Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнологические и микробиологические аспекты совершенствования фагодиагностики сибирской язвы

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические и микробиологические аспекты совершенствования фагодиагностики сибирской язвы"

На правах рукописи

Головинская Татьяна Михайловна

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ФАГОДИАГНОСТИКИ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 О ОКТ 2014

Ставрополь - 2014

005554232

005554232

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

Кулнченко Александр Николаевич, доктор медицинских наук, профессор Цыганкова Ольга Ивановна, доктор медицинских наук Официальные оппоненты:

Липницкий Анатолий Васильевич, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное казённое учреждение здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, главный научный сотрудник лаборатории сибирской язвы.

Терентьев Александр Николаевич, доктор медицинских наук, Федеральное казённое учреждение здравоохранения «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, заведующий лабораторией диагностики особо опасных инфекций.

Ведущая организация: Федеральное казённое учреждение здравоохранения «Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Защита состоится «и^^» декабря 2014 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.109.01 при ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора по адресу: 355035, г. Ставрополь, ул. Советская, 13-15

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора и на сайте\¥\¥\¥.зшрсЫ.ги

Автореферат разослан »¿>/Ър2014 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Жарникова Ирина Викторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В Российской Федерации практически ежегодно регистрируется заболеваемость людей и животных сибирской язвой, которая так же как во всем мире не имеет тенденции к снижению [Бургасов П.Н. с соавт., 1970; Бургасов П.Н., Рожков Г.И., 1984; Маринин Л.И. с соавт., 1999; Рязанова А.Г. с соавт., 2011; 2012;0нищенко Г.Г. с соавт. 1999, 2012; Куличенко А.Н. с соавт., 2012; Антюганов С.Н. с соавт., 2012, 2012а; Еременко Е.И. с соавт., 2010, 2013].

Опасность сибирской язвы в первую очередь связана с тяжестью течения заболевания людей и животных, высокой летальностью, значительностью экономических затрат на лечение больных и проведение противоэпидемических и про-тивоэпизоотических мероприятий. Другим аспектом этой проблемы является длительная выживаемость В. anthracis в споровой форме в окружающей среде, что приводит к формированию стойких почвенных очагов.

Составленный «Кадастр стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов Российской Федерации» содержит сведения о местонахождении 36091 стационарно неблагополучных пунктов с почвенными очагами сибирской язвы [Кадастр...М., 2005, Маринин Л.И., 2008], значительная часть которых находится на юге РФ [Хотько Н.И., 1994; Киреев Ю.Г. с соавт., 1996, Еременко Е.И. с соавт., 1996,-Агапов В.А. с соавт., 1997; Петров С.П. с соавт., 1997; Петрюк В.А. с соавт., 1997; Куличенко А.Н. с соавт., 2010; Буравцева Н.П. с соавт., 2011, 2011а,2012; Мезенцев В.М. с соавт., 2012; Антюганов С.Н. с соавт., 2012].

Степень разработанности темы нсследования.В настоящее время для проведения теста на фагочувствительность при идентификации культур В. anthracis,в Российской Федерации производится бактериофаг сибиреязвенный R/D-Ph-6 в виде фаг-тест-набора «Оболенск R1» для медицинского применения (ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», г. Оболенск) и бактериофаг сибиреязвенный Fah-ВНИИВВиМ - для ветеринарного применения (ГНУ Всероссийский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук, г. Покров).

Бактериофаги, применяющиеся для идентификации культур В. anthracis, обладают различным спектром специфической литической активности и неодинаковой специфичностью [Левина E.H., Архипова В.Р., 1967; Ипатенко с соавт., 1989; Васильев П.Г. с соавт., 1999; Цыганкова О.И., 2007; Саяпина Л.В., с соавт., 2011]. В связи с этим идет постоянный поиск новых бактериофагов, оптимальных по указанным свойствам.

Производство бактериофагов требует максимальной оптимизации технологического процесса с учетом их индивидуальных биологических особенностей, как для обеспечения эффективной репродукции бактериофага, так и для контроля

специфической активности и специфичности. Кроме этого, усовершенствование технологии производства преследует цели повышения качества готовой продукции и срока годности препарата, а также уменьшения количества манипуляций в биотехнологической производственной схеме, снижение затрат времени и средств.

Ранее был предложен препарат бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 [Солодовников Б.В. с соавт., 1997, 1997а], однако, техническая документация на его производство не была разработана и утверждена. Отсутствие регистрационного удостоверения Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения не позволяло регламентировать его применение для диагностики сибирской язвы.

Фаготипирование широко используется как метод изучения индивидуачь-ных особенностей штаммов микроорганизмов [Гремякова Т.А. с соавт., 1999; Сидоренко С.В. с соавт., 2003; Митрохина E.H., 2006; Скородумова Д.И., 2007 и др.], но до сих пор этот подход не был разработан для изучения штаммов В. anthracis.

Таким образом, очевидна необходимость разработки биотехнологии получения и внедрения в производство сибиреязвенного бактериофага, оптимизации схем анализа для совершенствования фагодиагностики сибирской язвы.

Цель исследования - совершенствование фагодиагностики сибирской язвы путем разработки биотехнологии производства препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма Л-26 жидкий» и схемы комплексного применения сибиреязвенных бактериофагов, обеспечивающей максимальную чувствительность и специфичность анализа.

Задачи исследования:

1. Разработать производственную биотехнологигопрепарата«Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий» с широким спектром специфической активности.

2. Осуществить подбор штаммов В. anthracis с различной чувствительностью к литическому действию сибиреязвенных бактериофагов для производственного контроля специфической активности и штаммов сапрофитов рода Bacillus для подтверждения специфичности препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий».

3. Разработать техническую документацию на препарат «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий» и внедрить его в практику.

4. Провести сравнительную оценку специфической активности и специфичности сибиреязвенных бактериофагов Гамма А-26, ВА-9, К ВИЭВ, R/D-RH-6, Fah-ВНИИВВиМ, Саратов, 186.

5. Экспериментально обосновать выбор сибиреязвенных бактериофагов для идентификации штаммов возбудителя сибирской язвы, для индикации в материа-

ле из объектов окружающей среды, а также для комплексного проведения идентификации и фаготипирования штаммов В. anthracis.

6. Оптимизировать параметры проведения теста реакции нарастания титра фага (РНФ) с использованием бактериофага R/D-Ph-6. Оценить специфичность теста при использовании смешанных культур В. anthracis и близкородственных сапро-фитов и материала, имитирующего пробы окружающей среды.

7. Разработать схему комплексного применения сибиреязвенных бактериофагов с различным спектром специфической активности для совершенствования лабораторной диагностики В. anthracis.

8. Разработать схему фаготипирования штаммов сибиреязвенного микроба и оценить ее эффективность.

Научная новизна исследования. На представительной выборке штаммов В. anthracis (114) и близкородственных представителях рода Bacillus (75) получены новые данные о специфической активности и специфичности сибиреязвенных бактериофагов Fah-ВНИИВВиМ, R/D-Ph-6, Гамма А-26, ВА-9, К ВИЭВ, Саратов и 186.

Впервые изучены биологические и диагностические свойства бактериофага 186, не применявшегося ранее для дифференциации В. anthracis от близкородственных сапрофитов, что позволило рекомендовать его использование для комплексного фаготипирования штаммов возбудителя сибирской язвы.

Научно обоснован выбор бактериофагов для наиболее достоверной идентификации (100 %) штаммов В. anthracis, в тесте РНФ с целью индикации возбудителя сибирской язвы и для комплексного проведения идентификации и фаготипирования.

Определен комплекс бактериофагов, обеспечивающих 100 % чувствительность и специфичность фагодиагностики сибирскойязвы.

На основе анализа чувствительности к отдельным бактериофагам штаммов В. anthracis и выделенных из их популяции фагорезистентных вариантов впервые разработана схема фаготипирования с применением бактериофагов Гамма А-26 и 186, позволяющая определять фаготип.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований отражены в следующих технических и методических документах, нашедших применение в научно-исследовательской и практической деятельности учреждения.

1. Нормативная документация на препарат «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий»: технические условия (ТУ) 9386-01301897080-2009, пусковой регламент (ПУР) № 01897080-03-09, инструкция по применению. Получено регистрационное удостоверение от Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения № ФСР 2011/10451.

2. Методические рекомендации «Комплексное применение сибиреязвенных бактериофагов Гамма А-26 и 186 для идентификации и фаготипирования штаммов Bacillus anthracis», утвержденные директором ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, 3 сентября 2013 г., протокол заседания Ученого совета № 8.

Налажено производство препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий»

Результаты исследований используются для чтения лекций и проведения семинарских занятий на курсах повышения квалификации в ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора.

Методология и методы исследования. При подготовке и реализациипро-граммы исследования использована методология, базирующаяся на традиционных, адаптированных к специфике поставленных задач, методах. В исследованиях использовали методы:биотехнологические и микробиологические, с последующей современной компьютерной статистической обработкой!! научным анализом полученных данных.

Положения, выносимые па защиту:

1. Разработанная биотехнология производства бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 позволяет получать препарат, отвечающий регламентированным требованиям, обеспечивающий идентификацию штаммов сибиреязвенного микроба, различающихся по фенотипическим и генетическим свойствам, и стабильно сохраняющий диагностические свойства в течение гарантийного срока годности.

2. Штаммы возбудителя сибирской язвы различаются по чувствительности к специфическим бактериофагам: 99,1 % исследованных штаммов чувствительны к бактериофагам Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-6, и только 58,7-65,7 % чувствительны к бактериофагам Fah-ВНИИВВиМ, 186, Саратов, К ВИЭВ.

3. Применение бактериофага R/D-Ph-6 с широким спектром специфической активности в тесте РНФ с оптимизированными параметрами обеспечивает точность анализа при тестировании смешанных культур и материала, имитирующего пробы окружающей среды в тесте индикации В. anthracis.

4. Разработанная схема комплексного применения бактериофагов Гамма А-26 и R/D-Ph-6 или бактериофага 186, в совокупности лизирующихвесь спектр изученных сибиреязвенных штаммов, различающихся по фенотипическим и генетическим свойствам, обеспечивает 100 % чувствительности и 100 % специфичности фагодиагностики сибирской язвы.

5. По чувствительности к бактериофагам Гамма А-26 и 186 штаммы сибиреязвенного микроба разделяются на 3 фаготипа.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена самостоятельно. Отдельные этапы работы выполнены совместно с доктором медицинских

наук, профессором Буравцевой Н.П. и доктором медицинских наук Цыганковой О.И. (ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора).

Степень достоверности и апробация результатов. Результаты исследований получены с использованием современного поверенного оборудования с привлечением статистических методов обработки данных.

Материалы диссертации доложены на итоговых научно-практических конференциях ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (Ставрополь, 2012, 2013 гг.).

Материалы диссертации были представлены на Всероссийской научной конференции «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2009); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010); X Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ в современных условиях», (Ставрополь, 2010); Юбилейной Всероссийской научной конференции, посвященной 75-летию кафедры общей и военной эпидемиологии и 90-летию со дня рождения академика В.Д. Белякова «Отечественная эпидемиология в XXI веке: приоритетные направления развития и новые технологии в диагностике и профилактике болезней человека» (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы болезней общих для человека и животных» (Ставрополь, 2012); XI Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения» (Саратов, 2012); Региональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Причерноморском регионе» (Ставрополь, 2013).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 13 опубликованных работах. Из них: в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК — 3 статьи, депонировано - 1 работа, в сборниках научных трудов, материалах научных и научно-практических конференций - 9 статей.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 146 страницах компьютерного текста, содержит 33 таблицы и 9 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследований и экспериментальную часть; заключения; выво-

s

дов. Список литературы включает 147 источников, из них: 98 - отечественных и 49 - зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Диссертационная работа выполнена в рамках плановой НИР ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспот-ребнадзора: «Совершенствование биотехнологии производства и внедрение в практику препаратадиагностического сибиреязвенного бактериофага» (№ Госре-гистрации01.200.952159)

В работе использовали 122 штамма сибиреязвенного микроба и 75 штаммов близкородственных спорообразующих бацилл, полученных из лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов» ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора; 3 коммерческих препарата бактериофагов Fah-ВНИИВВиМ, R/D-Ph-6, Гамма А-26 и экспериментальные серии бактериофагов ВА-9, К ВИЭВ, Саратов, 186 из рабочей коллекции лаборатории сибирской язвы.

Для культивирования микроорганизмов использовали: гидролизат Хоттин-гера pH (7,3±0,1); 0,7 % и 2 % агар Хоттингера pH (7,3±0,1); казеиновый агар Гладстона-Филдса (7,3±0,1); 1 % бикарбонатно-сывороточный агар; среду LB по Миллеру.

Штаммы микроорганизмов выращивали на обогащенной жидкой питательной среде. Для определения концентрации фаговых частиц использовался метод агаровых слоев [Gratia А., 1936]. Чувствительность культур к специфическим бактериофагам определяли чашечным методом [МУК 4.2.2413-08].

Статистический анализ данных осуществляли с использованием пакета прикладных программ «Statistika 6,0», системы электронных таблиц Excel 7,0, достоверность различий оценивалась по критерию Стьюдента. Текстовый и графический материал оформлен на персональном компьютере под управлением операционной системы MSMicrosoflXPProfessional и офисного пакета MSOffice 2007.

Разработка технологии производства бактериофага диагностического сибиреязвенногоГамма А-26 жидкого

Для разработки биотехнологии производства необходимо было восстановить жизнеспособность длительно хранившегося бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26, определить оптимальные условия культивирования, отобрать наиболее продуктивные производственные штаммы (бактериофаг, штамм размножения) и штаммы для контроля литических свойств, установить срок хранения конечного продукта производства.

Поскольку наиболее простой является методика репродукции сибиреязвенных бактериофагов в жидких питательных средах, то дальнейший подбор произ-

водственной пары «штамм размножения - бактериофаг» проводили путем пассирования бактериофага Гамма А-26 в бульонных культурах вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба.

Проведенные исследования показали, что концентрация репродуцированного бактериофага зависит от типа штамма В. anthracis, на котором производилось его размножение. Из апробированных 6 вакцинных сибиреязвенных штаммов В. anthracis: СТИ, СТИ-ПР, 55, 228/8, Sterne 34F2, Ichtiman, в качестве штамма размножения был выбран - В. anthracis 228/8. Репродукция бактериофага сибире-язвенногоГамма А-26 в данных условиях позволила обеспечить воспроизводство фага с конечной концентрацией lxlO10БОЕ/мл и показателем ДРТ- 10'5.

С использованием подобранных оптимальных условий репродукции (питательная среда, посевная доза штамма размножения в виде спор, время подращивания культуры, заражающая доза производственного бактериофага Гамма А-26, длительность фазы размножения) были получены три экспериментальные серии бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26.

Литическая активность этих серий была определена на 33 типичных вирулентных штаммах сибиреязвенного микроба, 16 - атипичных по капсулообразо-ванию, 6 вакцинных штаммах и 72 штаммах близкородственных спорообразую-щих бацилл рода Bacillus. У всех тестируемых штаммов В. anthracis в месте нанесения бактериофага на агаровой культуре образовывались четкие, округлые зоны лизиса при отсутствии в них фагорезистентных колоний. Результаты испытания свидетельствовали, что бактериофаг сибиреязвенный Гамма А-26 лизировал все 55 (100 %) штаммов В. anthracis. Среди сапрофитных аэробных спорообразующих бацилл выявлено 6 штаммов (В. megaterium 1 , 2, 3; В. subtilis 35, 37, 336), чувствительных к действию бактериофага Гамма А-26. Специфичность бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого, полученного нами составила-91,7 %.

Для контроля специфической активности бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 в качестве индикаторных штаммов нами было отобрано 5 вакцинных штаммов В. anthracis, дающих четкий фаголизис (положительный контроль) с бактериофагом. В качестве отрицательного контроля мы отобрали 6 штаммов близкородственных сапрофитов (В. cereus 16, 104; В. megaterium 5, 89; В. subtilis 36, 83), не лизирующихся бактериофагом Гамма А-26.

Таким образом, лабораторные испытания литического спектра бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 выявили полное совпадение результатов воздействия всех серий бактериофага на тестируемые культуры.

При исследовании изменений концентрации фаговых частиц бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 при длительном хранении в оптимальных условиях установлено, что в препаратах всех трех серий концентрация бактериофага Гамма

А-26 на протяжении 3 лет не снижалась ниже регламентированного уровня. ДРТ всех серий для контрольного индикаторного штамма Д. ап^Лгас« СТИ после трех лет хранения составил 10"4, что свидетельствует об определенном резерве показателей активности т. к. предполагается применение препарата в неразведенном виде.

На основании полученных результатов был определен гарантированный срок хранения препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий», который составил 2 года.

Основные стадии производства препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий» представлены на рисунке 1.

Рисунок 1 - Основные этапы производства бактериофага диагностического-сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого Сравнительная оценка основных биологических свойств сибиреязвенных

бактериофагов

Были изучены свойства доступных сибиреязвенных бактериофагов, определяющие пригодность их для применения. В условиях одного исследования, изучали 7 сибиреязвенных бактериофагов:ЕаЬ-ВНИИВВиМ, ШО-РЬ-б, Гамма А-26, 186, ВА-9, Саратов и К ВИЭВ.

Одним из требований, предъявляемых к производственным бактериофагам, является эффективность их репродукции для получения препаратов с достаточно высокой концентрацией фаговых частиц. Репродукцию бактериофагов осуществляли на вакцинном штамме В. апХ1ггас1$ СТИ. Процесс размножения всех бактериофагов на штамме В. апЛгаш СТИ проходил с увеличением выхода фагового потомства (таблица 1).

Таблица 1 - Эффективность репродукции различных сибиреязвенных бактериофагов__

Исследуемые бактериофаги Концентрация фаговых частиц (БОЕ/мл^

^ производственных пре-таратах бактериофагов до шесения в среду после внесения в среду размножения в полученном фаголи-зате

186 4,0x10' 8х105 2,5хЮ1и

Саратов 2,0x10' 4х105 1,5хЮ1и

Гамма А-26 4,0* 107 8x10* 1.3x10"

ВА-9 4,0x10* 8x10й 2,8x10*

К ВИЭВ 2,0x108 4х106 1,9x10*

РаЪ-ВНИИВВиМ 1,0x108 2x10" 3,0х|01и

ЛЛЗ-РЬ-б 1,0* 108 2x10" 1,9x10'"

Проведено определение динамики концентрации бактериофагов при длительном хранении в оптимальных условиях. Анализ полученных данных показал, что хранение бактериофагов К ВИЭВ и ВА-9 в оптимальных условиях (4±2) "С в течение двух лет практически не изменило их концентрации, в отличие от фагов 186, Саратов, РаЬ-ВНИИВВиМ, Я/О-РЬ-б, у которых концентрация снизилась на порядок, а у фага Гамма А-26 - на два порядка. При этом все сибиреязвенные бактериофаги сохраняли специфическую литическую активность при применении неразведенного препарата.

При изучении стабильности показателей специфической активности диагностических сибиреязвенных бактериофагов, при кратковременном хранении в условиях температур, превышающих регламентированные (4±2) "С, установлено, что препараты диагностических сибиреязвенных бактериофагов РаЬ-ВНИИВВиМ, М)-РЬ-6, Гамма А-26, 186, ВА-9, Саратов, К ВИЭВ в достаточной степени сохраняют специфическую активность при кратковременных отклонениях условий хранения и транспортирования от регламентированных, если находятся (транспортируются) при температуре до 25 °С продолжительностью до 30 суток, и могут быть использованы в диагностических целях.

Изучая действие температур (от 30 "С до 100 °С с интервалом в 10 °С) на бактериофаги Гамма А-26, И/О-РЬ-б и 186, определили, что они имеют разную степень чувствительности к температуре. При этом бактериофаг Гамма А-26 об-

ладает относительно низкой устойчивостью к действию повышенных температур (70 °С), а R/D-Ph-б и 186 наибольшей термоустойчивостъю.

Результаты проведенных исследований продемонстрировали, что диагностические сибиреязвенные бактериофаги Fah-ВНИИВВиМ, R/D-Ph-б, Гамма А-26, 186, ВА-9, Саратов, К ВИЭВ обладают свойствами необходимыми для производства их в виде препаратов: эффективно размножаются в жидкой культуре ави-рулентного штамма В. anthracis СТИ, в достаточной степени сохраняют специфическую активность при хранении (4±2) "С в течение двух лет, а также в условиях транспортирования, если находятся при температуре до 25 °С продолжительностью до 30 суток.

Определение спектра специфической литической активности сибиреязвенных бактериофагов

Для определения спектра специфическойлитической активности сибиреязвенных бактериофагов были использованы 114 штаммов В. anthracisc разными свойствами: 1) типичные по капсулообразованию - 80 штаммов; 2) атипичные по капсулообразованию - 26 штаммов; 3) атипичные по морфологии (OSS-варианты по классификации Л.И. Маринина, 2009) - 4 штамма; 4) штаммы не имеющие плазмиду pXOl - 1 штамм; 5) штаммы не имеющие плазмид pXOl и рХ02 - 3 штамма.

Анализ результатов показал, что лизабельность штаммов сибиреязвенного микроба бактериофагами Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-б была одинаковой в целом -99,1 %. Бактериофаги Fah-ВНИИВВиМ (67,5 %), К ВИЭВ (68,7 %), Саратов (75,0 %) и 186 (76,3 %) в большей степени различались по широте спектра лизи-руемых культур (таблица 2), при этом различия наблюдались только в группе вирулентных диплазмидных штаммов.

Учитывая интерес, проявляемый в настоящее время, к бактериофагам в плане возможности применения их или синтезируемых ими лгоинов в качестве антибактериального средства для лечения сибирской язвы, исследовали влияние капсулы на чувствительность бактериальных клеток к литическому действию сибиреязвенных бактериофагов.

При определении способности к капсулообразованию in vitro и влияния капсулы на фагочувствительность, была отобрана группа штаммов В. anthracis различающихся по ряду фенотипических свойств: 1) типичные штаммы образующие капсулу in vivo и на сывороточно- бикарбонатном агаре в условиях повышенного содержания углекислого газа; 2) штаммы, способные к капсулообразованию на питательных средах в атмосфере воздуха; 3) штаммы, не образующие капсулу ни при каких условиях (отсутствует плазмида рХ02). В качестве питательных сред применялись: среда, приготовленная на основе LB по Миллеру, среда Хоттингера и бикарбонатно-сывороточная среда.

Таблица 2 - Штаммы сибиреязвенного микроба, лизируемые бактериофагами

Штаммы В. anthracis Количество штаммов В. anthracis, лизщ руемых бактериофагами:

Гамма А-26 ВА-9 R/D-Ph-6 Fah-ВНИИВВиМ К ВИЭВ Саратов 186

Типичные по ¡сапсулообразо- ванию 79/80* (98,8 %) 79/80 (98,8 %) 80/80 (100%) 54/80 (67,5 %) 55/80 (68,7 %) 60/80 (75,0 %) 61/80 (76,3 %)

Атипичные по капсулообразо- ванию 'включая SM) 26/26 (100 %) 26/26 (100%) 25/26 (96,2 %) 10/26 (38,5 %) 10/26 (38,5 %) 10/26 (38,5 %) 10/26 (38,5 %)

Атипичные по морфологии [OSS - варианты) 4/4 (100%) 4/4 (100%) 4/4 (100%) 0/4 (0 %) 0/4 (0 %) 0/4 (0 %) 0/4 (0 %)

Штаммы, не имеющие плазмидурХОГ 1/1 (100%) 1/1 (100%) 1/1 (100%) 1/1 (100%) 1/1 (100 %) 1/1 (100%) 1/1 (100 %)

Бесплазмидные штаммы 3/3 (100 %) 3/3 (100%) 3/3 (100%) 3/3 (100%) 3/3 (100%) 3/3 (100%) 3/3 (100 %)

Всего 113/114 113/114 113/114 68/114 69/1 14 74/1 14 75/114

% 99,1 99,1 99,1 59,6 60,5 64,9 65,8

Примечание: *числитель - количество лизирующихся штаммов; знаменатель - общее количество штаммов.

Результаты исследований свидетельствуют, что капсульные клетки не чувствительны к действию всех бактериофагов, так как капсула предохраняет клетку от адсорбции бактериофагов. Было четко выявлено, что штаммы в акапсульной форме формирующие колонии ОБв-типа не лизируются бактериофагами РаЬ-ВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов и 186 (рисунок 2), что, вероятно,связано с отсутствием рецепторов специфичных для данных бактериофагов.

Рисунок 2 - Различная чувствительность культур двух типов В. апИггаЫя 646/294 к бактериофагам различных групп: А -вариант I типав Я-форме, Б - вариант II типа в ОЗЭ-форме.В надписях на чашках обозначены бактериофаги: 1-Гамма А-26; 2 - К ВИЭВ; 3 - РаЫВНИИВВиМ; 4 - Саратов; 5 - МЭ-РЬ-б; 6-186; 7 - ВА-9; 8 - Н/Б-РЬ-б в концентрации 106.

Изучение специфичности диагностических бактериофагов Bacillus anthracis Определение специфичности действия сибиреязвенных бактериофагов на 75 штаммах близкородственных спорообразующих сапрофитах (В. cereus, В. thurin-giensis, В. subtilis, В. megaterium, В. mesentericus, В. species) показало, что сибиреязвенные бактериофаги Fah-ВНИИВВиМ, R/D-Ph-6 , К ВИЭВ, Саратов и 186 не вызывали лизиса штаммов спорообразующих сапрофитов рода Bacillus и обладали 100 % специфичностью (таблица 3).

Таблица 3 - Сравнительная характеристика специфичности сибиреязвенных бактериофагов____________

Бактериофаг Кол-во штаммов бацилл отдельных видов, лизирующихся бактериофагом Всего Специфичность, %

Bacillus cereus Bacillus thurimgiensis Bacillus subtilis Bacillus megaterium Bacillus mesentericus Bacillus . species

186 0/18* 0/14 0/16 0/7 0/1 0/19 0/75 100

R/D-Ph-6 0/18 0/14 0/16 0/7 0/1 0/19 0/75 100

Fah-ВНИИВВиМ 0/18 0/14 0/16 0/7 0/1 0/19 0/75 100

К ВИЭВ 0/18 0/14 0/16 0/7 0/1 0/19 0/75 100

Саратов 0/18 0/14 0/16 0/7 0/1 0/19 0/75 100

Гамма А-26 0/18 0/14 3/16 3/7 0/1 0/19 ens 92

ВА-9 0/18 0/14 3/16 3/7 0/1 0/19 6/75 92

Примечание: *числитель - количество лизирующихся штаммов, знаменатель - общее количест-воштаммов.

Проявления неспецифического лизиса наблюдались при действии бактериофагов Гамма А-26 и ВА-9, которые лизировали одни и те же штаммы близкородственных сапрофитов рода Bacillus (В. subtilis 35, 37, 336; В. megaterium 1, 2, 3), однако значения ДРТ бактериофагов даже для наиболее чувствительных культур — В. subtilis 336 и В. megaterium 3 были ниже на два порядка по сравнению с контрольным штаммом В. anthracis СТИ.

Изучение возможности использования видоспецифического сибиреязвенного бактериофага R/D-RH-6 для индикации возбудителя В. anthracis в РНФ

По результатам проведенного нами сравнительного анализа свойств ни один из 7 сибиреязвенных бактериофагов не лизировал 100 % штаммов В. anthracis, однако, бактериофаги Гамма А-26 и R/D-Ph-6 лизировали наибольшее количество (по 99,1 %) исследованных штаммов, причем в совокупности они лизировали 100 % штаммов. Указанные бактериофаги выпускаются в виде сертифицированных коммерческих препаратов и могут быть рекомендованы для комплексного применения при идентификации штаммов возбудителя сибирской язвы.

Для фаготипирования штаммов В. anthracis,можно считать обоснованным сочетанное применение препаратов бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 и

экспериментальных серий бактериофага 186, обеспечивающих также 100 % чувствительности и 100 % специфичности анализа.

Бактериофаг R/D-RH-6 в наибольшей степени обладает сочетанием широкого спектра литического действия на штаммы сибиреязвенного микроба с высокой специфичностью, поэтому может быть использован в методах индикации возбудителя сибирской язвы, основанных на применении специфических сибиреязвенных бактериофагов.

Использование бактериофага R/D-Ph-б в целях индикации В. anthracis в объектах окружающей среды предполагает его размножение в жидкой питательной среде в условиях значительной контаминации близкородственными сапрофитными представителями рода Bacillus, в связи с чем было необходимо определить влияние этих культур на динамику нарастания концентрации бактериофага на культурах возбудителя сибирской язвы. Учитывая,что оценка теста производится в количественных показателях, необходимо было исключить влияние всех возможных факторов.

Для оценки возможности применения бактериофага R/D-RH-6 в тесте РНФ необходимо было более детально изучить количественные параметры динамики концентраций культуры В. anthracis и бактериофага, определить показатели специфической активности и специфичности в условиях их проявления в жидкой питательной среде. Также важным являлось изучение возможного влияния присутствия сапрофитных представителей рода Bacillus на концентрацию фаговых частиц в фильтрате среды инкубирования.

При изучении динамики изменения концентрации сибиреязвенного микроба и бактериофага R/D-RH-6 при культивировании в бульонной культуре были определены такие ключевые параметры как посевная доза идентифицируемого микроорганизма (1x108 КОЕ/мл), время предварительного подращивания до внесения бактериофага (3 ч), длительность совместной инкубации от внесения бактериофага до получения фильтрата (8 ч).

В результате изучения специфической активности бактериофага R/D-RH-6 в РНФ на различных штаммах сибиреязвенного микробаустановлено, что при использовании в качестве культуры размножения 31 штамма В. anthracis во всех случаях наблюдалось эффективное размножение бактериофага: на 18 из них (58,1 %), концентрация последнего достигала 1><109 БОЕ/мл, на 7 (22,6 %) - 10s БОЕ/мл, на 5 (16,1 %) - 10ш БОЕ/мл и только на одном штамме (3,0 %) — 10 БОЕ/мл, при этом минимальное увеличение концентрации бактериофага составляло четыре порядка.

Чтобы проверить возможность нарастания концентрации бактериофага R/D-RH-6 при культивировании в бульонных культурах близкородственных бацилл, проводили совместную инкубацию бактериофага R/D-RH-6 с 10 культурами са-

профитных представителей рода Bacillus. Уменьшение концентрации бактериофага отмечалось с половиной (50 %) из 10 использованных культур, а еще у 30 % -присутствие бактериофага не определялось. Способной обеспечивать размножение бактериофага R/D-RH-6 оказалась одна культура (10 %) - В. subtilis 37. При совместном культивировании штамма В. subtilis 37 с бактериофагом R/D-RH-6, концентрация последнего возрастала на 2 порядка.

Полученные данные о характере изменения концентрации бактериофага при размножении на смешанных культурах свидетельствуют о том, что присутствие, по крайней мере, некоторых близкородственных представителей рода Bacillus в среде размножения снижает на 2-3 порядка конечную концентрацию бактериофага R/D-RH-6 по сравнению с репродукцией на чистых культурах В. anthracis.

При испытании бактериофага R/D-RH-6 в РНФ на материале, имитирующем пробы окружающей среды (пробы из сена, зерна и почвы), контаминированном В. anthracis наблюдали увеличение концентрации бактериофага на 1-2 порядка по сравнению с контрольными пробами, что дает основание считать результат РНФ положительным.

Таким образом, в процессе выполнения работы были оптимизированы параметры проведения РНФ с использованием указанного бактериофага при учете результатов количественным методом по нарастанию концентрации бактериофага. Выявлено что бактериофаг R/D-RH-6 обладает достаточной специфической активностью - все исследованные штаммы В. anthracis (31), различающиеся по комплексу фенотипических свойств, в тесте давали положительный результат. Специфичность теста составила 90 %. Удовлетворительные результаты были получены и при тестировании смешанных культур и материала, имитирующего пробы окружающей среды.

Изучение возможности повышения эффективности фагодиагностики сибирской язвы при комплексном использовании бактериофагов

с различным литическим спектром Были выделены фагорезистентные культуры и определена их чувствительность к различным бактериофагам. Всего было отобрано 102 варианта штаммов В. anthracis по признаку устойчивости к тому или иному бактериофагу .Чаще всего выделялись культуры, резистентные к бактериофагам Fah-ВНИИВВиМ (32), К ВИЭВ (23), Саратов (20), 186 (17) - всего 92 культуры. Значительно реже выделялись варианты по признаку резистентности к лизирующему действию бактериофагов ВА-9 (5), Гамма А-26 (3) и R/D-Ph-6 (2).

На основе полученных данных, можно выделить 3 группы фагорезистент-ных вариантов В. anthracis, имеющих общие закономерности внутри каждой группы по чувствительности к изученным бактериофагам.

Штаммы первой группы, выделенные по признаку резистентности к бактериофагам Гамма А-26 и ВА-9 сохраняли фагорезистентность к обоим бактериофагам, при этом резистентность к литическому действию остальных бактериофагов проявлялась лишь в 18-38 "/¿.Варианты сибиреязвенного микроба резистентные к бактериофагам К ВИЭВ, РаЬ-ВНИИВВиМ, Саратов, 186 и представляющие вторую группу, ещё более четко демонстрировали различия в чувствительности к различным бактериофагам. Резистентным к действию бактериофагов Гамма А-26, ВА-9 и К/О-РЬ-б оказался только 1 % культур (1 вариант был резистентен к действию всех бактериофагов), тогда как 98-100 % из них были устойчивы к специфическому действию бактериофагов К ВИЭВ, РаЬ-ВНИИВВиМ, Саратов, 186. Немногочисленные культуральные варианты В. аШИгас'^ третьей группы (выделенные по признаку резистентности к бактериофагу Я/0-РЬ-6) были устойчивы к действию всех использованных в работе бактериофагов.

Для идентификации культур В. атНгаш предпочтительно применение наиболее вирулентных бактериофагов, резистентность к которым выявляется в минимальном количестве случаев при равных показателях специфичности. Оптимальным для идентификации является схема комплексного применения бактериофагов Гамма А-26 и К/Б-РЬ-б.

Результаты проведенных исследований стали основой для разработки схемы комплексного применения сибиреязвенных бактериофагов с различным спектром специфической активности для идентификации и фаготипирования штаммов В. аШИгаш.

При изучении специфической литической активности бактериофагов Гамма А-26, ВА-9, Я/О-РЬ-б, 186, РаЬ-ВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов было выявлено, что по широте спектра литического действия их можно разделить на две группы. К первой группе относятся бактериофаги Гамма А-26, ВА-9, Я/Б-РЬ-б, лизирую-щие 99,1 % штаммов В. ап&гаЫз, ко второй группе - бактериофаги 186, РаЬ-ВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов лизирующие 59,6 - 65,8 % этих же штаммов.

Исходя из этого, с целью идентификации и фаготипирования штаммов сибиреязвенного микроба оптимально одновременное применение бактериофагов с различной широтой литического спектра, один из которых лизирует все культуры В. аМИтый и обеспечивает надежность теста идентификации сибиреязвенных штаммов, а второй, проявляя избирательность в литическом действии по отношению к части культур, имеющих сходные свойства, способен эффективно выявлять эти различия. Из первой группы нами был выбран бактериофаг Гамма А-26, из второй группы предпочтение в применении для фаготипирования штаммов сибиреязвенного микроба было отдано бактериофагу 186, т. к. он лизировал большее (в данной группе бактериофагов) количество штаммов и в положительных случаях давал более четкие результаты.

Была разработана схема проведения комплексного теста, в которой исполь-зуютдва бактериофага: Гамма А-26 и 186, в основе которой находится чашечный метод, сопровождающийся двумя контролями.

В зависимости от наличия чувствительности к литическому действию обоих бактериофагов или одного из них определяется один из 3 фаготипов (таблица 4): Таблица 4 - Результаты оценки комплексного теста

Лизис бактериофагом Гамма А-26 Лизис бактериофагом 186 Идентификационный тест Фаготип

+ + положительный 1

+ - положительный 2

- + положительный 3

- - отрицательный не является В. апЛгас'и*

Примечание: (*) - теоретически возможен очень редкий штамм В. апЛгаси, отсутствующий в выборке изученных штаммов

Первый фаготип - культура лизируется бактериофагами Гамма А-26 и 186; 2 фаготип - культура лизируется бактериофагом Гамма А-26; 3 фаготип - культура лизируется бактериофагом 186. При изучении чашечным методом 114 штаммов В. апЛгас18 идентификационный тест был положителен у всех, к фаготапу 1 принадлежали 74,6 %, к фаготипу 2 - 24,5 % и к фаготипу 3 - 0,9 % исследованных штаммов. Наиболее типичными являются штаммы, относящиеся к фаготипу 1. Штаммы 2 и 3 фаготипов представляют интерес для всестороннего изучения, так как фагорезистентные штаммы и культуральные варианты нередко обладают целым комплексом атипичных фенотипических свойств [Цыганкова О.И. с соавт., 2008].

Разработана схема фаготипирования штаммов В. апАгаЫз, основанная на различиях в их чувствительности к бактериофагам, обладающих различным спектром литической активности, что выявляет не только наличие или отсутствие специфических рецепторов, но и особенности поверхностных структур бактериальных клеток, что влечет за собой изменение культурально-морфологических характеристик, адгезивных и антигенных свойств, иммуногенности.

Таким образом, на основании проведенных исследований и полученных результатов разработана биотехнология производства, оформлена техническая документация и налажен выпуск препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий». Получены новые сведения о биологических и диагностических свойствах семи сибиреязвенных бактериофагах, оценены возможности их использования в различных тестах с применением бактериофагов. Обосновано комплексное применение бактериофагов Гамма А-26 и Л/О-РЬ-б с широ-

ким спектром специфической активности для повышения достоверности фагоди-агностики сибирской язвы. Разработана схема фаготипирования штаммов В. anthracis, применение которой позволяет получить дополнительную характеристику культур и отобрать из их числа представляющие интерес для изучения механизмов фагорезистентности.

Выводы

1. Разработана биотехнология производства препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий»: предложен новый авирулентный штамм размножения (продуцент) бактериофага В. anthracis 228/8, подобраны условия репродукции бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 - дозы внесения культуры размножения в виде спор и производственного бактериофага, длительность инкубирования (получения фаголизата), экспериментально обоснован срок годности готового препарата.

2. Определены штаммы В. anthracis с различной чувствительностью к литиче-скому действию бактериофагов для проверки специфической активности и са-профитов рода Bacillus для подтверждения специфичности препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий».

3. Составлена и утверждена нормативная документация на бактериофаг сибиреязвенный Гамма А-26: технические условия (ТУ) 9386-013-01897080-2009, пусковой регламент (ПУР) № 01897080-03-09, инструкция по применению. Получено регистрационное удостоверение от Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения № ФСР 2011/10451. Налажено производство препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий».

4. Сибиреязвенные бактериофаги Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-6, 186, Fah-ВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов обладают различной специфической активностью и специфичностью. Бактериофаги Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-6 лизировали 99,1 % штаммов с разными фенотипическими свойствами, бактериофаги Fah-ВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов, 186 - 58,7-65,7 %. Бактериофага R/D-Ph-6, 186, Fah-ВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов обладают 100 % специфичностью, соответствующий показатель для бактериофагов Гамма А-26, ВА-9 составил 92 %.

5. На основании сравнительного анализа специфической активности и специфичности 7 сибиреязвенных бактериофагов установлено, что повышение достоверности фагодиагностики сибирской язвы может быть достигнуто за счет: комплексного применения бактериофагов Гамма А-26 и R/D-Ph-6 или 186 для идентификации штаммов сибиреязвенного микроба; бактериофага R/D-Ph-6 - для индикации В. anthracis в объектах окружающей среды методом РНФ; сочетанное применение сибиреязвенных бактериофагов Гамма А-26 и 186 для определения фаготипов штаммов возбудителя сибирской язвы.

6. Оптимизированы параметры теста РНФ с применением бактериофага 1ЪТ)-11Н-6 (предварительное подращивание пробы в течение 3 ч, доза внесения бактериофага - 2*104БОЕ/мл, последующая инкубация 8 ч). Доказана возможность применения бактериофага ИЛЗ-ЯН-б в тесте РНФ в целях индикации В. атНгаш в объектах окружающей среды.

7. В зависимости от наличия чувствительности к литическому действию бактериофагов Гамма А-26 и 186 или одного из них,штаммы В. амкгаш разделяются на 3 фаготипа. При изучении фаготипов предложенным методом, из 114 штаммов В. ап&гасЬ к фаготипу 1 принадлежали 74,6 %, к фаготипу 2 - 24,5 % и к фаготи-пу 3 - 0,9 % исследованных штаммов. По основным культурально-морфологическим и биохимическим свойствам наиболее типичными являются штаммы, относящиеся к фаготипу 1.

Практические рекомендации

1. При производстве препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий» использовать экспериментально обоснованную биотехнологическую схему, позволяющую получать препарат с высокой специфической активностью при сокращении времени производства, количества манипуляций и увеличении гарантированного срока годности

2. Для контроля качества препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий» в числе контрольных штаммов В. anth.ra.cis использовать вакцинный штамм 55, положительная проба с которым подтверждает широкий спектр специфической литической активности данного препарата, так как бактериофаги с более узким спектром литической активности (186, РаЬ-ВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов) не лизируют указанный штамм.

3. В целях повышения достоверности идентификации штаммов В. апШгаш использовать препараты диагностических бактериофагов «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий» и фаг-тест-набор «Оболенск Ш», лизирующие 99,1 % штаммов сибиреязвенного микроба с разными феноти-пическими свойствами

4. Для индикации возбудителя сибирской язвы использовать в тесте РНФ -бактериофаг ИЯЗ-РЬ-б (фаг-тест-набора «Оболенск И1») с широким спектром специфической активности

5. В практике работы «Референс-центра по мониторингу за возбудителем сибирской язвы» для идентификации штаммов возбудителя сибирской язвы и изучения их биологических свойств использовать комплексное применение бактериофагов «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий» экспериментальные серии бактериофага 186, что обеспечит идентификацию 100% штаммов и позволит определить их фаготип, ассоциирующийся с определенными фенотипическими особенностями.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Буравцева, Н. П. Сравнительная характеристика сибиреязвенных бактериофагов / Н. П. Буравцева, Т. М. Головинская, А. Г. Рязанова // Проблемы современной эпидемиолога». Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций: сб. науч. работ Всероссийской науч, конф. на базе Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (19-20 ноября, 2009). -Санкт-Петербург, 2009. - С. 125.

2. Рязанова, А. Г. Подбор производственного штамма сибиреязвенного микроба для размножения бактериофага «Гамма А-26» / А. Г. Рязанова, Т. М. Головинская, Н. П. Буравцева // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: матер, науч.-практич. школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора (25-27 мая, 2010). -Оболенск, 2010. - С. 332-334.

, Головинская, Т. М. Изучение специфичности диагностических сибиреязвенных бактериофагов / Т. М. Головинская, Н. П. Буравцева // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ в современных условиях (5-6 октября 2010). - Ставрополь, 2010, - С. 167168.

. Сравнительное изучение литической активности и специфичности экспериментальных серий бактериофагов Гамма А-26, К ВИЭВ, ВА-9 и Fah-ВНИИВВиМ / Т. М. Головинская, Н. П. Буравцева, О. И. Цыганкова, Е. И. Еременко // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - Вып. 3 (109). - С. 28-30. (Журнал из перечня ВАК).

. Головинская, Т. М. Подбор штамма Bacillus anthracis для репродукции сибиреязвенного бактериофага 186 / Т. М. Головинская, О. И. Цыганкова // Отечественная эпидемиология в XXI веке: приоритетные направления развития и новые технологии в диагностике и профилактике болезней человека: матер. Юбилейной Всероссийской науч.-практич. конф., посвящ. 75-летию кафедры общей и военной эпидемиологии и 90-летию со дня рождения академика В.Д. Белякова Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (19-20 апреля 2012). - Саикт-Петербург, 2012.-С. 143-144.

. Апробация применения бактериофага «R/D-Rh-6» в тесте нарастания титра для идентификации Bacillus anthracis / О. И. Цыганкова, Н. П. Буравцева, Т. М. Голо-пинскап, А. Г. Рязанова, JL В. Ляпустина, С. Ф. Бекетова // Актуальные проблемы болезней общих для человека и животных: матер. Всероссийской иауч.-практич. конф. с междунар. участием (23-24 мая 2012). - Ставрополь, 2012. - С. 147-148.

. Головинская, Т. М. Изучение устойчивости сибиреязвенных бактериофагов «Гамма А-26» и «186» к действию высоких температур / Т. М. Головинская, О.

И. Цыганкова // Актуальные проблемы болезней общих для человека и животных: матер. Всероссийской науч.-практич. конф. с междунар. участием (23-24 мая 2012).-Ставрополь, 2012.-С. 166.

8. Головинская, Т. М. Сравнительная характеристика литической активности сибиреязвенных бактериофагов по отношению к фагорезистентным вариантам культур Bacillus anthracis / Т. М. Головинская, О. И. Цыганкова // Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения: матер. XI Межгосударственной науч.-практич. конф. (16-17 октября

2012).-Саратов, 2012.-С. 66-68.

9. Головинская, Т. М. Сибиреязвенные бактериофаги: биологические свойства, практическое применение (обзор литературы) / Т. М. Головинская. - М., 2013. -33с.-Деп. в ВИНИТИ

10. Совершенствование фагодиагностики сибирской язвы: оценка специфичности бактериофага «186» / Т. М. Головинская, О. И. Цыганкова, А. Г. Рязанова, А. Н. Куличенко // Медицинский вестник Северного Кавказа. - 2013. - № 1. - С.68-69. (Журнал из перечня ВАК).

11.Головинская, Т. М., Цыганкова О,И. Влияние температурного режима на сохранение специфической активности сибиреязвенных бактериофагов / Т. М. Головинская, О. И. Цыганкова // Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемического благополучия в Причерноморском регионе: региональная науч.-практич. конф. с междунар. участием (24-25 сентября 2013): элетрон. издание. -Ставрополь, 2013. - С.93-94. - Режим доступа: http://snipchi.ru/updoc/Materiali%20konfcrenzii Sbornik.pdf

12.Цыганкова, О. И.Перспективы комплексного применения сибиреязвенных бактериофагов Гамма А-26 и 186 для идентификации и фаготипирования штаммов Bacillus anthracis / О. И. Цыганкова, Т. М. Головинская // Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемического благополучия в Причерноморском регионе: региональная науч.-практич. конф. с междунар. участием (24-25 сентября

2013): элетрон. издание. - Ставрополь, 2013. - С.93-94. - Режим доступа: httn://snipchi.ru/undoc/Materiali%20konferenzii Sbornik.pdf.

13.Головинская, Т. М. Разработка биотехнологии репродукции сибиреязвенных бактериофагов и сравнительная оценка стабильности их свойств и диагностической ценности / Т. М. Головинская, О. И. Цыганкова, А.Н. Куличенко // Проблемы особо опасных инфекций. - 2014. - Вып. 2 - С. 104-107. (Журнал из перечня ВАК).

ГОЛОВИНСКАЯ ТАТЬЯНА МИХАЙЛОВНА

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 30.09.2014 Формат 60x84 1/16. Гарнитура Times New Roman. Бумага офсетная. Объем 1,0 уч. изд. л. Тираж 100 экз. Заказ № 1262 Отпечатано в типографии "Master Jet Technology" 355000, Ставропольский край, г. Ставрополь, ул. Приозерная, 1