Разработка новой наносомальной лекарственной формы ломефлоксацина на основе биодеградируемых полимеров

Климова, Ольга Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка новой наносомальной лекарственной формы ломефлоксацина на основе биодеградируемых полимеров
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка новой наносомальной лекарственной формы ломефлоксацина на основе биодеградируемых полимеров"

На правах рукописи

48406Ш1

Климова Ольга Владимировна

Разработка новой наносомалыюй лекарственной формы ломефлоксацина на основе биодеградируемых

полимеров.

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехпологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2011

1 7 ;.:д° 2911

4840690

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшег профессионального образования «Первый Московский государственный медицински! университет имени И.М. Сеченова» (ГОУ ВПО Первый МГМУ) на кафедр биологической химии лечебного факультета (заведующий чл.-корр РАМН, проф., д.х.н Северин С. Е.)

Научный руководитель:

член-корреспондент РАН,

доктор химических наук, профессор Евгений Сергеевич Северин

Официальные оппоненты: академик РАМН,

доктор биологических наук, профессор Алексей Михайлович Егоров

доктор биологических наук, профессор Николай Николаевич Чернов

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

Защита состоится « 12 » апреля 2011 г. в 15:30 на заседании диссертационного совет Д.501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносов по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп.12, Биологически факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультет Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан « 9 » марта 2011 г. Ученый секретарь

Диссертационного совета 1

Д.501.001.21,

кандидат биологических наук

Пискункова Н.Ф.

Общая характеристика работы

Актуальность темы.

В настоящее время лечение внутриклеточных инфекций и опухолевых заболеваний является одной из наиболее важных проблем современной медицины. На пути решения этой проблемы возникает немалое количество трудностей, так как используемые лекарственные вещества (JIB) обладают невысокой эффективностью наряду со значительной токсичностью, и к ним быстро развивается бактериальная резистентность. Поиск новых более эффективных лекарственных средств (JIC) - это длительный и весьма дорогостоящий процесс. В связи с этим актуальной проблемой является разработка новых лекарственных форм (ЛФ) для повышения эффективности уже имеющихся и активно использующихся в клинической практике субстанций. Одним из перспективных направлений повышения эффективности, снижения побочных эффектов JIB и преодоления лекарственной резистентности представляется использование полимерных наночастиц (НЧ). Также с помощью НЧ становится возможным контролировать высвобождение ЛВ, что позволит, во-первых, создать на их основе пролонгированные ЛФ, во-вторых, поддерживать внутриклеточную концентрацию ЛВ на оптимальном уровне.

Данная концепция была неоднократно подтверждена экспериментально, и в настоящее время имеется значительное количество работ по этой тематике, в частности, публикации о высокой эффективности наносомальных препаратов в лечении туберкулеза, опухолевых заболеваний и т. д.

Среди используемых для получения НЧ полимеров особый интерес представляют сополимеры молочной и гликолевой кислот (PLGA). НЧ из данного вида полимеров эффективно сорбируют различные ЛВ, быстро биодеградируют, высвобождая ЛВ, обладают низкой токсичностью и хорошо выводятся из организма. Они также способны образовывать устойчивые коллоидные системы, пригодные для парентерального введения. Таким образом, НЧ из сополимеров молочной и гликолевой кислот (PLGA) являются перспективным носителем для создания коллоидных систем доставки JIB.

При анализе литературных данных было выяснено, что наиболее часто встречающимися в научной литературе фторхинолонами, используемыми для создания микро- и наносомальных ЛФ направленного действия, являются ципрофлоксацин и моксифлоксацин. Однако, еще не было сделано ни одной попытки создания наносомальной ЛФ на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот такого фторхинолона, как ломефлоксацин. Ломефлоксацин является одним из наиболее активных современных антиактериальных препаратов группы фторхинолонов. Введение ломефлоксацина в состав НЧ позволит значительно изменить его свойства, существенно расширить антибактериальную активность и улучшить фармакокинетические свойства данного ЛВ. Наличие в молекуле ломефлоксацина двух атомов фтора и метальной группы в пиперазиновом ядре требует индивидуального подхода к созданию его наносомальной ЛФ, а также

разработки оригинальных методик его качественного и количественного определения как в составе наносомальной ЛФ, так и в биологических образцах. В виду изменения свойств данного ЛВ потребуется также тщательное изучение его специфической и антибактериальной активности и изменений в распределении по органам и тканям во времени.

Цель работы:

Целью данной работы является разработка биотехнологического получения ломефлоксацина, иммобилизованного на НЧ из биодеградируемых полимеров для повышения его эффективности, снижения выраженности побочных эффектов, а также обеспечения пролонгированного действия JIB.

Задачи:

-осуществить иммобилизацию ЛВ на НЧ и оптимизировать технологию синтеза наносомальной ЛФ.

-разработать методику качественного и количественного определения ломефлоксацина в наносомальной ЛФ, в биологических образцах. Изучить стабильность ломефлоксацина в условиях его иммобилизации на НЧ.

-изучить специфическую активность химиотерапевтического ЛП на выбранных моделях с использованием микроорганизмов в нативном состоянии, и после сорбции наНЧ.

- изучить скорость высвобождения ЛВ из матрицы полимера-носителя in vitro и in vivo (изучение пролонгированного эффекта).

-изучить распределение ЛВ по органам и тканям с целью выявления изменения фармакокинетических параметров ломефлоксацина, ассоциированного с полимерными НЧ, полученными на основе сополимеров молочной и гликолевой кислоты.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые разработан подход к созданию наносомальной ЛФ ломефлоксацина ка основе сополимеров молочной и гликолевой кислот (PLGA), включающий в себя разработку оптимальных параметров синтеза для получения стабильной и воспроизводимой ЛФ, а также методики качественного и количественного определения ломефлоксацина в наносомальной ЛФ и в биологических образцах.

Впервые изучен механизм высвобождения лекарственного вещества из НЧ in vitro и in vivo и специфическая активность наносомальной ЛФ ломефлоксацина на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот (PLGA).

Экспериментальные подходы, разработанные для оптимизации методов получения наносомальной ЛФ ломефлоксацина, могут быть использованы при создании других наносомальных препаратов.

Результаты изучения механизма высвобождения ЛВ из НЧ in vitro и in vivo, а также результаты изучения распределения наносомального ломефлоксацина по органам и

тканям могут быть использованы при выборе доз и режимов лечения в последующих биологических испытаниях наносомальной формы ломефлоксацина.

Связь Цели и задач исследования с федеральными целевыми программами РФ.

Работа выполнена в Первом МГМУ им. И.М. Сеченова на кафедре биологической химии лечебного факультета в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» по приоритетному направлению «Индустрия наносистсм и материалов»

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Принципиальная возможность создания наносомальной ЛФ ломефлоксацина, получаемой на основе биодеградируемых полимеров и обладающей повышенной эффективностью, менее выраженными побочными эффектами, а также обеспечивающей пролонгированное действие ЛВ.

2. Иммобилизованный на НЧ ломефлоксацин сохраняет, а в случае с некоторыми микроорганизмами даже увеличивает апибактериальную активность.

3. Иммобилизация ломефлоксацина на НЧ приводит к его перераспределению по органам и тканям живого организма.

Личный вклад автора

Соискатель самостоятельно провела все эксперименты по получению НЧ с иммобилизованным на них ломефлоксацином, в динамике оценила перераспределение ЛВ но органам и тканям в сравнении с контролем. Интерпретация полученных результатов и их статистическая обработка также осуществлены автором.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на следующих конференциях, конгрессах и научных школах:

Всероссийская научная школа для молодежи «Наномедицина и нанотоксикология» 2009

- VI международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность» 2009

- Итоговая научная конференция молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» 2010

- XVII Российский национальный конгресс «Человек и Лекарство» 2010

VII международная конференция РАН «Молекулярная медицина и биобезопасность» 2010

Работа была награждена в 2010 году дипломом как лучшая научно-исследовательская работа в области диагностики и терапии социально-значимых заболеваний на основе достижений молекулярной медицины в рамках VII международной конференции РАН «Молекулярная медицина и биобезопасность».

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ (3 из них - в рецензируемых журналах из списка ВАК, 6 - тезисы докладов)

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 154 страницах, содержит Зсхемы, 9 рисунков, 20 таблиц, 37 графиков.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

В работе использовали реактивы фирм без дополнительной очистки, такие как бутилцианоакрилат (Sichel Werke, Германия), сополимеры молочной и гликолевой кислот 50:50 (PLGA 50:50), 75:25 (PLGA 75:25) и сополимер молочной и гликолевой кислот со свободной карбоксильной группой (PLGA-COOH) фирмы (Lactel, Absorbable Polymers International, США); полимеры молочной кислоты (PLA) (Lactel, Absorbable Polymers Internationa!, США), ломефлоксацин (Sigma-Aldrich, США), пoлoкcaмep(Sigma-Aldrich, США), гликохолата калия гидрат (ХимМед, Россия), альбумин (Reanal, Венгрия), твин-80 (Ferak, Германия), декстран с мол. массой 70000 (Sigma-Aldrich, США), соляная кислота (ХимМед, Россия), хлороформ (ХимМед, Россия), поливиниловый спирт (ПВС), 87-MJ0 % hydrol., average mol. wt 30,000-70,000; (Sigma-Aldrich, США), D-маннит (ICN, Biomedicals), гидрокарбонат натрия (ХимМед, Россия), aueTOHinph\n(Sigma-Aldrich, США), хлористый Memnen(Sigma-Aldrich, США). Электронные спектры в ультрафиолетовой и видимой области спектра записывали на спектрофотометре Ultrospec 2000 (Pharmacia, Швеция). Для ВЭЖХ использовали жидкостной хроматограф серии «Gold» (Beckman, США), а также насосы высокого давления М302, градиентный смеситель М811В, инжектор 7i25i (Rheodyne, США) фотометрический детектор «microUVIS20» (Cario Erba Instruments, Италия). Для хроматографического определения действующих веществ использовали колонку диасорб - 130 - С18Т размер 4.0X150 мм.

Удаление органических растворителей производили на роторном испарителе LABAROTA 4000-efficient. Гомогенизацию проводили на погружном диспергаторе

омогенизаторе) Ullra-Turrax® Т-25 (IKA®, ФРГ) с диспергирующим элементом (S25N S25F; S10N - S10F). Центрифугирование осуществляли с помощью центрифуг abofuge A (Heraeus, Германия) и J2-21 (Вескшап, США). Лиофилизацию ■уществляли на сушке HETOSICC (Heto Ltd., Denmark). НЧ получали методом преципитации и методами двойных и одинарных эмульсий. Полученные НЧ оценивались по размеру, степени включения ЛВ в НЧ. Анализ лученных НЧ проводился с помощью различных физико-химических методов, ачественное и количественное определение ломефлоксацина в качестве йствующего вещества проводилось с помощью спектрофотометрии в УФ-области и ЭЖХ. Размер получаемых НЧ изучали с помощью фотонной электронной 1ектроскопии. Также была изучена скорость высвобождения ЛВ из НЧ в водных едах in vivo и in vitro.

Определение специфической активности проводили in vitro на культурах икроорганизмов: Escherihia coli, Klebsiella pneumonia spp., Staphylococcus еиз.щтамм 906, Salmonella enteritidis ATCC 9640, Salmonella infantis spp., eudomonas aeruginosa ATCC 10145, Pseudomonas aeruginosa spp. Исследование шолнено по стандартной методике с использованием стерильных дисков.

Определение острой токсичности проводили in vivo на мышах линии Black, ошедших двухнедельный карантин. Животные содержались в стационарных ловиях вивария, получали стандартный корм и воду без ограничения, аносомальный ломефлоксацин вводили внутрижелудочно с помощью равматического зонда в дозах, рассчитанных с учетом массы тела и максимально пустимого количества жидкости, которое можно ввести внутрижелудочно белым ышам однократно. В каждой серии использовалось по 5 животных. Проведено 5 рий экспериментов. Критериями оценки острой токсичности служили картина нтоксикации и выживаемости животных. Наблюдения проводили в течение двух едель. Контролем служили животные, которым внутрижелудочно вводили ответствующие массы композита без действующего вещества (пустые НЧ), либо бстанцию ломефлоксацина, растворенную в эквивалентном объеме топологического раствора.

Исследование высвобождения ломефлоксацина из полимерной матрицы и его аспределение по органам и тканям организма проводилось in vivo на крысах линии istar. Животные содержались в стационарных условиях вивария, получали андартный корм и воду без ограничения, прошли двухнедельный карантин. 1аносомальный ломефлоксацин вводили внутрижелудочно в дозах, рассчитанных с четом массы тела и максимально допустимого количества жидкости, которое можно вести внутрижелудочно крысам однократно. Для сравнения готовился раствор, одержащий эквивалентное количество чистого ломефлоксацина, растворенного в том е объеме дистиллированной воды. Далее через определенные промежутки времени абивались экспериментальные и контрольные крысы. Для каждой определяемой ременной точки использовалось по 5 крыс. У крыс осуществлялся забор

биологического материала. Полученные после пробоподготовки образцы анализировались с помощью ВЭЖХ.

Результаты исследования и их обсуждение

В литературе описаны методы получения НЧ из РЬОА с использованием различного оборудования и дополнительных вспомогательных веществ. Наиболее часто используемыми и широко известными методами получения НЧ являются такие методы, как преципитация, методы двойного и одинарного эмульгирования с использованием гомогенизаторов с высоким давлением и без него, а также с использованием ультразвука.

Были опробованы такие методы получения НЧ, как метод преципитации, метод двойных и одинарных эмульсий. В качестве носителя были использованы следующие полимеры: БЦА, РЬОА50:50, РЬОА75:25 и РЬОА со свободной карбоксильной группой, РЬА.

При изучении влияния технологических параметров синтеза НЧ на свойства получаемой ЛФ (размер получаемых частиц и степень сорбции ломефлоксацина в полимерную матрицу) было найдено оптимальное сочетание параметров синтеза ля получения эффективной и стабильной ЛФ.

Наиболее предпочтительным для получения наносомальной ЛФ ломефлоксацина является метод двойных эмульсий, который обеспечивает оптимальный размер НЧ и наиболее высокую степень сорбции ЛВ. При использовании метода преципитации, метода одинарного и двойного эмульгирования были получены НЧ не сильно отличающиеся по размеру, но с существенно различающейся степенью сорбции ЛВ. Наибольшую степень сорбции имеют НЧ, полученные методом двойных эмульсий (42%±3). Для НЧ, полученных методом преципитации степень сорбции ЛВ равна 11%±1. НЧ, синтезированные методом одинарных эмульсий не сорбировали ЛВ в полимерную матрицу.

Для того, чтобы выявить зависимость свойств получаемых НЧ от природы полилактида в работе были использованы РЬА, РЬОА 50:50, РЬОА 75:25 и РЬОА со свободной карбоксильной группой. Полилактиды с различной природой использовались для получения НЧ методом эмульгирования. Влияние вида полимера на свойства будущей композиции с ЛВ является первостепенным. От этого зависят многие физико-химические свойства: размер частиц, степень включения ЛВ в полимерную матрицу, стабильность при хранении, защита от воздействия различных факторов внутри организма (особенно ферментов) и т.д. Но особенно важно, что от вида полимера зависят лекарственные свойства будущего препарата: токсичность, пролонгированность действия, эффективность и многие другие. Для всех образцов в этой серии экспериментов, равно как и для всех других, была определена степень сорбции ЛВ в НЧ и размер получаемых частиц. Полученные данные свидетельствуют о том, что наилучшая степень сорбции ЛВ в НЧ достигнута при использовании РЬвА 50:50, и она составила 42%±0,57 от общего количества введенного ломефлоксацина,

что близко по значению с показателем степени сорбции JIB в НЧ при использовании PLGA75:25 33%±0,57. Самая низкая степень сорбции была отмечена ири использовании PLA, как более гидрофобного 10%±1,53. По всей видимости, степень сорбции ломефлоксацина в некоторой мере связана с гидрофобностыо полимера-носителя. Также экспериментальным путем было установлено, что природа используемого полимера оказывает влияние также и на размер получаемых НЧ, хотя последнее намного менее выражено. Сополимеры молочной и гликолевой кислот как со свободной карбоксильной группой так и с этерифицированной дают чуть более крупные НЧ, чем препараты с полилактидом.

Зависимость степени сорбции ЛВ в НЧ от соотношения ЛВ:полимер исследовалась с применением только метода двойных эмульсий. Представленные выше образцы в процессе их получения были двукратно гомогенизированы в следующем режиме: и первая и вторая гомогенизации проводились троекратно по 1 минуте с перерывом 1 минута при скорости 24 000 об\мин. В качестве ПАВ использовался 1% раствор полившшлового спирта. От соотношения ЛВ:полимер во многом зависит степень включения ЛВ в полимерную матрицу. Представляется очевидным, что степень сорбции ЛВ будет тем выше, чем большим окажется соотношение ЛВ:полимер, но это неизбежно приведет к снижению содержания ЛВ в конечном препарате. Целыо данной серии экспериментов было установить при каком соотношении ЛВ: полимер степень сорбции ЛВ будет оптимальной. Все образцы получались при прочих равных параметрах, изменению подвергалось лишь соотношение ЛВ:полимер. Было выявлено, что наибольшая сорбция ломефлоксацина в НЧ достигается при соотношении ЛВ:полимер 1:7, при дальнейшем увеличении этого соотношения степень сорбции остается практически неизменной. Увеличение этого соотношения нецелесообразно, так как это неминуемо приведет к уменьшению содержания ломефлоксацина в ЛФ, что нежелательно. Соотношение ЛВ:полимер оказывает также некоторое, хотя и несущественное влияние на размер получаемых НЧ. Однако четкой закономерности между изменениями соотношения ЛВ:полимер и размером получаемых НЧ не выявлено.

Следует отметить, что данная закономерность не зависит от режима гомогенизации. Оптимальное соотношение ЛВ:полимер остается равным 1:7 как при 24 ООО об/мин., так и при б ООО об/мин.

Для того, чтобы выявить зависимость свойств получаемых НЧ от типа используемого стабилизатора эмульсии при прочих равных условиях использовались различные ПАВы для стабилизации эмульсии: 1% водный растворы TWIN-80, декстрана, альбумина, поливинилового спирта. Наилучший результат был получен при использовании в качестве стабилизатора поливинилового спирта; при этом степень сорбции ЛВ в полимерную матрицу составила 42%±0,57, а размер полученных НЧ 246нм±7,21. В случае применения TWEEN-80 и декстрана частицы не были получены вовсе из-за возникновения агрегации и образования относительно крупных конгломератов.

Для того, чтобы выявить зависимость степени сорбции JIB в НЧ от способа предварительного растворения ломефлоксацина в ходе исследовательской работы ломефлоксацин растворялся либо в дистиллированной воде, либо в водном растворе 0,01 м НС1 (метод двойных эмульсий), либо непосредственно в водном растворе 1% PVA (метод преципитации). Наилучшие результаты были достигнуты при получении НЧ методом двойных эмульсий с использованием в качестве первичного растворителя для ломефлоксацина раствора 0,01 М НС1. Степень сорбции JIB в полимерную матрицу при этом составила 42%±0,57, а размер полученных НЧ 246нм±7,21. Следует отметить также, что при получении НЧ методом двойных эмульсий, но с использованием в качестве первичного растворителя для ломефлоксацина HiOnllCT. и при получении НЧ методом преципитации, где в качестве первичного растворителя был взят 1% раствор PVA, были получены практически идентичные результаты: степень сорбции JIB составила 7%±0,57, а размер НЧ 245нм±3,60; степень сорбции JIB составила 10%±1, размер НЧ 267нм±4,39 соответственно.

Для изучения зависимости степени сорбции JIB в НЧ от способа предварительного растворения полимера в качестве первичных растворителей для полимера использовали хлороформ, хлористый метилен и ацетонитрил. Растворители выбирались исходя из свойств полимера и метода получения НЧ. Наилучший результат был достигнут при использовании хлороформа, как в случае получения НЧ методом преципитации, так и в случае получения НЧ методом двойных эмульсий, так как в данном случае степень сорбции JIB была максимальной. Однако, применение хлороформа и использование метода двойных эмульсий даст возможность получить НЧ с лучшими характеристиками.

Зависимости степени сорбции ЛВ в НЧ и размера НЧ от введения в синтез в качестве противоиона гликохолата калия гидрохлорида изучалась также с применением метода двойных эмульсий. Было показано, что если противоион включался в синтез совместно с полимером, то включение ЛВ не происходило вовсе, а если противоион включался в синтез совместно с ломефлоксацином, то степень сорбции была чуть ниже, чем у образцов, полученных без прнименсния противоиона. Присутствие противоиона не оказало влияния на размер получаемых НЧ, он варьировался в пределах 245-246 нм. Из выше изложенного можно сделать вывод о том, что в данном конкретном синтезе использование противоиона нецелесообразно.

Было изучено влияние режима первичной и вторичной гомогенизации на свойства получаемой наносомальной ЛФ ломефлоксацина. Гомогенизация может оказывать существенное влияние как на размер получаемых НЧ, так и на степень сорбции ЛВ в полимерную матрицу. Данную серию экспериментов проводили при двух различных условиях гомогенизации. Было выявлено, что изменение числа оборотов гомогенизации оказывает существенное влияние как на степень сорбции ЛВ в НЧ, так и на размер получаемых НЧ. Снижение интенсивности гомогенизации приводит к значительному укрупнению НЧ и существенному снижению степени сорбции ЛВ в НЧ. При различных режимах гомогенизации сохраняются зависимости, описанные ранее, а именно: увеличение степени сорбции ЛВ в НЧ с выходом на плато на фоне

увеличения соотношения ЛВ:полимер и отсутствие закономерности во влиянии данного параметра на размер получаемых НЧ. Таким образом, при незначительной разнице в размере НЧ степень сорбции JIB различается практически в 4 раза, то есть в данном случае прямая зависимость между размером НЧ и степенью сорбции ЛВ не наблюдается. Все вышеизложенное отражено на рисунках № 1,2.

1:3 !:5 1:7 1:10 1:2(1 Соотношение ЛВ: полимер

!"i J

-й-

f г

'J d\ Ж ¿11 21

11111

t.3 i:-s i > i ill 12n

Соотношение ЛВлолимер

Рисунок 1.

Рисунок 2.

Для изучения зависимости свойств получаемых НЧ от времени первичной гомогенизации проводилась серия экспериментов с применением метода двойных эмульсий; в качестве полимера носителя был использован РЬОА 50:50, первичным растворителем для полимера был хлороформ, первичным растворителем для ломефлоксацина был 0,01 М раствор НС1, в качестве ПАВ применяли 1% раствор поливинилового спирта. При прочих равных параметрах синтеза для всех образцов изменялся только режим первичной гомогенизации. Гомогенизацию проводили при скорости 24 ОООоб./мин. в интервале времени от 1 минуты до 4 минут. Так как при проведении процесса гомогенизации выделяется достаточное количество тепла за счёт трения вращающихся деталей, длительность одного цикла не должна превышать I мин. и между последующими циклами эмульгирования необходимо соблюдать паузы по 1 или более мин. Дальнейшее увеличение времени гомогенизации (> 4 мин.) будет требовать внешнего охлаждения. Экспериментальным путем было установлено, что время первичной гомогенизации сказывалось на степени включения ЛВ в полимерную матрицу и на размере получаемых НЧ. Увеличение времени гомогенизации приводило к небольшому увеличению степени сорбции и уменьшению размера частиц. Наилучший результат был достигнут при трех кратном гомогенизировании в течение 1 минуты с минутными интервалами. Степень сорбции при этом равнялась 44%±0,57, размер НЧ составил 279нм±8,08.

Для изучения зависимости свойств получаемых НЧ от времени вторичной гомогенизации проводилась серия экспериментов с теми же условиями, что и в предыдущей серии опытов. При прочих равных параметрах синтеза для всех образцов изменялся только режим вторичной гомогенизации. Гомогенизацию проводили при скорости 24 000 об./мин. в интервале времени от 1 минуты до 5 минут. Было выявлено,

что время вторичной гомогенизации не оказывает существенного влияния на степень сорбции JIB в полимерную матрицу, но отражается на размере получаемых НЧ. Чем более интенсивный и долговременный режим гомогенизации, тем меньше размер получаемых НЧ. В качестве оптимального был выбран временной режим гомогенизации в течение 1 минуты трехкратно с минутными интервалами. Данный режим позволит получить НЧ с наилучшими показателями степени сорбции и оптимальным размером, не требуя бо'льших временных и энергетических затрат.

Было более подробно исследовано влияние времени совместного перемешивания растворов JIB и PLGA перед первой гомогенизацией на степень сорбции JIB в НЧ. Время перед вторичным гомогенизированием при этом составляло 20 минут и не изменялось. Максимальная степень сорбции (44%±0,57) была достигнута при совместном перемешивании двух растворов не менее 20 минут, затем она практически не изменялась. На размер получаемых НЧ данный технологический параметр оказывает незначительное влияние.

При изучение зависимости свойств получаемых НЧ от времени совместного перемешивания перед вторичным гомогенизированием в ходе экспериментов было выявлено, что сокращение времени перемешивания смеси перед вторичной гомогенизацией сказывается на степени сорбции JIB в НЧ намного меньше, чем сокращение времени перемешивания смеси перед первичной гомогенизацией.

Таким образом, был подобран оптимальный состав наносомальной ЛФ ломефлоксацина и оптимизированы технологические параметры ее получения, что позволило перейти к биологическим методам тестирования наносомального ломефлоксацина.

Результаты изучения специфической антимикробной активности, проведенного in vitro на культурах микроорганизмов с использованием указанной выше оптимизированной наносомальной ЛФ ломефлоксацина: Escherihia coli, Klebsiella pneumonia spp., Staphylococcus aureus, штамм 906, Salmonella enteritidis ATCC 9640, Salmonella infantis spp., Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Pseudomonas aeruginosa spp. приведены на рис. № 3. Из рис. № 3 видно, что включение ломефлоксацина не только не уменьшило его антибактериальной активности, но и в некоторой степени даже увеличило ее (до 14 %). Заключение ЛВ в наносомальную ЛФ также не повлекло за собой исчезновения бактерицидной активности ломефлоксацина. Чуть более эффективным по сравнению с чистым ломефлоксацином оказался наносомальный ломефлоксацин при воздействии на такие микроорганизмы как Salmonella enteritidis ATCC 9640. Практически во всех опытах было отмечено, что вторичная зона роста бактерий отсутствует там, где в качестве испытуемого образца был взят наносомальный ломефлоксацин, что может свидетельствовать о пролонгированном действии данного препарата. Особенно это явление было выражено в опыте, где в качестве испытуемых бактерий использовали Escherihia coli.

29 30 30

Панель микроорганизмов

Наносомальный ломефлоксацин, 5% раствор Чистый яомефлоксацин, 5% раствор Нзносомальный ломефлоксацим, 10% раствор Чистый ломефлоксацин, 10% раствор

Специфическая активность наносомальмого ломефлоксаиина в сравнении с

Рисунок 3-

Было проведено определение острого токсического эффекта. При однократном пероральном введении максимально возможных доз полимера, содержащего ломефлоксацин, в количестве Уг от (1^50 для мышей=4г/'кг) и введении

эквивалентного количества чистого ломефлоксацина не было отмечено летальных исходов среди мышей, также не отмечалось визуально явного токсического воздействия и побочных эффектов как в контрольной, так и в испытуемой группах. Более детальное исследование токсических эффектов при однократном и систематическом введении сополимера молочной и гликолевой кислоты не проводилось, хотя имеются литературные данные об их наличии.

При создании наносомального ЛП необходимо добиться максимального включения ЛВ в полимерную матрицу, но не менее важно затем оценить насколько полным будет высвобождение лекарственной субстанции из НЧ в условиях живого организма, и каким образом будет изменяться концентрация ЛВ в плазме крови и различных органах и тканях во времени. Именно с этой целью была проведена серия опытов по изучению высвобождения ЛВ из полимерной матрицы in vivo на крысах линии Wistar.

Сравнительная фармакокинетика свободного и наносомального ломефлоксацина изучалась с использованием крыс-самцов линии Wistar массой 240-250 г (питомник РАМН «Столбовая», Москва). Животные содержались на обычном пищевом рационе. Лекарственные формы ломефлоксацина и наносомальный ломефлоксацин растворяли в воде для инъекций. Экспериментальные животные были разделены условно на две группы. Животным из первой группы вводили перорально однократно наносомальный ломефлоксацин (с содержанием действующего вещества 5,8% от общей массы) в дозе 270 мг/кг); животным второй группы, взятой в качестве сравнения вводили субстанцию ЛВ в эквивалентных количествах. Далее через определенные промежутки времени умерщвлялись экспериментальные и контрольные крысы. Выборка для каждой определяемой временной точки составляла 5 крыс. У крыс забирали органы и цельную кровь из полости сердца без использования гепарина. Полученный в результате пробоподготовки биологического материала образец анализировали с помощью ВЭЖХ.

Для характеристики изменения концентрации ломефлоксацина в крови и органах крыс во времени рассчитывали интегральный показатель площади под фармакокинетической кривой. Процент от дозы рассчитывали, исходя из значений масс органов (как правило масса навески составляла 1,8-2,1 г органа. Объем крови принимали равным 7% от массы животного. Адекватность выбранной модели для описания распределения исследуемых препаратов в организме экспериментальных животных подтверждаются полученными графиками, из которых следует, что фармакокинетическая зависимость, построенная по экспериментальным данным, практически полностью совпадает с зависимостью, моделирующей типичную кинетику второго порядка (двухчастевая математическая модель фармакокинетики).

Основные фармакокинетические константы субстанции ломефлоксацина, и ломефлоксацина, ассоциированного с полимерными наночастицами, обработаны с помощью двухчастевой математической модели и представлены в таб.№ 1.

Как видно из представленных данных, фармакокинетические константы, а именно время полувыведения (Т1А) и среднее время удерживания (MRT) антибиотика, связанного с наночастицами, увеличилось по сравнению с константами антибиотика сравнения в случаях с некоторыми органами в 3,2 раза, что свидетельствует о наличии пролонгированного эффекта у наносомального ломефлоксацина.

печень ПОЧКИ Легкие селезенка сердце предстзт. железа кровь

чист. нано ЧИСТ. нано чист. Нано ЧИСТ. нано чист. нано ЧИСТ. нано чист. нано

Т max, часы 2 1 2 1 2 1 2 2 , 2 1 2 1 2 2

С max 66 25 too 70 40 27 90 100 50 50 132 62 19 15

АиС(04«й) 341,3 611,1 665 835,4 307,3 606 467,72 1317.8 195,3 4S2.3 836,8 591,9 172,91 222.5

Ти 2.13 8,85 6.98 9,57 2,12 9,21 3,64 7.32 7,49 9,97 6,9 8,7 2,83 6.68

С max/AUC (0—»48) 0.198 0,040 0.150 0,083 0,013 0,039 0,192 0,072 0,256 0,110 0,158 0,104 0.109 0.067

CI, n/час 1.024 0.SS8 0.524 0.408 1.139 0 .489 0.748 0.263 1.782 0.752 0.416 0.583 2.024 1.56

MRT (среднее время удерживания) 4.63 13,21 6,66 15,03 4.62 t4,9 5.34 »0,6 5,Л 13.07 7.34 7.34 4 64 аде

Кр (коэфф. РаспределенияУ лис uaHn'AUCtpoi>> 1,97 2,75 3,85 3,?5 1,78 3,13 2,7 5,91 1.3 2.3 4.84 2.66 / /

Таблица № 1

Приведенные в таблице №1 фармакокинетические константы будут проанализированы далее для каждого из исследуемых органов отдельно.

Изменение концентрации ломефдоксащша в печени с течением времени прподнокрапюмперераяыюм введении субстанции ЛВ и Л В. включенного в состав НЧ

1 г з 5 12 24 48

Время, прошедшее с момента однократного пероралыкчго введения ЛВ

Рисунок 4.

Как видно из рисунка № 4 фармакокинетические кривые субстанции JIB и ее наносомалыюй формы резко различаются между собой. В случае однократного перорального введения субстанции ломефлоксацина, его концентрация в печени возрастает до максимума через 2 часа и быстро спадает практически до нуля. В случае применения наносомальной лекарственной формы резкого скачка концентрации не наблюдается, определенный концентрационный уровень антибиотика поддерживается на протяжении всего изучаемого временного отрезка. О пролонгации нахождения антибиотика в исследуемом органе свидетельствует изменение среднего времени удержания (MRT), для наносомальной ЛФ этот показатель выше в 2,85 раза, а также площадь под фармакокинетической кривой (AUC), для наносомальной ЛФ этот показатель выше в 1,78 раза. Время полувыведения у испытуемого образца и контроля также значительно различалось. Для наносомальной ЛФ ломефлоксацина Т\а составило 8,85 часа, а для субстанции ЛВ 2,13 часа. Показатели клиренса, константы характеризующей способность организма к элиминации (удалению) препарата, в данном случае также различаются более чем в 2 раза, что также указывает на более длительное присутствие ЛВ в печени по сравнению с чистым веществом.

Профили графиков изменения концентрации ломефлоксацина в почках с течением времени при однократном пероральном введении экспериментального образца и контроля оказались различны. Максимальная концентрация ЛВ при введении ломефлоксацина в наносомальной ЛФ достигается в почках уже через 1 час после перорального введения, однако она несколько ниже, максимальной концентрации препарата при его введении в виде чистой субстанции. Затем, в случае введения контрольного образца, концентрация ломефлоксацина резко возрастала и падала практически до нуля в течение первых 12 часов, в то время как при введении наносомалыюй ЛФ концентрация ломефлоксацина оставалась постоянной на оптимально высоком уровне и очень плавно снижалась в течение первых 24. Время полувыведения ломефлоксацина, значения клиренса и коэффициенты распределения в почках как для чистой субстанции, так и для наносомалыюй ЛФ приведены в таблице №1.

В легких при введении наносомального ломефлоксацина максимальная концентрация действующего вещества достигается через 1 час после однократного перорального приема и поддерживается на достигнутом уровне практически на протяжении 24 часов. При аналогичном введении контрольного образца, максимальная концентрация ЛВ достигается через два часа и в 1,5 раза превышает максимальную концентрацию, достигаемую при введении нано-формы, но значительно быстрее снижается и после 24 часов практически равна нулю. На рисунке № 5 четко видно наличие пролонгированного эффекта наносомального ломефлоксацина, о наличии которого также свидетельствует время полувыведения; для чистой субстанции время полувыведения составило 2,12 часа, а для нано-формы - 9,21 часа. Показатели клиренса и время удерживания для наносомального препарата в случае с легкими в три раза ниже, чем для чистой субстанции, введенной в качестве контроля.

И зменение концентрации ломефлоксацина в легких с течением времени при однократном перерпльном введешш субстанции ЛВ и ЛВ, включенного в состав НЧ

Bjwmsi. прошедшее с момента однократного перораяьного введения ЛВ. чаем

Рисунок 5.

Изменение концентрации ломефлоксацина в селезенке с течением времени при однократном переральном введении суостанцнн Л"В и ЛВ. включенного в состав НЧ

120 -г.....................-.............................-................-.......-.....-...............-.....................................—........................-.........-........................

1* нано ла

I—Ц0^су£><т,знцнм/1{1

S i !

1 j

I'pc.vju. прешедшее с момента однократного иерорапьного введения .Щ ч-кы

Рисунок № 6.

Графики изменения концентрации ломефлоксацина в селезенке с течением времени при однократном пероральном введении субстанции JIB и JIB, включенного в состав НЧ, схожи по профилю (рис. №6). Время достижения максимальной

концентрации JIB в органе совпало как для образца, так и для контроля (2 часа с момента перорального введения). Важно отметить, что в случае с селезенкой максимальная концентрация JIB при введении наносомального препарата незначительно превышает максимальную концентрацию, достигнутую при ведении чистой субстанции ломефлоксацина. В данном случае также имеет место пролонгированный эффект, о котором свидетельствуют такие показатели, как клиренс и среднее время удержания JIB. Для наносомального ломефлоксацина в случае изучения селезенки указанные параметры в 2-3 раза ниже, чем для контроля. Сходные данные были получены при изучении сердечной мышцы и крови.

При однократном пероральном введении наносомальной ЛФ в предстательной железе максимальная концентрация ЛВ оказалась ниже, чем при введении чистой субстанции (рис. №7). Клиренс и среднее время удерживания совпадали как в случае с образцом, так и в случае с контролем.

Изменение кокцсгара!ДО1Ломефлюксацкгс1 в продстательнойжслсзе стечением времени приоднокрштгомirepqwubnoM введении субстанции ЛВ и ЛВ, включешгога в состав НЧ

140

—су<>спн>|«< Ли |

X г 3 S 12 24 -*S

Врем», 1фошеллгее с момента однофятвого перорального шодетм ЛВ,

Рисунок А1» 7.

Значимого пролонгированного эффекта, сопровождающегося поддержанием концентрации ЛВ в исследуемом органе на терапевтически значимом уровне для наносомального ломефлоксацина в случае с предстательной железой не отмечено.

После описания изменений в распределении исследуемого ломефлоксацина, вводимого в различных ЛФ, по отдельным органам необходимо остановиться на общей картине распределения антибиотика в организме экспериментальных животных. В ходе данного исследования отмечено перераспределение ЛВ в зависимости от ЛФ, в составе которой был введен. Полученные данные представлены на рис. № 8.

Значение лис для различных тканей и органов

1317,8

«52.3

836,8

ищ

I Г 1 ■ I

* субстанции я начоЛВ

10ЧК« ДЦГ Т-»Т «ре«*.

Рисунок № 8

Из рисунка № 8 видно, что при введении ломефлоксацина в виде его наносомальной ЛФ удается увеличить степень его проникновения в печень, легкие и селезенку, т. е. в органы РЭС, а также в сердечную мышцу, в отличие от предстательной железы, степень проникновения ЛВ в которую снизилась.

Из приведенного выше материала можно сделать вывод о том, что НЧ из сополимеров молочной и гликолевой кислот, используемые в качестве носителя для действующего ЛВ, существенно меняют фармакокинетику ломефлоксацина в организме крыс. Установленно, что биодеградируемые и биосовместимые НЧ, использованные в качестве полимера-носителя при пероральном применении увеличивали биодоступность ЛВ, пролонгировали время его нахождения в организме, за счет его более длительного удержания в органах РЭС (эффект депонирования) и изменяли его распределение между тканями и органами, о чем свидетельствуют такие показатели, как площадь под фармакокинетической кривой (АиС), клиренс, среднее время удерживания (МЯТ), и коэффициент распределения Кр.

Заключение

В данной работе был разработан метод включения противомикробного антибиотика широкого профиля фторхинолонового ряда - ломефлоксацина в состав частиц субмикронного размера на основе сополимера молочной и гликолевой кислот, с целью повышения эффективности и безопасности ЛВ, а также обеспечения его пролонгированного эффекта. Отбор оптимального состава и технологических параметров получения полимерных композиций проводился с использованием таких критериев, как размер полимерных частиц и степень включения в них ломефлоксацина. Удовлетворительными считались результаты позволяющие получать частицы с размерами от 100 до 500 нм и степенью включения ЛВ > 30 %.

В ходе выполнения работы было установлено, что оптимальным является состав наносомальной ЛФ ломефлоксацина, указанный в таблице № 2.

Таблица № 2 Состав лекарственного препарата (ЛП)

Наименование компонента Содержание в ЛФ, % о т общей массы компонентов

Ломефлоксацин 5,8

PLGA 50:50 40,6

D-маннит 24,3

ПВС 29,2

Poloxamer 188 0,1

Итого: 100 %

В ходе выполнения данной научно-исследовательской работы была оптимизирована технология получения наносомальной ЛФ ломефлоксацина. Оптимальным является использование в качестве растворителей 1) для ломефлоксацина -0,01 М раствор соляной кислоты, 2) для полимера - хлороформ; соотношение водной и органической фазы 1:2,5; соотношение полимер:ЛВ 7:1; использование стабилизатора первичной эмульсии Ро1охатег 188. Кроме того, было установлено, что время совместного перемешивания компонентов перед первичным и вторичным гомогенизированием смеси должно составлять 20 минут; рекомендуемый режим первичной и вторично гомогенизации заключается в следующем: 1.скорость вращения ротора гомогенизатора - 24 000 об./мин; 2. время гомогенизации -трехкратно по одной минуте с минутными интервалами. Показана стабильность ЛФ при хранении более 1 года.

высвобождения JIB из полимерной матрицы в модельных опытах в условиях равновесного диализа. Время полного высвобождения JIB из наночастиц составило 96 часов. Полученная наносомальная ЛФ может храниться без признаков разложения антибиотика в течение 1 года при 5-8 °С в защищенном от света месте.

Было проведено изучение антибактериальной активности полученной новой ЛФ на культурах микроорганизмов: Escherihia coli, Klebsiella pneumonia spp., Staphylococcus aureus, штамм 906, Salmonella enteritidis ATCC 9640, Salmonella infantis spp., Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Pseudomonas aeruginosa spp., которое показало некоторое увеличение активности ЛВ в ЛФ по сравнению с субстанцией ломефлоксацина.

В опытах in vivo на крысах линии Wistar наносомальная лекарственная форма проявила пролонгированность действия, в сравнении с чистым ломефлоксацином.

Изучение общего токсического воздействия наносомального ломефлоксацина на организм мышей не показало его увеличения, а также усиления токсических эффектов, равно как и возникновения новых ранее не описанных нежелательных явлений.

Полученная новая композиция ломефлоксацина может быть использована в виде суспензии для внутримышечного или подкожного введения, кроме того она может быть использована для получения таблеток, капсул и других лекарственных форм перорального применения.

Таким образом, полученная полимерная композиция не уступает по большинству параметров используемым в настоящее время ЛФ ломефлоксацина, а по некоторым из них превосходит. В дальнейшем после определенной доработки новая наносомальная ЛФ ломефлоксацина может стать предметом для внедрения в промышленное производство.

Выводы

1. В ходе проведенного исследования разработаны подходы к созданию наносомальной ЛФ ломефлоксацина в виде наноразмерных частиц на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот; оптимизированы технологические параметры получения ломефлоксацина, иммобилизованного наНЧ.

2. Изучены физико-химические свойства полученной наносомальной ЛФ ломефлоксацина методами УФ-спектроскогши, ВЭЖХ, фотонно-корреляционной спектроскопии и др.

3. Показано, что иммобилизованный ломефлоксацин превосходит по специфической антимикробной активности субстанцию ломефлоксацина..

4. В опытах in vivo на крысах линии Wistar было показано пролонгированное действие иммобилизованного ЛВ по сравнению с субстанцией ломефлоксацина.

5. Изучено распределение по органам и тканям наносомалыюго ломефлоксацина, полученного на основе сополимеров молочной и гликолевой кислоты.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Климова О. В., Воронцов Е. А. Изучение влияния технологических параметров синтеза на физико-химические свойства наночастиц, получаемых на основе биодеградируемых полимеров. // Наномедицина и токсикология. Сборник тезисов и статей. - М., 2009,- с. 16

2. Климова О. В., Воронцов Е. А. Влияние технологических параметров синтеза на физико-химические свойства наночастиц с ломефлоксацином на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот. // Материалы VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». - М., 2009.- с. 122

3. Климова О.В. Подходы к разработке наносомальной лекарственной формы ломефлоксацина. // Тезисы итоговой научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день». -М.: Издательский дом «Бионика», 2010. -с. 75

4. Климова О.В. Разработка методов получения наносомальной лекарственной формы рифампицина на основе полиалкилцианоакрилатов. // Приложение к журналу «Вестник Российской Академии медицинских наук» № 6, 2008.-c.195

5. Климова О. В., Воронцов Е. А., Кузнецов С. Л., Северин С. Е. Разработка технологии получения наносомальной лекарственной формы ломефлоксацина на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот. // Сборник материалов XVII конгресса «Человек и лекарство». - М., 2010

6. Климова О. В. Влияние некоторых параметров синтеза на свойства наносомальной лекарственной формы ломефлоксацина. // Фармация, 2010, № 2,-с. 3739

7. Климова О. В., Воронцов Е.А., Семенов С. Ю., Северин С. Е., Северин Е. С. Влияние некоторых параметров синтеза на свойства наносомальной лекарственной формы, получаемой на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2010, № 4.-е. 27-33

8. Климова О. В., Годованный А.В., Рябцева М.С., Воронцов Е. А., Северин Е.С. Изучение наносомальной лекарственной формы ломефлоксацина, полученной на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот на наличие специфической активности и пролонгированного эффекта. // Молекулярная медицина, 2010, № 5

9. Климова О. В. Изучение наносомальной лекарственной формы ломефлоксацина, полученной на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот на наличие специфической активности и пролонгированного эффекта. // Материалы VII Международной конференции РАН «Молекулярная медицина и биобезопасность». -М., 2010.-е. 94

Подписано в печать:

02.03.2011

Заказ № 5097 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Климова, Ольга Владимировна

Список основных сокращений

Актуальность темы

Введение

Цели и задачи исследования

Научная новизна и практическая значимость работы

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 16 1.Ломефлоксацин, как действующее вещество новой наносомальной ЛФ. Его физико-химические и терапевтические свойства. Методы получения и применения

1.1 Ломефлоксацин в клинической практике

1.2 Ломефлоксацин. Химическая структура.

Методы получения и физико-химические свойства

2 Наносомальная лекарственная форма.

Преимущества и недостатки.

2.2. Общие сведения о наночастицах

2.2.1. История открытия и изучения наночастиц

2.2.2. Механизм действия наносомальных препаратов

2.2.3. Требования, предъявляемые к наночастицам и их классификация

3. Полимеры, используемые для получения наночастиц. Классификация полимеров 35 3.1. Наночастицы, получаемые на основе полиалкилцианоакрилатов (ПАЦА)

3.2 Наночастицы, получаемые на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот

4. Наносомальные лекарственные формы фторхинолонов на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот.

5. Методы получения наночастиц на основе полимеров различных типов

5.1 Получение наночастиц путем эмульгирования

5.2. Получение наночастиц путем нанопреципитации

6. Методы изучения и контроля параметров полученных наночастиц

II МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

1.Получение наносомальных форм JIB.

1.1 Метод преципитации

1.2 Метод одинарных эмульсий

1.3 Метод двойных эмульсий

1.3.1 Метод двойных эмульсий, осуществляемый с использованием PLGA 50:50, PLGA 75:25 и PLA

1.3.2 Метод двойных эмульсий, осуществляемый с изменением соотношения ЛВ:полимер

1.3.3 Метод двойных эмульсий, осуществляемый с использованием различных первичных растворителей для полимера и ЛВ

1.3.4 Метод двойных эмульсий, осуществляемый с использованием различных режимов гомогенизации

1.4 Метод двойных эмульсий, осуществляемый с применением противоиона

1.4.1 Метод двойных эмульсий, осуществляемый с применением противоиона, вводимого совместно с ломефлоксацином

1.4.2 Метод двойных эмульсий, осуществляемый 67 с применением противоиона, вводимого совместно с полимером

1.5 Метод двойных эмульсий, осуществляемый с использованием в качестве ПАВ TWEEN-80, декстрана, альбумина и ПВС

1.6 Гельфильтрация наносомального препарата

2. Анализ полученных наночастиц

2.1 Тест на ресуспендируемость

2.2 Определение размера наночастиц

3.3 Качественное и количественное определение ломефлоксацина в наночастицах и в супернатанте

3.3.1 Спектрофотометрический способ определения ломефлоксацина.

3.3.1.1 Определение общего содержания ломефлоксацина в наносомальной ЛФ

3.3.1.2 Определение содержания свободного и связанного ломефлоксацина в наносомальной ЛФ

3.3.2 Определение ломефлоксацина методом ВЭЖХ

4. Исследование параметров высвобождения ломефлоксацина из лекарственной формы in vitro. Релиз.

Проведение диализа наносомального препарата и чистого вещества

5. Изучение полученных наносомальных композиций in vitro и in vivo

5.1 Определение специфической активности

5.2 Определение острой токсичности

5.3 Релиз in vivo 77 5.4. Изучение распределения чистого и наносомального ломефлоксацина по органам и тканям in vivo

III РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.1 .Влияние технологических параметров синтеза на свойства получаемых наночастиц

1.1.1 .Метод получения НЧ и его влияние на свойства получаемой наносомальной ЛФ

1.1.2 Зависимость свойств получаемых НЧ от типа используемого полимера (бутилцианоакрилат, PLA, PLGA 50:50)

1.1.3 Зависимость свойств получаемых НЧ от природы полилактида

1.1.4 Зависимость свойств получаемых НЧ от соотношения ЛВ:полимер

1.1.5 Зависимость свойств получаемых НЧ от типа используемого стабилизатора эмульсии

1.1.6 Изучение зависимости степени сорбции

JIB в НЧ от способа предварительного растворения ломефлоксацина

1.1.7 Изучение зависимости степени сорбции ЛВ в НЧ от способа предварительного растворения полимера

1.1.8 Зависимость свойств НЧ от введения в синтез в качестве противоиона гликохолата калия гидрохлорида

1.1.9. Изучение зависимости степени сорбции JIB в НЧ от режима первичной и вторичной гомогенизации

1.1.10 Изучение зависимости свойств получаемых НЧ от времени первичной гомогенизации

1.1.11. Изучение зависимости свойств получаемых НЧ от времени вторичной гомогенизации

1.1.12 Изучение зависимости свойств получаемых НЧ от времени совместного перемешивания перед первичным гомогенизированием

1.1.13 Изучение зависимости свойств получаемых НЧ от времени перемешивания перед вторичным гомогенизированием

1.2Изучение стабильности экспериментальной лекарственной формы, разработка методов анализа

1.2.1 Изучение стабильности ломефлоксацина

1.2.2 Изучение стабильности суспензии наночастиц 118 2.1. Результаты исследования параметров высвобождения JIB из полимерной матрицы in vivo и in vitro; изучение специфической активности наносомального препарата

2.2. Определение специфической активности

2.3. Определение острой токсичности

2.4. Высвобождение JIB из полимерной матрицы in vitro в условиях равновесного диализа

2.5. Высвобождение JIB из полимерной матрицы in vivo 123 2.6 Изучение фармакокинетики наносомального ломефлоксацина в сравнении с чистой субстанцией JIB

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка новой наносомальной лекарственной формы ломефлоксацина на основе биодеградируемых полимеров"

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.

Выбранная тема является актуальной и новой в связи с тем, что на данный момент лечение внутриклеточных инфекций и опухолевых заболеваний является одной из наиболее важных проблем современной медицины. На пути решения этой проблемы возникает немалое количество трудностей. Лекарственные вещества (ЛВ), используемые настоящее время обладают низкой эффективностью, повышенной токсичностью, и к ним быстро развивается бактериальная резистентность. Поиск новых более эффективных лекарственных средств (ЛС) - это длительный и весьма дорогостоящий процесс. В связи с этим является актуальной разработка новых лекарственных форм (ЛФ) для повышения эффективности уже имеющихся и активно использующихся в клинической практике субстанций. Одним из перспективных направлений повышения эффективности, снижения побочных эффектов ЛВ и преодоления лекарственной резистентности представляется использование полимерных наночастиц (НЧ). Также с помощью НЧ становится возможным контролирование высвобождения ЛВ, что позволит, во-первых, создать на их основе пролонгированные ЛФ, во-вторых, обеспечивать внутриклеточную концентрацию на оптимальном уровне.

При анализе литературных данных было выяснено, что наиболее часто встречающимися в научной литературе фторхинолонами, используемыми для создания микро- и наносомальных ЛФ направленного действия являются ципрофлоксацин и моксифлоксацин. Однако, до настоящего момента не было сделано ни одной попытки создания наносомальной ЛФ на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот такого фторхинолона, как ломефлоксацин. Ломефлоксацин является одним из наиболее активных современных антиактериальных препаратов группы фторхинолонов. Введение ломефлоксацина в состав НЧ позволит значительно изменить его свойства, существенно расширить антибактериальную активность и улучшить фармакокинетические свойства данного ЛВ. Наличие в молекуле ломефлоксацина двух атомов фтора и мётильной группы в пиперазиновом ядре требует индивидуального подхода к созданию его наносомальной ЛФ, а также разработки оригинальных методик его качественного и количественного определения как в составе наносомальной ЛФ, так и в биологических образцах. В виду изменения свойств данного ЛВ потребуется также тщательное изучение его специфической и антибактериальной активности и изменений в распределении по органам и тканям во времени.

ВВЕДЕНИЕ.

Научно-техническое развитие современного общества ставит перед фармацевтической технологией ряд новых теоретических и практических задач, касающихся создания новых усовершенствованных лекарственных форм (ЛФ). Особенная роль стала отводиться именно ЛФ, т. к. все чаще рассматривается влияние на организм не только собственно лекарственной субстанции, но и препарата в целом. Именно лекарственный препарат с совокупностью сложных и многообразных взаимоотношений между всеми его компонентами и их влиянием на биологически активный компонент становится объектом активного дальнейшего изучения и усовершенствования. Наиболее рациональными могут считаться лишь те ЛФ, которые могут обеспечить максимальную доступность ЛВ, сводя при этом к минимуму побочные эффекты и возможные неудобства при его применении. Разработка новых ЛФ является хорошей альтернативой разработке новых ЛВ, что обусловлено рядом причин. Несмотря на то, что стало возможным применение математического моделирования для прогнозирования взаимосвязи между терапевтическим эффектом и химическим строением предполагаемой молекулы, путь создания новых ЛВ все также требует больших временных и финансовых затрат. С момента открытия нового ЛВ и до его внедрение в массовое производство и использование проходит около 10-15 лет.

Следует помнить также, что все ЛВ независимо от их принадлежности к той или иной фармацевтической группе обладают такими свойствами, как:

- токсичность '

- побочные эффекты

- относительно низкая специфичность действия (у многих)

- возникновение резистентности в случае их длительного применения

- особенности взаимодействия с другими ЛВ при совместном применении

Таким образом, наравне с разработкой новых ЛВ, не менее актуальным является и разработка новых ЛФ, для коррекции некоторых из

10 вышеперечисленных свойств ЛВ. При создании ЛФ желательно учитывать следующее:

- ЛФ должна повышать терапевтическую эффективность ЛВ

- ЛФ должна способствовать снижению побочных и токсических эффектов Важно также помнить, что при создании нового ЛП необходимо сделать для пациента лечение максимально комфортным, т.е. увеличить временные промежутки между приемами препарата, заменить, если это возможно, инфузионные и внутривенные методы введения ЛВ на пероральные. Разработка ЛФ является таким же важным этапом в создании ЛП, как и создание самого действующего ЛВ.

Одной из современных и соответсвующих выше описанным требованиям ЛФ являются наночастицы (НЧ) на основе различных полимеров. Использование наночастиц позволяет обеспечивать направленный транспорт лекарственного вещества в пораженный орган или ткань, что существенно уменьшает общее токсическое воздействие на организм [50] и, как следствие, снижает выраженность побочных эффектов. Также с помощью наночастиц становится возможным контролировать высвобождение лекарственного вещества, что позволяет, во-первых, создавать на их основе пролонгированные лекарственные формы, во-вторых, обеспечивать внутриклеточную концентрацию на оптимально высоком уровне.

В продолжении ранее начатых работ в ММА имени И. М. Сеченова, в Центре Молекулярной Диагностики и Лечения и в Московском научно-исследовательском институте медицинской экологии Департамента здравоохранения г. Москвы по разработке направленной доставки противомикробных и противоопухолевых средств для данной исследовательской работы был выбран препарат фторхинолонового ряда ломефлоксацин, а в качестве полимера для создания НЧ - сополимер молочной и гликолевой кислот (как основной).

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель: разработка биотехнологического получения ломефлоксацина, иммобилизованного на НЧ из биодеградируемых полимеров для повышения эффективности, снижения выраженности побочных эффектов, а также обеспечения пролонгированного действия ЛВ.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

-осуществить иммобилизацию ЛВ на НЧ и оптимизировать технологию синтеза наносомальной ЛФ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Впервые разработан подход к созданию наносомальной ЛФ на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот (PLGA) с ломефлоксацином, включающий в себя разработку оптимальных параметров синтеза для получения стабильной и воспроизводимой ЛФ, а также методики качественного и количественного определения ломефлоксацина в наносомальной ЛФ и в биологических образцах.

Результаты изучения механизма высвобождения ЛВ из НЧ in vitro и in vivo, а также результаты изучения распределения наносомального ломефлоксацина по органам и тканям могут быть использованы при выборе доз и режимов лечения в последующих биологических испытаниях наносомальной формы ломефлоксацина.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

2. Иммобилизованный на НЧ ломефлоксацин сохраняет, а в случае с некоторыми микроорганизмами даже увеличивает анибактериальную активность.

3. Иммобилизация ломефлоксацина на НЧ приводит к его перераспределению по органам и тканям живого организма.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА

Соискатель самостоятельно провела все эксперименты по получению НЧ с иммобилизованным на них ломефлоксацином, в динамике оценила перераспределение ЛВ по органам и тканям в сравнении с контролем. Интерпретация полученных результатов и их статистическая обработка также осуществлены автором.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы были представлены на следующих конференциях, конгрессах и научных школах:

Всероссийская научная школа для молодежи «Наномедицина и нанотоксикология» 2009

VI международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность» 2009

- Итоговая научная конференция молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» 2010

- XVII Российский национальный конгресс «Человек и Лекарство» 2010

VII международная конференция РАН «Молекулярная медицина и биобезопасность» 2010

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ (3 из них - в журналах из списка ВАК, 6 - тезисы докладов)

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 154 страницах, содержит 3 схемы, 9 рисунков, 20 таблиц, 37 графиков.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Климова, Ольга Владимировна

Выводы

2. Изучены физико-химические свойства полученной наносомальной ЛФ ломефлоксацина методами УФ-спектроскопии, ВЭЖХ, фотонно-корреляционной спектроскопии и др.

3. Показано, что иммобилизованный ломефлоксацин превосходит по специфической антимикробной активности субстанцию ломефлоксацина.

5. Изучено распределение по органам и тканям наносомального ломефлоксацина, полученного на основе сополимеров молочной и гликолевой кислоты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе выполнения работы было установлено, что оптимальным является состав наносомальной ЛФ ломефлоксацина, указанный в таблице№20.

Состав лекарственного препарата (ЛП) Таблица № 20

Наименование компонента Содержание в ЛФ, % от общей массы компонентов

Ломефлоксацин 5,8

PLGA 50:50 40,6

D-маннит 24,3

ЛВС 29,2

Poloxamer 188 0,1

Итого: 100 %

В ходе выполнения данной научно-исследовательской работы была оптимизирована технология получения наносомальной ЛФ ломефлоксацина.

139

Оптимальным является использование в качестве растворителей 1) для ломефлоксацина -0,01 М раствор соляной кислоты, 2) для полимера — хлороформ; соотношение водной и органической фазы 1:2,5; соотношение полимер:ЛВ 7:1; использование стабилизатора первичной эмульсии Poloxamer 188. Кроме того, было установлено, что время совместного перемешивания компонентов перед первичным и вторичным гомогенизированием смеси должно составлять 20 минут; рекомендуемый режим первичной и вторично гомогенизации заключается в следующем: 1.скорость вращения ротора гомогенизатора - 24 000 об./мин; 2. время гомогенизации - трехкратно по одной минуте с минутными интервалами. Показана стабильность ЛФ при хранении более 1 года.

Полученная наносомальная ЛФ ломефлоксацина была охарактеризована с помощью различных физико-химических методов: уф-спектроскопии, ВЭЖХ, фотонной-корреляционной спектроскопии и т. д. Была также изучена кинетика высвобождения ЛВ из полимерной матрицы в модельных опытах в условиях равновесного диализа. Время полного высвобождения ЛВ из наночастиц составило 96 часов. Полученная наносомальная ЛФ может храниться без признаков разложения антибиотика в течение 1 года при 5-8 °С в защищенном от света месте.

Полученная новая композиция ломефлоксацина может быть использована в виде суспензии для внутримышечного или подкожного, кроме того она может быть использована для получения таблеток, капсул и других лекарственных форм перорального применения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Климова, Ольга Владимировна, Москва

1. Зузова А. П. Новые фторхинолоны при интераабдоминальных инфекциях и инфекциях малого таза // Фарматека №10-2007

2. Майчук Ю.Ф., Вахова Е.С., Кононенко JI.A. Ломефлоксацин в лечении инфекционных заболеваний глаз // Антибиотики и химиотерапия, 1998-N10, стр. 32-35.

3. Максаквин новый антибактериальный препарат из группы фторхинолонов//Пульмонология, 1993. Приложение.

4. Оганесян Е. А., X Бадур и др. Разработка пероральной лекарственной формы рифампицина // Фармация №5, (2009) с. 37-39

5. Падейская E.H. Дифторхинолон, ломефлоксацин (максаквин): место среди фторхинолонов, возможности и перспективы. // Антибиотики и химиотерапия, 1998; 43 (10): 4-9.

6. Падейская E.H., Яковлев В.П. Антимикробные препараты группы фторхинолонов в клинической практике. М.: ЛОГ ATA, 1998. 352 е.;

7. Падейская E.H., Яковлев В.П. Фторхинолоны. М.: Биоинформ, 1995. 208с.

8. Патент 2314103 С1, Нестерук В. В., Сыров К. К., Опубликовано: 10.01.2008 РАСТВОР МОКСИФЛОКСАЦИНА ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

9. Патент №2308970; Дата публикации 2007.10.27; Название: АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ; Патентообладатель Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики" (AHO "ИнМоДи") (RU)

10. Под ред. Курганова A.A. Хроматография на благо России. М.: Издательская группа «Граница».- 2007. - 688с.

11. Страчунский Л.С., Белоусов Ю.Б., Козлов С.Н., Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии. Смоленск: МАКМАХ, 2007;

12. Чучалин А.Г., Цой А.Н., Архипов В.В. Диагностика и лечение пневмоний с позиций медицины доказательств. // Consilium-Medicum. 2002. - Том 4. -№12.;

13. Шипуло Е. В, Любимов И. И., Максименко О . О. и др. Получение и исследование наносомальной формы моксифлоксацина на основе полибутилцианоакрилата // Хим.-Фарм. журнал; том 42 №3, С.43-47, 2008

14. Шмелев Е.И., Чуканов В.И. Применение фторхинолонов при туберкулезе.// Consilium-Medicum. 2000. - Том 2. - №10

15. Шубин С.В. Артриты, связанные с урогенитальной инфекцией;Новый медицинский журнал ,-1996.-№1-2,- с.20-23

16. Яковлев В.П. Антибактериальные препараты группы фторхинолонов. // Русский медицинский журнал, Антибактериальные препараты, 1997; 5 (21): 1405-1413

17. Яковлев В.П., Блатун Л.А., Гришина И.А. Рандомизированное клинико-лабораторное исследование эффективности максаквина в сравнении с ципрофлоксацином. Пульмонология 1993; прилож: 92-94.

18. Ahmad Z, Pandey R, Sharma S, Khuller GK. Novel chemotherapy for tuberculosis: chemotherapeutic potential of econazole- and moxifloxacin-loaded PLG nanoparticles. // Int J Antimicrob Agents. 2008 Feb;31(2): 142-6. Epub 2007 Dec 26

19. Ahmed S. Zidan, Omaima A. Formulation of anastrozole nanoparticles as biodegradable anticancer drug carriers // PharmSciTech 2006; 7 (3) Article 61

20. Ain Q, Sharma S, Garg SK, Khuller GK. Role of poly DL-lactide-co-glycolide. in development of a sustained oral delivery system for antitubercular drug(s). // Int J Pharm 2002;239:37-46.

21. Asano et al. Effect of the composition on the hydrolytic degradation rate of poly(lactide)-poly(glycolide) copolymers. // J. Controlled Release 1989, 9, 111

22. Avgoustakis K. Pegylated poly(lactide) and poly(lactide-co-glycolide) nanoparticles: preparation, properties and possible application in drug delivery.// CurrDrug Deliv 2004;1:321-33

23. Bai L, Zhu H, Thrasher JS, Street SC. Synthesis and Electrocatalytic Activity of Photoreduced Platinum Nanoparticles in a Poly(ethylenimine) Matrix. // ACS Appl Mater Interfaces. 2009 Oct 28;1(10):2304-11

24. Branco Monica C., Schneider Joel P. Self-assembling materials for therapeutic delivery// Acta Biomaterialia 5 (2009) 817-831

25. C. Perez, A. Sanchez, D. Putnam, et al. Poly (lactic acid)-poly (ethylene glycol) nanoparticles as new carriers for the delivery of plasmid DNA, // J. Control Release,2001, 75:211-224.

26. Chasin M., Langer R. Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems// Marcel Dekker.- New York.- 1990

27. Chiellini F, Piras AM, Errico C, Chiellini E, Micro/nanostructured polymeric systems for biomedical and pharmaceutical applications. // Nanomedicine, 2008, 3(3):367-393 ;

28. Davis ME, Chen ZG, Shin DM, Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. // Nat Rev Drug Discov., 2008, 7(9):771-782

29. Debbia E.A., Pesce A., Schito E.G. In vitro assessment of the postantibiotic effect of lomefloxacin against gram-positive and gram-negative pathogens.// Amer.J.Med., 1992; 92: suppl. 4A: 455-475

30. Deppermann K., Lode H. Fluoroquinolones: interaction profile during enteral absorption. // Drugs, 1993; 45: suppl.3: 65-72

31. Dillen K, Vandervoort J, Van den Mooter G, Verheyden L, Ludwig A, Factorial design, physicochemical characterisation and activity of ciprofloxacin-PLGA nanoparticles. // Int J Pharm., 2004, 275(1-2):171-187

32. Drusano G.L. et al. Pharmacodynamics of a Fluoroquinolone Antimicrobial

33. Agent in a Neutropenic Rat Model of Pseudomonas Sepsis. // Antimicrob agentschemother. 1993. Vol. 37(3).- P. 483-490145

34. Dutt M, Khuller GK. Chemotherapy of Mycobacterium tuberculosis infections in mice with a combination of isoniazid and rifampicin entrapped in poly (DL-lactide-co-glycolide)microparticles. // J. Antimicrob Chemother 2001;47: 829835

35. Fawaz F, Bonini F,Maugein J, Lagueny AM. Ciprofloxacin-loaded polyisobutylcyanoacrylate nanoparticles: pharmacokinetics and in vitro antimicrobial activity. // Int J Pharm 1998;168:255-259

36. Fuminori Ito, Kimiko Makino Preparation and properties of monodispersed rifampicin-loaded poly(lactide-co-glycolide) microspheres // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 39 (2004) 17-21

37. Fysicochemische en microbiologische karakterisatie van PLGA nanopartikels bereid met Eudragit® of kationogene stoffen. Unpublished thesis, Katholieke Hogeschool Kempen, Gezondheidszorg en Chemie Geel, Theunis, S. (2004).

38. Haider KK, Mandal B, Debnath M. et al. Chloramphenicol-incorporated poly lactide-co-glycolide (PLGA) nanoparticles: formulation, characterization, technetium-99m labeling and biodistribution studies.

39. Harivardhan Reddy and R. S. R. Murthy PHARMACOKINETICS AND BIODISTRIBUTION STUDIES OF DOXORUBICIN LOADED POLY(BUTYL CYANOACRYLATE) NANOPARTICLES SYNTHESIZED BY TWO DIFFERENT TECHNIQUES; L. // Biomed., 2004, Papers 148(2), 161-166

40. Janoir Panyam, Labhasetwar V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. //Adv. Drug Deliv. Rev., 2003, 55: 329-347.

41. Jain, R. The manufacturing techniques of various drug loaded biodegradable poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) devices. //Biomaterials, 2000, 21 (23), 24752490.

42. Janoir C., Zeller V., Kitzis M.D., Moreau N.J., Gutmann L. High-level fluoroquinolone resistance in Streptococcus pneumoniae requires mutations in parC and gyrA. II Antimicrob Agents Chemother. 1996; 40: 2760-4.;

43. Kante B., Couverur B., Dubois-Krack G. Toxicity of polyalkylcyanoacrylate nanoparticles. I. Free nanoparticles. // J. Pharm. Sci., 1982, 71: 786

44. Kim I.Y., Jung U.W., Kim C.S. et al. Effects of a tetracycline blended polylactic and polyglycolic acid membrane on the healing of one-wall intrabony defects in beagle dogs. // Biomed Mater., 2007, 2(3):S106-S110

45. Kreuter J. Nanoparticles—a historical perspective // International Journal of Pharmaceutics 331 (2007) 1-10

46. Kristin L. Aillon, Yumei Xie, Nashwa El-Gendy, Cory J. Berkland et al. Effects of nanomaterial physicochemical properties on in vivo toxicity // Advanced Drug Delivery Reviews 61 (2009) 457-466

47. Kulkarni R.K., Pani K.C., Neuman C., Leonard F., Polylactic Acid for Surgical Implants. // AMA Arch Surg. 1966;93(5):839-843;

48. Kurkemyer J., Lima J., Adams M. et al. 29th Intersci Conf Antimicrob Agents// Chemotner. Houston, 1989; Abstr. 16.

49. Laura J. V., Paddock M. S. et al. Mechanism of Action of Lomefloxacin // ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, June 1990, p. 1088-1093

50. Lenaerts V., Nagelkerke J.F., van Berkel N.J.C. et al. Toxicity and association of polycyanoacrylate nanoparticles with hepatocytes. // J. Microencapsul., 1984, 1:253

51. Li Y, Kissel T. Synthesis, characteristics and in vitro degradation of star-block copolymers consisting of L-lactide, glycolide, and branched multi-arm polyethylene oxide). Polymer. 1998;39:4421-4427

52. Lim H, Raku T, Tokiwa Y, Hydrolysis of polyesters by serine proteases, // Biotechnology Letters, 2005, 27(7): 459-464;

53. Lim H, Raku T. Formulation pH modulates the interaction of insulin with chitosan nanoparticles. // J. Pharm Sei. 2002;91:1404-11

54. Lin B.Se Pu. Multi-residue determination of 11 quinolones in chicken muscle by high performance liquid chromatography with fluorescence detection // 2009 Mar;27(2) :206-10. Chinese

55. Longstreth J.A. 17th Intern Congr Chemother. Berlin, 1991; Abstr. 381

56. Mandal B, Halder KK, Dey SK, Bhoumik M, Debnath MC, Ghosh LK, Development and physical characterization of chloramphenicol loaded biodegradable nanoparticles for prolonged release. // Pharmazie, 2009, 64(7):445-449;

57. Mandal B., Alexander K.S. Evaluation of the drug-polymer interaction in calcium alginate beads containing diflunisal. // Pharmazie 65(2): 106-9, 2010 Feb.;

58. MARIE-THE'RE'SE LABRO, Interference of Antibacterial Agents with Phagocyte Functions: Immunomodulation or "Immuno-Fairy Tales"? // CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Oct. 2000, p. 615-650

59. Melisande Holzer, Vitali Vogel Physico-chemical characterisation of PLGA nanoparticles after freeze-drying and storage // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 72 (2009) 428-437

60. Misra R, Acharya S, Dilnawaz F, Sahoo SK, Sustained antibacterial activity of doxycycline-loaded poly(D,L-lactide-co-glycolide) and poly(e-caprolactone) nanoparticles. // Nanomedicine, 2009, 4(5):519-530;

61. Misra R, Acharya S, Dilnawaz F, Sahoo SK, Sustained antibacterial activity of doxycycline-loaded poly(D,L-lactide-co-glycolide) and poly(e-caprolactone) nanoparticles. //Nanomedicine, 2009, 4(5):519-530;

62. Neumann M. Clinical pharmacokinetics of the newer antibacterial 4-quinolons.// Clin. Pharmacokin., 1988; 14: 96-121

63. Owen I. Corrigan, Xue Li Preparation and properties of monodispersed rifampicin-loaded poly(lactide-co-glycolide) microspheres // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 39 (2004) 17-21

64. Owen I. Corrigan, Xue Li Quantifying drug release from PLGA nanoparticulates // European Journal of Pharmaceutical Sciences 37 (2009) 477485

65. Park TG. Degradation of Poly(D,L-lactic acid) microspheres—effect of molecular-weight. // J. Controll Release 1994;30(2): 161-73

66. Patrick B. O'Donnell, James W. McGinity Preparation of microspheres by the solvent evaporation technique // Advanced Drug Delivery Reviews 28 (1997) 25^42

67. Perrin D.E.; English J. P. Polyglicolide and polylactide. Biocompatibility. Handbook of biodegradable polymers.- CRC Press.- 2007.- chapter 1.- P. 13-15.

68. Piddock L. Characterization of the QRDR of gyrA of Bacteroides fragilis and role in fluoroquinolone resistance. 11 Proceedings of the 38th ICAAC; 1998 Sep 24-27; San Diego, USA. p. 121.

69. Pinto-Alphandary H, Andremont A, Couvreur P. Targeted delivery of antibiotics using liposomes and nanoparticles: research and applications. // Int J Antimicrob Agents. 2000 Jan;13(3):155-68.

70. Quintiliani R., Owens R.Jr., Grant E. Clinical role of fluoroquinolones in patients with respiratory tract infections. // Infect Dis Clin Pract 1999; 8 (Suppl 1):S28-41.;

71. Rawat M, Singh D, Saraf S. Nanocarriers: Promising Vehicle for Bioactive. // Biol Pharm Bull.- 2006.- Vol. 29(9).- P. 1790-1798.

72. Reddy L.H., Murthy R.S. Pharmacokinetics and biodistribution studies of Doxorubicin loaded poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles synthesized by two different techniques. // Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2004 Dec; 148(2): 161-6.

73. Ricci V. QuinoloneBinding Pocket of DNA Gyrase: Role of GyrB. // Antimicrob. Agents Chemother. 2002, 46, 1805-1815

74. Richer M., LeBel M. Pharmacokinetics of fluoroquinolones in selected populations. -In: Quinolone Antimicrobi? Agentsed // Washing-ton, 1993; 225244.

75. S. Hirosue, B. G. Muller, R. C. Mulligan, et al. Plasmid DNA encapsulation and release from solvent diffusion nanospheres. // J. Control Release, 2001, 70: 231242.

76. Sanchez A, Jose L, Alonso MJ. Development of biodegradable microspheres and nanospheres for the controlled release of cyclosporine // A. Int J fharm.-1993,- Vol. 99.-P. 263-73.

77. Senthilkumar M, Mishra P, Jain NK. Long circulating PEGylated poly(D,L-lactide-co-glycolide) nanoparticulate delivery of Docetaxel to solid tumors. // J Drug Target. 2008 Jun;16(5):424-35.

78. Sharma A, Pandey R, Sharma S, Khuller GK. Chemotherapeutic efficacy of poly (DL-lactide-co-glycolide) nanoparticle encapsulated antitubercular drugs at subtherapeutic dose against experimental tuberculosis. // J. Antimicrob Agents 2004;24:599-604

79. Simone EA, Dziubla TD, Muzykantov VR, Polymeric carriers: role of geometry in drug delivery. //Expert Opin Drug Deliv., 2008, 5(12):1283-1300;

80. Singh U.V., Bisht K.S., Rao S. et al. Reduced toxicity and enhanced antitumor efficacy of plumbagin using poly (lactic-co-glicolic) biodegradable injectable implant.// Indian Journal of Pharmacology.- 1997.- N. 29.- P. 168-172

81. Sokolsky-Papkov M, Agashi K, Olaye A, Shakesheff K, Domb AJ, Polymer carriers for drug delivery in tissue engineering. //Adv Drug Deliv Rev., 2007, 59(4-5):187-206;

82. Soppimath KS, Aminabhavi TM, Kulkarni AR, Rudzinski WE. Biodegradable polymeric nanoparticles as drug delivery devices. // J. Control Release 2001;70:1-20

83. Sorqel F., Kinzig M. Pharmacokinetics of gyrase inhibitors, part 2: renal and hepatic elimination pathways and drug interactions. //Amer.J.Med., 1993; 94: suppl.: 56-69

84. Stevanovic M, Uskokovic D, Poly(lactide-co-glycolide)-based Micro and Nanoparticles for the Controlled Drug Delivery of Vitamins. //Current Nanoscience, 2009, 5(1):1-14;

85. Stone J.W., Andrews J.M., Ashby J.P. Pharmacokinetics and inflammatory fluidpenetration of moxifloxacin following oral or intravenous administration.//

86. Antimicrob Agents Chemother 1988; 32: 1508-1510151

87. Surfactants and Polymers in Drug Delivery Martin Malmsten // Institute for Surface Chemistry and Royal Institute of Technology Stockholm, Sweden

88. Svetlana Gelperina, Kevin Kisich, Michael D. Iseman, and Leonid Heifets The Potential Advantages of Nanoparticle Drug Delivery Systems in Chemotherapy of Tuberculosis // AMERICAN JOURNAL OF RESPIRATORY AND CRITICAL CARE MEDICINE VOL 172, 2005

89. Tailoring of Poly(lactide-co-glycolide) to Control Properties. // Lakeshore Biomaterials, 21 (2000)

90. Tong R, Yala L, Fan TM, Cheng The formulation of aptamer-coated paclitaxel-polylactide nanoconjugates and their targeting to cancer cells. // J. Biomaterials. 2010 Apr;31(l l):3043-53

91. US patent №4528287 // Itoh Y., Kato H «6-Fluoro-l, 4-dihydro-4-oxo-7-substituted piperazinylquinoline-3-carboxylic acids and the method for preparing the same».

92. Van der Auwera, P., and M. Husson. Influence of antibiotics on motility and adherence of human neutrophils studied in vitro. // Drugs Exp. Clin. Res. 1989, XV:211-218

93. Vauthier C, Dubernet C, Fattal E, Pinto-Alphandary H, Couvreur P. Poly(alkylcyanoacrylates) as biodegradable materials for biomedical applications. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2003;55:519-548

94. Vauthier C, Dubernet C, Fattal E, Pinto-Alphandary H, Couvreur P. Poly(alkylcyanoacrylates) as biodegradable materials for biomedical applications //Adv. Drug Deliv. Rev. 2003 Apr 25;55(4):519-48

95. Vyas SP, Kannan ME, Jain S, Mishra V, Singh P. Design of liposomal aerosols for improved delivery of rifampicin to alveolar macrophages.// Int. J. Pharm. 2004 Jan 9;269(l):37-49.

96. Wadworth A.N., Goa K.L. Lomefloxacin. A review of its antimicrobial activity, pharmacokinetics properties, and therapeutic use. // Drugs. 1991; 42: 1018-1060.

97. Wang TW, Wu Y, Li MJ Preparation and drug release property of paclitaxel nanoparticles // Zhong Yao Cai. 2009 Sep;32(9): 1447-9

98. Wolfson J.S., Hooper D.C., Pharmacokinetics of fluoroquinolones in selected populations. // J. Quinolone Antimicrob. Agents, Washing-ton, 1993; 225-244.

99. Wolfson John S. and Hooper David C. Fluoroquinolone Antimicrobial Agents// CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Oct. 1989, p. 378-424

100. Yanasarn N., Sloat B.R., Cui Z. Nanoparticles engineered from Iecithin-in-water emulsions as a potential delivery system for docetaxel. // Int J Pharm. 2009 Sep 8;379(1): 174-80

101. YI Jeong, Na H.S., Nah J.W., Lee H.C., Preparation of ciprofloxacin-encapsulated poly(DL-lactide-co-glycolide) microspheres and its antibacterial activity. // J. Pharm Sci. 2009, 98(10):3659-3665;

102. Young-Jeong, Hee-Sam Na, Dong-Hyuk Seo Ciprofloxacin-encapsulated poly(dl-lactide-co-glycolide) nanoparticles and its antibacterial activity // International J. of Pharmaceutics 352 (2008) 317-323

103. Zhang T., Zhou X., Chen Y., Gu W. et al. Fluoroquinolone resistance and mutation patterns in gyrA and parC genes in Neisseria gonorrhoeae isolates from Shanghai // Univ. Sci. Technolog. Med. Sci. 2009 Feb;29(l):29-34

104. Zhigaltsev V., Winters G., Srinivasulu M. Development of a weak-base docetaxel derivative that can be loaded into lipid nanoparticles. // J. Control Release. 2010 Mar 2

Информация о работе

Климова, Ольга Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка новой наносомальной лекарственной формы ломефлоксацина на основе биодеградируемых полимеров - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы