Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологий получения препаратов природных и рекомбинантных белков из прокариотических клеток

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологий получения препаратов природных и рекомбинантных белков из прокариотических клеток"

2 1 №

е ^ О 1Ь V.'

На правах рукописи

ЛЕБЕДЕВ

Леонид Рудольфович

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ПРИРОДНЫХ И РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ИЗ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

специальность - 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове - 1998

Работа выполнена в Научно-исследовательском конструкторско-

технологическом институте биологически активных веществ Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии

«Вектор».

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Н.М. Пустошилова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С.Н. Загребельный

кандидат химических наук В.В. Зиновьев

Ведущая организация: Новосибирский институт биоорганической

химии, СО РАН

Защита состоится ^е^а^-л 1998 г. в 900 час. на заседании диссертационного совета Д 074.20.01. в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор». 633159, Новосибирская обл., п. Кольцове

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Автореферат разослан 1998 г.

Ученый секретарь г~\

диссертационного совета/ /¡/У л лЛ / {"Т.Н. Шубина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В современной биотехнологии проблемы получения функционально и химически чистых биологически активных веществ и анализ их биологических функций являются чрезвычайно актуальными на всех этапах разработки биопрепаратов, а отсутствие информации о физико-химических свойствах, получаемых веществ и физиолого-биохимических особенностях микроорганизмов-продуцентов являются основным из сдерживающих факторов интенсификации микробиологического синтеза, выделения и применения биологически активных веществ. Изучение физиологии и биохимии продуцентов, как природного происхождения, так и рекомбинантных штаммов, необходимо для оптимизации питательных сред, условий культивирования и целенаправленного управления микробиологическим синтезом.

Создание рекомбинантных штаммов-продуцентов биологически активных веществ для медицины требует разработки высокоэффективных технологий для очистки разрабатываемых препаратов.

Цель работы. Целью настоящей работы является выявление новых штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции, развитие и оптимизация современных методов повышения содержания целевых белков в штаммах-продуцентах биологически активных веществ, разработка комплекса приемов и методов, позволяющих получать из прокариотических клеток препараты белков как природного происхождения, так и рекомбинантных.

Задачи исследования.

1 .Выявить новые штаммы-продуценты эндонуклеаз рестрикции, провести работу по повышению продуктивности клеток по целевым белкам.

2.Разработать способы выделения и очистки эндонуклеаз рестрикщш, получить высокоочищенные препараты новых ферментов и охарактеризовать их в отношении субстратной специфичности.

3.Изучить стабильность штаммов-продуцентов рекомбинантных белков и разработать способы повышения их продуктивности.

4.Разработать технологии выделения и очистки рекомбинантных белков, получаемых из растворимой фракции клеток: ФНО-бета и аналога ФНО-альфа.

5.Разработать технологию выделения и очистки белка ТВ1 (кандидата в вакцины против Н1У-1) из нерастворимой фракции клеток (телец включения).

6.Исследовать свойства рекомбинантных белков.

Научная новизна работы.

- Выявлен двадцать один новый штамм-продуцент эндонуклеаз рестрикции, в том числе 3 - в роде ШшоЫит, мало изученном в отношении систем рестрикции-модификации.

- Идентифицированы последовательности узнавания выявленных новых рестриктаз.

-Впервые обнаружены рестриктазы с сайтами узнавания ТССССА и

1

AGGCCT в роде Bacillus.

- Изучено влияние состава сред при культивировании штаммов B.megateri-шп361 и B.sphaericus на выход рестриктаз и подобраны среды, повышающие урожай и продуктивность клеток.

- Показана возможность увеличения продуктивности штамма K.pneumo-niae378 по рестриктазе Kpn3781 методом отбора высокопродуктивных клонов.

- Предложен способ повышения продуктивности штамма M.luteus по рестриктазе Mlu I методом предварительного культивирования на среде с эндогенной ДНК в сочетании с отбором высокопродуктивных клонов.

- Предложен унифицированный метод выделения и очистки рестриктаз.

- Разработан новый сорбент гепарин-силохром для очистки ферментов.

- Изучена стабильность рекомбинангных штаммов-продуцентов факторов некроза опухолей и разработан оригинальный способ повышения содержания целевых белков в биомассах.

- Впервые разработан подход к снижению уровня берплазмидных клеток штамма-реципиента E.coli SG200-50, накапливающихся в ходе культивирования в популяции рекомбинангного хнтамма, несущего ген bla в качестве генетического маркера.

- Разработана легкомасштабируемая технология получения высокоочюцен-ных и высокоактивных препаратов факторов некроза опухолей из растворимой фракции клеток. Стадии очистки ФНО-бета оптимизированы и позволяют получать высокоочшценный препарат из биомасс с различным (от 0,5% до 10% и выше) содержанием целевого белка.

- Впервые разработан способ получения искусственного рекомбинантного белка TBI (содержит 6 Env эпитопов и 3 Gag эпитопа HIV-1) из нерастворимой фракции клеток (телец включения).

Практическая ценность.

- Результаты настоящей работы способствовали расширению ассортимента ферментов эндонуклеаз рестрикции. Выявлен 21 новый штамм-продуцент ферментов, в том числе: B.megaterium361 (Bme361 I), K.pneumoniae378 (Kpn378 I), R.leguminosanun69 (Rle69 I), B.coagulansllö (Bcollö I) -(A.c. 1631080, 1659480, Патенты РФ 2001952, 2054040, соответственно), разработан способ повышения продуктивности штамма-продуцента эндонуклеазы рестрикции Mlu I (A.c. 1738853), разработан способ получения эндонуклеазы рестрикции Rtr I (Ас. 1752769). Предложена унифицированная схема выделения и очистки эндонуклеаз рестрикции. Предложен и апробирован сорбент для их очистки. Опытные партии ферментов передавались ряду учреждений для проведения научно-исследовательских работ.

- Разработаны способы повышения продуктивности рекомбинангных штаммов по целевым белкам, в том числе разработан способ получения биомассы рекомбинантного штамма бактерий E.coli, обогащенной поли-пепгидом со свойствами лимфотоксина человека (положительное решение от

2

23.04.98r. о выдаче патента по заявке № 97103807/13 от 12.03.97г.). - Разработаны способы получения рекомбинантных белков из растворимой фракции клеток, в гол г числе - ФНО-бета (Патент РФ 2048521). Подготовлены проекты документации на производство ФНО-бета в ГНЦ ВБ «Вектор».

- Разработан способ получения белка TBI из нерастворимой фракции клеток (телец включения) - кандидата в вакцины против HIV-I.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на: V Всес. конф. "Методы получения и анализа биохим. препаратов" (Юрмала, 1987), IV Всес. конф. "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988), Всес. симп. "Ферменты рестрикции-модификации.от генов до белков" (Тракай, 1989), Межреспубл. совещ. "Нуклеазы микроорганизмов" (Рига, 1989), Междунар.коиф. "Получение, исследование, применение антибиотиков и биологически активных веществ" (Москва, 1990), Всес. конф. "Ферменты-народному хозяйству" (Черновцы, 1990), Intem.symp. "Metabolism and enzymology of nucleic acids..."(Czechoslovakia, Bratislava, 1990), I Bcec. конф. "Геном человека" (Переславль-Залесский, 1990), Всес. конф. "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, 1990), IX конф. "Ферменты микроорганизмов (нуклеазы)" (Казань, 1991), П отраслевая конф. молод.ученых (п.Кольцово,1990), Семинар "Препаративная масштабируемая хроматография биологически активных веществ" (Ленинград, 1991), I - IV Intern.conf."AIDS, Cancer and Human retroviruses"(St.-Pctergurg, 1992, 1993, 1995, 1996), VI конф. РФ "Новые направления биотехнологии" (Москва, 1994), VII Intern. Conf. "Comparative and applied virology" (Montreal, Quebec, Canada, 1994), II Intern, congress of immunoreabilitation (Antalia, Turkey, 1996), First Joint Meeting of the"ICS and ISICR" (Geneva, Switzerland,1996) и др.

Работа выполнялась в НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор" в соответствии с решением ряда программ: отраслевой научно-технической программой "Ферментная база", межведомственной научно-технической программой "Вакцины нового поколения" и др.

По материалам диссертации опубликована 31 печатная работа, из них 9 патентов, авторских свидетельств и положит, решений. Список приводится в конце реферата.

Структура диссертации. Диссертация содержит JJ6 страниц машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов, двух глав собственных исследований, заключения, выводов и приложения. Список цитируемой литературы содержит 279 источников. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 21 таблицей.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.ВЫЯВЛЕНИЕ НОВЫХ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ЭНДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ.

Выявление новых штаммов-продуцентов эндонуклсаз рестрикции.

Был проведен поиск штаммов-продуцентов эндонуклсаз рестрикции с новой специфичностью или же более технологичных продуцентов рестриктаз известной специфичности. Для этого использовали метод анализа отдельных колоний исследуемых штаммов. При помощи микробиологической петли отбирали отдельные колонии, выросшие на агаризованной среде и вносили ах в 150-200 мкл буфера, содержащего 0,1%-ный Тритон Х-100. Для разрушения клеток использовали обработку их суспензии ультразвуком. Выбор последнего для разрушения клеточных стенок был обусловлен тем , что перед отбором колоний мы не стремились определить род бактерий, тогда как при воздействии ультразвука можно разрушить клеточные стенки практически любых клеток. Преимущество ультразвуковой обработки состоит еще и в том, что процесс разрушения можно контролировать, измеряя оптическую плотность суспензий при длине волны 550-600 нм. Для анализа рестриктазной активности в процессе обработки клеточной суспензии ультразвуком отбирали аликвоты, центрифугировали и одинаковые объемы раствора вносили в инкубационную смесь, содержащую субстратную ДНК. Инкубацию проводили одинаковое врет и продукты реакции подвергали электрофорезу в 1%-ом геле агарозы. О наличии ферментативной активности судили по появлению дискретных полос субстратной ДНК на электрофореграмме. Как показал опыт, при снижении поглощения суспензии клеток при длине волны 550-600 нм при ультразвуковой обработке до 60-70% от исходного значения, наблюдался практически полный переход рестриктаз в раствор.

Были проверены штаммы микроорганизмов, выделенные из различных экологических ниш: из воздуха, сточных вод, почвы, клубеньков бобовых растений и др. Обнаружены эндонуклеазы рестрикции в штаммах родов Hafnia, Klebsiella, Rhizobium, Staphylococcus и большой группы Bacillus, в том числе -термофильных. Способ позволяет анализировать микроорганизмы без предварительного определения их таксономической принадлежности. При его использовании выявлен 21 новый штамм-продуцент эндонуклсаз рестрикции (табл. 1), три из них относятся к роду Rhizobium, представители которого мало изучены в отношении распространенности системы рестрикции-модификации.

Рестрикгазы с сайтами узнавания TGCGCA и AGGCCTb роде Bacillus были обнаружены впервые.

На выявленные новые штаммы-продуценты ферментов B.megaterium361, K.pneumoniae378, R.leguminosarum69, B.coagulansll6 получены патенты и авторские свидетельства: A.c. 1631080, Ас. 1659480, патенты 2001952, 2054040, соответственно.

Таблица 1. Новые штаммы-продуценты рестрикгаз.

Штамм Фермент Сайт узнавания Прототип

Bacillus

l.B.megaterium 361 Bme3611 GG/CC Hae III

2.B.species 122 Bspl22I CTGCAG PstI

3.B.species 54 Bsp54 I GGNCC Sau961

4.B.species S BspSI CCWGG BstNI

5.B. species L BspLI GGCG Hae III

6.B.brevis 7 Bbr7I GAAGACN(2/6) BbvII

7.B.species 9 Bsp9 I GGCC Hae III

8.B.species Q BspQI GG/CC Hae III

9.B.stearothermophilus 1 Bstl I CC/WGG BstNI

lO.B.stearothermophilus 2 Bst2 I CCAVGG BstNI

ll.B.coagulans6 Всоб I TGCGCA Fspl

12.B.coagulans 116 Bcol16 I CTCTTCN(l/4) Earl

13.B.schlegelii 4 Bsc4 I CCNNNNN/NNGG BsiYI

14.B.species P BspPI CCNNNNNNNGG BsiYI

15.B.species29 Bsp29I AGGCCT StuI

16.Hafnia alvei 22 Hal22 I GAATTC EcoRI

17.Klebsiella

pneumoniae 378 Kpn378 I CCGC/GG Sac II

18.Rhizobium trifolii Rtr I G/TCGAC SalGI

19.Rhizobium meliloti21 Rme211 AT/CGAT Clal

20.Rhizobium

leguminosarum69 Rle69 I GGTACCN(l/5) Ppa I

21. Staphylococcus

aureus 557 Sau5571 GGNCC Sau961

Разработка способов повышения продуктивности штаммов по ферментам.

Для разработки технологии получения препаратов рестриктаз необходимо иметь высокопродуктивные, технологичные, непатогенные штаммы-продуценты. Для решения этой задачи использовали несколько способов. Один из них (поиск новых штаммов, более продуктивных по сравнению с известными) описан выше. Далее, на примере культивирования продуцентов рестриктаз Bme361 I - Bacillus megaterium 361 и BspR I - Bacillus sphaericusR, было показано, wo применение культуральной среды более оптимального состава (по содержанию аминокислот и солей) приводит к повышению урожая биомасс и повышению количества целевых белков с единицы объема среды в 1,7 и в 1,25 раз, соответственно.

В ряде случаев, применяя описанный выше экспресс-метод анализа отдельных колоний, использовали пассирование (пересевы) клонов штаммов

5

с последующим селективным отбором высокопродуктивных. На примере селекции штамма Klebsiella pneumomae378 - продуцента рестриктазы Kpn378 I было продемонстрировано повышение продуктивности клеток по содержанию рестриктазы в 2 - 3 раза, с 10000 - 20000 ед.акт./г до 30000 - 40000 ед.акт./г клеток.

Для повышения продуктивности был предложен и апробирован способ индуцирования биосинтеза эндонуклеаз. Для этого добавляли в среду эндогенную ДНК. Использование только однократного пассирования посевного материала М. luteus на среде с ДНК (в качестве ивдуктора биосинтеза рестриктазы) в сочетании с отбором высокопродуктивных клонов позволило в итоге повысить в 10-15 раз содержание рестриктазы Mlu I в биомассе. На разработанный способ повышения продуктивности штамма M.luteus по рестриктазе Mlu I получено A.c. 1738853.

Разработка технологии выделения и очистки эндонуклеаз рестрикции.

Для извлечения ферментов из клеток использовали ультразвуковую обработку их суспензии. Контроль разрушения проводили, измеряя оптическое поглощение суспензии клеток при длине волны 550 нм. Экспериментально было установлено, что снижение поглощения до 60-70% от исходного значения сопровождается переходом в раствор до 90-95% рестриктаз. Дальнейшая обработка клеток ультразвуком приводила к значительному выходу в раствор балластных белков и нуклеиновых кислот, в том числе - неспецифических нуклеаз, протеаз и других, что нежелательно, так как приводит к усложнению схемы очистки. При контроле разрушения уже на стадии извлечения ферментов из клеток удается избавиться от части балластных белков (в том числе - части неспецифических нуклеаз) и нуклеиновых кислот.

Для дальнейшего освобождения от них препаратов ферментов использовали фракционирование экстракта клеток в системе ПЭГ-декстран. Использовали систему: 7%-ный ПЭГ - 2%-ный декстран. Подбор концентрации соли в системе проводился в статических условиях и заключался в выборе такой концентрации, когда основная часть фермента находилась в верхней фазе, а балластные белки, нуклеиновые кислоты и неспецифические нуклеазы оставались в нижней (декстрановой) фазе.

Далее для очистки ферментов использовали метод колоночной хроматографии на фосфоцеллюлозе P-II. Для доочистки, в ряде случаев, использовали хроматографию на гидроксилапатите или гепарин-силохроме. Синтез гепарин-силохрома проводили присоединением гепарина к аминопропилсилохрому, активированному эпихлоргидрином. По своим свойствам силохром, в отличие от сефарозы, устойчив к бактериальному зарастанию, обладает большей «жесткостью» и скоростью протока жидкости. Этими же преимуществами по сравнению с гепарин-сефарозой фирмы «BioRad» (США) обладает и синтезированный сорбент гепарин-силохром, не уступая ей в способности сорбировать рестриктазы и емкости по целевым

6

белкам. На разработанный сорбент гепарин-силохром получено удостоверение на рац. предложение N.257 от 05.01.1989г. (НИКТИ БАВ).

По описанной выше схеме было очищено большинство найденных ферментов. Количество стадий очистки зависело как от исходного содержания ферментов в клетках, так и от содержания неспецифических нуклеаз (табл.2).

Таблица 2.

Схемы очистки эндонуклсаз рестрикции.

Фермент Содержание фермента, ед.акт./г клеток Схема очистки

Вше3611 До 1000 ООО ПЭГ-декстран->Р-П

Всоб I до 700 000 То же

На122 I 10 000-20 000 Тоже

Шг I 40 000-60 000 ПЭГ-декстран->Р-П->ГАП

(или гепарин-силохром)

Р^а I 40 000-50 000 Тоже

Ше69 I 30 000-40 000 Тоже

В5р122 I 30 000-40 000

Шпе211 5 000-10000

8аи5571 300-500

ВБр54 I 200-300 — "шшш

Крп3781 30 0004 0 000 ПЭИ-»СА-»ДЕ-52->ГАП

Примечание: ПЭИ-фракционирование полиэтиленимином,

СА-фракционирование сульфатом аммония Если для получения высокоочищенных препаратов рестриктаз Вше361 I, Всоб I, На122 I достаточно было двустадийной очистки (из них одной хроматографической стадии), то для большинства ферментов процесс состоял из трех стадий (из них две хроматографические). В результате получались высокоочищенные препараты ферментов. На разработанный способ получения эндонуклеазы рестрикции Шг I получено А.с. 1752769.

При определении качества получаемых ферментных препаратов использовали ставшие традиционными способы: длительную инкубацию фермента с су бстратной ДНК (тест на эндонуклеазы) и реакцию "рестрикция - сшивка ДНК-лигазой - повторная рестрикция" (тест на экзонуклеазы и фосфатазы). Все получаемые препараты удовлетворяли этим тестам.

Однако, следует отмстить, что описанная выше схема не является универсальной для очистки всех ферментов эндонуклеаз рестрикции. Так, фракционирование в системе полиэтиленгликоль - декстран рестриктазы Крп378 I не привело к получению удовлетворительно очищенного фермента. Вследствие этого и последующая хроматография на фосфоцеллюлозе Р-И не

дала желаемых результатов. Для очистки этого фермента до необходимой функциональной чистоты была использована другая схема (табл.2).

Установление субстратной специфичности новых ферментов.

В ряде случаев установить специфичность продуцируемого фермента было возможно уже на стадии грубого клеточного экстракта, но для более точного установления сайта узнавания и особенно - места расщепления ДНК были необходимы очищенные препараты. Для установления специфичности мы использовали сопоставление картин гидролиза ДНК фага к, ДНК фага Т 7, репликативной формы ДНК фага М 13, ДНК плазмиды рВИ 322, получаемых при обработке субстратов обнаруженными рестриктазами с картинами гидролиза, осуществляемого известными ферментами. В случае недоступности предполагаемого фермента-прототипа проводили математическую обработку результатов расщепления для локализации сайтов узнавания с последующим их практическим подтверждением.

Для всех обнаруженных ресгрикгаз были определены участки узнавания и для части из них - места расщепления при помощи секвенирования участков ДНК в районах узнавания (табл.1).

Восемь новых штаммов-продуцентов обладали некоторыми преимуществами по сравнению с ранее известными (табл. 3).

Таблица 3.

Сравнительная характеристика выбранных штаммов.

Штамм-продуцент Фермент Прототип Отличительные свойства

B.megaterium 361 Bme3611 BspRI Продуктивность выше в 10 раз

B.coagulans 6 Всоб I Fsp I Продуктивность выше в 10 раз

B.schlegelii 4 Bsc4 I BsiYI Продуктивность выше в 50 раз

B.brevis 7 Bbr71 BbvII Продуктивность выше в 4,5раза

К.рпешпошае 378 Крп378I SacII Продуктивнее в 40 раз, наличие в штамме одной рестриктазы, фермент не ингибируется солями KCl, NaCl.

Rtrifolii RtrI SalGI Продуктивнее в 8 раз, наличие в штамме одной рестриктазы

R.meIiloti 21 Rme211 Clal Продуктивность выше в 10 раз

R.leguminosa-

rum 69 Rle691 Eco311 Продуктивность выше в 3, Зраза

Для подавляющего числа рестриктаз определены их мол. массы и оптимальные условия проведения реакции гидролиза.

2.РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ.

В работе исследовались способы получения рекомбинантных белков из растворимой фракции клеток - факторов некроза опухолей и из телец включения - белка TBI. Факторы некроза опухолей являются перспективными препаратами для использования в медицине. Для разрабатываемого аналога ФНО-альфа R31Q показана его меньшая системная токсичность и повышенная устойчивость к протеазам по сравнению с исходным ФНО-альфа. Белок TBI содержит эпитопы белков Env и Gag (HIV-I), перспективен для создания вакцины и является одним из белков, полностью сконструированных искусственно.

Изучение стабильности штаммов-продуцентов рекомбинантных белков н разработка способов повышения их продуктивности.

В работе использовали следующие плазмиды:

а) плазмиды, в которых гены встроены под контроль тандема промоторов А2 и A3 из ранней области бактериофага Т7 и содержащие ген bla (устойчивость к ампициллину (Арх) в качестве генетического маркера. Плазмида pTNF 31IA R3IQ содержит полусинтетический ген, кодирующий биосинтез ФНО-альфа с делецией 4-х N-концевых кодонов и заменой Arg на Gin в 31-ом положении. Плазмида pLT 21 аналогично содержит ген, кодирующий биосинтез ФНО-бета с делецией 21-ого N-концевого кодона. Кроме того, плазмида имеет в своем составе ген cat (устойчивость к хлорамфениколу).

б) плазмида pTBI, в которой синтетический ген, кодирующий биосинтез белка TBI, встроен под контроль RecA-промотора и содержащая ген Ыа (устойчивость к ампициллину (ApR).

В качестве реципиентных штаммов для трансформации плазмидами из первой группы использовали E.coli SG 200-50, дефектный по Ьа-протеазе и потому удобный для наработки рекомбинантных белков. Для плазмиды pTBI в качестве штамма-реципиента использовали клетки E.coli CSH 36.

Используя для получения биомасс рекомбинантных штаммов типичную схему, обнаружили, что получаемые от опыта к опыту биомассы значительно варьируют по содержанию целевых белков (от 5 до 30% для аналога ФНО-альфа и от 1 до 9% для ФНО-бета от уровня суммарного клеточного белка). Эти факты могут быть объяснены либо структурной нестабильностью плазмиды в клетках, либо ее элиминацией и накоплением в культуре безплазмид-ных клеток.

Чтобы исключить первое предположение, выделяли плазмидные ДНК из клеточных суспензий на различных стадиях культивирования и проводили их рестрикционный анализ (физическое картирование). Было показано, что структуры плазмидных ДНК в процессе культивирования не изменялись, полученные рестрикционные картины образцов ДНК из инокулята и из биомассы были идентичны таковым для исходных ДНК. Исходя из этого, можно предположить, что снижение уровня биосинтеза целевых белков в

9

биомассах является следствием накопления в культурах в процессе их культивирования безплазмидных клеток или клеток с низким количеством копий плазмиды.

При анализе отдельных клонов трансформированных клеток заметили, что они могут различаться по продуктивности целевого белка. Это, по видимому, объясняется рядом причин, основная из которых - содержание плазмидсодержащих клеток в колониях, которое зависит от фазы роста, плотности клеток на чашках с агаризованной средой (соответственно -количества оставшегося в среде ампициллина). Было показано, что дополнительный отбор среди колоний трансформантов наиболее продуктивных и использование их для получения инокулята позволяет получить популяцию клеток с более высоким уровнем биосинтеза целевого продукта (табл.4).

Таблица 4

Сравнительный анализ биомасс штамма-продуцента ФНО-бета (Е.соН БС 200-50/рЬТ 21), выращенных при использовании посевного материала, сделанного смывом всех трансформантов с чашки и полученного из отдельных, особо

проду ктивных клонов.

Посевной N. Содержание целевого продукта, % от суммы белков, материал опыта (проявление признака Арг\ %).

трансформи- инокулят биомасса

рованные клетки

Смыв с 1 чашки 2 3

Отдельные 1 клоны 2 3

9 + 2 (100) 7 + 2 (100) 11 ±2 (100)

15+2(100) 13 ±2(100) 16 + 2(100)

7 ± 2 (70) 5+2(60)

8 ±2 (74)

14 ±2 (93) 11 ±2(90) 14 ±2 (95)

5 ±2(10) 3±1 (7) 7 ± 1 (12)

12 ±2 (32) 9 ± 2 (28)

13 ±2(44)

Далее, при исследовании процесса роста культу ры, проводили отбор проб культуральной жидкости, разбавляли физ.р-ром и в количествах по 50-150 колоний рассевали параллельно на селективные (Ар) чашки и на чашки без антибиотика. По соотношению чисел колоний, выросших на чашках, рассчитывали содержание плазмидсодержащих клеток (Ара). Таким образом было показано, что в первой и второй трети логарифмической фазы роста культуры наблюдались преимущественно плазмвдсодержащие клетки, в конце логарифмической фазы их количество было примерно 50-60% от суммарного и в стационарной фазе роста резко снижалось.

Из табл. 4 видно, что процентное содержание амшщиллинустойчивых клеток в биомассах зависит в значительной степени от их исходного содержа-

10

ния в посевном материале (инокуляте). Вследствие этого было важно снизить исходное содержание бесплазмидных клеток. Поэтому при получении посевного материала (инокулята) был проведен ряд экспериментов:

1)инкубация суспензий клеток с различными концентрациями ампициллина с последующим высевом на агаризованную среду без антибиотика;

2)анализ культуральной жидкости (без клеток) на содержание в ней клеточных белков при инкубации суспензии клеток с антибиотиком. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Рост клеток на агаризованной среде без антибиотика после их инкубации в среде с различными концентрациями ампициллина.

Концентрация Реципиентные клетки Трансформированные клетки

антибиотика,

мкг/мл. Время предварительной ннкубацции

1ч Зч 1ч Зч

0 +++ •н-ь +++ +-Н-

50 -н- + +++ +++

100 + +■ +++ -Н-+

200 + + +++ +++

400 + +++ -Н-+

600 - +4- +

800 - + -

1200 - - -

+++ рост газоном; ++ отдельные колонии; + единичные колонии.

Как видно из таблицы, после инкубации реципиентных клеток (Ар3) в среде с антибиотиком до 400 мкг/мл в течение 1 ч отдельные колонии сохраняют способность к росту при высеве их на среду без селективного давления, тогда как после 3-х часовой инкубации их роста не наблюдалось. В то же время, после инкубации трансформированных клеток (Арр~) в тех же условиях их способность к росту практически не изменялась. Анализ культуральной жидкости гель-электрофорезом показал, что клеточные белки реципиентных клеток в значительных количествах начинают обнаруживаться при концентрациях ампициллина в среде выше 400 мкг/мл, т.е. происходит лизис безплазмидных клеток. Полученные данные свидетельствуют о том, что до определенных концентраций антибиотика происходит подавление роста безплазмидных клеток, но они могут сохраняться в нативном состоянии, и при инактивации ампициллина (З-лакгамазой способны к интенсивному размножению. При более высоких концентрациях происходит разрушение клеточных стенок безплазмидных бактерий и в культуре остаются преимущественно трансформированные клетки.

11

Учитывая вышеперечисленные результаты, для повышения содержания целевого продукта в биомассе, в дальнейшем мы использовали:

а)для получения посевного материала - отбор высокопродуктивных клонов трансформированных клеток;

б)для засева - посевной материал, состоящий из культуры клеток находящихся в середине логарифмической фазы роста, дополнительнс обработанный ампициллином в концентрации 400-500 мкг/мл в течение 2-3 ч;

в)сбор биомассы, когда культура находится в последней трети логарифмической фазы роста.

Этот комплекс методов позволил не только повысить процентное содержание аналога ФНО-альфа в биомассе до 35-40%, но и сделать процесс биосинтеза более управляемым.

Использование вышеперечисленных методов при культивировании рекомбинантного штамма-продуцента белка TBI - E.coli CSH 36/рТВ1 аналогично способствовало повышению продуктивности клеток по целевому белку.

В случае продуцента ФНО-бета, используя тот факт, что плазмида pLT 21 содержит кроме гена Ыа еще и ген cat, кодирующий биосинтез хлорамфениколтрансферазы (устойчивость к Cm), полученные трансформанты рассевали на плотных средах, содержащих наряду с ампициллином хлорамфеникол (150 мкг/мл). Это повышало селективный рост клеток, содержащих плазмиду, и одновременно вызывало увеличение количества копий плазмиды в клетках (хлорамфеникол вызывает амплификацию плазмидной ДНК). В результате повышались уровни содержания плазмццной ДНК в клетках и биосинтеза ФНО-бета (до 13-15% от суммы клеточных белков) при дальнейшей ферментации. На разработанный «Способ получения биомассы рекомбинантного штамма бактерий E.coli, обогащенной полипептидом со свойствами лимфотоксина человека» получено положительное решение от 23.04.98г. о выдаче патента по заявке № 97103807/13 от 12.03.97r.

Разработка технологий получения препаратов факторов некроза опухолей из растворимой фракции клеток.

Выделение факторов некроза опухолей начинали с выбора способа разрушения клеток для извлечения целевых белков. Наилучшим оказался способ с использованием ультразвуковой обработки клеток. Для разрушения клеточных стенок использовали обработку клеточной суспензии ультразвуком до снижения ее оптической плотности при длине волны 550 нм до 65-75% от исходной. Было показано, что целевые белки (до 90%) после центрифугирования суспензии оставались в растворе. Дальнейшая, более значительная, обработка ультразвуком нежелательна, так как может привести к более полному выходу из мембран клеток (после центрифугирования остающихся в осадке) в раствор других белков, в т.ч. протеаз. После разрушения клеток ультразвуком осадок удаляли центрифугированием, а

12

экстракт клеток использовали для очистки из него целевых белков.

В результате проведенных экспериментов то разработке схемы очистки факторов некроза опухолей было выяснено, что аналог ФНО-альфа и ФНО-бета сорбируются на анионообменных сорбентах. Также было обнаружено, что эти белки хорошо сорбируются на гидроксилапатите. Для их очистки использовали следующую схему:

Экстракт Хроматография_Хроматография_Диалш_Рехроматография

клеток нз ДЕАЕ-ц на ГАПе на ДЕАЕ-ц

Эта схема проще, чем известные (с использованием ультрафильтрации экстрактов клеток, применением гель-фильтрации), более технологична и процесс легко масштабируется.

В своей работе, при выборе значений рН для проведения хроматографий, мы провели серию экспериментов, результаты которых представлены в таблицах 6,7.

Таблица 6

Зависимость очистки ФНО-бета на ДЕАЕ-целлюлозе при различных значениях рН.

N. Условия Место элюции Содержание ФНО Выход ФНО Степень

ЭЛЮЦИИ ФНО-бета от суммарного от исход- очистки

(№С1, Моль/л) белка, % ного, %

1. рН 9,6 нанесение 8 40 0,8

пик 0,05-0,1 М 18 55 1.8

2. рН 9,2 нанесение 5 30 0,5

пик 0,07-0,12М 20 60 2

3. рН 8,8 нанесение 6 26 0,5

пик 0,07-0,12М 20 63 2

4. рН 8,4 нанесение 10 40 1,2

пик 0,05-0,1М 16 53 1,6

5. рН 8,0 нанесение 12 50 ■1,2

пик 0,04-0,1 М 13 42 1.3

6. рН 7,6 нанесение 13 54 1,3

пик 0,01-0,06М 12 36 1,2

Из данных таблицы 6 видно, что при хроматографической очистке ФНО-бета на ДЕАЕ-целлюлозе при рН выше 9,2 и шоке 8,8 увеличивается доля продукта, элюируемого при нанесении на колонку, при этом снижается его количество в целевой фракции, при элюции хлористым натрием. Степень очистки при этом снижается с 2 до 1,8 при рН 9,6 и до 1,6 при рН 8,4.

Из данных таблицы 7 видно, что при хроматографической очистке ФНО-бета на гидроксилапатите (в качестве второй стадии после хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе) при значениях рН выше 6,8 и ниже 6,6 увеличивается доля продукта не сорбируемого на колонку и злюируемго вместе с

13

Таблица 7

Зависимость очистки ФНО-бета на гидроксилапатите при различных значениях рН.

N. Условия Место элюции Содержание ФНО Выход ФНО Степень

ФНО-бета от суммарного от исход- очистки

(№С1, Моль/л) белка, % ного, %

1. Р1РЕБ нанесение 15 45 0,8

рН6,3 пик 0,1-0,3 М 80 50 4

2. НЕРЕБ нанесение 10 35 0,5

рН6,6 пик 0,15-0,ЗМ 98 60 5

3. НЕРЕБ нанесение 10 34 0,5

рН6,8 пик 0,15-0,ЗМ 98 60 5

4. НЕРЕБ нанесение 16 53 0,8

рН 7,1 пик 0,15-0,ЗМ 90 40 4,5

5. НЕРЕБ нанесение 50 45 2,5

рН 7,4 пик 0,12-0,ЗМ 80 35 4,0

6. К-фосфат нанесение 20 55 1

рН6,6 пик 0,1-0,3 М 90 40 4,5

7. К-фосфат нанесение 25 50 1,2

рН6,8 пик 0,1-0,3 М 95 44 4,7

8. К-фосфат нанесение 25 50 1,2

рН 6,8 пик 0,1-0,2 М 95 46 4,7

(К-фосфат)

балластными белками. При этом снижается количество продукта в целевой фракции, элюируемой хлористым натрием, и снижается значение степени очистки.

В результате, для проведения хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, было выбрано значение рН 8,9, а для проведения хроматографии на гидроксилапатите значение рН 6,8. Таким образом была разработана схема очистки ФНО-бета, позволяющая получать высокоочтценные препараты целевого белка из биомасс с его различным (от 0,5% до 10% и выше) содержанием (патент РФ 2048521).

Для очистки аналога ФНО-альфа использовали ту же схему. ФНО-альфа ИЗ 10 практически полностью сорбировался на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой при значении рН 8,3 и затем элюировался буфером со значением рН 7,2-7,4. При этом достигалась степень очистки в 1,6 - 1,7 раза с выходом целевого продукта около 75%. Аналогичный результат получался при элюции линейным градиентом №С1 от 0 до 0,15 Моль/л при значении рН 8,3. Целевой белок элюировался в этом случае при концентрации ИаС! около 0,1 Моль/л.

Для проведения второй хроматографии, на гидроксилапатите, раствор белков титровали до значения рН 6,8 перед нанесением на сорбент. Элюцию

14

белков проводили раствором калий-фосфата с повышающейся концентрацией от 0 до 0,4 Моль/л. Основной пик ФНО-альфа R31Q элюировался при концентрации калий - фосфата 0,2 - 0,33 Моль/л.

Дополнительную очистку препарата проводили при помощи рехроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе. Перед этим раствор ФНО-альфа R31Q диализовали против 10 мМ Трис-НС1-буфера, рН 8,3. При рехроматографии элюцию белков проводили линейным градиентом калий - фосфата (рН 8,3) от 0 до 0,15 М. ФНО-альфа R31Q элюировался при концентрации соли 0,07 - 0,1 Моль/л в виде довольно узкого пика и имел чистоту не ниже 95%. Данные по очистке ФНО-альфа R31Q из 3 г биомассы представлены в таблице 8.

Таблица 8 Очистка ФНО-альфа R31Q

Стадия Суммарный Содержание ФНО: Степень Выход, %

очистки белок, мг % от суммарных мг очистки

Экстракт клеток 171 29 49,6 1 100

ДЕАЕ-ц 78 48 37,4 1,65 75

ГАП 28,6 87 24,9 3 50

ДЕАЕ-ц 18,8 97 18,3 3.34 37

Аналогичные результаты по чистоте и выходу были получены при очистке аналога ФНО-альфа из различных количеств (до 50 г и выше) биомасс клеток. Разработанный процесс легко масштабируется.

Разработка метода получения белка ТВ1 (ндата в вакцины против Н1У-Г) из нез нерастворимой фракции клеток (телец включения).

При работе с белком ТВ1 (кандидат в вакцины против Н1У-1) было отмечено, что белок накапливается в клетках как в растворимой форме, так и в тельцах включения, причем в последних - в большей степени. Если при культивировании при 32°С это соотношение составляло около 1:2 -1:3, то при повышении температуры культивирования до 37°С основная масса белка находилась в тельцах включения.

Попытки очистить растворимую форму белка до необходимой чистоты не привели к желаемому результату. Для наработки белка мы использовали температуру культивирования 37°С и выделение его проводили из телец включения. Для этого суспензию клеток подвергали обработке ультразвуком до снижения в ней оптической плотности при длине волны 550 нм до 55-65% от исходной. Тельца включения осаждали центрифугированием и дважды промывали буфером, содержащим 50 мМ Трис-НС1 (рН 8,5), 1 мМ гпС12, 0, 1 мМ СиС12 и 0,5мМРМЯР.

В экспериментах по экстракции белков из полученного осадка растворами с возрастающими концентрациями мочевины было установлено, что белок ТВ1

15

растворяется практически полностью при концентрации мочевины в растворе 6 Моль/л. Поэтому извлечение его из телец включения проводили при этой концентрации при перемешивании в течение трех часов при комнатной температуре. Не растворившиеся белки отделяли центрифугированием. Практически весь белок TBI при этом находится в растворе мочевины.

Для освобождения от части балластных белков и примесей нуклеиновых кислот проводили хроматографию экстракта из телец включений на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой ДЕ-52. Белки элюировали линейным градиентом концентрации NaCl от 0 до 0,2 Моль/л в буфере, содержащем мочевину (6 Моль/л). Элюция целевого белка наблюдалась при концентрации NaCl около 0,1 Моль/л. Фракции, содержащие белок TBI, объединяли, добавляли ацетат натрия до конечной концентрации 20 мМ и снижали значение рН до 4,8, титруя раствор уксусной кислотой. После 30-минутной инкубации выпавшие в осадок балластные белки удаляли центрифугированием. Было показано, что при значениях рН 4,6-5,2 наблюдается освобовдение от значительной части балластных белков, тогда как сам белок TBI остается в растворе. Затем проводили ренатурацию белка. Для этого раствор разбавляли в два раза буфером (50 мМ трис-HCl, рН 8,5) и перемешивали в течение 3 ч при температуре 4°С. Далее раствор белков вновь разбавляли в два раза и инкубировали при перемешивании в течение 5 ч. Полученный раствор белков диализовали против того же буфера в течение ночи при температуре 4°С. Часть балластных белков при этой процедуре выпадала в осадок, который удаляли центрифугированием.

Полученный раствор ренатурнрованного белка TBI наносили на колонку с ДЕАЕ-целлюлозой и проводили хроматографию, как описано выше, но в отсутствие мочевины. Целевой белок в этом случае элюировался при концснтращш NaCl около 0,15-0,2 Моль/л. Объединенные фракции, содержащие белок TBI, диализовали против буфера, содержащего 10 мМ Трис-HCl (рН 7,6), 0,15 М NaCl (две-три смены буфера по 1 л). Выход целевого продукта (белка TBI) в процессе очистки составлял около 40% от его исходного содержания (0,7-0,9 мг из 1 г клеток), чистота белка - не менее 90%.

Применение комбинации из двух хроматографий на ДЕАЕ-целлюлозе позволило получить высокоочшценный препарат. При использовании для этих целей ряда других сорбентов (КМ-целлюлозы, фенил-сефарозы, гвдроксилапатита) нам не удалось достичь желаемой очистки от примесей. Разработанный процесс очистки также легко масштабируется.

Исследование свойств рекомбинантных белков.

Полученные препараты цитокинов и белка TBI охарактеризованы по своим физико-химическим характеристикам и биологическому действию. Для фактора некроза опухолей-бета проведен анализ аминокислотного состава и показано, что его структура соответствует ожидаемой. Определены мол.массы белков в денатурирующих условиях: для аналога ФНО-альфа - около 17300 Д, для ФНО-бета - около 16200 Д, белка TBI - 21000 Д.

16

В случае аналога ФНО-альфа (R31Q) с заменой аминокислоты Arg на Gin в 31-ом положении, для подтверждения его структурных сходств с исходным ФНО-альфа, провели ряд исследований. При гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-150 в физиологическом растворе (в нативных условиях) оба препарата ФНО вели себя одинаково и определялись во фракциях, соответствующих элюции белков с мол. массой как 17300 Д так и около 32000-35000 Д и 50000- 55000 Д. При помощи обработки сшивающим агентом было показано, что основной формой ФНО-альфа (и его аналога) в растворе является тример.

При анализе конформационной стабильности молекул ФНО использовали гель-электрофорез в градиенте мочевины. Электрофоретическая подвижность ФНО-альфа с заменой Arg на Gin в 31-ом положении была идентична для исходного ФНО и до концентрации мочевины 3 М изменялась незначительно. В интервале значений концентрации мочевины от 3 до 4 М происходило снижение подвижности. Вероятно, в этом интервале происходит кооперативное изменение структур молекул белков под действием денатурирующего агента.

Аналогичные изменения наблюдались и для молекул ФНО-бета при концентрации мочевины выше 5 М. Такие характеры перехода обычно наблюдаются у глобулярных белков со стабильной компактной структу рой.

При исследовании стабильности белка TBI гель-электрофорезом в градиенте мочевины обнаружили, что начиная с концентрации мочевины 1 Моль/л подвижность белка TBI относительно плавно (с незначительным изгибом в области концентрации 3 Моль/л) начинает замедляться, вплоть до концентрации 6 Моль/л, где практически выходит на плато, т.е. молекулы полностью разворачиваются (денатурируют). Такой характер переходов свидетельствует о небольшой стабильности компактной структуры белка.

Информация, полученная при гель-электрофорезе в градиенте мочевины полезна еще и тем, что позволяет судить о процессах ренатурации белка. Известно, что для конформационных переходов белковой молекулы при ренатурации необходим некоторый интервал времени. Исходя из полученных данных при очистке, на стадом ренатурации, мы использовали инкубацию раствора белка TBI в точках при концентрации мочевины 1,5 и 3 Моль/л. При более быстром разбавлении раствора при этих значениях концентрации мочевины белок имел склонность выпадать в осадок. Этот подход (инкубация белков при их ренатурации при определенных концентрациях мочевины, соответствующих местам их структурного перехода) можно использовать при выделении других белков, синтезируемых клетками в виде телец включений.

Значительный интерес вызывало изучение стабильности препаратов при их контакте с кровью. Известно, что в сыворотке крови преобладают преимущественно трипсиноподобные протеазы, которые могут вызывать деградацию молекул ФНО. В случае изучения стабильности ФНО-альфа и его

17

аналога R31Q выяснили, что R31Q по сравнению с исходным белком более устойчив к протеолизу. При гидролизе исходного белка до 50% (0,1%-ный раствор трипсина, 30° С) его аналог сохранялся практически полностью (87%).

Специфическая цитотоксическая активность ФНО-альфа и его мутантного аналога R31Q в отношении мышшных фибробластов L 929 в экспериментах составляла около (4-5) х107 Е/мг и (2-4) х107 Е/мг белка соответственно. Таким образом, как и следовало ожидать, замена Arg31 на Gin, аминокислоту, которая находится в этом положении у ФИО мыши и кролика, практически не повлияла на циготоксическую активность препарата. Полученные результаты дают основания надеяться, что аналог ФИО с заменой Arg31 на Gin перспективен в плане создания на его основе лекарственного противоопухолевого препарата пролонгированного действия, с меньшей вводимой дозой, чем у природного ФНО-альфа, и с меньшей системной токсичностью.

Биологическая активность препаратов ФНО-бета, определенная в том же тесте, наблюдалась высокая, около (4-8)х107 Е/мг белка.

Изучение белка TBI (кандидата в вакцины против HIV-I) только начинается. Изучены его некоторые свойства (мол. масса, стабильность). Показано, что при его введении мышам, вырабатываются антитела, специфически реагирующие как с этим белком, так и с белками оболочки вируса HIV.

Выводы

1.Выявлен 21 новый штамм-продуцент эндонуклеаз рестрикции. Рестриктазы с сайтами узнавания TGCGCA и AGGCCT в роде Bacillus были обнаружены впервые. Восемь штаммов-продуцентов имеют технологические преимущества перед штаммами-продуцентами ферментов-прототипов и перспективны для практического использования.

2.Показано, что подбор сред для культивирования продуцентов рес-триктаз Bme361 I - B.megaterium361 и BspR I - B.sphaericusR приводил к повышению выхода по ферментам в 1,7 и в 1,25 раза, предварительный селективный отбор продуктивных клонов штамма K.pneumoniae378 приводил к повышению продукции клеток по рестриктазе Kpn378 I в 2 -3 раза, а предварительное пассирование на средах с индуктором биосинтеза ресгриктаз (ДНК) в сочетании с селективным отбором высокопродуктивных клонов способствовало повышению продуктивности штамма M.luteus в 10-15 раз.

3.Разработана схема очистки: фракционирование клеточного экстракта в системе ПЭГ-декстран, хроматография на фосфоцеллюлозе и хроматография на гидроксилапатите (или гепарин-силохроме), позволяющая получать высокоочищенные препараты эвдонуклеаз рестрикции. Установлено, что контроль степени разрушения клеток при извлечении из них целевых белков, позволяет уже на этой стадии уменьшить содержание примесей в целевой фракции и тем самым упростить процедуру дальнейшей очистки.

18

Разработан, синтезирован и апробирован сорбент - гепарин-силохром, который может быть использован для очистки рестриктаз.

4.Изучена стабильность рекомбинантных штаммов-продуцентов факторов некроза опухолей при культивировании и установлено, что снижение содержания целевых белков в биомассах обусловлено не деградацией плазмидных ДНК, а накоплением в культуре безплазмидных клеток.

5.Предложена схема получения биомасс, которая включает использование отдельных, высокопродуктивных клонов трансформированных клеток для получения посевного материала, использование в качестве посевного материала культуры клеток в первой трети логарифмической фазы роста, обработанной ампициллином в концентрациях 400-500 мкг/мл в течение 2-3 ч и сбор клеток, когда культура находится в конце лог. фазы роста. Ее применение позволяет повысить содержание целевых белков в биомассах при культивировании рекомбинантных клеток с плазмидами, содержащими в качестве генетического маркера ген Ыа (ФНО-бета с 1-9% до 13-15%, ФНО-альфа с 15-25% до 35-40%).

6.Разработана технология выделения и очистки факторов некроза опухолей, включающая в себя разрушение клеток ультразвуком и последующие хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, гидроксилапатите и рехроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе, позволяющая получать высоко-очищенные препараты белков.

7.Разработан метод выделения и очистки белка TBI (кандидата в вакцины против HIV-I) из телец включения, позволяющий получать высокоочищенный препарат.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1.Лебедев Л.Р. "Использование гепарин-силохрома для выделения и очистки рестриктаз".//Тез. докладов международной конф. "Получение, исследование, применение антибиотиков и биологически активных веществ". Москва.-1990.-с.7.

2.Лебедев Л.Р., Репин В.Е., Дегтярев С.Х., Пустошилова Н.М. "Выделение и изучение свойств эндонуклеазы рестрикции Rsa I из Rliodopseudomonas spheroides".//npiHui. биохимия и микробиология,- 1991.-Т.27.-Вып,3.-с.331-338. З.Зернов Ю.П., Лебедев Л.Р., Чижиков В.Е., Бабкин И.В. "Установление субстратной специфичности эндонуклеазы рестрикции Крп 378 I". //Биоорган.Х1»шя.-1990.-Т.16.-К5-с.603-604.

4.Лебедев Л.Р., Пустошилова Н.М. "Выделение рестриктазы Sau 96 I, ее физические и каталитические свойства"./ЯТрикл. биохимия и микробиология. -1990.-Т.26. -Вып. 5 .-с.602-608.

5.Андреева И.С., Афиногенова Г.Н., Лебедев Л.Р., Пустошилова Н.М., Чижиков В.Е., Поздняков "Установление субстратной специфичности сайт-специфической дезоксирибонуклеазы Rtr Г'.//Биоорган.химия.- 1991.-Т. 17.-N.2.-C.277-279.

6.Андреева И.С., Афиногенова Г.Н., Лебедев JI.P., Надолинная И.Г., Пусто-шилова Н.М. "Крп 378 I - эндонуклеаза рестрикции 2-ого класса из Klebsiella pneumoniae". //Молек. генетика, микробиол. и вирусол,- 1991.-N.2.-C.31-32.

7.Андреева И.С., Афиногенова Г.Н., Лебедев Л.Р., Пустошилова Н.М., Майстренко Г.Г., Гордиенко Н.Я. "Сайт-специфическая эндонуклеаза рестрикции Rme 21 I из Rhizobium теЫой".//Молск. генетика, микробиол. и вирусол.-1991.-Ы,3.-с.30-31.

8. Андреева И.С., Лебедев Л.Р., Серов Г. Д., Денисова Л.Я., Пустошилова Н.М. "Вте 361 I - новая сайт-специфическая дезоксирибонуклеаза II типа из Bacillus megaterium 36Г'.//Прикл. биохимия и микробиология.-1992.-Т.28,-Вып.2.-с. 173-177.

9.Андреева И.С., Афиногенова Г.Н., Лебедев Л.Р., Зернов Ю.П., Серов Г.Д., Чижиков В.Е., Пустошилова Н.М. "Эндонуклеазы рестрикции: выявление новых штаммов продуцентов и получение ферментных препаратов".//Биологические науки.-1992.-К.2.-с.ЗЗ- 40.

Ю.Коробко В.Г., Добрынин ВН., Давыдов И.В., Лебедев Л.Р., Гилева И.П., Пустошилова Н.М., Петренко В. А. "Получение и бактериальная экспрессия му-тантного гена лимфотоксина человека".//Биоорган. химия.-Т.19.-Ы.4.-с.414-419. П.Репин В.Е., Лебедев Л.Р., Серов Г.Д., Бабкин И.В., Чижиков В.Е. "Установление субстратной специфичности эндонуклеазы рестрикции Bstl I". //Сибирский биологический журнал.-1992.-Вып.6.-с. 15-16.

12.Репин В.Е., Лебедев Л.Р., Чижиков В.Е., Терещенко Т.А. "Всо11б I -новый изошизомер эндонуклеазы рестрикции Ksp632 Г'.//Биоорган. химия.-1993.-T.19.-N.4.-C.410-413.

13.Репин В.Е., Серов Г.Д., Лебедев Л.Р, Пучкова Л.И., Терещенко Т.А, Чижиков В.Е. "Новые эндонуклеазы рестрикции типа II из термофильных бактерий рода ВасШи5".//Биоорган.химия.-1993.-Т. 19,- N.5.C.583-585.

14.Корепанова A.B., Ерошкин А.М., Иванисенко М.А., Мнкрюков H.H., Лебедев Л.Р., Пустошилова Н.М., Петренко В.А., Ильичев А.А "Получение мутантного фактора некроза опухолей человека с повышенной устойчивостью к протеазам".//Мол.биология.-1994.-Т.28.- Вып. 1.-е. 143-149.

15.Repin V.E., Lebedev L.R., Puchkova L., Serov G.D., Tereschenko Т., Chizikov V.E., Andreeva I. "New restriction endonucleases from thermophilic soil bacteria".//Gene.-157. -p.321 -322.

lö.Eroshkin AM., Karginova E.A, Gileva I.P., Lomakin A.S., Lebedev L.R., Kamynina T.P., Pereboev A.V., Ignatiev G.M. "Desing of four-helix-bundle protein as a candidate HIV vaccine".//Protein Engeneering.-1995.-V.8.-N.2.-p.l67-173.

17.Лебедев Л.Р., Зернов Ю.П., Андреева И.С., Пустошилова Н.М. "Разработка технологии получения фактора некроза опухолей и его исследования". //Биотехнология.-1995. -N. 12.-е. 19-24.

18.Лебедев Л.Р., Андреева И.С., Пустошилова Н.М. "Исследование биосинтеза рекомбинантного лимфотоксина человека в клетках E.coli".//Биотехнология. -1996.-N.1.-C.9-12.

"Исследование биосинтеза интерферона алъфа-2 и факторов некроза Кухолей на стадиях культивирования".//Молек. генетика, микробиол. и

120.Erosbkin A.M., Smolina MI., Pokrovsky A.G., Ignat'ev GM, Lebedev LI, Eroshkina G.A"Desing of artificial T and В cell epitope containing protein TBI, candidate for HIV-I vaccine".// 4th intern.conf. "AIDS, Cancer and Related Problems". -St.-Petergurg. - 1996.-p.57.

21. Пусто Шилова H.M., Путинцева Н.И., Лебедев Л.Р. "Фактор некроза опухо-лей-бета (лимфотоксин): современное состояние и перспективы использования". //ГНИИЭМП. Минэкономики РФ. Химико-фармацевтическое производство. Обзорная информаыия.-М.-1997.-Вып. I.-26C.

22.Лебедев Л.Р., Ерошкин AM., Гнлева КП. "Способ получения синтетического белка- кандидата в вакцины против ШУ-Г'.//Биотехн6логия.-1997.-№ 7-8,-с.38-42.

23.Ас. 1631080 "Штамм бактерий B.megaterium 361 - продуцент рестриктазы Вше 361 I". Андреева И.С., Лебедев Л.Р., Пустошилова Н.М., Серов Г.Д Б.и-1991-.N.8.

24.A.c. 1659480 "Штамм Kpneumoniae 378 - продуцент эндонуклеазы рестрикции Крп 378 Г. Андреева И.С., Афиногенова Г.Н., Зеряов Ю.П., Лебедев Л.Р., Пустошилова Н.М. Б.И.-1991.-К24.

25. Ас. 1738853 "Способ получения биомассы Micrococcus lúteas, обогащенной эвдонуклеазой рестрикции MluI". Лебедев Л.Р., КорсунЛЛ. Б.и.-1992.-К21.

26.А.С. 1752769 "Способ получения рестриктазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GTCGAC". Андреева И.С., Афиногенова Г.Н., Лебедев Л.Р., Пустошилова Н.М., Гордиенко Н.Я., Майстренко Г.Г. B.H.-1992.-N.29.

27. Патент РФ 2001952 "Штамм Rhizobium leguminosaram 69 - продуцент эндонуклеазы рестрикции Rie 69 I". Лебедев Л.Р., Андреева И.С., Гордиенко Н.Я., Майстренко Г.Г., Репин В.Е., Пустошилова Н.М. E.n.-1993.-N.39-40.

28.Патент РФ 2048521 "Способ получения полипептида со свойствами лимфо-токскна человека". Гилева RH, Коробко В.Г., Давыдов И.В., Лебедев Л.Р., Петренко В. А, Пустошилова H M. Б.И.-1995.-М.32.

29.Положительное решение от 11.05.95г. по заявке 93003627/13 "Штамм бактерий B.schlegelii-продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 -CCNNNNNNNGG-3. " Репин В.Е., Терещенко Т. А, Лебедев Л.Р. Б.и.-1995.-К29.

30.Положительное решение от 30.01.95г. по заявке 94005709/13 "Штамм бактерий Bacillus coagulans-продуценг эндонуклеазы рестрикции Всо116 I". Регата В.Е., Терещенко Т. А., Лебедев Л.Р. Б.И.-1995.- N.20. Патент РФ 2054040.

31.Положительное решение от 23.04.98г. о выдаче патента по заявке № 97103807/13 "Способ получения биомассы рекомбинакгного штамма бактерий E.coli, обогащенной полипептидом со свойствами лимфотоксина человека". Лебедев Л.Р., Андреева И.С., Пустошилова Н.М.

;ирусол.-1996.-КЗ.-с.23-26.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лебедев, Леонид Рудольфович, Бердск

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ВИРУСОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ "Вектор". НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ КОНСТРУКТОРСКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ПРИРОДНЫХ И РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЖОВ ИЗ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

На правах рукописи

ЛЕБЕДЕВ Леонид Рудольфович

Специальность - 03.00.23 - биотехнология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель к.б.н. Пустошилова Н.М.

Бердск - 1998

ВВЕДЕНИЕ 3

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6

Получение препаратов белков из

прокариотических клеток 6

Получение ферментов (эндонуклеаз рестрикции) 6

Способы анализа микроорганизмов на наличие эндонуклеазной активности 6

Способы выделения и очистки эндонуклеаз рестрикции 8 Способы исследования субстратной специфичности ферментных препаратов 20

Получение рекомбинантных белков 25

Способы создания штаммов-продуцентов рекомбинантных белков 25

Способы получения и очистки рекомбинантных белков 28 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 39

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 48

1 Выявление новых штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикций и разработка технологии выделения и очистки ферментных препаратов 48

1.1 .Выявление новых штаммов-продуцентов

эндонуклеаз рестрикции 48

1.2.Разработка способов повышения продуктивности штаммов по ферментам 51

1.3.Разработка технологии выделения и очистки эндонуклеаз рестрикции 54

1.4.Установление субстратной специфичности новых ферментов 62

2.Разработка технологии получения рекомбинантных белков 70

2.1.Изучение стабильности штаммов-продуцентов рекомбинантных белков и разработка способов повышения их продуктивности 70

2.2.Разработка технологии получения препаратов факторов некроза опухолей из растворимой

фракции клеток 79

2.3. Разработка метода получение белка (кандидата

в вакцины против ШУ-1) из нерастворимой фракции клеток (телец включения) 86

2.4 .Исследование свойств рекомбинантных белков 92

ВЫВОДЫ 96

ЛИТЕРАТУРА 98

ПРИЛОЖЕНИЯ 116

ВВЕДЕНИЕ

В современной биотехнологии проблемы получения функционально и химически чистых биологически активных веществ и анализ их биологических функций являются чрезвычайно актуальными на всех этапах разработки биопрепаратов, а отсутствие информации о физико-химических свойствах получаемых веществ и физиолого-биохимических особенностях микроорганизмов-продуцентов являются основным из сдерживающих факторов интенсификации микробиологического синтеза, выделения и применения биологически активных веществ. Изучение физиологии и биохимии продуцентов, как природного происхождения, так и рекомбинантных штаммов, необходимо для оптимизации питательных сред, условий культивирования и целенаправленного управления микробиологическим синтезом. Именно благодаря развитию и совершенствованию вышеперечисленного комплекса методов возможен дальнейший прогресс в развитии этой науки.

В последние годы, в связи с накоплением знаний по изучению связи между "архитектурой" и биохимическими свойствами белковых молекул, появилась возможность создания новых белков путем биосинтеза и клонирования искусственных генов. Наибольшие успехи достигнуты в работах с E.coli, которая стала центральным объектом исследований благодаря генетической изученности. Успешно для этих целей используются и другие микроорганизмы. Клетки микроорганизмов применяют, в частности, для биосинтеза и наработки таких важных полипептидов как цитокины, иммуномодуляторы, факторы роста, белки оболочек вирусов и многих других. Все эти микроорганизмы-продуценты созданы при помощи трансформации их рекомбинантными плазмидами, т.е. методами генетической инженерии.

Одним из основных моментов зарождения генетической инженерии было открытие сайт-специфических эндодезоксирибонуклеаз (эндонуклеаз рестрикции, рестриктаз). И дальнейшее развитие ведущих направлений биологической науки (молекулярно-генетических исследований и генетической инженерии, в частности) и ее прикладных аспектов, имеющих самое непосредственное отношение к решению биотехнологических проблем, во многом зависит от доступности широкого ассортимента рестриктаз различной субстратной специфичности.

Эндонуклеазы рестрикции являются одним из незаменимых инструментов при определении первичной структуры ДНК, создании рекомбинантных молекул ДНК, исследованиях генетического материала как природного, так и созданного искусственно.

Как при получении ферментов нуклеинового обмена (в частности -эндонуклеаз рестрикции), так и при получении биологически активных белков с использованием рекомбинантных ДНК, приходится решать комплекс проблем. С практической точки зрения процессы получения биологически активных веществ из прокариотических клеток можно разделить на ряд взаимосвязанных этапов:

а)поиск, селекция, создание штаммов-продуцентов БАВ, разработка методов и способов повышения их продуктивности в ходе культивирования штаммов и наработки биомасс;

б)разработка комплекса методов и способов извлечения целевых БАВ (в частности - белков) из клеток, выделения и очистки последних до необходимой степени чистоты (или до гомогенности);

в)характеристика получаемых препаратов по их функциональным свойствам.

Решение вопросов по каждому этапу, основанное на использовании последних достижений микробиологии, биохимии, генной инженерии и других наук, безусловно внесет существенный вклад в развитие биотехнологии и будет использовано для получения биологически активных веществ.

Сегодня биотехнология во всем мире рассматривается как самая перспективная с точки зрения практики область знаний. Проводятся опыты по созданию живых вакцин, создаются трансгенные животные, широко дискутируются вопросы о клонировании человека и т.д. Продолжающийся подъем биотехнологии постоянно требует устойчивого и полного обеспечения генно-инженерных, диагностических и др. работ ферментами обмена нуклеиновых кислот, и, в первую очередь, широким спектром эндонуклеаз рестрикции. Как следует из вышеописанного, они необходимы не только при создании генно-инженерных конструкций, но и для их дальнейшего контроля в ходе практического использования. Вследствие этого, поиск новых штаммов-продуцентов и разработка методов получения ферментов расширяют возможности вышеупомянутых работ.

Целью настоящей работы является выявление новых штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции, разработка комплекса приемов и методов, позволяющих получать из прокариотических клеток препараты белков как природного происхождения, так и рекомбинантных.

В задачу проведенных исследований входило развитие и оптимизация современных методов повышения уровня целевых белков в штаммах-продуцентах биологически активных веществ, процессов разделения и анализа биоорганических соединений.

У

На защиту выносится:

1.Выявление 21-ого нового штамма-продуцента эндонуклеаз рестрикции. Разработка методов повышения продуктивности штаммов.

2.Разработка способов выделения и очистки эндонуклеаз рестрикции. Разработка нового сорбента для их хроматографической очистки.

3.Изучение стабильности рекомбинантных штаммов-продуцентов факторов некроза опухолей и разработка комплекса методов, позволяющих повысить содержание целевых продуктов в биомассах.

4.Разработка технологий выделения и очистки рекомбинантных белков из растворимой фракции клеток: аналога фактора некроза опухолей-альфа и фактора некроза опухолей-бета.

5.Разработка способа выделения и очистки рекомбинантного белка из нерастворимой фракции клеток (телец включения): белка ТВ1 -кандидата в вакцины против Н1У-1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Получение препаратов белков из прокариотических клеток

Получение ферментов (эндонуклеаз рестрикции).

Получение рекомбинантных белков путем биосинтеза их в прокариотических клетках стало возможным благодаря развитию методов генетической инженерии. Успешное же развитие молекулярной биологии и генетической инженерии и их прикладных направлений трудно себе представить без наличия необходимого энзимологического инструментария, способного специфически фрагментировать и модифицировать нуклеиновые кислоты. И одной из актуальных задач при этом является расширение спектра этих ферментов, в том числе - эндонуклеаз рестрикции II типа (рестриктаз, КФ 3.1.23.Х). Исследованиям по распространенности, функциям и прикладным аспектам эндонуклеаз рестрикции посвящено значительное количество обзоров [1-9 и др.]. Несмотря на то, что к настоящему времени открыто более 2500 ферментов, представленных 188 специфичностями [10], их поиск интенсивно продолжается [11-14]. В данном разделе обзора рассмотрены основные методологические аспекты получения рестриктаз.

Способы анализа микроорганизмов на наличие эндонуклеазной активности.

Для получения новых эндонуклеаз рестрикции на первом этапе, как правило, проводится поиск штаммов-продуцентов ферментов с новой специфичностью или же более технологичных продуцентов рестриктаз известной специфичности. Важное значение при этом имеет выбор способа, позволяющего быстро анализировать большое количество штаммов и имеющего высокую чувствительность. Биологические подходы, заключающиеся в ограничении размножения бактериофагов в исследуемых культурах [15-16], не нашли широкого применения в силу их громоздкости, длительности и низкой результативности. Суть их заключалась в том, что, имея набор различных фагов, размножающихся на представителях анализируемого рода или вида бактерий, и, наблюдая за ограничением развития фагов бактериями в зависимости от предшествующего хозяина, можно выявлять различные системы рестрикции-модификации, присущие данному таксону. Реализация этого метода в первую очередь зависит от наличия у исследователя фагов с широким кругом хозяев и набора идентифицированных бактериальных хозяев. Также следует учитывать, что фаги в процессе эволюции взаимоотношений вирус-клетка смогли выработать различные способы, предотвращающие деградацию своей ДНК при проникновении в бактериальную клетку [17-18]. Используемый фаг

может и не иметь сайтов узнавания на своей ДНК для рестриктазы. Например, для вида Staphylococcus aureus известно существование так называемого сверхвирулентного фага Sb-1. Этот фаг развивается в бактериях данного вида независимо от наличия в них систем рестрикции-модификации. Исследование структуры ДНК фага не выявило ни одного сайта для разрезания рестриктазой Sau ЗА I [18]. Кроме того, биологическим методом трудно оценить продуктивность найденного штамма по рестриктазе. Попытки визуально оценить активность рестриктаз по темпам лизиса Bacillus globigii бактериофагом SP 50 показали, что эту оценку следует считать качественной [19].

Применение биохимических методов (ультрацентрифугирование продуктов гидролиза субстратной ДНК в градиенте сахарозы и анализ продуктов гидролиза вискозиметрическим методом) для поиска и идентификации специфических эндонуклеаз завершилось открытием одной из первых рестриктаз II типа-Hind II [20]. Немногим ранее были обнаружены рестриктазы из штаммов Е. coli [21,22].

Предложенный в дальнейшем электрофоретический метод для разделения продуктов гидролиза ДНК [23,24] позволил проводить целенаправленный широкомасштабный поиск эндонуклеаз рестрикции.

В первых работах, посвященных поиску рестриктаз, авторы анализировали их активность в частично очищенных экстрактах клеток [25]. Было показано, что введение дополнительных стадий очистки рестриктаз или изменение существующих позволяет обнаружить новые штаммы-продуценты, дававшие отрицательный результат при первичной их проверке [26]. С расширением объема работ по поиску ферментов возникла необходимость в

максимально упрощенных методах, позволяющих провести массовое тестирование проверяемых штаммов. В результате появились работы с описанием приемов экспресс-анализа небольших объемов исследуемых культур на наличие рестриктазной активности [27,28]. Соколов Н.Н. и соавт. [27] предложили для извлечения рестриктаз из клеток использовать обработку 1 мл суспензии клеток 0,1 мл толуола в течение 10 мин с последующим анализом водной фазы. В последующих работах они использовали этот метод для обнаружения рестриктазных штаммов [29,30]. Whitehead P.R. и Brown N.L. [28] использовали для анализа клетки, полученные из 4 мл культуры, которые они суспендировали в растворе, содержащем сахарозу, лизоцим и ЭДТА, затем к суспензии добавляли детергент Brij-58 и MgCb . После инкубации клетки удаляли, а полученную надосадочную

жидкость использовали для анализа на наличие специфической эндонуклеазной активности.

Наиболее простым в настоящее время методом массового

скрининга штаммов является способ, разработанный Белавиным П.А., Дедковым В.С. и Дегтяревым С.Х. [31]. Предложенный прием представляет собой упрощенный и усовершенствованный метод Whitehead P.R. и Brown N.L. [28]. Основным различием между ними, позволяющим значительно снизить трудоемкость, является использование в качестве исходного материала биомассы отдельных колоний, выращенных на агаризованной среде. Так же есть отличия и при разрушении клеток - в последнем случае разрушение проводится в один этап (15 мин при комнатной температуре) и клетки суспендируются в буферном растворе, содержащем в качестве пермеализующих агентов тритон Х-100 и лизоцим. Метод отличается большой чувствительностью. При его использовании обнаружено значительное число рестриктазных штаммов [32-35]. Среди проверенных культур положительные результаты были получены со штаммами, принадлежащими к родам Bacillus, Kurthia, Paracoccus, Vibrio, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Providencia, Flavobacterium и к ряду других, отрицательные со Streptomyces и Nocardia [31]. Поэтому авторы при исследовании штаммов Streptomyces и Nocardia для их пермеализации использовали более жесткие условия -неионный детергент NF-40 вместо тритона Х-100 и относительно высокие концентрации NaCl (до 1М) [36]. Репин В.Е. и Дегтярев С.Х. [37], используя метод анализа отдельных колоний, проанализировали ряд способов разрушения клеточных стенок. Сравнивались

"толуольный" [27], "сферопластный" [28] и "тритоновый" [31]. Методы анализа различались по чувствительности: наивысшая была отмечена для тритонового метода [31]. В дальнейшем, используя этот метод, авторы обнаружили ряд новых штаммов-продуцентов рестриктаз [9,38].

Следует отметить, что существует ряд причин, по которым имеющиеся в клетках специфические нуклеазы могут быть и не обнаружены. Среди них - отсутствие сайтов узнавания в субстратной ДНК, используемой в исследовании, имитация отсутствия сайтов узнавания природными модификациями субстратов в виде метилирования [26]. Рестриктазная активность также может маскироваться большой активностью неспецифических нуклеаз. Случаи отсутствия пермеализации могут быть идентифицированы визуально (например, по отсутствию в экстрактах клеточных нуклеиновых кислот) и клетки могут быть подвергнуты другим методам вскрытия [4].

Способы выделения и очистки эндонуклеаз рестрикции.

Для изучения субстратной специфичности рестриктаз в большинстве случаев необходимы их очищенные препараты. Для их практического использования в качестве аналитических реагентов

требуется их высокая функциональная чистота, т.е. отсутствие примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз.

Основными этапами выделения любого внутриклеточного фермента, в том числе - рестриктаз, является получение экстракта клеток и собственно очистка целевого белка. Сам процесс очистки может быть разделен на этапы:

а)удаление дебриса (обломков клеток, рибосом, липидов и др.);

б)удаление нуклеиновых кислот и "грубое" фракционирование белков;

в)получение фермента, пригодного для физического картирования

(удаление значительной части балластных белков);

г)получение высокоочищенного препарата фермента, пригодного для генно-инженерных работ (удаление микропримесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз);

Разрушение клеток для получения их экстракта можно проводить различными способами. Большое распространение для этой цели получила обработка клеточной массы ультразвуком [39-81], иногда клетки перед этим обрабатываются лизоцимом [19,41-43,67,68,72-79], лизостафином [43]. Некоторые авторы ограничивались только инкубацией клеток с лизоцимом [82], с лизоцимом и тритоном Х-100 [83].

В ряде случаев авторы для разрушения клеток использовали пресс Френча [84-87], реже - растирание клеток с селикагелем [88], смесью алюминия [89], разрушение при помощи стеклянных шариков [19,90], использовали осмотический шок [91], экстракцию органическими растворителями [27]. Mayer H. и Reichenbach H. сравнивали три различных метода разрушения клеток: ультразвуковую дезинтеграцию, осмотический шок и механический способ (при помощи гомогенизат