Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РАЗРАБОТКА ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ПРЯМОГО ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИГЕНОВ ВИРУСА КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "РАЗРАБОТКА ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ПРЯМОГО ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИГЕНОВ ВИРУСА КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ"

Л' ЗЇЗ/£

На правах рукописи

УДК 619:616.98:578.833.31:616-074

Васильев Александр Павлович

Разработка твердофазного нммуноферментного анализа для прямого обнаружения антигенов вируса классической чумы

свиней

03.00,06 - Вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Покров - 2005

Работа выполнена в Государствен ном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микрбио-логии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВиМ Россел ьхозакадем и и)

Научные руководи г ел и:

доктор ветеринарных наук, профессор

Куриннов Виктор Васильевич

доктор биологических наук, профессор

Стрижаков Александр Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник доктор биологических наук, старий научный сотрудник

Диев Вячеслав Иванович

Новиков Борис Валентинович

Ведущая организация:

ГНУ ВсеросиВский научно исследовательский институт экспериментальной ветеринарии

Защита состоится 23 июня 2005 г. в 13 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, г. Пкров, Владимирской области, ГНУ ВНИИВВиМ. Тел/факс; (09243)62125. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан » мая 2005 г

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук -

В.Ям2юукова

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность

Несмотря на многолетние усилия, прилагаемые для ликвидации классической чумы свиней (КЧС), болезнь продолжает представлять серьезную угроз* свиноводству во всем мире. Благоприятная эпизоотическая ситуация в России, значительное сокращение числа вспышек классической чумы свиней (9 - в 2002 г. и 6 - в 2003 г.) привели к относительному благополучию страны по КЧС, однако угроза спорадических вспышек болезни, в том числе в крупных свинокомплексах, постоянно существует.

Различные формы течения болезни, циркуляция вируса различной па-тогенности на фоне вакцинированного поголовья свиней, вторичные инфекции приводят к многообразию клинических симптомов, патологоанатом и че-ских изменений, что затрудняет постановку точного диагноза на классическую чуму свиней и оценку истинной эпизоотической ситуации.

Для проведения лабораторных исследований на КЧС применяется метод выделения вируса в культуре клеток с последующей идентификацией иммунофлуоресиенцией, который в настоящее время считается эталонным (OIE, 2000), но его использование возможно только в хорошо оснащенных, вирусологических лабораториях или научных учреждениях (Вишняков И.Ф.,198б).

Для прямого обнаружения вируса непосредственно в патологическом материале используются реакция прямой иммунофлуоресиенции и полиме-разная цепная реакция (ПЦР), однако первый метол обладает невысокой чувствительностью (26-77%) и субъективностью (Куриннов В.В. и соавт. 1993; Ressang A. and Boer J., 1971), а метод ПЦР, хотя и признан весьма полезным диагностическим инструментом, особенно при исследовании аутолнзнрован-ных или цитотоксических проб, пока используется для исследования ограниченного количества проб и в основном для филогенетических исследований полевых изолятов вируса (Stadejek T. 1996),

ЦНБ МСХА фонд научной литературы

В ведущих лабораториях Европейского Союза и США для обнаружения антигена вируса КЧС разработаны несколько вариантов иммунофер-ментного анализа пол разными коммерческими названиями: CHEKiT® CSF-VIRUS (DR.BOMMELI AG, Швейцария), Herd Chek CSFV Ag, (IDEXX, США), SERELISA HCV Ag (RHONE MERIEUX, Франция), однако сведения об их диагностической оценке ограничены, В России были выполнены работы по разработке метода прямого обнаружения специфического антигена вируса, основанного на ингибиции рекомбинантного белка Е2 непрямым жид-кофазным блокирующим вариантом ИФА (Бъядовская О.П. и соавт., 2002), но в ветеринарных лабораториях метод пока не используется.

Таким образом, в связи с очевидной необходимостью решения проблемы мониторинга и ликвидации болезни на территории России, необходим дополнительный, доступный и чувствительный метод прямого обнаружения антигена вируса КЧС в патологическом материале для использования в региональных лабораториях, и особенно, при вспышках КЧС в промышленных свинокомплексах.

1.2. Цель и задачи исследований.

Основной целью исследований являлась разработка метола твердофазного иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител для прямого обнаружения антигенов вируса КЧС в органах и тканях зараженных свиней.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

- получить стабильные клоны гибридом, продуцирующие моноклональ-ные антитела к антигенным детерминантам структурного полипептида Е2 вируса классической чумы свиней;

- отработать методы скрининга моноклональных антител и определить их иммунологическую и полипептидную активность, специфичность, биохимические характеристики;

- определить оптимальные концентрации и условия взаимодействия улавливающих и детектирующих моноклональных антител с антигеном вируса КЧС;

- разработать метод двухсайтового ТФ ИФА для прямого обнаружения антигенов вируса КЧС и определить диагностические объекты для исследования;

- изучить аналитическую и диагностическую чувствительность и специфичность метода двухсайтового ТФ ИФА при исследовании патологического материала от экспериментально заражённых вирусом классической чумы свиней и при вспышках болезни в свинокомплексах.

1.3. Научная новизна.

Получено 9 клонов гибридных клеток, стабильно секретнрующие мо-ноклональные антитела, специфичные к антигенным детерминантам основного структурного полипептнда Е2 вируса КЧС. На основе сэндвич ТФ ИФА усовершенствован способ отбора моноклональных антител для использования в качестве улавливающих и детектирующих структурный полипептид Е2 вируса КЧС,

Разработан метод двухсайтового ТФ ИФА для прямого обнаружения антигена вируса КЧС в лейкоцитах крови инфицированных вирусом КЧС свиней, пригодный для лабораторной диагностики и мониторинга болезни.

Ь4. Практическая значимость и реализация результатов исследований.

На основании результатов апробации в экспериментальных условиях, проведения экспертизы полевого патологического материала и комиссионных испытаний разработанный метод двухсайтового ТФ ИФА рекомендован для лабораторной диагностики КЧС и мониторинга болезни в свинокомплексах.

Результаты исследований стали основой для изготовления Набора препаратов для обнаружения вируса классической чумы свиней методом двухсайтового твердофазного иммуноферментного анализа на основе монокло-

нальных антител. Пригодность разработанного твердофазного иммунофер-ментного анализа для прямого обнаружения антигенов вируса классической чумы свиней подтверждена комиссионными испытаниями и при проведении диагностических исследований на классическую чуму свиней в ГНУ ВНИ-ИВВиМ.

1.5. Апробация работы.

Результаты исследований, выполненных по теме диссертации, доложены и обсуждены на заседаниях учёного совета ГНУ ВНИИВВиМ в 2001-2004 г., Международной научно-практической конференции «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов» (г. Покров 2003)

1.6. Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

1.7. Структура II объём работы

Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения.

Работа содержит 20 таблиц и иллюстрирована 8 рисунками. Список литературы включает 151 источник, из которых 134 зарубежные.

1.8. Основные положения диссертацией но О работы, выдвигаемые на защиту:

- методы получения моноклональных антител к основному структурному поли пептиду Е2 вируса КЧС, оценка их пригодности в качестве диагностических препаратов для иммунохимических реакций;

- отбор и характеристика улавливающих и детектирующих моноклональных антител к разным саГггам полипептида Е2 вируса, как основа разработки метода двухсайтового твердофазного иммуноферментного анализа для прямого обнаружения вируса КЧС

- аналитическая и диагностическая чувствительность и специфичность метода двухсайтового ТФ ИФА, результаты его апробации при исследовании

патологического материала от экспериментально заражённых животных и лабораторной диагностике КЧС.

1.9. Личный вклад соискателя

Основной объём исследований проведём автором самостоятельно. Изучение иммунохимических характеристик моноклональных антител проводились совместно с к.б.н., старшим научным сотрудником Анохиной Е.Г.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.К Материалы и методы

Вирусы. Для получения антигена вируса КЧС, скрининга гибридом и экспериментального заражения свиней использовали вирулентные штаммы "Ши-Мынь" и его клеточно-культуральный вариант "Шн-Мынь-51" (вирус 51-го пассажа в культуре клеток РК-15), с активностью 1060 ККИД^/см3; "Alfort - 187" с активностью JO^-IO65 ККИД50/см3; аттенунрованные (вакцинные) шталшы "ЛК-ВНИИВВиМ" ("J1K-65") и его трофоварнант «Л К-К» с активностью 105,0 ИмДя/см1; палевые изоляты, выделенные при исследовании патологического материала от свиней в период с 2000 по 2003 годы; ре-камбинантный вирус оспооакцины (PeK-K4Q. экс премирующий полипептиды вируса КЧС с активностью Ю10 ТЦД.«/см\

Для оценки специфичности методов использовали антигенно-родственные вирусы жвачных - вирус диареи КРС (штамм "Oregon C^V"), вирус пограничной болезни овец ПБО (штамм "Moredun") и гетерогенные вирусы - вирус болезни Ауески (штамм «Производственный»), вирус болезни Тешена (штамм "Закарпатский").

Вирусы были получены из музея микроорганизмов ГНУ ВНИИВВнМ и Центральной ветеринарной лаборатории (Великобритания).

Животные. Для получения иммунных спленоцитов использовали взрослых мышей линии BALB/c, рожавших самок живой массой 25-30 г, выращенных в питомнике "Столбовая" АМН России. До начала эксперимента животных выдерживали в условиях карантина в течение 14 дней. Кормление осуществляли в соответствии с рационами. Свиней крупной белой породы

различного возраста (от 2 до 6 мес.) и пола, получали из вивария ГНУ ВНИ-ИВВиМ.

Культуры клеток. Для культивирования вируса КЧС, вирусов болезней Ауески и Тешена использовали перевиваемые культуры (слеток почки поросёнка {РК-15, SK-6); вируса диареи КРС -MDBK; вируса ПБО - первичную культуру клеток тесгикул 1-2 месячных ягнят (ТЯ); рекомбннантного вируса осповакцииы (Рек-КЧС) - CV-1, Клетки получали из лаборатории '"Культур клеток с музеем клеточных штаммов" ГНУ ВНИИВВиМ

В качестве партнёра для слияния со спленоцитами иммунизированных мышей использовали миеломную линию клеток Sp 2/0 -Ag 14.1 (Sp 2/0), дефектную по ГГФРТ (НИИБТ МЗ РФ).

Сыворотки. Для поддержания роста гибридных клеток и перевиваемых клеток животных использовали фстальную сыворотку КРС производства фирмы "Sigma" (США, Cat. № F 2442).

Диагностические препараты. Набор препаратов для иммунофлуорешент-нои диагностики классической чумы свиней, изготовленный по ТУ 9388-07900008064-96, серия №5 и №6; конъюгат ПХ-поликлональные антитела КЧС, приготовленный по методу, описанному Saunders G.C. (1976), набор препаратов моноклональных антител для дифференциации пестивирусов иммунопе-роксидазным методом (CEDITEST), любезно предоставленный доктором Терпстра С. (1D-DLO, г. Лелистад, Нидерланды). Смесь моноклон ал ьных антител к El (gp33), Е0 (gp44/48) и Е2 (gp55) вируса КЧС были предоставлены доктором Weiland Е. (Федеральный научно-исследовательский центр вирусных болезней животных, г, Тюбинген, Германия).

С целью очистки и получения антигенов вируса КЧС, культуры клеток SK-6 или РК-15 выращивали в 1,5 литровых роллерных сосудах в среде Игла (MEM) с содержанием 10% фетальнон сыворотки КРС, 100 ел/см3 пенициллина, 100 мкг/см3 стрептомицина. Инфицированную культуру клеток инкубировали при 37°С в течение 16-72 часов (в зависимости от цели). Затем содержимое роллеров дважды замораживал и-оттай вал и, осветляли от кле-

точного детрита центрифугированием при 2000 об/мин в течение 20 мин. Осветлённую вируссодержащую жидкость хранили при температуре минус 70°С до использования.

Титрование вируса проводили в культурах клеток с использованием реакции прямой иммунофлуоресценцин, титр вируса вычисляли по методу Рида-Менча и выражали в клеточн о-культуральных инфекционных дозах (ККИД5с/см3).

Иммунизация мышей. Мышей линии BALB/c, доноров спленоцитов, иммунизировали антигенами вируса КЧС, полученными разными способами с использованием полного и неполного адъюванта Фрейнда и без адъюванта, сочетая сроки и способы введения по различным схемам (Стрижаков A.A., 1994).

Контроль иммунного ответа. Для проверки результатов иммунизации мышей и характера иммунного ответа на антиген, в сыворотках крови мышей определяли уровень специфических антител к вирусу КЧС гистохимическим иммуноферментным анализом (ГХ ИФА), непрямым твердофазном ИФА (ТФ ИФА), реакцией непрямой иммунофлуоресценцин (РНИФ) и РН.

Гибридизация клеток. Слияние клеток проводили по методу Kohler & Milstein (1975) и Wensvoort G. и соавт.(144), В качестве партнера для слияния с B-лимфоцитами из селезенки мыши, иммунной к вирусу КЧС, использовали миеломную линию клеток SP 2/0-Agl4.

Клонирование гибридных клеток и скрининг гибридом. Клонирование гибридных клеток проводили в полужидком агаре. Скрининг гибридом, продуцирующих вирусспецифические моноклональные антитела, проводили через 10 - 15 дней после начала клонообразования три раза с трехдневными интервалами непрямым ТФ ИФА, ГХ ИФА и РНИФ.

Анализ белков проводили в пластинчатых гелях 12x10x0.03 см в прерывистой буферной системе как описано Laemmly U.K. (1970). Электроперенос полипептидов из полиакриламидного геля на нитроцеллюлоз ну ю мембрану осуществляли по методу Kyhse-Anderson (1984),

Определение белка проводили как опнсано Lowry O.H.,et al. (1951)

Приготовление иммунопероксидазных конъюгатов, Использовали модифицированный метод периодатного окисления по Tjtssen Р. (1980). Активность коньюгатов определяли прямым методом ТФ ИФА.

Определение функциональных свойств метода ТФ ИФА.

Для определения функциональных свойств разработанного метода ТФ ИФА (аналитическая и диагностическая чувствительность, специфичность) использовали рекомендации, указанные в руководстве МЭБ (Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines 2000, часть 1.1.3). В качестве эталонного метода, по сравнению с которым проводили расчёты диагностической чувствительности и специфичности, использовали метод ви русо выдел ей и я в культуре клеток РК-15 с последующей иммунофлуоресцентной идентификацией (Методические указания по лабораторной диагностике классической чумы свиней № 13-7-2/809 от 30.12.96 г.).

Диагностическую чувствительность (ДЧ) метода определяли в % по соотношению количества положительных проб (П) к сумме положительных и ложно-отрицательных проб (ИП+JIO), полученных от исследуемых инфицированных животных:

ДЧ = -2-х 100%

м п+ло

Диагностическую специфичность (ДС) метода определяли в % по соотношению количества отрицательных проб (О) к сумме отрицательных и ложно-положительных всех исследуемых благополучных животных (0+ ЛП):

лг- 0 х

д о+лп

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Statgraphics (Version 2.1.).

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Получение антнгенов вируса KMC Для гипериммунизации мышей и отработки методов скрининга гибридом, продуцирующих внрусспецифическне МА, были получены препараты антигенов вируса КЧС (штаммов «Ши-Мынь», «Alfort-187», «ЛК-К») и ре-

комбинантного вируса осповакыины (Рек-КЧС), экспресс и рующего полипептиды вируса КЧС и анти ген и о-ро детве иных пестивирусов, Учитывая известные проблемы получения высокоочишенного вируса КЧС (Laude Н.,1977; Николаева Н.,1983; Moennig V., 1990), для иммунизации мышей и скрининга методом ТФ ИФА брали препараты антигенов в виде очищенного вируса и осветлённых лизатов инфицированных клеток.

Для заражения культуры клеток РК-15 и наработки в и рус содержащего материала использовали кл его ч но-культу рал ьный вариант «Ши-Мынь-51» и штамм «ЛК-К» вакцинного вируса. Для очистки вируса использовали лизат инфицированных клеток, выращенных роллерным способом. Для этого, инфицированный клеточный монослой (множественность заражения 0,01-0,01 К К ИД sc/Hm™,) через 48 часов культивирования механически снимали со стекла, ресуспендировали в фосфатном буферном растворе (ФБР) рН-7,6 и разрушали в гомогенизаторе Даунса (3-5 циклов).

После центри фугирован и я разрушенных клеток при 3000 об/мин в течение 20 минут, над осадок использовали в качестве антигена для гипериммунизации мышей. Осадок ресуспендировали в ФБР и после обработки фреоном ! 13 вирус в полученном экстракте очищали ультацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы (7-35%) при 50000 об/мин в течение 2 часов (Bekman, ротор SW-65). После центрифугирования в каждой фракции градиента определяли инфекционную активность вируса.

Титр вируса в исходном в и руссо держащем материале (концентрат инфицированных клеток РК-15) составил 10м ККИД;о/см3, а после концентрирования и очистки в градиенте сахарозы (фракциях с 19-20%-ным содержанием сахарозы) составил 108'5 ККИД^см5. Удельная активность очишенных препаратов составила I0S! ККИД!0 на 1 мг белка, выход по инфекционности составил П % и практически не зависел от используемого штамма вируса. Очищенный вирус также использовали для иммунизации мышей BALB/c,

Рекомбинанатный вирус осповакцины (Рек-КЧС) культивировали в перевиваемой культуре клеток CV-I во флаконах РУ или в пробирках с стек-

лянными пластинками при множественности заражения 0,01-0,1 ТЦД!№|и1ег1(1 в течение 48-72 часов {до обнаружения признаков ЦПД),

Активность полученных препаратов антигенов вируса КЧС, в том числе и рекомбинантного белка осповакнины, определяли непрямым методом ТФ ИФА с использованием смеси моноклональных антител к белкам Е1 (врЗЗ), Е0 (ёР44/48) и Е2 (ер55).

Установлена корреляция обнаружения вирусспеиифических белков вируса КЧС в виде специфической флуоресценции цитоплазмы инфицированных клеток в зависимости от срока культивирования.

Результаты сравнительного определения инфекционной и антигенной активности полученных препаратов вируса КЧС представлены в табл. 1.

Таблица 1

Результаты определения инфекционной и антигенной активности препаратов

вируса КЧС

Испытуемые антигенные Инфекционная Кониеитрацня Лнтн генная

препараты активность белка (мг/мл) активность

<1йККИД50/см3) ТФ ИФА

ШМ-51 ("л^г РК-15) 6.0±0,5 8 1:1280

Очищенный вирус ШМ-51 7,0±0,5 0,5 1:1280

А1Гог1-187{лтат РК-15) 6,0±0,15 8 1:320

ЛК-К {лнзат ПСГК) 8,5±0_23 7 1:10240

Осповакцина Рек -КЧС (лн- 8,0 ±0,5 9 1:640

зат СУ-Т)

Препараты антигенов вируса КЧС (штаммы «Ши-Мынь -51», А^оп-187», «ЛК-К») и рекомбинантного вируса осповакцины Рек-КЧС использовали для иммунизации мышей и отработки непрямого метода ТФ ИФА, скрининга гибридом, продуцирующих вирусспеиифнческие МА.

2.2.2. Получение гибридом, секретируюших МА к структурным пол »пептидам вируса КЧС

Гиперилииунизация мышей ВАЬВ/с вирусом КЧС и контроль иммунного ответа. 10 мышам ВАЬВ/с антигены вируса КЧС в виде экстракта клеток РК-15, инфицированных штаммом «Ши-Мынь-51», по 0,1 см3 вводили отдельно или сочетано подкожно, внутри брюшин но и внутрнселезёночным способами восемь раз с промежутком 14 дней. Первое введение осуществля-

ли с полным адьювантом Фрейнда, второе и последующие - с неполным адь-ювантом Фрейнда. Бустер-дозу антигенов вводили внутриселезеночно. Лучшие результаты гипериммунизации получены при использовании антигенов в виде осветлённого лизата клеток инфицированных штаммом «Шы-Мынь-51», штаммом «ЛК-К» и лизата клеток С\М, инфицированных Рек- КЧС ос-повакцины. Титр антител в сыворотках крови мышей после полного цикла иммунизации был в непрямом ТФ ИФА 1:1280-1:2560, 1:640 и 1:320, соответственно, В дальнейшей иммунные спленоциты получали от мышей после введения лизата клеток РК-15, инфицированных вирулентным вирусом КЧС «Ши-Мынь -51».

Результаты гибридизации клеток и скрининга гибридом, секретирую-щих монокл ональные антитела к вирусу КЧС. Слияние спленоцитов с клетками мышиной миеломы 5Р-2/0-Ац-14,1 проводили при количественном соотношении 5:1. Полученные гибридные клетки выращивали в ростовой среде ДМЕМ с содержанием 20% фетальной сыворотки КРС, селективных добавок ГАТ и ГТ при температуре 37°С в атмосфере 95%-й влажности и 5%-Й концентрации СО?- Начало клонообразования наблюдали на 7-10 сутки после гибридизации. В результате гибридизации было получено 512 клонов гибридных клеток. Культуральную жидкость каждого клона в объёме 0,05-0,1 см3 отбирали для скрининга, а в лунки вносили недостающее количество ростовой среды.

Скрининг полученных гибридом, секретирующих моноклональные антитела к вирусу КЧС, проводили непрямым методом ТФ ИФА, РНИФ и ГХ-ИФА трёхкратно, исследованием культу рал ьной жидкости каждого полученного клона гибридом на седьмые сутки культивирования с промежутком 3 дня (на 7, 10, 13 сутки). Результаты скрининга представлены в табл. 2. Из данных таблицы видно, что после проведения 3-го скрининга было выявлено только 28 клонов гибридных клеток из 512 полученных, которые продуцировали моноклональные антитела к вирусу КЧС. Содержание моноклональных

Результаты скрининга клонов гибридных клеток непрямым ТФ ИФА

Показатель Номер скрининга

1-й 2-й 3-й

Получено гибридных колоний клеток всего 512

Количество гибридных колоний клеток, продуцирующих моноклональные антитела к антигенам вируса КЧС 48 34 28

Количество гибридных колоний клеток, продуцирующих антитела с не установленной специфичности или не продуцирующие антитела 464 47S 484

% колоний клеток, продуцирующих антитела, специфичные к антигенам вируса КЧС 9,4 6,6 5,5

антител к вирусу КЧС в культуральных жидкостях указанных положительных клонов было также подтверждено РНИФ и ГХ-ИФА,

В результате 3-х кратного клонирования полученных 28 клонов гибридом в полужидком агаре получено 9, стабильно продуцирующих моноклональные антитела к вирусу КЧС (табл. 3)

Клонированные клетки гибридом, секретирующие моноклональные антитела, специфичные к антигенам вируса КЧС, выращивали в 10,0 мл флаконах до концентрации 100 тыс. клеток/см3 и хранили в жидком азоте до использования.

Таблица 3

Активность вирусспецифическнх МА в культуральных жидкостях гибридом, полученных после 3-го клонирования

Методы скрининга

Шифр клона Непрямой ТФ ИФА ГХ ИФА РНИФ

К1 1:320 1:40 1:200

К2 1:320 - -

КЗ 1:640 1:120 1:800

К4 1:640 1:80 1:200

KS 1:320 1:120 1:200

Кб 1:1280 1:240 1:800

К9 1:320 1:120 1:200

K1I 1:640 1:120 1:400

К12 1:320 1:120 1:400

Обозначение (-) - МА не обнаружены.

2.23. Получение препаративных количеств моноклональных антител, определение их активности и специфичности

Взрослым рожавшим самкам BALB/c вводили внутрибрюшикно по 0,5 см5 НАФ и затем, через 3 суток внутри брюшин но 1-2 млн, гибридных клеток клонов KI, К2, КЗ, К4, К5, Кб, К9, К11 и К12 в 2 см1 среды ДМЭМ. Отбор асчитической жидкости проводили на 7-14 сутки после введения гибридом. От каждой мыши получали от 3 до 6 см3 асцита.

Титры антител во фракции выделенных IgG асиитических жидкостей определяли непрямым ТФ ИФА, РНИФ, ГХ ИФА и РН (табл. 4),

Нейтрализующая активность полученных моноклон ал ьных антител установлена только для клонов К11 и КЗ (1:16).

Специфичность монокло нал ьных антител определяли непрямыми ТФ ИФА и ГХ ИФА с использованием антигенов (или инфицированных вирусами клеток), полученных к различным штаммам и полевым изолятам вируса КЧС (Ши-Мынь -51, ЛК - ВНИИВВиМ, Alfort-187, 782, 792, 793, 796, 797, 804), а также антигенно-родственных пестивирусов жвачных ВПБО (штамм Moredun) и ВД КРС (штамм Oregon CMV), а также и гетерологичных вирусов: вирусов болезни Тешена (штамм Закарпатский), болезни Ауески (штамм "Производственный"), Установлено, что моноклональные антитела 6-ти клонов (К 1, КЗ, К4, Кб, К9 и К12) из 9-ти испытуемых реагировали с антигенами всех штаммов и изолятов вируса КЧС и антнгенно-родственных пестивирусов и не вступали в реакции с антигенами гетерогенных вирусов, Моноклональные антитела клона К5 не реагировали с антигенами штамма AI fort-157, полевых изолятов №792, 793 и антигенно-родственных вирусов; клона KI 1 -реагировали с антигенами штамма Alfort-157, но не вступали в реакцию с антигенами полевых изолятов №792, 793 вируса КЧС и антигенно-родственных вирусов.

Титр моноклональных антител к вирусу КЧС во фракции ^О ИАЖ мышей ВАЬВ/с на 7-14 сутки после введения гибридных клеток

Шифр клона Метольг титрования МЛ

Непрямой ТФ ИФА РНИФ ГХ ИФА РН

К1 1:1953125 1:703125 1:140625 -

К2 1:1953125 1:703125 1:140625 -

КЗ 1:1953125 1:703125 1:28125 1:16

К4 1:390625 1:703 i 25 1:28)150 -

К5 1:390625 1:28125 1:5625 -

Кб 1:390625 1:703125 1:140625 -

К9 1:390625 1:140625 1:28125 -

K1I 1:78125 1:28125 1:28125 1:16

К12 1:390625 l: Н0625 1:28125 -

Обозначение: (- > - антитела не обнаружены

Полипептидная специфичность моноклональных антител к вирусу КЧС. Электрофорезом в ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях и им-муноблоттингом установлено, что моноклональные антитела 8 изучаемых клонов связываются с антигенными детерминантами, расположенными на гликопротеине Е2 (gp55) вируса КЧС, моноклональные антитела клона К12 взаимодействовали с гликопротеином мм 71 кДа.

Таким образом, используемая гибридомная технология, включающая использование лнзатов клеток РК-15 с высоким содержанием вируса КЧС (штамм «Ши-Мынь») и трёхуровневым скринингом (непрямой ТФ ИФА, ГХ 11ФА и РНИФ) позволяет получать моноклональные антитела к основному структурному полипептиду Е2 вируса КЧС.

2.2.4. Разработка метода деухсайтоаого ТФ 11ФА для обнаружения антигенов вируса КЧС

С целью разработки двухсайтового ТФ-ИФА были наработаны препаративные количества асцитов моноклональных антител (25-120 мл) всех 9 отобранных клонов (моноклональные антнтела для сенсибилизации твёрдой

фазы и улавливания антигена), а также на их основе были изготовлены 9 соответствующих конъюгатов с пероксидазой хрена (детектирующие монокло-нальные антитела) для обнаружения нммунокомплекса (АТ-АГ). В работе использовали конъюгаты МА-ПХ с активностью в прямом варианте ТФ ИФА не ниже 1:3200,

Определение и отбор улавливающих и детектирующих монокпональ-ных антител

Для выполнения двухсаитового ТФ ИФА необходимо было подобрать пары немеченых и меченных моноклональных антител, не конкурирующие за сайт (ы) связывания на исследуемом антигене вируса КЧС. Решение этой задачи выполнялось сэндвич вариантом ТФ ИФА следующим образом:

В лунки двух вертикальных рядов 96-ти луночных микропанелей вносили моноклональные антитела каждой гибридомы (КІ, К2, КЗ,К4, К5, Кб, К9, К11 и К12), разведённые 0,02 М КББ рН 9,6 от 1:200 до 1:25600 в объёме 0,1 см3/лунка. Концентрация общего белка в исходных немеченных МА составляла 10 мг/см3. Пластины инкубировали в течение ночи при 4*С.

После блокирования свободных сайтов связывания полистирола ФБР-Т\тееп-БСА в течение 30 мин при 37*С, в лунки четных вертикальных рядов вносили нормальный культу рал ьный антиген, а в лунки нечетных рядов -специфический культуральный антиген в разведении 1:10 ФБР-БСА (с избытком по белку в 2 раза) в объёме 0,1 см'. Пластины инкубировали при 37°С в течение I часа и затем, после отмывки в лунки панелей вносили по 0,1 см3 мкл коньюгатов МА-ПХ тех же клонов, взятые в рабочем разведении. После 90 мин инкубирования при 37°С вносили субстрат и через 30 минут проводили учёт.

Между каждым этапом пластины отмывали трехкратно, а перед внесением хромогенного субстрата шесть раз ФБР-Т\уееп.

Оптимальную концентрацию улавливаюших МА, используемых для сенсибилизации микропанелей, и определение их конкуренции с детектирующими антителами коньюгата МА-ПХ за связывание с антигеном опреде-

ляли по результатам учёта оптической плотности (ОП). При получении положительного результата (ОП>2) в лунках, в которых концентрация улавливающих (сенсибилизирующих) МА была 0,05-0,025 мг/см3 (1:200-1:400), считали, что улавливающие и детектирующие моноклональные антитела данной пары не конкурируют за сайты связывания антигена. Результаты подбора пар улавливающих и детектирующих МА представлены в табл. 5.

Таблица 5

Результаты подбора пар улавливающих (сенсибилизирующих) МА и детек-

тирующих меченными МА -ПХ при обнаружении культу рал ьного антигена вируса КЧС в сэндвич ТФ-ИФА

МА клонов гибридом (сенсибилизированные) Конъюгаты МА- ПХ (меченые моноклональные антитела клонов гибридом)

К] К2 КЗ К4 К5 Кб К9 КІ2 ПХ-ПА

К1 1:200

К2 1:400 1:400'

КЗ 1:400

К4 1:400 1:200 - 1:200"

К5 1:200г 1:200 : " 1:200 1:400 1:200-

Кб 1100? 1:200-

К9 1*00- 1:400 V

К11

К12 іяоо: 1:200 1:200::

ПА

- положительный сигнал, оптическая плотность £2 (отсутствие конкуренции);

| "" | -отрицательный сигнал (конкуренция)

В результате установлено 20 пар улавливающих и детектирующих мо-ноклональных антител, не конкурирующих между собой за связывание с культуральным антигеном: (К1: К9-ПХ), (К2 : К9-ПХ), (К2 : ПА-ПХ), (КЗ : К5-ПХ), (К4 : К2-ПХ), (К4 : К12-ПХ), (К5 : К1-ПХ), (КЗ : К2-ПХ), (К5 : КЗ-ПХ), (К5 : К9-ПХ), (К5 : ПА-ПХ), (Кб : К1-ПХ), (Кб -. ПА-ПХ), <К9 ; К2-ПХ), (К9 : К5-ПХ), (К9 ; К12-ПХ),(КІ2 : К1-ПХ), (К12 : К9-ПХ), (К12 : ПА-ПХ)

На основе отобранных 20 пар улавливающих и детектирующих моно-клональных антител, определяли пары антител для последующего изучения воспроизводимости двухсайтового ТФ-ИФА на микропанелях различных фирм, определения его функциональных свойств и комплектования диагностического набора препаратов для практического использования.

Для этого сравнивали результативность обнаружения культуральных антигенов вирулентного вируса КЧС (штамм ШМ-51) и рекомбинантного вируса осповакцины Рек-КЧС.

Было установлено, что лучшая результативность и воспроизводимость обнаружения используемых антигенов вируса КЧС были получены при использовании пар моноклональных антител для сенсибилизации твёрдой фазы микропанелей производства фирм «Costar» и «Titertek» и детектирующих меченных пероксидазой хрена моноклональных антител в следующей после-до вательности: (MA К9 - коньюгат МА К5-ПХ), (MA К5 - коньюгат МА К9-ПХ) и (МА К9- коньюгат МА К12-ПХ). Коэффициент вариации при трёх по-вторностях на микропанелях «Costar» и «Titertek» составил 4,8-6,8% соответственно.

В связи с тем, что моноклональные антитела клона К5 не реагировали с антигеном вирулентного референс штамма «Alfort-157» и полевыми изоля-тами (п.2.2.3.), в дальнейшей работе в двухсайтовом ТФ ИФА использовали пару МАК9-МАК12-ПХ.

Определение оптимальных условий постановки метода двухсайтового ТФ ИФА для обнаружения антигена вируса К'■¡С в патологическом материале

Для определения оптимальных условий постановки метода двухсайтового ТФ ИФА с целью обнаружения антигена вируса в патологическом материале от 12-ти подсвинков, инфицированных внутримышечно виру содержащей кровью, (штамм «Ши-Мынь») в дозе 1040 ЛДч/см1, отбирали пробы крови в динамике инфекции, а после гибели — пробы внутренних паренхиматозных органов.

Пробы крови, отобранные каждые 5 суток после заражения, фракционировали с использованием «Р1ео1-Рак», отдельно получали плазму, лейкоцитарную фракцию и хранили до исследования при минус 70°С. Из проб внутренних органов готовили 10%-ную суспензию на ФСБ,

Определение оптимальной концентрации улавливающих \1А (К9) для сенсибилизации твердой фазы.

В работе использовали следующие антигены:

вируссодержащие пробы лейкоцитов крови (титр вируса 105 СККИД5о/см3), полученные на 12 сутки после заражения поросят;

культуральный антиген вируса КЧС (штамм «Ши-Мынь-51») (титр вируса 106'0KKИДs<)/cм,)-положительный контроль;

проба лейкоцитов, полученная перед заражением - отрицательный антиген.

Выполнение анализа.

Моноклональные антитела клона К9 вносили по 0,! см1 0,02 М КББ рН 9,6 в два вертикальных ряда лунок в двукратных разведениях (концентрация белка составляла от 1,0 мг/см3 до 0,03125 мг/см®). Инкубацию пластин проводили при 4°С в течение! 8 часов;

• блокирование свободных сайтов твёрдой фазы, внесением в лунки отмытых панелей по 0,2 см5 ФБР-Т\уееп-БСА в течение 30 мин при 37°С;

- внесение в лунки чётных вертикальных рядов отрицательных антигенов, а в лунки нечетных рядов • вируссодержащие пробы лейкоцитов, разведённые от 1:2 до 1:128в0,1 см'ФБР-БСА, и инкубирование при 37°С в течении 1 час;

- внесение в лунки конъюгата МА12-ПХ в рабочем разведении и инкубирование в течение 60 мин при 37°С;

• внесение в лунки субстрата и инкубирование в течение 30 мин при комнатной температуре,

- учёт результатов.

Между каждым этапом пластины отмывали трехкратно, а перед внесением хромогенного субстрата - шесть раз ФБР. Учёт результатов проводили спектрофотометр и чески. Результаты двухсайтового ТФ ИФА с разной концентрацией улавливающих МА при обнаружении антигена вируса КЧС в пробах лейкоцитов инфицированного поросёнка обработаны и представлены графически на рис I.

Оптическая

плотность

0,295 0,294

Концентрация МЛ (мґ/емЗ) " ■■■ -рмімденіїе проС лсГікішитов 1:4 ^ '-ря»Є(№нт проб Момнтов 1:4 ■ ™ -рііведснис прйбдеіікіїцніоа 1:8 -----отрниятздьный квнгроль

Рнс, 1. Зависимость показателей оптической плотности от конце траинм улавливающих моноклональныч антител клона К9 (мг/см3)

Полученные данные исследований показали, что антиген вируса КЧС в лейкоцитах крови инфицированных животных двухсайтовым ТФ ИФА обнаружен (ОП £2) при концентрации улавливающих (сенсибилизирующих) МА не менее 0,5 мг/см\

В последующих исследованиях по оценке чувствительности и специфичности двухсайтового ТФ-ИФА использовали 96-тн луночные микропане-

ли фирмы Titertek или COSTAR, сенсибилизированные моноклональными антителами клона К9 в концентрации не менее 0,5 мг/см\

2.2.5, Определение аналитической it диагностической чувствительности, специфичности двухсайтового ТФ ИФА при обнаружении антигена вируса КЧС у экспериментально заражённых свиней.

Способность двухсайтового ТФ ИФА давать положительный сигнал при исследовании проб виру ссодержаших материалов, содержащих известную концентрацию инфекционного вируса (аналитическая чувствительность), и отрицательный сигнал при исследовании проб, не содержащих вирус (аналитическая специфичность) определяли при проверке культуральных антигенов вируса КЧС, проб крови к органов от экспериментально заражённых свиней, антигенно-родственных вирусов, а также проб, не содержащих вирус КЧС (гетерогенные вирусы, пробы органов и крови от незаражённых свиней.

Чувствительность двухсайтового ТФ-ИФА при исследовании лейкоцитарной фракции и плазмы крови заражённых свиней составила 3.0-3.5 lg ККИД5о£м\ При исследовании культуральных антигенов вакцин ЛК-ВНИИВВиМ и ЛК-К и антигенно-родственных вирусов (ВД КРС и ВПБО), также получены положительные результаты.

В результате исследования крови, органных нормальных антигенов нн-тактных животных и культуральных антигенов гетерогенных вирусов (болезней Ауески, Тешена, РРСС) получен отрицательный результат.

При определении сроков обнаружения антигена вируса КЧС установлено (рис,2), что при остром течении болезни, вызваной вирулентным вирусом (штамм «Ши-Мынь»), антиген вируса обнаружен с б-х суток после заражения (на 2 суток позже ви русо выделения) при выраженных гипертермии и лейкопении вплоть до гибели.

1 2 3 4 £ в 7 в 9 10 11 11 13 14 15 16

-ректальная температура '— —количетво лейкоцитов тыс ммЗ жснмя

Рис.2, Сроки обнаружения антигена вируса КЧС (штамм «Ши-Мыиь») двухбайтовым ТФ ИФА в пробах лейкоцитов крови свиней в зависимости от клинического состояния и течения и нфе к uno иного процесса.

В зависимости от патогенностн нзолята, течения и исхода болезни антиген вируса КЧС в пробах лейкоцитов был обнаружен на 6 сутки (вирулентные изоляты № 805, КМ) и 9 -10 сутки (низко-вирулентные полевые изоляты Троицкое -02, Шувалово-03) до 12-15 суток. Обнаружение антигена двухсай-товым ТФ ИФА коррелируете концентрацией вируса в крови и лейкоцитов. Так, положительный сигнал (ОП >2) получен при титре вируса не менее 3,0 ККИД50/см\ лейкопении ниже 3 тыс/мм3 и гипертермии. Диагностическая чувствительность двухсайтового ТФ ИФА в период между 6-12 сутками после экспериментального заражения, по сравнению с методом вирусовыделе-ния, составляет 83-91,6%.

В табл. 8 представлены результаты определения диагностической чувствительности двухсайтового ТФ-ИФА при исследовании проб крови от экспериментально заражённых подсвинков вирусом КЧС (штамм «Ши-Мынь»), отобранные в динамике инфекции.

Диагностическая чувствительность двухсайтового ТФ-ИФА в динамике инфекции при исследовании фракций проб крови от 12 экспериментально заражённых поросят вирусом КЧС (штамм «Ши-Мынь»)

Исследуемая Реакция метола Сутки после заражения

фракция крови 0 5 7 10 12

Положительная 0 4 10 9 М

Лейкоциты Ложно-отркиательная 0 8 2 3 1

Чувствительность (%) 33,3 83,3 75,0 91,6

Положительная 0 2 5 7 7

Сыворотка Л ожно-отрицател ьная 0 10 7 5

Чувствительность (%) 16,4 41,6 58.0 58,0

Из данных таблицы видно, что диагностическая чувствительность двухсайтового ТФ-ИФА варьирует, в завимости от времени отбора проб крови после заражения: на 5 сутки —33,3%, с 7 по 12 сутки составила 75-91,6%; при исследовании сывороток—16,4,41,6 и 58%% соответственно,

2.2.6. Апробация метода двухсайтового ТФ ИФА при вспышках КЧС на свинокомплексах

Оценку диагностической чувствительности и диагностической специфичности метода двухсайтового ТФ ТФА проводили при исследовании проб крови (сыворотки), полученных от вынужденно убитых поросят группы до-рашивания при вспышке КЧС в ЗАО «Владимирское» и ЗАО «Краснодонское» в 2001 году (неблагополучные свинокомплексы), и 61 пробы крови, полученных из 3-х благополучных по чуме хозяйств. После проведения вирусологических исследований сыворотки были проверены ТФ ИФА. Результаты сравнительных исследований в и русо выделен и я и метода двухсайтового ТФ ТФА представлены в табл. 9,

В результате исследования всех 55 проб крови, полученных из неблагополучных свинокомплексов методом выделения в культуре клеток РК-15, вирус обнаружен в 32 пробах, что на 11% выше чувствительности метода двухсайтового ТФ ИФА. По отношению к стандартному методу, диагностическая чувствительность двухсайтового ТФ ИФА составила 81%, диагностическая специфичность-100%.

Результаты определения диагностической чувствительности и специфичности двухсайтового ТФ ИФА при исследовании проб крови от вынужденно убитых животных неблагополучных и благополучных по КЧС свино-

водческих хозяйств

Наименование свинокомплекса Кол-во исследованных проб (всего) Методы обнаружения вируса:

изоляция вируса РК-15 двухсаПтовый ТФ ИФА

Неблагополучные по КЧС хозяйства

ЗАО «Владимирское» 30 20 1*.

ЗАО «Краснодонское» 25 12 10

Итого: 55 32 (5К%) 2й <47%)

Диагностическая чувствительность »1%

Благополучнее по КЧС хозяйства

ООО «Вел гран корм» 2« 0 0

ФГУП «Калининградское» 25 0 0

Колхоз им. Фрукте 0 0

Итого: 61 0 0

Диагностическая специфичность 1011%

Таким образом, на основании результатов исследования проб органов от незаражённых и заражённых вирусом КЧС свиней (в том числе разными полевыми изолятами) в эксперименте и при исследовании полевых материалов при вспышках КЧС в свинокомплексах, можно сделать заключение о том, что разработанный метод двухсайтового ТФ ИФА обладает диагностической чувствительностью и специфичностью, которые позволяют рекомендовать его для проверки в широких производственных испытаниях для последующего использования для диагностики и мониторинга болезни в крупных свиноводческих комплексах.

з.выводы

1. Получено 8 клонов гибридом, стабильно продуцирующих монокло-нальные антитела, специфичные к антигенным детерминантам основного структурного полипептида Е2 вируса КЧС,

2, Моноклональные антитела клонов К1, КЗ, К4, Кб, К9 и К12 в виде ас-иитических жидкостей имеют активность от 1:78125 до 1:1953125 в непрямом ТФ ИФА и реагируют с вирулентным, вакцинными штаммами вируса КЧС, а также антигенно-родственнымн пестивирусами (диареи крупного ро-

гатого скота, пограничной болезни овец), Моноклональные антитела клонов К2, К5 и KII обладали избирательной способностью реагировать с референс-штаммами и полевыми изолятами вируса классической чумы свиней,

3. Отобранные методом сэндвич ТФ ИФА неконкурирующие моноклональные антитела клонов гибридом К9 и К12 обладали специфичностью к разным эпитогам структурного полипептида Е2 вируса КЧС и пригодны для его улавливания и детекции методом двухсайтового ТФ ИФА.

4. Разработан метод двухсайтового ТФ ИФА для прямого обнаружения антигенов в лейкоцитах больных классической чумой свиней. Аналитическая чувствительность метода составила при концентрации вируса не менее 3.0 lg ККИДчо/см3 вируса.

5. Установлено, что при исследовании проб лейкоцитов от свиней, полученных в период между 6-12 сутками после экспериментального заражения вирусом КЧС разной патогенности, диагностическая чувствительность двухсайтового ТФ ИФА, по сравнению с методом виру совы деления, составляет 83-91,6%,

6. В результате апробации при исследовании полевых материалов, полученных из неблагополучных и благополучных по КЧС свинокомплексах разработанный метод двухсайтового ТФ ИФА, по сравнению с методом виру совыдедения, имеет чувствительность 81% и специфичность 100%.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Подготовлена и утверждена директором ГНУ ВНИИВВиМ временная нормативная документация: «Инструкция на изготовление и контроль набора препаратов для обнаружения вируса классической чумы свиней твердофазным иммуноферментным анализом на основе моноклонапьных антител», «Технические условия на набор препаратов для обнаружения вируса классической чумы свиней твердофазным иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител», «Наставление по применению набора препаратов для обнаружения вируса классической чумы свиней твердофазным иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител».

5.СППСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ НО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Куриннов В.В., Цыбанов С.Ж., Бунькова Н.И., Коломыцев A.A., Стрижа-ков A.A., Васильев А.П., Лыска В.М., Стариков В.М. Генотипирование полевых изолятов вируса КЧС домашних свиней и диких кабанов // Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей: Материалы международной научно-практической конференции / ВНИИВВнМ.- Покров, 2002.- С. 133-135

2. Васильев А.П., Стрижаков A.A., Куриннов В.В., Стрижакова О.М. Сравнительная оценка антигенной активности препаратов классической чумы свиней для получения монокпональиых антител // Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей: Материалы международной научно-практической конференции / ВНИИВВнМ.- Покров, 2002.- С. 308-309.

3. Васильев А.П. Сравнительная опенка современных методов диагностики вируса классической чумы свиней // Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: Труды международной научно-практической конференции, посвященной 45 летию института / Покров, 2003.- С. 396-401,

4. Куриннов В.В., Сергеев В.А., Забережный А.Д., Грибенникова Т.В., Цыбанов С.Ж., Коломыцев A.A., Стрижаков A.A., Лыска В.М., Васильев А.П., Стариков A.M., Медведева Е.Ю. Вопросы клинической и лабораторной диагностики классической чумы свиней // Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: Труды международной научно-практической конференции посвященной 45- летию института / Покров, 2003.-С. 375-384.

5. Коломыцев A.A., Стрижаков A.A., Куриннов В.В., Живодеров С.П., Васильев А.П., Балышев В.М., Чичикин А.Ю. Классическая чума диких кабанов: "Экологический портрет" возбудителя // Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: Труды международной научно-практической конференции посвященной 45 летию института / Покров, 2003.-С. 354-360.

6. Васильев А.П., Стрижаков A.A., Куриннов В.В, Получение и характери-

стика моноклональных антнтел, специфичных к антигенам вируса классической чумы свиней // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных: Материалы международной научной конференции молодых ученых /ФГУ ВНИИЗЖ,- Владимир, 2004,- С. 101-105. 7. Куриннов В.В., Забережный АД,, Гребенникова Т.В., Цыбанов С.Ж., Ко-ломыцев A.A., Стрижаков A.A., Лыска В.М., Васильев А.П., Стариков A.M., Медведева Е.Ю. Клиническая и лабораторная диагностика классической чумы свиней // Ветеринария,- 2004,- №5,- С. 18-22.

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ, г. Покров, Владимирской области

Тираж 75 экз.