cumulus oophorus in vitro is dependent upon a specific factor (s) secreted by the oocyte / R. Buccione, B.C. Vanderhyden, P.J. Caron, J.J. Eppig // Dev. Biol. 1990. - V. 138. - P. 16-25.

49. Byskov, A.G. Cumulus cells of oocyte-cumulus complexes secrete a meiosis-activating substance when stimulated with FSH / A.G. Byskov, C. Yding Andersen, A. Hossaini, X. Guoliang // Mol. Reprod. Dev. 1997. - V. 46. - P. 296-305.

50. Callesen, H. Preovulatory endocrinology and oocyte maturation in supe-rovulated cattle / H. Callesen, T. Greve, P. Hyttel // Theriogenology. 1986. - V. 43.-P. 1115-1128.

51. Camp, T.A. Cellular localization and hormonal regulation of follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone receptor messenger RNAs in the rat ovary / T.A. Camp, J.O. Rahal, K.E. Mayo // Mol. Endocrinol. 1991. - V. 5. - P. 1405-1417.

52. Christmann, L. MPF components and meiotic competence in growing pig oocytes / L. Christmann, T. Jung, R.M. Moor // Mol. Reprod. Dev. 1994. -V.38.-P. 85-90.

53. Ciereszko, R. Luteotrophic action of prolactin during the early luteal phase in pigs: the involvement of protein kinases and phosphatases / R. Ciereszko, M. Opalka, B. Kaminska et al. // Reprod. Biol. 2001. - V. 1. - P. 62-83.

54. Ciereszko, R. Prolactin signalling in porcine theca cells: the involvement of protein kinases and phosphatases / R. Ciereszko, M. Opalka, B. Kaminska et al. // Reprod. Fertil. Dev. 2003. - V. 15. - P. 27-35.

55. Clarke, D.L. Changes in prolactin receptor expression during pregnancy in the mouse ovary / D.L. Clarke, D.I. Linzer // Endocrinology. 1993. - V. 133. — P. 224-232.

56. Clarke, D.L. Prolactin receptor messenger ribonucleic acid expression in the ovary during the rat estrous cycle / D.L. Clarke, B.J. Arey, D.L Linzer // Endocrinology. 1993. - V. 133. - P. 2594-2603.

57. Clarke, L.A. Expression and localization of prolactin receptor messenger ribonucleic acid in red deer ovary during the estrous cycle and pregnancy / L.A. Clarke, D.C. Wathes, H.N. Jabbour // Biol. Reprod. 1997. - V. 57. - P. 865-872.

58. Conti, M. Role of cyclic nucleotide signaling in oocyte maturation / M.

59. Conti, C.B. Andersen, F. Richard et al. // Mol. Cell. Endocrinol. 2002. - V. 187. -P. 153-159.

60. Cran, D.G. Qualitative and quantitative structural changes during pig oocyte maturation / D.G. Cran // J. Reprod. Fertil. 1985. - V. 74. - P. 237-245.

61. Cran, D.G. Cortical granules during oocyte maturation and fertilization / D.G. Cran //J. Reprod. Fertil. Suppl. 1989. - V. 38. - P. 49-62.

62. Crosby, J. Changes in protein phosphorylation during the maturation of mammalian oocytes in vitro / J. Crosby, J. Osborn, R. Moor // J. Exp. Zool. — 1984.-V. 229.-P. 459-466.

63. Crozet, N. Nucleolar structure and RNA synthesis in mammalian oocytes /N. Crozet // J. Reprod. Fertil. Suppl. 1989. - Y. 38. - P. 9-16.

64. Demura, R. Prolactin interacts with gonadotropin through a suppression of c-AMP production probably as a LH-sensitive adenylate cyclase inhibitor / R. Demura, T. Suzuki, H. Komatsu et al. // Endocrinol. Japon. 1986. - V. 33. - P. 29-33.

65. Di Rosa, M. Prolactin induces chitotriosidase expression in human macrophages through PTK, PI3-K, and МАРК pathways / M. Di Rosa, A.M. Zambi-to, A.R. Marsullo et al. // J. Cell. Biochem. 2009. - V. 107. - P. 881-889.

66. Dieleman, S.J. Effects of in vivo prematuration and in vivo final maturation on developmental capacity and quality of pre-implantation embryos / S.J. Dieleman, P.J.M. Hendriksen, D. Viuf et al. // Theriogenology. 2002. - V. 57. - P. 5-20.

67. Doldi, N. Treatment versus no treatment of transient hyperprolactinemia in patients undergoing intracytoplasmic sperm injection programs / N. Doldi, E. Papaleo, L. De Santis, A. Ferrari // Gynecol. Endocrinol. 2000. - V. 14. - P. 437-441.

68. Donovan, P.J. Migratory and postmigratory mouse primordial germ cells behave differently in culture / P.J. Donovan, D. Stott, L.A. Cairns et al. // Cell. -1986.-V. 44.-P. 831-838.

69. Downs, S.M. Protein kinase С and meiotic regulation in isolated mouse oocytes / S.M. Downs, J. Cottom, M. Hunzicker-Dunn // Mol. Reprod. Dev. -2001.-V. 58. P. 101-115.

70. Duan, W.R. Cloning and characterization of an ovarian-specific protein that associates with the short form of the prolactin receptor / W.R. Duan, D.I.H. Linzer, G. Gibori // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 15602-15607.

71. Ducibella, T. Quantification and localization of cortical granules during oogenesis in the mouse / T. Ducibella, P. Duffy, J. Buetow // Biol. Reprod. 1994. -V. 50.-P. 467-473.

72. Duckworth, B.C. G2 arrest in Xenopus oocytes depends on phosphorylation of cdc25 by protein kinase A / B.C. Duckworth, J.S. Weaver, J.V. Ruderman //

73. PNAS. -2002. V. 99.-P. 16794-16799.

74. Duranthon, V. The developmental competence of mammalian oocytes: a convenient but biologically fuzzy concept / V. Duranthon, J.P. Renard // Therioge-nology. 2001. - V. 55. - P. 1277-1289.

75. Dusza, L. Role of prolactin in the regulation of ovarian function in pigs / L. Dusza, J.E. Tilton //J. Reprod. Fert. Suppl. 1990. - V. 40. - P. 33-45.

76. Eppig, J.J. Murine oocytes suppress expression of luteinizing hormone receptor messenger ribonucleic acid by granulosa cells / J.J. Eppig, K. Wiggles-worth, F.L. Pendola, Y. Hirao // Biol. Reprod. 1997. - V. 56. - P. 976-984.

77. Eppig, J,J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals / J.J. Eppig // Reproduction. 2001. - V. 122. - P. 829-838.

78. Erickson, B.H. Development and senescence of the postnatal bovine ovary / B.H. Erickson // J. Anim. Sci. 1966. - V. 25. - P. 800-805.

79. Erickson, G.F. FSH induction of functional LH receptors in granulosa cells cultured in a chemically defined medium / G.F. Erickson, C. Wang, A.J. Hsueh // Nature. 1979. - V. 279. - P. 336-338.

80. Erikson, E. Biochemical characterization of the p34cdc2 protein kinase component of purified maturation-promoting factor from Xenopus eggs / E. Erik-son, J.L. Mailer// J. Biol. Chem. 1989. - V. 264. - P. 19577-19582.

81. Espey, L.L. Current status of the hypothesis that mammalian ovulation is comparable to an inflammatory reaction / L.L. Espey // Biol. Reprod. 1994. - V. 50.-P. 233-238.

82. Fair, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity / T. Fair, P. Hyttel, T. Greve // Mol. Reprod. Dev. -1995.-V. 42.-P. 437-442.

83. Fair, T. Follicular oocyte growth and acquisition of developmental competence / T. Fair // Anim. Reprod. Sci. 2003. - V. 78. - P. 203-216.

84. Fan, H.Y. Inhibitory effects of cAMP and protein kinase С on meiotic maturation and MAP kinase phosphorylation in porcine oocytes / H.Y. Fan, M.Y. Li, C. Tong et al. // Mol. Reprod. Dev. 2002. - V. 63. - P. 480-487.

85. Fassi-Fihri, N. Critical effect of granulosa cells from preovulatory follicles on IVM, IVF and embryonic development in cattle / N. Fassi-Fihri, D. Chu-pin, B. Marquant Le Guienne, M. Thibier // Theriogenology. 1991. - V. 35. - P. 198.

86. Fortune, J.E. Prolactin modulates steroidogenesis by rat granulosa cells: II. Effects on estradiol / J.E. Fortune, R.N. Wissler, S.E. Vincent // Biol. Reprod. -1986.-V. 35.-P. 92-99.

87. Fresno Vara, J.A. Stimulation of c-Src by prolactin is independent of Jak2 / J.A. Fresno Vara, M.V. Carretero, H. Geronimo et al. // Biochem. J. 2000. -V. 345, Pt. l.-P. 17-24.

88. Fulka, J.Jr. The fall of biological maturation promoting factor (MPF) and histone HI kinase activity during anaphase and telophase in mouse oocytes / J.Jr. Fulka, T. Jung, R.M. Moor // Mol. Reprod. Dev. 1992. - V. 32. - P. 378-382.

89. Gautier, J. Purified maturation promoting factor contains the product of a Xenopus homolog of the fission yeast cell cycle control gene cdc2 / J. Gautier, C. Norbuiy, M. Lohka // Cell. 1988. - V. 54. - P. 433-439.

90. Gilchrist, R.B. Mouse oocyte mitogenic activity is developmentally coordinated throughout folliculogenesis and meiotic maturation / R.B. Gilchrist, L.J. Ritter, D.T. Armstrong // Dev. Biol. 2001. - V. 240. - P. 289-298.

91. Gilchrist, R.B. Oocyte-somatic cell interactions during follicle development in mammals / R.B. Gilchrist, L.J. Ritter, D.T. Armstrong // Anim. Reprod.

92. Sci. -2004. V. 82-83.-P. 431-446.

93. Gosden, R.G. Ovulation 1: Oocyte develoment throughout life / R.G. Gosden // Gametes The oocyte. V. 3. Eds: J.G. Grudzinskas, J.L. Yovich. - Cambridge: Cambridge University Press, 1995. - P. 119-149.

94. Guraya, S.S. Biology of ovarian follicles in mammals / S.S. Guraya. -Berlin- Heidelberg: Springer Verlag, 1985. - 320 p.

95. Hashimoto, N. Regulation of meiotic metaphase by a cytoplasmic maturation-promoting factor during mouse oocyte maturation / N. Hashimoto, T. Ki-shimoto // Dev. Biol. 1988. - V. 126. - P. 242-252.

96. Hashimoto, S. Application of in vitro maturation to assisted reproductive technology / S. Hashimoto // J. Reprod. Dev. 2009. - V. 55. - P. 1-10.

97. Hillier, S.G. Gonadotropic control of ovarian follicular growth and development / S.G. Hillier // Mol. Cell. Endocrinol. 2001. - V. 179. - P. 39-46.

98. Hinrichs, K. Manipulation of oocyte maturation in vitro / K. Hinrichs // Arch. Anim. Breed. 1996. - V. 39, Special issue. - P. 43-50.

99. Нота, S.T. Neomycin, an inhibitor of phosphoinositide hydrolysis, inhibits the resumption of bovine oocyte spontaneous meiotic maturation / S.T.

100. Нота // J. Exp. Zool. 1991. - V. 258. - P. 95-103.

101. Hu, Z.Z. Isolation and characterization of two novel forms of the human prolactin receptor generated by alternative splicing of a newly identified exon 11 / Z.Z. Hu, J. Meng, M.L. Dufau // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - P. 4108641094.

102. Hu, Z.Z. Complex 5' genomic structure of the human prolactin receptor: multiple alternative exons 1 and promoter utilization / Z.Z. Hu, L. Zhuang, J. Meng et al. // Endocrinology. 2002. - V. 143. - P. 2139-2142.

103. Huang, K.T. Paradigm-shifters: phosphorylated prolactin and short prolactin receptors / K.T. Huang, E. Ueda, Y.H. Chen, A.M. Walker // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 2008. - V. 13. - P. 69-79.

104. Hunzicker-Dunn, M. FSH signaling pathways in immature granulosa cells that regulate target gene expression: branching out from protein kinase A / M. Hunzicker-Dunn, E.T. Maizels // Cell. Signal. 2006. - V. 18. - P. 1351-1359.

105. Hyttel, P. Ultrastructure of in-vitro oocyte maturation in cattle / P. Hyttel, K.P. Xu, S. Smith, T. Greve // J. Reprod. Fertil. 1986. - V. 78. - P. 615-625.

106. Hyttel, P. Oocyte growth, capacitation and final maturation in cattle / P. Hyttel, T. Fair, IT. Callesen, T. Greve // Theriogenology. 1997. - V. 47. - P. 2332.

107. Ihle, J.N. STATs and MAPKs: obligate or opportunistic partners in signaling / J.N. Ihle // Bioessays. 1996. - V. 18. - P. 95-98.

108. Ihle, J.N. Jaks and Stats in signaling by the cytokine receptor superfa-mily / J.N. Ihle, I.M. Kerr // Trends Genet. 1995. - V. 11. - P. 69-74.

109. Ikeda, S. Apoptosis in cumulus cells during in vitro maturation of bovine cumulus-enclosed oocytes / S. Ikeda, H. Imai, M. Yamada // Reproduction. -2003.-V. 125.-P. 369-376.

110. Jabbour, H.N. Prolactin receptor subtypes: a possible mode of tissue specific regulation of prolactin function / H.N. Jabbour, P.A. Kelly // Rev. Reprod. 1997. -V. 2.-P. 14-18.

111. Jaken, S. Protein kinase С isozymes and substrates / S. Jaken // Curr. Opin. Cell. Biol.-1996.-V. 8.-P. 168-173.

112. Jinno, M. A therapeutic role of prolactin supplementation in ovarian stimulation for in vitro fertilization: the bromocriptine-rebound method / M. Jinno, Y. Katsumata, T. Hoshiai et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1997. - V. 82. - P. 3603-3611.

113. Joyce, I.M. Comparison of GDF-9 and oocyte regulation of kit ligand expression in mouse ovarian follicles / I.M. Joyce, A.T. Clark, F.L. Pendola, J.J. Eppig // Biol. Reprod. 2000. - V. 63. - P. 1669-1675.

114. Kane, M.T. A review of in vitro gamete maturation and embryo culture and potential impact on future animal biotechnology / M.T. Kane // Anim. Reprod. Sci.-2003. V. 79.-P. 171-190.

115. Kawagoe, S. Further evidence that prolactin controls the prepubertal sexual development in the female rat / S. Kawagoe, M. Hiroi // Gynecol. Obstet.1.vest. 1989. - V. 27. - P. 197-200.

116. Kavvagoe, S. Involvement of prolactin in the control of follicular maturation / S. Kawagoe, M. Hiroi // Gynecol. Obstet. Invest. 1990. - V. 29. - P. 5155.

117. Keefer, C.L. Bovine embryo development in vitro: effect of in vitro maturation conditions on fertilization and blastocyst development / C.L. Keefer, S.L. Stice, M. Maki-Laurila // Theriogenology. 1991. - V. 35. - P. 223.

118. Kelly, P.A. The prolactin/growth hormone receptor family // P.A. Kelly, J. Djiane, M.C. Postel-Vinay, M. Edery // Endocr. Rev. 1991. - V. 12. -P. 235-251.

119. Kiapekou, E. Prolactin receptor mRNA expression in oocytes and preimplantation mouse embryos / E. Kiapekou, D. Loutradis, E. Patsoula et al. // Reprod. Biomed. Online. 2005. - V. 10. - P. 339-346.

120. Kiapekou, E. Effect of prolactin in the absence of hCG on maturation, fertilization, and embryonic development of in vitro matured mouse oocytes / E. Kiapekou, E. Zapanti, G. Mastorakos et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2006. - V. 1092.-P. 450-459.

121. Kidder, G.M. Gap junctions and ovarian folliculogenesis / G.M. Kidder, A.A. Mhawi // Reproduction. 2002. - V. 123. - P. 613-620.

122. Kinoshita, H. Expression of ovarian prolactin receptor in relation to hormonal changes during induction of ovulation in the rat / H. Kinoshita, T. Yasui, K. Ushigoe et al. // Gynecol. Obstet. Invest. 2001. - V. 52. - P. 132-138.

123. Krasnow, J.S. Regulation of aromatase messenger RNA and estradiol biosynthesis in rat ovarian granulosa and luteal cells by prolactin / J.S. Krasnow, G.L. Hickey, J.S. Richards // Mol. Endocrinol. 1990. - V. 4. - P. 13-21.

124. Kruip, T.A. Structural changes in bovine oocytes during final maturation in vivo / T.A. Kruip, D.G. Cran, Т.Н. Van Beneden, S.J. Dieleman // Gamete Res.-1983.-V. 8.-P. 29-47.

125. Kubelka, M. Time sequence of germinal vesicle breakdown in pig oocytes after cycloheximide and p-aminobenzamidine block / M. Kubelka, J. Motlik,

126. J.J. Fulka et al. // Gamete Res. 1988. - V. 19. - P. 423-431.

127. Kuwana, T. Active locomotion of human primordial germ cells in vitro / T. Kuwana, T. Fujimoto // Anat. Rec. 1983. - V. 204. - P. 21-25.

128. Kuzmina, T.I. Effects of prolactin on intracellular stored calcium in the course of bovine oocyte maturation in vitro / T.I. Kuzmina, I.Yu. Lebedeva, H. Torner et al. // Theriogenology. 1999. - V. 51. - P. 1363-1374.

129. Levesque, J.T. Resumption of meiosis is initiated by the accumulation of cyclin В in bovine oocytes / J.T. Levesque, M.A. Sirard // Biol. Reprod. 1996. -V. 55.-P. 1427-1436.

130. Li, R. Oocyte-secreted factor(s) determine functional differences between bovine mural granulosa cells and cumulus cells / R. Li, R.J. Norman, D.T. Armstrong, R.B. Gilchrist // Biol. Reprod. 2000. - V. 63. - P. 839-845.

131. Liu, Y.X. Prolactin delays gonadotrophin-induced ovulation and down-regulates expression of plasminogen-activator system in ovary / Y.X. Liu, X.R. Peng, Y.J. Chen et al. // Flum. Reprod. 1997. - V. 12. - P. 2748-2755.

132. Lu, K.H. Pregnancy established in cattle by transfer of embryos derived from in vitro fertilization of oocytes matured in vitro / K.H. Lu, I. Gordon, M. Gallagher, H. McGovern // Vet. Rec. 1987. - V. 121. - P. 259-260.

133. Lussier, J.G. Growth rates of follicles in the ovary of the cow / J.G. Lussier, P. Matton, J.J. Dufour // J. Reprod. Fertil. 1987. - V. 81. - P. 301-307.

134. Magoffin, D.A. Primary culture of differentiating ovarian androgen-producing cells in defined medium / D.A. Magoffin, G.F. Erickson // J. Biol. Chem. 1982. - V. 257. - P. 4507-4513.

135. Markstrom, E. Survival factors regulating ovarian apoptosis dependence on follicle differentiation / E. Markstrom, E.C. Svensson, R. Shao et al. // Reproduction. - 2002. - V. 123. - P. 23-30.

136. Masui, Y. Oocyte maturation / Y. Masui, H.J. Clarke // Int. Rev. Cytol.- 1979. V. 57. - P. 185-282.

137. Mattioli, M. Transduction mechanisms for gonadotropin-induced oocyte maturation / M. Mattioli // Zygote. 1994. - V. 2. - P. 347-349.

138. Mattioli, M. Molecular aspects of gonadotropin-induced oocyte maturation / M. Mattioli // Arch. Animal Breeding. 1996. - V. 39. - P. 31-41.

139. Mattioli, M. Calcium elevation in sheep cumulus-oocyte complexes after luteinising hormone stimulation / M. Mattioli, L. Gioia, B. Barboni // Mol. Reprod. Dev. 1998. - V. 50. - P. 361-369.

140. Mattioli, M. Expanded cumuli induce acrosome reaction in boar sperm / M. Mattioli, P. Lucidi, B. Barboni // Mol. Reprod. Dev. 1998. -V. 51. - P. 445453.

141. Mattioli, M. Signal transduction mechanism for LH in the cumulusoocyte complex / M. Mattioli, B. Barboni // Mol. Cell. Endocrinol. 2000. - V. 161.-P. 19-23.

142. Mayes, M.A. Effect of type 3 and type 4 phosphodiesterase inhibitors on the maintenance of bovine oocytes in meiotic arrest / M.A. Mayes, M.A. Sirard // Biol. Reprod. 2002. - V. 66. - P. 180-184.

143. McNatty, K.P. Relationship between plasma prolactin and the endocrine microenvironment of the developing human antral follicle / K.P. McNatty // Fertil. Steril. 1979. - V. 32. - P. 433-438.

144. Meduri, G. Follicle-stimulating hormone receptors in oocytes? // G. Meduri, N. Charnaux, M.A. Driancourt et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002. -V. 87.-P. 2266-2276.

145. Mehlmann, L.M. Stops and starts in mammalian oocytes: recent advances in understanding the regulation of meiotic arrest and oocyte maturation / L.M. Mehlmann // Reproduction. 2005. - V. 130. - P. 791-799.

146. Mellado, M. Conformational changes required in the human growth hormone receptor for growth hormone signaling / M. Mellado, J.M. Rodriguez-Frade, L. Kremer et ai. // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 9189-9196.

147. Mendes, M.C. Effect of transitory hyperprolactinemia on in vitro fertilization of human oocytes / M.C. Mendes, R.A. Ferriani, M.M. Sala et al. // J. Reprod. Med. 2001. - V. 46. - P. 444-450.

148. Merton, J.S. Factors affecting oocyte quality and quantity in commercial application of embryo technologies in the cattle breeding industry /J.S. Merton, A.P.W. de Roos, E. Mullaart et al. // Theriogenology. 2003. - V. 59. - P. 651-674.

149. Monniaux, D. Growth factors and antral follicular development in domestic ruminants / D. Monniaux, P. Monget, N. Besnard et al. // Theriogenology. -1997.-V. 47.-P. 3-12.

150. Moor, R. Maturation of pig oocytes in vivo and in vitro / R. Moor, Y. Dai//Reprod. Suppl.-2001. V. 58.-P. 91-104.

151. Moses, R.M. Cytostatic factor (CSF) in the eggs of Xenopus laevis / R.M. Moses, Y. Masui // Exp. Cell. Res. 1989. - V. 185. - P. 271-276.

152. Murray, A.W. The role of cyclins synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity / A.W. Murray, M.J. Solomon, M.W. Kirschner // Nature. 1989. - V. 339. - P. 280-286.

153. Murray, A.W. Creative blocks: cell-cycle checkpoints and feedback controls / A.W. Murray // Nature. 1992. - V. 359. - P. 599-604.

154. Murray, S.C. Regulation of granulosa cell-derived ovarian metallopro-teinase inhibitors) by prolactin / S.C. Murray, S.C. Keeble, K.N. Muse, Т.Е. Curry // J. Reprod. Fertil. 1996. - V. 107. - P. 103-108.

155. Nagai, T. The improvement of in vitro maturation systems for bovine and porcine oocytes / T. Nagai // Theriogenology. 2001. - V. 55. - P. 1291-1301.

156. Natraj, U. Hormonal regulation, localization, and functional activity of the progesterone receptor in granulosa cells of rat preovulatory follicles / U. Natraj, J.S. Richards // Endocrinology. 1993. - V. 133. - P. 761-769.

157. Nimrod, A. A specific FSH receptor in rat granulosa cells: properties of binding in vitro / A. Nimrod, G.F. Erickson, K.J. Ryan // Endocrinology. 1976. -V. 98.-P. 56-64.

158. Norbury, C. Regulatory phosphorylation of the p34cdc2 protein kinase in vertebrates / C. Norbury, J. Blow, P. Nurse // EMBO J. 1991. - V. 10. - P. 3321-3329.

159. Nurse, P. Universal control mechanism regulating the onset of M-phase / P. Nurse // Nature. 1990. - V. 344. - P. 503-508.

160. Otsuka, F. Biological function and cellular mechanisms of bone mor-phogenetic protein-6 in the ovary / F. Otsuka, R.K. Moore, S. Shimasaki // J. Biol. Chem. -2001. V. 276. - P. 32889-32895.

161. Parrish, J.J. Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen / J J. Parrish, J.L. Susko-Parrish, M.L. Leibfried-Rutledge et al. // Theriogenology. -1986.-V. 25.-P. 591-600.

162. Peng, X.R. Localization of luteinizing hormone receptor messenger ribonucleic acid expression in ovarian cell types during follicle development and ovulation / X.R. Peng, A.J. Hsueh, P.S. LaPolt et al. // Endocrinology. 1991. - V. 129. - P. 3200-3207.

163. Perks, C.M. Prolactin acts as a potent survival factor against C2-ceramide-induced apoptosis in human granulosa cells / C.M. Perks, P.V. New-comb, M. Grohmann et al. // Hum Reprod. 2003. V. 18. - P. 2672-2677.

164. Picazo, R.A. Cellular localization and changes in expression of prolactin receptor isoforms in sheep ovary throughout the estrous cycle / R.A. Picazo, J.P. Garcia Ruiz, J. Santiago Moreno et al. // Reproduction. 2004. - V. 128. - P. 545-553.

165. Picton, H.M. Activation of follicle development: the primordial follicle / H.M. Picton // Theriogenology. 2001. - V. 55. - P. 1193-1210.

166. Qazi, A.M. Ligand-independent homo- and heterodimerization of human prolactin receptor variants: inhibitory action of the short forms by heterodimerization / A.M. Qazi, C.H. Tsai-Morris, M.L. Dufau // Mol. Endocrinol. 2006.1. V. 20.-P. 1912-1923.

167. Rajakoski, E. The ovarian follicular system in sexually mature heifers with special reference to seasonal, cyclical and left-right variations / E. Rajakoski // Acta Endocrinol. Suppl. (Copenh.) 1960. - V. 52. - P. 1-68.

168. Ravindranath, N. Vascular endothelial growth factor messenger ribonucleic acid expression in the primate ovary / N. Ravindranath, L. Little-Ihrig, H.S. Phillips et al. // Endocrinology. 1992. - V. 131. - P. 254-260.

169. Richard, F.J. Effect of follicular cells on oocyte maturation. I: Effects of follicular hemisections on bovine oocyte maturation on vitro / F.J. Richard, M.A. Sirard I I Biol. Reprod. 1996. - V. 54. - P. 16-21.

170. Richards J.S. Molecular mechanisms of ovulation and luteinization / J.S. Richards, D.L. Russell, R.L. Robker et al. // Mol. Cell. Endocrinol. 1998. -V. 145.-P. 47-54.

171. Roche, J.F. Control and regulation of folliculogenesis a symposium in perspective / J.F. Roche // Rev. Reprod. - 1996. - V. 1. - P. 19-27.

172. Rolland, R. Demonstration of a specific receptor for prolactin in porcine granulosa cells / R. Rolland, J.M. Hammond // Endocr. Res. Commun. -1975.-V. 2.-P. 281-298.

173. Ronen-Fuhrmann, T. Spatio-temporal expression patterns of steroidogenic acute regulatory protein (StAR) during follicular development in the rat ovary / T. Ronen-Fuhrmann, R. Timberg, S.R. King et al. // Endocrinology.1998.-V. 139.-P. 303-315.

174. Roy, S.K. Radioreceptor and autoradiographic analysis of FSH, hCG and prolactin binding sites in primary to antral hamster follicles during the peri-ovulatory period / S.K. Roy, S.C. Wang, G.S. Greenwald // J. Reprod. Fertil. -1987.-V. 79.-P. 307-313.

175. Roy, S.K. In vitro effects of follicle-stimulating hormone, luteinizing hormone, and prolactin on follicular deoxyribonucleic acid synthesis in the hamster / S.K. Roy, G.S. Greenwald // Endocrinology. 1988. - V. 122. - P. 952-958.

176. Riisse I. Oogenesis in cattle and sheep /1. Riisse // Bibl. Anat. 1983. -V. 24.-P. 77-92.

177. Russell, D.L. Differentiation-dependent prolactin responsiveness and stat (signal transducers and activators of transcription) signaling in rat ovarian cells / D.L. Russell, J.S. Richards // Mol. Endocrinol. 1999. - V. 13. - P. 2049-2064.

178. Sagata, N. The c-mos proto-oncogene product is a cytostatic factor responsible for meiotic arrest in vertebrate eggs / N. Sagata, N. Watanabe, G.F. Vande Woude, Y. Ikawa // Nature. 1989. - V. 342. - P. 512-518.

179. Sagirkaya, H. Developmental potential of bovine oocytes cultured in different maturation and culture conditions / H. Sagirkaya, M. Misirlioglu, A. Kaya et al. // Anim. Reprod. Sci. 2007. - V. 101. - P. 225-240.

180. Sakaguchi, K. Differential regulation of prolactin receptor mRNA expression in rat liver and' kidney by testosterone and oestradiol / K. Sakaguchi, T. Ohkubo, T. Sugiyama et al. // J. Endocrinol. 1994. - V. 143. - P. 383-392.

181. Schindler, C. Cytokine signal transduction / C. Schindler // Receptor. -1995.-V. 5.-P. 51-62.

182. Schuetz, A.W. Alterations in the cell cycle of mouse cumulus granulosa cells during expansion and mucification in vivo and in vitro / A.W. Schuetz, D.G. Whittingham, R. Snowden // Reprod. Fertil. Dev. 1996. - V. 8. - P. 935-943.

183. Schuler, L.A. Prolactin receptor heterogeneity in bovine fetal and maternal tissues / L.A. Schuler, R.J. Nagel, J. Gao et al. // Endocrinology. 1997. -V. 138.-P. 3187-3194.

184. Shibaya, M. Bovine corpus luteum as an extrapituitary site of prolactin production / M. Shibaya, S. Murakami, Y. Tatsukawa et al. // Mol. Reprod. Dev. -2006.-V. 73.-P. 512-519.

185. Shimada, M. Roles of cAMP in regulation of both MAP kinase and p34 (cdc2) kinase activity during meiotic progression, especially beyond the MI stage / M. Shimada, T. Terada // Mol. Reprod. Dev. 2002. - V. 62. - P. 124-131.

186. Shitsukawa, K. Cloning and characterization of the cGMP-inhibited phosphodiesterase PDE3A expressed in mouse oocyte / K. Shitsukawa, C.B. Andersen, F.J. Richard et al. // Biol. Reprod. 2001. - V. 65. - P. 188-196.

187. Sirard, M.A. In vitro inhibition of oocyte nuclear maturation in the bovine / M.A. Sirard, N.L. First // Biol. Reprod. 1988. - V. 39. - P. 229-234.

188. Sirard, M.A. Timing of nuclear progression and protein synthesis necessary for meiotic maturation of bovine oocytes / M.A. Sirard, H.M. Florman, M.L. Leibfried-Rutledge et al. // Biol. Reprod. 1989. - V. 40. - P. 1257-1263.

189. Sirard, M.A. Resumption of meiosis: mechanism involved in meiotic progression and its relation with developmental competence / M.A. Sirard // Theriogenology.-2001.-V. 55.-P. 1241-1254.

190. Sirard, M.A. In vivo and in vitro effects of FSH on oocyte maturation and developmental competence / M.A. Sirard, S. Desrosier, A. Assidi // Theriogenology. 2007. - V. 68, Suppl. 1. - P. 71-76.

191. Sjogren, A. Prolactin and gonadotrophs interactions on progesterone formation in cultured human granulosa cells / A. Sjogren, T. Hillensjo, P. Roos, L. Hamberger // Hum. Reprod. 1988. - V. 3. - P.601-605.

192. Slomczynska, M. Prolactin binding analysis and immunohistochemical localization of prolactin receptor in porcine ovarian cells / M. Slomczynska, E. Gregoraszczuk, K. Kochman, S. Stoklosowa // Endocr. J. 2001. - V. 48. - P. 7180.cdc2

193. Solomon, M.J. Cyclin activation of p34 / M.J. Solomon, M. Glotzer, Т.Н. Lee et al. // Cell. 1990. -V. 63. - P. 1013-1024.

194. Sunderland, S.J. Selection, dominance and atresia of follicles during the oestrous cycle of heifers / S.J. Sunderland, M.A. Crowe, M.P. Boland et al. // J. Reprod. Fertil. 1994. - V. 101. - P. 547-555.

195. Szollosi, D. The nuclear envelope: its breakdown and fate in mammalian oogonia and oocytes / D. Szollosi, P. Calarco, R. Donahue // Anat. Rec. -1972.-V. 174.-P. 325-339.

196. Tarkowski, A.K. An air-drying method for chromosome preparations from mouse eggs / A.K. Tarkowski // Cytogenetics. 1966. - V. 5. - P. 394-400.

197. Thomas, R.E. Differential effects of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors on bovine oocyte meiotic maturation / R.E. Thomas, D.T. Armstrong, R.B. Gilchrist // Dev. Biol. 2002. - V. 244. - P. 215-225.

198. Torner, H. Dynamics of meiosis and protein kinase activities in bovine oocytes correlated to prolactin treatment and follicle size / H. Torner, M. Kubelka, B. Heleil et al. // Theriogenology. 2001. - V. 55. - P. 885-899.

199. Trott, J.F. Tissue-specific regulation of porcine prolactin receptor expression by estrogen, progesterone, and prolactin / J.F. Trott, K.C. Horigan, J.M. Gloviczki et al. // J. Endocrinol. 2009. - V. 202. - P. 153-166.

200. Van den Hurk, R. In vivo and in vitro development of preantral follicles / R. Van den Hurk, M.M. Bevers, J.F. Beckers // Theriogenology. 1997. - V. 47. -P. 73-82.

201. Van den Hurk, R. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiatian and maturation within ovarian follicles / R. van den Hurk, J. Zhao // Theriogenology. 2005. - V. 63. - P. 1717-1751.

202. Van Tol, H.T. Influence of FSH and hCG on the resumption of meiosis of bovine oocytes surrounded by cumulus cells connected to membrana granulosa / H.T. van Tol, M.J. van Eijk, C.L. Mummery et al. // Mol. Reprod. Dev. 1996. -V. 45.-P. 218-224.

203. Van Wezel, I.L. Morphological characterization of bovine follicles and their environment in vivo / I.L. van Wezel, RJ. Rodgers // Biol. Reprod. 1996. -V. 55.-P. 1003-1011.

204. Vanderhyden, B.C. Species differences in the regulation of cumulus expansion by an oocyte-secreted factor (s) / B.C. Vanderhyden // J. Reprod. Fertil. 1993. - V. 98.-P. 219-227.

205. Vanderhyden, B.C. Mouse oocytes regulate granulosa cell steroidogenesis throughout follicular development / B.C. Vanderhyden, E.A. Macdonald // Biol. Reprod. 1998. - V. 59. - P. 1296-1301.

206. Veldhuis, J.D. Divergent effects of prolactin upon steroidogenesis by porcine granulosa cells in vitro: influence of cytodifferentiation / J.D.Veldhuis, P. Klase, J.M. Hammond // Endocrinology. 1980. - V. 107. - P. 42-46.

207. Vlahos, N.P. Prolactin receptor gene expression and immunolocaliza-tion of the prolactin receptor in human luteinized granulosa cells / N.P. Vlahos, E.M. Bugg, M.J. Shamblott et al. // Mol. Hum. Reprod. 2001. - V. 7. - P. 10331038.

208. Vozzi, C. Involvement of connexin 43 in meiotic maturation of bovine oocytes / C. Vozzi, A. Formenton, A. Chanson et al. // Reproduction. 2001. - V. 122.-P. 619-628.

209. Wandji, S.A. FSH and growth factors affect the growth and endocrine function in vitro of granulosa cells of bovine preantral follicles / S.A. Wandji, J.J. Eppig, J.E. Fortune // Theriogenology. 1996. - V. 45. - P. 817-832.

210. Wu, B. Dynamics of maturation-promoting factor and its constituent proteins during in vitro maturation of bovine oocytes / B. Wu, G. Ignotz, W.B. Currie, X. Yang // Biol. Reprod. 1997. - V. 56. - P. 253-259.

211. Wu, X.Q. Translocation of classical PKC and cortical granule exocyto-sis of human oocyte in germinal vesicle and metaphase II stage / X.Q. Wu, X. Zhang, X.H. Li et al. // Acta Pharmacol. Sin. 2006. - V. 27 - P. 1353-1358.

212. Xu, Z. Expression of follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone receptor messenger ribonucleic acids in bovine follicles during the first follicular wave / Z. Xu, H.A. Garverick, G.W. Smith et al. // Biol. Reprod. 1995. - V. 53.-P. 951-957.

213. Yong, E.L. Mediation of gonadotrophin-stimulated growth and differentiation of human granulosa cells by adenosine-3',5'-monophosphate: one molecule, two messages / E.L. Yong, D.T. Baird, S.G. Hillier // Clin. Endocrinol. (Oxf). -1992.-V. 37.-P. 51-58.

214. Yoshimura, Y. Developmemafpotential of rabbit oocyte matured in vitro: the possible contribution of prolactin / Y. Yoshimj/ra, Y. Hosoi, A. Iritani et al. // Biol. Reprod. 1989. - V. 41. - P. 26-33.

215. Yoshimura, Y. Prolactin inhibits ovulation by reducing ovarian plasmin generation / Y. Yoshimura, M. Jinno, T. Oda et al. // Biol. Reprod. 1994. - V. 50. -P. 1223-1230.

216. Zhang, M. Atrial natriuretic peptide inhibits the actions of FSH and forskolin in meiotic maturation of pig oocytes via different signalling pathways / M. Zhang, Y. Tao, B. Zhou et al. / J. Mol. Endocrinol. 2005. - V. 34. - P. 459-472.

Информация о работе

Мормышев, Александр Николаевич
кандидата биологических наук
п. Дубровицы Московской обл., 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Молекулярные и цитологические аспекты участия пролактина в регуляции созревания ооцитов коров - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы