Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Подходы к разработке наносомальной лекарственной формы рифампицина
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Подходы к разработке наносомальной лекарственной формы рифампицина"

На правах рукописи

ОГАНЕСЯН ЕРВАНД АЛЕКСАНДРОВИЧ

ПОДХОДЫ К РАЗРАБОТКЕ НАНОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ РИФАМПИЦИНА

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2005

Работа выполнена в Московской Медицинской Академии имени И.М. Сеченова

Научные руководители:

доктор медицинских наук кандидат химических наук

Воротников Игорь Константинович Гелъперина Светлана Эммануиловна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук доктор химических наук,

Никитина Зоя Кимовна

академик РАМН, профессор

Швец Виталий Иванович

Ведущая организация:

Российский Химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева

Защита состоится <<10 » мая 2005 года в «14» часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 при Всероссийском НИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7.

Автореферат разослан «10» апреля 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.070.01

канд. с./х. наук М.В. Кирцова

сЮвг/б'52>'

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Лечение внутриклеточных инфекций является серьезной проблемой, одним из решений которой может стать осуществление направленного транспорта антибиотиков в инфицированные клетки. Многие возбудители внутриклеточных инфекций, такие как Mycobacteria, Salmonella, Staphylococcus aureus и др., способны выживать и размножаться в макрофагах, естественной функцией которых является захват и уничтожение микроорганизмов. В этом случае макрофаги становятся нишей для патогенных микроорганизмов и мишенью для химиотерапии, а результативность лечения зависит от того, удается ли доставить лекарственное вещество (ЛВ) в макрофаги в эффективных концентрациях.

Одним из путей решения этой проблемы является применение коллоидных систем доставки ЛВ на основе биодеградируемых наночастиц. Попадая в кровяное русло, наночастицы фактически повторяют путь бактерий, то есть фагоцитируются резидентными макрофагами в органах ретикулоэндотелиальной системы (РЭС) и циркулирующими моноцитами, обеспечивая, таким образом, эффективный транспорт адсорбированных ЛВ в макрофаги. В клетке частицы подвергаются деградации под действием ферментов и выделяют ЛВ, что позволяет достичь высоких внутриклеточных концентраций. Кроме того, наночастицы способны проникать и накапливаться в очагах патологии, для которых характерны повышенная проницаемость капилляров и нарушения лимфотока (зоны воспаления и опухолевого роста). Эти свойства наночастиц, наиболее выраженные при внутривенном введении, легли в основу концепции о возможном повышении эффективности противобактериальных ЛВ с помощью наночастиц. Действительно, было показано, что наночастицы значительно повышают эффективность антибиотиков при лечении инфекций, для которых характерна внутриклеточная локализация возбудителей, таких как, например, сальмонеллез или листериоз (Pinto-Alphandary Н et al., 2000).

В последнее время в литературе появились также данные о высокой активности наносомальных препаратов при лечении туберкулеза у мышей (Pandey R. et al., 2003). Однако эта область применения наночастиц мало изучена. В то же время, можно полагать, что создание наносомальных лекарственных форм позволит повысить эффективность и снизить токсичность применяемых в клинической практике противотуберкулезных средств. Это направление исследований приобретает особую актуальность в условиях

значительного роста заболеваемости туберкулезом легких во всех странах мира.

Среди синтетических биодеградируемых полимеров, используемых для получения наночастиц, интерес представляют полиалкилцианокрилаты. Наночастицы из полиалкилцианокрилатов обладают низкой токсичностью и эффективно сорбируют различные ЛВ (Vauthier С et al., 2003; Kreuter J., 1994). В водных растворах эти наночастицы образуют устойчивые коллоидные системы, пригодные для парентерального введения. Таким образом, наночастицы из полиалкилцианокрилатов являются перспективным носителем для создания коллоидных систем доставки JIB.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработать подходы к созданию наносомальной лекарственной форме рифампицина для внутривенного введения на основе наночастиц из полибутилцианоакрилата (ПБЦА); изучить фармакокинетику этой лекарственной формы.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи.

1. Разработать методику получения наносомальной формы рифампицина на основе наночастиц из ПБЦА; изучить влияние различных параметров процесса на характеристики наночастиц.

2. Изучить стабильность рифампицина в условиях формирования наночастиц.

3. Разработать методику анализа рифампицина в наносомальной форме и в биологических образцах.

4. Изучить фармакокинетику наносомального рифампицина в сравнении со стандартной лекарственной формой рифампицина.

5. Изучить влияние модификации поверхности наночастиц на фармакокинетику наносомального рифампицина.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые разработан подход к созданию наносомальной лекарственной формы на примере полибутилцианоакрилатных наночастиц с рифампицином.

Впервые изучены параметры процесса получения наносомальной лекарственной формы рифампицина путем анионной полимеризации бутилцианоакрилата в присутствии рифампицина.

Впервые изучена фармакокинетика наносомальной лекарственной формы рифампицина на основе наночастиц из ПБЦА. Показано, что модификация

наночастиц поверхностно-активными веществами (полоксамер 407 и полоксамин 908) позволяет целенаправленно менять биораспределение наносомального рифампицина.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

Показано, что применение наночастиц позволяет целенаправленно изменять фармакокинетику наносомального рифампицина, способствуя его распределению в органы ретикулоэндотелиальной системы. Можно полагать, что эта лекарственная форма будет эффективна при лечении инфекций, для которых характерна локализация возбудителей в органах РЭС (в том числе, туберкулеза).

Экспериментальные подходы, разработанные для оптимизации методов получения наносомальной формы рифампицина, могут быть использованы при создании других наносомальных препаратов.

Сформулирован ряд критериев для стандартизации наносомальных лекарственных форм для внутривенного введения и предложены соответствующие методы контроля качества.

Результаты фармакокинетического исследования могут быть использованы при выборе доз и режимов лечения в последующих биологических испытаниях наносомальной формы рифампицина.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

Российском Национальном Конгрессе «Человек и Лекарство» (Москва, 2004);

VII Российском съезде фтизиатров «Туберкулез сегодня» (Москва, 2003);

III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные паута и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004);

1-ой Международной Конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004 год)

31* Meeting of the Controlled Release Society (Honolulu, USA, 2004)

ПУБЛИКАЦИИ

Основное содержание диссертации опубликовано в 6 печатных работах.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и их обсуждение», заключения и выводов. Диссертация изложена на листах машинописного текста и содержит

рисунка,3таблицы. Список литературы состоит и/^наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение наночастиц и определение их физико-химических характеристик

Наночастицы получали методом эмульсионной полимеризации бутилцианоакрилата в водной среде. Для этого бутилцианоакрилат (Sicomet, Sichel-Werke GmbH, Германия) при перемешивании прибавляли к раствору стабилизатора (декстран-70 и/или плюроник F68) в водной соляной кислоте (pH 1,5-3). Рифампицин (0,27-ь2,7 мг/мл) вводили в реакционную смесь до начала полимеризации или через 30 мин после прибавления мономера. Общее время полимеризации составляло 3 ч, после чего реакционную смесь нейтрализовали 0,1N NaOH; затем добавляли криопротектор маннит (3% в/о), фильтровали через стеклянный пористый фильтр, разливали по флаконам, замораживали и лиофилизовали в течение 24 ч (Alpha Christ 2-4).

Размер наночастиц определяли методом фотонной корреляционной спектроскопии (ФКС) (Coulter N4MD, Coulter Electronics).

Степень сорбции рифампицина определяли как отношение количества рифампицина, связанного с наночастицами, к общему количеству рифампицина в лекарственной форме. Для этого после нейтрализации реакционной смеси или после ресуспендирования лиофилизата наночастицы отделяли методом ультрафильтрации (микрофильтры Microcon 30 kDa) или ультрацентрифугирования (20000 об/мин, ультрацентрифуга J21, Beckman), затем проводили количественный анализ рифампицина в фильтрате/'супернатанте методом спектрофотометрии или ВЭЖХ.

Относительную степень сорбции JIB наночастицами (% от концентрации ЛВ в полимсризационной среде) вычисляли как:

Относительная сорбция JIB = 100% х (Ci - Cß/Ci, где

С, - начальная концентрация рифампицина (мг/мл),

Cf - концентрация рифампицина в супернатанте/фильтрате (мг/мл).

Количественное определение рифампицина в лиофилизированном препарате проводили методом УФ-спектрофотометрии после разрушения наночастиц в смеси диметилформамид/вода.

Стабильность рифампицина определяли методом обращеннофазной ВЭЖХ (хроматограф SP-800, Spectra Physics), длина волны детекции 254 нм, подвижная фаза - ацетонитрил-вода 1:1, трифторуксусная кислота 0,1%, ЭДТА 0,01%.

Фармакокинетическое исследование. В исследовании использовали экспериментальный образец наносомального рифампицина со следующими характеристиками: размер частии - 620 нм, степень сорбции рифампицина 60%, соотношение ЛВ/полимер 1/7.

Использовали мышей самцов линии BALB/c массой 24-25 г (питомник РАМН «Столбовая», Москва). Животных разделили на четыре группы (п = 6) и вводили внутривенно следующие лекарственные формы рифампицина: 1) стандартную лекарственную форму (рифампицин - лиофильный порошок для инъекций, Ферейн, Россия) [РИФ]; 2) наносомальный рифампицин [РИФ-НЧ]; 3) наносомальный рифампицин, модифицированный полоксамером 407 [РИФ-НЧ+Р407]; 4) наносомальный рифампицин, модифицированный полоксамином 908 [РИФ-НЧ+Р908].

Для модификации лиофилизированные наночатицы перед опытом ресуспендировали в 0,125% растворе ПАВ; раствор выдерживали 30 мин при 20°С.

Доза рифампицина составляла 27 мг/кг, доза ПАВ (полоксамера 407 или полоксамина 908) - 35 мг/кг, объем инъекции - 0,7 мл.

Через 5 мин; 1,0; 3,0; 5,0; 15,0 и 24,0 ч после введения препаратов животных умерщвляли декапитацией. Органы (легкие, печень, селезенка) отделяли, готовили навески 100±1 мг, прибавляли 0,5 мл дистиллированной воды и 50 мкл 0,!М фосфатного буфера (рН 7.4) и гомогенизировали. Гомогенат количественно переносили в пробирки, приливали 3,0 мл ацетонитрила и помещали в ультразвуковую баню на 15 мин для разрушения наночастиц. Аналогично готовили образцы плазмы. Затем все образцы центрифугировали при 3000 об/мин 5 мин, фильтровали через нейлоновый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и определяли концентрацию рифампицина в фильтрате методом ВЭЖХ (состав подвижной фазы: ацетонитрил - вода (65:35), трифторуксусная кислота 0,1%, ЭДТА Na-соль 0,075%).

Для характеристики фармакокинетики рифампицина в крови и органах мышей рассчитывали интегральный показатель площади под фармакокинетической кривой (AUC) (программа «Фарма», Холодов Л.Е., Дорохов В.В., 1989). Результаты приведены как «среднее арифметическое i доверительный интервал» (п = 6, уровень значимости 0,95).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Предварительные эксперименты, проведенные нашей группой, продемонстрировали принципиальную возможность создания наносомальной лекарственной формы рифампицина на основе наночастиц из полибутилцианоакрилата. Наносомальный рифампицин проявил высокую эффективность при лечении сальмонеллеза и сепсиса у мышей (Скидан И.Н. с соавт., 2003). Однако влияние технологических параметров на свойства наночастиц и стабильность рифампицина в условиях образования наночастиц не были изучены, также не было исследовано распределение наносомального препарата в организме.

Таким образом, целью настоящего исследования являлась оптимизация метода получения наносомальной лекарственной формы рифампицина для внутривенного введения, а также стандартизация экспериментальных образцов.

Сложность поставленных перед нами задач была обусловлена тем что, поскольку наносомальные препараты еще не вошли в клиническую практику, нет и нормативно-технической документации, определяющей требования к наносомальным формам для внутривенного введения. В соответствии с поставленными задачами мы сформулировали ряд критериев, позволяющих на данном этапе исследований стандартизовать экспериментальные образцы наносомальной лекарственной формы рифампицина, а также соответствующие методы контроля.

При разработке требований мы руководствовались следующими соображениями (таблица 1):

1) размер частиц должен быть значительно меньше диаметра наиболее мелких капилляров кровеносной системы, который, по разным оценкам, составляет 4-7 мкм;

2) по литературным данным, наиболее устойчивыми являются суспензии с размером частиц <1 мкм;

3) эффективность наносомального препарата в существенной степени зависит от того, насколько полно ЛВ сорбировано наночастицами. Таким образом, степень сорбции ЛВ (доля ЛВ, содержащегося в наночастицах) является одним из основных критериев для оптимизации процесса;

4) стабильность рифампицина: при разработке требований к содержанию примесей в лекарственной форме мы руководствовались нормативной документацией для существующих лекарственных форм рифампицина;

5) использование твердой (лиофилизированной) наносомальной формы рифампицина позволяет увеличить сроки ее хранения. Срок хранения лиофилизированной наносомальной формы рифампицина при 4°С не менее 6 месяцев.

Изучение стабильности рифампицина, определение примесей.

Образование наночастиц и включение в них рифампицина происходит в результате полимеризации бутилцианоакрилата. Процесс происходит в относительно мягких условиях (водная среда, рН2-3, 20°С, время реакции 2-3 ч). В то же время известно, что рифампицин может в кислой среде подвергаться гидролизу с образованием дезоксиформил-рифампицина (РИФ-ЯУ), а в слабощелочной среде - окисляться до хинона. Кроме того, бутилцианоакрилат обладает высокой реакционной способностью и может вступать в реакцию с рифампицином, что приведет к образованию побочных продуктов. В связи с этим необходимо было изучить стабильность рифампицина в кислой среде и в условиях полимеризации бутилцианоакрилата.

Таблица 1. Основные характеристики наносомальной лекарственной формы рифампицина для внутривенного введения__

№ Параметр Норма Тест

1 Средний размер частиц в суспензии Не превышает 700 нм; частицы >1000 нм отсутствуют ФКС

2 Стабильность наносуспензии Не менее 8 часов при 20°С ФКС

3 Степень сорбции рифампицина в наночастицах Не менее 50% при соотношении рифампицин/полимер не менее 1:20 ВЭЖХ или спекгро-фотометрия

4 Стабильность рифампицина Общее содержание примесей не превышает 6% ВЭЖХ

< Устойчивость наночастиц к лиофилизации При добавлении растворителя к лиофилизату образуется устойчивая коллоидная система (опалесцирующая жидкость) без видимых агломератов и/или осадка. Размер частиц соответствует требованию №1 Визуальный контроль, ФКС

Стабильность рифампицина изучали методом ВЭЖХ. Показано, что рифампицин относительно устойчив в кислой среде (рН 1,68, комнатная температура): убыль площади его пика на хроматограмме не превышала 3-4% в течение 3 часов.

Стабильность рифампицина в условиях полимеризации оценивали по количеству примесей в лиофилизированном препарате. Показано, что площадь посторонних пиков на хроматограмме не превышала 3%, при этом хинон и дезоксиформилрифампицин обнаруживались в следовых количествах.

Таким образом, можно ожидать, что в указанных условиях содержание примесей рифампицина в наносомальном препарате не превысит значений, установленных для существующих лекарственных форм рифампипина (ФСП 420053171901; НД 42-9301-98; ФС 42-2058-97) - до 3% рифампицина хинона и 1,5*4% прочих примесей).

Изучение стабильности наносуспензии. Методом ФКС было показано, что при хранении суспензии в течение 24 ч при 20°С размер частиц практически не менялся, что свидетельствует об устойчивости коллоидной системы в данных условиях.

Определение степени сорбции. Для определения степени сорбции необходимо отделить наносомальный (то есть сорбированный наночастицами) рифампицин от «свободного». Для отделения наночастиц использовали ультрафильтрацию или ультрацентрифугирование. Мы провели ряд экспериментов по сравнению этих методов. В первом случае мембранные фильтры подбирали таким образом, чтобы: а) сорбция рифампицина была минимальной; б) фильтр не пропускал наночастицы; в) можно было анализировать образцы объемом не более 0,5 мл. Мембранные микрофильтры Microcon 30 kDa полностью удовлетворяли этим условиям; потери ЛВ на фильтре были сопоставимы с ошибкой спектрофотометрического определения (3-5%). Недостатком метода является его неэкономичность, обусловленная высокой стоимостью мембранных фильтров.

В случае ультрацентрифугирования, в режиме, необходимом для отделения наночастиц (50 мин, 20000g), концентрации свободного вещества в супернатанте оказываются выше (в 1,5-2 раза для образцов с исходным содержанием рифампицина 0,27-2,72 мг/мл), а степень сорбции, соответственно, ниже значений, получаемых при ультрафильтрации. Возможно, это связано с деформацией наночастиц при большом ускорении. Другим объяснением может быть неполное осаждение наночастиц.

В связи с этим для определения степени сорбции ЛВ в наночастицах использовали ультрафильтрацию.

Количественное определение рифампицина в лиофилизированном препарате проводили методом УФ-спектрофотометрии после разрушения наночастиц в смеси диметилформамид/вода.

Влияние технологических параметров на свойства наночастиц

Наночастицы из ПАЦА получают методом анионной полимеризации в водной среде. Для того чтобы формировались наночастицы, полимеризация должна проходить медленно и в присутствии стабилизаторов; тогда при достижении определенной молекулярной массы полимера образуется наносуспензия. Однако в водной среде этот процесс инициируется гидроксильными ионами, в связи с чем реакцию, как правило, проводят при I рН<3 (Kreuter, 1994). В полимеризации могут также принимать участие

нуклеофильные агенты (например, лекарственные вещества с нуклеофильными группами). Кроме того, процесс полимеризации и формирования наночастиц зависит от таких параметров как тип/концентрация мономера, стабилизатора, ЛВ, очередность добавления компонентов. Очевидно, что оптимизация получения наночастиц является сложной задачей.

Поскольку наиболее важными показателями качества наносомального препарата, определяющими его эффективность и поведение в организме, являются размер частиц и степень сорбции ЛВ, мы изучили влияние некоторых технологических параметров синтеза на эти свойства наночастиц.

Выбор времени добавления рифампицина в реакционную среду. ЛВ можно сорбировать на готовых частицах, но наиболее эффективным методом сорбции является проведение полимеризации в присутствии ЛВ. Однако введение рифампицина в полимеризационную среду до бутилцианоакрилата оказалось невозможным, поскольку приводило к образованию аморфной полимерной массы. Возможной причиной может быть следующее. Известно, что при добавлении мономера в водную среду он образует неустойчивую эмульсию, однако уже через 30 минут реакционная смесь становится гомогенной (Behan N et al., 2001). При этом собственно полимеризация и процесс образования наночастиц к этому времени еще далеко не завершены. Вероятно, рифампицин диффундирует в первичные капли мономера, инициируя обвальную полимеризацию.

Исходя из этого, рифампицин вводили в реакционную среду через 30 мин » после начала полимеризации, когда весь мономер растворен в реакционной

среде. Этот прием позволил избежать больших потерь полимера, наночастицы же получались удовлетворительного размера. ■ Выбор рН полимеризационной среды. Из рисунка 1 видно, что снижение

рН среды с 3 до 1,5 приводит к повышению среднего размера наночастиц с 250 до 500 нм. Подобная зависимость типична для наночастиц из ПАЦА (Kreuter 1994).

Как видно из рисунка 2, при повышении рН с 2 до 3 степень сорбции рифампицина значительно падает. Возможно следующее объяснение.

Поскольку повышение рН ускоряет процесс формирования наночастиц, то при рН~3 к моменту добавления рифампицина частицы уже в основном сформировались, и диффузия рифампицина внутрь частицы затруднена. В этом случае сорбция становится менее эффективной. В связи с этим, в дальнейших экспериментах мы проводили полимеризацию при рН 2, то есть в условиях, когда степень сорбции рифампицина максимальна.

1 5 2 25 3

рН полимеризационной среды

Рисунок 1. Влияние рН полимеризационной среды на средний размер наночастиц (с (РИФ) =1 мг/мл)

1.5 2 2.6 3

рН полимеризационной среды

Рисунок 2. Влияние рН полимеризационной среды на степень сорбции рифампицина (с (РИФ) = 1 мг/мл)

Выбор концентрации рифампицина. Основной критерий для выбора оптимальных условий синтеза наносомалыюй лекарственной формы - это эффективность сорбции рифампицина наночастицами.

Мы изучили зависимость сорбции рифампицина от его исходной концентрации в реакционной среде (рШ) в диапазоне 0,27-5-2,7. Исходная концентрация бутилцианоакрилата во всех опытах составляла 10 мг/мл.

На рисунке 3 показана зависимость степени сорбции от исходного соотношения рифампицин/полимер в реакционной смеси. Видно, что с ростом этого соотношения степень сорбции падает. В то же время, с ростом соотношения рифампицин/полимер растет и нагрузка рифампицина на наночастицы.

Изотерма сорбции (зависимость количества сорбированного рифампицина от концентрации свободного рифампицина) носит линейный характер (рисунок 4), т.е. в исследованном диапазоне концентраций не достигается насыщения полимерной матрицы рифампицином.

Несмотря на высокую степень сорбции, синтез наночастиц при концентрациях рифампицина <1 мг/мл сочли нецелесообразным, т к соотношение рифампицин/полимер в этих условиях слишком низко (менее 1/10); с другой стороны, с повышением исходной концентрации рифампицина , (3£,72 мг/мл) снижалась его растворимость в полимеризационной среде. В связи с этим, оптимальной исходной концентрацией рифампицина в полимеризационной среде мы сочли 1,5 мг/мл.

Следует отметить, что в присутствии рифампицина размер наночастиц несколько увеличивается по сравнению с «пустыми» наночастицами, полученных в тех же условиях (250-300 нм) (рисунок 5). Необходимо отметить, что при любой концентрации в исследованном диапазоне размер наночастиц оказывается удовлетворительным для внутривенного введения.

100 -г-О

о ■ 000

1 00 2 00 Рифампицин, мг/мл

Рисунок 3. Влияние исходной концентрации рифампицина на степень сорбции (рН полимеризационной среды = 2), п=3

S о. 50

Концентрация рифампицина (свободного), мг/мл

Рисунок 4. Изотерма сорбции рифампицина (рН полимеризационной среды = 2). п=3

600 -I 500 -

é 400 1 i зоо < ä 200

u 100 •

О 05 1 15 2

исходная концентрация рифампицина, мг/мл

Рисунок 5.

Зависимость размера наночастиц от исходной концентрации рифампицина (рН полимеризационной среды = 2)

Влияние ПАВ на свойства наночастиц. Размер наночастиц является важным параметром, в значительной степени определяющим их судьбу в организме, поэтому мы изучили возможность получения наночастиц различного размера. Известно, что присутствие неионных ПАВ в полимеризационной среде влияет на размеры образующихся иолиалкилцианоакрилатных наночастиц (Кесйу, 2004). В качестве ПАВ часто используют блоксополимеры оксиэтилена и оксипропилена - полоксамины или полоксамеры (Мо§Ыпи, 2001).

■ с F68 0 mg/ml Be F68 0 1 mg/ml □ с F68 0 5 mg/ml

Рисунок 6 Влияние концентрации плюроника F68 на размер

наночастиц (с (РИФ) = 1мг/мл)

■ с F68 0 mg/ml

■ с F68 0 1 mg/ml □ с F68 0 5 mg/ml

Рисунок 7. Влияние концентрации плюроника F68 на степень сорбции рифампицина (с (РИФ) = 1мг/мл)

Мы изучили влияние полоксамера 188 (плюроника F68) на размер полибутилцианоакрилатных наночастиц с рифампицином. Как показали наши эксперименты, использование плюроника F68 позволяет значительно снизить размер наночастиц (с 450 нм до 200-250 нм) (рисунок 6), что коррелирует с данными Seijo В. с соавт. Однако с введением плюроника F68 в полимеризационную среду падает степень сорбции рифампицина (рисунок 7). Известно, что полоксамеры способны сорбироваться на поверхности наночастиц, создавая гидрофильную оболочку, что, вероятно, и влияет на сорбцию рифампицина.

Поэтому, исходя из того, что степень сорбции JIB в наночастицах является одним из основных параметров, определяющих эффективность наносомальных препаратов, на данном этапе работы мы отказались от полимеризации в присутствии плюроника F68.

Таким образом, полученные нами результаты позволяют рекомендовать следующие условия получения наносомальной формы рифампицина на основе наночастиц из ПБЦА:

состав полимеризационной среды 0,01N HCl, декстран 1%; концентрация бутилцианоакрилата 1%; концентрация рифампицина 1,5 мг/мл;

время добавления рифампицина - через 30 минут после начала полимеризации.

Рисунок 8. Уровень рифампицина в Рисунок 9. Уровень рифампицина в

плазме крови. легочной ткани.

Следует отметить, что методика отличается хорошей воспроизводимостью: средний размер 400-600 нм, степень сорбции 55-65%, выход по рифампицину 85-90%.

Предварительная оценка стабильности наносомальной формы рифампицина показала, что через 12 месяцев хранения лиофилизата при 4°С и естественной влажности размер частиц несколько увеличился (на 20-30%), однако не превысил установленного нами предела (<1 мкм).

Изучение фармакокинетики наносомального рифампицина

I. Сравнительная фармакокинетика стандартной и наносомальной лекарственных форм.

Известно, что при внутривенном введении коллоидные частицы распределяются в тканях и органах РЭС, в основном в печени, селезенке и легких. При внутриклеточных инфекциях (в том числе и туберкулезе) эти

органы являются очагом инфекции. Пашей задачей было выяснить, можно ли с помощью наночастиц повысить концентрацию рифампицина в РЭС-органах.

Фармакокинетическое исследование стандартной лекарственной формы рифампицина, проведенное на мышах Ва1Ь/с, показало, что концентрация антибиотика в плазме крови плавно убывала в течение 24 ч (рисунок 8). Применение наночастиц привело к изменению параметров фармакокинетики рифампицина: в интервале от 5 мин до 5 ч наблюдалось некоторое повышение концентрации рифампицина в плазме, и только после этого концентрация антибиотика начинала снижаться

□ РИФ ИРИФ-НЧ

ЕЗ РИФ-НЧ-407 □ РИФ-НЧ-908

Рисунок 10. Площадь под фармахокинетической кривой (АиС) рифампицина для печени

Рисунок 11. Площадь под фармакокинетической кривой рифампицина (АиС) для плазмы и легких

Как и следовало ожидать, наночастицы способствуют накоплению рифампицина в органах РЭС: отмечено увеличение интегрального показателя АЪ"С для легких, печени и селезенки (рисунки 10 - 12). Рост интегрального показателя накопления антибиотика АиС в легких составил 13% по сравнению со стандартной лекарственной формой. В то же время, накопление печени было более значительным - в два раза по сравнению со стандартной лекарственной формой. Следует отметить, что максимальная концентрация рифампицина в печени достигалась через 1 ч после введения, в то время как пиковая концентрации в плазме достигается позже - в интервале от 3 до 5 ч. Возможно, это объясняется медленным высвобождением рифампицина из печени, которая играет роль своеобразного депо. Для свободного же рифампицина процесс распределения, как указано выше, проходит быстро.

В связи с этим целью была поставлена задача повысить концентрацию рифампицина в легких при одновременном снижении его концентрации в печени.

И. Влияние модификации поверхности наночастщ на биораспределение наносомального рифампицина.

Эффективным способом уменьшить накопление наночастиц в печени является модификация их поверхности веществами, препятствующими опсонизации НЧ белками плазмы. Такая модификация предотвращает быстрый захват НЧ макрофагами и тем самым уменьшает их накопление в органах РЭС (Moghimi. 2003). За счет этого время циркуляции наночастиц увеличивается (так называемый эффект стерической стабилизации НЧ). Одними из наиболее эффективных модификаторов являются блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида. Их макромолекулы содержат гидрофильные и гидрофобные сегменты, что позволяет этим веществам, с одной стороны, удерживаться на гидрофобной поверхности частиц, а с другой - создавать стерическое «облако», препятствующее контакту частиц с белками плазмы.

Среди соединений этого ряда, предложенных для стерической стабилизации наночастиц, интерес представляют полоксамер 407 (Pluronic F127) и полоксамин 908 (Tetronic 908), поскольку из литературы известно, что эти ПАВы позволили снизить концентрацию пустых полистирольных частиц в печени в 10 раз (Armstrong, 1997). На основании этого для дальнейших исследований нами были выбраны полоксамер 407 (Р407) и полоксамин 908 (Р908).

Для того чтобы изучить, каким образом модификация полибутилцианоакрилатных наночастиц этими ПАВ влияет на фармакокинетику рифампицина, наночастицы перед введением инкубировали в течение 30 мин в 1% растворе ПАВ (РИФ-НЧ+Р407) и (РИФ-НЧ+Р908).

Полученные результаты представлены на рисунках 8 - 13. Видно, что полоксамер 407 и полоксамин 908 существенно меняют фармакокинетику наносомального рифампицина в плазме крови. У групп животных, получавших модифицированные наночастицы, интегральный показатель AUC в плазме повысился на 30 - 50% по сравнению с группами, получавшими стандартный препарат. Рост концентрации рифампицина в плазме сопровождался повышением его накопления в легких: на 75% для лекарственной формы, модифицированной полоксамером 407, и на 30% - полоксамином 908 (рисунок И). При этом накопление в печени значительно снизилось - в два раза по сравнению с ^модифицированным наносомальным рифампицином (рисунок 10).

Таким образом, модификация наночастиц исследованными ПАВ позволяет добиться повышения концентрации рифампицина в легких при одновременном снижении его накопления в печени. Насколько нам известно, подобные данные получены впервые. Предыдущие исследователи изучали влияние блок-сополимеров на биораспределение пустых наночастиц, но не связанного с ними ЛВ.

Рисунок 12. Площадь под Рисунок 13. Накопление

фармакокинетической кривой (АиС) рифампицина в селезенке,

рифампицина для селезенки

Интересно, что модификация НЧ полоксамином 908 и полоксамером 407 приводит также и к необычно высокому накоплению РИФ в селезенке по сравнению как со свободным, так и с немодифицированным наносомальным рифампицином (рисунки 12, 13). Площадь под кривой для группы РИФ-НЧ-П908 была в 8 раз, а для группы РИФ-НЧ-Р407 - в 6-7 раз выше, чем для группы РИФ, в то время как у животных, получивших РИФ-НЧ, этот показатель только в 2,5 раз выше, чем у группы РИФ (рисунок 12). Подобный эффект наблюдали также для пустых полистирольных наночастиц, модифицированных этими ПАВ (Armstrong, 1997).

Таким образом, полоксамер 407 и полоксамин 908 существенно влияют на фармакокинетику наносомального рифампицина, позволяя повысить его концентрацию в легких и в плазме и снизить его накопление в печени (по сравнению с немодифицированной наносомальной лекарственной формой). Последнее особенно важно, поскольку одним из побочных эффектов рифампицина является его гепатотоксичность.

Значительное повышение концентрации антибиотика в легких, печени и селезенке позволяет предположить, что модифицированная наносомальная лекарственная форма рифампицина проявит высокую активность при лечении внутриклеточных инфекций, в том числе туберкулеза.

1. Разработаны подходы к стандартизации экспериментальных наносомальных лекарственных форм. Для стандартизации предложены следующие параметры и аналитические методы контроля: размер частиц (фотонная корреляционная спектроскопия), степень сорбции (спектрофотометрическое определение свободного рифампицина после отделения наночастиц методом ультрафильтрации); количественное определение рифампицина (ВЭЖХ или спектрофотометр ия после растворения полимерной матрицы и других ингредиентов).

2. Отработана методика получения наносомальной лекарственной формы рифампицина на основе биодеградируемых наночастиц из полибутилцианоакрилата. Оптимизация ряда технологических параметров (рН полимеризационной среды, концентрация рифампицина, концентрация ПАВ) позволила получить лекарственную форму, удовлетворяющую установленным нами критериям: размер частиц не превышал 1 мкм при степени сорбции 60%.

3. Показано, что рифампицин стабилен в процессе полимеризации; наносомальный препарат можно лиофилизировать.

4. Применение неионогенного ПАВ (плюроник Р68) в качестве стабилизатора позволяет значительно снизить размеры НЧ, однако в случае РИФ приводит также к снижению степени сорбции.

5. Впервые изучена фармакокинетика наносомальной лекарственной формы рифампицина на основе наночастиц из ПБЦА. Показано, что применение наночастиц позволяет модифицировать фармакокинетику антибиотика при внутривенном введении Основным местом локализации наносомального рифампицина при внутривенном введении являются печень и селезенка. Интегршгьные показатели накопления А11С по сравнению со свободным рифампицином возрастают в печени в 2 раза, в селезенке в 2,5 раз. Интегральный показатель накопления в плазме повышается в 1,3 раза по сравнению со стандартным рифампицином.

6. Впервые показано, что модификация поверхности наночастиц полоксамером 407 позволяет повысить уровень антибиотика в легких (в 1,8 раз), при этом значительно снижается накопление наносомального рифампицина в печени. Аналогичный эффект получен при модификации

наночастиц полоксамином 908: накопление рифампицина в легких повышается в 1,5 раза.

7 Наносомальный рифампипин. модифицированный полоксамером 408, можно рекомендовать для дальнейшего изучения возможности доставки антибиотиков в легочную ткань.

Список работ, опубликованных пп теме диссертации.

1. Гельперина С.Э., Скидан И.Н., Анисимова Е.В., Максименко О.О., Оганесян Е.А., Хейфец Л.Б. Повышение активности антибиотиков с помощью биодеградируемых полимерных наночастиц // Материалы VII Российского съезда фтизиатров. - Москва, 2003. - С.331.

2. Оганесян Е.А. Новая лекарственная форма рифампицина для направленного транспорта в альвеолярные макрофаги // Материалы Ш Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - Москва, 2004. -С.354-355.

3. Оганесян Е.А., Максименко О.О., Свешников П.Г., Будько А.П., Северин Е.С., Хейфец Л.Б., Гельперина С.Э. Разработка наносомальных лекарственных форм антибиотиков на основе полиалкилцианоакрилатов // Тезисы докладов XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2004. - С. 212.

4. Gelperina S., Budco A., Oganesyan Е., Maximenko О., Vanchugova L., Shipulo E., Sveshnikov P., Severin E., Kisich K., Heifets L. Biodistribution study of rifampicin bound to poly(butylcyanoacrylate) nanoparticles // Transact. 31st Annual Meeting of the Controlled Release Society.- Honolulu, 2004,- №518.

5. Оганесян E А., Максименко O.O., Свешников П.Г., Будько А.П., Северин Е.С., Хейфец Л.Б., Гельперина С.Э. Разработка наносомальной лекарственной формы рифампицина на основе полиалкилцианоакрилатов // Материалы I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». - Москва, 2004. - С. 91.

6. Гельперина С.Э., Оганесян Е.А., Свешников П.Г, Северин Е С., Хейфец Л.Б. Применение наносомальных препаратов для лечения внутриклеточных инфекций // Ремедиум. - № 12. - 2004. - С. 43-44.

Принято к исполнению 08/04/2005 Исполнено 09/04/2005

Заказ №748 Тираж: 100 экз..

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www autoreferat.ru

РНБ Русский фонд

2005^4 47950

Содержание диссертации, кандидат биологических наук , Оганесян, Ерванд Александрович

Список основных сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Биораспределение коллоидных систем при внутривенном вве- 11 дении. Влияние поверхностно-активных веществ на фармакоки-нетику коллоидных систем.

1.2. Коллоидные носители лекарственных веществ - способ повы- 17 сить эффективность противотуберкулезных агентов.

1.2.1. Внесосудистое введение

1.2.2. Внутривенное введение

1.3. Наночастицы из ПАЦА как носители лекарственных средств.

2. Материал и методы

3. Результаты и их обсуждение

3.1. Получение экспериментальной лекарственной формы

3.1.1. Изучение стабильности экспериментальной лекарственной 39 формы, разработка методов анализа

3.1.2. Влияние технологических параметров на свойства наноча- 53 стиц

3.2. Изучение фармакокинетики наносомального рифампицина

3.2.1. Сравнительная фармакокинетика свободного и наносомаль- 69 ного рифампицина

3.2.2. Влияние модификации поверхности наночастиц на биораспределение наносомального рифампицина.

3.2.2.1. Влияние полоксамера 407 на фармакокинетику нано- 77 сомального рифампицина

3.2.2.2. Влияние полоксамина 908 на фармакокинетику наносомального рифампицина

3.2.3. Накопление наносомального рифампицина в селезенке

Введение Диссертация по биологии, на тему "Подходы к разработке наносомальной лекарственной формы рифампицина"

Лечение внутриклеточных инфекций является серьезной проблемой, одним из решений которой может стать направленный транспорт антибиотиков в инфицированные клетки. Многие возбудители внутриклеточных инфекций, такие как Mycobacteria, Salmonella, Staphylococcus aureus и др., способны выживать и размножаться в макрофагах, естественной функцией которых является захват и уничтожение микроорганизмов. В этом случае макрофаги становятся нишей для патогенных микроорганизмов и мишенью для химиотерапии, а результативность лечения, очевидно, зависит от того, удается ли доставить лекарственное вещество в макрофаги в эффективных концентрациях.

Одним из путей решения этой проблемы является применение коллоидных систем доставки JIB на основе наночастиц. Хорошо известно, что нано-частицы обеспечивают эффективный транспорт адсорбированных JIB в макрофаги. Попадая в кровяное русло, наночастицы фактически повторяют путь бактерий, то есть фагоцитируются резидентными макрофагами и циркулирующими моноцитами. Во внутриклеточной среде частицы подвергаются деградации под действием ферментов и выделяют JIB, что позволяет достичь высоких внутриклеточных концентраций и, таким образом, обеспечить повышение терапевтической эффективности. Кроме того, наночастицы способны проникать и накапливаться в очагах патологии, для которых характерны повышенная проницаемость капилляров и нарушения лимфотока (зоны воспаления и опухолевого роста). Эти свойства наночастиц, наиболее выраженные при внутривенном введении, легли в основу концепции о возможном повышении эффективности противобактериальных JIB с помощью наночастиц. Действительно, было показано, что наночастицы значительно повышают эффективность антибиотиков при лечении экспериментальных инфекций, для которых характерна внутриклеточная локализация возбудителей, таких как, например, сальмонеллез или листериоз (77).

В последнее время в литературе появились также данные о высокой активности наносомальных препаратов при лечении туберкулеза у мышей (75). Однако эта область применения наночастиц мало изучена. В то же время, можно полагать, что создание наносомальных лекарственных форм позволит повысить эффективность и снизить токсичность применяемых в клинической практике противотуберкулезных средств. Это направление исследований приобретает особую актуальность в условиях значительного роста заболеваемости туберкулезом легких во всех странах мира.

Среди синтетических биодеградируемых полимеров, используемых для получения наночастиц, интерес представляют полиалкилцианокрилаты. На-ночастицы из полиалкилцианокрилатов обладают низкой токсичностью и эффективно сорбируют различные JIB [52, 101]. В водных растворах эти на-ночастицы образуют устойчивые коллоидные системы, пригодные для парентерального введения; препараты на их основе можно стерилизовать и хранить в лиофилизированном виде. Таким образом, наночастицы из полиалкилцианокрилатов являются перспективным носителем для создания коллоидных систем доставки JIB.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработать подходы к созданию наносомальной лекарственной формы рифампицина для внутривенного введения на основе наночастиц из полибу-тилцианоакрилата (ПБЦА); изучить фармакокинетику этой лекарственной формы.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи.

1. Разработать методику получения наносомальной формы рифампицина на основе наночастиц из ПБЦА; изучить влияние различных параметров процесса на характеристики наночастиц.

2. Изучить стабильность рифампицина в условиях полимеризации бу-тилцианоакрилата.

3. Разработать методику анализа рифампицина в наносомальной форме и в биологических образцах.

4. Сравнить фармакокинетику наносомального рифампицина и стандартной лекарственной формы рифампицина.

5. Изучить влияние модификации поверхности наночастиц на фармакокинетику наносомального рифампицина.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые разработан подход к созданию наносомальной лекарственной формы на примере полибутилцианоакрилатных наночастиц с рифампицином.

Впервые изучены параметры процесса получения наносомальной лекарственной формы рифампицина путем анионной полимеризации бутил-цианоакрилата в присутствии рифампицина.

Впервые изучена фармакокинетика наносомальной лекарственной формы рифампицина на основе наночастиц из ПБЦА. Показано, что модификация наночастиц поверхностно-активными веществами (полоксамер 407 и полоксамин 908) позволяет целенаправленно менять биораспределение наносомального рифампицина.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

Показано, что применение наночастиц позволяет целенаправленно изменять фармакокинетику наносомального рифампицина, способствуя его распределению в органы ретикулоэндотелиальной системы. Можно полагать, что эта лекарственная форма будет эффективна при лечении инфекций, для которых характерна локализация возбудителей в органах РЭС (в том числе, туберкулеза).

Экспериментальные подходы, разработанные для оптимизации методов получения наносомальной формы рифампицина, могут быть использованы при создании других наносомальных препаратов.

Сформулирован ряд критериев для стандартизации наносомальных лекарственных форм для внутривенного введения и предложены соответствующие методы контроля качества.

Результаты фармакокинетического исследования могут быть использованы при выборе доз и режимов лечения в последующих биологических испытаниях наносомальной формы рифампицина.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

Российском Национальном Конгрессе «Человек и Лекарство» (Москва, 2004);

VII Российском съезде фтизиатров «Туберкулез сегодня» (Москва,

III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва,

1-ой Международной Конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004 год)

31st Meeting of the Controlled Release Society (Honolulu, USA, 2004)

ПУБЛИКАЦИИ

Основное содержание диссертации опубликовано в 6 печатных работах.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и их обсуждение», заключения и выводов. Диссертация изложена на 109 листах машинописного текста и содержит 34 рисунка, 3 таблицы. Список литературы состоит из 108 наименований.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Оганесян, Ерванд Александрович

1. Разработаны подходы к стандартизации экспериментальных на-носомальных лекарственных форм. Для стандартизации предложены следующие параметры и аналитические методы контроля: размер частиц (фотонная корреляционная спектроскопия), степень сорбции (спектрофотомет-рическое определение свободного рифампицина после отделения наночастиц методом ультрафильтрации); количественное определение рифампицина (ВЭЖХ или спектрофотометрия после растворения полимерной матрицы и других ингредиентов).

2. Отработана методика получения наносомальной лекарственной формы рифампицина на основе биодеградируемых наночастиц из полибу-тилцианоакрилата. Оптимизация ряда технологических параметров (рН полимеризационной среды, концентрация рифампицина, концентрация ПАВ) позволила получить лекарственную форму, удовлетворяющую установленным нами критериям: размер частиц не превышал 1 мкм при степени сорбции 60%.

3. Показано, что рифампицин стабилен в процессе полимеризации; наносомальный препарат можно лиофилизировать.

4. Применение неионогенного ПАВ (плюроник F68) в качестве стабилизатора позволяет значительно снизить размеры НЧ, однако в случае РИФ приводит также к снижению степени сорбции.

5. Впервые изучена фармакокинетика наносомальной лекарственной формы рифампицина на основе наночастиц из ПБЦА. Показано, что применение наночастиц позволяет модифицировать фармакокинетику антибиотика при внутривенном введении. Основным местом локализации наносомального рифампицина при внутривенном введении являются печень и селезенка. Интегральные показатели накопления AUC по сравнению со свободным рифампицином возрастают в печени в 2 раза, в селезенке в 2,5 раз.

Интегральный показатель накопления в плазме повышается в 1,3 раза по сравнению со стандартным рифампицином.

6. Впервые показано, что модификация поверхности наночастиц полоксамером 407 позволяет повысить уровень антибиотика в легких (в 1,8 раз), при этом значительно снижается накопление наносомального рифампицина в печени. Аналогичный эффект получен при модификации наночастиц полоксамином 908: накопление рифампицина в легких повышается в 1,5 раза.

7. Наносомальный рифампицин, модифицированный полоксамером 408, можно рекомендовать для дальнейшего изучения возможности доставки антибиотиков в легочную ткань.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что распределение лекарств в организме можно целенаправленно менять как на клеточном, так и на тканевом уровне, используя различные системы доставки. В последние годы отмечается возрастающий интерес к коллоидным системам доставки лекарственных веществ (JIB): липосомам, микрочастицам, наночастицам. Идея внутривенного использования таких систем для повышения избирательности действия противоинфекционных лекарственных средств основана, во-первых, на их способности накапливаться преимущественно в тканях с повышенной проницаемостью капилляров, во-вторых, на том, что коллоидные частицы повторяют путь бактерий, захваты-ваясь инфицированными макрофагами. Цель настоящего исследования - разработка методики получения противотуберкулезного антибиотика рифампицина, ассоциированного с наночастицами из ПБЦА, сравнительное изучение фармакокинетики свободного и наносомального рифампицина, изучение возможности использования ПАВов для направленной модификации биораспределения наносомального рифампицина.

Наночастицы из ПБЦА получают в «мягких» условиях: при комнатной температуре, нормальном давлении, без использования органических растворителей. Тем не менее, синтез проводится в кислой среде, поэтому было важно контролировать стабильность рифампицина в полимеризационной среде. Нами показано, что в этих условиях распадается не более 3% рифампицина, то есть при использовании предложенной методики в готовом продукте не будет значительного количества примесей.

Размер наночастиц не превышал 500-600 нм, т.е. был приемлем для внутривенного введения. Известно, что размер наночастицы из ПАЦА можно лиофилизовать и хранить длительное время в сухом виде. Растворитель (вода для инъекций) добавляется непосредственно перед использованием лекарственной формы. Мы показали, что размер наночастиц после ресуспендирования не меняется в течение 24 часов, что свидетельствует о безопасности внутривенного введения наносомального рифампицина.

Свойства наночастиц из ПАЦА зависят от большого числа технологических параметров, важнейшими из которых являются рН полимеризационной среды, концентрация стабилизатора/ПАВа, концентрация лекарственного вещества. Размер наночастиц понижался при повышении рН с 2 до 3, снижалась и степень сорбции. Скорость полимеризации тем выше, чем выше рН среды, и при более высоком рН к моменту добавления рифампицина в среде остается меньше мономера, на котором антибиотик может впоследствии сорбироваться. Повышение же размера наночастиц при использовании разных рН связано, скорее всего, с нуклеофильными свойстами рифампицина.

С целью уменьшения размеров наночастиц была изучена возможность применения ПАВа - плюроника Ф68 в качестве стабилизатора наночастиц. Действительно, при рН 2 размер частиц существенно снижался, что, возможно, связано с солюбилизацией. Однако снижалась и степень сорбции рифампицина, по-видимому, в связи с солюбилизацией антибиотика, «вымыванием» его из наночастиц. Поэтому на данном этапе мы отказались от использования ПАВа.

Концентрация рифампицина в полимеризационной среде - важнейший технологический параметр, определяющий свойства наносомальной лекарственной формы. Чем выше соотношение JlB/полимер, тем менее будет выражена токсичность полимера, однако с повышением концентрации JIB может наступить насыщение полимерной матрицы, что приведет к снижению степени сорбции. Мы показали, что в диапазоне концентраций 0,27 - 2,7 мг/мл изотерма сорбции примерно линейна, то есть насыщения полимерной матрицы не достигается. При концентрациях рифампицина выше 1,5 мг снижалась фильтруемость суспензии, повышался размер наночастиц, вероятно, вследствие низкой растворимости рифампицина при таких концентрациях, а также в связи с его нуклеофильными свойствами. Необходимо отметить, что при исходной концентрации рифампицина 1,5 мг/мл соотношение JIB/полимер очень высоко и составляет примерно 1/6.

Таким образом, была отработана методика получения наносомальной формы рифампицина; следующей задачей было фармакокинетическое исследование, в котором определяли накопление рифампицина в плазме основных РЭС-органах.

Наносомальный рифампицин накапливался в РЭС-органах более интенсивно по сравнению со стандартным. Площадь под кривой увеличилась в 2 раза для печени и в 1,3 раза для легких. Эти результаты легко объясняются особенностями биораспределения коллоидных систем. Одним из главных побочных эффектов рифампицина является гепатотоксичность, поэтому нужно искать способы снижения концентрации рифампицина в печени.

Как указано выше, ПАВы являются эффективными модификаторами распределения лекарственных веществ. Располагаясь на поверхности частиц, они придают поверхности гидрофильные свойства и создают эффективный стерический барьер, предотвращающий опсонизацию и фагоцитоз. Следовательно, понижается захват наночастиц макрофагами печени, увеличивается время циркуляции лекарственного вещества в кровотоке и за счет этого лекарственное вещество перераспределяется между РЭС-органами. Действительно, использование полоксамера 407 в качестве ПАВа позволило повысить уровень рифампицина в плазме в 1,5-2 раза, в легких - в два раза по сравнению со стандартным рифампицином. Очень важно отметить, что при использовании полоксамера 407 уровень рифампицина в печени снизился в два раза по сравнению с немодифицированным наносомальным рифампицином и был сопоставим с уровнем свободного рифампицина.

Схожие результаты получены для другого ПАВа — полоксамина 908. Уровень модифицированного полоксамином 908 наносомального рифампицина в плазме и легких был повышен в 1,5 раза по сравнению с немодифицированными наночастицами, в печени же накопление рифампицина снижалось до уровня свободного антибиотика.

Значительное повышение концентрации антибиотика в легких, печени и селезенке позволяет предположить, что модифицированная наносомальная лекарственная форма рифампицина проявит высокую активность при лечении туберкулеза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидат биологических наук , Оганесян, Ерванд Александрович, Москва

1. Рифампицин кристаллический порошок НД 42-9301-98

2. Рифампицин Ферейн®, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,15г. ФСП 420053171901

3. Рифампицин 0,05г и 0,15г в капсулах. ФС 42-2058-97

4. Adams LB, Sinha I, Franzblau SG, Krahenbuhl JL, Mehta RT. Effective treatment of acute and chronic murine tuberculosis with liposome-encapsulated clofazimine. Antimicrob Agents Chemother. 1999 Jul;43(7): 1638-43

5. Ahsan F, Rivas IP, Khan MA, Torres Suarez Al. Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers—liposomes and microspheres~on the phagocytosis by macrophages. J Control Release. 2002 Feb 19;79(l-3):29-40. Review.

6. Ain Q., Sharma S, Khuller GK, Garg SK. Alginate-based oral drug delivery system for tuberculosis: pharmacokinetics and therapeutic effects. J Antimicrob Chemother. 2003 Apr;51(4):931-8. Epub 2003 Mar 13.

7. Ain Q., Sharma S., Garg S.D., Khuller G.D. Role of poly(DL-lactide-co-glycolide) in development of a sustained oral delivery system for antitubercular drug(s). International Journal of Pharmaceutics 239 (2002) 37-46

8. Araujo L., Lobenberg R., Kreuter J. Influence of the surfactant concentration on the body distribution of nanoparticlesJ Drug Targeting 6 (1999) 373385

9. Arias JL, Gallardo V, Gomez-Lopera SA, Plaza RC, Delgado AV. Synthesis and characterization of poly(ethyl-2-cyanoacrylate) nanoparticles with a magnetic core. J Control Release. 2001 Dec 13;77(3):309-21.

10. Bain DF, Munday DL, Cox PJ Evaluation of biodegradable rifampicin-bearing microsphere formulations using a stability-indicating high-performance liquid chromatographic assay: Eur J Pharm Sci. 1998 Dec;7(l):57-65

11. Barrow EL, Winchester GA, Staas JK, Quenelle DC, Barrow WW. Use of microsphere technology for targeted delivery of rifampin to Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 1998 Oct; 42(10):2682-9.

12. Beaulac C, Sachetelli S, Lagace J. Aerosolization of low phase transition temperature liposomal tobramycin as a dry powder in an animal model of chronic pulmonary infection caused by Pseudomonas aeruginosa. J Drug Targeting 1999; 7: 33-41.

13. Behan N, Birkinshaw C, Clarke N. Poly n-butyl cyanoacrylate nanoparticles: a mechanistic study of polymerisation and particle formation Biomate-rials. 2001 Jun; 22(11):1335-44.

14. Brigger I, Chaminade P, Desmaele D, Peracchia MT, d'Angelo J, Gurny R, Renoir M, Couvreur P. Near infrared with principal component analysis as a novel analytical approach for nanoparticle technology. Pharm Res. 2000 Sep; 17(9): 1124-32.

15. Brigger I, Morizet J, Aubert G, Chacun H, Terrier-Lacombe MJ, Couvreur P, Vassal G. Poly(ethylene glycol)-coated hexadecylcyanoacrylate nanospheres display a combined effect for brain tumor targeting. J Pharmacol Exp Ther. 2002 Dec; 303 (3):928-36.

16. Calvo P, Gouritin B, Chacun H, Desmaele D, D'Angelo J, Noel JP, Geor-gin D, Fattal E, Andreux JP, Couvreur P. Long-circulating PEGylated poly-cyanoacrylate nanoparticles as new drug carrier for brain delivery. Pharm Res. 2001 Aug; 18 (8 ):1157-66.

17. Conley J, Yang H, Wilson T, et al. Aerosol delivery of liposome-encapsulated ciprofloxacin: aerosol characterization and efficacy against Fran-cisella tularenis infection in mice. Antimicrobial Agents Chemother 1997; 41: 1288-1292.

18. Demoy M., Andreux J.-P., Weingarten C., Gouritin В., Guilloux V., Couvreur P. Spleen Capture of Nanoparticles: Influence of Animal Species and Surface Characteristics. Pharmaceutical Research, vol. 16 No. 1. 1999

19. Deol P, Khuller GK Lung specific stealth liposomes: stability, biodistribu-tion and toxicity of liposomal antitubercular drugs in mice Biochim Biophys Acta. 1997 Mar 15; 1334 (2-3):161-72

20. Deol P, Khuller GK, Joshi K. Therapeutic efficacies of isoniazid and rifampin encapsulated in lung-specific stealth liposomes against Mycobacteriumtuberculosis infection induced in mice. Antimicrob Agents Chemother. 1997 Jun; 41 (6): 12.11-4

21. Dhillon J, Fielding R, Adler-Moore J, Goodall RL, Mitchison D. The activity of low-clearance liposomal amikacin in experimental murine tuberculosis. J Antimicrob Chemother. 2001 Dec;48(6):869-76.

22. Donald PR, Sirgel FA, Venter A, Smit E, Parkin DP, Van de Wal BW, Mitchison DA The early bactericidal activity of a low-clearance liposomal amikacin in pulmonary tuberculosis J Antimicrob Chemother. 2001 Dec;48(6):877-80

23. Douglas S.J., Ilium L., and Davis S.S. Particle size and size distribution fo poly(butyl 2-cyanoacrylate) nanoparticles. II. Influence of stabilizers. Journal of Colliid and Interface Science. Vol. 103 No. 1 January 1985.

24. Douglas S.J., Ilium L., Davis S.S., and Kreuter J. Particle size and size distribution of poly(butyl-2-cyanoacrylate) nanoparticles I. Influence of physico-chemical Factors. Journal of Colloid and Interface Science. Vol. 101, No. 1, September 1984

25. Duchene D, Ponchel G, Wouessidjewe D. Cyclodextrins in targeting. Application to nanoparticles. Adv Drug Deliv Rev. 1999 Mar l;36(l):29-40.

26. Dutt M, Khuller GK Chemotherapy of Mycobacterium tuberculosis infections in mice with a combination of isoniazid and rifampicin entrapped in Poly (DL-lactide-co-glycolide) microparticles J Antimicrob Chemother. 2001 Jun;47(6):829-35

27. Dutt M, Khuller GK. Sustained release of isoniazid from a single injectable dose of poly (DL-lactide-co-glycolide) microparticles as a therapeutic approach towards tuberculosis. Int J Antimicrob Agents. 2001 Feb; 17(2): 115-22.

28. Dutt M, Khuller GK. Therapeutic efficacy of Poly(DL-lactide-Co-Glycolide)-encapsulated antitubercular drugs against Mycobacterium tuberculosis infection induced in mice. Antimicrob Agents Chemother. 2001 Jan;45(l):363-6.

29. Elder AC, Gelein R, Oberdorster G, Finkelstein J, Notter R, Wang Z. Efficient depletion of alveolar macrophages using intratracheally inhaled aerosols of liposome-encapsulated clodronate. Exp Lung Res. 2004 Mar; 30 (2 ): 105-20.

30. Emary WB, Toren PC, Mathews B, Huh K. Disposition and metabolism of rifapentine, a rifamycin antibiotic, in mice, rats, and monkeys. Drug Metab Dispos. 1998 Aug;26(8):725-31.

31. Fattal E, Youssef M, Couvreur P, Andremont A. Treatment of experimental salmonellosis in mice with ampicillin-bound nanoparticles. Antimicrob Agents Chemother 1989; 33: 1540-3

32. Fawaz F., Bonini F., Maugein J., Lagueny A.M. Ciprofloxacin-loaded polyisobutylcyanoacrylate nanoparticles: pharmacokinetics and in vitro antimicrobial activity. International Journal of Pharmaceutics 168 (1998) 255-259

33. Fawaz F., Guyot M., Lagueny A.M., Devissaguet J.Ph. Ciprofloxacin-loaded polyisobutylcyanoacrylate nanoparticles: preparation and characterization. International Journal of Pharmaceutics 154 (1997) 197-203

34. Gaspar MM, Neves S, Portaels F, Pedrosa J, Silva MT, Cruz ME. Therapeutic efficacy of liposomal rifabutin in a Mycobacterium avium model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 2000 Sep;44(9):2424-30.

35. Gipps E., Groscurt P., Kreuter J., Speiser P.P. The effects of poly(alkylcyanoaciylate) nanoparticles on human normal and malignant nesen-chymal cells in vitro. Int. J. Pharm. 40 (1987) 23-31

36. Gulyaev AE, Gelperina SE, Skidan IN, Antropov AS, Kivman GY, Kreuter J. Significant transport of doxorubicin into the brain with polysorbate 80-coated nanoparticles. Pharm Res. 1999 Oct;16 (10):1564-9

37. Henry-Michelland S, Alonso MJ, Andremont A, Maincent P, Sauzieres J, Couvreur P. Attachment of antibiotics to nanoparticles: preparation, drug release and antimicrobial activity in vitro. Int J Pharm 1987; 35: 121-7

38. Ilium L., Khan M.A., Мак E., and Davis S.S. Evaluation of carrier capacity and releaxe characteristics for poIy(butyl 2-cyanoacryIate) nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics 30 (1986) 17-28.

39. Kabanov A.V., Lemieux P., Vinogradov S., Alakhov V. Pluronic® block copolymers: novel functional molecules for gene therapy. Advanced Drug Delivery Reviews 54 (2002) 223-233

40. Kabanov AV, Batrakova EV, Miller DW. Pluronic block copolymers as modulators of drug efflux transporter activity in the blood-brain barrier. Adv Drug Deliv Rev. 2003 Jan 21;55(l):151-64. Review.

41. Kante В., Couverur В., Dubois-Krack G., De Meester C., Guiot P., Roland M., Vercier M., Speiser P. (1982). Toxicity of polyalkylcyanoacrylate nanoparticles. I. Free nanoparticles. J. Pharm. Sci. 71: 786

42. Kreuter J. Colliodal drug delivery systems. N.Y.: Marcel Dekker Inc, 1994.-352p

43. Labana S, Pandey R, Sharma S, Khuller GK. Chemotherapeutic activity against murine tuberculosis of once weekly administered drugs (isoniazid and rifampicin) encapsulated in liposomes Int J Antimicrob Agents. 2002 C)ct;20(4):301-4.

44. Leemans JC, Juffermans NP, Florquin S, van Rooijen N, Vervoordeldonk MJ, Verbon A, van Deventer SJ, van der Poll T. Depletion of alveolar macrophages exerts protective effects in pulmonary tuberculosis in mice. J Immunol. 2001 Apr 1; 166(7): 4604-11.

45. Lenaerts V., Nagelkerke J.F., van Berkel N.J.C., Couvreur P., Grislain L., Roland M., and Speiser P. (1984). Toxicity and association of polycyanoacry-late nanoparticles with hepatocytes. J. Microencapsul. 1: 253

46. Lenaerts V., Raymond P., Juhasz J., Simard V.A., and Jolicoeur C. New method for the preparation of cyanoacrylic nanoparticles with improved colloidal properties. Journal of Pharmaceutical Sciences Vol. 78, No. 12, December 1989.

47. Lherm C., Muller R., Puisieux F., Couvreur P. PP. Cytotoxicity of cyanoacrylate nanoparticles with different alkyl chain length. Int. J. Pharm. 84 (1992) 13-22

48. Li YP, Pei YY, Zhou ZH, Zhang XY, Gu ZH, Ding J, Zhou JJ, Gao XJ, Zhu JH. Stealth polycyanoacrylate nanoparticles as tumor necrosis factor-alpha carriers: pharmacokinetics and anti-tumor effects. Biol Pharm Bull. 2001 Jun; 24 (6): 662-5.

49. Magenheim В., Benita S. Nanoparticle characterization: a comprehensive physicochemical approach. S.T.P. Pharma Sciences 1 (4) 221-241 1991.

50. Miyazaki, Т., Kohno, S., Sasayama, K., Inoue, Y., Нага, K., Ogasawara, M., Sato, Т., and Sunamoto, J., Polysaccharide-anchored liposomal amphotericin В for the treatment of murine pulmonary candidiasis. Tohoku J Exp Med, 168:483-490, 1992

51. Moghimi S.M. Re-establishing the long circulatory behaviour of poloxam-ine-coated particles after repeated intravenous administration: applications in cancer drug delivery and imaging. Biochimica et Biophysica Acta 1472 (1999) 399-403

52. Moghimi S.M., Hunter A.C. Poloxamers and poloxamines in nanoparticles engineering and experimental medicine. Trends in Biotechnology, 18 (2000), 412-420

53. Moghimi SM, Hunter AC, Murray JC. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacol Rev 2001; 53: 283-318

54. Moghimi SM, Szebeni J. Stealth liposomes and long circulating nanoparticles: critical issues in pharmacokinetics, opsonization and protein-binding properties. Prog Lipid Res. 2003 Nov; 42 (6):463-78. Review.

55. Moghimi SM. Opsono-recognition of liposomes by tissue macrophages. International Journal of Pharmaceutics 162 (1998) 11 18.

56. Muller R.H., Lherm C., Herbort J., Couvreur P. Propidium-iodide-loaded polyaldylcyanoacrylate particles — labeling conditions and ooading capacity. Colloid Polym Sci 269: 147-152 (1991).

57. O'Hara P, Hickey AJ. Respirable PLGA microspheres containing rifam-picin for the treatment of tuberculosis: manufacture and characterization. Pharm Res. 2000 Aug;17(8):955-61.

58. Page-Clisson M.-E., Pinto-Alphandary H., Ourevitch M., Andremont A., Couvreur P. Develppment of ciprofloxacin-loaded nanoparticles: physico-chemical study of the drug carrier. Journal of Controlled Release 56 (1998) 2332.

59. Pandey R, Zahoor A, Sharma S, Khuller GK Nanoparticle encapsulated an-titubercular drugs as a potential oral drug delivery system against murine tuberculosis Tuberculosis (Edinb). 2003;83(6):373-8

60. Pinto-Alphandary H, Andremont A, Couvreur P. Targeted delivery of antibiotics using liposomes and nanoparticles: research and applications. Int J Antimicrob Agents. 2000 Jan; 13(3): 155-68. Review.

61. Poiani, G.J., Kemnitzer, J.E., Fox, J.D., Tozzi, C.A., Kohn, J., Riley, and D J., Polymeric carrier of proline analogue with antifibrotic effect in pulmonary vascular remodelling. Am J Respair Crit Care Med, 155: 1384-1390, 1997

62. Quenelle DC, Staas JK, Winchester GA, Barrow EL, Barrow WW. Efficacy of microencapsulated rifampin in Mycobacterium tuberculosis-infected mice. Antimicrob Agents Chemother. 1999 May;43(5):l 144-51.

63. Quenelle DC, Winchester GA, Staas JK, Barrow EL, Barrow WW. Treatment of tuberculosis using a combination of sustained-release rifampin-loaded microspheres and oral dosing with isoniazid. Antimicrob Agents Chemother. 2001 Jun;45(6): 1637-44.

64. Seijo В., Fattal E., Roblot-Treupel L., Couvreur P. Design of nanoparticles of less than 50 nm diameter: preparation, characterization and drug loading. International Journal of Pharmaceutics, 62 (1990) 1-7

65. Sethuraman VV, Hickey AJ. Powder properties and their influence on dry powder inhaler delivery of an antitubercular drug. AAPS PharmSciTech. 2002;3(4):E28.

66. Sham JO, Zhang Y, Finlay WH, Roa WH, Lobenberg R. Formulation and characterization of spray-dried powders containing nanoparticles for aerosol delivery to the lung. Int J Pharm. 2004 Jan 28;269(2):457-67.

67. Sharma R., Saxena D., Dwivedi A.D., and Misra A. Inhalable Microparti-cles Containing Drug Combinations to Target Alveolar Macrophages for Treatment of Pulmonary Tuberculosis. Pharmaceutical Research, Vol. 18, No 10, October 2001

68. Shishoo CJ, Shah SA, Rathod IS, Savale SS, Kotecha JS, Shah PB. Stability of rifampicin in dissolution medium in presence of isoniazid Int J Pharm. 1999 Nov 10; 190( 1): 109-23

69. Sihorkar V, Vyas SP Potential of polysaccharide anchored liposomes in drug delivery, targeting and immunization J Pharm Pharmaceut Sci (www.ualberta.ca/~csps) 4(2): 138-158, 2001

70. Skidan IN, Bobruskin Al, Guliaev AE, Shalkharbaeva SD, Severin SE, Steinniger S, Kreuter J, Gel'perina SE. Optimization of "Photosens" pharma-kokinetics by biodegradable nanospheres Antibiot Khimioter. 2001;46(4):6-10

71. Skidan IN, Gel'perina SE, Severin SE, Guliaev AE Enhanced activity of rifampicin loaded with polybutyl cyanoacrylate nanoparticles in relation to in-tracellularly localized bacteria Antibiot Khimioter. 2003;48(l):23-6

72. Sommerfeld P., Schroeder U., Sabel B.A. Long-term stability of PBCA nanoparticles suspensions suggests clinical usefulness. International Journal of Pharmaceutics 155 (1997) 201-207

73. Sommerfeld P., Schroeder U., Sabel B.A. Sterilization of unloaded polybu-tylcyanoacrylate nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics 164 (1998) 113-118

74. Steiniger SC, Kreuter J, Khalansky AS, Skidan IN, Bobruskin Al, Smir-nova ZS, Severin SE, Uhl R, Коек M, Geiger KD, Gelperina SE. Chemotherapy of glioblastoma in rats using doxorubicin-loaded nanoparticles. Int J Cancer. 2004 May l;109(5):759-67;

75. Suarez S, O'Hara P, Kazantseva M, Newcomer CE, Hopfer R, McMurray DN, Hickey AJ. Airways delivery of rifampicin microparticles for the treatment of tuberculosis. J Antimicrob Chemother. 2001 Sep;48(3):431-4.

76. Sunamoto J., and Sato T. Improved drug delivery directed to specific tissue using polysaccharide-anchored liposomes, in Tsuruta, T: Nakajima, A (eds), Multiphase Biomedical Materials. The Netherlands, pp. 169-171, 1989

77. Takada M., Yuzuriha Т., Katayama K., Iwamoto K., and Sunamoto J. Increased lung uptake of liposomes anchored with polysaccharides. Biochim Bio-phys Acta, 802: 237-244, 1984

78. Torchilin V.P. Drug targeting. European Journal of Pharmaceutical Sciences 11 Suppl. 2 (2000) S81 S91

79. Tseng Y.C., Hyon S.H., Ikada Y. Modification of the synthesis and investigation of properties for 2-cyanoacrylates, Biomaterials 11 (1990) 73-79

80. Vauthier C, Dubernet C, Fattal E, Pinto-Alphandary H, Couvreur P. Poly(alkylcyanoacrylates) as biodegradable materials for biomedical applications : Adv Drug Deliv Rev. 2003 Apr 25;55(4):519-48

81. Vauthier C., Schmidt C., Couvreur P. Measurement of the density of polymeric nanoparticulate drug carriers by isopycnic centrifugation. Journal of Nanoparticle Research 1: 411-418, 1999

82. Verdun C, Brasseur F, Vranckx H, Couvreur P, Roland M. Tissue distribution of doxorubicin associated with polyisohexylcyanoaciylate nanoparticles. Cancer Chemother Pharmacol. 1990;26(l):13-8.

83. Vinogradov Serguei V., Bronich Tatiana K., Kabanov Alexander V. Nanosized cationic hydrogels for drug delivery: preparation, properties and interactions with cells. Advanced Drug Delivery Reviews; 54 (2002) 135-147

84. Vyas SP, Kannan ME, Jain S, Mishra V, Singh P. Design of liposomal aerosols for improved delivery of rifampicin to alveolar macrophages. Int J Pharm. 2004 Jan 9;269(l):37-49.

85. Watnasirichaikul S, Rades T, Tucker IG, Davies NM. Effects of formulation variables on characteristics of poly (ethylcyanoacrylate) nanocapsules prepared from w/o microemulsions. Int J Pharm. 2002 Mar 20;235(l-2):237-46.

86. Whitehead TC, Lovering AM, Cropley IM, Wade P, Davidson RN. Kinetics and toxicity of liposomal and conventional amikacin in a patient with mul-tidrug-resistant tuberculosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1998 Nov; 17(11):794-7

87. Zhang Q, Liao GT, Wei DP, Zhang CJ. Increase of gentamicin uptake in cultured mouse peritoneal macrophage and rat hepatocytes when used in the form of nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics 164 (1998) 21 -27.