Конструирование магноиммуносорбента для обнаружения возбудителя сибирской язвы

Лягоскин, Иван Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Конструирование магноиммуносорбента для обнаружения возбудителя сибирской язвы
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование магноиммуносорбента для обнаружения возбудителя сибирской язвы"

003485760

На правах рукописи

УДК: 619:616.98:579.852.11.573.6.579

ЛЯГОСКИН ИВАН ВЛАДИМИРОВИЧ

Конструирование магноиммуносорбента для обнаружения возбудителя

сибирской язвы

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор, Селянинов Ю.О.

Покров, 2009 - 3 ДЕК 2009

003485760

Работа выполнена в Государственном научном учреждешн Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственны> наук (ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ).

Научный руководитель

доктор биологических наук,

профессор Селянинов Юрий Олегович

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук,

профессор Гаврилов Владимир Андреевич

доктор биологических наук,

профессор Еремец Владимир Иванович

Ведущая организация - Федеральное государственное учреждение «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных», г. Казань

Защита диссертации состоится «18» декабря 2009 г. в «11-30» часов на заседании диссертационного совета при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120, Владимирская обл., Покров, ГНУ ВНИИВВиМ. Тел/факс: (49243)62125.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ. Автореферат разослан «13» ноября 2009 г.

И.о. Ученого секретаря диссертационного совета,

доктор ветеринарных наук, профессор

Хрипунов Е.М.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Проблемы совершенствования и разработки новых методов индикации патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды и в настоящее время продолжают оставаться актуальными. Уже более 50 лет для этих целей успешно применяются иммунохимические методы, в основе которых лежит образование высокоспецифического комплекса антиген - антитело. Однако на практике значительные потенциальные возможности современных методов не всегда реализуются. Во-первых, это связано с трудностями выделения культур микроорганизмов из различных объектов внешней среды, особенно при низких концентрациях обнаруживаемых в пробе бактерий. Во-вторых, высокий уровень контаминации исследуемых объектов посторонней микрофлорой, в том числе обладающей значительным уровнем антигенного родства.

Поскольку сибирская язва наряду с такими патогенами как клостридии, нерсинии, листерии, клебсиеллы и др. относится к почвенно-очаговым инфекциям, все указанные проблемы индикации присущи и этому микроорганизму, а применяемые в настоящее время утвержденные методы обнаружения В.аЫЬгасЬ характеризуются достаточно высокой трудоемкостью и низким процентом выделения (Бургасов П.Н. и др., 1970; Соркин Ю.И. и др., 1988).

Для повышения эффективности индикации патогенов из объектов окружающей среды был предложен метод, основанный на использовании магнитных сорбентов, представляющих собой полимерные микрогранулы с композитными феррочастицами, и иммобилизированными на их поверхности специфическими антителами. Сорбенты позволяют осуществлять селективное концентрирование на своей поверхности целевых клеток и одновременно освобождаться от контаминирующей микрофлоры и примесей (Ефременко В.И., 1996).

В 2003 году Абгарян А.Г. с соавт. для индикации В. аткгас1з в пробах

почвы были изготовлены магнитные частицы с сорбированными на них

антиспоровыми иммуноглобулинами в. Однако сорбированные

иммуноглобулины, выделенные из полиспецифических сывороток, обладали

высоким уровнем перекрестных реакций со спорами близкородственных

сапрофитов. что явилось препятствием для широкого внедрения метода в практику.

Наличие значительного числа сибиреязвенных захоронений и падёжных мест на территории РФ и существование постоянной угрозы возникновения инфекции обусловливают необходимость разработки эффективных и специфичных методов выявления возбудителя сибирской язвы в объектах окружающей среды.

Цель и задачи исследования

Целыо данной работы являлось сравнительное изучение антигенного состава спор возбудителя сибирской язвы и близкородственных сапрофитов, получение видоспецифических противосибиреязвенных антиспоровых иммуноглобулинов и конструирование на их основе магноиммуносорбентов, пригодных для селективного обнаружения спор В. anthracis в объектах внешней среды.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести комплексное изучение фенотипических, антигенных и дифференциальных свойств штаммов/изолятов группы В. cereus.

2. Изучить полипептидный спектр поверхностных споровых белков сибиреязвенного микроба и близкородственных сапрофитов и подобрать эффективный метод выделения специфических антигенов из спор В. anthracis.

3. Подобрать эффективную схему иммунизации животных для получения иммунных сывороток с высокими титрами антиспоровых антител.

4. Изучить полипептидную специфичность антител антиспоровых сывороток и перекрёстную реактивность поверхностных антигенов спор штаммов группы Bacillus cereus.

5. Из гипериммунных сывороток выделить и охарактеризовать видоспецифические противосибиреязвенные антиспоровые иммуноглобулины.

6. На основе видоспецифических иммуноглобулинов к спорам сибиреязвенного микроба изготовить экспериментальные образцы иммунореагентов для иммунофлюоресцентного и иммуноферментного анализов и оценить возможность их использования для детекции антигенов В. anthracis.

7. Сконструировать магноиммуносорбент для обнаружения возбудителя сибирской язвы, изучить его селективные свойства, разработать методику применения и провести испытания в лабораторных и приближённых к реальным условиях..

Научная новизна работы

1. Определены методические приемы и их последовательность, дающие возможность конструировать магноиммуносорбент с иммобилизированными на его поверхности видоспецифичными сибиреязвенными антиспоровыми антителами.

2. Разработан способ селективного выделения спор возбудителя сибирской язвы из объектов внешней среды.

3. Установлено, что сэндвич - метод ТФ ИФА на основе видоспецифических иммуноглобулинов к спорам сибиреязвенного микроба позволяет дифференцировать споры В. амЬ-аЫй от спор штаммов сапрофитов рода ВасШш независимо от степени их антигенного родства.

Практическая значимость результатов исследования

1. Предложена эффективная схема иммунизации лабораторных и сельскохозяйственных животных, позволяющая получать активные иммунные сыворотки на поверхностные антигенные детерминанты спор .5. амкгаая и оптимизирован метод выделения видоспецифических сибиреязвенных антиспоровых иммуноглобулинов.

2. На основе видоспецифических иммуноглобулинов к спорам сибиреязвенного микроба изготовлены иммунореагенты для иммунофлюоресцентного и иммуноферментного анализов и разработан высокоспецифичный сэндвич - метод ТФ ИФА для детекции антигенов Я апЛгааз.

3. Метод получения магноиммуносорбента, обладающего селективной сорбцией спор сибиреязвенного микроба из пула спорообразующей микрофлоры предлагается к использованию при разработке и совершенствовании схем индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды.

Результаты экспериментальной работы использованы при разработке следующих документов:

«Методические рекомендации по подготовке проб почвы к исследованию на контаминацию возбудителем сибирской язвы» (2008 г.);

- «Методические рекомендации по изготовлению и применению магноиммуносорбента на основе иммуноглобулинов к спорам B.anthracis» (2009 г.).

Вышеперечисленные документы одобрены ученым советом, утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ РОСЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ и рассмотрены на секции Биотехнологии Отделения ветеринарии РАСХН.

Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые

на защиту

Методические подходы к конструированию магноиммуносорбента с иммобилизованными на поверхности антиспоровыми сибиреязвенными антителами и использование его для обнаружения возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды.

Результаты экспериментальных исследований по разработке сэндвич -метода ТФ ИФА для дифференциации спор В. anthracis от спор типичных и близкородственных в антигенном отношении представителей рода Bacillus.

Апробация и публикация результатов

Материалы диссертации доложены на международных научно-практических конференциях «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» ВНИТИБП (Щёлково, 2006, 2007), международных научно-практических конференциях «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2007, 2008, 2009); «Актуальные вопросы инвазионной и инфекционной патологии животных» (Улан-Удэ, 2008); «Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных и микотических болезней сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб и пчел», ВИЭВ (Москва, 2009) и на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ (2005 - 2009).

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 1 статья в журнале «Ветеринария», включенном в перечень изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Личный вклад автора в выполнении работы

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали следующие сотрудники института: к.в.н. И.Ю. Егорова (освоение микробиологических методов), к.б.н., Е.Г. Анохина (освоение методов электрофоретического разделения белков и иммуноблоттинг), к.в.н. О.В. Капустина (освоение методов иммуноферментного анализа), к.б.н. И.В. Ногина (освоение методов мечения иммуноглобулинов ФИТЦ), д.б.н. В.Н. Пономарев (электронная микроскопия, получение магносорбентов).

Объем it структура диссертации

Диссертация изложена на 154 страницах, иллюстрирована 19 таблицами и 24 рисунками. Список литературы включает 194 источника, из которых 61 иностранных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы н методы

Штаммы и изоляты микроорганизмов: В работе были использованы культуры следующих микроорганизмов: вакцинных штаммов В. anthracis 55-ВНИИВВиМ, М-71, "Sterne", Шуя-15, A Ames, СТИ-1; вирулентного штамма №76 и изолятов сибиреязвенного микроба, выделенных в различных регионах РФ и ближнего зарубежья - №№ 5, 7, 8; спорообразующих сапрофитов рода Bacillus - В. cereus № 96, Дакар 1, B.subtilis 830, B.mesentericus 66, B.pumilis NRS\ 20, B.megaterium и почвенных изолятов №№ 63, 69, 98, 223, 263, 313, 365, 369, положительно реагирующих в реакции Асколи с преципитирующей сибиреязвенной сывороткой; Listeria monocytogenes №766; Micrococcus luteus; Citrobacter freundii; Pseudomonas aeruginosa; Vibrio parahaemalyticus.

Все перечисленные штаммы и изоляты получены из музея бактериальных культур ГНУ ВНИИВВиМ. Хранение штаммов микроорганизмов осуществляли в 30 % растворе глицерина при 4°С.

Животные. Аутбредные белые мыши, массой 15-20 г; кролики породы «Шиншилла» массой 2-2,5 кг; козы, зааненской породы, возрастом 3-4,5 лет массой 60-75 кг. Содержание и кормление животных проводили согласно принятым нормам. В исследованиях использовали только клинически здоровых животных.

Питательные среды. Мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА); среда для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба (СВК); бульон и агар Сабуро; картофельный агар.

Сыворотки. Сыворотка сибиреязвенная преципитирующая (ФГУП Орловская биофабрика, ТУ-10-19-77-89); сыворотка крови лошадей неспецифическая неконсервнрованная (Курская биофабрика ТУ 46-21-936-74).

Антигены. Антиген сибиреязвенный бактерийный стандартный (Тобольская биофабрика, ТУ-46-21 173-75).

Приготовление антигенных препаратов. Комплексный споровой термоантиген получали путём автоклавирования суспензии спор с концентрацией 10ч спор/см' при 1 атм. (121°С) в течение 30 мин. Растворимый термоантиген получали путём осаждения детрита спор из комплексного антигена центрифугированием при 8000 об/мин в течение 40 минут. Супернатант использовали как растворимые антигены, а детрит -корпускулярные. Поверхностные полипептиды спор выделяли термоэкстракцией (10 мин при 99°С) с использованием буфера, содержащего 4 % раствор додецилсульфата натрия (SDS).

Получение специфических сывороток и их освобождение от группоспецифических антител. При получении специфических антиспоровых сывороток использовали схемы гипериммунизации животных, предложенные Клинебергер-Нобель [Б.Ф. Шуляк,2003] и Н.П. Буравцевой (1978). Гипериммунную антиспоровую сыворотку, полученную на антигенные детерминанты спор штамма 55-ВНИИВВиМ, адсорбировали антигенами близкородственных сапрофитов (Дакар 1 и №96) по методу Р. Хофмана с соавтор. (1979) с модификациями.

Определение концентрации белка проводили по методу О.Н. Lowry, et al. (1951).

Электронная микроскопия. Мечение антител коллоидным золотом проводили по методике Л. А. Дыкмана(1996).

Электрофоретический анализ препаратов и иммуноблоттинг

проводили в пластинчатых гелях 12x10x0.085 см в прерывистой буферной системе как описано U.K. Laemmly (1970). Электроперенос полипептидов из

полиакрмламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли по методу Р.К.. Tornbin et al. (1979).

Выделение антител из полнспецифических сывороток. Выделение антител проводили по методам предложенным R.A. Keckwick (1940) и Р. Скоупс (1985).

Приготовление конъюгатов иммуноглобулинов с перокспдазой хрена. Использовали модифицированный метод перийодатного окисления по Р. Tjissen (1985). Активность коньюгатов определяли прямым методом ТФ ИФА.

Приготовление конъюгатов иммуноглобулинов с ФИТЦ. Конъюгаты антител с ФИТЦ готовили по методике предложенной J.L. Riggs et al. (1958).

Изготовление магнонммуносорбента. Магноиммуносорбенты изготовляли по методикам, предложенным И.В. Жарниковой (2004), Е.В. Алиевой (2008) и В.И. Ефременко (2008). На активированные перхлоратом натрия магносорбенты ковалентно иммобилизировали иммуноглобулины сыворотки крови козы. Иммобилизацию проводили при 37°С в течение часа.

Статистическая обработка результатов. При анализе и обработке результатов исследований использовали статистические методы, описанные Г.Ф. Лакиным с использованием персонального компьютера и пакета прикладных программ Statgraphics (Version 2.1.). Достоверными считались данные, полученные после обобщения результатов не менее 3-х опытов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение биологических свойств штаммов/изолятов группы В. cereus.

На первом этапе исследований нами была сформирована рабочая коллекция штаммов/изолятов, которая включала следующие микроорганизмы: вирулентные капсулообразующие сибиреязвенные (№№ 76, 5, 7, 8); слабовирулентные капсулообразующие сибиреязвенные (М-71, AAmes); авирулентные бескапсульные сибиреязвенные (Шуя-15, 55-ВНИИВВиМ, СТИ 1, Sterne); типичные представители сапрофитов различных видов (В. cereus №96, В. subtilis 830, В. mesentericus 66, В. pumilis NRS, 20); почвенные изоляты группы В.cereus (№№ 63, 69, 98,223, 313, 365, 373) и штамм Дакар 1.

Критериями для отбора штаммов в рабочую коллекцию служили:

типичные для вида культурально-морфологические и биологические свойства,

а также наличие/отсутствие перекрёстно реагирующих антигенов, выявляемых в реакции преципитации.

Так, штамм Дакар 1 относится к виду В. cereus, однако в антигенном отношении имеет перекрестно реагирующие с преципитирующей сибиреязвенной сывороткой антигены (РТП-позитивные). Сходными антигенными свойствами обладают и изоляты №№ 63, 69, 98, 313 и 365, 373, выделенные из почвы скотомогильника. Сибиреязвенный штамм 55-ВНИИВВиМ, в отличие от дефектного по Sap белку штамма СТИ 1, имеет более полный набор поверхностных антигенов (по данным Н.И. Микшис), а штамм В. cereus №96 является одним из «референс»- штаммов этого вида.

Сравнительное изучение комплекса фенотипических, антигенных и дифференциальных свойств отобранных для рабочей коллекции штаммов/изолятов рода Bacillus, в том числе и выделенных из почвы, подтвердило циркуляцию в природе культур сапрофитов, имеющих высокий уровень сходства своих биологических свойств со свойствами возбудителя сибирской язвы. Наличие у таких культур сапрофитов сходных фенотипических признаков и общих с В. anthracis антигенов значительно затрудняет обнаружение возбудителя сибирской язвы, особенно в объектах внешней среды. Полученные результаты также свидетельствуют о необходимости использования при разработке специфичных тест-систем, предназначенных для обнаружения и идентификации сибиреязвенного микроба, не только культур типичных представителей своих видов (референс-штаммов), но и культур микроорганизмов подобных штамму Дакар 1, занимающих «промежуточное» положение между видами.

Подбор методов выделения специфических антигенов из спор микроорганизмов рода Bacillus.

При проведении работ по подбору метода получения поверхностных

антигенов спор нами было установлено, что такие способы как щелочной и

кислотный гидролиз, а также ультразвуковая дезинтеграция не отвечают

требованиям данной работы, т.к. не позволяют выделять отдельные

полипептиды в активной для иммунохимических реакций форме. Наиболее

оптимальными из испытанных методов выделения поверхностных споровых

антигенов, являлись термоэкстракция и солюбилизация белков ионным

детергентом. В первом случае растворимые термоантигены получали автоклавированием суспензии спор в дистиллированной воде, а во втором обработкой суспензии спор буферным раствором, содержащим БОБ, и термоэкстракцией при 99°С. Установлено, что в полипептидных профилях препаратов, полученных двумя последними методами, содержится более 20 белков различной молекулярной массы. Основные отличия выражались лишь в количественном соотношении выделяемых полипептидов - при термоэкстракции количество белка было значительно ниже.

При изучении полипептидной специфичности полученных экстрактов методом иммунноблоттинга, установлено, что антитела преципитирующей сибиреязвенной сыворотки взаимодействуют с большей частью мажорных и минорных белков, присутствующих в полипептидных профилях испытуемых препаратов, и каких либо значимых отличий в их составе не установлено.

Дополнительно изменения в структуре спор, происходящие при выделении термоантигенов, были изучены методом электронной микроскопии. Установлено, что после воздействия температуры в результате экстракции с поверхности спор белков и полисахаридов толщина наружной оболочки уменьшается при сохранении целостности клетки.

Подбор эффективной схемы иммунизации животных для получения гипериммунных антиспоровых сывороток.

Для иммунизации животных были выбраны две схемы:

По первой схеме, предложенной Клинербергер-Нобель [Б.Ф. Шуляк, 2003], комплексные термоантигены вводили кроликам внутривенно в возрастающих дозах (по 1, 2, 3, 4 и 5 см^) с интервалом 48 часов. Для получения сыворотки забор крови проводили через 10 дней после последней иммунизации (табл. 1).

По второй схеме, разработанной Н.П. Буравцевой [1978] комплексные термоантигены вводили в объеме 1 см^ каждые 72 часа, чередуя внутривенное введение с подкожным. При подкожном способе вводили смесь антигена 0,5 см^ с равным количеством полного (первая инъекция) и неполного адъюванта Фрейнда (последующие). Общее число сделанных инъекций равнялось десяти. Для получения сыворотки забор крови проводили через 10 дней после последней иммунизации (табл. 2).

Таблица 1 Уровни сывороточных антиспоровых антител и перекрестной реактивности споровых антигенов в непрямом методе ТФ ИФА (после 5 инъекций антигенов)

п=3

Споровый антиген на твердой фазе № схемы введения антигена Гипериммунная сыворотка (титр антител)

В. ап1Ига&з 55-ВНИИВВиМ В. сегеиз Дакар 1 В. сегеиз №96

В. аШкгаЫз 55-ВНИИВВиМ 1 1:1215-1:3645 1:135-1:405 1:135-1:405

2 1:1215-1:3645 1:405-1 1215 1:135-1:405

В. сегеиз Дакар 1 1 1:135-1:405 1:405-1 1215 1:405-1:1215

2 1:3645-1:10935 1:3645-1 10935 1:3645-1:10935

В. сегеиз №96 1 1:405 -1:1215 1:405-1 1215 1:405-1:1215

2 1:3645-1:10935 1:3645-1 10935 1:3645-1:10935

Примечание: при титровании сыворотки использовали 3-кратный шаг, начиная с разведения 1:45

Таблица 2 Оценка активности антиспоровых сывороток и перекрестной реактивности споровых антигенов в непрямом методе ТФ ИФА после десяти инъекций по второй схеме иммунизации

п=3

Споровый антиген на твердой фазе Гипериммунная сыворотка (титр антител)

55-ВНИИВВиМ Дакар 1 №96

В.аШИгаси 55-ВНИИВВиМ 1:32805- 1:98415 1:10935 - 1:32805 1:10935-1:32805

В. сегеш Дакар 1 1:3645 - 1:10935 1:98415 -1:295245 1:32805-1:98415

В. сегеш №96 1:10935- 1:32805 1:32805 -1:98415 1:98415-1:295245

Примечание: при титровании использовался Зх-кратный шаг, сыворотка титровалась с разведения 1:45

Результаты исследования сывороток крови кроликов в разработанном

нами непрямом методе ТФ ИФА показали, что использование схемы

иммунизации кроликов по Н.П. Буравцевой позволяет получить сыворотки

крови с высоким титром специфических антиспоровых антител.

Изучение антигенного состава спор штаммов В. апИггас^ и В. сегет с

использованием серологических реакций

Сравнительное изучение спектров споровых антигенов штаммов группы

В.сегеия и их перекрестной реактивности проводили с использованием

полученных нами гипериммунных антиспоровых кроличьих сывороток. При

исследовании гипериммунных сывороток в РДП установлено, что линии

преципитации формировались при взаимодействии термоантигенов с

антителами гомологичных сывороток в разведении до 1:2 для штамма 55-ВНИИВВиМ В.шиЬгас/л, до 1:4 и 1:16 для штаммов №96 и Дакар1 В.сегет соответственно. С использованием гетерологичных сывороток, линии преципитации выявлялись при взаимодействии антигенов спор штамма 55-ВНИИВВиМ и штамма №96 с антителами на штамм Дакар 1 В.сегет в разведении до 1:8. Перекрестные взаимодействия между антителами сыворотки крови на споровые антигены штамма 55-ВНИИВВиМ В.тиИгаси и термоантигенами спор штамма №96 В.сегет не выявлены.

Оценку специфической активности и перекрёстной реактивности споровых антигенов штаммов группы В. сегет также изучали в непрямом методе ТФ ИФА. Дополнительно способность споровых антигенов штаммов группы В.сегет индуцировать выработку агглютинирующих антител и их перекрёстную реактивность проверяли в РИГА с использованием изготовленных экспериментальных эритроцитарных диагностикумов.

В результате проведенных исследований с помощью непрямого метода ТФ ИФА нами выявлена наибольшая перекрестная реактивность между споровыми антигенами штаммов, относящихся к виду В.сегет, и наименьшая между антигенами В.апХкгаш штамма 55-ВНИИВВиМ и В.сегет Дакар 1. Однако, титры антител, выявляемые при взаимодействии термоантигенов с гомологичными сыворотками, были выше, чем с гетерологичными (табл. 2).

Агглютинирующие антитела выявлялись только в сыворотке, полученной на антигены штамма Дакар 1. Титр антител в данной сыворотке находился на уровне 1:640 и выше. В антиспоровых сыворотках крови кроликов на штаммы 55-ВНИИВВиМ и № 96 агглютинирующие антитела не выявлены.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о высокой антигенной активности спор В. сегет штамма Дакар 1 и их способности индуцировать выработку в организме животных как преципитирующих, так и агглютинирующих антител. Результаты изучения антигенного состава спор штаммов группы В. сегет с использованием различных серологических реакций подтвердили данные о высоком уровне перекрестной реактивности между антигенами штаммов Дакар1 и 55-ВНИИВВиМ, свидетельствующем об их антигеном родстве и низком уровне идентичности антигенов штаммов №96 и 55-ВНИИВВиМ.

Изучение полипептилнмх спектров спор исследуемых штаммов с использованием Г1ААГ-8Э8 электрофореза и иммуиоблоттинга

Поскольку одним из наиболее информативных методов определения полипептидной специфичности иммуноглобулинов является ПААГ-БОБ- ^ электрофорез с последующим иммуноблоттингом нами были проведены исследования по сравнительной оценке антигенного состава исследуемых штаммов с использованием указанных методов.

Установлено, что полипептидные профили спор исследуемых штаммов имеют значительное сходство, причем в наибольшей степени это сходство отмечалось между штаммами 55-ВНИИВВиМ и Дакар 1. В основном различия проявлялись в интенсивности окраски некоторых фракций. Молекулярная масса полипептидов колебалась от 10 до 120 кДа, а количество фракций варьировало от 20 до 25 в зависимости от штамма.

Определение специфичности белков В.амИгас'т штамм 55-ВНИИВВиМ показало, что в экстракте спор этого штамма гомологичной сывороткой выявляется до 23 антигенов, а сыворотками, полученными на штамм Дакар 1 и 96 В.сегеия - 16 и 9 антигенов соответственно. Антитела гипериммунной сыворотки, полученной на В. сегет штамм №96, в большей степени взаимодействовали с полипептидами небольшой молекулярной массы (10-40 к.Да) (рис. 1).

66 кД& 4Г- кДа

24кД&

20.1 кДа

14.2 кДа

1 2 3 4

Рис. 1. Иммуноблоттинг ЗОБ-экстракта спор В.аМИгаск штамм 55 -ВНИИВВиМ с антиспоровыми гипериммунными сыворотками кроликов.

Примечание: 1 - антиспоровая сыворотка на В.амЬгас'и, штамм 55-ВНИИВВиМ: 2 - антиспоровая сыворотка на В. сегет штамм Дакар 1: 3 -антиспоровая сыворотка на В. сегеш штамм №96; 4 - Маркерные белки.

Изучение специфической активности протпвоенбнреязвенных аитиспоровых гипериммунных сывороток крови коз

Известно, что кролики отвечают образованием преципитпруюших антител на наибольшее число представляемых антигенов. В отличие от них, гипериммунные сыворотки лошадей и коз, как правило, выявляют меньший спектр антигенов, и поэтому могут обладать более высокой специфичностью.

Иммунизацию коз, комплексным термоантигеном из спор штамма В.ап1Нгас15 55-ВНИИВВиМ проводили по схеме, предложенной Н.П. Буравцевой, показавшей наилучшие результаты в экспериментах на кроликах. Определение специфической активности полученных сывороток в непрямом методе ТФ ИФА и РДП с использованием различных антигенов, позволило установить наличие у них высокой активности и специфичности. Титр выявляемых противосибиреязвенных антител составлял 1:12800-1:25600, при взаимодействии с гомологичным антигеном и 1:3200-1:6400 - с гетерологичными термоантигенами (В.сегет Дакар1 и №96).

При исследовании гипериммунной сыворотки крови козы в РДП установлена высокая активность антител, проявляющаяся в виде линии преципитации в разведении с гомологичным термоантигеном до 1:128, с гетерологичным до 1:8 (Дакар 1). Специфических преципитинов к антигенам В. сегет штамм № 96 в сыворотке козы не обнаружено.

Для повышения специфической активности сыворотки крови козы, было проведено её освобождение от антител к общим для спор рода ВасШш антигенным детерминантам.

После истощения сыворотки комплексным термоантигеном из штамма Дакар 1 титр антител с гомологичным антигеном составил 1:6400-1:12800, а с гетерологичными - 1:200-1:400. Титры антител в сыворотке, истощённой комплексным термоантигеном В.сегет штамм №96, составляли 1:6400-1:12800 и 1:1600-1:3200 соответственно.

Поскольку сыворотка козы, истощенная комплексным термоантигеном В.сегет штамм Дакар1 обладала более высокой специфичностью, она была использована для дальнейших исследований.

Изучение специфичности очищенных иммуноглобулинов козы методом иммуноэлектронной микроскопии

Специфичность взаимодействия антиспоровых антител с поверхностными антигенами сибиреязвенных спор изучали методом иммуноэлектронной микроскопии с использованием протеина А, меченного коллоидным золотом.

А Б В

Рис. 2. Иммуноэлектронная микроскопия взаимодействия противосибиреязвенных антиспоровых антител сыворотки козы с антигенными детерминантами спор различных штаммов (негативное контрастирование, увеличение х 100000): А) В.аЫкгас'к 55- ВНИИВВиМ: Б) В.сегеия Дакар1: В) В.сегеия №96.

Примечание: темные точки - антитела, выявляемые белком А, меченым коллоидным золотом

Как видно на представленных микрофотографиях большая часть поверхности сибиреязвенных спор штамма 55-ВНИИВВиМ покрыта прикрепившимися к ней антителами (рис 2А). На поверхности спор В.сеге\и штамма Дакар 1 наблюдалось прикрепление единичных антител (рис. 2Б), а на спорах В.сегеш штамма №96 (рис 2В) антитела практически отсутствовали.

Определение полипептиднон специфичности очищенных иммуноглобулинов козы методом иммуноблоттннга

Из представленной на рис. 3 иммуноблоттограммы видно, что в отличие от не истощённых антиспоровых сывороток кроликов и коз, очищенные противосибиреязвенные иммуноглобулины специфически связываются только с полипептидом спор сибиреязвенного микроба с молекулярной массой около 19 кДа. Взаимодействия иммуноглобулинов с антигенами спор штаммов Дакар 1 и №96 В.сегеив не выявлено.

ЧЯ I '

'¡И З^кДа

НМ кЛ»

12 3 4

Рис. 3. Иммуноблоттинг SDS-экстрактов спор исследуемых штаммов с иммуноглобулинами противосибиреязвенной антиспоровой сыворотки козы.

Примечание: I - SDS и- ¡.п спор B.anthracis штамм 55-ВПИИВВнМ; 2 - SDS-лизат спор В. cereus штамм Дакар 1:3- SDS-лизат спор В. cereus штамм №96: 4 - Маркерные белки.

Таким образом, в результате проведённых исследований нами установлено наличие в полипептидном спектре спор сибиреязвенного микроба видоспецифических полипептидов. подобрана эффективная схема иммунизации животных для получения антиспоровых сывороток и оптимизированы условия выделения видоспецифических антиспоровых иммуноглобулинов, пригодных при конструировании препаратов для обнаружения спор сибиреязвенного микроба иммунохимическими методами.

Конструирование препаратов для детекции антигенов В. anthracis

Для изготовления ФИТЦ- и пероксидазного конъюгатов использовали иммуноглобулины козы, освобожденные от общих для рода Bacillus антител комплексным термоантигеном из спор штамма Дакар 1 В.cereus.

При использовании ФИТЦ-конъюгата в качестве метки для определения видовой принадлежности спор установлено, что полученный конъюгат, в рабочем разведении 1:16, специфически связывается с антигенами спор сибиреязвенных штаммов и изолятов. Иммобилизированные сибиреязвенные споры, обработанные ФИТЦ-конъюгатом, обнаруживаются по характерному изумрудно-зеленому свечению. Флюоресцирующие иммуноглобулины перекрёстно реагировали только со спорами В.cereus из группы РТП-позитивных штаммов/изолятов и не давали перекрёстных реакций со спорами типичных представителей различных видов рода Bacillus. При микроскопии споры РТП-позитивных штаммов/изолятов имели вид диффузных образований с неярким бледно зеленым свечением.

При оценке специфичности прямого метода ТФ ИФА, на основе изготовленного пероксидазного сибиреязвенного конъюгата, было установлено, что разработанный метод позволяет достоверно дифференцировать споры сибиреязвенного микроба (55-ВНИИВВиМ, М-71, Sterne) от спор типичных близкородственных сапрофитов (В. subtilis 830, В. mesenlericiis 66, В. pumilis NRS, B.cereus №96). При идентификации спор РТП-позитивных изолятов/штаммов (№69, Дакар 1) оптическая плотность хромогенного субстратного раствора в лунках с указанными споровыми культурами была в 1,6 раза ниже, чем в лунках с культурами В. anthracis, что является свидетельством недостоверности выявляемых различий и наличия перекрёстных взаимодействий.

Сравнительное изучение чувствительности и специфичности преципитирующей сибиреязвенной сыворотки (реакция Асколи) и полученных иммуноглобулинов из гипериммунной сыворотки козы провели в разработанном сэндвич - методе ТФ ИФА.

В ходе проведенных работ установлено, что разработанный на основе антиспоровых иммуноглобулинов сэндвич - метод ТФ ИФА по чувствительности и специфичности превосходит реакцию Асколи. Сэндвич -метод ТФ ИФА позволяет дифференцировать штаммы сибиреязвенного микроба от штаммов/изолятов близкородственных сапрофитов, независимо от уровня их антигенного родства, а также представителей микроорганизмов других таксономических групп, нормальных обитателей объектов внешней среды. Кроме того, сэндвич - метод на основе иммуноглобулинов к споровым антигенам В.anthracis обладает высокой избирательной специфичностью, так как изготовленные реагенты не взаимодействует с термоантигенами вегетативных форм исследуемых штаммов.

Таким образом, проведенные исследования показали, что полученные

иммуноглобулины к споровым антигенам В.anthracis специфичны, а

разработанные на их основе иммунохимические методы позволяют проводить

прямое выявление споровых антигенов и дифференциацию спор

сибиреязвенного микроба от спор других представителей рода Bacillus.

Наибольшей специфичностью обладает сэндвич - метод ТФ ИФА, который

даёт возможность проводить дифференциацию сибиреязвенных спор от спор

РТП-позитивных микроорганизмов, обладающих наиболее высоким антигенным родством с В. шиИгаах.

Конструирование магнопммуносорбента для обнаружения возбудителя сибирской язвы

В качестве матрицы для магнопммуносорбента (МИС) использовали аэросил - 300, содержащий основное вещество диоксид кремния (8102). Модификатором сорбента выбран декстран (полиглюкин). В качестве активатора использовали перхлорат натрия.

С целью отработки оптимальной сенсибилизирующей дозы антител для полного насыщения МИС, сорбцию проводили при различных концентрациях иммуноглобулинов. На твердую матрицу сорбента иммобилизировали иммуноглобулины крови козы, выделенные из истощенной комплексным термоантигеном В. сегет штамма Дакар 1 сыворотки. Иммуноглобулины добавляли в объеме 2 см"1 с концентрацией 1, 2, 3 иг/см0.

Результаты проведенных исследований, показывают, что концентрация белка 2 мг/см^ является оптимальной для полного насыщения антителами сорбента, использованного в виде 10% взвеси.

Для определения сорбционной емкости сорбента использовались разные соотношения суспензии МИС к суспензии спор В.апвм-ас'^ с концентрацией Зх10лспор/см^. Проведенные исследования показали, что при соотношении суспензии с пор к МИС в соотношении 1:2 эффективность сорбции составляет 27%, а при соотношениях 1:0,5 и 1:1 сорбируется только 10-14% спор (табл. 3).

Таблица 3 Определение сорбционной емкости сконструированного МИС

п=3

Концентрация Соотношение (суспензия спор/МИС)

спор, спор/см3 1:0,5 1:1 1:2

% сорбции спор на МИС

3000±100 10,0±2,0 14,0±2,0 27,0±4,0

Контроль сорбции спор на МИС проводили фазово-контрастной и люминесцентной микроскопией. Установлено, что сорбция спор на поверхности МИС происходит неравномерно. В поле зрения микроскопа обнаруживались

частицы сорбента, как с единичными, так и с несколькими десятками спор на поверхности (рис. 4).

Для повышения процента генерирующих спор проведены опыты по их десорбции с поверхности сорбента.

А Б В

Рис. 4. Фазово-контрастная (Л. Б) и люминесцентная (В) микроскопия комплекса МИС со спорами

Примечание: Увеличение: х 800; стрелками указаны иммобилизированпые на МИС споры: В - Споры B.anthracis штамма Sterne меченные ФИТЦ- конъюгатом.

Проведенные исследования показали, что наиболее оптимальным способом десорбции спор с МИС является прогревание комплекса МИС-спора при температуре 60°С в течение 30 минут. При данном способе процент десорбированных спор составил 36 % (табл. 4).

Таблица 4 Количественные показатели различных вариантов десорбции спор с МИС

п=3

Способ обработки комплекса МИС- спора % десорбированных спор % связанных с МИС спор

Химический 0,1±0,01 99,9 ± 5,3

ж s экспозиция 15 мин 26±1,0 74± 4.1

о у s п экспозиция 30 мин. 36± 2,6 64±3,5

Оценка специфичности изготовленного МИС

Специфичность экспериментального образца МИС была испытана на панели микроорганизмов, содержащей как представителей рода Bacillus, так и гетерологичных микроорганизмов - нормофлоры почвы. Из представителей

рода Bacillus использовали сибиреязвенные вакцинные штаммы 55-ВНИИВВиМ, Sterne. AAmcs, штаммы близкородственных сапрофитов - В. cereus №№ 96, 69, Дакар I, B.subtilis 830, B.mesentericus 66, B.pumilis XJiS B.megaterium. Из гетерологичных микроорганизмов тестировали Listeria monocytogenes №766; Micrococcus luteus; Citrobacter freundii; Pseudomonas aeruginosa; Vibrio parahaemalyticus.

В суспензии вносили МИС в соотношении 1:2, инкубировали 2 часа, промывали ЗФР и проводили контрольный высев сорбентов на питательные среды.

Установлено, что споры всех исследуемых штаммов сибиреязвенного микроба специфически связываются с сконструированным МИС и наблюдается частичное связывание с МИС спор наиболее близких в антигеном отношении РТП-позитивных микроорганизмов В.cereus изолят №69 и Дакар 1. Гетерологичные микроорганизмы и типичные представители рода Bacillus не вступали во взаимодействие с иммуноглобулинами, иммобилизованными на МИС.

С целью изучения возможности применения разработанного МИС для обнаружения сибиреязвенных спор в объектах внешней среды были приготовлены образцы почвы, искусственно контаминированные спорами.

При приготовлении образцов использовали как стерильную, так и естественно контаминированную почву. В образцы стерильной почвы вносили в равных соотношениях споры B.anthracis Sterne и В.cereus №96 в количестве 100 и 1000 спор на 1 г почвы. В образцы нестерильной почвы вносили только споры B.anthracis Sterne. В каждую пробу почвы вносили по 1 см3 споровой суспензии, перемешали встряхиванием и выдерживали при комнатной температуре 18-24 часа.

Выделение спор сибиреязвенного микроба проводили согласно разработанных нами «Методических рекомендаций по подготовке проб почвы к исследованию на контаминацию возбудителем сибирской язвы» (Покров, 2008) и «Методических указаний по лабораторной диагностике сибирской язвы...» (1989).

К элюатам, приготовленным по предложенному нами способу, добавляли

по 2 cmj МИС и инкубировали на орбитальном шейкере в течение 2 часов со

скоростью 50-100 об/мин. Затем сорбенты двукратно промывали ЗФР, удерживая МИС на внутренней поверхности флакона постоянным магнитом. МИС с селективно сорбировавшимися на их поверхности спорами ресуспендировали в 2 см"' ЗФР и прогревали в водяной бане при 60°С в течение 30 мин. Суспензию сорбента высевали на чашки Петри с дифференциально-диагностической средой в объеме 1/10 от исходного объема элюата. Посевы инкубировали в течение 18 - 20 часов при температуре 37 °С. Идентификацию выделенных культур проводили согласно «Методических указаний по лабораторной диагностике сибирской язвы...» (1989).-

В посевах почвенных вытяжек, приготовленных регламентированным методом, наблюдали сплошной рост фосфатазопозитивных микроорганизмов, демаскирующих рост сибиреязвенных колоний, поэтому отбор подозрительных колоний был затруднен.

В посевах почвенных вытяжек, приготовленных предлагаемым методом, наблюдали локальный рост отдельных колоний, что облегчало процесс идентификации сибиреязвенных культур (рис. 5).

Рис. 5 Выделение возбудителя сибирской язвы из пробы нестерильной почвы разными методами

Примечание: Почвенные вытяжки, при высеве 1/10 от исходного объема элюата.

А,Б,В -посевы методом истощения (по Дригальскому), Г - выделение с использованием МИС (1, 2 - колонии сибиреязвенного микроба, 3- колония сапрофита)

В ходе исследований было установлено, что при контаминации стерильной почвы суспензией смеси сибиреязвенных спор и спор сапрофитов в соотношении 1:1 (102 спор/г) на дифференциально - диагностической среде обнаруживался рост 20 колоний сибиреязвенного микроба, а при контаминации суспензией спор (10^ спор/г) - 50 колоний. Использование регламентированного метода не позволило выявить наличие сибиреязвенного

микроба в пробе, контамииированной спорами п количестве 10" спор/г, а при контаминации 10' спор/г на СВК наблюдался рост 20 колоний сибиреязвенного микроба. Сопоставимые результаты были получены при использовании в опыте образцов нестерильной почвы (табл. 5).

Таблица 5. Сравнительная эффективность способов обнаружения В.аШкгаЫз в пробах почвы

п=3

Испытуемая проба Доза обсеменения почвы, спор/г Количество спор В.шиИгааз, выделенных из проб почвы

Регламентированный метод Предлагаемый метод

Стернльная почва

Sterne + №96 (102 + 10') 0 20±3

Sterne + №96 (I0J+ I0J) 10±2 50±4

Нестерильная почва

Контроль 0 0

Sterne (102) 10±2 20±3

(100 20±3 40±4 ..

Таким образом, оптимальным методическим подходом для выделения спор сибиреязвенного микроба из элюата почвы является добавление к элюату изготовленного МИС в соотношении 1:2, инкубация смеси на орбитальном шейкере в течение 2 часов при скорости 50 - 100 об/мин, применение прогревания смеси при 60иС в течение 30 мин, для десорбции спор с МИС. Использование в работе сконструированного нами магноиммуносорбента позволяет селективно выделять искомый патоген даже в пробах с высокой микробной обсеменённостью, таких как почва. Способность МИС прочно (на уровне реакций антиген-антитело) фиксировать на своей поверхности споры сибиреязвенного микроба позволяет осуществлять промывку пробы от механических загрязнений и снижать нагрузку сопутствующей микрофлоры, значительно облегчая процесс скрининга подозрительных культур и их последующую идентификацию.

выводы

1. В результате комплексного изучения биологических свойств штаммов/изолятов рабочей коллекции выявлены штаммы сапрофитов с высокой степенью фенотипического и антигенного родства, которые целесообразно использовать при разработке и определении диагностической ценности тест-систем, предназначенных для обнаружения и идентификации сибиреязвенного микроба.

2. Установлено, что схема иммунизации кроликов и коз, заключающаяся в чередующихся внутривенных и подкожных введениях споровых антигенов с интервалом 72 часа позволяет получать высокоактивные и специфичные антиспоровые сыворотки.

3. В результате проведённых исследований установлено различие в количестве общих с сибиреязвенным микробом (В. anthracis 55-ВНИИВВиМ) антигенов спор у штаммов сапрофитов с высоким уровнем антигенного родства {В. cereus Дакар 1) и типичных представителей рода Bacillus (В. cereus №96) -16 и 9 соответственно.

4. Предложен метод получения видоспецифических противосибиреязвенных антиспоровых иммуноглобулинов, пригодных для конструирования иммунореагентов для иммунофлюоресцентного и иммуноферментного анализов. Использование данных иммуноглобулинов позволяет снизить уровень перекрестных взаимодействий с антигенами близкородственных сапрофитов (В.cereus №96 и Дакар 1).

5. Полученные пероксидазный и ФИТЦ-коньюгаты в рабочих разведениях 1:12800 и 1:16, соответственно, в прямых методах ТФ ИФА и МФА выявляют споры возбудителя сибирской язвы и наиболее близких в антигеном отношении В.cereus изолят №69, штамм Дакар 1 и не взаимодействуют со спорами типичных представителей рода Bacillus {В.cereus №96, B.subtilis 830, В.mesentericus 66, B.pumilis NRS).

6. Разработанный сэндвич - метод ТФ ИФА позволяет специфически дифференцировать споры сибиреязвенного микроба, от спор штаммов сапрофитов рода Bacillus независимо от степени их антигенного родства.

7. Сконструирован магноиммуносорбент на основе

иммуноглобулинов к спорам В. anthracis использование, которого позволяет

селективно выделять споры возбудителя сибирской язвы из проб объектов внешней среды (почва, вода), снижает нагрузку сопутствующей нормофлоры, в том числе и спорообразуюшей, что облегчает процесс скрининга подозрительных культур и их последующую идентификацию.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований разработаны, утверждены и рекомендуются в практику научно-исследовательских учреждений следующие разработанные методики:

1 .«Методические рекомендации по подготовке проб почвы к исследованию на контаминацию возбудителем сибирской язвы», утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ (протокол №3 от 26.03.2008 г.) и рассмотрены на секции Биотехнологии Отделения ветеринарии РАСХН (29.10.2009).

2.«Методические рекомендации по изготовлению и применению магноиммуносорбента на основе иммуноглобулинов к спорам Яал//?гасш>, утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ (протокол №9 от 11.06.2009 г.) и рассмотрены на секции Биотехнологии Отделения ветеринарии РАСХН (29.10.2009).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лягоскин, И.В. Перспективы применения иммуномагнитной сепарации в экспресс индикации патогенов / И.В.Лягоскин, Ю.О.Селянинов // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: материалы Междунар. науч.-прак. конф.- Щёлково, 2006.- С. 160-162.

2. Лягоскин, И.В. Видоспецифические антигены спор представителей группы В.сегеш / И.В.Лягоскин, Е.Г. Анохина, Ю.О.Селянинов // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: материалы Междунар. науч.-прак. конф.- Щёлково, 2007.- С. 245-249.

3. Лягоскин, И.В. Получение бактериальных антигенов (обзор методов) / И.В.Лягоскин // Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных: материалы Междунар. науч. конф. - Ульяновск, ГСХА, 2007.-С.З-10.

4. Лягоскнн, И.В. Изучение перекрестной реактивности у представителе группы B.cereus / И.В. Лягоскин, Ю.О. Селянинов, И.Ю. Егорова // Актуальнь вопросы инвазионной и инфекционной патологии животных: материал Международной н - п. конференции / Бурятская ГСХА им. В.Р. Филлипова. Улан-Удэ, 2008.-С. 74-75.

5. Егорова, И.Ю. Сравнительная характеристика почвенных изолят( группы B.cereus / И.Ю. Егорова, Ю.О. Селянинов, И.В. Лягоскин. Ветеринария. - №6 - 2008. - С. 29-33.

6. Лягоскин, И.В. Подбор условий проведения ИФА с использование спор B.anthracis / И.В.Лягоскин, Ю.О. Селянинов; И.В. Вологина // Актуальнь вопросы аграрной науки и образования: материалы Междунар. науч. конф. Ульяновск, ГСХА, 2008. - С.51-55.

7. Лягоскин, И.В. Вопросы экологии возбудителя сибирской язвы / И.1 Лягоскин, Г.Ф. Архипова // Проблемы профилактики и борьбы с осоЕ опасными, экзотическими и малоизученными инфекциооыми болезням животных: Материалы межд. науч.-практ., конф., 13-14 ноября 2008 / ГН ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ г. Покров - С. 233-237.

8. Архипова, Г.Ф., Методы санации очагов сибирской язвы / Г.Ф Архипова, И.В. Лягоскин, П.Ю. Зубаирова // Проблемы профилактики и борьб с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционным болезнями животных: Материалы межд. науч.-практ., конф., 13-14 ноября 2008 ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ г. Покров - С. 216-219.

9. Лягоскин, И.В. Получение и оценка специфичности гипериммуннь сывороток против поверхностных антигенов спор B.anthracis // И.В. Лягоски О.В. Капустина, И.В. Вологина, Ю.О. Селянинов, Б.В. Новиков, Е.1 Барышникова // Современные средства и методы диагностики, профилактики лечения инфекционных, протозойных и микотических болезне сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб и пчел: Материал Междунар. н.-п.конф., ВИЭВ, 2009. - С.442-445.

10. Вологина, И.В. Оценка пригодности использования культурально морфологических и биохимических свойств для определения видовс принадлежности микроорганизмов рода Bacillus / И.В. Вологина, Г.Ф Архипова, И.В. Лягоскин, Ю.О. Селянинов // Современные средства и метод диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных микотических болезней сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб пчел: Материалы Междунар. н.-п.конф., ВИЭВ, 2009. - С.133-136

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ РОСЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ, г. Покров Владимирской области

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лягоскин, Иван Владимирович

Список сокращений

1. Введение

1.1 Актуальность темы

1.2 Цель и задачи исследований 12 1.3. Научная новизна работы

1.4 Практическая значимость результатов исследования

1.5 Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту

1.6 Апробация и публикация результатов

1.7 Личный вклад автора в выполнении работы

1.8 Объем и структура диссертации

2. Обзор литературы

2.1 Общая характеристика микроорганизма и его таксономическое положение

2.2 Экология возбудителя сибирской язвы

2.3 Антигенный состав Bacillus anthracis

2.3.1 Капсула

2.3.2 Клеточная стенка

2.3.3 Споры

2.3.4 Внеклеточные антигены В.anthracis

2.4 Получение бактериальных антигенов 32 2.4.1 Физические методы

2.4.1.1 Продавливание с помощью пресса

2.4.1.2 Разрушение ультразвуком

2.4.1.3 Баллистическое разрушение

2.4.1.4 Измельчение в твердом состоянии

2.4.1.5 Получение термоантигенов

2.4.2 Химические методы

2.4.2.1 Экстракция антигенов клеточной поверхности

2.4.2.2 Применение детергентов

2.4.2.2.1 Ионные детергенты

2.4.2.2.2 Неионные детергенты

2.4.2.2.3 Соли желчных кислот

2.4.3 Физико-химические методы разрушения клеток

2.5 Индикация и идентификация возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды

Введение Диссертация по биологии, на тему "Конструирование магноиммуносорбента для обнаружения возбудителя сибирской язвы"

1.1 Актуальность темы

Совершенствование существующих и разработка новых методов индикации различных микроорганизмов в объектах внешней среды продолжают оставаться актуальной проблемой. Уже более 50 лет для индикации патогенных микроорганизмов успешно применяются иммунохимические методы. В их основе лежит образование высокоспецифического комплекса между антигеном и антителом. Причем главная задача при разработке иммунодиагностических тест-систем состоит в визуализации единичных взаимодействий антиген-антитело путем регистрации макроскопического сигнала. На практике значительные потенциальные возможности биотехнологических методов на основе специфичных антител для детекции опасных патогенов не всегда реализуются. Во-первых, это связано с серьёзными трудностями, возникающими при выделении культур микроорганизмов из различных объектов внешней среды, особенно в тех случаях, когда концентрация обнаруживаемых бактерий в пробе является низкой. Вторым фактором, затрудняющим детекцию инфекционных агентов, является высокий уровень контаминации исследуемых объектов посторонней непатогенной микрофлорой, в том числе близкородственной, обладающей значительным уровнем антигенного родства. Например, межвидовые антигенные различия В. anthracis и других непатогенных представителей этого рода (В. cereus, В. subtilis, В. thuringiensis) минимальны.

Для преодоления указанных трудностей индикации патогенов из объектов окружающей среды был предложен метод, основанный на использовании магнитных сорбентов, представляющих собой полимерные микрогранулы с композитными феррочастицами, и иммобилизированными на их поверхности специфическими антителами. Иммуносорбенты позволяют осуществлять селективное концентрирование на своей поверхности целевых клеток из смеси с другими бактериями и дают возможность проведения дальнейшей идентификации патогена [Ефременко В.И., 1996].

Учитывая перспективность метода иммуномагнитной сепарации в последнее десятилетие учеными разрабатываются иммуномагнитные биосорбенты для экспресс индикации различных агентов. Так, Зинченко О.В. с соавт. (2006) разработали эффективный способ подготовки проб почвы, контаминированной Burkholderia pseudomallei, Николаева О.Г., Гаврюшкин

A.Н., и др. (2006) использовали комплекс магносорбентов с моноклональными антителами, для выявления клеток Francisella tularensis.

B.И. Ефременко с соавт. (2008) предложили способ выделения вируса гриппа птиц в пробах воды с применением МИС.

Сибирская язва относится к инфекциям основным источником возбудителя которых в последние десятилетия стала почва. Однако до настоящего времени в арсенале практических врачей отсутствуют методы, позволяющие объективно оценить уровень зараженности мест сибиреязвенных захоронений и степень их эпидемической опасности. Применяемые утвержденные методы обнаружения B.anthracis характеризуются высокой трудоемкостью, низкой чувствительностью и эффективностью выделения - 0,6 - 9,7 % [Бургасов П.Н. и др., 1970; Соркин Ю.И. и др., 1988, Г.Г. Онищенко и др. 2006].

Использование селективных сред упрощает выделение В. anthracis из объектов внешней среды, содержащих близкородственные бациллы, [Kiel J. 1998, Parker J.F., 1999, D.C. Dragon and R.P. Rennie, 2001], но появление в результате длительного нахождения в почве атипичных сибиреязвенных штаммов может сильно затруднять идентификацию патогена.

Для повышения эффективности индикации В. anthracis в пробах почвы за счет селективного концентрирования Абгарян А.Г. с соавт. (2003) было предложено применение магнитных частиц с сорбированными антиспоровыми иммуноглобулинами G, при этом используемые авторами иммуноглобулины имели высокий уровень перекрестных реакций с культурами близкородственных сапрофитов.

По данным ряда авторов, клеточная стенка В. anthracis помимо группоспецифических содержит и видоспецифические антигены [Безносов М.В. 1997; Микшис Н.И. и др, 2004; John W. et al., 1988, R. Fluck et al. 1997, A.P. Phillips et K.L. Martin 1998], получение к которым антител и конструирование на их основе магноиммуносорбентов позволит повысить специфичность и эффективность методов индикации, за счет избирательного выделения целевых микроорганизмов.

Таким образом, проведение работ по совершенствованию методов индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды на основе конструирования магноиммуносорбента с иммобилизированными на его поверхности высокоспецифичными антителами против антигенных детерминант спор В. anthracis является актуальной задачей.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Лягоскин, Иван Владимирович

6. ВЫВОДЫ

3. В результате проведённых исследований установлено различие в количестве общих с сибиреязвенным микробом (В. anthracis 55-ВНИИВВиМ) антигенов спор у штаммов сапрофитов с высоким уровнем антигенного родства {В. cereus Дакар 1) и типичных представителей рода Bacillus {В. cereus №96) — 16 и 9 соответственно.

5. Полученные пероксидазный и ФИТЦ-коньюгаты в рабочих разведениях 1:12800 и 1:16, соответственно, в прямых методах ТФ ИФА и МФА выявляют споры возбудителя сибирской язвы и наиболее близких в антигеном отношении B.cereus изолят №69, штамм Дакар 1 и не взаимодействуют со спорами типичных представителей рода Bacillus {B.cereus №96, B.subtilis 830, B.mesentericus 66, B.pumilis NRS).

7. Сконструирован магноиммуносорбент на основе иммуноглобулинов к спорам В. anthracis использование, которого позволяет селективно выделять споры возбудителя сибирской язвы из проб объектов внешней среды (почва, вода), снижает нагрузку сопутствующей нормофлоры, в том числе и спорообразующей, что облегчает процесс скрининга подозрительных культур и их последующую идентификацию.

Практические предложения

131

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического применения предложены:

2. «Методические рекомендации по изготовлению и применению магноиммуносорбента на основе иммуноглобулинов к спорам В.anthracis», утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ (протокол №9 от 11.06.2009 г.).

Вышеперечисленные документы рассмотрены на секции Биотехнологии Отделения ветеринарии РАСХН 29.10.2009.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лягоскин, Иван Владимирович, Покров

1. Александрова, Н.М. Обнаружение спор возбудителя сибирской язвы во внешней среде / Н.М.Александрова, Т.Х.Фаизов // Ветеринарная патология. -2003. № 1. - С.139 - 141.

2. Алиева, Е.В. Магнитоуправляемая тест-система при диагностике листериоза /Е.В.Алиева // Известия высших учебных заведений. СевероКавказский регион. Естественные науки. Приложение. №2(2). — Ростов-н/Д, 2003. - С. 43-45.

3. Алиева, Е.В. Опыт применения новой тест-системы для экспресс-индикации возбудителей кампилобактериоза в условиях чрезвычайной ситуации / Е.В. Алиева // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2003. — №6. - С.86-89.

4. Анисенко, О.В. Синтез сорбентов с заданными свойствами и создание на их основе биопрепаратов иммобилизированных ферментов: дис. . канд. биол. наук: 03.00.23 /Анисенко Ольга Владимировна. — Ставрополь, 2005.- 156 с.

5. Архипов, В.В. Об очагах сибирской язвы и их оздоровлении. Вопросы эффективности противосибиреязвенных мероприятий / Архипов В.В.-М., 1974.-С. 153 154.

6. Бакулов, И.А. Сибирская язва (антракс): новые страницы в изучении «старой» болезни / И.А. Бакулов, В.А. Гаврилов, В.В. Селиверстов. Владимир; Вольгинский: Посад, 2001. - 285 с.

7. Барыкова, Ю.А. Выделение и изучение белковых компонентов бактерий рожи свиней вакцинного штамма РВ-2: автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.23 / Барыкова Юлия Александровна. Щелково, 2005. - 24 с.

8. Безносов, М.В. Выделение и изучение специфических антигенов Bacillus anthracis с целью конструирования диагностических ипрофилактических препаратов: дис канд. биол. наук: 03.00.07 / Безносов

9. Михаил Владимирович. Саратов, 1997. — 177с.

10. Биологическая безопасность / М.А.Пальцев и др.. — М.: Медицина, 2006. 304 е.: ил.

11. Буерова, С.В. Усовершенствование средств диагностики и идентификации возбудителя сибирской язвы дис. канд. биол. наук: 03.00.07; 16.00.03 / Буерова Светлана Васильевна. Казань, 2002. - 168с.

12. Бургасов, П.Н. Метод оценки противосибиреязвенного иммунитета по превентивным свойствам сыворотки / П.Н. Бургасов, Г.И. Рожков // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1971. -№ 6 - С. 124-134.

13. Бургасов, П.Н. Сибиреязвенная инфекция / П.Н. Бургасов, Г.И. Рожков. М.: Медицина, 1984. - 212 с.

14. Вершигора, А.Е. Основы иммунологии. Руководство. — 2-е изд., испр. и доп. / А.Е. Вершигора Киев: Вища школа. Головное изд-во, 1980. -504 с.

15. Воллер, А. Иммуноферментные реакции в диагностической медицине. Теория и практика / А. Воллер, А. Бидуэлл // Бюллетень ВОЗ. -1977. -№53. С. 38-45.

16. Выделение белков S-слоя из культуральных фильтратов

17. Выделение из почвы атипичных штаммов сибиреязвенного микроба / Н.П.Буравцева и др. // Профилактика природно-очаговых инфекций: сборник материалов науч. конференции. Ставрополь, 1983. - С. 16-17.

18. Выделение поверхностного антигена вегетативных клеток Bacillus anthracis СТИ-1 и изучение его протективный свойств / М.В. Безносов и др. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии.-1997. -№1.- С. 9-13.

19. Выявление клеток Francis ella tularensis в комплексе с иммуномагнитными частицами / О.Г.Николаева и др. // Материалы VII Межгосударственной научно-практической конференции. Оболенск, 2006.1. C. 226-227.

20. Горшков, С.И. Биологическое действие ультразвука / С.И. Горшков, О.Н. Горбунов, Г.А. Антропов. М.: Медицина, 1965. - 200 с.

21. Гринин, А.С. Очистка, концентрирование и фракционирование вирусов животных / А.С. Гринин, И.Н. Титов. М.: Колос, 1971. - 239 с.

22. Диагностическое значение субъединичного сибиреязвенного антигена/А.К. Галиуллин и др. //Ветеринария. 1996. - №1. - С. 17-19.

23. Дрейд, А.И. Применение ультразвука. 2000 Электронный ресурс. Режим доступа: http: // www.rezonans-npk.ru

24. Дыкман, JI.A. Развитие методологии иммуноанализа почвенныхассоциативных бактерий с использованием препаратов коллоидного золота: автореф. дис.канд. биол. наук: 03.00.23 / Дыкман JI.A. — Саратов, 1996. — 24 с.

25. Егоров, A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа / A.M. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев М.: Высшая Школа, 1991. -288 с.

26. Егорова, И.Ю. Фенотипические и генетические маркеры полевых изолятов Bacillus anthracis: дис. канд. вет. наук: 16.00.03 / Егорова Ирина Юрьевна. Покров, 2005.- 115 с.

27. Егорова, И.Ю. Сравнительная эффективность методов индикации Bacillus anthracis в почве / И.Ю. Егорова, Ю.О. Селянинов, И.В. Вологина // Ветеринария. 2006. - №6. - С.26-30.

28. Езепчук, Ю.В. Патогенность как функция биомолекул / Ю.В. Езепчук.-М., 1985.- С. 67-73.

29. Еременко, Е.И. Биологические и популяционные аспекты патогенности Bacillus anthracis: дис. . д-ра. мед. наук: 03.00.07 / Еременко Евгений Иванович. — Ставрополь, 1997.- 275 с.

30. Еременко, Е.И. Прорастание спор возбудителя сибирской язвы / Е.И. Еременко и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - №1. - С. 72 - 74.

31. Ефременко, В.И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях / В.И.Ефременко. Ставрополь, 1996. - 131с.

32. Жарникова, И.В. Структурированный керамический носитель с магнитным материалом для иммобилизации антител / И.В. Жарникова // Биотехнология.-2004. -№1.-С.71 -76.

33. Завирюха, А.И. Дифференциальная диагностика возбудителя сибирской язвы от ложносибиреязвенных бацилл / А.И. Завирюха, О.П.Степанюк // Достижения и перспективы борьбы с сибирской язвой в СССР. М., 1978. - С. 130-131.

34. Завирюха, А.И. Почвенные очаги и их санация. Сибирская язва — почвенная инфекция / А.И.Завирюха // Актуальные вопросы профилактики сибирской язвы: тезисы докладов XIII Пленарного заседания

35. Межведомственной научно — методической комиссии по борьбе с сибирской язвой. Ташкент; М, 1990. - С.87.

36. Завирюха, А.И. Сезонные изменения микрофлоры почвы места захоронения трупов животных, павших от сибирской язвы / А.И. Завирюха, О.П. Степанюк // Сборник науч. трудов Украинской с.-х. академии. 1979. -Вып.216. - С.115-118.

37. Здоровье населения и среда обитания // Информационный бюллетень. М, 2004. №11. - С. 49.

38. Злыгостев, А. Бактерии и актиномицеты. Общая характеристика бактерий и актиномицетов Электронный ресурс.- Режим доступа: http: // plant.geoman.ru «Жизнь растений»

39. Иммуногенность рекомбинантных бациллярных штаммов с клонированным геном синтеза протективного антигена Bacillus anthracis / Н.И. Микшис и др. // Молекулярная генетика микробиология и вирусология. 2007. - №3. - С. 15-21.

40. Иммунология. Методы исследований / пер. с англ. М. Трукко и др.; под общей ред. И. Лефковитса, Б. Перниса. М.: Мир, 1983. - 349 е., ил.

41. Иммунология: Практикум / Е.У. Пастер и др.. — Киев.: Выща шк., 1989.-304 е.: ил.56.

42. Иммуноферментный анализ / пер. с англ, под ред. Т. Нго, Г. Ленхоффа. М.: Мир, 1988. - 446с.

43. Исаенко, Е.Ю. Применение ультразвука для дезинтеграции микробных клеток Электронный ресурс. — Режим доступа: www .i minamn. org / j ournal .htm

44. Использование магноиммуносорбентов для обнаружения возбудителя мелиоидоза в пробах почвы методом ПЦР / Зинченко О.В. и др. // Материалы VII межгосударственной научно-практической конференции. Оболенск, 2006. - С. 203-204.

45. Колбасов, Д.В. Изучение генетической вариабельности возбудителя сибирской язвы: дис. канд. вет. наук: 16.00.03 / Колбасов Денис Владимирович. Покров, 2005.- 115 с.

46. Колонии, Г.В. Эволюция сибирской язвы. Сообщение II. История распространения болезни и формирование нозоареала / Г.В. Колонии // Журнал микробиологии, эпидемиологии и эпидемиологии 1971. - №1. -С.118-122.

47. Колычев, Н.М. Ветеринарная микробиология и иммунология / Н.М. Колычев, Р.Г. Госманов. -М.: КолосС, 2003. 432 с.

48. Коротич, А.С. Сибирская язва / А.С. Коротич, Л.И. Погребняк. -Киев: Урожай, 1976. 159 с.

49. Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды. Методические указания. М.: Агропромиздат,1989. - 32 с.

50. Ладный, В.И. Сибирская язва на территории Российской

51. Федерации / В.И. Ладный, Г.В. Ющенко // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2009. - №2. - С. 36 - 40.

52. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М: Высшая школа, 1990.352с.

53. Лашкевич, В.А. Использование моноклональных антител в вирусологии / В.А.Лашкевич // Вопросы вирусологии. 1983. - №6. - С.648 -654.

54. Левина, Е.Н. Изучение антигенов В. anthracis и В. cereus с помощью люминесцентно серологического и цитохимических методов исследования / Е.Н. Левина, Л.Н. Кац // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологиии. - 1966. - №4. - С. 98-103.

55. Литвин, В.Ю. Общие закономерности и механизмы существования патогенных микроорганизмов в почвенных и водных экосистемах / В.Ю.Литвин // Экология возбудителей сапронозов. М., 1988. - С.20 - 34.

56. Ломаковская, В.М. О размножении микроба сибирской язвы в почвах разных типов / В.М. Ломаковская // Научные труды Львовского зооветеринарного института. Львов, 1956. - Т.8. - С.44 - 52.

57. Мавзютов, А.Р. Ингибиторы полимеразной цепной реакции / А.Р. Мавзютов и и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2003. - №3. - С. 93 - 98.

58. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / под общ.ред. Л.Б. Борисова и A.M. Смирновой. М.: Медицина, 1994. - 528 е.: ил

59. Методы общей бактериологии / пер. с англ., под ред. Ф.Герхардта и др.. М.: Мир, 1983. - 536 е., ил.

60. Микшис, Н.И. Корреляция вирулентности Bacillus anthracis с экспрессией признаков, кодируемых хромосомными генами / Н.И.Микшис, С.А.Еремин, М.Ф.Болотникова // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1999.-№ 4 - С. 25-29.

61. Микшис, Н.И. Прототипы сибиреязвенных вакцин на основе генно-инженерных бациллярных штаммов и синтезируемых ими антигенов автореф. дис. д-ра. мед. наук: 03.00.07: 03.00.15 / Микшис Наталья Ивановна. Саратов, 2009. - 49 с.

62. Миротворский, К.А. Опыт изучения взаимоотношений между возбудителем сибирской язвы и почвенными микроорганизмами / К.А. Миротворский // Советское Здравохранение Туркмении. — 1940. №6.

63. Митин, С.С. Испытание активности цитоплазменного сибиреязвенного антигена на белых мышах, морских свинках и кроликах / С.С. Митин // Достижения и перспективы борьбы с сибирской язвой в СССР: тезисы докл. науч.-метод. комис. -М.,1978. — С.93-94.

64. Моноклональные антитела для изучения роли антигенов белковой природы в серотипировании бактерий Y.pseudotuberculosis / В.А.Федорова и др. // Молекулярная генетика микробиология и вирусология. -2001. №3. -С. 28-35.

65. Носков, Н.И. Почва — важнейший резервант сибирской язвы / Н.И.Носков // Ученые записки Кабардино Балкарского Гос. Университета. - Нальчик. - 1967. - Вып. 34 - С. 105 - 117.

66. Онищенко, Г.Г. Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в России в 1999 2003 г.г.»

67. Опыт использования ГИС-технологий для изучения закономерностей пространственно-временного распределения стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов / Б.Л.Черкасский и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2005. - №6.- С. 19-23.

68. Определитель бактерий Берджи / под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др. М., 1997. - Т.2. - 800 с.

69. Пальцев, М.А О биологической безопасности / М.А.Пальцев // Вестник Российской академии наук. 2003. - Т. 73, № 2. - С. 99-109.

70. Перспективы применения генотипирования Bacillus anthracis в эпидемиологическом анализе / О.И.Цыганкова и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2006. - №1.- С.24-28.

71. Покишевский, Н.А. Сибирская язва как почвенная эпизоотия / Н.А. Покишевский, А.Д. Головин // Практическая ветеринария. 1931. - №7. -С.20-23.

72. Полипептидные спектры SDS- антигенэкстрактов представителей рода Bacillus /А.К. Галиуллин и др. // Ветеринария. 2004. - №11. - С.24-27.

73. Получение и свойства пригодного к иммобилизации ферромагнитного кремнезема, модифицированного карбонизированным лигнином и карбодиимидом / Т.Н. Орлова и др. // Вестник Московского Университета (Сер.2 Химия). 2008. - Т.49, №3. - С. 213 - 216.

74. Почва — основной резервуар возбудителя сибирской язвы / Н.Г.Ипатенко и др.. // Ветеринария. 1991. - №12. - С.23 - 26.

75. Преснов, И.Н. Выживаемость в почве возбудителя сибирской язвы: автореф. дис. . канд. вет. наук: 16.00.03. / Преснов И.Н. М., 1966. -20 с.

76. Преснов, И.Н. Изменчивость B.anthracis в природных условиях / И.Н.Преснов // Ветеринария. 1966. -№7. - С. 35 - 37.

77. Проблема биотерроризма в современных условиях / А.А.Воробьев и др.. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии 2002. - №3. - С. 3 - 12.

78. Продукция белков S- слоя штаммами Bacillus anthracis / Н.И.Микшис и др. // Биотехнология. 2004. - №5. - С.22-32.

79. Профилактика сибирской язвы / Н.Г.Ипатенко и др. // Ветеринария. 1992. - № 2. - С. 31-32.

80. Рогожин, В.В. Практикум по биологической химии: Учебно-методическое пособие / В.В.Рогожин. СПб.: Лань, 2006. — 256 с.

81. Родзиковский, А. В. Популяционная динамика сибиреязвенного микроба в некоторых почвах: дис. канд. мед. наук: 03.00.07. / Родзиковский

82. A. В. Иркутск, 1989. - 114 с.

83. Ройт, А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д.Мейл; пер. с англ. М.: Мир, 2000. - 592с.

84. Роль компонентов S-слоя в иммуногенности возбудителя сибирской язвы / Н.И. Микшис и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - №1. - С. 29 - 32.

85. Романов, М.Г. Моноклональные антитела к антигенам

86. B.anthracis: получение и применение: дис. .канд. биол. наук: 03.00.23 / Романов Михаил Геннадьевич. М., 2005. - 98с.

87. Северин, Е.С. История и современное состояние молекулярной диагностики / Е.С.Северин, М.А.Пальцев // Молекулярная медицина. 2006. - №4. -С.13 - 25.

88. Селянинов, Ю.О. Новый способ определения гемолитической активности штаммов В. anthracis / Ю.О. Селянинов, И.Ю. Егорова // Вестник РАСХН. 2004. - №5. - С. 42-45.

89. Селянинов, Ю.О. О диагностических ошибках при индикации и идентификации В. anthracis / Ю.О. Селянинов, И.Ю. Егорова // Ветеринария. -2008. -№Ю. -С.30-33.

90. Селянинов, Ю.О. Сибирская язва: биологические и генетические свойства возбудителя и технология получения ассоциированных вакцин на основе штамма 55-ВНИИВВиМ: дис. . д-ра. биол. наук: 03.00.23 / Селянинов Юрий Олегович. Покров, 2007.- 262 с.

91. Серологическое родство возбудителя сибирской язвы с некоторыми спорообразующими микробами / В.В. Акимович и др. // Специфическая профилактика особо опасных инфекций: сборник науч. трудов М., 1964. - С. 226-236.

92. Сибирская язва / под ред. С.Г. Колесова. М.: Колос, 1976 - 287с.

93. Сибирская язва / Н.Г. Ипатенко и др.; под ред. Н.Г. Ипатенко. -2-е изд., перераб. и доп. М.: Колос, 1996. - 335 е., ил.

94. Сибирская язва: Актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики / Г.Г.Онищенко и др.. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - 448 с.

95. Сибирская язва: ранние этапы внутриклеточной стадии развития инфекции / И.В.Бахтеева и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2005. - № 4.- С. 3 - 9.

96. Скоупс, Р. Методы очистки белков / пер. с англ. В.К.Антонова Р. Скоупс. М.: Мир, 1985. - С.56-90.

97. Соркин Ю.И. Сибирская язва в Восточной Сибири (1860-1967г.г.): автореф. дис. канд. мед. наук: 14.00.30/ Соркин Ю.И. Саратов, 1972, 29с.

98. Сорока, С.А. Влияние акустических колебаний на биологические объекты / С.А.Сорока // Вибрация в технике и технологиях. 2005. - № 1. — С. 39-41.

99. Сравнительный анализ средств, применяемых для дезинфекции опасных микроорганизмов / А.Д.Украинцев и др. //Химическая и биологическая безопасность. 2005.- №6 (24). -С. 12-22.

100. Степанов А.С. Разработка основ генетического анализа возбудителя сибирской язвы: дисс. . д-ра. мед. наук: 03.00.07 / Степанов А.С. Саратов, 1992. - 230с.

101. Таксономия возбудителя сибирской язвы / Л.И. Маринин и др. // Проблемы медицины, экологии и биотехнологии: сборник тезисов докладов юбилейной науч. конф. поев. 25-летию ГНЦ прикладной микробиологии, Оболенск, 1999. С. 102 - 103.

102. Теория и практика иммуноферментного анализа / A.M. Егоров и др.. — М.: Высшая Школа, 1991. 288 е.: ил.

103. Токсические свойства некоторых почв Сибири и Дальнего Востока по отношению к микробу сибирской язвы. Краевая инфекционная патология Восточной Сибири / Иванова Д.П. и др.. Иркутск, 1978. - С.213-218.

104. Трансдукционная и конъюгапионная передача плазмиды рХ02 Bacillus anthracis / Степанов А.С. и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1989. -№ 12. - С. 39-43.

105. Федорова, Г.А. Особенности эпизоотологии и биологических свойств изолятов возбудителя сибирской язвы в Алтайском крае: автореф. дис. . канд. вет. наук: 16.00.03 / Федорова Галина Анатольевна. —Барнаул, 2005. 23с.

106. Фримель, Г. Иммунологические методы / пер. с нем. А.Н. Маца; Г. Фримель. М.: Мир, 1979. - 520 е.: ил.

107. Фримель, Г. Иммунологические методы / пер. с нем. А.П. Тарасова; Г.Фримель. М.: Медицина, 1987. - 472 е.: ил.

108. Цыганкова, О.И. Гемолитическая и протеолитическая активность сибиреязвенного микроба: дис. . канд. мед. наук: 03.00.07 / Цыганкова Ольга Ивановна-Саратов, 1993. 179 с.

109. Черкасский, Б.Л. Сибирская язва / Б.Л.Черкасский, Н.Ж.Жанузаков. Алма-Ата, 1980. - 192 с.

110. Чуйская, Г.Я. Изучение сибирской язвы в связи с пребыванием В.anthracis в почве: дис. . канд. мед. наук / Чуйская Г.Я. Кишинев, 1967. -140 с.

111. Шаркова, В.Е. Ошибки при проведении иммуноферментного анализа / В.Е. Шаркова, Г.С.Власов, Н.В. Свежова // Клиническая лабораторная диагностика. — 2007. №3. - С. 42 — 45.

112. Шахбанов, А.А. Ультраструктура В. anthracis и В. cereus / А.А.Шахбанов// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. — 1975. №6. -С. 92-96.

113. Шевченко, О.В. Протеолитическая активность возбудителя сибирской язвы: дис. . канд. мед. наук: 03.00.07 / Шевченко Оксана Владимировна. Саратов, 1999. - 99 с.

114. Шляхов, Э.Н. Иммунология, иммунодиагностика, иммунопрофилактика инфекционных болезней / Э.Н. Шляхов. Кишинев: Картя Молдовеняскэ, 1977. - 424 с.

115. Шляхов, Э.Н., Материалы испытания методов лабораторной диагностики сибирской язвы и идентификации возбудителя / Э.Н.Шляхов, Е.В.Груз // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1967. -№ 10.-С. 52-55.

116. Шляхов, Э.Н. Сибирская язва (очерки эпидемиологии, лабораторной диагностики и профилактики) / Э.Н.Шляхов, Е.В. Груз, В. И. Присакарь. Кишинев: Штинца, 1975. - 162 с.

117. Шуляк, Б.Ф. Грамположительные бактерии, молликуты и спирохеты. Руководство по бактериальным инфекциям собак. Том 1. / Б.Ф. Шуляк. М.: Олита, 2003. - 544 с.

118. Экспериментальные данные по выявлению вируса гриппа с помощью магнитных иммуносорбентов / В.И. Ефременко и др. // Вопросы вирусологии, 2008. №3. - С. 43 - 45.

119. Эпидемиологическая обстановка по сибирской язве в РФ Монисов А.А. и др. // Материалы Межрегион, рабочего совещания ВОЗ / ФАО по сибирской язве. Алмааты, 1997. - С. 27 - 29.

120. Ярилин, А.А. Гомеостатические процессы в иммунной системе. Контроль численности лимфоцитов / А.А.Ярилин // Иммунология. 2004. -Т.25, №5.-С.312-320.

121. A high-affinity monoclonal antibody to anthrax protective antigen passively protects rabbits before and after aerosolized Bacillus anthracis spore challenge / N. Mohamed et al.. // Infec. and Immun. 2005. - 73, № 2. - P.795-802.

122. An amplified ELISA for the detection of parvovirus В19 Ig M using monoclonal antibody to FITC / K.E. Brown et al. // J. Virol. Meth.-1989. Vol. 26. - P. 189- 198.

123. Ask, C. Comparative analysis of B. anthracis, B. cereus and related species on the basis of reverse transcpiptase sequencing of 16s RNA / C. Ask, J.A.E. Farrow, M. Darsch // Int. J. Syst. Bacteriol. 1991. - Vol. 41. - P. 343 -346.

124. Baba, T. Studies on the immunospecific and non-specific substance of Bacillus anthracis / T. Baba // Jap. J. Bacteriol. 1964. - Vol.19, №2. - P.58-60.

125. Beall, F.A. Rapid lethal effect in rats of a third component found upon fractionating the toxin of Bacillus anthracis / F.A. Beall, M.J. Taylor, C.B. Thorne //J. Bacteriol. 1962. - Vol.83, №6. - P. 1274-1280.

126. Campbell, A.M. Monoclonal antibody and immunosensor technology / A.M. Campbell // Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. 1991.- Vol. 23.-P. 427.

127. Characterization of the Bacillus anthracis S-layer: cloning and sequencing of the structural gene / I. Etienne-Toumelin et al. // J. Bacteriol. -1995.-Vol. 177.-P.614.

128. Demonstration of capsule plasmid in Bacillus anthracis / Green B.D. et al. // Inf. Immun, 1985. -№ 49. P. 291-297.

129. Differentiation of B. anthracis and others B. species by lectins / Cole H.B. et al. // J. Clin. Microbiol. 1984. - №1. - P.48-53.

130. Dragon, D.C. Evaluation of spore extraction and purification methods for selective recovery of viable Bacillus anthracis spores / D.C. Dragon et al. // Letters in Applied Microbiology. 2001. - Vol. 33. - P. 100-105.

131. Dragon, D.C. The ecology of anthrax spores: tough but not invincible / D.C.Dragon, R.P.Rennie // Can. Vet. J. 1995. - Vol. 36, № 5. - P. 295-301.

132. Evidence for plasmid mediated toxin production in Bacillus anthracis / P. Mikesell // Inf. Immun. 1983, № 39. - P. 371-376.

133. Evolution of Biolog system for the identification of B. anthracis Baillie L.W. et al. // Let. Appl. Microbiol. 1995. -Vol. 20, №4. - P.209 -211.

134. Fluck, R. Fluoreszenzserologishe untersuchungen von kreuzreaktion zwischen sporen von B. anthracis und sporen aerobersporenbildner / R. Fluck, R.Bohm, D.Stranch // Zentralbaltfur veterinar medizin. Series B. - 1977. - S. 497 - 507.

135. Formation and composition of the Bacillus anthracis endospore / H. Lui et al. // J. Bacteriol. 2004 -Vol. 186. - P. 164-178.

136. Freer, J.H. Virulence Mecchanism of Bacterial Pathogenecity / J.N.Freer//International Workshop on Anthrax.-Winchester, 1989.-P.43.

137. Genomebased bifoinformatic selection of chromosomal Bacillus anthracis putativ vaccine candidates coupled with proteomic identification of surface-associated antigens / Ariel N. et al. // Infection Immun, 2003. №71. - P. 4563-4579.

138. Hugh Jones. M.E. Global Report, 2000. 4th International Conferenceon Anthrax. Program and Abstracts Book. June 10- 13, 2001. St. John s College. -Annapolis. Maryland; USA, 2001. P. 13.

139. Human Ingestion of Bacillus anthracis — Contaminated Meat H. Kassenbord et al. // 4th International Conference on Anthrax. Program and Abstracts Book. June 10 13, 2001. St. Johns College. - Annapolis. Maryland; USA, 2001.- P. 19-20.

140. Identification of Bacillus anthracis by Using Monoclonal Antibody to Cell Wall Galactos-N-Acetylglucosamin Polysaccharide / W. John Ezzell et al. // Journal of Clinical Microbiology, 1990. P.223-231.

141. Identification of В. anthracis Sterne strain from strains using special medium / J.E. Parker et al. // The 2-nd International Workshop on the molecular biology of B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis. — Taos; New Mexico; USA, 1999.-P. 48.

142. Identification of B. anthracis using the API 50 CHB system / Conge R. et al. // Proc. Inter. Workshop on anthrax. Winchester, England, 1996. -№87.-P. 34-36.

143. Identification of Bacillus anthracis by Using Monoclonal Antibody to Cell Wall Galactos-N-Acetylglucosamin Polysaccharide / Ezzell J. W. et al. // Journal of Clinical Microbiology. 1990. - P.223-231.

144. Identification of the immunodominant protein and other proteins of the Bacillus anthracis exosporium / C.T.Steichen et al. // J. Bacteriol. 2003. -Vol. 185.-P. 1903-1910.

145. Immunological Analysis of Cell-Associated Antigens of Bacillus anthracis / J. W. Ezzell et al. // Infection and Immunity. 1988. - Vol.56, № 2. -P. 349-356.

146. Interaction of the 20 kDa and 63 kDa fragments of anthrax protective antigen: Kinetics and thermodynamics / Kenneth A. Christensen et al. // Biochemistry. 2005. - Vol. 44, № 3. - P.1047-1053.

147. Isothiocyanate compounds as fluorescent labelling agents for immune serum / J.L. Riggs et al. // Amer. J. Path. 1958. - Vol. 34. - P. 1081 - 1097.

148. John, W. Ezzell. Immunological Analysis of Cell-Associated Antigens of Bacillus anthracis / W. Ezzell John, G. Abshire Teresa // Infection and Immunity. -1988. V. 56, № 2. - P. 349-356.

149. Keppie, J. The chemical basis of the virulence of Bacillus anthracis. IX. Its Aggressins and their mode of action / J.Keppie, P.W. Harris Smith, H. Smith // Brit. J. Exptl. Path. - 1963. - Vol. 44, № 4. - P. 446 - 453.

150. Koehler, Т.М. Bacillus subtilis (natto) plasmid pLS20 mediates interspecies plasmid transfer/ T.M.Koehler, C.B. Thorne // J. Bacteriol. -1987. -Vol. 169, № 11. P. 5271 - 5278.

151. Laemmli, V.K. Cleavage of structural protection during the assemble of the bacteriophage T4 / V.K.Laemmli // Nature. 1970. - Vol. 27. - P. 680 -685.

152. Lawrence, D. Differentiation of Bacillus anthracis from Bacillus cereus by Gas-Chromatographic Whole-Cell Fatty-Acid Analysis / D.Lawrence, S. Heitefuss // Journal of Clinical Microbiology. 1997. - Vol. 29. - P.P. 1508-1512.

153. Logan, N.A. Bacillus and recently derived genera // Manual of clinical microbiology / N.A. Logan, P.C. Turnbull. Washington (D. C.): American Society for Microbiology, 1999. - P. 357-369.

154. Lorez, I. Bacterial sporulation is not under the same control as catabolit repression of enzymes / I.Lorez, B.Wong, E.Freese // Abstrs. 79 th. Ann. Meet. Amer. Soc. Microbiol. Los Angeles, Calif.-1979. - Washington D.C., 1979. -P. 111.

155. Mishell, B.B.Selected methods in cellular immunology / B.B. Mishell, S.M. Shiigi. San Francisco W.H. Freeman and Company, 1980. - 486 p.

156. Mock, M. /М. Mock, A. Fouet //Microbiol. Rev. 2001. - Vol. 55. -P. 647—671.

157. Molecular characterization of the Bacillus anthracis main S-layer component: evidence that it is the major cell-associated antigen / S. Mesnage et al. //Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 23, №6. - P. 1147-1155.

158. Monoclonal Antibodies for Bacillus anthracis Spore Detection and Functional Analyses of Spore Gennination and Outgrowth 1 / Swiecki M.K. et al. // J. of Immunology. 2006. - Vol. 176. - P. 6076-6084.

159. Neutralizing Monoclonal Antibodies Directed against PA Bacillus anthracis / F. Brossier et al. // 4 International Conference Anthrax, June 10 13, 2001, St John's College Annapolis. - Maryland; USA, 2001. - P. 44.

160. Phillips, А.Р. Investigating of spores surface antigen in the genus Bacillus by the use polyclonal antibodies in immunofluorescent tests / A.P. Phillips, K.L. Martin // J. App. Bacteriology. 1998. - №64. - P. 47 - 55.

161. Potter, M. Growth of primary plasmocytomas in the mineral oil-conditioned peritoneal environment / M. Potter, J.G. Pumphrey, J.L. Walters //J. Natl. Cancer Inst. 1972. - Vol. 49, №. 1. - P. 305-308.

162. Protein measurement with the folin phenol reagent / O.H. Lowry et al. // J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.

163. Proteomic analysis of the spore coats of Bacillus subtilis and Bacillus anthracis / Lai E.M. et al. // J. Bacteriol. 2003. - Vol. 185. - P. 1443-1454.

164. Redmond, C. Identification of proteins in the exosporium of Bacillus anthracis / C. Redmond et al. // J. Microbiol. 2004. - Vol. 150. - P. 355 - 363.

165. Ruhfel, R.E. Interspecies transduction of plasmids, among Bacillus anthracis, B. cereus, and B. thuringiensis / R.E. Ruhfel, N.J. Robillard, C.B. Thorne // J. Bacteriol. 1984.-Vol. 157, №3.-P. 708-711.

166. Selective growth medium for the rapid environmental recovery and identification of anthrax bacillus / J.L. Kiel et al. // 3r-d International Conference on Anthrax, Plymouth, England. 7 10-th September 1998. - Plymouth, 1998. -P. 54.

167. Steichen, C.T. Characterization of the exosporium basal layer protein BxpB of Bacillus anthracis / C.T. Steichen, J.F. Kearney, C.L. Turnbough // J. Bacteriol. 2005. - Vol. 187. - P. 5868-5876.

168. Suppresion of sporulation of Bacillus subtilis / Freese F. et al. // Spores Pap. 5 th Int. Spore Conf. Fontana (Wise.), 1971. Washington, 1972. - P. 212-221.

169. Sylvestere, P. A collagen-like surface glycoprotein is a structural component of the Bacillus anthracis exosporium / P. Sylvestere, E.Coutrure-Tosi, M.Mock // Mol. Microbiol. 2002. - Vol. 45. - P. 169 - 178.

170. Thorne, C.B. Transducing Bakteriophag of B. cereus and B. anthracis / C.B. Thorne // J. Bacteriol. Rew. 1968. - Vol. 32. - P. 358 - 361.

171. Thorsell, W. Comparison of the haemolytic properties of Bacillus cereus and Bacillus anthracis / W. Thorsell, B.K. Nordberg // Acta vet. scand. -1961.-Vol. 2, № l.-P. 15-21.

172. Tijssen, P. Practice and theory of enzyme immunoassays / P. Tijssen// Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology.— Amsterdam; New York; Oxford: Elsevier, 1985. Vol. 15.

173. Tombin, P.K. Electroforetic transfer of proteins from polyacrilamide gel to nitrocellulose sheets / P.K. Tombin, T.Staehelin, J. Gordon // Proc. Natl. Acad. Sci. 1979. - V. 76, №9. - P. 4350 - 4354.

174. Vodkin, MH. Cloning of the protective antigen gene of Bacillus anthracis / MH. Vodkin, SH. Leppla // Cell. 1983. - Vol. 34. - P. 693-697.

175. Williams, D.D. Surface layer protein EA1 is not a component of Bacillus anthracis spores but is a persistent contaminant in spore preparations D.D. Williams, C.L. Turnbough // J. Bacteriol. 2004. - Vol.186 - P.566-569.

176. Yelton, D.B. Transduction in B.cereus by each of two bacteriophages / D.B. Yelton, C.B. Thorne // J.Bacteriol. 1990. - Vol. 102. -P. 573 - 579.

177. Yin, Fen-Ke. A lepfenebacillusnak a hozza hasonlo aerob sporas bakteriumoktel vato elkulonitese, az agargeldiffuzions precipitacions probaval / Yin Fen-Ke // Magy. Allatorv. Lapja. 1961. - Vol. 15, №10. - P. 369-373.

Информация о работе

Лягоскин, Иван Владимирович
кандидата биологических наук
Покров, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Конструирование магноиммуносорбента для обнаружения возбудителя сибирской язвы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы