Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка методов выделения и очистки бактериальных эндотоксинов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов выделения и очистки бактериальных эндотоксинов"

ШП1ИС1ЕРСТВ0 ЗДРАВООХРАКЕШ¡Я РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РР §АНКТ-0ДТЕРБУРГСКМ Ж'ЖО-ЖИАШВТИЧЕСКИк ИНСТИТУТ

- 5 ИЮН 1995

На правах рукописи

КАДОЛИНА Ирина Борисовна

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ВКДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОТОКСИНОВ

03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург, 1995

Диссертационная работа выполнена на кафедре биотехнологии Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института

Научный руководитель:

доктор химических наук, вед.научн.сотр.

Консультант:

кандидат химических наук, доцент

Оффициальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

ЕЛЬКИН ШИй ЭЫИЛЬЕВШ

ГЛАЗОВА НАТАЛЬЯ К1АДЙМИР0ВНА

ЗАИКИЕА НАДЕЖДА АЛЕКСАНДРОВНА

КОЛИКОВ ВСЕВОЛОД ЩКАЙЛОВИЧ

доктор технических наук, профессор

Ведущее предприятие: АО Научно-исследовательский технологический институт антибиотиков и ферментов г.Санкт-Петербург

Защита состоится*^ 1995г. в часов на за-

седании Специализированного Совета К 084.63.01 при Санкт-Петербургском хиыико-фармацевгическом институте по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул.цроф.Попова, 14..

С диссертацией мояно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института.

Автореферат разослан 1995г.

Ученый секретарь ¡г) Л

Специализированного Совета, /

кандидат биологических наук Н.В.Кириллова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность теки. Проблема получения высокоочшценных лекарственных препаратов (особенно инъекционных форм) является достаточно трудной задачей в связи с тем, что отечественные технологии большинства из них не соответствуют международным правилам 6Г1Р. Особенно это касается ряда инъекционных лекарственных препаратов, для которых очень жесткие требования по содержанию пирогеиных примесей. Часто технология их получения несовершенна и длительна по времени, особенно для белковых препаратов; это приводит к микробной обсемененности продукта, что в свою очередь вызывает загрязнение готового лекарственного средства бактериальными эндотоксинами. Последние же являются наиболее распространенными пирогенными примесями, присутствующими на различных технологических стадиях получения лекарственных препаратов. Бактериальные эндотоксины являются компонентами клеточной стенки грамотрицательных микроорганизмов и представляют собой высокомолекулярные липополисахариды.

3 связи с этим является актуальной разработка методов выделения и очистки, а также анализ бактериальных эндотоксинов.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в получении эндотоксинов из клеток бактерий Р$%ри&Ыо(¿6)и£.со£/' с применением твердофазного и глубинного культивирования, их идентификация, а также изучение возможности применения макропористых сополимеров для разделения эндотоксинов и балластных примесей с целью получения максимально очищенного препарата эндотоксинов.

Конкретные задачи были следующими:

- получить бактериальные эндотоксины из клеток бактерий В. соб (уиЕдаг-и) и Рз.риИс/а (¿6) , используя твердофазный и глубинный метод культивирования;

- провести сравнительный анализ полученных экстрактов эндотоксинов, исследуя их компонентный состав;

- изучить закономерности сорбции эндотоксинов и белковых примесей на молекулярных сорбентах с модифицированной и немодигои-цированной поверхностью;

- провести кинетико-динамический анализ сорбции эндотоксинов и белковых примесей;

- провести оптимизацию фронтального процесса выделения и очистки бактериальных эндотоксинов.

Научная новизна работы. I. Впервые было предложено использовать для получения бактери-

альных эндотоксинов не твердофазный, а глубинный метод культивирования. Показана целесообразность использования глубинного способа культивирования для получения бактериальных эндотоксинов.

2. В качестве источника для получения бактериальных эндотоксинов были также впервые использованы клетки бактерий

Рб ри6/с/а (36') , выделенные из отечественного препарата "Путидойл" производства Бердского химического завода.

3. Для выделения и очистки бактериальных эндотоксинов впервые предложены макропористые неионогенные сополимеры и их карбонизированные аналоги.

4. Впервые проведена оптимизация сорбционно-хроматографиче-ского процесса разделения эндотоксинов и белковых компонентов по скорости протекания раствора через колонку.

5. Впервые предложена цринципиальная схема выделения бактериальных эндотоксинов непосредственно из культуральной жидкости, что позволило получить эндотоксины в достаточно большом количестве и с высокой степенью чистоты.

Практическое значение. На основании экспериментальных данных был предложен эффективный способ выделения и очистки бактериальных эндотоксинов. Получена адирогенная вода, используемая для приготовления инъекционных препаратов, удовлетворяющая требованиям ФС. Предлагаемый способ выделения и очистки бактериальных эндотоксинов позволил сократить время процесса в 3 раза, а также получать максимально очищенный препарат эндотоксинов, который в дальнейшем может использоваться в качестве рабочего стандарта эндотоксинов.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Всероссийской научной конференции: "Химия и технология лекарственных веществ", г.С.-Петербург, 1994?; семинаре "Теория и практика ионного обмена, ионообменная хроматография", Всероссийского химического общества им.Д.И.Менделеева, г.С.-Петербург, 1994,1995г; а также на заседаниях кафедры биотехнологии и микробиологии СПХФИ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано £ печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка используемых литературных источников, включающего_наименования. Работа изложена

на_страницах машинописного текста, включая_рисун-

ков, _таблиц и приложения на_ стр.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ЗКСПЕРИЖНТМЬНЬИ ИССЛЕДОВАНИЙ. . Известно, что наиболее широко используемыми грамотри-цательными микроорганизмами для получения эндотоксинов являются £сс£/, $аРл?о/}еР£а оРог^ (стандарты эндотоксинов), ¿>оРпюлгВ?о ¿ур/>! (препарат "Пирогенал") с применением твердофазного культивирования и последующей водно-феноль-ной экстракцией» Выход эндотоксинов, как правило, невелик и они представляют собой многокомпонентные системы. Поэтому, применение новых видов грамотрицателъных бактерий, также как и применение новых, более эффективных методов выделения и очистки является актуальным.

В работе для получения эндотоксинов использовали клетки бактерий и впервые используемые для этой цели клетки бактерий Рз. /36) . Экстракты эндотоксинов полученные из данных бактерий методом водно-фе-нольной экстракции были, охарактеризованы и сопоставлены ыевду собой. Полученные характеристики приведены в таблице I. В таблице I приведены следующие характеристики экстрактов:

- масса влажных клеток бактерий после культивирования до проведения водно-фенольной экстракции в к ^ » г);

- объем полученного экстракта эндотоксинов из влажных клеток бактерий (Уд, мл);

- масса сухого остатка в экстракте (/7?с 0 , г);

- концентрации: поллсахарвддв (Сп/с, мг/г);

белков (Сб, мг/г);

эндотоксинов - по ЛАД-тесту (СдНд, ЕДэ/мл);

- удельная концентрация (активность) эндотоксинов (ЕДэ/г).

Из таблицы I видно, что при твердофазном способе культивирования Рл. риЬ'с/а (36) выход по массе вланных клеток в 5,5 раз больше, чем у £. СоЕ/„ Кроме того, содержание полисахаридов, белков и эндотоксинов в экстрактах эндотоксинов из клеток бактерий АраИс/а/3£>) такие значительно больше. .,

Поскольку Рз ¿¡я {¿Ю по сравнению с язляется наиболее продуктивным штаммом (табл.1), то был ис-слеован процесс получения эндотоксинов методом водно-фено-льной экстракции из культуры РзриМа {36) при глубинном культивировании в течение 96 часов. Результаты также призе-

дены в таблице I, из которой видно, что в условиях глубинного культивирования содержание полисахаридов, белков и эндотоксинов было незначительным.

Таблица I.

ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСТРАКТОВ ЭНДОТОКСИНОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ КЛЕТОК БАКТЕРИЙ Р*.риШо(36> и £. со£/Г^аы) С ПРИМЕНЕНИЕМ ТВЕРДОФАЗНОГО И ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Культивирование -Наименование штамма /7в.к.б г У* мл !Т1 с.о. г Содержание: Удельная активность ЕДэ/г

Си/с, мг/г Сб' мг/г Сэнд> ЕДэ/мл

8 й 1 1 £.соИ (уиРдат) 1,3 100 0,200 3,0 1 Ю, 05 4,3 £ 0,10 19,50-' iI.II 9750

Йь.риЬ'сЬ (36) 7Д 100 0,270 8,1 го, 94 8,5 * 0,73 41,00 г 3,3 15185

ГЛУБИННОЕ (36) 0,12 100 0,054 4,1 * -♦0,08 0,05* 0,01 0,05 £ 0,01 93 н.р-р 35164

При сопоставлении полученных данных с графиками зависимостей изменения роста биомассы, рН, концентрации полисахаридов, белков и эндотоксинов от времени проведения ферментации, приведенных на рис.1 (а,б) можно сделать следующие выводы:

- из рас.1(а,б) видно, что концентрация полисахаридов сначала уменьшается, что связано с потреблением Р-л.риИЖ (36) углеводных компонентов питательной среды (крахмала), затем концентрация полисахаридов возрастает;

- концентрация бактериальных эндотоксинов на протяжении всего процесса ферментации в нативном растворе возрастает;

Рис.1 (а,б) Зависимости изменения роста биомассы (I),

РН (2), концентрации полисахаридов (3), белков (4) эндотоксинов (5) от времени ферментации

- к 72 ч возрастает концентрация белков;

- рост биомассы прекращается уке после 48 часов.

Из рис.1(а,б) видно, что незначительный выход бактериальных эндотоксинов цря водно-фенольной экстракции обусловлен тем, что за время биосинтеза (S6 ч) происходит лизис клеток, и эндотоксины, и белки выходят в нативный раствор. Это подтверждается данными, рис.Ка,б). Особенно сильное нарастание бактериальных эндотоксинов начинается с 48 часов. Поэтому, более целесообразным в последующей работе представлялось проводить ферментацию в течение 72 часов (т.к. начиная с 72ч рост эндотоксинов незначителен), а затем выделять бактериальные эндотоксины не из клеток бактерий методом водно-фенольной экстракции, а концентрировать их непосредственно из культура-льной звдкости, применяя сорбционный метод.

Был изучен компонентный состав полученных экстрактов эндотоксинов методом водно-фенольной экстракции с применением твердофазного культивирования. Гельзфоматограымы очищенных экстрактов эндотоксинов методами диализа и ультрафильтрации, приведены на рис.2 и рис.3. В экстрактах анализировали содержание полисахаридов по реакции на моно- и олигосахара фенола с концентрированной сйрной кислотой, белки - по методу Лоури, эндотоксины - по ЛАЛ-тесту.

С целью получения максимально очищенного препарата эндотоксинов были изучены возможности применения макропористых сополимеров для разделения эндотоксинов и примесей белковой природы.

В статических условиях наш были получены зависимости концентрации эндотоксинов в фазе сорбента (С0, мг/мл) от равновесной концентрации эндотоксинов в растворе (Сравн» мг/мл). Соответствующие изотермы приведены на рис.4(а,б,в,г). Из рис.4 видно, что сорбент АЛОС обладает несколько меньшей со-рбционной емкостью по отношению к эндотоксинам, чем другие сорбенты. При больших концентрациях емкость падает цракти-чески до нуля. На рис. 4(г) приведены изотермы сорбции эндотоксинов и белковых примесей на сорбенте Долисорб с не-модяфицированной поверхностью. Для эндотоксинов сорбция подчиняется уравнению Лэнгмюра. Однако, в данном случае, сорбент Полисорб обладает незначительной емкостью сорбции. Изотерма сорбции для белковых примесей тлеет перегиб, указывающий на влияние кооперативных взаимодействий. Поэтому,

Д280 а.

Рис.2 Гелъхроматограммн экстракта эндотоксинов из клеток бактерий Ps. pitido (36) а. - "Phormacia' (А=280нм), б,- после диализа

1 - полисахариды (Сп/с. мг/мл),

2 - белковые примеси (Сб, мг/мл),

3 - эндотоксины (Счнп, ЕДэ/мл)

Д280

бактерий Р-5 риНс/а (56)

а. - "РЬагшс'а « (д=280нм),

б. - после ультрафильтрации

1 - полисахариды (Сп/с, глг/мл),

2 - белковые примеси (С^, мг/мл),

3 - эндотоксины (С „п, ЕДэ/мл)

в дальнейшей работе была проведена модификация поверхности Полисорба катамшом.

Наибольшей сорбционной емкостью по отношению к эндотоксинам обладает Полисорб с модифицированной поверхностью (рис„4 в). При равновесных концентрациях до 0,5 мг/мл белковые примеси практически не сорбируются на сорбентах СКН--4М и Полисорбе (рис.4 б,в) в противоположность сорбенту АЛОС (рис.4 а), обладающему значительной емкостью сорбции по отношению к белковым примесям.

Равновесные коэффициенты распределения (К^) веществ меяду фазой сорбента и раствором при сорбции эндотоксинов и белковых примесей на модифицированном Полисорбе для начальных участков, изотерм сорбции приведены в таблице 2.

Таблица 2

РАВНОВЕСНЫЕ И КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ПРОЦЕССА СОРБЦИИ ЭНДОТОКСИНОВ К БЕЛКОВЫХ ПРИМЕСЕЙ НА МОДИФИЦИРОВАННОМ ПОЛИСОРБЕ

Ч *£>Э(рср . м2/с

Белок 2,5 9,5 х Ю-11

Эндотоксин 12 2,6 х Ю~П

При изучении кинетики сорбции эндотоксинов я белковых примесей были рассчитаны коэфшициентн внутренней диффузии

" ¿0 - X_

где Я - радиус зерна сорбента, м

- среднее время сорбция (первый начальный кинетический момент), с

ícp определяется как площадь над кинетической кривой, построенной в координатах А = у/г^ , ограниченной сверху прямой Р - I.

б

Рис.4 Изотермы сорбции I - белковых примесей, 2 - эндотоксинов на сорбентах а - МОС, б - СКН-4М

13 в

С, мг/мл 20

15

10 5

0 0,4 0,8 1,2 1,6 п мг/мл

Рис. 4

Изотермы сорбции I - белковые примеси, 2 - эндотоксины на сорбенте Полисорб в - модифицированном, г - немодифицированном

»

_ >

где Т - объем сорбента, мл "У - объем раствора, мл

Следует отметить, что сорбция эндотоксинов и примесей белковой природа на сорбенте Полисорб с модифицированной поверхностью происходит с большей скоростью, чем на сорбенте Полисорб с немодифищрованной поверхностью. Рассчитанные £>зср<р Для модифицированного Полисорба ^представлены в таблице 2, из которой видно, что значения &ЭСрср для исследуемых объектов близки по порядку величины. Однако, необходимо отметить, что ввиду сложности исследуемой системы рассчитать истинную величину коэффициентов внутренней диффузии не представлялось возможным. Представленные в таблице 2 значения являются приближенными оценками величин ¿Цг^ . Это особенно касается величины для белковых примесей, ввиду того, что белковые примеси - это скорее всего не чистый компонент, а смесь веществ. __

Для получения более точных значений -ЯЦ»^? , необходимо применить другую модель рассчета, а именно - "оболочка-ядро".

В ходе работы был исследован процесс сорбции эндотоксинов и примесей белковой природы в динамических условиях при различных скоростях пропускания раствора эндотоксинов:

$ = 1,0 х Ю-4 м/с;

(Г2 = 6,3 х Ю-4 м/с;

^ =10 х Ю"4 м/с.

Были получены выходные кривые, которые приведены на рис.5. Были рассчитаны значения критерия регулярности режима сорбции (Л ) для каждой скорости.

где Е - порозность слоя сорбента,

рабочая скорость процесса, м/с - средний диаметр зерна сорбента, м Н0- высота слоя сорбента, м

Из выходных кривых, представленных на рис.5(а,б,в)

¿р 1,0 х 10~4 м/с

6,3 х Ю-4 м/с

6 Щ

¿у 10 х Ю-4 м/с

* Щ

Рис.5 Выходные кривые сорбции I - белковых примесей, 2 - эндотоксинов в динамических условиях при различных скоростях пропускания раствора эндотоксинов

видно, что проскок эндотоксинов и белковых примесей наступает почта одновременно. Это согласуется с данными таблицы 2, из которой видно, что равновесные коэффициенты распределения эндотоксинов и белковых примесей близки по величине. В условиях близких к равновесным (Д> 0,35 - высокоэффективная сорбция регулярный режим) это делает невозможным разделение эндотоксинов и белков, поскольку возможность разделения в таком режиме определяется только различаем в значениях коэффициентов распределения. Однако, можно разделить эндотоксины и белковые примеси в нерегулярном режиме (рис.5 б). Показано, что при 6,3 х КГ4 м/с эндотоксины и белковые примеси разделяются в обычном фронтальном процессе. При дальнейшем же увеличении скорости пропускания раствора ( 10 х Ю-4 м/с) разделение вновь отсутствует. Зто объясняется тем, что при очень больших скоростях пропускания раствора удерживаемые объемы ( У^ ), (где I - эндотоксины, белковые примеси) всех веществ стремятся к нулю, и проскок всех веществ происходит вместе с проскоком фронта растворителя.

Кроме того, при изучении процесса десорбции эндотоксинов и белковых примесей с поверхности модифицированного Полисорба была подобрана область рН оптимальная для десорбции.

Таким образом, в результате проведенных исследований был подобран эффективный сорбент для поглощения эндотоксинов. На кодифицированном сорбенте Полисорб удалось осуществить оптимизацию фронтального процесса разделения эндотоксинов и белковых примесей.

ВЫВОДЫ.

1. В ходе работы были получены и исследованы эндотоксины из клеток бактерий Р^еис/отопо^ ^¿/Ыа. /36) Показано, что культура /%.риНс/о/36) может успешно использоваться для получения бактериальных эндотоксинов.

2. Впервые в ходе работы для получения бактериальных эндотоксинов из клеток грамотрицательных микроорганизмов был применен метод глубинного культивирования. Показано, что данный метод обладает рядом преимуществ перед твердофазным:

- сокращается врега цикла получения эндотоксинов:,

- более прост в исполнении;

- для выделения эндотоксинов ке требуется применения токсичных органических веществ.

3. Осуществлена оптимизация фронтального процесса сорбции эндотоксинов и белковых примесей по скорости.

4. Показана возможность десорбции эндотоксинов, свободных от белковых примесей.

5. Показано преимущество использования глубинного культивирования с последующей сорбцией эндотоксинов непосредственно из культуральной ясвдкости по сравнении с твердофазным способом культивирования я последующей вод-но-фенольной экстракцией.

6. Подобраны оптимальные условия как для выделения бактериальных эндотоксинов, так и очистки растворов от пи-рогенных примесей.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Кадолина И.Б., Глазова Н.В., Юнкерова Л.И.

Выделение и анализ бактериальных эндотоксинов из клеток грамотрицательных бактерий Р1.риИс1о(36)и Е-Соё/'/уиЕдог/з)

Журнал Прикладная биохимия и микробиология

2. Кадолина И.Б., Глазова Н.В., Елькин Г.Э.

Сорбция бактериальных эндотоксинов на макропористых сорбентах.

Журнал Прикладная биохимия и микробиология

3. Кадолина И.Б., Глазова Н.В., Елькин Г.Э. ..Быченкова О.В.

Изучение сорбции бактериальных эндотоксинов из различных штаммов микроорганизмов. Тез.докл. на Всероссийской конференции "Химия и технология лекарственных веществ", СПб, 1994.

4. Кадолина И.Б., Глазова Н.В., Юнкерова Л.И., Быченкова О.В.

Получение и анализ бактериальных эндотоксинов из различных продуцентов. Тез.докл. на Всероссийской конференции "Химия и технология лекарственных веществ", СПб, 1994.

5. Жарова Е.А., Кадолина И.Б., Глазова Н.В., Елькин Г.Э. Применение различных методов для получения апирогенной

воды. Тезисы на Всероссийской конференции, г.Саратов, 1853.

6.Глазова Н.В., Рачковская Л.Н., Елькик Г.Э., Кадолина И„Б.

Курдявка Л.В.

Сорбция токсических и пирогенных примесей из лекарственных препаратов на молекулярных сорбентах. Тез. докл. на Международной конференции:"Проблемы сорб-ционкой детоксикации организма", г.Новосибирск, 1995.