Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка методического подхода к генетическому типированию штаммов сибиреязвенного микроба

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методического подхода к генетическому типированию штаммов сибиреязвенного микроба"

На правах рукописи

Цыганкова Елена Анатольевна

РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКОГО ПОДХОДА

К ГЕНЕТИЧЕСКОМУ ТИПИРОВАНИЮ ШТАММОВ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА

03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г 4465

Саратов 2007

003174465

Работа выполнена в ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Еременко Евгений Иванович

Официальные оппненты:

доктор биологических наук, профессор Попов Юрий Алексеевич

доктор медицинских наук, профессор Липницкий Анатолий Васильевич

Ведущая организация: ФГУ «48 Центральный НИИ Министерства обороны Российской Федерации» (г Киров)

Защита состоится « 7 » ноября 2007 г в 13 00 часов на заседании диссертационное совета Д 208 078 01 по присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора по адресу 410005, г Саратов, ул Университетская, 46

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Автореферат разослан «.

»

2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник

А А Слудский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Сибирская язва в настоящее время продолжает оставаться проблемой для здравоохранения и ветеринарии. Даже в высокоразвитых странах случаются разлитые эпизоотии этой инфекции Примером может служить небывалая по масштабам эпизоотия сибирской язвы сельскохозяйственных и диких травоядных животных на сопредельных территориях США и Канады летом и осенью 2006 года, в ходе которой заболел один человек (Nishi J S. et al, 2007) Вспышки заболеваемости людей связаны с эпизоотиями и носят спорадический характер Тем не менее, они всегда сопряжены с проведением большого объема диагностических, терапевтических, противоэпидемических, профилактических мероприятий Проблема сибирской язвы вряд ли будет окончательно решена в связи с существованием стационарно-неблагополучных пунктов, сопряженных с почвенными очагами инфекции, сохраняющимися неопределенно долго Только на территории Российской Федерации таких пунктов зарегистрировано более 35 тысяч (Черкасский Б.Л, 1969, Онищенко Г.Г. с соавт., 1999, Черкасский Б Л, 2002) Чрезвычайная устойчивость спор Bacillus anthracis,' выживающих во внешней среде десятилетиями без утраты вирулентности, обеспечивает потенциал новых эпи-зоотий, возможность распространения возбудителя за пределы эпизоотического очага с инфицированными продуктами животноводства и заболевания людей Возросшая в современных условиях мобильность населения и расширяющиеся торгово-экономические связи определяют повышенный риск завоза возбудителя из неблагополучных областей с импортируемыми продуктами

В последние годы заявил о себе новый аспект проблемы — использование возбудителя сибирской язвы в качестве средства биологического терроризма (Черкасский Б.Л., 2004, Frischknecht F et al, 2003) Вдыхание спор сибиреязвенного микроба в таких случаях, как и при военном применении, ведет к развитию у жертв ингаляционной формы инфекции, отличающейся тяжелым течением и частыми фатальными исходами

Весьма важным вопросом, который в числе прочих необходимо решать всякий раз при возникновении вспышек сибирской язвы как природного характера, так и вызванных преднамеренным использованием спор В anthracis в качестве поражающего агента, является вопрос о происхождении и путях распространения возбудителя Неоценимым для его практического решения становится подход, основанный на генетическом типировании возбудителя В частности, при расследовании вспышки сибирской язвы вследствие террористического акта в США в 2001 году были использованы разработанные там же методы многолокусного анализа областей генома с вариабельным числом тандемных повторов (MLVA) (Keim Р et al, 2000) и секвенирования гена протективного антигена (ПА) (Price L et al, 1999; Hoflmaster A et al, 2002) Эти методы позволили проследить связи случаев инфекции между собой и местом заражения, а также отличить культуры, не относящиеся к этой вспышке Однако выявить генетическую вариабельность штаммов, выделен-

ных в ходе одной вспышки, а также у вариантов одного и того же штамма дал возможность только полный сиквенс геномов (Read Т et al, 2002)

В связи с этим особую важность приобретает не только совершенствование методов и средств диагностики, профилактики и лечения, но и разработка точных и эффективных методов генетического типирования возбудителя для определения источника происхождения штаммов Banthracis, вызвавших вспышку сибирской язвы или использованных при террористическом акте В настоящее время наиболее распространен метод молекулярного типирования штаммов В anthracis, основанный на анализе нескольких хромосомных и плазмидных локусов с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR- локусов), называемый MLVA (Keim Р et al, 2000, Le Fleche P et al., 2001) MLVA в сочетании с филогенетическим анализом обнаружил закономерное географическое распределение генотипов штаммов сибирея шейного микроба и различия в степени генетического родства между ними (Еременко ЕИ и др , 2000, Keim P et al, 2000, Fasanella A et al, 2001, Le Fleche P et al, 2001, Wang В et al, 2001, Malio A et al., 2006) Необходимо отметить, что MLVA в оригинальном варианте и тем более секвенационное типи-рование требует дорогостоящего оборудования и реактивов, которыми в настоящее время в Российской Федерации располагает очень ограниченный круг ведущих научно-исследовательских учреждений У нас в стране предложена более доступная модификация MLVA, с использованием которой оценена генетическая вариабельность штаммов Banthracis, выделенных в СНГ (Еременко Е И и др , 2000, Цыганкова О И и др , 2003). Кроме того, в качестве дополнительных генетических маркеров при определении степени генетического родства штаммов используют предложенное L Pnce et al (1999) определение генотипа гена ПА в соответствии с полиморфизмом единичных нуклеотидов (SNP) Несмотря на высокую разрешающую способность данных систем генотипирования, они не способны различать штаммы, произошедшие из одного источника и имеющие одинаковый MLVA- и ПА-генотипы Метод анализа полиморфизма длины амплификационно-рестрикционных фрагментов (PCR-RFLP- анализ) гена протективного антигена возбудителя, который мог бы стать доступной альтернативой секвена-ционному типированию этого гена Целесообразным может быть дополнение существующих схем генетического анализа штаммов В anthracis маркерами единичных нуклеотидных повторов (SNR), которые проявляют высокую степень генетического полиморфизма (Цыганкова Е А , Еременко Е И, 2005, Muscillo M et al, 2005, Stratüo Ch et al, 2006), новыми VNTR-маркерами, а также замена определения SNP методом сиквенса на PCR-RFLP-анализ гена ПА Решение этих задач позволило бы предлояапъ приемлемый для нынешнего уровня оснащенности большинства лабораторий соответствующего профиля у нас в стране метод генетического типирования сибиреязвенного микроба

Таким образом, исследования, направленные на поиск практически приемлемого методического подхода к генетическому типированию сибиреязвенного микроба, представляются актуальными

Цель исследования - разработка методического подхода к генетическому типированию сибиреязвенного микроба, основанного на сочетании MLVA, SNR- и PCR- RFLP - анализа Задачи исследования:

1 Провести поиск потенциально вариабельных тандемных и единичных нуклеотидных повторов в геноме B.anthracis Сконструировать прай-меры к обнаруженным областям с тандем ными и единичными нуклео-тидными повторами и оптимизировать параметры амплификации с ними в ПЦР для VNTR- и SNR-анализа

2. Изучить вариабельность выявленных областей генома штаммов возбудителя сибирской язвы

3 Подобрать эндонуклеазы, имеющие сайты узнавания и рестрикции в пределах гена протективного антигена сибиреязвенного микроба Подобрать праймеры для амплификации областей гена протективного антигена и последующего рестрикционного анализа

4 Разработать метод анализа полиморфизма длины амплификационно-рестрикционных фрагментов (PCR-RFLP- анализ) гена протективного антигена

5 Изучить вариабельность последовательностей гена ПА у штаммов сибиреязвенного микроба и морфологических колониальных вариантов их популяций разработанным методом

6 Разработать методический подход к генетическому типированию В anthracis, основанный на сочетанном применении MLVA, SNR- и RFLP-PCR- анализа гена ПА

7 Оценить возможности применения использованных методов генетического типирования для эпидемиологического анализа штаммов возбудителя сибирской язвы разного географического происхождения, а также выделенных в ходе отдельных вспышек сибиреязвенной инфекции

Научная новизна. Для генетического типирования сибиреязвенного микроба сконструированы оригинальные праймеры PX3f/PX4i, 39VNTRchf/39VNTRchr и 196chr/196chf - к вариабельным плазмидным и хромосомным областям генома; 16Achf/16Achr, polyAf/polyAr и PXfTPXr - к SNR-областям генома, PA 953f/PA 953г и PA800f/PA800r - к гену ПА

Подобраны оптимальные набор эндонуклеаз и условия реакций рестрикции, проведения обычной и мультиплексной ПЦР для VNTR-, SNR- и RFLP-PCR-анализа

Впервые обнаружена генетическая вариабельность плазмидной VNTR области РХЗ-4, ассоциированная с фенотипической вариабельностью штаммов, отличающихся по комплексу биохимических и патогенных свойств

Впервые обнаружена генетическая вариабельность хромосомного ло-куса 39VNTRch, расположенного в пределах гена, кодирующего синтез кол-лагенового адгезивного белка В anthracis

Впервые разработан метод PCR-RFLP анализа гена ПА сибиреязвенно го микроба Впервые выявлена высокая вариабельность полиадениновых об-

ластей генома и PCR-RELP типов гена ПА штаммов, выделенных в ходе одной вспышки сибирской язвы, а также вариантов штаммов, имеющих идентичный ML VA-генотип

Впервые идентифицировано шесть новых, а также пять известных, но не встречавшихся ранее MLVA-генотипов среди штаммов, выделенных на территории СНГ

Разработан методический подход к генетическому типированию сибиреязвенного микроба, основанный на сочетанном анализе маркеров MLVA, PCR-RELP и SNR в нашей модификации, позволяющий дифференцировать штаммы разного географического происхождения, а также группы изолятов и отдельные штаммы, выделенных во время вспышек сибиреязвенной инфекции

Практическая значимость. Разработанные методы генетического ти-пирования используются в лаборатории Ставропольского НИПЧИ для анализа музейных, вновь поступивших для идентификации и выделенных из исследуемого материала штаммов возбудителя сибирской язвы Полученные в результате исследования новые генетические характеристики шгаммов дополнили имеющиеся в компьютерной базе данных «Штаммы Bacillus ап-thracis»

По материалам диссертационной работы составлены методические рекомендации

1 «Методические рекомендации по комплексной оценке фенотипиче-ских признаков (гемолитической, протеолитической, лецитиназной и пиг-ментсинтезирующий активностей, способности штаммами/ изолятами продуцировать капсулу и токсин т vitro) культур Bacillus anthracts», рекомендованные на заседании секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН академиком И А Бакуловым 28 мая 2004 г., протокол секции №2 и утвержденные директором СтавНИПЧИ (2004 г)

2 «Молекулярное типирование штаммов сибиреязвенного микроба на Основе вариабельности нуклеотидных последовательностей гена протектив-ного антигена», утвержденные директором СтавНИПЧИ (2005 г)

3 «Методические рекомендации по межвидовой и внутривидовой дифференциации группы бацилл, включающих В anthracis», утвержденные директором СтавНИПЧИ (2005 г.)

4 «Методические рекомендации по филогенетическому анализу штаммов микроорганизмов» утвержденные директором СтавНИПЧИ (2005 г.)

5 Учебно-методическое пособие «Теоретические основы и практические аспекты полимеразной цепной реакции», утверждено директором СтавНИПЧИ (2005 г)

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Локус с вариабельным числом тандемных повторов РХ 3-4 в межгенной области плазмиды рХ02 имеет два аллельных варианта, присущих штаммам сибиреязвенного микроба с разной фенотипической экспрессией комплекса ассоциированных с вирулентностью признаков

2 Анализ трех областей генома, содержащих единичные нуклеотидные повторы, позволяет выявить высокую степень индивидуальной генетической вариабельности у штаммов В аМЪгаыя

3 РСЯ-Ш^иР-анализ гена ПА, основанный на амплификации двух фрагментов гена pag с последующей рестрикцией тремя эндонуклеазами, обнаруживает семь РСЯ-КБЬР типов гена ПА среди штаммов В ап-1Игас1х и их вариантов разного происхождения

4 Методический подход к генотипированию штаммов В апйггаЫз, основанный на сочетанием анализе маркеров МЪУА, РСЯ-ИРЬР и ЭЫЯ в нашей модификации дает возможность одновременно дискриминировать штаммы, происходящие из разных вспышек сибирской язвы, объединяя штаммы из одной вспышки, и различать штаммы, выделенные в течение отдельной вспышки

Материалы диссертации вошли в заключительный отчет по НИР Став-НИПЧИ «Изучение фенотипической и генетической вариабельности штаммов сибиреязвенного микроба» № ГР 02 200 109091

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции, посвященный 75-летию НИИ Микробиологии МО РФ (Киров,

2003), 5-ой Всероссийской научно-практической конференции (г Москва,

2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников Содружества независимых государств- проблемы биологической безопасности и противодействия терроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), научно-практической конференции «Фундаментальные исследования в биологии и медицине» (Ставрополь 2006), VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006), научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 2007)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, из них 3 - в рецензируемых изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, депонировано — 1 работа, в сборниках научных трудов, материалах научных и научно-практических конференций - 18 работ

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 182 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 251 работу, из них 17 - отечественных и 234 -зарубежных авторов Материалы иллюстрированы 20 рисунками и 24 таблицами

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Объектом изучения были 157 штаммов В anthracis, выделенных на территории России и стран СНГ в период с 1967 по 2004 г Штаммы были получены из рабочей коллекции лаборатории сибирской язвы и из коллекционного центра СтавНИПЧИ

Фенотипические свойства штаммов определяли в соответствии с методическим указаниями «Лабораторная диагностика сибирской язвы животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды» (Москва, 1989) с некоторыми модификациями и дополнениями разработанными в лаборатории сибирской язвы СтавНИПЧИ дополнительными методами.

Приготовление проб ДНК проводили согласно методическим указаниям МУ 3 5 5 - 1034-01 «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями Í-IV групп при работе методом ПЦР» (Москва, 2001)

Были использованы две системы ML VA- генотипирования штаммов В anthracis 8-ми локусный (Р Keim et al, 2000), и анализ полиморфных хромосомных локусов Ceb-Bams, разработанный Р Le Fleche et al (2001) Нуклеотидные последовательности праймеров и режимы амплификации соответствующих фрагментов совпадают с описанными авторами

Амплификацию ДНК проводили с использованием реактивов для ПЦР производства фирмы «ИнтерЛабсервис» (Москва). Праймеры, использованные в данной работе, были синтезированы фирмами «ИнтерЛабсервис» и «Литех» по нуклеотидным последовательностям, описанным в литературе или разработанным в процессе выполнения данной работы

Для проведения ПЦР использовали амплификаторы ДНК Mastercycler 22331 (Eppendorf, Германия) и МС-2 «Терцик» (ДНК-технология, Россия)

Электрофорез проводили в камерах для горизонтального электрофореза Sunrise™ Gibco BRL Horizontal Gel Electroforesis Apparatus™ фирмы Life Technologies (США) с размером геля 20x25 см, Subcell 192 фирмы BioRAD с размером геля 25x25 и SE-2N фирмы «Helicón» с размером геля 8,5x12,5 см Регистрировали изображение с использованием ультрафиолетового трансиллюминатора TFX-20M Gibco BRL UV Transillummator фирмы «Life Technologies» с длиной волны 320 нм Регистрацию и анализ изображений осуществляли с помощью системы «Kodak Digital Science EDAS 120 System».

Размеры ампликонов определяли с использованием компьютерной программы Kodak ID Image Analytic Software (Eastman Kodak Company, 2000)

Для генотипирования штаммов В anthracis по гену ПА использовались эндонуклеазы рестрикции фирм «СибЭнзим» (Россия) и «New England BioLabs» (США) Рестрикционный анализ фрагментов ДНК проводили в соответствии с методикой, описанной Т Манниатисом с соавт (1984) с некоторыми модификациями

Поиск новых последовательностей с тандемными повторами в геноме сибиреязвенного микроба проводили, используя ресурсы GenBank, с помо-

щью программ Tandem Repeat Finder (TRF) и BLASTN

Расчет и подбор праймеров осуществляли с помощью программы Gene Runner Version 3 00, Hastings Software, 1994

Для филогенетического анализа штаммов В anthracis использовали пакет программ PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 3 6 (alpha3), a также программу Tree View [Win32] 1 5 2 и Mega 3 (Kumar S , Tamura К, Nei M, 2004) Для определения места прикрепления праймеров на хромосоме или плазмиде разных штаммов В anthracis использовали базу данных GENEWAYS Для сравнения идентифицированных нами генотипов с известными использовали базу данных (http //www minisatell it/upsud-ír) Графики строили с использованием программы MS Excel 7 0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ опубликованных в GenBank последовательностей генома В anthracis с помощью программ TRF и BLASTN позволил обнаружить несколько потенциально вариабельных при исследовании in silico VNTR-локусов, к каждому из которых нами были сконструированы праймеры и разработана программа амплификации

Повтор, названный РХ 3-4, состоит из 8 нуклеотидов (АСАТТТАС) и находится в межгенной области около генов capR и герА Было идентифицировано три аллеля 248, 256 и 393 п.н , Аллель размером 248 п н содержит два повтора, содержащих по три копии каждый, и разделенных участком из 99 п н Аллель 256 п н. отличается наличием дополнительной копии в первом повторе Аллель 393 п н по сравнению с 256 п н имел удвоение сегмента, включающего первую VNTR-область и разделяющую последовательность в 105 пн

Нами были исследованы 116 штаммов В anthracis по данному локусу Основываясь на полученных данных, можно сделать вывод, что аллель 248 РХ 3-4 характерен для сибиреязвенных штаммов с типичными фенотипиче-скими свойствами. Аллель размером 256 п н был обнаружен у атипичных пс набору фенотипических признаков штаммов В anthracis Все они отличались неспособностью образовывать преципитаты на среде СОПЭК с сибиреязвенным гамма-глобулином для изучения способности штаммов к токсинопро дукции, вызывать протеолиз альбумина и гемолиз отмытых эритроцитов барана, расти на синтетической среде 9А без триптофана Кроме того, штаммы ICO S, 12/16 S, 140П и 14/41 ASM образовывали капсулу на воздухе, а штамм 14/41 II обладал лецитиназной активностью. Типичные по всем признакам штаммы 1 СО и варианты штаммов 12/16 и 140П имели аллель 24£ п н , как и все 106 природных штаммов В anthracis из коллекции СтавНИП-ЧИ Аллель 393 РХЗ-4 у исследованных штаммов В anthracis выявлен не был

Природные штаммы В anthracis, изученные в процессе выполнение данной работы, проявляли типичные культурально-биохимические свойства и имели разные ML VA-генотипы, однако, генотип 13N не был выявлен ни у одного из этих штаммов, как и аллель 256 РХЗ-4 Таким образом, аллель 256

п н выявляется только у атипичных по одному или нескольким признакам штаммов В. anthracis, имеющих ML VA-генотип 13N, в то время как аллель 248 п н характерен для типичных по комплексу культурально-биохимических признаков штаммов В anthracis, которые относятся к разным ML VA-генотипам Можно предположить, что наличие аллели 256 п н. локуса РХ 3-4 может служить своеобразным дополнительным «маркером атипич-ности» штаммов В anthracis.

Еще один вариабельный тандемный повтор 39VNTRch, размером 39 пн обнаружен нами на хромосоме В anthracis При исследовании 126 штаммов В anthracis и 13 видов близкородственных сапрофитов рода Bacillus (.В thurmgiensis и В cereus) было выявлено 4 аллеля данного локуса 478, 439, 400 и 283 п н. Выявленный тандемный повтор имеется у В anthracis, В thuringiensis и B.cereus У ряда штаммов вариабельная область с повтором 39 VNTR приходится на межгенное пространство, а у других - на расположенный на том же участке ген, кодирующий синтез адгезивного коллагенового белка Количество повторов у В anthracis варьирует от пяти до семи, наиболее распространенным является аллель 400 п н, содержащий шесть повторов Ранее описана генетическая вариабельность, связанная с VNTR, в области, кодирующий коллагеноподобный белок филаментов экзоспориума В anthracis, который определен так же как иммунодоминантный (Steichen С, et al, 2003) Было показано, что длина филаментов прямо связана с количеством повторов (Sylvestre P., et al 2003) Возможно, и число тандемных повторов локуса 39 VNTR ch может оказывать влияние на адгезивные свойства штаммов, а так же их иммуногенность.

Таким образом, обнаруженные нами новые локусы с вариабельным числом тандемных повторов разных размеров и разной степенью полиморфизма среди штаммов сибиреязвенного микроба, которые пригодны для генетического типирования.

При анализе in sihco полной нуклеотидной последовательности генома 5 штаммов В anthracis нам удалось выявить три перспективных области на хромосоме и плазмиде рХ02 В anthracis, вариабельных по содержанию аденинсодержащих SNR. Мы разработали праймеры, состав реакционной смеси и подобрали программу амплификации выбранных фрагментов генома В anthracis Были проанализированы 3 SNR-локуса в геноме В anthracis два из них — Poly А и РХ F-R находятся на плазмиде рХ02, а один -16А ch — на хромосоме S anthracis.

Poly А участок на плазмиде рХ02 В anthracis, вариабельный по числу аденинсодержащих нуклеотидов, описан Т Read et al (2002) как повтор VX-3, имеющий 6 аллелей с 37, 36, 35, 30, 14, 6 аденинами Позднее были описаны новые аллели и показана высокая степень вариабельности данного SNR (Цыганкова Е.А , Еременко Е И. 2005, Muscillo M et al, 2005). Праймеры Poly А, позволяют амплифицировать фрагмент, размер которого определяется как 301+п, где п — число аденинсодержащих нуклеотидов

Локус РХ F-R, так же представляет собой поли-А SNR участок на плазмиде рХ02 В anthracis. Размер амплифицируемого фрагмента составля-

er 238+n, где n - число аденинсодержащих нукдеотидов Тандемный повтор РХ 3-4 и SNR-локус РХ F-R находятся на расстоянии 1196 п н друг от друга

Недостаток двух вышеописанных SNR-локусов заключается в том, что они не могут быть использованы при изучении штаммов В anthracis, лишенных плазмиды рХ02

Обнаруженный нами вариабельный полиадениновый локус 16А ch расположен на хромосоме В anthracis и поэтому присутствует у всех изученных штаммов Размер повтора определяется как 307+п, где n - вариабельное количество аденин содержащих нуклеотидов

Каждый локус анализировался в двух выборках штаммов (штаммы из отдельных вспышек и штаммы из разных географических регионов) Ни для одного из изученных локусов не выявлено закономерности распределения [То годам или в зависимости ог источника выделения На основе этих данных был определен Pic (коэффициент вариабельности) отдельно для двух выборок штаммов В anthracis по вспышкам и из разных географических регионов

По локусу РХ F-R для штаммов В anthracis, подобранных по вспышкам, выявлено 11 аллелей, а для штаммов из разных регионов — только 6 аллелей Среди штаммов по вспышкам наиболее часто встречается аллель 252 п н Остальные аллели встречаются значительно реже и не привязаны к конкретной вспышке, кроме аплеля 258, который обнаружен у всех, кроме одного штаммов из двух последовательных вспышек в Терском районе Кабардино-Балкарской Республики (1998 и 1999 гг) Среди штаммов из разных географических регионов встречается только шесть аллелей, что, возможно, объясняется меньшим числом штаммов в данной выборке Величина Рю для штаммов по вспышкам составляет 0,7758, а для штаммов из разных регионов -0,7970

По вариабельному локусу Poly А обнаружено 11 аллелей среди штаммов, подобранных по вспышкам и 10 аллелей среди штаммов из различных регионов Среди штаммов по вспышкам, выделенных преимущественно на территории Кавказа и Закавказья, величина аллеля колеблется в интервале 314-327 пн Среди штаммов, выделенных в различных регионах Росси и стран СНГ, величина ампликона колеблется от 321 до 342 п н Следует так же отметить, что если для территории Северного Кавказа и Закавказья характерны аллели величиной менее 330 п.н, то для Центральной России характер™ фрагменты Poly А большей величины от 331 до 342 п н Индекс вариабельности Pic для обеих групп штаммов практически одинаков, и составляет 0,864 для штаммов по вспышкам и 0,860 для штаммов из разных регионов

Локус 16А ch оказался наиболее вариабельным из трех изученных для выборки штаммов по вспышкам выявлено 27 аллелей, а среди штаммов из разных регионов — 10 Всего для полиморфного локуса 16А ch выявлено 32 аллеля Индекс вариабельности Рю для штаммов по вспышкам близок к единице и составляет 0,984, а для штаммов из разных регионов - 0,82 Заслуживает внимания не только высокая разрешающая способность данного локуса,

но и то, что штаммь! из одной вспышки имеют близкую величину области 16А ch, и Отличаются от штаммов из других вспышек Таким образом, из трех изученных локусов оптимальным для использования в генотипирова-нии штаммов В anthracis является локус 16А ch Так как данный локус расположен на хромосоме, то его можно определять у всех, в том числе и у moho- и бесплазмидных штаммов Локус 16Ä ch не только обладает высокой дискриминирующей способностью, но и позволяет объединять штаммы из одной вспышки в группы с близкими величинами данного SNR локуса Нами подобран такой состав реакционной смеси для локуса 16 A ch, при котором можно Проводить амплификацию по той же программе, что и MLVA-локусы системы Р Keim et al (2000), для одновременного определения ML VA-генотипа и величины аллеля локуса 16A ch

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что единичные нуклеотидные повторы обладают высокой разрешающей способностью при их использовании для генетического анализа и типирования* штаммов Значительное разнообразие аллелей каждого локуса и их комбинации, уникальные практически для каждого штамма, при дополнении существующих схем MLVA-генотипирования характеристикой данного локуса, позволяют добиться большой точности в определении степени генетического родства изучаемых штаммов"

Нами изучена возможность генетического типирования штаммов сибиреязвенного микроба методом PCR-RFLP анализа гена ПА, позволяющим выявлять полиморфизм длины ресгрикционных фрагментов и получать представление о SNP в пределах гена pag

Подбор эндонуклеаз, способных выявлять полиморфизм длины ресгрикционных фрагментов в гене ПА, проводился с использованием программы Gene Runner Для анализа использовались последовательности гена pag В anthracis, опубликованные в сети MedLine на сайте Gene Bank Все нуклеотидные позиции, описываемые в данной работе, базируются на последовательности штамма Sterne (номер доступа в GeneBank - М22589) Были отобраны 7 ферментов, с помощью которых, используя метод PCR-RFLP, можно выявлять изменения нуклеотидной последовательности гена ПА В anthracis Были разработаны собственные праймеры, позволяющие получать фрагменты ДНК гена pag, содержащие сайты рестрикции для выбранных эндонукле-аз

При электрофорезе продуктов рестрикционного расщепления ампли-конов pag 67-68, РА 953 и РА 800 специфическими эндонуклеазами в некоторых пробах были обнаружены фрагменты, не соответствующие рассчитанным при компьютерном моделировании Описанные несоответствия могут объясняться неоднозначностью сайтов узнавания и рестрикции для этих эндонуклеаз Кроме того, это может свидетельствовать о гетерогенности популяции штаммов или о наличии в клетках нескольких отличающихся копий плазмиды pXOl Образование ресгрикционных фрагментов не соответствующих ожидаемым результатом при действии эндонуклеаз Aci I, НруСН4 IV, Fok I не позволяло однозначно интерпретировать результаты рестрикции

и определять PCR-RFLP тип гена ПА Поэтому эндонуклеазы рестрикции Aci I, НруСН4 IV, Fok I были исключены из схемы определения типа гена ПА методом RFLP-PCR анализа При действии эндонуклеазы рестрикции Hmf I у всех изученных в данном исследовании штаммов В. cmihracis (116) наблюдалось образование одинаковых по величине рестрикционных фрагментов (801, 136, 17 пн), поэтому при определении PCR-RFLP типа гена ПА данный фермент не учитывался

Таким образом, для типирования штаммов В anthracis методом PCR-RFLP анализа по гену протективного антигена было отобрано 3 эндонуклеазы рестрикции Mfe I, PspE I, BstMC 1 Разные комбинации фрагментов, образующихся при действии этих эндонуклеаз на ампликоны pag 67-68 (Mfe I и PspE I) и РА 953 (BstMC I) позволяют выделить среди штаммов В anthracis 7 генотипов ПА (таблица 1).

Таблица 1 PCR-RFLP типы гена pag выявленные при использовании эндонуклеаз рестрикции.

Размеры фрагментов после обработки эндо-нуклеазами рестрикции, п.н. PCR-RFLP тип гена ПА

Mfe I PspE I Bst MCI

327,420 747 107,847 1

747 747 107,847 2

327,420 747 954 3

327,420 68,679 107,847 4

747 68,679 107,847 5

747 747 954 6

327,420 68,679 954 7

На основании данных по генотипировании 116 штаммов В аЫкгаыя методом RFLP-PCR анализа была построена диаграмма, представленная на рисунке 1, отражающая распределение штаммов В аМИгасм выделенных в разные годы из разных источников по PCR-RFLP типам гена ПА

2,1%

5,3%

1 -7 - разные РСЯ-К РЬР типы гена ПА

Рисунок 1. Распределение природных штаммов В. апЛИгаск по генотипам ПА.

Наиболее многочисленными и разнообразными по источнику выделения являются штаммы, относящиеся к 1 РСК-КРЬР типу гена ПА (49,5%), выделенные из почвы с места прирезки и скотомогильников, материала от больных людей и животных, проб воды, смывов и соскобов с различных поверхностей. Вторую по частоте встречаемости группу составляют штаммы, относящиеся к 4 РСЛ-НРЬР типу гена ПА (25,3%), распространенному исключительно на территории Кавказа и Закавказья, как и редкие 5, 6 и 7 РСЯ-ИРЬР типы гена ПА (кроме штамма 539/59, имеющего 6 тип гена ПА и выделенного в Волгоградской области). Таким образом, территория Кавказа и Закавказья наиболее разнообразна по генетическому составу популяции штаммов В. аЫИгасгв, постоянно циркулирующих на данной территории и периодически вызывающих вспышки сибирской язвы у животных и людей. Большое генетическое разнообразие штаммов В. апЛгаЫя, выделяемых на территории юга России и близлежащих стран: Азербайджана, Грузии и Узбекистана, выявляемое как при анализе методом МЬУА, так и при определении Ы^ЬР-РСЛ типа гена Г1А, можно объяснить, во-первых, благоприятными климатическими и почвенными условиями, способствующими длительному хранению спор и их попаданию в организм животного, и, во-вторых, исторически сложившимся торговым и миграционным путями, проходящим по данной территории.

Нами так же было проанализировано распределение штаммов В. ап-Мгаыя с разным РСЯ-ИРЬР типом гена ПА в соответствии с источником выделения. Как видно из гистограммы, представленной на рисунке 2, среди штаммов, выделенных из почвы и материала от больных и умерших от си-

бирской язвы людей большую часть составляют штаммы 1 и 4 PCR-RFLP типов гена ГГА Эти две группы штаммов - выделенных из почвы и из материала от больных людей наиболее разнообразны по количеству ПА генотипов среди штаммов, выделенных из почвы с места прирезки или скотомогильников обнаружено шесть из семи PCR-RFLP типов гена ПА (1-6). В группе штаммов, выделенных от больных и умерших от сибирской язвы людей встречается пять из семи PCR-RFLP типов гена ПА 1,4-7 Следует отметить, что в выборке штаммов, выделенных из материала от больных людей не встречаются штаммы со 2 или 3 PCR-RFLP типом гена ПА. Наиболее редкими являются 5, 6 и 7 PCR-RFLP типы гена ПА 5 PCR-RFLP тип гена ПА выявлен у трех штаммов В anthracis, выделенных из материала от больных людей и почвы с места забоя MPC. 6 PCR-RFLP тип гена ПА имеют только два из 129 исследованных нами штаммов В anthracis, выделенные из крови больного и с места забоя КРС К 7 PCR-RFLP типу гена ПА относятся два штамма, выделенные из материала от больных людей во время двух практически одновременных вспышек сибирской язвы в Азербайджане в 1980 г Среди штаммов, выделенных из материала от животных, а так же из проб воды, смывов и соскобов встречаются 1,2,3 и 4 PCR-RFLP типы гена ПА, однако эти группы штаммов немногочисленны и частота встречаемости этих PCR-RFLP типов гена ПА практически одинакова

почва материал от материал от пробы воды, больных животных смывы и

соскобы

источник выделения

■ 1 D2a3@4B5fa6S7,

I -7 - разные ПА генотипы

Рисунок 2 Распределение РСК-КЖЬР типов гена ПА штаммов В. аМЛгаск по источнику выделения.

Таким образом, наиболее разнообразными по числу PCR-RFLP типов гена ПА являются штаммы, выделенные из почвы и из материала от больных и умерщих от сибирской язвы людей Редкие PCR-RFLP типы гена ПА - 5, 6 и 7 встречаются только у этих двух групп штаммов

PCR-RFLP-анализ ДНК гена ПА штаммов сибиреязвенного микроба показал, что наиболее высокая степень вариабельности, характеризующаяся наличием 7 разных PCR-RFLP типов гена ПА, присуща изолятам из разных вспышек инфекции Как показывает анализ данных, штаммы из одной вспышки могут иметь разные PCR-RFLP типы гена ПА, единственным исключением является вспышка в Кабардино-Балкарской Республике (КБР) в 1998, все штаммы из которой имеют одинаковый 4 PCR-RFLP тип гена ПА

Наиболее разнообразны по PCR-RFLP типу гена ПА штаммы, выделенные во время одной хорошо документированной вспышки в Карачаево-Черкесской Республике (КЧР) в 1992 г, продолжавшейся более месяца на территории одного района четыре PCR-RFLP типа гена ПА (1,2,3,6) у семи штаммов, и штаммы из вспышки в Ставропольском крае в 2004 г — три PCR-RFLP типа гена ПА (1,2,3) у семи штаммов В anthracis Для штаммов из КБР, представленным тремя вспышками, характерен в основном 4 PCR-RFLP тип гена ПА, только два штамма - 1169 и 1204 имеют 5 PCR-RFLP тип гена ПА Интересно отметить, что штаммы из Терского района КБР, происходящие из двух вспышек в 1998 и 1999 гг в одном и том же селе, относились к PCR-RFLP типам гена ПА 4 и 5, при этом все четыре выделенные в 1998 г штамма имели 4 тип гена ПА, а два штамма, выделенные в следующем году, принадлежали к 4 и 5 PCR-RFLP типам гена ПА, различающимся по наличию сайта рестрикции для эндонуклеазы Mfe I 4 PCR-RFLP тип гена ПА имеют практически все штаммы из Азербайджана, выделенные в 1980г У двух азербайджанских штаммов, выделенных из материала от больных, обнаружен 7 PCR-RFLP тип гена ПА Штаммы, выделенные во время вспышки сибирской язвы в Малгобекском районе Чечено-Ингушской АССР в 1968 г, относятся к 1, 2 и 3 PCR-RFLP типам гена ПА Два не связанных с этой вспышкой штамма В anthracis - 52/33 и 73/42 имеют 4 PCR-RFLP тип гена ПА, который, как и одинаковый MLVA-генотип, так же указывает на возможное общее происхождение этих штаммов

Штаммы В anthracis разного географического происхождения были менее разнообразны, чем выделенные в ходе отдельных вспышек и принадлежали к четырем PCR-RFLP типам гена ПА из семи При этом наиболее распространенным был генотип 1 обнаруженный у большинства штаммов (27 штаммов).

Среди вакцинных, акапсульных и атипичных по капсулообразованию штаммов, а так же их исходных вариантов, как и среди других групп штаммов В. anthracis преобладающим является 1 PCR-RFLP тип гена ПА, выявленный у большинства вакцинных штаммов, штаммов 12/16, 14/41 и их акапсульных и S-вариантов, ICO, 140П и 140Псар" У штаммов В anthracis СТИ и 228/2 отсутствовала амплификация фрагмента РА 953, что можно объяснить

мутацией одного или нескольких нуклеотидов в месте прикрепления одного из праймеров.

Для проверки предположения о высокой гетерогенности популяции штаммов по нуклеотидной последовательности гена pag, нами была проведена выборочная селекция трех штаммов В anthracis Селекция проводилась по признаку морфологии колоний У вариантов штаммов В anthracis 1020/11 (4 варианта), 1021/23 (5 вариантов) и Sterne (3 варианта), отобранных по морфологии колоний, было выявлено пять PCR-RFLP типов гена ПА Все четыре выделенных варианта штамма 1020/11 имеют разные PCR-RFLP типы гена ПА, исходный штамм 1020/11 имеет 3 PCR-RFLP тип гена ПА, которого нет ни у одного из выделенных вариантов У пяти вариантов штамма 1021/23 обнаружено два PCR-RFLP типа гена ПА - 1 и 2, исходный штамм относится к 1 типу гена ПА, от которого 2 тип гена ПА отличается по сайту рестрикции Mfe I. Таким образом, популяция любого штамма является гетерогенной по нуклеотидной последовательности гена ПА

Таким образом, при PCR-RFLP генотипировании гена ПА 116 штаммов В anthracis было выявлено 7 PCR-RFLP типов гена ПА, образующихся за счет комбинаций рестрикционных фрагментов разной величины, образующихся при действии эндонуклеаз Mfe I и PspE I на ампликон pag 67-68 и эндонуклеазы BstMC I на ампликон РА 953 Из 7 эндонуклеаз рестрикции, предварительно отобранных для проведения PCR-RFLP по гену протектив-ного антигена, было выбрано 3 фермента Mfe I, PspE I и BstMC I, комбинация которых оптимальна для индивидуального типирования штаммов внутри вспышки по гену ПА

Метод PCR-RFLP определения типа гена ПА может использоваться как альтернатива методу выявления полиморфизма единичных оснований, основанному на определении полной нуклеотидной последовательности

При определении MLVA-генотипа было обнаружено шесть новых полных генотипов и пять неполных MLVA-генотипов В anthracis

При анализе локуса vrrA 98 штаммов В anthracis нами было выяснено, что подавляющее большинство штаммов (78,6%) относятся к VNTRt категории, которая наиболее часто встречается как на территории стран бывшего СССР, так и во всем мире Географически VNTR4 категория распространена на всей территории Европейской части России, в Дагестане, РСО-Алания, Оренбургской, Ульяновской, Тамбовской, Липецкой, Самарской областях, Краснодарском крае, Башкирии так же в Молдове, Грузии, Узбекистане VNTR4 категорию имеют штаммы В anthracis, выделенные в ходе вспышек в Ставропольском крае (2004 г), Кабардино-Балкарской Республике (1994, 1998, 1999 гг ), Азербайджане (две вспышки в 1980 г ) Аллель 325 н п (VNTR5 категория) выявлен у штаммов В anthracis из Карачаево-Черкесской Республики (1992 г ) и Чечено-Ингушской АССР (1968 г) а так же штаммы из Тульской, Калужской, Волгоградской и Курской областей Эта группа включает штаммы, выделенные из самых разнообразных объектов материала от больных людей и животных, проб почвы, смывов с различных поверхностей Штаммы, имеющие VNTR5 категорию, хотя и встречаются достаточно редко

(5,6% по данным Jackson P.J et al 1997), но распространены практически повсеместно Один штамм,, выделенный от больного в Воронежской области, имел VNTR3 категорию Редкая для СНГ VNTR3 категория в мировой коллекции является второй по частоте встречаемости после VNTR4 Нами был обнаружен один штамм с не встречавшейся у нас ранее VNTR2 категорией Это штамм из Каракалпакии (Узбекистан), выделенный от трупа человека.

Штаммы из Курского района Ставропольского края имеют генотип 6N который отличается от 18 генотипа только по локусу vrrA, а от генотипа 25 — по локусу CG3 Оба генотипа (18 и 25) относятся к генетической ветви Al (Keim Р et al, 2000). Штаммы из КБР, выделенные в ходе трех вспышек, имеют одинаковые аллели шести хромосомных локусов, однако различные величины плазмидных локусов pXOlaat и pX02at выделяют штаммы из каждой вспышки в отдельный генотип 43, 14N и 36 Генотип 14N отличается от генотипа 43 величиной аллеля рХ02 at, а от генотипа 36 - величиной аштеля pXOlaat Штаммы из КЧР отличаются от широко распространенного на территории СНГ генотипа 17 (Цыганкова О И с соавт, 2003) только величиной локуса pXOlaat и относятся к генотипу 4N, описанному ранее Цыганковой О И. (2003). Штаммы из Азербайджана представлены двумя практически одновременными вспышками в Ждановском районе (конец августа 1980 г ) и Джульфинском районе (сентябрь 1980 г) Штаммы из Ждановского района имеют генотип 44 за исключением штамма 500/561, имеющего генотип 45, а штаммы из Джульфинского района имеют генотип 43 Генотипы 43,44 и 45 различаются только по локусу pXOl aat Штамм В anthracis 500/561, отличающейся от других штаммов из Ждановского района выделен от больного 11 августа 1980 г., и, по всей видимости, не связан с последовавшей в конце августа вспышкой Таким образом, генетический анализ штаммов В anthracis может эффективно разделить штаммы из близких территориально или по времени вспышек и выявить их однородность или различия Из 17 изученных Иркутских штаммов В anthracis только два - 283/3002 и 284/3028 имеют полный генотип 15N, так как остальные 15 штаммов лишены плазмиды рХ02. Генотип 15N близок к генотипу 12 ветви Ala, и отличается от него только величиной аллеля по локусу vrrC2 Остальные штаммы имеют одинаковые характеристики хромосомных локусов, но различаются между собой по локусу pXOl aat часть штаммов имеет аллель 135 п н, а часть -129 п н

Штаммы В anthracis, выделенные в 1968 г на территории Чечено-Ингушской АССР отличаются от 12 генотипа по локусу vrrA, а от генотипа 24 — по локусу CG3 и относятся к генотипу 6N Исключение составляют два штамма - 52/33 и 73/42, выделенные в других районах Чечено-Ингушской АССР в то же, время и имеющие генотип 35, который, по данным Цыганковой О И с соавт (2003), наряду с 17 генотипом наиболее часто встречается на территории Кавказа и Закавказья Среди штаммов из различных географических регионов встречаются как описанные ранее, так и новые генотипы Уникальным является штамм В.. anthracis 217/1, выделенный в Каракалпакии (Узбекистан) от трупа человека, поскольку является бесплазмидным штаммом Неизвестно, был ли этот штамм изначально бесплазмидным, или эли-

минация обеих плазм ид является результатом длительного хранения Этот штамм единственный известный к настоящему времени на территории России и стран СНГ относящийся к VNTR2 категории Генотип 17N, выявленный только у штамма В anthracis 427/618 из Калужской области, благодаря редкому аллелю рХ02 at - 139 п н близок к генотипам 70 и 72 ветви A4 Генотип 18N отличается от 12 генотипа только по локусу vrrB2, а от генотипа 24 — по локусу CG3 Оба генотипа — 12 и 24 относятся к ветви AI Генотип 19N обнаружен только у одного штамма -1207, выделенного в Курской области в 2000 г., и по генетическим характеристикам наиболее близок к генотипу 17N, от которого отличается только по локусу рХ02 at

Таким образом, большое генетической разнообразие штаммов В anthracis, выделенных на территории Кавказа и Закавказья по сравнению со штаммами, выделенными на Европейской территории бывшего СССР, можно объяснить тем, что исторически Кавказ являлся частью многих торговых путей и миграционных потоков, что могло способствовать проникновению штаммов возбудителя сибирской язвы с нехарактерным (отличающимся) генотипом на территорию Европейской части бывшего СССР

Для выявления генетического разнообразия и филогенетических связей штаммов В anthracis, выделенных в разных регионах стран СНГ нами для филогенетического анализа были взято 29 штаммов, выделенных в разных географических регионах, а так же по одному штамму из каждой изученной в данной работе вспышки, чтобы выяснить связь штаммов В anthracis, характерных для Северного Кавказа и Закавказья со штаммами из других регионов Дендрограмма, построенная на основе данных MLVA-генотипирования, представлена на рисунке 3

Так как все изученные нами штаммы В anthracis относятся к генетической ветви A (Keim Р et al., 2000), то обозначение филогенетических ветвей на рисунке 3 было дано произвольно, без соотнесения с генетическими кластерами (ветвями) внутри группы А, так как новые генотипы не могут быть отнесены к какой-то определенной ветви кластера А из-за частичного несовпадения значений некоторых локусов

Характер дендрограммы, построенной на основе анализа восьми полиморфных локусов с вариабельным числом тандемных повторов позволяет выявить наиболее различающиеся группы штаммов В anthracis Прикорневое деление штаммов на две основные ветви обусловлено наличием аллеля CG3158 (ветвь 1) или CG3153 (ветвь 2)

ЗВ2

Рисунок 3. Филогенетические связи штаммов В. anthracis, выделенных в разных регионах стран СНГ на основе MLVA-анализа.

Ветвь 1 включает штаммы, относящиеся к генетическому кластеру A3 .а (Keim Р. et al., 2000). Все штаммы В. anthracis, входящие в эту группу выделены на территории Северного Кавказа и Закавказья: в Дагестане, РСО-А, Грузии, Азербайджане, КБР, Чечено-Ингушской АССР. Деление ветви 1 на подтипы 1А и 1В происходит за счет различий в величине полиморфного ло-куса рХ02 at. Подтип 1А объединяет штаммы с генотипами 35, 43, 44, 45 которые различаются между собой величиной локуса pXOlaat, Все штаммы, относящиеся к группе 1 А, имеют аллель pX02at 141 п.н. В группу 1В входят штаммы из двух вспышек в Терском районе КБР в 1998 и 1999 гг.

Ветвь 2 более структурирована и многочисленна и включает штаммы из самых разных регионов: Ульяновской области, Северной Осетии, Узбекистана, Иркутска, Дагестана, Башкирии, Самарской области, Грузии, Липецкой области, Краснодарского края, Молдовы, Тамбовской, Тульской, Калужской и Оренбургской областей. Прикорневое деление штаммов на две основные ветви - 2А и 2В обусловлено принадлежностью к VNTR4 или VNTR, категории. Группа 2А более многочисленна и географически представлена наиболее широко, так как включает штаммы из Центральной России, Сибири и соседних стран: Молдовы, Грузии. Деление на кластеры внутри ветви 2А определяется принадлежностью к 126 п.н. (2А1) или 129 п.н. (2А2) аллелю pXOlaat. Ветвь 2А2, в свою очередь, делится на ряд более мелких групп, в

соответствии с принадлежностью к определенному аллелю по локусу pX02at

По другим хромосомным локусам не было обнаружено значительного генетического разнообразия- локусы vrrC¡, vrrB¡ и vrrB2 у всех изученных штаммов имели одинаковые аллели 613, 229 и 162 п н соответственно, за исключением штамма 217/1, имеющего аллель 538 п н. локуса vrrCi Как уже отмечалось ранее (Цыганкова О И с соавт. 2003, Еременко Е И. с соавт, 2002) именно значительно большее разнообразие аллелей плазмидных локу-сов pXOl aat и рХ02 at и их различные комбинации позволяют выделить множество генотипов у В anthracis В данном исследовании нам удалось обнаружить по 4 аллеля локусов pXOl aat и рХ02 at. Их комбинации между собой, а так же с различными величинами 6 хромосомных локусов позволили нам описать 6 новых генотипов На основании полученных данных можно сделать вывод, что наиболее типичной как для Северного Кавказа, так и для всей России и сопредельных стран (Молдовы, Грузии, Азербайджана, Узбекистана) является генетическая ветвь А, и в частности кластер АЗа (Keim Р et al, 2000), к которому относится большинство изученных нами штаммов

Кроме восьмилокусной системы генотипирования Keim Р et al (2000), нами была проведена оценка степени полиморфизма (PIC) хромосомных локусов Ceb-Bams (Le Fleche Р. et al., 2001) для выявления наиболее вариабельных локусов, пригодных для выявления генетического разнообразия между штаммами из одной вспышки или штаммами из двух одновременных вспышек на близлежащих территориях

Различные комбинации 12 исследованных локусов Ceb-Bams позволяют выделить 10 СВ генотипов Из 12 локусов Ceb-Bams треть (четыре локуса) для всех исследованных штаммов имеет одинаковую величину аллеля По шести локусам Ceb-Bams (1, 3, 5,13,22,23, 53) обнаружены по два аллеля По локусу Ceb-Bams 53 аллель 212 п н встречается только у двух штаммов из разных мест По локусу Ceb-Bams 5 аллель 307 п н встречается только у двух штаммов из разных вспышек, разделенных и во времени, и территориально Только по одному локусу - Ceb-Bams 13 выявленыо три разных аллеля

Нами был определен индекс вариабельности (PIC) для локусов, используемых при генотипировании методом MLVA-анализа Keim Р. et al (2000) и по системе Le Fleche et al (2001) (локусы Ceb-Bams). Эти данные представлены в таблице 2

Таблица 2 Индекс вариабельности полиморфных локусов (PIC) используемых для генотипирования штаммов В anthracis__

MI,VA- анализ (Keim et al., 2000) ML VA- анализ - полиморфные локусы Ceb-Bams

(Le Fleche et al 2001)

локус индекс вариабельности (PIC) локус индекс вариабельности (PIC)

vrrA 0.424 Ceb-Bams 1 0.4758

vrrCz 0.495 Ceb-Bams 3 О 3580

vrrCGj 0 495 Ceb-Bams 5 0.0581

pXOlat 0.646 Ceb-Bams 13 0.4758

pX02 aat 0.696 Ceb-Bams 22 0.3580

Ceb-Bams 23 0.390

Ceb-Bams 30 0.5322

Ceb-Bams 53 0.0581

Из таблицы 2 видно, что хромосомные локусы, используемые в обеих системах генотипирования, имеют практически одинаковый индекс вариабельности, не превышающей значения 0 5 (кроме локуса Ceb-Bams 30), в то время как вариабельные плазмидные локусы характеризуются более высоким значением PIC Генетическая стабильность шести хромосомных локусов в сочетании с высокой вариабельностью двух плазмидных локусов обеспечивают высокую дискриминационную способность системы генотипирования Keim Р et al, (2000) и указывает на определенную географическую приуроченность выделенных штаммов В anthracis О большей разрешающей способности этой системы свидетельствует и величина генетической дистанции 0 005 против 0 02 для локусов Ceb-Bams, используемая при филогенетическом анализе штаммов Однако, полиморфные хромосомные локусы начинают играть ведущую роль при изучении штаммов, лишенных одной или обеих плазмид вирулентности

Локусы Ceb-Bams следует использовать при создании полного генетического паспорта штаммов, однако в качестве быстрого и надежного метода дискриминации штаммов они не пригодны еще и из-за значительной трудоемкости и длительности данного метода генотипирования Если схема генотипирования Keim Р et al, (2000) была успешно модифицирована для амплификации всего в трех реакционных смесях Еременко Е И с соавт (2000) при одном режиме амплификации, то большинство локусов Ceb-Bams ам-плифицируются в отдельных реакционных смесях по разным программам амплификации Опробованные нами смеси для одновременного амплифици-рования нескольких локусов Ceb-Bams позволяют несколько упростить и ускорить генотипирование, однако, невозможность использования одной программы для амплификации большинства локусов Ceb-Bams по-прежнему не позволяет использовать данную систему в качестве быстрого метода генотипирования

Сочетание ML VA и PCR-RFLP-анализа может, в отличие от одного MLVA, обеспечивать разделение штаммов из одной вспышки и из одного географического региона на группы При этом можно получить предварительную характеристику вспышки, в частности, представление о ее эпизоотической интенсивности, частоте трансмиссии возбудителя между вовлеченными во вспышку животными

Одновременное использование многолокусной системы генотипирова-ния Keim Р et al., (2000), выделяющей крупные генетические группы (генотипы) и высокополиморфных SNR-локусов, обладающих уникальными практически для каждого штамма характеристиками, позволяет более эффективно проводить генетический анализ штаммов В anthracis и прослеживать их изменчивость в ходе вспышки при действии различных условий (выделение из разных объектов, пассирование через организм больных людей и животных, выделение штаммов из объектов, подвергшихся дезинфекции)

При ускоренном генотипировании штаммов наиболее целесообразным, по нашему мнению, является использование MLVA-системы Keim et al (2000), определение типа гена ПА методом PCR-RFLP анализа и вариабельного хромосомного локуса 16А ch, который способен одновременно различать штаммы внутри вспышки и объединять штаммы из одной вспышки по близким значениям данного аллеля

Исходя из этого, мы объединили в одну схему MLVA анализ и SNR-локус 16 А ch Результат такого анализа представлен в виде дендрограммы на рисунке 4

1255 J-1® 1256 |—в 1257 —f—Ш? 1260

| r * 1258 ■Ч* 1259 1® 1261 i 1168

1169

1170 473/634 477/616 487/633 464/617 462/471 492/497 505/628 474/635

j1*' 1182 J>r 1185 1183 l— W 1184

CW 1203 T 1204

_| m 52/33

-1 ■ 73/42

-Ф 500/561

r- ' 490/563 1— # 491/558 H r- ♦ 476/539 4j * 484/551 ' . 499/558 , 1020/11 I 1027/207 I® 1025/131 J* 1029/211 _fl 9 1021/23 П,* 1030/213 4» 1038/311

i. И 46/27 . И 47/28 , Я 48/29 I Я 51/32 , ■ 50/31 I % 54/35 ■ Я 49/30

Рисунок 4. Филогенетический анализ штаммов В. ипЛгасЬ по вспышкам с использованием восьми локусов МЬУА и вариабельного локуса 16А с!ь

Как видно из данной дендрограммы, SNR-локус !6А ch способен одновременно различать штаммы внутри вспышки и объединять штаммы из одной вспышки по близким значениям данного аллеля.

Исходя из полученных результатов, наиболее целесообразным методическим подходом к генотипированию представляется использование для предварительного исследования штаммов системы MLVA Keim et al. (2000) в сочетании с PCR-RFLP-анализом гена ПА или с анализом вариабельного хромосомного локуса 16А ch. Эти методики предоставляет возможность разделить генотипы штаммов из одной вспышки на групповые подтипы.

Для получения индивидуальной характеристики штаммов из одной вспышки следует использовать сочетание MLVA по Keim Р. et al. (2000) с анализом трех SNR-локусов.

Таким образом, разработанный методический подход к генетическому типированию сибиреязвенного микроба, основанный на сочетанном анализе маркеров MLVA, PCR-RFLP и SNR в нашей модификации, дает возможность сравнивать как штаммы, выделенные в разных географических регионах, так и дифференцировать изоляты из нескольких и даже одной вспышки сибиреязвенной инфекции.

выводы

1 В результате поиска in silico в геноме В anthracis выявлено по три потенциально вариабельных области с тандемными повторами и единичными повторами нуклеотидов Сконструированные праймеры к этим областям и оптимизированные параметры амплификации в ПЦР выявили разную степень их вариабельности

2. Показано, что VNTR- локус РХ 3-4 имеет два отличающихся ал-лельных варианта, присущих штаммам сибиреязвенного микроба с разной фенотипической экспрессией комплекса ассоциированных с вирулентностью признаков Локус VNTR 39, находящийся в области гена адгезивного колла-генового белка у одних штаммов и в области псевдогена или межгенной области у других штаммов бацилл группы Bacillus cereus, имеет не менее четырех аллелей Вариабельность этого локуса может влиять на характер адгезии у разных штаммов

3 Три локуса с единичными нуклеотидными повторами имеют высокую степень индивидуальной генетической вариабельности у штаммов В anthracis. Индекс вариабельности Pic для обеих групп штаммов практически одинаков, и составляет 0,864 дня штаммов по вспышкам и 0,860 для штаммов из разных регионов Величина Pic РХ F-R для штаммов из группы, сформированной по вспышкам, составляет 0,7758, а для штаммов из разных регионов - 0,7970 Индекс вариабельности Pic локуса 16А ch для штаммов по вспышкам близок к единице и составляет 0,984, а для штаммов из разных регионов - 0,820.

4 Установлено, что эндонуклеазы Mfe I, PspE 1, BstMC I имеют по одному сайту рестрикции в пределах последовательности гена ПА Сконструированные праймеры к двум фрагментам гена ПА и оптимизированные параметры реакций рестрикции и амплификации для этих эндонуклеаз обеспечивают проведение генотипирования штаммов методом PCR-RFLP

5 Разработанный метод PCR-RFLP анализа гена протективного антигена позволяет обнаруживать не менее семи типов среди штаммов сиби-

реязвенного микроба Метод отличается большей простотой и доступностью по сравнению с методом сравнительного определения полной нуклеотидной последовательности при аналогичной разрешающей способности

6 С использованием метода РС11-КРЬР показано, что чаще всего (49,5%) встречался 1 РСК-КРЬР тип гена ПА, присущий кал вирулентным изолятам разного географического происхождения, так и большинству вакцинных штаммов Ко второму по частоте встречаемости 4 РСК-ЛРЬР типу гена ПА, а также к редким 5 и 7 PCR.-R.FLP типам гена ПА принадлежали только штаммы, выделенные на Кавказе и в Закавказье Наиболее вариабельными по РСК-КРЬР типу гена ПА были штаммы, выделенные из почвы и из материала от больных и умерших от сибирской язвы людей Морфологические колониальные варианты одного и того же штамма имели 2-3 разных РСЫ-КРЬР типа гена ПА

7 МГУ А 8-ми вариабельных локусов выявил среди изученных штаммов шесть новых полных генотипов и пять неполных МЬУА-генотипов В аЫкгасьч. а также пять известных, но ранее не встречавшихся среди изоля-тов с территории СНГ генотипов.

8 Разработанный методический подход к генетическому тпирова-нию сибиреязвенного микроба, основанный на сочетанном анализе маркеров МГ УА, РСЯ-ИРГР и в нашей модификации, дает возможность сравнивать как штаммы, выделенные в разных географических регионах, так и дифференцировать изоляты го нескольких и даже одной вспышки сибиреязвенной инфекции В предлагаемом методическом подходе к генотипирова-нию В аЫкгаая МЪУА-генотип в сочетаннйх схемах позволяет выявить принадлежность к определенному географическому региону и сопоставить полученные данные с мировой коллекцией В аМЪгас1ъ Включение в схемы маркеров PCR-RFLP гена ПА и локуса 16А сЬ разделяет штаммы из одной вспышки, имеющие одинаковый МГУА генотип, на групповые подтипы, а маркеров трех вИК-локусов - на индивидуальные генотипы

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Цыганкова Е А , Еременко Е И, Цыганкова О И Разработка подхода к молекулярному типированию гена протективного антигена В anthracis // Сборник научных трудов, посвященный 75-летию НИИ Микробиологии МОРФ, Киров, 2003 г , с 128-130

2 Еременко Е И , Рязанова А Г , Цыганкова О И , Цыганкова Е А Ге-номика Bacillus anthracis // Генодиагностика инфекционных болезней Сборник трудов 5-ой Всероссийской научно-практической конференции, г Москва, 2004 г, с 172-175

3 Цыганкова Е А , Еременко Е И Обнаружение единичного нуклео-тидного повтора на плазмиде вирулентности рХ02 Bacillus anthracis П Естествознание и гуманизм Сборник научных работ т 2, №1, Томск, 2005, с 15

4 Рязанова А Г , Цыганкова Е А , Еременко Е И , Цыганкова О И Изучение генетической вариабельности атипичных штаммов Bacillus anthracis // Санитарная охрана территорий государств участников Содружества независимых государств проблемы биологической безопасности и противодействия терроризму в современных условиях Материалы VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ Волгоград, 2005, с 183-185

5 Цыганкова Е А , Еременко Е И, Цыганкова О И VNTR -анализ штаммов Bacillus anthracis с использованием нового локуса плазмиды рХ02с вариабельным числом тандемных повторов // Санитарная охрана территорий государств участников Содружества независимых государств проблемы биологической безопасности и противодействия терроризму в современных условиях Материалы VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ Волгоград, 2005, с 197-198

6 Цыганкова О И , Еременко Е И, Цыганкова Е А Обнаружение и характеристика новых аллелей VNTR-локусов генома Bacillus anthracis И Санитарная охрана территорий государств участников Содружества независимых государств проблемы биологической безопасности и противодействия терроризму в современных условиях Материалы VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ Волгоград, 2005, с 198-199

7 Цыганкова О И , Еременко Е И , Цыганкова Е А , Рязанова А Г Сравнительная характеристика субкультур штамма Bacillus anthracis 1(СО) методом анализа хромосомных полиморфных локусов с вариабельным числом тандемных повторов // Санитарная охрана территорий государств участников Содружества независимых государств проблемы биологической безопасности и противодействия терроризму в современных условиях Материалы VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ Волгоград, 2005, с 199-201

8 Яцышина С Б , Цыганкова О И , Астахова Т С , Еременко Е И , Обухов И Л , Шипулин ГА , Цыганкова Е А., Рязанова А Г Разработка мультип-

лексной тест-системы для идентификации Bacillus anthracis II Санитарная охрана территорий государств участников Содружества независимых государств проблемы биологической безопасности и противодействия терроризму в современных условиях Материалы VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ Волгоград, 2005, с 305-307

9 Цыганкова О И , Еременко Е И, Рязанова А Г , Цыганкова Е А. Мультиплексная амплификационная тест-система для идентификации и дифференциации Bacillus anthracis // ЖМЭИ№3 2005, с 69-74

10. Цыганкова Е.А «Методы генетического типирования Bacillus anthracis» И Деп в ВИНИТИ 17 12 2004 № 2023-В 2004 с 66

11 Цыганкова О И, Еременко Е.И , Рязанова А.Г., Цыганкова Е А Мультиплексная амплификационная тест-система для идентификации штаммов Bacillus anthracis и оценки их генетического потенциала патогенности // ж Эпидемиология и инфекционные болезни № 1 2006, с 24-28

12. Еременко Е.И, Цыганкова О И, Рязанова А Г, Цыганкова Е А Прорастание спор сибиреязвенного микроба // ЖМЭИ №1 2006, с 72-74

13. Цыганкова Е А, Еременко Е И Молекулярное типирование штаммов Bacillus anthracis и эпидемиологический анализ // Фундаментальные исследования в биологии и медицине Сборник научных трудов Ставрополь 2006 С 186-189

14 Еременко Е И, Цыганкова О И., Брюханов А Ф., Рязанова А Г., Цыганкова Е А., Аксенова Л.Ю Анализ молекулярного разнообразия Bacillus anthracis //Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств Материалы VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ Протвино А-ПРИНТ ЗАО, 2006 С-100-101.

15. Рязанова А Г, Еременко Е.И, Цыганкова О И, Цыганкова Е А Использование метода многолокусного анализа регионов генома с вариабельным числом тандемных повторов (MLVA) для идентификации атипичных штаммов сибиреязного микроба и дифференциации от близкородственных бацилл // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств Материалы VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ Протвино А-ПРИНТ ЗАО, 2006 С - 121-122

16 Цыганкова Е А Новый вариабельный тандемный повтор в области гена адгезивного коллагенового белка Bacillus anthracis //Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств. Материалы VU Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. Протвино А-ПРИНТ ЗАО, 2006 С -124-125.

17 Цыганкова Е.А , Еременко Е И, Цыганкова О И Генетическое разнообразие локуса vrrA у штаммов Bacillus anthracis, выделенных на территории стран СНГ //Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств Материалы УП Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ Протвино А-ПРИНТ ЗАО, 2006 С - 125-127

18 Цыганкова ОИ, Еременко ЕИ, Цыганкова ЕА, Рязанова А Г Особенности фенотипических свойств и генотипов вариантов Bacillus ап-lhracis/14резвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств Материалы УП Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ Протвино А-ПРИНТ ЗАО, 2006 С - 128-129

19 Буравцева Н П , Еременко Е И, Цыганкова Е А, Мезенцев В М, Чимидова Н М , Манджиева К Л , Еременко Е И , Цыганкова Е А , Каляева Т Б , Подсвиров А В Эпизоотолого-эпидемиологическое районирование территории Калмыкии по сибирской язве // Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России Материалы научно-практической конференции - Ставрополь, 2007 -Часть I - С. 56-59

20 Еременко Е И , Цыганкова О И , Цыганкова Е А., Рязанова А Г Молекулярное разнообразие природных штаммов и лабораторных вариантов Bacillus anthracis II Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России- Материалы научно-практической конференции - Ставрополь, 2007 - Часть I - С 119

21. Цыганкова Е А Генетическое типирование штаммов сибиреязвенного микроба // Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России Материалы научно-практической конференции - Ставрополь, 2007 - Часть П - С 161-168

22 Цыганкова О И, Цыганкова Е А , Еременко Е И Видоспецифиче-ские праймеры к гену plcR Bacillus anthracis П Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России Материалы научно-практической конференции - Ставрополь, 2007 - Часть П - С 169-171

Подписано в печать 05 10 2007 г Тираж 100 экз

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии издательско-полиграфического комплекса «АГРУС». 355017 г Ставрополь, ул Мира, 302

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Цыганкова, Елена Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Геном В.аШкгаЫя и современные методы его изучения.

1.1. Характеристика генома сибиреязвенного микроба.

1.2. Методы генетического типирования В. аШкгаЫя и молекулярное разнообразие штаммов.

1.3. Теоретические и практические аспекты генетического типирования возбудителя сибирской язвы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Бактериальные штаммы.

2.1.2. Реактивы и питательные среды.

2.1.3. Лабораторное оборудование.

2.1.4. Программное обеспечение.

2.2. Методы.

2.2.1. Фенотипические свойства штаммов.

2.2.2. Приготовление проб ДНК.

2.2.3. Метод отбора колониально-морфологических вариантов штаммов

В. аЫкгаш.

2.2.4.Метод анализа нуклеотидной последовательности гена ПА.

2.2.5. Метод рестрикционного анализа.

2.2.6. Метод выявления областей генома с тандемными повторами.

2.2.7. Метод многолокусного анализа областей генома

2.2.8. Методы статистической обработки материала.

ГЛАВА 3. ОБНАРУЖЕНИЕ И АНАЛИЗ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ОБЛАСТЕЙ ГЕНОМА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА С ТАНДЕМНЫМИ И ЕДИНИЧНЫМИ НУКЛЕОТИДНЫМИ ПОВТОРАМИ.

3.1. Поиск областей с тандемными повторами в геноме В.аЫкгаш.

3.2 Идентификация и анализ новых УШИ-локусов в геноме В.апШгаЫБ.

3.3. Поиск и анализ областей генома В. агйЬгасгъ с единичными нуклеотидными повторами.

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДА АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА ДЛИНЫ АМПЛИФИКАЦИОННО-РЕСТРИКЦИОННЫХ ФРАГМЕНТОВ ГЕНА ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА В. АШНЯАСШ.

4.1 Анализ т яШсо полиморфизма единичных нуклеотидных повторов в гене ПА сибиреязвеннного микроба.

4.2 Подбор эндонуклеаз с сайтами рестрикции в пределах гена ПА и условий ПЦР с праймерами к области этого гена сибиреязвенного микроба.

4.3 Оптимизация набора эндонуклеаз и условий рестрикции для РСЯ-ИТЕР-анализа гена ПА и анализ полученных результатов.

4.4. Распределение РСЯ-КБЬР- типов гена ПА по источнику выделения и географическим регионам.

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКОГО ПОДХОДА К ГЕНО

ТИПИРОВАНИЮ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА, ОСНОВАННОГО

НА СОЧЕТАННОМ ПРИМЕНЕНИИ MLVA, SNR, PCR-RFLP АНАЛИЗА ГЕНА ПА И ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ МЕТОДОВ.

5.1. Генотипирование штаммов В. anthracis с использованием MLVA.

5.2. Использование MLVA в сочетании с PCR-RFLP-анализом гена ПА.

5.3. Использование SNR-локусов для выявления дополнительного генетического разнообразия.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методического подхода к генетическому типированию штаммов сибиреязвенного микроба"

Актуальность проблемы

Сибирская язва в настоящее время продолжает оставаться проблемой для здравоохранения и ветеринарии. Даже в высокоразвитых странах имеют место разлитые эпизоотии этой инфекции. Примером может служить небывалая по масштабам эпизоотия сибирской язвы среди сельскохозяйственных и диких травоядных животных на сопредельных территориях США и Канады летом и осенью 2006 г. (Nishi J. S. et al., 2007). Вспышки заболеваемости людей, связаны с эпизоотиями и носят спорадический характер. Тем не менее, они всегда сопряжены с проведением большого объема диагностических, терапевтических, противоэпидемических, профилактических мероприятий. Запоздалая и ошибочная диагностика сибирской язвы у людей нередко влечет за собой неадекватную терапию, чреватую летальными исходами, особенно при осложненной кожной, кишечной и висцеральной формах заболевания.

Проблема сибирской язвы вряд ли будет окончательно решена в связи с существованием стационарно-неблагополучных пунктов, сопряженных с почвенными очагами инфекции, сохраняющимися неопределенно долго. Только на территории России таких пунктов зарегистрировано более 35 ООО (Черкасский Б.Д., 1969; Онищенко Г.Г. с соавт., 1999; Черкасский Б.Д., 2003). Чрезвычайная устойчивость спор Bacillus anthracis, выживающих во внешней среде десятилетиями без утраты вирулентности, обеспечивает потенциал новых эпизоотий, возможность распространения возбудителя за пределы эпизоотического очага с инфицированными продуктами животноводства и заболевания людей. Возросшая в современных условиях мобильность населения и расширяющиеся торгово-экономические связи определяют повышенный риск завоза возбудителя из неблагополучных областей с импортируемыми продуктами.

В последние годы заявил о себе новый аспект проблемы - использование возбудителя сибирской язвы в качестве средства биологического терроризма (Черкасский Б.Л., 2004; Frischknecht F. et al., 2003). Вдыхание спор сибиреязвенного микроба в таких случаях, как и при военном применении, ведет к развитию у жертв ингаляционной формы инфекции, отличающейся тяжелым течением и частыми летальными исходами.

Весьма важным вопросом, который в числе прочих необходимо решать всякий раз при возникновении вспышек сибирской язвы, как природного характера, так и вызванных преднамеренным использованием спор В. anthracis в качестве поражающего агента, является вопрос о происхождении и путях распространения возбудителя. Неоценимым для его практического решения становится подход, основанный на генетическом типировании возбудителя. В частности, при расследовании вспышки сибирской язвы вследствие террористического акта в США в 2001 г., были использованы разработанные там же методы многолокусного анализа областей генома с вариабельным числом тандемных повторов (MLVA) (Keim P. et al., 2000) и секве-нирования гена протективного антигена (ПА) (Price L. et al., 1999; Hoffmaster A. et al., 2002). Эти методы позволили проследить связь случаев инфекции между собой и местом заражения, а также отличить культуры, не относящиеся к этой вспышке. Однако выявить генетическую вариабельность штаммов, выделенных в ходе одной вспышки, а также у вариантов одного и того же штамма дал возможность только полный сиквенс геномов (Read T. et al., 2002).

Применение ML VA в сочетании с филогенетическим анализом дало возможность обнаружить закономерное географическое распределение генотипов штаммов сибиреязвенного микроба и различия в степени генетического родства между ними (Еременко Е.И. с соавт., 2000; Keim P. et al., 2000; Fasanella A. et al., 2001; Le Flech P. et al., 2001; Wang B. et al., 2001, Maho A. et al., 2006). Необходимо отметить, что ML VA в оригинальном варианте и тем более секвенационное типирование требует дорогостоящего оборудования и реактивов, которыми в настоящее время в Российской Федерации располагает очень ограниченный круг ведущих научно-исследовательских учреждений. У нас в стране предложена более доступная модификация ML VA, с использованием которой оценена генетическая вариабельность штаммов B.anthracis, выделенных в СНГ (Еременко Е.И. с соавт., 2000, Цыганкова О.И. с соавт., 2003). Однако до настоящего времени не разработаны практически применимые методические подходы и методы, позволяющие исследовать как географические и филогенетические связи изолятов сибиреязвенного микроба, так и дифференцировать штаммы, выделенные в ходе отдельных вспышек сибирской язвы и внутри каждой из таких вспышек. Отсутствует? метод анализа полиморфизма длины амплификационно-рестрикционных \ фрагментов (PCR-RFLP-анализ) гена протективного антигена (ПА) сибире- ( язвенного микроба, который мог бы стать доступной альтернативой секвена-ционному типированию этого гена. Весьма информативным может быть i также анализ вариабельности единичных нуклеотидных повторов (SNR), ко- ^ торому посвящены лишь отдельные работы (van Belkum A. et al., 1998; Keim P. et al., 2004; Diamant E. et al., 2004; Read T. et al., 2002; Muscillo M. et al., ( 2005; Stratilo Ch. et al., 2006).

Таким образом, исследования, направленные на поиск практически приемлемого методического подхода к генетическому типированию сибиреязвенного микроба, представляются актуальными.

Цель исследования - разработка методического подхода к генетическому типированию сибиреязвенного микроба, основанного на сочетании ML VA, SNR- и PCR- RFLP - анализа. Задачи исследования:

1. Провести поиск потенциально вариабельных тандемных и единичных нуклеотидных повторов в геноме B.anthracis. Сконструировать прай-меры к обнаруженным областям с тандемными и единичными нуклео-тидными повторами и оптимизировать параметры амплификации с ними в ПЦР для VNTR- и SNR-анализа.

2. Изучить вариабельность выявленных областей генома различных штаммов возбудителя сибирской язвы.

3. Подобрать эндонуклеазы, имеющие сайты узнавания и рестрикции в пределах гена протективного антигена сибиреязвенного микроба. Подобрать праймеры для амплификации областей гена протективного антигена и последующего рестрикционного анализа.

4. Разработать метод анализа полиморфизма длины амплификационно-рестрикционных фрагментов (PCR-RFLP- анализа) гена протективного антигена сибиреязвенного микроба.

5. Изучить вариабельность последовательностей гена ПА у штаммов сибиреязвенного микроба и морфологических колониальных вариантов их популяций разработанным методом.

6. Разработать методический подход к генотипированию B.anthracis, основанный на сочетанном применении MLVA, SNR- и PCR- RFLP- анализа гена ПА.

7. Оценить возможности применения использованных методов генетического типирования для эпидемиологического анализа штаммов возбудителя сибирской язвы разного географического происхождения, а также выделенных в ходе отдельных вспышек сибиреязвенной инфекции.

Научная новизна. Для генетического типирования сибиреязвенного микроба сконструированы оригинальные праймеры: PX3f/PX4r, 39VNTRchf/39VNTRchr и 196chr/196chf к вариабельным плазмидным и хромосомным областям генома; 16Achf/16Achr, polyAf/polyAr и PXf/PXr к SNR-областям генома; PA 953f/PA 953г и PA800f/PA800r к гену ПА.

Подобраны оптимальный набор эндонуклеаз и условия реакций рестрикции, проведения обычной и мультиплексной ПЦР для VNTR-, SNR- и PCR-RFLP-анализа. Впервые обнаружена генетическая вариабельность плаз-мидной VNTR-области РХЗ-4, ассоциированная с фенотипической вариабельностью штаммов, отличающихся по комплексу биохимических и патогенных свойств. Впервые обнаружена генетическая вариабельность хромосомного локуса 39VNTRch, расположенного в пределах гена, кодирующего синтез коллагенового адгезивного белка B.anthracis. Впервые разработан метод PCR-RFLP анализа гена ПА сибиреязвенного микроба. Впервые выявлена высокая вариабельность полиадениновых областей генома и PCR-RFLP типов гена ПА штаммов, выделенных в ходе одной вспышки сибирской язвы, а также вариантов штаммов, имеющих идентичный ML VA-генотип. Впервые идентифицировано шесть новых, а также пять известных, но не встречавшихся ранее ML VA-генотипов среди штаммов, выделенных на территории СНГ. Разработан методический подход к генетическому типированию сибиреязвенного микроба, основанный на сочетанном анализе маркеров MLVA, PCR-RFLP и SNR в нашей модификации, позволяющий дифференцировать штаммы разного географического происхождения, а также группы изолятов и отдельные штаммы, выделенные во время вспышек сибиреязвенной инфекции.

Научно-практическая значимость. Разработанные методы генетического типирования используются в лаборатории сибирской язвы ФГУЗ СтавНИПЧИ для анализа музейных, вновь поступивших для идентификации и выделенных из исследуемого материала штаммов возбудителя сибирской язвы. Полученные в результате исследования новые генетические характеристики штаммов дополнили данные, имеющиеся в компьютерной базе данных «Штаммы Bacillus anthracis».

Материалы диссертационной работы вошли в следующие методические документы, утвержденные на учрежденческом уровне: «Методические рекомендации по комплексной оценке фенотипических признаков (гемолитической, протеолитической, лецитиназной и пигментсинтезирующий активностей, способности штаммами/изолятами продуцировать капсулу и токсин in vitro) культур Bacillus anthracis», рекомендованные на заседании секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН академиком И.А. Бакуловым 28 мая 2004 г., протокол секции №2 и утвержденные директором СтавНИПЧИ профессором Ефременко В.И. [протокол заседания Ученого совета № 9 от 21 октября 2004 г.]. «Молекулярное типирование штаммов сибиреязвенного микроба на основе вариабельности нуклеотидных последовательностей гена протективного антигена», утвержденные директором СтавНИПЧИ профессором Ефременко В.И. [протокол заседания Ученого совета № 5 от 27 мая 2005 г.]. «Методические рекомендации по межвидовой и внутривидовой дифференциации группы бацилл, включающих В. аМЬгаЫй», утвержденные директором СтавНИПЧИ профессором Ефременко В.И. [протокол заседания Ученого совета № 5 от 27 мая 2005 г.]. «Методические рекомендации по филогенетическому анализу штаммов микроорганизмов» утвержденные директором СтавНИПЧИ профессором Ефременко В.И. [протокол заседания Ученого совета № 5 от 27 мая 2005 г.]. Учебно-методическое пособие «Теоретические основы и практические аспекты полимеразной цепной реакции», утверждено директором СтавНИПЧИ профессором Ефременко В.И. [протокол заседания Ученого совета № 5 от 27 мая 2005 г.].

Материалы диссертации вошли в заключительный отчет по НИР СтавНИПЧИ «Изучение фенотипической и генетической вариабельности штаммов сибиреязвенного микроба» № ГР 02.200.109091.

Материалы диссертации включены в лекционный материал, предназначенный для врачей, биологов и лаборантов учреждений санитарно-эпидемиологического профиля и клинических диагностических лабораторий при проведении первичной специализации и курсов усовершенствования по вопросам специфической индикации и лабораторной диагностики особо опасных заболеваний.

Положения, выносимые на защиту: 1. Локус с вариабельным числом тандемных повторов РХ 3-4 в межгенной области плазмиды рХ02 В. аМкгаЫБ имеет два аллельных варианта, присущих штаммам сибиреязвенного микроба с разной фенотипической экспрессией комплекса ассоциированных с вирулентностью признаков.

2. Анализ трех областей генома, содержащих единичные нуклеотидные повторы, позволяет выявить высокую степень индивидуальной генетической варибельности у штаммов В. аШкгаш.

3. РСК-И^ЬР-анализ гена ПА, основанный на амплификации двух фрагментов гена pag с последующей рестрикцией тремя эндонуклеазами, обнаруживает семь генотипов среди штаммов В. аМкгаш и их вариантов разного происхождения.

4. Методический подход к генотипированию штамов, основанный на со-четанном анализе маркеров МЬУА, РСЯ-КРЬР и 8М1 в нашей модификации дает возможность одновременно дискриминировать штаммы, происходящие из разных вспышек сибирской язвы, объединяя штаммы из одной вспышки, и различать штаммы, выделенные в течение отдельной вспышки.

Апробация работы: материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции, посвященный 75-летию НИИ Микробиологии МО РФ (Киров, 2003), 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (г. Москва, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников Содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия терроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), научно-практической конференции «Фундаментальные исследования в биологии и медицине» (Ставрополь 2006), VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств». (Оболенск, 2006), научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 2007).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, из них 4 - в рецензируемых изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура и объем диссертации '

Работа изложена на 181 странице компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 251 работу, из них 17 отечественных и 234 - зарубежных авторов. Материалы иллюстрированы 20 рисунками и 24 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Цыганкова, Елена Анатольевна

ВЫВОДЫ

1. В результате поиска in silico в геноме B.anthracis выявлено по три потенциально вариабельных области с тандемными повторами и единичными повторами нуклеотидов. Сконструированные праймеры к этим областям и оптимизированные параметры амплификации в ПНР выявили разную степень их вариабельности.

2. Показано, что VNTR- локус РХ 3-4 имеет два отличающихся ал-лельных варианта, присущих штаммам сибиреязвенного микроба с разной фенотипической экспрессией комплекса ассоциированных с вирулентностью признаков. Локус VNTR 39, находящийся в области гена адгезивного колла-генового белка у одних штаммов и в области псевдогена или межгенной области у других штаммов бацилл группы Bacillus cereus, имеет не менее 4 аллелей. Вариабельность этого локуса может влиять на характер адгезии у разных штаммов.

3. Три локуса с единичными нуклеотидными повторами имеют высокую степень индивидуальной генетической вариабельности у штаммов B.anthracis. Индекс вариабельности Pic для обеих групп штаммов практически одинаков, и составляет 0,864 для штаммов по вспышкам и 0,860 для штаммов из разных регионов. Величина Pic РХ F-R для штаммов из группы, сформированной по вспышкам, составляет 0,7758, а для штаммов из разных регионов - 0,7970. Индекс вариабельности Pic локуса 16А ch для штаммов по вспышкам близок к единице и составляет 0,984, а для штаммов из разных регионов - 0,820.

4. Установлено, что эндонуклеазы Mfe I, PspE I, BstMC I имеют по одному сайту рестрикции в пределах последовательности гена ПА. Сконструированные праймеры к двум фрагментам гена ПА и оптимизированные параметры реакций рестрикции и амплификации для этих эндонуклеаз обеспечивают проведение генотипирования штаммов методом PCR-RFLP.

5. Разработанный метод PCR-RFLP-анализа гена протективного антигена позволяет обнаруживать не менее 7 PCR-RFLP типов гена ПА среди штаммов сибиреязвенного микроба. Метод отличается большей простотой и доступностью по сравнению с методом сравнительного определения полной нуклеотидной последовательности при аналогичной разрешающей способности.

6. С использованием метода РСК-ИГЬР показано, что чаще всего (49,5%) встречался 1 РСИ-КРЬР тип гена ПА, присущий как вирулентным изолятам разного географического происхождения, так и большинству вакцинных штаммов. Ко второму по частоте встречаемости 4 РСЯ-Ю^Р типу гена ПА, а также к редким типам 5 и 7 ПА принадлежали только штаммы, выделенные на Кавказе и в Закавказье. Наиболее вариабельными по РС11-ИРЬР типу гена ПА были штаммы, выделенные из почвы и из материала от больных и умерших от сибирской язвы людей. Морфологические колониальные варианты одного и того же штамма имели 2-3 разных РСЯ-Ю^Р типа гена ПА.

7. МЬУА 8-ми вариабельных локусов выявил среди изученных штаммов шесть новых полных генотипов и пять неполных МЬУА-генотипов В. агикгаЫБ, а также 5 известных, но ранее не встречавшихся среди изолятов с территории СНГ генотипов.

8. Разработанный методический подход к генетическому тпирова-нию сибиреязвенного микроба, основанный на сочетанном анализе маркеров МЬУА, РСК-ИРЬР и 8МЯ в нашей модификации, дает возможность сравнивать как штаммы, выделенные в разных географических регионах, так и дифференцировать изоляты из нескольких и даже одной вспышки сибиреязвенной инфекции. В предлагаемом методическом подходе к генотипирова-нию В.апЛгаЫз МЬУА-генотип в сочетанных схемах позволяет выявить принадлежность к определенному географическому региону и сопоставить полученные данные с мировой коллекцией В. апМгаш. Включение в схемы маркеров РСЛ-Ш^Р типа гена ПА и локуса 16А сЬ разделяет штаммы из одной вспышки, имеющие одинаковый МЬУА генотип, на групповые подтипы, а маркеров трех БЫК-локусов - на индивидуальные генотипы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Возбудитель сибирской язвы, B.anthracis, на протяжении долгого времени является объектом пристального внимания ученых. Важность его изучения обусловлена способностью спор B.anthracis длительно сохраняться в почвенных очагах, периодически вызывая вспышки сибирской язвы, а так же высокой вирулентностью и возможностью использования этого микроба в качестве биологического оружия в военных и террористических целях. В связи с этим особую важность приобретает не только совершенствование методов и средств диагностики, профилактики и лечения, но и разработка точных и эффективных методов генетического типирования возбудителя для определения источника происхождения штаммов B.anthracis, вызвавших вспышку сибирской язвы или использованных при террористическом акте.

В настоящее время наиболее распространен метод молекулярного типирования штаммов B.anthracis, основанный на анализе нескольких хромосомных и плазмидных локусов с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR- локусов), называемый ML VA (Keim P. et al., 2000; Le Fleche P. et al., 2001). В качестве дополнительных генетических маркеров при определении степени генетического родства штаммов используют предложенное L. Price et al., (1999) определение генотипа гена ПА в соответствии с полиморфизмом единичных нуклеотидов. Несмотря на высокую разрешающую способность данных систем генотипирования, они не способны различать штаммы, произошедшие из одного источника и имеющие одинаковый ML VA- и ПА- генотипы. Кроме того, используемые методы требуют наличия дорогостоящего оборудования для автоматического сиквенса и фрагментного анализа. В связи с этим, целесообразным может быть дополнение существующих схем генетического анализа штаммов B.anthracis маркерами единичных нуклеотид-ных повторов (SNR), которые проявляют высокую степень генетического полиморфизма (Цыганкова Е.А., Еременко Е.И., 2005, Muscillo М. et al., 2005, Stratilo Ch. et al., 2006), новыми VNTR-маркерами, а также замена определения SNP методом сиквенса на PCR-RFLP-анализ гена ПА. Решение этих задач позволило бы предложить приемлемый для нынешнего уровня оснащенности большинства лабораторий соответствующего профиля у нас в стране метод генетического типирования сибиреязвенного микроба.

Нами при анализе in silico полной нуклеотидной последовательности генома пяти штаммов B.anthracis удалось выявить три перспективные области на хромосоме и плазмиде рХ02, вариабельные по количеству аденинсо-держащих нуклеотидов. Мы разработали праймеры, состав реакционной смеси и подобрали программу амплификации выбранных фрагментов генома B.anthracis. Было проанализировано три SNR-локуса в геноме В. anthracis: два из них - Poly А и РХ F-R находятся на плазмиде рХ02, а один -16А ch -на хромосоме. Каждый локус анализировался по двум выборкам штаммов (из отдельных вспышек и из разных географических регионов). При исследовании SNR локуса Poly А среди группы штаммов В. anthracis, подобранных по вспышкам (46 штаммов, имеющих плазмиду рХ02), было выявлено 11 аллелей. В выборке из 29 штаммов В. anthracis из разных географических регионов (у четырех штаммов отсутствовала плазмида рХ02) идентифицировано 10 аллелей. Среди первой группы штаммов размер Poly А локуса колеблется в интервале от 314 п.н. (13 А) до 327 п.н. (26 А), а среди штаммов из различных географических регионов диапазон был значительно шире - от 321 п.н. (20 А) до 342 п.н. (41 А). Следует так же отметить, что если для территории Северного Кавказа и Закавказья (Ставропольсккий край, Кабардино-Балкарская Республика, Карачаево-Черкесская Республика, Чечено-Ингушская АССР, Азербайджан, Грузия) характерны аллели величиной менее 330 п.н., то для Центральной России (Воронежская, Оренбургская, Самарская, Ульяновская, Калужская, Липецкая области) характерны фрагменты Poly А большей величины: от 331 до 342 п.н. Индекс вариабельности Pic для обеих групп штаммов В. anthracis практически одинаков, и составляет 0,864 для штаммов по вспышкам и 0,860 для штаммов из разных регионов.

Для вариабельного SNR-локуса РХ F-R обнаружено 11 аллелей при исследовании 46 штаммов, изолированных в ходе отдельных вспышек и шесть аллелей для выборки штаммов из различных географических регионов. Среди штаммов В. anthracis, принадлежащих к разным вспышкам инфекции, наиболее часто встречается аллель 252 п.н. Аллель 252 п.н. характерен для штаммов из двух вспышек - в Ставропольском крае в 2004 г. и в Карачаево-Черкесской Республике в 1992 г., этот же аллель имеет большая часть (кроме двух) штаммов В. anthracis из Малгобекского района Чечено-Ингушской АССР. Остальные аллели данного локуса встречаются значительно реже и не привязаны к конкретной вспышке, кроме аллеля 258 п.н., который обнаружен у всех, кроме одного штамма из двух последовательных вспышек в Терском районе Кабардино-Балкарской Республики (1998, 1999). Величина Pic РХ F-R для штаммов В. anthracis из группы, сформированной по вспышкам, составляет 0,7758, а для штаммов из разных регионов - 0,7970.

Недостаток двух вышеописанных SNR-локусов заключается в том, что они не могут быть использованы при изучении штаммов В. anthracis, лишенных плазмиды рХ02.

Полиадениновый SNR-локус 16А ch расположен на хромосоме В. anthracis и поэтому присутствует у всех изученных штаммов. Этот локус оказался наиболее вариабельным из трех выявленных и изученных нами: для выборки штаммов по вспышкам выявлено 28 аллелей, а среди штаммов из разных регионов - 10. Всего для полиморфного локуса 16А ch было выявлено 32 аллеля. Индекс вариабельности Pic для штаммов В. anthracis из отдельных вспышек близок к единице и составляет 0,984, а для штаммов из разных регионов - 0,820. Заслуживает внимания не только высокая разрешающая способность данного локуса, но и то, что штаммы из одной вспышки имеют близкую величину области 16А ch, и отличаются от штаммов из других вспышек сибиреязвенной инфекции.

Проведенный нами анализ показал, что из трех изученных локусов оптимальным для использования при генотипировании штаммов В. anthracis на первоначальном этапе является локус 16А ch. Так как данный локус расположен на хромосоме, то его можно определять у всех, в том числе и у моно- и бесплазмидных штаммов. Локус 16А ch не только обладает высокой дискриминирующей способностью, но и позволяет объединять штаммы из одной вспышки в группы с близкими величинами данного SNR локуса. Нами подобран такой состав реакционной смеси для локуса 16 А ch, при котором можно проводить амплификацию по той же программе, что и MLVA-локусы системы Р. Keim et al., (2000), для одновременное определение MLVA -генотипа и величины аллеля локуса 16А ch.

Ни для одного из изученных локусов не было выявлено закономерности распределения по годам или в зависимости от источника выделения.

Проведенный анализ показал, что единичные нуклеотидные повторы обладают высокой разрешающей способностью при их использовании для генетического анализа и типирования штаммов В. anthracis. Значительное разнообразие аллелей каждого локуса и их комбинации, уникальные практически для каждого штамма, при дополнении существующих схем MLVA -генотипирования характеристикой данного локуса, позволяют добиться большой точности в определении степени генетического родства изучаемых штаммов.

Кроме SNR, на плазмиде вирулентности рХ02 было обнаружен вариабельный тандемный повтор, который, как показали наши исследования, является своеобразным «маркером атипичности», так как аллель 248 п.н. обнаруживается у типичных по фенотипическим и биохимическим признакам штаммов В. anthracis, а аллель 256 п.н. - у штаммов, отличающихся по одному или нескольким признакам от типичных. Величина аллеля РХ 3-4 коррелирует с MLVA-генотипом изучаемых штаммов: все атипичные штаммы, имеющие генотип 13N, имеют РХ 3-4 аллель 256 п.н. Повтор РХ 3-4 имеет более сложную структуру, нежели большинство VNTR, и состоит из двух областей с повторами размером 8 п.н., разделенных областью размером 105 п.н., при этом один из аллелей, не обнаруженный среди исследованных нами штаммов, но встречающийся среди полных сиквенсов штаммов B.anthracis в GenBank, имел удвоение сегмента из 4 повторов и разделяющей области.

Еще один вариабельный тандемный повтор 39VNTR ch, размером 39 п.н., обнаружен нами на хромосоме В. anthracis. При исследовании 116 штаммов В. anthracis и 13 видов близкородственных сапрофитов рода Bacillus (В. thuringiensis и B.cereus) были выявлены четыре аллеля данного локу-са: 478, 439, 400 и 283 п.н. Выявленный тандемный повтор имеется у В. anthracis, В. thuringiensis и B.cereus. В результате анализа in silico нами выявлено, что у ряда штаммов вариабельная область с повтором 39 VNTR приходится на межгенное пространство, а у других - на расположенный на том же участке ген, кодирующий синтез адгезивного коллагенового белка. Количество повторов у В. anthracis варьирует от пяти до семи, наиболее распространенным является аллель 400 п.н., содержащий шесть повторов. Ранее описана генетическая вариабельность, связанная с VNTR, в области, кодирующий коллагеноподобный белок филаментов экзоспориума В. anthracis, который определен так же как иммунодоминантный (Steichen С., et al., 2003). Было показано, что длина филаментов прямо связана с количеством повторов (Sylvestre P., et al 2003) Возможно, и число тандемных повторов локуса 39 VNTR ch может оказывать влияние на адгезивные свойства штаммов, а так же на их иммуногенность.

Еще одной группой генетических маркеров, способных выявлять меж-штаммовые различия, являются SNP (Price L. et al., 1999; Read T. et al., 2002)/

При анализе in silico полной нуклеотидной последовательности гена протективного антигена 16 штаммов В. anthracis, опубликованных на сайте GeneBank, нами были выявлены шесть SNP в пределах гена pag, для каждого из которых были подобранны эндонуклеазы рестрикции. На основании SNP нами была разработана схема генотипирования штаммов В. anthracis по гену протективного антигена методом PCR-RFLP анализа. Для амплификации гена pag были разработаны три пары праймеров и подобран режим амплификации таким образом, чтобы амплификация всех трех фрагментов происходила при одном режиме амплификации. Было проведено генотипирование 138 штаммов В. anthracis по PCR-RFLP типу гена протективного антигена. В ходе работы из семи эндонуклеаз для генотипирования штаммов В. anthracis по гену протективного антигена было отобрано три: Mfe I, PspE I, BstMC I. Разные комбинации фрагментов, образующихся при действии этих эндонуклеаз на ампликоны pag 67-68 (Mfe I и PspE I) и РА 953 (BstMC I) позволяют выделить среди штаммов В. anthracis семь PCR-RFLP типов гена ПА.

Наиболее разнообразными по числу PCR-RFLP типов гена ПА являются штаммы, выделенные из почвы и из материала от больных и умерших от сибирской язвы людей. Редкие PCR-RFLP типы гена ПА- 5, 6 и 7 встречаются только в этих двух группах штаммов.

Наиболее многочисленными и разнообразными по источнику выделения являются штаммы, относящиеся к 1 PCR-RFLP типу гена ПА (49,5%), выделенные из почвы с места прирезки и скотомогильников, материала от больных людей и животных, проб воды, смывов и соскобов с различных поверхностей. Вторую по частоте встречаемости группу составляют штаммы, относящиеся к 4 PCR-RFLP типу гена ПА (25%), распространенному исключительно на территории Кавказа и Закавказья, как и редкие 5, 6 и 7 типы гена ПА (кроме штамма В. anthracis 539/59, имеющего 6 PCR-RFLP тип гена ПА и выделенного в Волгоградской области).

Для проверки предположения о высокой гетерогенности популяции штаммов по нуклеотидной последовательности гена pag, нами была проведена выборочная селекция колониально-морфологических вариантов трех штаммов В. anthracis. Селекция проводилась по признаку морфологии колоний. У вариантов штаммов 1020/11 (четыре варианта), 1021/23 (пять вариантов) и Sterne (три варианта), отобранных по морфологии колоний, было выявлено пять генотипов ПА. Все четыре выделенных варианта штамма 1020/11 имеют разные PCR-RFLP типы гена ПА, исходный штамм 1020/11 имеет 3 PCR-RFLP тип гена ПА, которого нет ни у одного из выделенных вариантов. У пяти вариантов штамма 1021/23 обнаружено 2 PCR-RFLP типа гена ПА - 1 и 2, исходный штамм имеет генотип 1 ПА , от которого 2 генотип отличается по сайту рестрикции Mfe I. Таким образом, можно сделать вывод, что популяции многих штаммов является гетерогенной по нуклеотидной последовательности гена ПА.

При анализе локуса уггА 98 штаммов В. апОпгаыь нами было выяснено, что подавляющее большинство штаммов (78,6%) относятся к УЫТ!^ категории, которая наиболее часто встречается как на территории стран бывшего СССР, так и во всем мире. Географически УШТ^ категория распространена на всей территории Европейской части России: Дагестане, Республике Северной Осетии-Алании, Оренбургской, Ульяновской, Тамбовской, Липецкой, Самарской областях, Краснодарском крае, Башкирии а так же в Молдове, Грузии и Узбекистане. УШТ^ категорию имеют штаммы, выделенные в ходе вспышек в Ставропольском крае (2004 г.), Кабардино-Балкарской Республике (1994, 1998, 1999 гг.), Азербайджане (две вспышки в 1980 г.). Аллель 325 п.н. (УЫТК5 категория) выявлен у штаммов из Карачаево-Черкесской Республики (1992 г.) и Чечено-Ингушской АССР (1968 г) а так же у штаммов из Тульской, Калужской, Волгоградской и Курской областей.

Один штамм, выделенный от больного в Воронежской области, имел УМТЯз категорию. Редкая для СНГ УМТЯз категория в мировой коллекции является второй по частоте встречаемости после УШТ^. Нами был обнаружен один штамм с не встречавшейся у нас ранее УШИг категорией. Это штамм В. аШЬгаыь 217/1 из Каракалпакии (Узбекистан), выделенный от трупа человека.

По другим хромосомным локусам не было обнаружено значительного генетического разнообразия: локусы у/тС/, хггВ] и \ггВ2 у всех изученных штаммов имели одинаковые аллели 613, 229 и 162 п.н. соответственно, за исключением штамма В. ашЬгаыБ 217/1, имеющего аллель 538 п.н. локуса уггС]. Как уже отмечалось ранее (Еременко Е.И. и др., 2002; Цыганкова О.И. и др., 2003), именно значительно большее разнообразие аллелей плазмидных локусов рХ01аМ и рХ02м и их различные комбинации позволяют выделить множество генотипов у В. аЫЬгаыь. В данном исследовании нам удалось обнаружить по четыре аллеля локусов рХО\ааг и рХ02м. Их комбинации между собой, а так же с различными величинами 6 хромосомных локусов позволили нам описать шесть новых генотипов.

На основании анализа MLVA-генотипов штаммов В. anthracis из разных регионов России и стран СНГ можно сделать вывод, что наиболее типичной как для территории Северного Кавказа, так и для всей России и сопредельных стран (Молдовы, Грузии, Азербайджана, Узбекистана) является генетическая ветвь А, и в частности кластер АЗа (Keim Р. et al., 2000), к которому относится большинство изученных нами штаммов В. anthracis.

При сравнительном анализе дендрограмм, построенных на основе MLVA (8-ми локусный анализ Р. Keim et al., 2000 и вариабельных хромос-моных областей Ceb-Bams Р. Le Fleche et al., 2001), видно, что система гено-типирования более точно отражает реально существующие связи. Дендро-грамма, построенная на основании локусов Ceb-Bams имеет практически то же строение, что и дендрограмма, построенная с использованием данных MLVA-анализа по системе Keim Р. et al., однако, из-за отсутствия в системе Р. Le Fleche et al., плазмидных локусов, имеющих большую по сравнению с хромосомными степень вариабельности, она менее структурирована и не разделяет на отдельные подтипы штаммы из разных вспышек (Кабардино-Балкарская Республика, Азербайджан, Чечено-Ингушская АССР). Кроме того, одинаковое число тандемных повторов в каком-либо локусе Ceb-Bams (например, Ceb-Bams 5 или Ceb-Bams 53) может привести к искажению реально существующих связей между штаммами В. anthracis и неправильным выводам при эпидемиологическом расследовании. Генетическая стабильность хромосомных локусов в 8 MLVA системе в сочетании с высокой вариабельностью плазмидных локусов обеспечивают высокую дискриминирующую способность данной системы генотипирования. О большей разрешающей способности системы Р. Keim et al. свидетельствует и величина генетической дистанции 0,005 против 0,02 для локусов Ceb-Bams, т.е. в 4 раза.

Мы объединили данные по 8 локусам MLVA и 12 локусам Ceb-Bams. для того, чтобы проверить, насколько увеличится разрешающая способность филогенетического анализа при их совместном использовании. Дендрограм-ма, построенная с использованием обеих систем генотипирования, практически не отличается от дендрограммы, построенной с использованием данных только по 8 локусам MLVA. Единственным отличием является объединение неродственных штаммов В. anthracis 1255 и 492/497 на основании редкого аллеля 212 локуса Ceb-Bams 53. Однако следует отметить, что именно хромосомные локусы Ceb-Bams (Ceb-Bams 5) позволяют отделить штамм В. anthracis 462/471 из Нагорного Карабаха (Азербайджан) от штаммов из Джуль-финского района Азербайджана, имеющих такой же MLVA-генотип. Таким образом, можно сделать вывод о том, что MLVA система Р. Keim et al. эффективно разделяет штаммы в соответствии с мировой классификацией генотипов В. anthracis. В то же время, использование только этой MLVA-системы не всегда позволяет эффективно разделять штаммы, изолированные одновременно на близких территориях (Нагорных Карабах и Джульфинский район Азербайджана), что очень важно при расследовании случаев заболеваний сибирской язвы. На основании полученных данных мы считаем, что полиморфные хромосомные локусы Ceb-Bams Р. Le Fleche et al. следует использовать в дополнение к системе Р. Keim et al., (2000) при создании полного генетического паспорта штаммов, однако в качестве быстрого и надежного метода дискриминации штаммов они менее пригодны еще и из-за значительной трудоемкости и длительности данного метода генотипирования. Если система генотипирования Р. Keim et al., (2000) была успешно модифицирована Е.И. Еременко и др., (2001) для амплификации всего в 3 реакционных смесях при одном режиме амплификации, то большинство локусов Ceb-Bams ам-плифицируются в отдельных реакционных смесях по разным программам амплификации. Опробованные нами смеси для одновременного амплифици-рования нескольких локусов Ceb-Bams позволяют несколько упростить и ускорить генотипирование, однако большое количество локусов Ceb-Bams невозможность использования одной программы амплификации по-прежнему не позволяет использовать ее в качестве ускоренного метода генотипирова-ния.

Для выявления более тонких различий между штаммами В. anthracis, относящимися к одному MLVA генотипу целесообразно использовать маркеры PCR-RFLP- и SNR- анализов (Цыганкова Е.А., Еременко Е.И. 2005; Цыганкова Е.А., Еременко Е.И. 2006; Keim Р. et al., 2003; Muscillo М. et. al 2005). Информативность SNR характеристики заключается в способности выявлять различия у штаммов с идентичным MLVA генотипом. Анализ характеристик трех выявленных и изученных нами полиморфных SNR-локусов позволил выявить большее генетическое разнообразие В. anthracis. Дендрограмма, построенная на основании данных по 8 VNTR-локусам MLVA и 3 SNR-локусам показывает, что благодаря использованию SNR-локусов для генетического анализа внутри каждой вспышки удается выделить штаммы, различающиеся по величине SNR-локусов или их комбинациям.

Так, при использовании только MLVA схемы Р. Keim et al., (2000) штаммы В. anthracis из Баксанского района Кабардино-Балкарской Республики и Джульфинского района Азербайджана невозможно отличить друг от друга, так как они имеют одинаковый 43 MLVA-генотип. При включении в схему генотипирования SNR- локусов становится возможным разделение штаммов В. anthracis с одинаковым MLVA -генотипом: ветвь, включающая штаммы из Баксанского района Кабардино-Балкарской Республики и Джульфинского района Азербайждана делится на 2 группы: меньшую, куда входят штаммы из Баксанского района Кабардино-Балкарской Республики и примыкающие к ним из-за близких характеристик локусов РХ F-R и Poly А штаммы В. anthracis 505/628 и 473/634, и большую, включающую штаммы только из Джульфинского района Азербайджана.

Одновременное использование схемы генотипирования на основе MLVA, выделяющей более крупные генетические группы (генотипы) и высокополиморфных SNR-локусов, обладающих уникальными практически для каждого штамма характеристиками, позволяет более эффективно проводить генетический анализ штаммов В. anthracis и прослеживать их изменчивость в ходе вспышки сибирской язвы при действии различных условий (выделение из разных объектов, пассирование через организм больных людей и животных, выделение штаммов из объектов, подвергшихся дезинфекции).

При ускоренном генотипировании штаммов наиболее целесообразным, по нашему мнению, является использование MLVA-системы Р. Keim et al. (2000), определение типа гена ПА методом PCR-RFLP анализа и вариабельного хромосомного локуса 16А ch, который способен одновременно различать штаммы внутри вспышки и объединять штаммы из одной вспышки по близким значениям данного аллеля.

Для получения индивидуальной характеристики штаммов из одной вспышки следует использовать сочетание MLVA по Keim et al. (2000) с анализом трех SNR-локусов.

Таким образом, разработанный методический подход к генетическому тпированию сибиреязвенного микроба, основанный на сочетанном анализе маркеров MLVA, PCR-RFLP и SNR в нашей модификации, дает возможность сравнивать как штаммы, выделенные в разных географических регионах, так и дифференцировать изоляты из нескольких и даже одной вспышки сибиреязвенной инфекции

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Цыганкова, Елена Анатольевна, Саратов

1. Методические рекомендации «Использование многолокусной полиме-разной цепной реакции для идентификации штаммов В. anthracis и оценки их генетического потенциала патогенности» Цыганкова О.И., Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Брюханов А.Ф. (Ставрополь, 2002).

2. Манниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. -М.: Мир, 1984.- С. 480.

3. Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп при работе методом ПЦР: МУ 3.5.5. 1034-01. - Москва: Минздрав России, 2001. - С. 8.

4. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В. и др. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - С. 448.

5. Цыганкова О.И., Еременко Е.И., Брюханов А.Ф. и др. Генотипирова-ние штаммов сибиреязвенного микроба, изолированных на территории стран СНГ // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунол. 2003. - № 6. - Приложение. -С. 51-56.

6. Цыганкова Е.А., Еременко Е.И., Цыганкова О.И. Разработка подхода к молекулярному типированию гена протективного антигена В. anthracis // Сборник научных трудов, посвященный 75-летию НИИ Микробиологии МО РФ. Киров, 2003. - С. 128 - 130.

7. Цыганкова Е.А., Еременко Е.И. Обнаружение единичного нук-леотидного повтора на плазмиде вирулентности рХ02 Bacillus anthracis II Естествознание и гуманизм: Сборник научных работ. Томск, 2005. - Т.2, №1. -С. 15.

8. Цыганкова Е.А., Еременко Е.И. Молекулярное типирование штаммов Bacillus anthracis и эпидемиологический анализ // Фундаментальные исследования в биологии и медицине: Сборник научных трудов. Ставрополь 2006. - С. 186- 189.

9. Черкасский, Б.Л. Критерии оценки эпизоотологической и эпидемиологической активности стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов // Журн. микробиол. 1969. - № 1. - С. 132-136.

10. Черкасский, Б.Л. Эпидемиология и профилактика сибирской язвы. М.: «ИНТЕРСЭН», 2002. - 384 с.

11. Abravaya К., Carrino J. J., Muldoon S., Lee H.H. Detection of point mutations with a modified ligase chain reaction (Gap-LCR). // Nucleic Acids Res. -1995. -Vol. 23. № 4. - P. 675-682.

12. Agaisse H., Gominet M., Okstad O.A. et al. PlcR is pleotropic regulator of extracellular virulence factor gene expression in Bacillus thuringiensis II Mol. Microbiol. 1999. -Vol. 32. - № 5. - P. 1043-1053.

13. Ahmadian A., Gharizadeh В., Gustafsson A.C. et al. Single-nucleotide polymorphism analysis by pyrosequencing // Anal. Biochem. -2000. Vol.280.-№1.-P. 103-110.

14. Arber W. Promotion and limitation of genetic exchange // Science.- 1979.-Vol. 205.-P. 361-365.

15. Alland D., Whittam T.S., Murray M.B. et al. Modeling bacterial evolution with comparative-genome-based marker systems: application to Mycobacterium tuberculosis evolution and pathogenesis // J. Bacteriol. Jun 2003. - Vol. 185. -№11. -P. 3392-3399.

16. Andersen G.L., Simchock J.M., Wilson K.H. Identification of a region of genetic variability among Bacillus anthracis strains and related species // J.Bacteriol.-1996.-Vol. 178. P. 377-384.

17. Arguello J.R., Little A.-M., Pay A.L. et al. Mutation detection and typing of polymorphic loci through double strand conformation analysis // Nat. Genet.-1998.-Vol. 18.-P. 192-194.

18. Bartkus J.M., Leppla S.H. Transcriptional regulation of the protective antigen gene of Bacillus anthracis II Infect. Immun. 1989. - Vol. 57. - № 8. - P. 405408.

19. Botstein D., White R.L., Skolnik M., Davise R.W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms // Am. J. Hum. Genet. 1980. - Vol. 32. - №3. - P. 314-331.

20. Borgogne A., Drysdale M., Hilsenbeck S. et al. Global effects of virulence gene regulators in a Bacillus anthracis strain with both virulence plasmids // Infection and Immunity. May 2003. - Vol. 71. - №5. - P. 2736-2743.

21. Candela T., Mock M., Fouet A. Cap E, a 47 amino acid peptide, is necessary for Bacillus anthracis poly glutamate capsule synthesis // J. Bacteriol. Nov. 2005. - Vol.187. - №22. - P. 7765-7772.

22. Candela T., Fouet A. Bacillus anthracis CapD belonging to the gamma-glutamyltranspeptidase family is required for the covalent anchoring of capsule to peptidoglycan //Mol. Microbiol. Aug. 2005. - Vol.57. - №3. - P. 717-726.

23. Caskey, C. T., Pizzuti A., Fu Y. et al. Triplet repeats mutations in human disease // Science. 1992. - Vol.256. - P. 784-789.

24. Cataldi A., Labruyere E., Mock M. Constructions and characterization of a protective antigen deficient Bacillus anthracis strain // Mol. Microbiol. -1990. -V. 4. - №7. - P. 1111-1117.

25. Chang H.W., Yang C.H., Chang P.L. et al. SNP-RFLP restriction enzyme mining for SNPs in genomes // BMC Genomics 2006; 7:30.

26. Charlton S., Moir A.J.G., Baillie L., Moir A. Characterisation of the exosporium of Bacillus cereus II J. Appl. Microbiol. 1999. - Vol.87. - P. 241245.

27. Chen J., Hebert P.D. Directed termination PCR: a one-step approach to mutation detection //Nucleic Acids Res. 1998. - Vol. 26. - P. 1546-1547.

28. Chen Y., Succi J., Koehler T.M. Silent P-lactamase genes in Bacillus an-thracis II Abstract Book. 4t-h International Conference on Anthrax. Annapolis, USA, 10-13 June 2001.-P. 33.

29. Cifarelli, R. A., Gallitelli M., Cellini F. Random amplified hybridization microsatellites (RAHM): isolation of a new class of micro-satellite containing DNA clones // Nucleic Acids Res. 1995. - Vol. 23. - P. 3802-3803.

30. Clements M.O., Moir A. Role of the gerl operon of Bacillus cereus 569 in the response of spores to germinates // J. Bacteriol. 1998. - Vol.180- P. 67296735.

31. Coggins, L. W., O'Prey M. DNA tertiary structures formed in vitro by misaligned hybridization of multiple tandem repeat sequences // Nucleic Acids Res. 1989. - Vol. 17. - P. 7417-7426.

32. Corfe B.M., Sammons R.L., Smith D.A., Mauel C. The gerB region of the Bacillus subtilis 168 chromosome encodes a homologue of the gerA spore germination operon // Microbiology. 1994. - Vol. 140- P. 471-478.

33. Cotton R.G. Mutation detection by chemical cleavage // Genet. Anal. -1999. Vol. 14. - № 5-6- P. 165-168.

34. Crow J.F. Spontaneous mutation of a risk factor // Exp. Clin. Immunoge-net.- 1995.-Vol. 12-P. 121-128.

35. Dai Z., Sirard J.-C., Mock M., Koehler T. M. The atxA gene product activates transcription of the anthrax toxin genes and is essential for virulence // Mol. Microbiol.-1995.-Vol. 16.-P. 1171-1181.

36. Dai Z., Koechler T. Regulation of anthrax toxin activator gene (AtxA) expression in Bacillus anthracis: temperature, not C(V bicarbonate affects atx sythesis // Infection and Immunity. July 1997. - Vol. 65. - №7. - P. 2576-2582.

37. Diamant E., Palti Y., Gur-Arie R. et al. Phylogeny and strain typing of Escherichia coli, inferred from variation at mononucleotide repeat loci // Appl. Environ. Microbiol. Apr 2004. - Vol. 70. - №4. - P. 2464-2473.

38. Drysdale M., Bourgogne A., Hilsenbeck S.G., Koechler T.M. AtxA controls Bacillus anthracis capsule synthesis via acpA and a newly discovered regylator acpB I I J. of Bacteriology. Jan. 2004. - Vol.186. - №2. - P. 307-315.

39. Dwyer K.G., Lamonica J.M., Schumacher J.A. et al. Identification of Bacillus anthracis specific chromosomal sequences by suppressive subtractive hybridization // BMC Genomics. Feb. 2004. - Vol.12. - №5 (1):15.

40. Easterday W.R., Van Ert M.N., Simonson T.S., Wagner D.M. Use of the single nucleotide polymorphisms in the plsR gene for specific identification of Bacillus anthracis II J. of Clinical Microbiology. Apr. 2005. - Vol.43. - №4. - P. 1995-1997.

41. Edlund T., Siden I., Boman H.G. Evidence for two immune inhibitors from Bacillus thuringiensis interfering with the humoral defense system of saturniid pupae //Infeect. Immun. 1976. - Vol.14. - P. 934-941.

42. Ellenbrok H., Nattermann H., Ozel M. et al. Rapid and sensitive identification of pathogenetic and apathogenetic Bacillus anthracis by real-time PCR // FEMS Microbiol. Lett. 2002. - Vol.214. - P. 51-59.

43. Etienne-Toumelin J., Serard J.C. et al. Characterization of the Bacillus anthracis S-layer: cloning and sequencing of the structural gene // J. Bacteriol. -1995. - Vol. 177. - №3. - P. 614-620.

44. Ewing B., Green P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities // Genome Res. 1998. - Vol. 8. - P. 186.

45. Ezzell J.W., Abshire T., Ibrahim S. et al. Identification of Bacillus anthracis: an overview // Abstract Book. 3rd International Conference on Anthrax. -Plymouth, England., September 7-10, 1998. P.47.

46. Fasanella A., Smith K.L., Keys C. et al. Molecular Epidemiology of Bacillus anthracis in Italy // Abstract Book. 4th International Conference on Anthrax. -St. John's College, Annapolis, Maryland, USA, June 10-13,2001. P. 14.

47. Farchaus J.W., Ribot W.J., Ezzel J.W. Purification and characterization of the major surface array protein from the avirulent Bacillus anthracis Delta Sterne-1 //J. Bacterid. 1995. - Vol. 177. - P. 614-620.

48. Foster, P. L., Trimarchi J. M. Adaptive reversion of a frame shift mutation in Escherichia coli by simple base deletions in homopolymeric runs //Science. -1994.-Vol. 265.-P. 407-409.

49. Fouet A., Namy O., Lambert G. Characterization of the operon encoding the alternative oB factor from Bacillus anthracis and its role in virulence // J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182. - №18. - P. 5036-5045.

50. Fouet A., Smith K., Keys C. et al. Diversity among French Bacillus anthracis isolates // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40. - P. 4732-4734.

51. Frischknecht F. The history of biological warfare. Human experimentation, modern nightmares and lone madmen in the twentieth century // EMBO reports. 2003. - Vol. 4. - Special issue. - P. 47-52.

52. Gaylord P., Heeger A.J., Bazan G.C. DNA hybridization detection with water-soluble conjugated polymers and chromophore-labeled single-stranded DNA // J. Am. Chem. Soc. Jan. 2003. - Vol. 125. - №4. - P. 896-900.

53. Gierczynski R., Kaluzewsky S., Rakin A. Intriguing diversity of Bacillus anthracis in eastern Poland the molecular echoes of the past outbreaks // FEMS Microbiology Letters. - 2004. - Vol. 239. - P. 235-240.

54. Gohar, M., 0kstad O. A., Gilois N. et al. Two-dimensional electrophoresis analysis of the extracellular proteome of Bacillus cereus reveals the importance of the PlcR regulon // Proteomics. 2002. - Vol. 2. - P. 784-791.

55. Gominet, M., Slamti L., Gilois N. et al. Oligopeptide permease is required for expression of the Bacillus thuringiensis PlcR regulon and for virulence // Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 40. - P. 963-975.

56. Gottesman S., Neidhardt G. Gene Function in Procariotes // Eds. J. Beckwithet al. Cold Spring Harb. - 1983. - P. 163-183.

57. Green B.D., Battisti B.L., Koehler T.M. et al. Demonstration of a capsule plasmid in Bacillus anthracis II Infect. Immun. 1985. - Vol.49. - P. 291-297.

58. Green B.D., Battisti B. L., Thorne C.B. Involvement of Tn4430 in transfer of Bacillus anthracis plasmids mediated by Bacillus thuringiensis plasmid pX012 //¿Bacterid. 1989. -Vol. 171.-P. 104-113.

59. Griffin T.J., Hall J.G., Prudent J.R., Smith L.M. Direct genetic analysis by matrix assisted laser desorption/ ionization mass spectrometry // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol.96. - P. 6301-6306.

60. Guidi-Rontani C., Pereira Y., Ruffle S. et al. Identification and characterization of a germination operon on the virulence plasmid pXOl of Bacillus anthracis II Mol. Microbiol. 1999. - Vol.33. - P. 407- 414.

61. Guidi-Rontani C., Weber-Levy M., Labruyere E., Mock M. Germination of Bacillus anthracis spores within alveolar macrophages // Mol. Microbiol. -1999.-Vol.31.-P. 9-17.

62. Gur-Arie R., Cohen C.J., Eitan Y. et al. Simple sequence repeats in Escherichia coli: abundance, distribution, composition, and polymorphism // Genome Res. Jan. 2000. - Vol. 10. - № 1. - P. 62-71.

63. Guttmann D.M., Ellar D.J. Phenotypic and genotypic comparisons of 23 strains from the Bacillus cereus complex for a selection of known and putative B. thuringiensis virulence factors // FEMS Microbiology Letters. 2000. - Vol. 188. -P. 7-13.

64. Hacia J.G., Collins F.S. Mutation analysis using oligonucleotide microar-rays // J. Med. Genet. 1999. - Vol. 36. - P. 730-736.

65. Harrell L.J., Andersen G.L., Wilson K.H. Genetic variability of B. anthracis and related species // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol.33. - №.7. - P. 18471850.

66. Hauge, X. Y., Litt M. A study of the origin of "shadow bands" seen when typing dinucleotide repeat polymorphisms by the PCR // Nucleic Acids Res. -1993.-Vol.2.-P. 411-4 15.

67. Healey B.G., Matson R.S., Walt D.R. Fiberoptic DNA sensor array capable of detecting point mutations // Anal. Biochem. 1997. - Vol.251. - P. 270-279.

68. Heath, D.D., Iwama G. K., Devlin R. H. PCR primed with VNTR core sequences yields species specific patterns and hypervariable probes // Nucleic Acids Res. 1993. Vol.21. - P. 5782-5785.

69. Hecker M., Schumann W., Volker U. Heat-shock and general stress response in Bacillus subtilis II Mol. Microbiol. 1996. - - Vol.19. - P. 417-428.

70. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. Real time quantitative PCR // Genome Res. 1996. - Vol. 6. - №.9. - P. 86-94.

71. Henderson I. Fingerprinting Bacillus anthracis strains // Abstract Book. Inter. Workshop on Anthrax. Winchester, England, September 19-21, 1995. - P. 55-59.

72. Hill K.K., Ticknor L.O., Okinaka R.T. et al. Fluorescent amplified fragment length polymorphism analysis of Bacillus anthracis, Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis isolates // Appl. Environ. Microbiology 2004. Vol.70. - P. 1068-1080.

73. Hoffmaster A.R., Koehler T.M. Autogenous regulation of the Bacillus anthracis pag operon // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - №.15. - P.4485-4492.

74. Hoffmaster A.R., Fitzgerald C.C., Ribot E. et al. Molecular subtyping of Bacillus anthracis and the 2001 Bioterrorism-Associated Anyhrax Outbreak, United States // Emerging Infection Diseases. Oct. 2002. - Vol. 8. - № 10. - P. 1111-1116.

75. Hogar M., 0kstad O.A., Fedhila S. et al. PlcR and virulence factors in Batlicillus cereus II Abstract Book. 5 International Conference on Anthrax. Nice, France, 2003. - P. 58.

76. Howard J.T., Ward J., Watson J.N., Roux K.H. Heteroduplex cleavage analysis using SI nuclease // Biotechniques. 1999. - Vol. 27. - № 1. - P. 9-18.

77. Huber C.G., Oefner P.J., Preuss E., Bonn G.K. High-resolution liquid chromatography of DNA fragments on non-porous poly-(styrene-divinylbenzene) particles //Nucleic Acids Res. 1993. - Vol. 21. - P. 1061-1066.

78. Hugh-Jones M., Jackson P.J., Keim P. Genetic diversity in the protective antigen gene of Bacillus anthracis //J. Bacteriol. 1999. - Vol.181. - № 8. - P. 2358-2362.

79. Hurtle W., Bode E., Kulesh D., Kaplan R. Detection of Bacillus anthracis gyrA gene by using a minor groove binder probe // J. of Clin. Microbiol. Jan. 2004.-Vol. 42.-№1.-P. 179-185.

80. Ivins B.E., Welkos S.L. Cloning and expression of the Bacillus anthracis protective antigen gene in Bacillus subtilis II Infect. Immun. 1986. - Vol. 54. -№.2. - P.537-542.

81. Jackson P.J., Walthers E.A., Kalif A.S. et al. Characterization of the Variable-Number Tandem Repeats in vrrA from different Bacillus anthracis isolates // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - Vol. 63. - №4. - P.1400-1405.

82. Jeffreys, A. J., Wilson V., Thein S. L. Hypervariable "minisatellite" regions in human DNA // Nature. 1985. - Vol. 314. - P. 67-73.

83. Jeffreys, A. J., Wilson V., Thein S. L. Individual specific finger-prints of human DNA // Nature. 1985. - Vol. 316. - P. 76-79.

84. Jeffreys, A. J., Wilson V., Thein S. L. et al. DNA fingerprints and segregation analysis of multiple markers in human pedigrees // Am. J. Hum. Genet. 1986. -Vol. 39.-P. 11-24.

85. Jeffreys, A. J., MacLeod A., Tamaki K. et al. Minisatellite repeats coding as a digital approach to DNA typing // Nature . -1991. Vol. 354. - P. 204-209.

86. Irie R., Fujita Y., Kobayashi M. Nucleotide sequence and gene organization of the gerK spore germination locus of Bacillus subtilis 168 // J. Gen. Appl. Microbiol. 1996. - Vol. 42. - P. 41-53.

87. Kaspar R.R., Robertson D.R. Purification and physical analysis of Bacillus anthracis plasmids pXOl and pX02 // Bioch. Res. Comm. 1987. - Vol. 149. - № 2.-P. 362-368.

88. Keim P., Kalif A., Schupp J. et al. Molecular Evolution and Diversity in Bacillus anthracis as Detected by Amplified Fragment Length Polimorphism Markers // J. Bacteriol. 1997. - Vol.179. - №3 - P.818-821.

89. Keim P., Klevytska A., Price L.B. et al. Molecular diversity in Bacillus anthracis // J.App.Microbiol. 1999. - Vol. 87. - P.215-217.

90. Keim P., Price L.B., Klevytska A.M. et al. Multiple-locus VNTR analysis (MLVA) reveals genetic relationships within Bacillus anthracis II J.Bact. 2000. -Vol. 182. - P.2928-2936.

91. Keim P., Zinser G., Solomon D. et al. Dissection of Bacillus anthracis into distinct types using VLVA // Abstract Book. 4th International Conference on Anthrax June 10 - 13, 2001, St. John's College, Annapolis, Maryland, USA, P. 16.

92. Keim P., Van Ert M., Read T. et al. The evolution of B. anthracis subtypes from a B. cereus ancestor: VNTR and SNP for evolutionary analysis // Abstract Book. 5th International Conference on Anthrax. Nice, France, 2003. P. 24.

93. Keim P., Solomon D., Huynh L. et al. Single nucleotide repeats (SNRs)thin the B. anthacis genome are highly mutable // Abstract Book. 5 International Conference on Anthrax. Nice, France, 2003. - P. 65.

94. Keim P., Van Ert M., Pearson T. et al. Anthax molecular epidemiology and forensis: using and appropriate marker for different evolutionary scales // Infect. Genet. Evol. 2004. - Vol. 4. - P.205-213.

95. Kilger C., Paabo S. Direct DNA sequence determination from total genomic DNA // Nucleic Acids Res. 1997. - Vol. 25. - P.2032-2034.

96. Kim H.S., Sherman D., Johnson F., Aronson A. Characterization of a maior Bacillus anthracis spore coat protein and its role in spore inactivation // J. Bacterid. Apr 2004. - Vol. 186. - №8. - P.2413-2417.

97. Klichko, V. I., Miller J., Wu A. et al. Anaerobic induction of Bacillus anthracis hemolytic activity //Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. - Vol. 303. -P.855-862.

98. Koehler T., Ruhfel R.E., Green B.D., Therne B.C. // American Society for Microbiology: Annual Meeting. 86th: Abstract. Washington. - 1986 - P. 157.

99. Koehler T.M., Pasha R., Williams R.P. //General Meetingof Amer. Soc. Microbiol. Wachington. - 1992. - P. 46.

100. Koehler T.M., Dai Z., Kaufman-Yarbray M. Regulation of the Bacillus anthracis protective antigen: C02 and a trans-acting element activate transcription from one of two promoters // J. Bacteriol. 1994. - Vol.176. - P.586-595.

101. Koehler T.M. Bacillus anthracis genetics and virulence gene regulation // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2002. - Vol.271. - P. 143-164.

102. Kristensen T., Nedelcheva-Kristensen V., Borresen-Dale A.-L. High throughput screening for known mutations by automated analysis of single sequencing reactions (SSR) // Bio Techniques. 1998. - Vol. 24. - P.832-835.

103. Kumar S., Tamura K., Nei M. Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment //Briefings in bioinformatics. -2004.-Vol. 5.-P. 150-163.

104. Kwok S., Kellogg D.E., McKinney N. et al. Effect of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction: human immunodeficiency virus type 1 model studies //Nucleic Acids Res. 1990. - Vol. 18. - №4. - P.999-1005.

105. Lai E-M., Phadle N.D., Kachman T. et al. Proteomic analysis of the spore coats of Bacillus subtilis and Bacillus anthracis II J. Bacteriol. Feb. 2003. - Vol. 185.-№4. -P. 1443-1454.

106. Le Flèche P., Hauck Y., Onteniente L. et al. A tandem repeats database for bacterial genomes: application to the genotyping of Yersinia pestis and Bacillus anthracis II BMC Microbiology. 2001., 1:2.

107. Leach, F. S., Nicolaides N. C., Papadopoulos N. et al. Mutations of a MutS homolog in hereditary non-polyposis colorectal cancer // Cell. 1993. - Vol. 75.-P. 1215-1225.

108. Leendertz F.H., Yumlu S., Pauli G. et al. A new Bacillus anthracis found in wild chimpanzees and a gorilla from West and Central Africa // PLoS Pathog. -2006.-Vol. 2.-Issue l:e8.

109. Leppla S.H. Anthrax toxin edema factor: a bacterial adenilate cyclate that increases cyclic AMP concentrations in eucaryotic cells // Proc. Acad. Sei. Us. -1982. Vol. 79. - P.3162-3166.

110. Leppla S.H. Anthrax toxins //In: Bacterial toxins and virulence factors in disease. Ed. Moss J., Iglevski B„ Vaughan M., Tu A.T. N.Y. 1995. - P. 543-572.

111. Levinson, G., Gutman G. A. Slipped-strand mispairing: mecha-nism for DNA sequence evolution // Mol. Biol. Evol. 1987. - Vol. 4. - P.203-221.

112. Levinson, G., and Gutman G. A. High frequency of short frameshifts in poly-CA/GT tandem repeats borne by bacteriophage M13 in Escherichia coli K-12 //Nucleic Acids Res. 1987. - Vol. 15. - P.5323-5338.

113. Levy H., Fisher M., Kobiler D., Altboum Z. Identification of strain specific markers in Bacillus anthracis by random amplification of polymorphic DNA // Abstract Book. 5th International Conference on Anthrax. Nice, France, 2003. -P. 64.

114. Lewis, R. J., Brannigan J. A., Offen W. A. et al. An evolutionary link between sporulation and prophage induction in the structure of a repressor: anti-repressor complex // J. Mol. Biol. 1998. - Vol. 283. - P.907-912.

115. Li W.H., Ellsworth D.L., Krushkal J. et al. Rates of nucleotide substitution in primates and rodents and the generation-time effect hypothesis // Mol. Phy-logenet. Evol. 1996. Vol. 5. - P. 182-187.

116. Lista F., Faggioni G., Valjevac S. et al. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci Multi Locus Variable-Number Tandem Repeats Analysis // BMC Microbiology. 2006. - Vol. 6. - P.33.

117. Little S.F., Novak J.M., Leppla S.H. et al. Characterization of lethal factor binding domains of protective antigen of Bacillus anthracis using monoclonal antibodies // Microbiology. 1995. - Vol. 142. - P.707-715.

118. Livak K.J. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay // Genet. Anal. 1999. - Vol. 14. - №5-6. - P. 143-149.

119. Lizardi P.M., Huang X., Zhu Z. et al. Mutation detection and single molecule counting using isothermal rolling circle amplification // Nat. Genet. -1998.-Vol. 19. №3. - P.225-32.

120. Luna V.A., King D.S., Peak K.K. et al. Bacillus anthracis virulent plas-mid pX02 genes found in large plasmids of two other Bacillus species // J. Clin Microbiol. 2006. - Vol. 44. - №7. - P.2367-2377.

121. Lyamichev V., Mast A.L., Hall J.G. et al. Polymorphism identification and quantitative detection of genomic DNA by invasive cleavage of oligonucleotide probes // Nat. Biotechnol. 1999. - Vol. 17. - P.292-296.

122. Lysov I.U., Florent'ev V.L., Khorlin A. A. et al. Determination of the nucleotide sequence of DNA using hybridization with oligonucleotides // Dokl. Acad. NaukSSSR- 1988. Vol. 303. - №6.-P.1508-1511.

123. Maho A., Rossano A., Hachler A. et al. Antibiotic susceptibility and molecular diversity of Bacillus anthracis strains in Chad: detection of a new phyloge-netic subgroup // J. Clin. Microbiol. 2006. - Vol. 44. - №9. P.3422-3425.

124. Makino S.J., Sasacawa C., Uchida I. Cloning and CO2 dependent expression of the genetic region for encapsulation from Bacillus anthracis II Mol. Microbiol. 1988. - Vol. 2. - №3. P.371-376.

125. Marras S.A., Kramer F.R., Tyagi S. Multiplex detection of single nucleotide variations using molecular beacons // Genet. Anal. Biomol. Eng. 1999. - Vol. 14. -P.151-156.

126. Mesnage S., Fouet A. Plasmid-encoded autolysinc in Bacillus anthracis: modular structure and catalytic properties // J. of Bacteriol. Jan 2002. - Vol. 184. -№l.-P.331-334.

127. Mignot, T., Mock M., Robichon D. et al. The incompatibility between the PlcR- and AtxA-controlled regulons may have selected a nonsense mutation in Bacillus anthracis II Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 42. - P. 1189-1198.

128. Mikesell P., Ivins B.E., Ristroph J.D., Dreier T.M. Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bacillus anthracis II Infect. Immun. 1983. - Vol. 39. - P.371-376.

129. Mitas M. Trinucleotide repeats associated with human disease //Nucleic Acids Res. 1997. - Vol. 25. - P.2245-2253.

130. Nakamura, Y., Leppert M., O'Connell P. et al. Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping // Science. 1987. - Vol. 235.-P. 1616-1622.

131. Nakamura, Y., Carlson M., Krapcho K. et al. New approach for isolation of VNTR markers // Am. J. Hum. Genet. -1988. Vol. 43. - P. 854-859.

132. Nishi J. S., Ellsworth T. R., Lee N. et al. An outbreak of anthrax (Bacillus anthracis) in free-roaming bison in the Northwest Territories, June-July 2006 // J. Can. Vet. 2007. - Vol. 48. - P. 37-38.

133. Nikiforov T.T., Rendle R.B., Goelet P. et al. Genetic bit analysis: a solid phase method for typing single nucleotide polymorphisms // Nucleic Acids Res. -1994.-Vol. 20.-P. 4167-4175.

134. Nurmi J., Ylikoski A., Soukka T. et al. A new label technology for the detection of specific polymerase chain reaction products in a closed tube // Nucleic Acids Res. 2000. - Vol. 28. - № 8. - P. 28.

135. Okamoto Y., Nagano H. Detection ofp53 gene mutations in its full trans-lational sequence by cleavase fragment length polymorphism analysis // Ann. Clin. Biochem. 1999. - Vol. 36. - P. 511-513.

136. Okamoto T., Suzuki T., Yamamoto N. Microarray fabrication with cova-lent attachment of DNA using bubble jet technology // Nat. Biotechnol. 2000. -Vol. 18.-P. 438-441.

137. Okinaka R., Cloud K., Hampton O. et al. Sequence, assembly and analysis pXOl and pX02 // Abstract Book. 3 rd International Conference on Anthrax, University of Plymouth, 7-10th September 1998. P18.

138. Okinaka, R. T., Cloud K., Hampton O. et al. Sequence and organization of pXOl, the large Bacillus anthracis plasmid harboring the anthrax toxin genes // J. Bacterid. 1999. - Vol. 181. - P. 6509-6515.

139. Okstad, O. A., Gominet M., Purnelle B. et al. Sequence analysis of three Bacillus cereus loci carrying PlcR-regulated genes encoding degradative enzymes and enterotoxin // Microbiology. 1999. - Vol. 145. - P. 3129-3138.

140. Orti, G., Pearse D. E., Avise J. C. Phylogenetic assessment of length variation at a microsatellite locus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94. -P. 10745-10749.

141. Pastinen T., Partanen J. Syvanen A.-C. Multiplex fluorescent solidphase minisequencing for efficient screening of DNA sequence variation // Clin. Chem. -1996.-Vol. 42.-P. 1391-1397.

142. Plaschke J., Voss H., Hahn M. et al. Doublex sequencing in molecular diagnosis of hereditary diseases // Bio Techniques. 1998. - Vol. 24. - P. 838-841.

143. Pomerantsev, A. P., Staritsin N. A., Mockov Y., Marinin L. I. Expression of cereolysine AB genes in Bacillus anthracis vaccine strain ensures protection against experimental hemolytic anthrax infection // Vaccine. 1997. - Vol. 15. -P.1846-1850.

144. Pomerantsev A.P., Kalnin K.V., Osorio M., Leppla S. H. Phosphatidyl-choline-specific phospholipase C and sphingomyelinase activities in bacteria of the Bacillus cereus group // Infect, and Immunity. Nov. 2003. - P.6591-6606

145. Preisz H. Zbl.Bakt., 1908 (1 Abt. Orig.)-47.-585.

146. Price L.B., Hugh-Jones M., Jackson P.J., Keim P. Genetic diversity in the protective antigen gene of Bacillus anthracis //J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181. -№.8. - P.2358-2362.

147. Qi Y., Patra G., Liang X. et al. Utilization of the rpoB gene as a specific chromosomal marker for real-time PCR detection of Bacillus anthracis II Appl. and Envir. Microbiology. Aug. 2001. - Vol. 67. - №8. - P. 3720-3727.

148. Radnedge L., Argon P.G., Hill K.K. et al. Genome differences that distinguish Bacillus anthracis from Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis II Appl. and Environ. Microbiology. May 2003. - Vol. 69. - №5. - P. 2755-2764.

149. Ramisse V., Patra G., Vaissaire J., Mock M. The Ba813 chromosomal DNA sequence effectively traces the whole Bacillus anthracis community // J. Appl. Microbiol. 1999. - Vol. 87. - P. 224-228.

150. Ravel J., Gajer P., Pop M. et al. Bacillus anthracis comparative genomics applied to SNP discovery // Abstract Book. 5th International Conference on Anthraxio Nice, France, 2003. - P. 50.

151. Read T.D, Salzberg S.L., Pop M. et al. Comparative genome sequencing for discoveiy of novel polymorphism in Bacillus anthracis II Science. 2002. -Vol. 296. - P.2029-2023.

152. Read T., Fräser C. Bacillus anthracis genomics // Abstract Book. 5th International Conference on Anthraxio Nice, France, 2003. - P. 20.

153. Read T.D., Peterson S.N., Tourasse N. et al. The genome sequence of Bacillus anthracis Ames and comparison to closely related bacteria // Nature. -May, 2003. Vol. 423(6935). - P. 81-86.

154. Richardson, T., Cato S., Ramser J. et al. Hybridization of microsatellites to RAPD: a new source of polymorphic markers // Nucleic Acids Res. 1995. -Vol. 23. - P. 3798-3799.

155. Roloff H., Glockner P., Mistele K., Bohn R. The taxonomic relationship between B.anthracis and the B.cereus group, investigated by DNA-DNA hybridization and DNA amplification fingerprinting (DAF) // Salisbury Medical Bulletin:

156. Proceedings of the International Workshop on Anthrax, Winchester, England, September 19-21,1995, Special Supplement. 1996. - №87. - P.38-40.

157. Rosche, W. A., Trinh T. Q., Sinden R. R. Differential DNA secondary-structure-mediated deletion mutation in the leading and lagging strands // J. Bacterid. 1995. - Vol. 177. - P. 4385-4391.

158. Rosche, W. A., Jaworski A., Kang S. et al. Single-stranded DNA-binding protein enhances the stability of CTG triplet repeats in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1996. - Vol. 178. - P. 5042-5044.

159. Ruano G., Kidd K.K. Coupled amplification and sequencing of genomic DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1991. Vol. 88. - P. 2815-2819.

160. Ruhfel R.E., Robillard N.J, Therne C.B. Interspecies transduction of plasmids among Bacillus anthracis, B. cereus and B. thuringiensis II J. Bacteriol. -1984.-Vol. 157.-P. 2263-2266.

161. Sachadyn P., Stanislawska A., Kur J. One tube mutation detection using sensitive fluorescent dyeing of MutS protected DNA // Nucleic Acids Res. 2000. - Vol. 28. - №8 :E36.

162. Salamitou, S., Ramisse F., Brehelin M. et al. The plcR regulon is involved in the opportunistic properties of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus in mice and insects // Microbiology. 2000. - Vol. 146. - P. 2825-2832.

163. Sapolsky R.J., Hsie L., Berno A. et al. High throughput polymorphism screening and genotyping with high-density oligonucleotide arrays // Genet. Anal. Biomol. Eng. 1999. - Vol. 14. - P. 187-192.

164. Schumm J.W., Knowlton R.G., Braman J.C. et al. Identification of more than 500 RELPs by screening random genomic clones // Am. J. Hum. Genet. -1988.-Vol. 42.-P. 143-159.

165. Shangkuan Y.H., Chang Y.H., Yang J.F. et al. Molecular characterization of Bacillus anthracis using multiplex PCR, ERIC-PCR and RAPD // Lett. Apll. Microbiol. 2001. - Vol. 32. - №3. - P. 139-145.

166. Shangkuan Y.H., Chang Y.H. Nucleotide sequence analysis of groEL of

167. Bacillus anthracis, B. cereus, B. thuringiensis, and B. mycoides II Abstract Book, th

168. International Conference on Anthrax, St. John's College, Annapolis, Maryland, USA, June 10 13, 2001. - P.20-B.12B.

169. Shannon J. G., Ross C. L., Koehler T. M., Rest R. F. Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin // Infect. Immun. 2003. - Vol. 71. - P. 3183-3189.

170. Shin H.J., Seong W.K., Chun J.H., Oh H.B. Characterization of genetic diversity within Korean Bacillus anthracis isolates using Multiple-Locus VNTR Analysis // Abstract Book. 5th International Conference on Anthrax. Nice, France, 2003.-P. 53.

171. Silman N., Bramhill E., Hudson M. et al. Development of diagnostic mi-croarrays for the detection and typing of Bacillus anthracis II Abstract Book. 5th International Conference on Anthrax. Nice, France, 2003. - P. 52.

172. Singh Y., Klimpel K.R., Arora N. et al. The chymotrypsin sensitive site, FFD315, in anthrax toxin protective antigen is required for translocation of lethal factor // J. Biol. Chem. - 1994. - Vol. 269. - № 46. - P. 29039 -29046.

173. Singh Y., Chaudhary V.K., Leppla S.H. A deleted variant of Bacillus anthracis protective antigen is non-toxic and blocks anthrax toxin action in vivo // J. Biol. Chem. Nov, 1989. - Vol. 264. - № 32. - P. 19103-19107.

174. Skaar E.P., Gaspar A.H., Schneewind O. Bacillus anthracis IsdG, a heme-degrading monooxygenase // J. Bacteriol. Feb, 2006. - Vol. 188. - № 3. - P. 1071-1080.

175. Slamti, L., Lereclus D. A cell-cell signaling peptide activates the PlcR virulence regulon in bacteria of the Bacillus cereus group // EMBO J. 2002. -Vol. 21.-P. 4550-4559.

176. Slamti L., Perchat S., Gominet M. et al. Distinct mutations in PlcR explane whysome strains of the Bacillus cereus group are nonhemolytic //J. of Bacteriol. 2004. - Vol. 186. - №11. - P. 3531-3538.

177. Smith J., Modrich P. Mutation detection with MutH, MutL and MutS mismatch repair proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93. - №9. -P. 4374-4379.

178. Smith K.L., De Vos V., Bryden H. et al. Bacillus anthracis diversity in KrugerNational Park// J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P.3780-37784.

179. Snyder M.P., Kimbrell D., Hunkapiller M. A transposable element that splits the promoter region inactivates a Drosophila cuticle protein gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - Vol. 79. - №23. - P.7430-744.

180. Sokolov B.P. Primer extension technique for the detection of single nucleotides in genomic DNA // Nucleic Acids Res. 1990. - Vol. 18. - P.3671.

181. Song J., Xie G., Myers G. et al. The LANL threat pathogens database: facilitating comparative genomics of Bacillus anthracis neighbors // Abstract Book. 5th International Conference on Anthrax. Nice, France. - 2003. - P. 51.

182. Steichen Ch., Kearney J., Tornbough C.L. Identification of the immunodominant protein and other proteins of the Bacillus anthracis exosporium // J. of Bacteriol. Mar. 2003. - Vol. 185. -№5. - P. 1903-1910.

183. Strand, S., Prolla T. A., Liskay R. M., Petes T. D. Destabilization of tracts of simple repetitive DNA in yeast by mutations affecting DNA mismatch repair // Nature. 1993. - Vol. 365. - P. 274-276.

184. Sue D., Marston C.K., Hoffmaster A.R. et al. Genetic diversity in a Bacillus anthracis historical collection // J. Clin. Microbiol. 2007. - Vol. 45. -№6. -P, 1777-1782.

185. Sylvestre P., Couture-Tosi E., Mock M. A collagen-like surface glycoprotein is a structural component of the Bacillus anthracis exosporium // Mol. Microbiol. Vol. 45.-P. 169-178.

186. Sylvestre P., Couture-Tosi E., Mock M. Polymorphism in the collagenlike region of the Bacillus anthracis BclA protein leads to variation in exosporium filament length // J. of Bacteriol. Mar. 2003. - Vol. 185. - №5. - P. 1555-1563.

187. Sylvestre P., Couture-Tosi E., Mock M. Contribution of ExsFA and ExsFB proteins to the localization of BclA on the spore surface and to the stability of the Bacillus anthracis exosporium // J. of Bacteriol. Aug 2005. - P. 5122-5128.

188. Syvanen A.-C. From gels to chips: "minisequencing" primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms // Hum. Mutat.- 1999.-Vol. 13.-P. 1-10.

189. Tain G.Z., Hai R., Yu D.Z. et al. Use of variable-number tandem repeats to examine genetic diversity of Bacillus anthracis II Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. Aug. 2006. - Vol. 27. - №8. - P. 712-715.

190. Tanquay R. M. Transcriptional activation of heat-shok genes in eukaryo-tes // Biochem. Cell. Biol. 1988. - Vol. 66. - P. 584-593.

191. Teska J.D., Allan C.M., Redus S.L. et al. Identification of Bacillus anthracis using MIDI whole cell fatty acid analysis // Abstract Book. 4th International Conference on Anthrax. June 10-13, 2001, St. John's College, Annapolis, Maryland, USA.-P. 15.

192. Tippets M.T., Robertson D.L. Molecular cloning and expression of the Bacillus anthracis edema factor toxin gene: calmodulin-dependent adenylate cyclase // J. Bacteriol. 1988. - Vol. 170. - №5. - P. 2263-2266.

193. Thibodeau S. N., Bren G., Schaid D. Microsatellite instability in cancer of the proximal colon // Science. 1993. - Vol. 260. - P. 816-819.

194. Thorne C.B. Biochemical properties of virulent and avirulent strains of Bacillus anthracis II Ann. N.Y. Acad. Sci. 1960. - Vol.88. - №6. - P. 1024-1033.

195. Thorne C.B. Transduction in Bacillus cereus and Bacillus anthracis II Bact. Rev. 1968. - Vol. 32. - P. 358-361.

196. Thorne C.B. Transducing bacteriophage for Bacillus cereus II J. Virol. -1968.-Vol. 2.-P. 657-662.

197. Thorne C.B., Holt S.C. Cold lability of Bacillus cereus bacteriophage CP-51 // J. Virol. 1974. - Vol. 14. - P. 1008-1012.

198. Thorne C.B. Genetics of Bacillus anthracis. In: Leive L., Bonventre P.F., Morello J.A. and Wu H.C. (ed.). Microbiology. - 1985, American Society for Microbiology, Washington D.C.

199. Thorne C.B. Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria // American Society for Microbiology. 1993. - P. 113-114.

200. Tippets T.M., Robertson D.L. Molecular cloning and expression of the Bacillus anthracis edema factor toxin gene: a calmodulin dependent adenylate cyclase // J. Bacteriol. - 1988. - Vol. 170. - № 5. - P. 2263-2266.

201. Tito B.J., Poff. H.E., Novotny M.A. et al. Automated fluorescent analysis procedure for enzymatic mutation detection // Clin. Chem. 1998. - Vol. 44. - P. 731-739.

202. Todd S.J., Moir A. J., Johnson M.J., Moir A. Genes of Bacillus cereus and Bacillus anthracis encoding proteins of the exosporium //J. Bacteriol. Jun. 2003. - Vol. 185. - № 11. - P. 3373-3378.

203. Turnbull P.C.B., Hutson R.A., Ward M.J. et al. Bacillus anthracis but not always anthrax // J. Appl. Bact. 1992. - Vol. 72. - P. 21-28.

204. Uchida I., Sekizaki T., Hashimoto K., Terakado N. Association of the encapsulation of Bacillus anthracis with a 60 megadalton plasmid // J. Gen. Microbiol. -1985. Vol. 131.-№2.-P. 363-367.

205. Uchida I., Hashimoto K., Terakado N. Virulence and immunogenicity in experimental animals of Bacillus anthracis strains harboring or lacking 110 Mda and 60 Mda plasmids // J.Gen.Microbiol. 1986. - Vol.132. - P.557-559.

206. Uchida I., Hornung J.M., Thorne C.B. et al. Cloning and characterization of gene whose product is a trans-activator of anthrax toxin synthesis // J. Bacteriol. 1993. - Vol.175. - № 17. - P.5329-5338.

207. Uchida I., Makino S., Terakado N. Cross-talk to the genes for Bacillus anthracis by atxA, gene encoding the trans-activator of anthrax toxin synthesis // Mol. Microbiol. -1997. Vol.23. - № 6. - P.1229-1240.

208. Van Belkum, A., Scherer S., Van Leeuwen W. et al. Variable number of tandem repeats in clinical strains of Haemophilus influenzae II Infect. Immun. -1997.-Vol. 65. P.5017-5027.

209. Van der Auwera G., Mohillon J. TnpXOl, a germination-associated class II transposon from Bacillus anthracis II Plasmid. May. 2005. - Vol. 53. - № 3. -P.251-257.

210. Van Ert M.N., Easterday W.R., Huynh L.Y. et al. Global Genetic Population Structure of Bacillus anthracis // PLoS ONE 2(5): e461. doi:10.1371/journal.pone.0000461

211. Van Ham, S. M., Van Alphen L., Mooi F. R., Van Putten J. P. M. Phase variation of H. influenzae fimbriae: transcriptional control of two divergent genes through a variable combined promoter region // Cell. 1993. - Vol. 73. - P.1187-1196.

212. Vetter S.M., Shlievert P.M. Glycerol monolayram inhibits virulence factor production in Bacillus anthracis //Antimicrobial agents and chemotherapy. -Apr. 2005. -Vol. 49. №4. - P. 1302-1305.

213. Vierti N. J., Marrero R., Hoover T. A., Welkos S. L. Identification and characterisation of a trans-activator involved in the regulation of encapsulation by Bacillus anthracis II Gene. -1995. -Vol. 152. № 1. - P.l-9.

214. Vogler A. P., Purvis A. Comparative method and evolution // EXS. -2002. -Vol. 92. P.225-236.

215. Vos P., Hogers R., Bleeker M. et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting // Nucleic Acids Res. 1995. -Vol. 23. - P.4407-4414.

216. Waldor, M. K., Rubin E. J., Pearson G. D. et al. Regulation, replication, and integration functions of the Vibrio cholerae CTXphi are encoded by region RS2 // Mol. Microbiol. 1997. -Vol. 24. - P.917-926.

217. Wallace R.J. Digestion of rumen bacteria in vitro // Br. J. Nutr. Jan. 1983. -Vol. 49. -№ l.-P. 101-108.

218. Walt D.R. Bead based fiber optic arrays // Science. 2000. -Vol. 287. -P.451-452.

219. Wang B., Smith K.L., Keys C. et al. Molecular epidemiology of BacillusxLanthracis in China // Abstract Book. 4 International Conference on Anthrax, -June 10 -13, 2001. St. John's College, Annapolis, Maryland, USA. - P.M.

220. Welkos S.L. Plasmid-associated virulence factors of non-toxigenic (pXOl") Bacillus anthracis II Microb. Pathog. 1991. -Vol. 10. - P.183-198.

221. Welkos S.L, Vietri N.J, Gibbs P.H. Non-toxigenic derivatives of the Ames strain of Bacillus anthracis are fully virulent for mice: role of plasmid pX02 and chromosome in strain-dependent virulence. // Microb. Pathog. 1993. Vol. 14. - P.381-388.

222. Welsh, J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic Acids Res. 1990. - Vol. 18. - P.7213-7218.

223. Williams J. K., Kubelik A. R., Livak K. J. et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acids Res. -1990.-Vol. 18.-P.6531-6535.

224. Wood, H. E., Devine K. M., McConnell D. J. Characterization of a repressor gene (xre) and a temperature-sensitive allele from the Bacillus subtilis prophage, PBSX // Gene. 1990. - Vol. 96. - P.83-88.

225. Xu Y., Kool E.T. High sequence fidelity in a non-enzymatic DNA automation reaction // Nucleic Acids Res. 1999. - Vol. 27. - № 3. - P.875-881.

226. Yager T.D., Baron L., Batra R. et al. High performance DNA sequencing and the detection of mutations and polymorphisms on the Clipper sequencer // Electrophoresis. 1999. - Vol. 20. - P.1280-1300.

227. Yelton D.B., Thorne C.B. Transduction in Bacillus cereus by each of two bacteriopiohages // J. Bact. -1970. Vol. 102. - P. 573-579.

228. Zhu K.Y., Clark J.M. Addition of a competitive primer can dramatically improve the specificity of PCR amplification of specific alleles // Biotechniques. -1996. Vol. 21. - № 4. - P.586-590.

229. Zinser G., Schupp J.M., Keim P. Identification of novel VNTR loci in Bacillus anthracis II Abstract Book. 2nd International Workshop on the molecular biology of B.anthracis, B.cereus, B.thuringiensis, August 11-13, Taos, New Mexico, USA.- 1999. -P.61.

230. Zinser G., Solomon D.L., Miller S. et al. Mutation rate estimates for VNTR regions in Bacillus anthracis II Abstract Book. 4th International Conference on Anthrax, June 10-13 2001, St. John's College, Annapolis, Maryland, USA. -P.28-B.17A.