Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии и методов контроля производства реагентов для транскрипции ДНК в системе in vitro

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии и методов контроля производства реагентов для транскрипции ДНК в системе in vitro"

российская академия сельскохозяйственных наук

:ероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. я.р. коваленко

РГЗ OA t. м айв ш';

На правах рукописи УДК 577.214

КОВАЛЕВ Сергей Юрьевич

' РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ И МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ ПРОИЗВОДСТВА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ТРАНСКРИПЦИИ ДНК В СИСТЕМЕ in vitro

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте прикладной микробиологии и на Омутнинском химическом заводе.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

А.П. Простяков доктор биологических наук

C.B. Кузнецова

Ведущая организация: Институт вирусологии имени Д.И. Ивановского

РАМН

час. на заседании специализированного совета Д 020.28.02. по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ Автореферат разослан 1994 г.

I

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук Г.А. Трондина

Научные руководители: доктор ветеринарных наук

Р.В. Боровик кандидат биологических наук Ю.В. Ремнев

Защита диссертации состоится

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Развитие молекулярной биологии во многом зависит от наличия качественных реактивов, а предлагаемая номенклатура реактивов для молекулярно-биологических исследований и прикладных целей в Российской федерации пока еще .крайне ограничена. Использование фаговых ДНК-зависимых РНК-полимераз открыло широкие возможности для синтеза РНК в системе in vitro. Для этой цели крайне важно применение целевых наборов высококачественных реагентов для синтеза РНК. Отечественные реагенты, выпускаемые отдельными лабораториями и кооперативами для этих нужд, во многих случаях не отвечают требуемому качеству, уступают зарубежным препаратам. Детали промышленного производства наборов за рубежом являются "ноу хау" и не могут быть использованы в отечественном производстве.

В настоящее время за рубежом широко используются наборы реагентов для синтеза РНК в системе in vilro. Эти наборы содержат Т7 и SP6 РНК-полнмеразы, ингибитор РНКаз из плаценты человека, риботрифосфаты, плазмиду с Т7 и (или) SP6 промоторами, контрольную матрицу и буферный раствор для проведения реакции транскрипции. Этот комплекс обеспечивает гарантированное получение высокомолекулярных РНК в требуемом количестве с заданными свойствами, что значительно облегчает решение задач по получению диагностических гибридизационных "зондов", синтезу белка in vitro и получение антисмысловых РНК. Отечественной промышленностью подобные наборы не выпускаются.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы является совершенствование промышленной технологии получения реагентов для синтеза РНК в системе in vitro и создание на их основе в транскрипционных наборов. Конкретными задачами исследования является: 1) разработка 'производственной методики выделения ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7; 2) совершенствование технологии производства ингибитора РНКаз из плаценты человека; 3) оптимизация методов получения РНК транскриптов в системе in vitro с использованием полученных реагентов; 4) разработка технических условий и производственной методики на получение транскрипционных наборов; 5) изучение условий длительной стабилизации ферментативной активнд£ги Т7 РНК-полимеразы.

Научная новизна работы.

Предложена новая технология производства наборов для транскрипции в системе in vitro с • использованием отечественных реагентов. Разработана оригинальная технология выделения ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7, позволяющая получать в заводских условиях фермент гарантированного качества. Проведено совершенствование технологии производства ингибитора РНКаз из плаценты человека, заключающееся в сокращении стадий выделения ингибитора, что позволяет получать препарат высокой удельной активности. Представлены новые данные по оптимизации методов получения и контроля качества транскриптов в системе in vitro. Показана эффективность ингибитора РНКаз из плаценты человека в отношении увеличения стабильности при хранении и повышении активности РНК полимеразы фага Т7.

Практическое значение работы.

На основании проведенных исследований разработана производственная методика и технология производства транскрипционных наборов. Получены опытные образцы и опытные партии наборов. Созданы предпосылки для серийного выпуска транскрипционных наборов с целью получения высокомолекулярных РНК в требуемом количестве с заданными свойствами. Разработана необходимая нормативно-технологическая документация для выпуска транскрипционных наборов:

а) производственная методика на получение транскрипципционного набора;

б) технические условия на транскрипционный набор;

в) дополнения и изменения к производственным методикам выделения Т7 РНК-полимеразы и ингибитора РНКаз из

плаценты

человека.

На защиту выносится.

Новые экспериментальные данные по совершенствование технологии выделения Т7 РНК-полимеразы и ингибитора РНКаз из плаценты человека. Данные по оптимизации транскрипционных наборов с использованием полученных реагентов. Способы стабилизации и повышения активности Т7 РНК-полимеразы.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, в которых рассмотрены основные аспекты применения транскрипционных наборов m основе бактериофаговых РНК-полимераз в практике молекулярно-5иологических исследований, а также известные лабораторные методы шделения РНК-полимеразы бактериофага Т7, белкового ингибитора ?НКаз из плаценты человека и их физико-химические свойства; жспериментальной части, включающей материалы и методы исследований; результатов и их обсуждения; выводов и практических тредложений. Материалы изложены на 102 страницах машинописного текста, содержат 18 рисунков и 6 таблиц. Список литературы включает Л наименований. Приложения на 12 листах содержат перечень утвержденной нормативно-технической документации и отзывы научных учреждений-потребителей Т7 РНК-полимеразы и ингибитора РНКаз из глаценты человека о качестве препаратов. *"""

\пробация работы.

Материалы диссертации доложены на 2-ой отраслевой конференции -конкурса молодых ученых (Новосибирск, 1990), на :еминаре отдела функциональной биохимии ГНИИ ПМ (Оболенск, 1992). Основные результаты работы изложены в трех публикациях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Разработка технологии получения Т7 РНК-полимеразы из :уперпродуцента E.coli HB 101/pAR 13.

Первым этапом исследований по разработке опытно - промышленной технологии получения РНК-полимеразы фага Т7 была сравнительная эценка лабораторных методов получения Т7 РНК-полимеразы, эписанных в литературе.

Данные экспериментов, полученные после их воспроизведения показали, что они мало пригодны для производственных условий.

Препараты Т7 РНК-полимеразы, полученные с помощью одностадийного метода хроматографической очистки на аффинном сорбенте Цибакрон голубой-сефароза, обладали РНКазной активностью. Таким же свойством обладала РНК-полимераза, выделенная цвустадийной процедурой с использованием ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе ДЕ-52 и на аффинном сорбенте Цибакрон голубой-сефароза. Кроме того, удельная активность Т7 РНК-полимеразы, полученной двустадийной хроматографией не превышала 10-15 ед.а/мкл, тогда как ведущие западные фирмы производят этот препарат с активностью 70-80

ед.а/мкл. Конечный выход Т7 РНК полимеразы при воспроизведении обоих лабораторных методик составлял не более 10% от количества фермента, содержащегося в лизате. Было отмечено также, что готовый ферментный препарат терял свое активность в процессе хранения в среднем на 30% в месяц.

Таким образом, присутствие нуклеазных примесей, низкая удельная активность, а также резкое падение активности при хранении не позволяли эффективно использовать Т7 РНК-полимеразу в качестве реагента в транскрипционном наборе для синтеза РНК в системе in vitro. В основе разработанной опытно - промышленной технологии были использованы лабораторные методы очистки Т7 РНК-полимеразы. При этом ставились задачи: 1) получить препарат свободный от рибонуклеазных примесей; 2) выделить РНК-полимеразу с высокой удельной активностью; 3) увеличить выход готового продукта; 4) стабилизировать ферментный препарат в процессе хранения. Поставленные задачи были решены следующим образом. Для увеличения выхода готового продукта осаждение из лизата нуклеиновых кислот, к которым фермент обладает большим сродством, проводили внесением стрептомицин сульфата в конечной концентрации "0.3-0.4%, что позволяло максимально извлечь нуклеиновые кислоты вместе с ферментом из лизата. Далее, освобождались от нуклеиновых кислот, препятствующих успешному проведение хроматографии на аффинном сорбенте Цибакрон голубой-сефароза из-за высокого сродства фермента к нуклеиновым кислотам, хроматографией на ионообменном сорбенте ДЭАЭ-целлюлозе ДЕ-52 (рис.1). Это позволило снизить концентрацию нуклеиновых кислот в ферментном препарате до 3-4% и повысить выход фермента на стадии аффинного сорбента с 10% до 40%. Для увеличения удельной активности ферментного препарата на конечной стадии очистки была использована хроматография на аффинном сорбенте ДНК-агароза (рис.2), позволяющая получать ферментный препарат с высокой удельной активностью до 100 ед.а/мкл, кроме того на этом сорбенте происходила доочистка фермента от рибонуклеазных примесей.

В итоге опытно-промышленная технология получения Т7 РНК-полимеразы состоит -из следующих стадий: 1) культивирование суперпродуцента E.coli и лизис клеточной биомассы; 2) осаждение нуклеиновых кислот стрептомицин сульфатом; 3) экстрагирование фермента из осадка нуклеиновых кислот 0,2 М хлоридом аммония; 4) ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлоза ДЕ-52; 5) аффинная хроматография на голубой сефарозе; 6) аффинная хроматография на ДНК-агарозе.

С учетом внесенных изменений разработан новый способ выделения Т7 РНК-полимеразы. Полученные по нему ферментные препараты обладали активностью 70-100 ед.а/мкл, 30-40% выходом, свободные от рибонуклеазной активности (см.табл 1).

Номер фракции

Рис.1. Хроматограмма очистки Т7 РНК-полимеразы на ДЭАЭ-целлюлозе ДЕ-52.

« - относительная концентрация НК (%); *—* - поглощение при 280 нм; о--о - активность фермента (ед/мкл); ----концентрация N11401 (М).

10 15 20 Ноыер фракции

! в. о

о*

и

и

гг а о а

Рис. 2. Хроматограмма очистки Т7 РНК-полимеразы на аффинном сорбенте ДНК-агароза. •—• - поглощение при 280 нм; Л—А - активность фермента (ед/мкл); ____- концентрация ЫЩС! (М).

Таблица 1.

Результаты экспериментов по выделение Т7 РНК-полимеразы по вновь разработанной технологии.

Кол-во Общая Удельная Выход

Степень

Стадии очистки белка по Лоури (мг) активн. ед.акт. активность ед.акт./мг белка (%) очистк

Осветленный лизат 405 625000 1543 100 _

экстракт осадка НК 26.3 511000 19210 81.8 12.5

После ДЭАЭ-целлюлозы 14.9 434000 29130 69.5 18.9

ДЕ-52

После аффинного сорбента 5.0 328000 65600 52.5 42.6

голубая сефароза

После аффинного сорбента 1.8 256000 142200 40.9 92.3

ДНКагароза

Разработка путей стабилизации ферментативной активности Т7 РНК-полимеразы в процессе хранения.

В результате проведенных исследований нами было установлено, что внесение в ферментный препарат неионных детергентов, таких как Тритон Х-100 и Нонидет Р-40 в концентрации 0.1% приводило к стабилизации ферментативной активности на 25% по отношению к контролю. Следует отметить, что данная концентрация детергента близка в данных условиях к критической концентрации мицеллообразования, которая составляет для данного детергента 3.3*10 М. Иными словами при концентрации 0.1% детергента Тритон Х-100 происходило образование мицелл, которое, по всей вероятности, препятствовало ассоциации белковых молекул Т7 РНК-полимеразы в процессе хранения, что сказывалось на повышении стабильности фермента. Кроме детергентов, для стабилизации ферментативной активности Т7 РНК-полимеразы нами был использован белковый ингибитор РНКаз из плаценты человека. В результате, внесение ингибитора приводило к увеличение стабильности фермента в процессе хранения до 28% по отношение к контролю. Совместное внесение в ферментный препарат и Тритона Х-100 и ингибитора РНКаз приводило к еще большему увеличение стабильности ферментативной активности в процессе хранения и результат более чем на 40% превышала таковой в контроле (рис.3).

Выбор в пользу ингибитора РНКаз был сделан нами потому что, производимый ферментный препарат Т7 РНК-полимеразы предназначался для использования в транскрипционном наборе, в который также входит и

ингибитор РНКаз из плаценты человека, таким образом внесение ингибитора в ферментный препарат давало возможность получить комплексный ферментный препарат гарантированно защищенный от нуклеазных примесей и удобный для использования в транскрипционном наборе. Присутствие Тритона Х-100 в ферментном препарате не влияло на протекание реакции транскрипции и не снижало выход РНК-транскриптов.

2. Совершенствование технологии получения ингибитора РНКаз из плаценты человека.

Одним из основных компонентов транскрипционного набора является ингибитор РНКаз из плаценты человека. Производство его освоено на Омутнинском химическом заводе. Технология выделения ингибитора РНКаз, согласно производственной методике, заключается в двухстадийной хроматографической очистке с использованием аффинного сорбента РНКаза А - Сефароза и анионообменного сорбента ДЭАЭ-целлюлоза ДЕ-52. Получаемый с помощью данной производственной методиктингибитор РНКаз имеет удельную активность 20-25 ед акт/мкл и полностью свободен от комплекса ингибитор-РНКаза А, проявляющих слабую нуклеазную активность. Однако при использовании ингибитора РНКаз в качестве компонента транскрипционного набора для синтеза РНК в системе in vitro требует более высокой удельной активности фермента, а также иных подходов в оценке качества. Наша задача состояла в том, чтобы при минимальном изменении технологии выделения максимально повысить удельную активность препарата. Работу по усовершенствование производственной методики проводили в направлении использования преимуществ аффинной хроматографии и подбора условий проведения хроматографии на этом сорбенте. В своей деятельности мы основывались на работе Исаева A.C., 1990, в которой были показаны преимущества и недостатки одностадийного способа очистки ингибитора РНКаз. К недостаткам данного способа можно отнести наличие неспецифической сорбции комплекса РНКаза А-ингибитор, а также свободной РНКазы и тем самым наличие незначительных РНКазных примесей в препарате ингибитора РНКаз. К преимуществам - технологичность, экономичность, и главное, высокую удельную активность ингибитора 100 ед акт/мкл и выше. После проведения первой стадии хроматографической очистки ингибитора РНКаз на аффинном сорбенте РНКаза А-Сефароза согласно условий, описанных в производственной методике, было показано что следы РНКазных примесей присутствует не во всех партиях ингибитора. При увеличении времени отмывки аффинного сорбента буфером 0.5 М NaCl с 12 часов до 18 мы не обнаружили РНКазные примеси в препаратах ингибитора. Далее мы увеличили скорость отмывки сорбента после нанесения с 1 об/ч до 2 об/ч при времени отмывки 12 ч и также не обнаружили следов РНКазных примесей.

Рис.3. Влияние белкового ингибитора РНКаз в совокупности с неионным детергентом Тритон Х-100 на стабильность ферментативной активности Т7 РНК-полимеразы: А - содержание ингибитора РНК-аз в конечной концентрации

0.17 мг/мл и Тритона Х-100 в концентрации 0.1%, Б - контроль в присутствии Тритона Х-100 в конечной

концентрации 0.1 %, В - контроль в отсутствии ингибитора и детергента.

Таким образом увеличение объема буфера при отмывке сорбента играет решающую роль в освобождении от неспецифической сорбции РНКазных примесей и тем самым- обеспечивает их отсутствие в препаратах ингибитора.

При определении активности ингибитора РНКаз спектрофотометри-ческим методом нами был отмечен тот факт, что некоторые партии ингибитора, полученные по технологии двустадийного выделения не проявляли пропорционального подавления активности РНКазы А при внесении пропорционального количества ингибитора и как следствие этого не происходило 100% ингибирования активности РНКазы при количестве ингибитора в несколько раз превосходящее расчетное. Однако эти павши проявляли ингибирующий эффект при совместной инкубации с 5 Б [ Р] РНК. Поэтому нами при определении активности ингибитора был введен такой критерий качества, как 100% ингибирующая активность ингибитора РНКаз и расчет удельной активности ингибитора проводили с учетом этого критерия. Кроме того, при длительном выдерживании РНКазы с ингибитором, в случае ее 100% ингибирования,

2

3 ^

А-

Б-ß'

f

* #

Рис. 4. Радиоавтография геля после электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях м-[32Р] РНК, полученной в реакции транскрипции с Т7 РНК-полимеразой.

1 - Фрагменты ДНК, полученные рестрикцией плазмиды

pBR 322 рестриктазой Ava II, длиной А-303, Б-279, В-249 и Г-222 нуклеотида;

2 - РНК-транскрипты полученные с нелинеаризованной

плазмиды GEM-2;

3 - РНК-транскрипты, полученные с линеаризванной

рестриктазой Bsp RI плазмиды GEM-2 в присутствии ингибитора РНКаз, длиной 341 н 4 - тоже, что и 3, но без ингибитора РНКаз.

ы обнаружили, что некоторые партии ингибитора теряли способность вязываться с РНКазой и в следствие чего РНКаза частично зсстанавливала свое активность. Учитывая тот факт, что большинство еакций, в которых используется ингибитор РНКаз, имеет родолжительность в среднем 60 мин, нами, при определении качества ыл введен такой критерий, как полное 100% ингибирование РНКазы в гчение 60 мин. Только после соответствия этим критериям, качество нгибитора считалось удовлетворительным и пригодным для ^пользования в качестве компонента транскрипционного набора.

Ингибитор РНКаз, полученный по усовершенствованной технологии использовали в реакции транскрипции in vitro линеаризованно рестриктазой Ava II ДНК плазмиды GEM-2 с помощью РНК-полимераз1 фага Т7, с целью увеличения выхода полноразмерных копий РН] длиной 341 нуклсотид (см. рис. 4). Из полученной радиоавтограмм] геля, после электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях, хорош видно, что в присутствии ингибитора РНКаз выход полноразмерны копий РНК значительно выше, это доказывает высокую эффективност применения ингибитора РНКаз, полученного по „.усовершенствованно технологии, в реакции бесклеточного синтеза РНК.

Совместно с к.б.н. И.А. Назаренко, НГУ, г. Новосибирск.

3. Разработка набора реагентов и методов определения качества его работы для универсального синтеза РНК в системе in vitro.

К транскрипционным наборам предъявляется ряд требований касающихся конечного продукта реакции транскрипции - м-РНК. Особо внимание уделяется прежде всего полноразмерности синтезируемой РНК а также ее количественному выходу в процессе реакции транскрипцш Зарубежные фирмы выпускающие транскрипционные наборы предлагаю в качестве критерия качества измерять количество включенно радиоактивной метки в кислотонерастворимый продукт за определенны промежуток времени. Такой подход в оценке качества набор целесообразен лишь в том случае, если набор предназначен для синтез РНКовых олигонуклеотидов, например зондов, длинной не более 100-30 нуклеотидов. Однако для синтеза более протяженных молекул РНК о 1000 нуклеотидов и выше важно точное соответствие синтезируемой РН1 длине матрицы. В этом случае на первое место выступает такой критери качества, как полноразмерность транскриптов определенной длины, также их количественный выход по отношение к количеству ДН1 матрицы. Для этой цели нами была разработана система определени качества работы транскрипционного набора, с учетом выше изложенны замечаний.

Прежде всего в качестве контрольной матрицы нами была выбран плазмида GEM-2, несущая промоторы фагов Т7 и SP6, состоящая из 286 нуклеотидных пар и имеющая ряд уникальных сайтов рестрикции Благодаря наличие этих сайтов, а именно Bgl I и Pvu И, mi линеаризовали pGEM-2, получив тем самым ДНК-матрицу по длин соответствующую, начиная с точки старта Т7 промотора 1648 н.п., случае Bgl I и 2837 н.п., в случае Pvu II. Использовав данные матрицы реакции транскрипции, нами были получены РНК-транскрипты по длин соответствующие длине протяженности ДНК-матрице см. рис.5.

Не менее важное значение в оценке качества транскрипционнол набора, играет количественный выход РНК-транскриптов. П литературным данным (Krieg P.A., and Melton D.A., 1987) удельны] выход синтезированной РНК в реакции транскрипции Т7 РНК полимеразой составляет не менее 10 мкг на 1 мкг ДНК-матрицы. Для

определении количественного выхода РНК, мы использовали два подхода: зо-первых, мы находили количество РНК-транскриптов :пектрофотометрическим методом, определяя концентрацию :интезированной РНК, после того как ДНК-матрица была удалена из реакционной смеси обработкой ДНКазой, свободной от нуклеазных лримесей, а РНК была высажена этанолом из реакционной смеси. И тосле ее растворения, определяли концентрацию на спектрофотометре 1ри длине волны 260 нм. При оптимальных условиях работы транскрипционного набора выход РНК составляет 15-18 мкг на 1 мкг ЦНК-матрицы, что соотнетствует зарубежным аналогам.

Однако этот метод применим в основном, лишь в тех случаях, когда :интезируемая РНК небольшой длины до 500-700 нуклеотидов, тапример, при получении зондов. При синтезе же больших молекул РНК, в реакционной смеси могут находиться, по ряду причин, шачительные количества неполноразмерных РНК-транскриптов. В этом хлучае определяли количество только полноразмерной РНК методом )лектрофореза с последующим сканированием окрашенных бромистым тщием электрофореграмм. По соотношение площадей пиков ДНК-патрицы и соответствующей ей по длине РНК-транскрипта на сенситограмме судили о количественном выходе РНК.

Перечисленные методы и приемы в оценке качества работы транскрипционного набора внесены в разработанную нами производственную методику на получение транскрипционного набора. Следует отметить, что эти методы и приемы носят универсальный <арактер и могут быть использованы не только в качестве критериев качества, но и применены в научных исследованиях при оценке работы :истем транскрипции с любыми матрицами.

I. Влияние различных факторов на работу транскрипционного набора.

На проведение реакции транскрипции в системе in vitro оказывает злияние многие факторы. Для оптимизации транскрипционного набора юзданного на основе отечественных реагентов, мы исследовали влияние m активность Т7 РНК-полимеразы таких факторов как, концентрация PEG, этанола, а также концентрация NaCl. Мы остановили свой выбор та этих веществах по ряду причин. Во-первых, плазмидные ДНК, «пользуемые в реакции транскрипции выделяют центрифугированием в градиенте плотности CsCl с бромидом этидия. Однако в последнее время пирокое применение нашел метод щелочного лизиса в присутствии SDS с юследующим осаждением полиэтиленгликолем, позволяющий быстро^ц. в юльшом количестве без применения ультрацентрифуг ' получить «обходимую плазмидную ДНК. Два основных компонента PEG и )танол, используемых в этой процедуре могут быть привнесены вместе с матрицей в реакцию транскрипции. Во-вторых, NaCl является )пределяющим компонентом ряда буферов используемых в реакции зестрикции. Определение влияния концентрации NaCl на активность Т7 эНК-полимеразы позволило бы проводить реакцию транскрипции «посредственно в рестриктазном буфере. Определение влияния выше тазванных веществ на реакцию транскрипции in vitro проводили в

А 2 3

4

В -

А-Б-

Рис. 5. Электрофореграмма РНК полученных в реакции

транскрипции линеаризованной рестриктазами плазмиды GEM-2. Электрофорез проводили в ПААГ с 7 М мочевиной, А- линеаризованная плазмида GEM-2, Б- транскрипт длиной 2837 н., В- 1648 н.

1 - РНК-транскрипты с pGEM-2, линеаризованной

рестриктазами Pvu II и Bgl I;

2 - РНК-транскрипты с pGEM-2, линеар. рестриктазой Pvu II;

3 - РНК-транскрипты с pGEM-2, линеар. рестриктазой Bgl I;

4 - контроль-линеаризованная pGEM-2.

стандартных условиях, внеся в реакционную смесь PEG, этанол и NaCl конечной концентрации 2,5%, 5% и 50 мМ соответственно, сравнива: полученные результаты с контролем.

Таблица 2.

Влияние концентрации PEG, этанола и NaCl на активность Т7 РНК-полимеразы ,

Вносимый компонент

% от активности в контроле

NaCl (50мМ) этанол (5%) PEG (2.5%)

53 95 67

Результаты приведенные в таблице 2 указывает на то, что реакцию транскрипции in vilro не следует проводить в присутствии рестриктазных буферов, в которых концентрация NaCl превышает 50 мМ. Присутствие этанола оказывает незначительное влияние на активность Т7 РНК-полимеразы, в то время как PEG существенно ее снижает. Таким образом, при выделении плазмиды щелочным методом важно тщательно отмывать 70% этанолом для удаления следов PEG.

Кроме того, нами была проведена работа по определение тех рестрикционных буферов в которых можно непосредственно проводить реакцию транскрипции in vilro. Как известно , несмотря на разнообразие изученных к настоящему времени рестриктаз, условия реакции для этих ферментов является чрезвычайно схожими. Поэтому в реакции рестрикции использует, как правило один из четырех буферов, добавляемых к реакционной смеси в количестве 1/10 объема. Ниже приведены составы 10-кратных буферных смесей (все концентрации указаны в мМ).

10х Буфер NaCl Трис-HCl, рН 7.5 MgCl2 2-Меркаптоэтанол

I 0 100 100 50

II 500 100 100 50

III 1000 500 100 50

IV 1500 500 100 50

С этой целью в рестрикционные буфера, содержащие ДНК-матрицу, четыре риботрифосфата, а также [ Н]-УТФ с 5 мкКи/50 мкл, вносили Т7 РНК-полимеразу и результаты сравнивали с контролем - стандартной реакционной смесью для проведения реакции транскрипции.

Таблица 3.

Активность Т7 РНК-полимеразы в присутствии буферов рестрикции.

Рестрикционный буфер Активность Т7 РНК-полимеразы

I 81 %

II 72 %

III 21 %

IV 15 %

Процент активности Активность в рестрикционном буфере

Активность в транскрипционном буфере

Результаты приведенные в табл. 3 указывает на то, что реакцию транскрипции без значительного падения активности Т7 РНК-полимеразы можно проводить сразу после завершения реакции рестрикции без смены буфера в рестрикционных буферах I и II и не рекомендуется в III и IV. Это также подтверждается результатами полученными ранее по влияния концентрации NaCl на активность Т7 РНК-полимеразы.

$ ы В О д ы

1. Разработанный новый метод выделения РНК-полимеразы ¡актериофага Т7 из суперпродуцента Е.соН НВ 101, включающий ряд ювых этапов, позволяет получать высоко очищенные препараты с 'дельной активностью от 70 ед.акт/мкл и выше, свободные от (ибонуклеазных примесей. Выход достигает около 40%.

2. Усовершенствованная производственная методика выделения [нгибитора РНКаз из плаценты человека, обеспечивает получение в аводских условиях высокоочищенного препарата с высокой удельной 1Ктивностью 100-200 ед/мкл. Выход ингибитора при этом составляет 60-'0%.

3. На основе разработанных методов выделения РНК-полимеразы ¡актериофага Т7 и ингибитора РНКаз из плаценты человека, внесены оответствующие изменения и дополнения в производственные методики юлучения этих ферментных препаратов.

4. Разработана система контроля качества транскрипционного шбора, включающая в себя определение полноразмерности получаемых 'НК-транскриптов, а также их количественный выход, который оставляет не менее 90%.

5. Оптимизированы условия для работы транскрипционного набора шлученного на основе отечественных реагентов. Даны практические >екомендации для получения максимального выхода полноразмерных 'НК-транскриптов.

6. Показаны пути стабилизации ферментативной активности Т7 3НК-полимеразы в присутствии ингибитора РНКаз из плаценты геловека и неионного детергента Тритон Х-100.

7. Разработана и утверждена нормативно-техническая документа-щя, необходимая для постановки транскрипционного набора на фоизводство:

- производственная методика на получение транскрипционного набора;

- технические условия (проект) на транскрипционный набор.

ФАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований и разработанной юрмативно-тсхнической документации создана опытно-промышленная ехнология выделения РНК-полимеразы фага Т7 из суперпродуцента 5.соН и ингибитора РНКаз из плаценты человека, пригодных для гспользования их в качестве компонентов транскрипционного набора. В .989-1990 годах по этой технологии Омутнинский химический завод фиступил к серийному выпуску препаратов. В настоящее время фоизведено 250 000 ед.а Т7 РНК-полимеразы и свыше 1 000 000 ед.а

ингибитора РНКаз из плаценты человека. Из производимых реагентов ■ Т7 РНК-полимеразы и ингибитора РНКаз создан транскрипционньп набор. Разработана производственная методика его получения, котора5 станет основой промышленной технологии его производства.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Ковалев С.Ю., Исев A.C., Ремнев Ю.В., Байдусь А.Н. Спосо! выделения РНК-полимеразы бактериофага Т7. // Тез. докл. 2-oi отраслевой конф.-конкурса молодых ученых. Кольцово, 1990, - 90-91 с.

2. Ковалев С.Ю., Исаев A.C., Ремнев Ю.В., Боровик Р.В Повышение и стабилизация ферментативной активности клонироваино! ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7.// рук. деп. ВИНИТИ,

№

3. Ковалев С.Ю., Ремнев Ю.В., Боровик Р.В. Фаговые РНК полимеразы и их использование в молекулярной биологии. Кратки обзор.// В печати.