Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка и совершенствования средств и методов экстренной постэкспозиционной защиты центральной нервной системы животных от вируса бешенства

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Разработка и совершенствования средств и методов экстренной постэкспозиционной защиты центральной нервной системы животных от вируса бешенства"

¿1

На правах рукописи

ЛЕБЕДЬКО ЕВГЕНИЙ ИВАНОВИЧ

Разработка и совершенствования средств и методов экстренной постэкспозиционной защиты центральной нервной системы животных от вируса бешенства

06.02.02- ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Щелково-2010 г

004600314

Работа выполнена в отделе вирусологии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ВНИТИБП).

Научный руководитель;

доктор ветеринарных наук, лауреат премии Правительства РФ,

Заслуженный ветеринарный врач России, Иванов Виктор Серафимович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Кузнецова Светлана Владимировна

доктор ветеринарных наук, профессор, лауреат премии Правительства РФ

Заслуженный работник высшей школы РФ, Белоусова Раиса Васильевна

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко».

Защита состоится 26 марта 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, поселок Биокомбината, дом 17, ВНИТИБП; e-mail: unitil?p@mail.ru,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП РАСХН. Автореферат разослан 24 февраля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Ю.Д. Фролов

1. Общая характеристика работы 1.1. Актуальность темы.

Бешенство или гидрофобия (Rabies - лат., Lyssa - греч., Tollwut - нем., La Rage - франц., Rabies- англ., La Rabbia- итал.) - древнейшая неизлечимая, нейровирусная болезнь человека и животных, с раневым механизмом передачи вируса от животных к животным и от животных к человеку. (Груздев К.Н., Недосеков В.В., 2001; Knobel D.L. et al, 2005).

Ежегодно в мире за антирабической помощью обращается более 12 млн. человек. Более 50 тыс. человек и 1 млн. животных погибают после укусов бешеными животными. Для более 3 миллиардов людей существует угроза подвергнуться нападению бешеных животных (Rotivel V. Et al, 1998; WHO technical report scries, 2004; Бюл. ВОЗ 7.12, 2007).

В РФ ситуация по бешенству также продолжает оставаться напряженной, с тенденцией к ухудшению эпизоотической и эпидемиологической обстановки. (Бешенство в РФ. Информационный билютень, Москва, 2006; Хисматуллина H.A. с соавт., 2005; Мовсесянц A.A., 2005).

Защищенность людей от этой смертельной вирусной инфекции во многом определяется частотой случаев бешенства среди животных, живущих рядом с человеком, а защищенность самих животных - от эффективности их иммунизации антирабическими вакцинами.

Согласно действующим инструкциям, ангирабические вакцины, в частности из штамма Щелково-51, применяются не только для профилактической (предэкспозиционной), но и при вынужденной (постэкспозиционной) иммунизации, которую начинают проводить не позднее 48 часов после возможного инфицирования животных. Фактически её осуществляют во время инкубационного периода болезни, продолжительность которого позволяет создавать, при своевременной двукратной вакцинации, состояние невосприимчивости ЦНС к вирусу бешенства, до его проникновения в этот орган. Однако, при несвоевременном обращении за помощью, а также

С\

при многочисленных укусах опасной локализации существует угроза опережающего продвижения возбудителя болезни к ЦНС и развития последствий, в результате которых жертвы перед гибелью становятся опасными источниками инфекции.

: Такая возможность обуславливает необходимость разработки и совершенствования средств и методов экстренной (постэкспозиционной) защиты ЦНС ценных и редких животных от вируса бешенства. Целесообразность проведения исследований в этом направлении признана и экспертами ВОЗ по бешенству. Актуальным признается и вопрос о механизме защиты «забарьерного органа» - ЦНС от вируса бешенства.

1.2. Цели и задачи исследований

Цель исследований:

1. Разработать и совершенствовать технологию получения и применения специфических средств экстренной защиты ЦНС животных от вируса бешенства;

2. Определить перспективы применения неспецифических противовирусных препаратов для экстренной защиты ЦНС животных от возбудителя бешенства;

3. Провести поиск нетрадиционных экспериментальных подходов к решению проблемы экстренной защиты ЦНС животных и человека от вируса бешенства.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• разработать доступный рациональный способ получения высокоактивной, стабильной при хранении стандартизированной антирабической сыворотки;

• определить время проявления сё протективной активности на уровне ЦНС, при подкожной и внутримышечной инокуляции животным;

• определить уровень защиты ЦНС животных от вируса бешенства, в зависимости от дозы вводимых им подкожно вирусней грализугощих антител;

• изучить влияние сывороточных аптирабических антител на развитие поствакцинального иммунитета при двукратной вакцинации животных в зависимости от дозы и времени введения антител;

• изучить динамику проявления иммуногенности отечественной антирабической вакцины «Рабикан» в процессе её пятикратной (в 0-ой, 3-ий, 7-ой, 14-ый, 30-ый день) инокуляции белым крысам и мышам, предварительно иммунизированных в О-вой день антирабической сывороткой;

• исследовать эффективность комбинированного и раздельного применения коммерческих неспецифичсских противовирусных препаратов амиксина и рифампицина для защиты ЦНС животных от возбудителя бешенства;

• изучить влияние амиксина и рифампицина на развитие антирабичсского поствакцинального иммунитета;

• исследовать эффективность комбинированного применения неспецифических (амиксина и рифампицина) и специфических (антирабической вакцины) средств при экстренной защите ЦНС животных от вируса бешенства;

• исследовать возможность дистантного воздействия антирабической сыворотки на репродукцию вируса бешенства в чувствительных клетках in vitro.

1.3. Научная новизна

Впервые, с применением отечественных антирабических вакцин из вируса бешенства шт. «Щелково - 51», разработан эффективный способ получения стабильной при хранении стандартизированной сухой антирабической сыворотки крупного рогато скота, обладающей выраженной вируснейтрализующей in vitro и протективной активностью на уровне ЦНС.

Впервые получены и представлены данные характеризующие динамику проявления позитивных и негативных последствий пассивной иммунизации на

развитие поствакцинального иммунитета и защищенность ЦНС животных от вируса бешенства.

Впервые показано, что экстренная защита ЦНС от вируса бешенства может проводиться по схеме, предусматривающей интрацеребральное введение животным отечественной инактивированной антирабической вакцины «Рабикан» и подкожную инокуляцию им коммерческих неспецифических препаратов - амиксина и рифампицина.

1.4. Практическая значимость работы

1.4.1. Разработан доступный экономичный способ получения высокоактивной антирабической сыворотки крови крупного рогатого скота и изготовления из неё стандартизированного стабильного при хранении сухого антителосодержащего антирабического препарата, обладающего выраженной вируснейтрализующей - in vitro, и протективной - in vivo, активностью.

1.4.2. Полученные результаты нашли своё отражение в:

• технических условиях на референс - сыворотку антирабическую сухую (ТУ 9388-131-00494189, согласованных с заместителем руководителя Россельхознадзора 3 марта 2008 года);

• инструкции по изготовлению рефсренс - сыворотки антирабической сухой, утвержденной директором ВНИТИБП 12 ноября 2007 г.;

• инструкции по применению референс - сыворотки антирабической сухой, утвержденной заместителем руководителя Россельхознадзора 3 марта 2008 г.

1.5. Основные положения, выносимые на защиту

1.5.1. Предложенная нами технология позволяет получать сухую антирабическую сыворотку крови крупного рогатого скота, которая является однородным, высокостабильным вируснейтрализующим препаратом, обладающим выраженной протективной активностью на уровне ЦНС в первые часы и дни после её подкожного введения животным в комбинации с антирабической вакциной, изготовленной из вируса бешенства штамм Щелково - 51, или без нее.

1.5.2. Экстренную постэкспозиционную иммунизацию животных

целесообразно проводить по схеме рекомендованной ВОЗ для людей,

4

предусматривающей однократную инъекцию антител и пятикратное введение антирабической вакцины.

1.5.3. Экстренная защита животных от бешенства может основываться на интрацеребральном введении им антирабической вакцины «Рабикан», подкожной инокуляции амиксииа и рифамницина, и последующей вакцинации согласно действующим наставлениям.

1.5.4. Антирабическая сыворотка крови крупного рогатого скота может воздействовать дистантно на накопление антигена вируса бешенства в монослойной культуре клеток ВНК-21.

1.6. Апробация

Основные положения диссертационной работы отражены в итоговых отчетах ГНУ ВНИИТБП за 2006-2009 гг. Материалы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИТБП (2006-2009 гг.), а также на Международной конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» 20-21 декабря 2007 года (Щелково, 2007 г.), на конференции молодых ученых Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина, 17 марта 2008 года (Москва, 2008 г.)

1.7. Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 4 статьи, в том числе 1 публикация в журнале, рекомендованном ВАК РФ «Ветеринарная медицина» №2-3.

1.8. Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 108 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, содержащий 120 источника. Работа иллюстрирована 13-тью таблицами и дополнена приложениями.

1.9. Личный вклад Основная часть диссертационной работы выполнена автором самостоятельно. Отдельные опыты проведены с помощью сотрудников отдела противовирусных препаратов ВНИТИБП - за что автор выражает им искреннюю благодарность.

2. Материалы и методы

Животные: крупный рогатый скот (быки), массой 230-250 кг; щенки беспородных собак, массой 2,5-3,2 кг; белые крысы «Вистар», массой около 150 г, беспородные белые мыши, в основном массой 12-15 г.

Вирусы: производственный фиксированный вирус бешенства штамм Щелково - 51; вирус бешенства CVS - международный рефсренс - штамм, полученный из института им. JI. Пастера, г. Париж.

Культура клеток: перевиваемая линия клеток почки сирийского хомяка ВНК - 21/13, из производственного криобанка клеток ВНИТИБП.

Питательные среды и растворы: среда Игла и 199; коммерческая сыворотка крови крупного рогатого скота; 0,25 % - ный раствор трипсина; раствор Хенкса и фосфатно - буферный раствор, рН 7,3 - 7,5.

Культивирование клеток: клетки ВНК -21 выращивали при 36-37° С роллерным способом, на внутренней поверхности круглостенных стеклянных 0,5 - 1,0 литровых сосудов культивирования, вращающихся со скоростью 10 -12 об/час. Для их снятия со стекла использовали раствор трипсина.

Культивирование вируса. Снятые со стекла клетки инфицировали вирусом бешенства штамм Щелково - 51, высеивали в круглостенные сосуды и выращивали роллерным способом, с использованием смеси питательных сред Игла, 199 и сыворотки крови крупного рогатого скота. Вирус, в виде вируссодержащей культуралыюй жидкости, получали через 72 и 96 часов культивирования.

Размножение стандартного вируса бешенства штамм CVS осуществляли путем его пассирования через мозг мышей.

Титрование вируса. Титр инфекционности вируса бешенства штаммов

Щелково - 51 и CVS определяется на белых мышах массой 10 - 12 г. Для этого

готовили 10 - кратное разведение исследуемого материала на растворе Хенкса

б

и каждым разведением заражали 5-7 белых мышей интрацеребрально в дозе 0,03 мл. Наблюдение за животными проводили в течение 14 суток. Погибшими от бешенства считали тех животных, смерть которых наступала после 5-го дня заражения с проявлением клинических признаков бешенства. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в lg ЛД50/мл.

Определение иммуногепности аитирабических вакцин. Эффективность поствакциналыюго иммунитета оценивали по выживаемости животных, зараженных в мозг вирусом бешенства штамм CVS и по уровню вируснейтрализующей активности антител в их крови, определяемой в реакции нейтрализации.

Определение в реакции нейтрализации (РН) вируснейтрализующей активности сыворотки крови животных. Реакцию нейтрализации проводили общепринятыми методами на мышах (методы лабораторных исследований по бешенству ВОЗ, Женева. 1975).

Статистическая обработка результатов исследований. Статистическую обработку результатов проводили согласно методикам, изложенным в соответствующей главе «Методы лабораторных исследований по бешенству» ВОЗ, Женева - 1975, с определением средних величин выборки х~, средней квадратичной ошибки m и достоверности разницы между средними величинами по таблице t Стьюдента (Сюрин В.Н., 1966).

3. Результаты исследования

3.1 Разработка и совершенствование технологии получения и применения специфических средств экстренной защиты ЦНС животных от вируса бешенства.

По мнению экспертов по бешенству, любой укус с появлением крови должен рассматриваться как опасный укус 3-й категории тяжести (WHO, 931, 18, 2004), требующий комбинированного применения ангирабического иммуноглобулина (АИГ) и вакцины.

Применение аитирабических антител преследует цель защиты ЦНС людей от вируса бешенства до его проникновения в этот орган и выигрыша времени

для формирования поствакциналыюго иммунитета.

7

В ветеринарной практике при вынужденной иммунизации животных против бешенства антирабичсский иммуноглобулин или антирабическая сыворотка не применяются, хотя показания к их применению имеются.

Во многом это объясняется отсутствием доступных и активных препаратов для пассивной иммунизации животных.

Целью настоящей работы являлась разработка эффективного способа получения высокоактивного стабильного при хранении сухого стандартизированного антирабического сывороточного препарата и технологии его применения для экстренной постэкспозиционной защиты ЦНС ценных ил просто любимых животных от вируса бешенства.

3.2. Разработка технологии получения сухой антирабической сыворотки и изучение её вируснейтрализующей активности в процессе хранения. В опытах использовали 5 быков, с массой 230-250 кг и антирабическую референс - вакцину сер 1-06 с активностью 1,8 МЕ/мл, изготовленную во ВНИТИБП из вируса бешенства штамм Щелково-51, репродуцированного в монослое культуры клеток ВНК-21. Перед применением сухую вакцину восстанавливали до первоначального объема адыовантным растворителем, с таким расчетом, чтобы в 6 мл вакцины оказалась одна максимальная доза сапонина.

Препарат вводили подкожно в область шеи в дозе 6 мл (10 МЕ) двукратно, с интервалом в 38 дней. Через 12 и 19 дней после второй вакцинации от животных брали кровь и методом отстаивания и центрифугирования получали сыворотку крови крупного рогатого скота.

К объединенной в одной ёмкости сыворотке добавляли 5 % защитной среды высушивания, представляющей собой стерильный водный раствор пентона (15 %), сахарозы (15 %) и желатина (4,5 %). Смесь расфасовывали по 10 мл во флаконы объемом 20 см1 и подвергали сублимационному высушиванию в специализированном цехе Щелковского комбината.

Вируснейтрализирующую активность препарата после изготовления и в

процессе хранения, определяли классическим методом в реакции

нейтрализации на мышах относительно сывороточного стандарта, против

8

стандартного вируса бешенства штамм CVS . Активность сыворотки выражали в международных единицах (МЕ/мл). Результаты приведенных опытов отражены в таблице 1.

Таблица 1

Вируснейтрализующая активность сыворотки крови крупного рогатого скота

антирабической сухой.

№ проб Активность после изготовления в МЕ/мл Активность после хранения в МЕ/мл

№ проб 6-8° С 24 мес. № проб 20-25° С 12 мес. № проб 36-37 ° С 5 мес.

1 154,0 4 151,0 7 148,0 10 128,0

2 145,0 5 150,0 8 145,0 11 130,0

3 157,0 6 153,0 9 150,0 12 137,0

Приведенные в таблице данные свидетельствуют о высокой стабильности и однородности изготовленной серии препарата, активность которого можно принять за 150 МЕ/мл.

Важно также отметить, что полученные результаты нашли своё отражение в технологической документации на рефрекс - сыворотку актирабическую сухую.

Представляло интерес исследовать протективную активность полученного антирабического препарата.

3.3. Изучение нротектишюй активности сухой антирабической сыворотки крупного рогатого скота на уровне ЦНС.

На белых мышах определяли скорость формирования невосприимчивости ЦНС к вирусу бешенства, при подкожном и внутримышечном введении животным антирабической сыворотки. Для этого через 1, 2, 3, 5 и 24 часа после пассивной иммунизации определяли индексы защиты, которые рассчитывали по разнице титров интрацеребралыюй инфекционное™ вируса бешенства штамм CVS для контрольных и иммунизированных мышей.

Из представленных данных в таблице 2 следует, что при подкожной или внутримышечной иммунизации животных антирабическими антителами сыворотки крови крупного рогатого скота их протсктивная активность на

уровне ЦНС мышей начинает проявлять Через 2 часа после введения и по истечению последующих 3-х часов почти достигает своего максимума.

Таблица 2

Вр'смя проявления протекгииной активности антирабических антител на уровне ЦНС

мышей.

№№ опытов Доза антитсл/кг Место введения антител . Индексы защиты (в lg ЛД50 )послс введения антител через:

1ч. 2 ч. Зч. 5 ч. 24 ч.

1 160-180 подкожно 0 0,8 1,7 2,0 2,3

2 160-180 внутримышечно 0 1,0 1,5 2,1 2,4

В другой серии опытов мышам вводили подкожно, антитела сыворотки крови крупного рогатого скота, в дозах от 35 до ЗОООМЕ/кг. Через 24, 48 и 72 часа на иммунизированных и неиммунизированных (контрольных) животных проводили Титрование вируса бешенства штамм CVS. Как и в предыдущем опыте, степень защиты выражали индексом защиты. Полученные данные представлены в таблице 3. Из представленных данных видно, что степень защиты ЦНС от вируса бешенства резко возрастает с повышением дозы вводимых в организм мышей антирабических вируснейтрализующих антител.

Таблица 3

Протективная активность антирабических антител сыворотки крови крупного рогатого

скота.

Доза антител в МЕ/кг Индексы защиты (в lg ЛД50 )носле введения антител через:

24 ч. 48 ч. 72 ч.

2500-3000 4,2 4,7 3,8

1000-1200 3,8 4,2 3,2

530-620 3,3 3,7 2,8

170-200 2,5 2,2 2,0

35-40 1,5 1,3 1,0

Для определения протсктивной активности антирабической сыворотки

крупного рогатого скота в опыте на собаках, были взяты беспородные щенки

примерно 35 - 40 дневного возраста, массой 2,5-3,2 кг. Трем щенкам ввели

подкожно по 10 мл сыворотки (500 МЕ/кг), трем другим по 5 мл (250 МЕ/кг), а

щенкам 3-й группы - 1 мл (50 МЕ/кг) через 2-а дня иммунизированных и

неиммунизированных (контрольных) животных заразили в мозг

фиксированным вирусом бешенства в дозе 200-300 ЛД50. За животными

Ю

наблюдали в течение 21 дня. Результаты проведенной работы представлены в

таблице 4.

Таблица 4

__Протективная активность антирабичсской сыворотки р опыте на собаках._

групп Лк№ Доза введенных Результат интрацеребрального заражения

животных животных антител в МП/кг животных фиксированным вирусом бешеиства

1 1 500 не заболело

2 -II- не заболело

3 -II- не заболело

2 4 250 не заболело

5 -II- не заболело

6 -II- летальный (8 день)

3 7 50 летальный (б день)

8 -//- летальный (7 день)

9 -II- летальный (6 день)

4 контроль 10 0 летальный (6 день)

11 0 летальный (7 день)

Из представленных данных видно, что антирабическая сыворотка крови

крупного рогатого скота обладает выраженной протективной активностью в дозах 250-500 МЕ/кг.

В целом полученные нами результаты указывают на перспективность применения антирабической сыворотки крупного рогатого скота в качестве специфического средства для спасения редких и ценных животных от бешенства. Представляло интерес исследовать ее влияние на развитие поствакцинального иммунитета и на устойчивость ЦНС животных к заражению вирусом бешенства при комплексном применении антирабической сыворотки и вакцины.

3.4. Изучение иммуногенности антирабической вакцины на интактных мышах и на мышах, иммунизированных антирабичсской сывороткой

Иммуногенность вакцины определяли методом Национальных институтов здоровья США-№Н (методы лабораторных исследований по бешенству ВОЗ, Женева, 1975). Результаты проведенных экспериментов представлены в таблицах 5 и 6.

Таблица 5

Иммуногенная потенция антирабической вакцины на мышах

Тип сыворотки, использованной для пассивной иммунизации мышей Иммуногенность антирабической вакцины в МЕ/мл, на фоне пассивной иммунизации мышей в дозах

ОМЕ/кг (контроль) 12-15 МЕ/кг 20-25 МЕ/кг 40-45 МЕ/кг

Антирабическая сыворотка крови крупного рогатого скота, с активностью 150МЕ/МЛ 1,55 0,65 0,27 0,08

Антирабическая сыворотка крови мышей, с активностью 10 МЕ/мл 1,58 0,54 0,18 0

Таблица 6

Иммуногенность антирабической вакцины на фоне пассивной иммунизации мышей_

Дозы сыворотки введенные подкожно мышам Проявляемость иммуногенной потенции вакцины в МЕ/мл и (%)

На фоне пассивной иммунизации проведенной после первой вакцинации через (час): Контроль

4 24 48 72 168

40-45 МЕ/кг 0,06 (4%) 0,15 (10%) 0,28 (18,6%) 0,52 (34,6%) 0,85 (56,6%) 1,50 (100%)

130-150 МЕ/кг 0 0Д5 (9,3%) 0,20 (12,5%) 0,4В (30%) 0,67 (41,8%) 1,60 (100%)

Приведенные в таблицах 5 и 6 данные свидетельствуют, что

антирабические антитела сыворотки крови крупного рогатого скота и мышей, инокулированные мышам, до вакцинации или через 4 часа после вакцинации, в дозе 40-45 МЕ/кг практически полностью блокируют развитие поствакципального иммунитета при двукратной вакцинации животных, а в минимальных дозах 12-15 МЕ/кг и 20-25 МЕ/кг снижают проявляемость иммуногенной потенции вакцины в 2,4-2,9 и 5,5-8,7 раза, соответственно.

В этой связи представлялось целесообразным исследовать на лабораторных животных эффективность однократного введения им антирабической сыворотки и вакцины по схеме 0, 3, 7, 14, 30-й день, рекомендованной ВОЗ и применяемой в различных странах для экстренной защиты людей от бешенства.

3.5. Изучение иммуногенности антирабической вакцины на крысах, предварительно иммунизированных антирабической сывороткой крупного рогатого скота. В опыте исследовали 175 самок крыс линии ВИСТАР, со средней массой 147г. Сухую антирабическую сыворотку крови

крупного рогатого скота с активностью 150 МЕ/мл разводили стерильным физиологическим раствором 1:10 и вводили 66 крысам в объеме 0,5 мл подкожно в область лопатки. В результате доза антител на одно животное составила 7,5 ME, а из расчета на 1 кг живого веса - около 51 МЕ/кг. Сразу после пассивной иммунизации крыс этой группы вакцинировали антирабической вакциной «Рабикан», восстановленной до первоначального объема коммерческим адыовантным растворителем РКАВ.

Вакцину с активностью 1,5 МЕ/мл вводили подкожно, в область бедра, в объеме 0,5 мл. В этот же день только вакциной иммунизировали 66 животных другой группы. Затем крыс этих двух групп вакцинировали повторно через 3, 7, 14 и 30 дней. Препарат вводили также как и в нулевой день, но восстанавливали его до первоначального объема не РКАВ, а стерильной дистиллированной водой. Далее, через 1, 3, 7, 14, 30 и 45 дней от 2-3 крыс каждой группы брали сыворотку крови для исследования в реакции нейгрализации, а 8 животных из каждой группы подвергали интрацеребральному заражению вирусом бешенства штамм CVS в дозе 15-20 крысиных ЛД50. В качестве контрольных животных служили неиммунизированные крысы. Окончательный результат учитывали на 20-е сутки после их заражения.

Приведенные данные свидетельствуют, что при комбинированном

применении антирабической сыворотки и вакцины, введенные животным

антирабические антитела (50 МЕ/кг) проявляются в сыворотке крови крыс на

уровне 0,30-0,32 МЕ/кг в течение 3 дней и обеспечивают защиту 37,5 %

животных при их заражении в мозг вирусом CVS, в дозах вызывающих 100 %

гибель неиммунизированных животных или животных иммунизированных

только вакциной. На этом этапе комплексная иммунизация выглядит

предпочтительней, чем иммунизация животных только вакциной. Однако к 7-

му и особенно к 14 дню после начала иммунизации картина резко изменятся и

становиться очевиден провал поствакцинального иммунитета в группе

животных иммунизированных антирабической сывороткой и вакциной. В

частности, антитела в крови животных этой группы к 7-му дню снижаются до

0,2 МЕ/мл, а к 14-му дню - до нуля, с одновременным снижением

.13

выживаемости зараженных животных до 25 и 12,5 %, соответственно. В противоположность этому в группе, где животных иммунизировали только вакциной, активность антител к 7-му и 14-му дню возрастала до 0,8 МЕ/мл и 7,1 МЕ/мл, а выживаемость до 75 и 100 %, соответственно. Такие показатели поствакцинального иммунитета на фоне пассивной иммунизации проявлялись лишь через 30 и 45 дней.

Таблица 7.

Результаты иммунизации белых крыс антирабической сывороткой в дозе 50 МЕ/кг и последующей пятикратной их вакцинации антирабической вакциной «Рабикан».

Дни взятия сыворсптн крови и заражения крыс Лггивноегь сыворотки крови, н мму ниэировачныи внтнрабичсскоП сывороткой и вакциной (МЕ/мл) Результат шпрт |срсбрал м< о го заражения ПАССИВНО И активно иммуиизирпнгннмх животных вирусом Активность антител в сыворотке кропи иммужпиро ванных только вакциной (МП/мл) Результат инчр ацсрсбралмюго заражения вакцинированных крыс, вирусом бешенства Результат интрвцерсбралмюго заражения ненммуитяроааг.та* ЖИВОТНЫХ вирусом бешена ва нгтамм СУЭ

Кол-во зараженных крыс Кол-во выживших животных Кол-во зараженных крыс Кол-во ВЫЖИВШИХ животных Кол-во зараженных крис Кол-во выживших животных

1 0,32 8 3 (37,5%) 0 К _ 0 8 0

3 0,30 8 3 (37,5%) 0 0 5 0

7 0,20 8 2 (25,0%) 0,9 8 6 (75%) 8 0

14 0,00 8 1 (12,5%) 7,1 8 8 (100%) 8 0

30 . 0,90 8 5 (62,5%) ил 8 8(100%) 7 0

45 8,7 8 8 (100%) 37,0 7 7(100%) 8 0

В целом опыт показывает, что при пятикратной вакцинации

животных на фоне предварительно введенной антирабической сыворотки, поствакцинальный иммунитет у крыс развивается примерно на 20 дней медленнее, чем при иммунизации крыс только вакциной. Причем в этом промежутке, скорее всего между 7 и 14-ми сутками, животные могут оказаться практически полностью беззащитными при проникновении в их ЦНС вируса бешенства в количестве 15-20 ЛД50. Поэтому преимущество комплексного применения антирабической сыворотки и вакцины перед чисто вакцинальным вариантом видится в способности введенных подкожно 50 МЕ/кг антител проникать в кровеносное русло животных и защищать ЦНС на уровне 37,5 %, по крайней мере в течение первых трех дней после вакцинации, когда поствакцинальный иммунитет при обычных способах вакцинации еще не проявляется на должном уровне.

Полученные результаты указывали на целесообразность изучения эффективности комбинированной технологии защиты животных от бешенства на уровне ЦНС с использованием разных доз антител и вакцины.

Опыты в этом направлении проведены на белых мышах. 3.6. Динамика проявления антителоиндуцирующей и протективной активности антирабической вакцины на фоне пассивной иммунизации мышей

Проведено два независимых эксперимента. Примерно через час после пассивной иммунизации осуществляли первую вакцинацию мышей. Затем мышей вакцинировали повторно через 3, 7, 14 и 30 дней. В дни вакцинации от части животных брали сыворотку крови для исследования в РН, и в этот же день, на иммунизированных и контрольных животных проводили титрование вируса бешенства штамм CVS. Результаты выражали в МЕ/мл и индексом защиты.

Результаты опытов, представленные в таблице 8 свидетельствуют, что комплексное применение антирабической сыворотки крупного и антирабической вакцины «Рабикан» сопровождается появлением в крови мышей антител с активностью 2,1-3,2 МЕ/мл, которые сохраняются в течение 3 дней и проявляют способность защищать ЦНС мышей от 200-1000 мышиных интрацеребральных ЛД50 (индексы защиты 2,3-30 lg ЛД50).

Даже через 7 дней сыворотка , крови мышей обладала вируснейтрализующей активностью близкой официально признанному лимиту надежности - 0,5 МЕ/мл и обеспечивала защиту ЦНС мышей от 30-50 ЛД50 вируса бешенства. К 14-му дню антитела практически полностью исчезали из крови мышей, но ЦНС животных все же могла противостоять 6-10 ЛД50 вируса бешенства (индексы защиты 0,8-1,0 lg ЛД50). К 30-му дню активность сыворотки крови мышей повышалась до 0,1-0,12МЕ/мл, а индексы защиты возрастали до 1,2-1,5 lg ЛДзо. Похоже, что к этому времени негативное влияние пассивной иммунизации на развитие поствакцинального иммунитета почти прекращалось и последняя пятая вакцинация обусловила появление в крови

мышей поствакципальпых антител в титрах превосходящих лимит надежности в 7-12 раз, обеспечивающих защиту ЦНС животных от 1000-4000 ЛД50.

Таблица 8

Результаты иммунизации мышей антирабической сывороткой и антирабической вакциной.

Результат вакцинации на (fluxte пассивной иммунизации ммигей в дозах: Результаты иммунизации животных только ваттной

Дни отятия смииротки H Дота 390-400 М1Лг 39-40 МК/кг (контроль)

жггрипсрсбрального заражения жнилтнмх вирусом бешенстла CVS. внкиины В МП/мышь Активность СЫВОрОТКИ кропи мыший R МЕ/мл Индексы защити н [g лд» Активность сыворотки кропи мышей а МЕ/мл Индексы ЭШЦ1ГГЫ В lg лд» Астнаность сыпоротаи кронк мышей в МЕ/мл Индексы запцггы в lg ад»

1 0,15 2,8 2,5 0,35 1,3 0 0,2

0,03 3,2 3,0 0,42 1,5 0 0,1

3 0,15 2,4 2,3 0,25 1,2 0 0

0,03 2,1 2,6 0,30 1,6 0 0,2

7 0,15 0,38 1.5 0,00 0,7 0,48 1,8

0,03 0,60 1,7 0,06 0,9 0,55 2,0

14 0,15 0,05 0,8 0,40 1,6 2,6 2,9

1 0,03 0,00 . .м 0,22 1,4 2,1 2,3

30 0,15 0,10 1,2 1.2 2,0 4,0 3,0

0,03 0,12 1,5 1,7 _У 5,0 3,3

45 0,15 3,5 3,0 4,2 3,5 9,8 3,8

0,03 6,0 3,6 5,6 3,7 12,0 4,5

Из изложенного вытекает, что в случаях безотлагательной необходимости

защиты редких и ценных животных от бешенства представляется возможным применение сухой антирабической сыворотки, получаемой по разработанной нами технологии в комбинации с антирабическими вакцинами, приготовленными из вируса бешенства штамм Щелково — 51. При этом сочетанную пассивную и активную иммунизацию животных можно проводить по схеме рекомендованной ВОЗ, предусматривающей однократную инъекцию антирабических антител и последующую вакцинацию антирабическими вакцинами в 0,3,7,14, 30-й день.

Однако имеющиеся сообщения о случаях заболевания людей, несмотря на своевременное проведение полного курса прививок, указывают на необходимость поиска и апробирование неспецифических препаратов, способных защищать ЦНС от вируса бешенства и не оказывать негативного воздействия на развитие поствакцинального иммунитета(Агуа S.A., 1999; Gacouin A et al, 1999; Wilde H, Et al, 1996).

Результаты проведенной в этом направлении работы изложены в следующей главе настоящей рукописи.

3.7. Перспектива применения нсспсцефичсских противовирусных препаратов для экстренной защиты животных от бешенства.

В последние годы большое внимание уделяется противовирусным эффектам индукторов эндогенных интерферонов, но из потенциальных индукторов лишь единичные оказались пригодными для клинического применения. Среди низкомолекулярных синтетических препаратов это -амиксин, который согласно инструкции по применению, утвержденной Государственным комитетом Минздрава РФ в 1999 году, используют для лечения больных при вирусных гепатитах, энцефаломиелитах, герпесе, гриппе, цитомегаловирусной инфекции.

Наше внимание амиксин привлек своим свойством индуцировать синтез эндогенных интерферонов в мозговой ткани и защищать мышей от 5 - 8 интрацерсбральных ЛД50 вируса бешенства (Романцов М.Г., Ершов Ф.И. с соавт., 1998; Иванов B.C., Самуйленко А.Я. с соавт, 2001).

В клинической практике также широко используется полусинтетический антибиотик рифампицин, активный в отношении микобактерий туберкулеза и лепры, стафилококков, менингококков и др. Была показана возможность его использования для профилактики бешенства людей и животных (Машковский М.Д., 1998; Ковалев H.A. с соавт., 2001).

3.8. Эффективность комбинированного и раздельного применения амиксииа и рифампицина для защиты ЦНС животных от возбудителя бешенства.

В опытах использовали беспородных белых мышей массой 14 - 16 г и препараты амиксин и рифампицин.

Конечную эффективность препаратов определяли на 21 сутки после интрацеребрального заражения мышей вирусом бешенства штамм CVS и выражали ее процентом выживших животных. Схема комбинированного применения препаратов включала в себя подкожное введение 5 мг/кг амиксина и 100 мг/кг рифампицина за 20 ч до инфицирования и через 2 ч после заражения. Затем рифампицин вводили ежедневно в течение 3 суток.

Раздельное введение препаратов осуществляли аналогичным образом.

17

Результаты двух проведенных опытов показали, что амиксии и рифампицин в виде монопрепаратов защищают от гибели 10,5-21 % мышей, в то время как их комбинированное применение обеспечивает выживание от 40% до 50% животных при 100-%-ной гибели их в контрольных группах.

В згой связи, целесообразно было провести исследования, направленные на выявление влияния сочетанного применения амиксина и рифампицина на развитие поствакциналыюго иммунитета и на определение возможности и условий использования этих препаратов в комплексе с антирабической вакциной для экстренного предупреждения поражения ЦНС животных вирусом бешенства.

3.9. Изучение влияния сочетанного применения амиксина и рифампицина на развитие поствакциналыюго иммунитета против бешенства.

Известно, что наиболее выраженный иммунный ответ отмечается при непосредственной вакцинации животных в мозг (Грибенча C.B., Селимов М.А., 1972; Иванов B.C., Самуйленко А.Я. с соавт., 2000).

Представляло практический интерес исследовать влияние амиксина и рифампицина на антителоиндуцирующую активность антирабической вакцины при ее интрацеребральном введении.

Проведены два опыта: в первом - крыс иммунизировали в мозг антирабической вакциной в дозе 0,36МЕ/0,2 мл, во втором - в дозе 0,072МЕ/0,2 мл. Через 1-1,5 ч после этого животным вводили подкожно 5 мг/кг амиксина и 100 мг/кг рифампицина. Через 24-30 ч данные препараты вводили повторно. В контрольных группах животным вводили только вакцину. Через 3, 7, 24 и 80 дней от животных получали пробы сыворотки крови и исследовали их в РН. Результаты опытов представлены в таблице 9.

Приведенные данные свидетельствуют, что амиксин и рифампицин не оказывают негативного влияния на развитие поствакциналыюго иммунитета. Антирабическая вакцина «Рабикан» может индуцировать образование в организме крыс антител заметного уровня, через 72 ч после ее введения в мозг животных.

Таблица 9

Активность антирабической вакцины «Рабикан» при ее введении о мозг крысам линии __«Висгар», на фоне подкожной инокуляции животиым амиксина и рифампицина

№ опыта Доза вакцины, МЕ/0,2 мл Группа животных, иммунизированных вакциной в комбинации с амиксином и рифампицином Группа животных, иммунизированных только вакциной

Вирусиейтрализующая активность антител сыворотки крови крыс (МЕ/мл), полученной после их вакцинации через (дней):

3 7 24 80 3 7 24 Г 80

1 0,36 0,32 2,95 >10 1,7 0,37 2,40 >10 1,55

2 0.072 0,27 1,7 6,2 1,2 0,24 2,05 5,2 1,32

Поэтому целью наших дальнейших исследований были изучение защитных

свойств амиксина и рифампицина в комбинации с антирабической вакциной, введенной в мозг и подкожно, в сравнении с ангирабической сывороткой и ее комбинации с вакциной. Результаты этих экспериментов представлены в таблице 10. Таблица 10

Эффективность комбинированного применения антирабической вакцины, амиксина и рифампицина при иитрацеребралыюм заражении мышей вирусом бешенства

Препараты и методы их применения

Интервал между вякцинациеАи заражением Тсегы эф. Вакцина (в мозг) амнксии + рифампицик (подкожно) ГСамиша (н мозг) Вакцина (подкожно) амккинн + рифампицин (подкожно) Вакцина (подкожно) АС"' (подкожно 45-50 МЕ/кг) вакцина (я мозг) АС"' (подкожно 45-50 МЕ/кг) Кошроль

% ».ж. • 43 0 Г 40 0 50 35 0

Т.а.,МЕ/мл" 0 0 0 0 - - -

2 % в.ж. 41 0 54 0 55 38 0

Т.а., МЕ/мл 0 0 0 0 - - -

3 % в.ж. 46 35 17 5 42 30 0

Т.а., МЕ/мл 0,25 0,22 0,09 0,05 - - -

4 % в.ж. 61 57 25 20 40 25 0

Т.а., МЕ/мл 0,31 0,35 0,1 0,08 - - -

5 У. в.ж. 83 85 42 44 30 14 0

Т.а., МЕ/мл 1,25 1,3 - - - - -

6 % в.ж. 100 100 84 77 - 10 0

Т.а., МЕ/мл 2,3 2,1 - - - - -

7 % в.ж. 100 100 100 100 20 10 0

Т.а., МЕ/мл 3,2 2,8 0,8 1,2 0,09 - -

* - % выживших мышей; ** - Титр антител, МЕ/мд; *+* - Антирабическая сыворотка.

Представленные в таблице 10 данные показывают, что введенная в мозг вакцина начинает проявлять протективную (35%) и антитслоиндуцирующую (0,22 МЕ/мл) активность через 3 дня после вакцинации. Далее эти показатели быстро возрастают и к 5-6 суткам

достигают величии (1,3-2,1 МЕ/мл), обеспечивающих 85-100 %-ную защиту ЦНС животных от 10-15 ЛД50 вируса бешенства. Практически на этом же уровне проявляется и иммупогенность вакцины при се применении с амиксином и рифампицином. Представляется, что испытанный нами способ интрацеребральной вакцинации и последующего подкожного введения амиксина и рифампицина в перспективе может найти практическое применение для защиты ценных и редких животных от бешенства. 3.10 Изучение возможности дистантного воздействия антирабической сыворотки на систему вирус - клетка, с тестированием активности вируса методом прямой иммунофлюоресценции

Подложкой для выращивания инфицированных вирусом бешенства (штамм Щелково-51) клеток ВНК-21 служили пластинки из кварцевого стекла толщиной 0,6 мм, а сосудами культивирования - пластиковые плоскостенные флаконы объемом 50 см3. На одной из стенок флакона вырезалось отверстие диаметром 11 мм. К отверстию герметично с помощью термопластической массы припаивалась кварцевая пластинка. В этих опытах, в качестве ростовой питательной среды применялась смесь сред Игла и 199, содержащая 8-10% коммерческой сыворотки крови крупного рогатого скота. К ростовой среде добавляли клетки ВНК-21 из расчета 2-3x105клеток/мл и 0,001-0,0005 ЛД5о/клетку вируса бешенства штамм Щёлково-51. В каждый сосуд культивирования вносили по 10 мл такой смсси.

Затем флаконы помещали в кюветы, содержащие антирабическую или коммерческую сыворотки крупного рогатого скота с таким расчетом, чтобы сыворотка полностью омывала наружную поверхность флаконов с припаянной пластинкой. Использовалась антирабическая сыворотка крупного рогатого скота с активностью 195±12 МЕ/мл и коммерческая сыворотка крупного рогатого скота, не содержащая антител против вируса бешенства.

Инфицированные клетки культивировали в течение 35-40 ч при 37°С. По

истечению указанного времени стекла - подложки с выросшим на них

монослоем клеток ВНК-21 отделяли от пластика, споласкивали в растворе

Хенкса и затем погружали в охлажденный до -30°С ацетон. После извлечения

20

из ацетона препараты высушивали на воздухе, обрабатывали флюоресцирующим глобулином и помещали во влажную камеру при 37°С на 40 минут. Затем их промывали забуференным физиологическим раствором, высушивали на воздухе и просматривали с помощью люминесцентного микроскопа.

Очаги флюоресценции учитывали по всей поверхности клеточного моиослоя с 4-х кратной повторностыо. Степень дистантного воздействия антител на репродукцию вируса бешенства в мопослое клеток ВНК-21 оценивали по индексам, которые рассчитывали для каждой пары препаратов путем деления количества очагов специфического свечения на подложке омываемой сывороткой, не содержащей антирабических антител, на количество очагов флюоресценции, обнаруженных на подложке, омываемой антирабичсской сывороткой. Индексы, превышающие единицу, свидетельствовали о положительном эффекте воздействия. Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице 11.

Таблица 11

Влияние дистантного воздействия антирабических антител на репродукцию вируса бешенства в культуре клеток ВНК-21, х~±гп

№ опыта Количество очагов (х"±т) флюоресценции в препаратах, омываемых Индекс воздействия

сывороткой, не содержащей антитела против бешенства антирабической сывороткой

1 27 ±2,22 12 ±0,75 2,25

2 32 ± 0,94 11 ± 1,0 .....2,90

3 69 ± 1,27 72 ±1,69 1 0,95

4 38 ± 1,35 21 ±0,79 1,80

5 54 ±2,10 27 ±1,06 2,00

6 47 ±4,10 19 ±0,93 2,47

7 15 ±0,75 7 ±0,43 2,14

8 18 ±0,96 10 ±0,79 1,80

9 12 ±0,75 5 ± 0,43 2,40

10 55 ±2,37 30 ± 1,34 1,83

11 75 ± 1,7 43 ± 1,11 1,74

12 84 ± 1,26 91 ± 0,79 0,92

13 28 ± 0,96 12 ±0,61 2,33

14 18 ±0,55 7 ±0,35 2,57

15 31 ± 1,11 18 ± 0,75 1,72

Полученные нами результаты подтверждают основное положение рассматриваемой гипотезы, предполагающей, что защита ЦНС человека и животных от вируса бешенства осуществляется дистантно антирабическими антителами через стенки кровеносных сосудов мозга. В таком изложении она позволяет дать ответ на вопрос: каким образом осуществляется защита забарбьерного органа (мозга) антителами, которые начинают действовать буквально через несколько часов после их подкожного введения в организм, но которые не проникают и не должны проникать в защищаемый забарьерный орган - ЦНС? Что касается самого биополя антител, то его пока нельзя идентифицировать с каким-либо физическим конкретным полем. Однако признано, что носителем дистантной информации в биологических системах могут быть кванты электромагнитного поля или биофотоны. ( Казначеев В.П. и др., открытие № 122,1973; Popp F.F., 1977).

Показана также возможность регистрации сверхслабого свечения культуры клеток ВНК - 21, инфицированных вирусом бешенства (Пухов В.А., Иванов B.C., г. Владимир, 1976). Не исключено, что в наших опытах такое свечение выполняло роль сигнала для возбуждения биополя антирабических антител, которое и оказывало сдерживающие влияние на репродукцию вируса бешенства в клетках ВНК -21.

4. Выводы

1. Разработана технология получения и применения сухой антирабической сыворотки крупного рогатого скота для экстренной постэкспозиционной защиты ценны и редких животных от вируса бешенства.

2. Антирабическая сыворотка крупного рогатого скота является однородным, высокостабильным вируснейтрализующим препаратом, обладающим выраженной протективиой активностью на уровне ЦНС в первые часы и дни после её подкожного введения животным, в комбинации с антирабической вакциной из вируса бешенства штамм Щелково -51, или без нес.

3. Отрицательным последствием применения антирабической сыворотки

при вакцинации животных по применяемой для людей схеме (0, 3, 7, 14, 30)

22

является «провал» поствакцинального иммунитета на 7-ой или 14-й день, который характеризуется практически полным исчезновением антител из крови животных и многократным снижением резистентности их ЦНС к возбудителю бешенства. Однако, негативное влияние пассивной иммунизации на развитие активного иммунитета преодолевается через 15 дней после 5-й вакцинации.

4. Применение антирабической сыворотки в сочетании с антирабичсской вакциной является важным условием спасения редких и ценных животных от бешенства. Очевидно также, что иммунизацию животных целесообразно проводить по схеме, рекомендуемой ВОЗ для людей, которая предусматривает однократную инъекцию им антител и последующую вакцинацию в О, 3, 7, 14 и 30-й день.

5. Антирабическая вакцина «Рабикан», изготовленная из вируса бешенства штамм «Щелково - 51», начинает защищать ЦНС от вируса бешенства уже через 3-е суток после её введения в этот орган. В течение последующих 2-3-х суток ЦНС животных приобретает практически полную невосприимчивость, по крайней мере, к 10-15 ЛД50 вируса бешенства. Такой способ использования антирабической вакцины, в комплексе с неспецифическими препаратами - амиксином и рифампицином, может найти практическое применение в качестве запасного варианта, когда нет возможности по каким-либо причинам осуществлять экстренную защиту ценных животных от бешенства путем сочетания пассивной и активной иммунизации.

6. Антирабическая сыворотка крови животных может воздействовать на систему вирус - клетка через кварцевую мембрану и снижать накопление антигена вируса бешенства в культуре клеток ВНК - 21. Эти результаты могут служить свидетельством справедливости основного положения известной гипотезы, предполагающей, что защита (невосприимчивость) ЦНС к вирусу бешенства индуцируется дистантным (бесконтактным) воздействием антител на клетки ЦНС и опосредуется энерго - информационным полем

специфических антител, циркулирующих в кровеносных сосудах ЦНС. (Иванов B.C., Самуйленко А.Я., 2001).

5. Практические предложения

1. Экстренную постэкспозиционную защиту ценных и редких животных от бешенства рекомендуется осуществлять но схеме ВОЗ, применяемой для людей, предусматривающей однократную инъекцию антирабического иммуноглобулина в дозе 40 ME/кг и пятикратное введение антирабической вакцины в 0-вой, 3-ий, 7-ой, 14-ый и 30-ый день.

2. В качестве стандартизированного более экономичного и доступного а1ггирабического антителосодержащего препарата для экстренной пассивной иммунизации ценных и редких животных предлагается применять высушенную сыворотку крови крупного рогатого скота, полученную в результате двукратной иммунизации животных антирабической вакциной, содержащей в своем составе инактивированный вирус бешенства штамм Щелково - 51 и сапонин.

3. При отсутствии препаратов, содержащих антирабические антитела, экстренная постэкспозиционная защита животных от бешенства может быть осуществлена путем интрацеребральпого введения им антирабической вакцины «Рабикан», подкожной инокуляции амиксина и рифампицина и последующей вакцинации согласно действующим инструкциям.

6. Список работ, опубликованных но теме диссертации:

1. Иванов И.В., Бронникова В.В., Лебедько Е.И., Елизова H.A.. Эффективность комбинированного применения амиксина и рифампицина при защите ЦНС животных от вируса бешенства. Мат. Международной научно-нрактической конференции, посвящ. 80-летию И.А. Хорькова, Щелково, 2006, 62-64.

2. Иванов B.C., Иванов И.В., Лебедько Е.И.. Применение специфических и неспецифических препаратов при защите центральной нервной системы животных от вируса бешенства. Мат. Международной научно-практической конференции (20-21 декабря 2007 г.) Щелково 2007. Стр. 90-95

3. Лебедько Е.И., Иванов B.C., Иванов И.В., Масимов H.A.. Применение специфических и неспецифических препаратов при защите центральной нервной системы животных от вируса бешенства. - Ветеринарная медицина,- 2008, №2-3-стр. 17-19.

4. Д.А. Салов, И.В. Иванов, B.C. Иванов, Н.М. Пухова, Е.И. Лебедько, ИЛ. Беро. Иммуногенность отечественной низкодозной жидкой антирабической вакцины, «УНИРЭВ» в процессе хранения. Мат. Международной научно-практической конференции, «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов, посвященной 40-летию Всероссийского научно -исследовательского и технологического института биологической промышленности». Щелково, 2009, стр. 175-379.

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Лебедько, Евгений Иванович

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Эпидемиологическое и эпизоотологическое значение бешенства в инфекционной патологии человека и животных.

2.2. Ситуация и особенности бешенства в современном мире.

2.3. Чувствительность животных и человека к бешенству, биологические хозяева, источники и резервуар возбудителя инфекции.

2.4. Характеристика возбудителя.

2.5. Патогенез бешенства.

2.6. Инкубационный период и формы клинического проявления болезни.

2.7. Иммунитет при бешенстве.

2.8. Специфические средства профилактики и методы их применения при экстренной (постэкспозиционной) защите ЦНС животных и человека от внедрения вируса бешенства.

2.9. Неспецифические коммерческие противовирусные препараты и перспективы их использования для защиты животных при бешенстве.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Разработка и совершенствования средств и методов экстренной постэкспозиционной защиты центральной нервной системы животных от вируса бешенства"

Актуальность темы

Бешенство или гидрофобия (Rabies - лат., Lyssa - греч., Tollwut - нем., La Rage - франц., Rabies- англ., La Rabbia- итал.) - древнейшая неизлечимая, нейровирусная болезнь человека и животных, с раневым механизмом передачи вируса от животных к животным и от животных к человеку (Груздев К.Н., Недосеков В.В., 2001; Knobel D.L. et al, 2005).

Ежегодно в мире за антирабической помощью обращается более 12 млн. человек. Более 50 тыс. человек и около 1 млн. животных погибают после укусов бешеными животными. Для более 3 миллиардов людей существует угроза подвергнуться нападению бешеных животных (Rotivel V. Et al, 1998; WHO technical report series, 2004; Бюл. ВОЗ 7.12, 2007).

В РФ ситуация по бешенству также продолжает оставаться напряженной с тенденцией к ухудшению эпизоотической и эпидемиологической обстановки (Бешенство в РФ. Информационный билютень, Москва, 2006; Хисматуллина Н.А. с соавт., 2005; Мовсесянц А.А., 2005).

Защищенность людей от этой смертельной вирусной инфекции во многом определяется частотой случаев бешенства среди животных, живущих рядом с человеком, а защищенность самих животных - от эффективности иммунизации антирабическими вакцинами.

Согласно действующим инструкциям антирабические вакцины, в частности из штамма Щелково-51, применяются не только для профилактической (предэкспозиционной), но и при вынужденной двукратной иммунизации, которую начинают проводить не позднее 48 часов после возможного инфицирования животных. Фактически её осуществляют во время инкубационного периода болезни, продолжительность которого позволяет создавать, при своевременной вакцинации, состояние э невосприимчивости ЦНС к вирусу бешенства до его проникновения в этот орган. Однако, при несвоевременном обращении за помощью, а также при многочисленных укусах опасной локализации существует угроза опережающего продвижения возбудителя болезни к ЦНС и развития последствий, в результате которых жертвы перед гибелью становятся опасными источниками инфекции.

Такая возможность обуславливает необходимость разработки и совершенствования средств и методов экстренной (постэкспозиционной) защиты ЦНС ценных и редких животных от вируса бешенства. Целесообразность проведения исследований в этом направлении признана и экспертами ВОЗ по бешенству. При этом ими отмечается необходимость «разработки недорогих эффективных схем постэкспозиционной вакцинации ценных (домашних и диких) животных, с возможным применением антирабических антител и неспецифических противовирусных препаратов (Комитет экспертов ВОЗ по бешенству; 8 доклад - Женева, 1994).

Актуальным остается вопрос о механизме защиты «забарьерного органа» - ЦНС от вируса бешенства.

Новая гипотеза (Иванов B.C., Самуйленко А.Я., 2001), предполагающая возможность нетрадиционного дистантного воздействия антител и «неких» растворимых факторов, способных проникнуть в забарьерный орган, на клетки ЦНС, многое объясняет, но из-за отсутствия экспериментальных доказательств остается невостребованной. Результаты нашего поиска подходов к решению обозначенных выше актуальных проблем представлены в соответствующих главах настоящей работы.

Цели и задачи исследований

Цель исследований:

1. Разработать и совершенствовать технологию получения и применения специфических средств экстренной защиты ЦНС животных от вируса бешенства;

2. Определить перспективы применения неспецифических противовирусных препаратов для экстренной защиты ЦНС животных от возбудителя бешенства;

3. Провести поиск нетрадиционных и экспериментальных подходов к решению проблемы экстренной защиты ЦНС животных и человека от вируса бешенства.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать доступный рациональный способ получения высокоактивной, стабильной при хранении, стандартизированной антирабической сыворотки;

2. Определить время проявления её протективной активности на уровне ЦНС, при подкожной и внутримышечной инокуляции животным;

3. Определить уровень защиты ЦНС животных от вируса бешенства в зависимости от дозы вводимых им подкожно вируснейтрализующих антител;

4. Изучить влияние сывороточных антирабических антител на развитие поствакцинального иммунитета при двукратной вакцинации животных в зависимости от дозы и времени введения антител;

5. Изучить динамику проявления иммуногенности отечественной антирабической вакцины «Рабикан» в процессе её пятикратной (в 0-ой, 3-ий, 7-ой, 14-ый, 30-ый день) инокуляции белым крысам и мышам, предварительно иммунизированных в 0-вой день антирабической сыворотки;

6. Исследовать эффективность комбинированного и раздельного применения коммерческих неспецифических противовирусных препаратов 7 амиксина и рифампицина для защиты ЦНС животных от возбудителя бешенства;

7. Изучить влияние амиксина и рифампицина на развитие антирабического поствакцинального иммунитета;

8. Исследовать эффективность комбинированного применения неспецифических (амиксина и рифампицина) и специфических (антирабической вакцины) средств при экстренной защите ЦНС животных от вируса бешенства;

9. Исследовать возможность дистантного воздействия антирабической сыворотки на репродукцию вируса бешенства в чувствительных клетках in vitro.

Научная новизна

Впервые, с применением отечественных антирабических вакцин из вируса бешенства шт. «Щелково- 51», разработан эффективный способ получения стабильной при хранении стандартизированной сухой антирабической сыворотки крупного рогато скота, обладающей выраженной вируснейтрализующей in vitro и протективной активностью на уровне ЦНС.

Впервые получены и представлены данные характеризующие динамику проявления позитивных и негативных последствий пассивной иммунизации на развитие поствакцинального иммунитета и защищенность ЦНС животных от вируса бешенства.

Впервые показано, что экстренная защита ЦНС от вируса бешенства может проводиться по схеме, предусматривающей интрацеребральное введение животным отечественной инактивированной антирабической вакцины «Рабикан» и подкожно инокуляцию им комплексных коммерческих неспецифических препаратов - амиксина и рифампицина.

Практическая значимость работы

Разработан доступный экономичный способ получения высокоактивной антирабической сыворотки крови крупного рогатого скота и изготовления из неё стандартизированного стабильного при хранении сухого антителосодержащего антирабического препарата, обладающего выраженной вируснейтрализующей (in vitro) и протективной (in vivo) активностью.

Полученные результаты нашли своё отражение в перечисленных ниже технических документах:

1. Технические условия на референс - сыворотку антирабическую сухую (ТУ 9388-131-00494189, согласованных с заместителем руководителя Россельхознадзора 3 марта 2008 года);

2. Инструкция по изготовлению референс — сыворотки антирабической сухой, утвержденной директором ВНИТИБП 12 ноября 2007 г.;

3. Инструкция по применению референс - сыворотки антирабической сухой, утвержденной заместителем руководителя Россельхознадзора 3 марта 2008 г.

Проведенные исследования позволили также аргументировать целесообразность использования сыворотки крови крупного скота антирабической сухой для экстренной постэкспозиционной защиты ЦНС ценных животных от вируса бешенства и конкретизировать схему применения этого антителосодержащего антирабического препарата в комбинации с антирабическими вакцинами, в частности, изготовленными из вируса бешенства штамм Щелково -51.

Предложенная нами технология позволяет получать сухую антирабическую сыворотку крови крупного рогатого скота, которая является однородным, высокостабильным вируснейтрализующим препаратом, обладающим выраженной протективной активностью на уровне ЦНС в первые часы и дни после её подкожного введения животным в комбинации с антирабической вакциной, изготовленной из вируса бешенства штамм Щелково -51, или без нее.

Экстренную постэкспозиционную иммунизацию животных целесообразно проводить по схеме рекомендованной ВОЗ для людей, предусматривающей однократную инъекцию антител и пятикратное введение антирабической вакцины.

Экстренная защита животных от бешенства может основываться на интрацеребральном введении им антирабической вакцины «Рабикан», подкожной инокуляции амиксина и рифампицина, и последующей вакцинации согласно действующим наставлениям.

Антирабическая сыворотка крови крупного рогатого скота может воздействовать дистантно на накопление антигена вируса бешенства в монослойной культуре клеток ВНК-21.

Основные положения выносимые на защиту

1. Предложенная нами технология позволяет получать сухую антирабическую сыворотку крови крупного рогатого скота, которая является однородным, высокостабильным вируснейтрализующим препаратом, обладающим выраженной протективной активностью на уровне ЦНС в первые часы и дни после её подкожного введения животным в комбинации с антирабической вакциной, изготовленной из вируса бешенства штамм Щелково - 51, или без нее.

2. Экстренную постэкспозиционную иммунизацию животных целесообразно проводить по схеме рекомендованной ВОЗ для людей, предусматривающей однократную инъекцию антител и пятикратное введение антирабической вакцины.

3. Экстренная защита животных от бешенства может основываться на интрацеребральном введении им антирабической вакцины «Рабикан», подкожной инокуляции амиксина и рифампицина, и последующей вакцинации согласно действующим наставлениям.

4. Антирабическая сыворотка крови крупного рогатого скота может воздействовать дистантно на накопление антигена вируса бешенства в монослойной культуре клеток ВНК-21.

Апробация

Основные положения диссертационной работы отражены в итоговых отчетах ГНУ ВНИИТБП за 2006-2009 гг. Материалы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИТБП (2006-2009 гг.) а также на Международной конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» 20-21 декабря 2007 года (Щелково, 2007 г.), на конференции молодых ученых Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина, 17 марта 2008 года (Москва, 2008 г.).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 4 статьи, в том числе 1 -публикация в журнале, рекомендованном ВАК РФ «Ветеринарная медицина» №2 - 3.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 108 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, содержащий 120 источников. Работа иллюстрирована 13-тью таблицами и дополнена приложениями.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Лебедько, Евгений Иванович

5. Выводы

1. Разработана технология получения и применения сухой антирабической сыворотки крупного рогатого скота для экстренной постэкспозиционной защиты ценны и редких животных от вируса бешенства.

2. Антирабическая сыворотка крупного рогатого скота является однородным, высокостабильным вируснейтрализующим препаратом, обладающим выраженной протективной активностью на уровне ЦНС в первые часы и дни после её подкожного введения животным, в комбинации с антирабической вакциной из вируса бешенства штамм Щелково - 51, или без неё.

3. Отрицательным последствием применения антирабической сыворотки при вакцинации животных по применяемой для людей схеме (0, 3, 7, 14, 30) является «провал» поствакцинального иммунитета на 7-ой или 14-й день, который характеризуется практически полным исчезновением антител из крови животных и многократным снижением резистентности их ЦНС к возбудителю бешенства. Однако, негативное влияние пассивной иммунизации на развитие активного иммунитета преодолевается через 15 дней после 5-й вакцинации.

4. Применение антирабической сыворотки в сочетании с антирабической вакциной является важным условием спасения редких и ценных животных от бешенства. Очевидно также, что иммунизацию животных целесообразно проводить по схеме, рекомендуемой ВОЗ для людей, которая предусматривает однократную инъекцию им антител и последующую вакцинацию в 0, 3, 7, 14 и 30-й день.

5. Антирабическая вакцина «Рабикан», изготовленная из вируса бешенства штамм «Щелково - 51», начинает защищать ЦНС от вируса бешенства уже через 3-е суток после её введения в этот орган. В течение последующих 2-3-х суток ЦНС животных приобретает практически полную невосприимчивость, по крайней мере, к 10-15 ЛД5о вируса бешенства. Такой способ использования антирабической вакцины, в комплексе с неспецифическими препаратами - амиксином и рифампицином, может найти практическое применение в качестве запасного варианта, когда нет возможности по каким-либо причинам осуществлять экстренную защиту ценных животных от бешенства путем сочетания пассивной и активной иммунизации.

6. Антирабическая сыворотка крови животных может воздействовать на систему вирус - клетка через кварцевую мембрану и снижать накопление антигена вируса бешенства в культуре клеток ВНК — 21. Эти результаты могут служить свидетельством справедливости основного положения известной гипотезы, предполагающей, что защита (невосприимчивость) ЦНС к вирусу бешенства индуцируется дистантным (бесконтактным) воздействием антител на клетки ЦНС и опосредуется энерго — информационным полем специфических антител, циркулирующих в кровеносных сосудах ЦНС.

6. Практические предложения

1. Экстренную постэкспозиционную защиту ценных и редких животных от бешенства рекомендуется осуществлять по схеме ВОЗ, применяемой для людей, предусматривающей однократную инъекцию лошадиного антирабического иммуноглобулина в дозе 40 МЕ/кг и пятикратное введение антирабической вакцины в 0-вой, 3-ий, 7-ой, 14-ый и 30-ый день.

2. В качестве стандартизированного более экономичного и доступного антирабического антителосодержащего препарата для экстренной пассивной иммунизации ценных и редких животных предлагается применять высушенную сыворотку крови крупного рогатого скота, полученную в результате двукратной иммунизации животных антирабической вакциной, содержащей в своем составе инактивированный вирус бешенства штамм Щелково - 51 и сапонин.

3. При отсутствии препаратов, содержащих антирабические антитела, экстренная постэкспозиционная защита животных от бешенства может быть осуществлена путем интрацеребрального введения им антирабической вакцины «Рабикан», подкожной инокуляции амиксина и рифампицина и последующей вакцинации согласно действующим инструкциям.

4. Полученные нами результаты подтверждают возможность бесконтактного (дистантного) воздействия антирабических антител на репродукцию вируса бешенства в чувствительных клетках, указывают на перспективность исследований, направленных на создание средств, способных изменять, усиливать или, наоборот, гасить излучение биологических объектов. Представляется, что работа в этом направлении может привести к новым практическим решениям, идеям, предложениям в самых разных областях науки.

7. Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Иванов И.В., Бронникова В.В., Лебедько Е.И., Елизова Н.А. Эффективность комбинированного применения амиксина и рифампицина при защите ЦНС животных от вируса бешенства. Мат. Международной научно-практической конференции, посвящ. 80-летию И.А. Хорькова, Щелково, 2006, 62-64.

2. Иванов B.C., Иванов И.В., Лебедько Е.И. Применение специфических и неспецифических препаратов при защите центральной нервной системы животных от вируса бешенства. Мат. Международной научно-практической конференции (20-21 декабря 2007 г.) Щелково 2007. Стр. 90-95

3. Лебедько Е.И., Иванов B.C., Иванов И.В., Масимов Н.А. Применение специфических и неспецифических препаратов при защите центральной нервной системы животных от вируса бешенства. - Ветеринарная медицина.-2008, №2-3-стр. 17-19.

4. Д.А. Салов, И.В. Иванов, B.C. Иванов, Н.М. Пухова, Е.И. Лебедько, ИЛ. Беро. Иммуногенность отечественной низкодозной жидкой антирабической вакцины, «УНИРЭВ» в процессе хранения. Мат. Международной научно-практической конференции, «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов, посвященной 40-летию Всероссийского научно - исследовательского и технологического института биологической промышленности». Щелково, 2009, стр. 175-179.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Лебедько, Евгений Иванович, Щелково

1. Абрамова Т.Я., Абрамов В.В., Кожевников B.C. с соавт. Зависимость иммунологических параметров от неврологической памяти у здоровых людей. Гл. Иммунология, 2000, 2, 50-51.

2. Авилов В.М., В.А. Седов, А.С. Коломыщев, В. А. Ведерников, П.Н. Пытал ев, A.M. Голюкин, Г.В. Хахин. Необходим учет новых особенностей эпизоотологии бешенства. Ветеринария, 1998, №6.

3. Апалкин В.А., Ведеркников В.А., Балдина И.В., Яременко Н.А., Гулюкин A.M. Ветеринария, 2004, 12, 3-7.

4. Бредберн М. Концепция гематоэнцефалического барьера. Москва. Медицина. 1983. 480.

5. Бюллетень ВОЗ №49/50, За 7.12.2007, 82, 425-436

6. Бюллетень ВОЗ о распространении заболевания бешенством в мире. 1996, 4, 20-23.

7. Бюллетень ВОЗ о распространении заболевания бешенством в мире. 1995,4, 19-21.

8. Ведерников В.А., Седов В.А., Ивановский Э.В,. Бешенство животных. Москва, «Колос», 1974, 9-91.

9. Ганнушкина И.В. Иммунологические аспекты травмы и сосудистых поражений головного мозга. Москва. Медицина. 1974, 199.

10. Грибенча С.В., Новицкий Ю.А. Бешенство как экспериментальная модель изучение вопросов нейроиммунологии. Аллергология и иммунологи, 2004, т.5, 1,207-209.

11. Грибенча С.В. Бешенство. Медицинская вирусология. Москва, 2008, 586-593.

12. Грибенча С.В. Современные аспекты биологии и профилактики лиссавирусных инфекций. Дисс. на соискание ученой степени доктора медицинских наук, Москва, 1993.

13. Груздев Л.К., Уласов В.И., Груздев К.Н. Экология вируса бешенства и проблемы контроля заболевания «Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных». Троицк, 2000, 155.

14. Груздев К.Н., Недосеков В.В. Бешенство животных. Москва «Аквариум», 2001, 303.

15. Гурвич А.Г. Теория биологического поля. Москва, 1944, 155.

16. Гурвич А.Г. Понятие «целого» в свете теории биологического поля. Вкн. Работы по митогенезу и теории биологического поля. Москва. 1947, 141147.

17. Гурвич А.Г., Залкина С.Я., Песочинский Б.С. Учение о раковом тушителе. 1947, 100.

18. Гурвич А.Г., Еремеев В.Ф., Корабчевский Ю.А. Энергетические основы митогенетического излучения и его регистрации на фотоэлектронных умножителях. Москва, 1974, 95.

19. Дудел Дж., Рюэгг И., Шмидт Р., Яниг В. Физиология человека. Москва, «Мир», 1985, 250-264.

20. Журавлев А.И., Журавлева А.И. Сверхслабое свечение сыворотки крови и его значение. Москва, 1975, 127.

21. Иванов B.C., Самуйленко А.Я. К вопросу защиты ЦНС от вируса бешенства и её роли в этом процессе. Мат. Международной н.-п. конференции «Нейроинфекции», г. Покров, 2001, с.53-56.

22. Иванов А.В., Хисматуллина Н.А., Юсупов Р.Х., и др. Эпизоотолого-эпидемиологический надзор за бешенством; методическое руководство. Мин-во сельского хозяйства РФ. Казань. 2006.

23. Иванов B.C., Кузнецов П.П., Школьников Е.Э. Состояние и перспективы борьбы с бешенством животных и человека. Ж. Вестник

24. Иванов B.C. К вопросу о механизме защиты ЦНС от вируса бешенства. Тез. доклада междунар. Конференции «Современные проблемы рабиологии». М. Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов. 1988, 22-23.

25. Иванов B.C. К вопросу предэкспозиционной и постэкспозиционной иммунологии животных против бешенства. Докл. Конф. Посвящ. 100 летию открытия вируса ящура. Владимир.1997, 188.

26. Иванов А.В., Хисматуллина Н.А., Юсупов Р.Х., Чернов А.Н. Диагностика и профилактика бешенства животных. Москва. 2007.

27. Иванов B.C., Иванов И.В., Самуйленко А.Я. с соавт. Вакцина антирабическая для животных. (УНИРЭВ). Патент на изобретение № 2366457, 2008.

28. Иванов B.C., Самуйленко А.Я., Кузнецов П.П., Иванов И.В. Перспективы использования индукторов интерферона для повышения эффективности специфических средств экстренной профилактики бешенства.

29. Сб. статей международной научно-практической конференции «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными экзотическими и зооантропонозными болезнями животных», Покров, 2000, 221-224.

30. Информационный бюллетень. Бешенство в РФ в 2000-2005 годах. Москва, 2006.

31. Казначеев В.П., Шурин С.П., Михайлова Л.П. Открытие №122. Дистантные межклеточные взаимодействия в системе двух тканевых культур. Офиц.бюлл. комитета по делам изобретений и открытий при совете Министров СССР. 1973, №19,3.

32. Карпов С.П., Прегер С.М., Синельников Г.Е., Федоров Ю.В. Антирабический гамма-глобулин. КН. Гипериммунные сыворотки. Томск. 1976, 298-309.

33. Колабеков М.И. Бешенство животных в Северо-Кавказском регионе. Вестник ветеринарии, 1998, 4, 19-21.

34. Комитет экспертов ВОЗ по бешенству 8-й доклад. Женева, 1994.

35. Крупальник В.Л., Нагасингхе Сампат. Бешенство животных. Лекция, Москва, 2005, 40.

36. Логинова С.Я., Ковальчук А.В., Борисевич С.В. с соавт. Изучение эффективности амиксина при экспериментальной хантавирусной инфекции. Вопр. Вирус., 2002, №5, 25-29.

37. Малашхия Ю.А., Геладзе М.Г. К иммунологической функции микроглии. Вкн современные проблемы физиологии нервной и мышечной систем. Тбилиси. 1985.

38. Малашхия Ю.А., Ратиани Л.Н., Чейшвили Л.Д. Состояние Т- и В-систем иммунитета в нормальной спинномозговой жидкости у людей различных возрастных групп. М. Невропат. И психиатр, 1978. № 11, 16491652.

39. Малашхия Ю.А. Иммунный барьер мозга. Москва. Медицина. 1986. 155.

40. Марченко И.С. Влияние растений через излучения. Брянск. 1978, 120.

41. Машковский М.Д. Лекарственные средства издание 13-ое, т. 2, Харьков, 1998, 341-342.

42. Медуницын Н.В, Вакцинология, Москва, 1999, 63.

43. Методы лабораторных исследований по бешенству. 3-е издание ВОЗ, 1975, 297-303.

44. Михайлова Л.П., Казначеев В.П., Шурин С.П. Информационная роль сверхслабых световых потоков в биологических системах. Вкн. Вопросы биофизики. Новосибирск, 19667, 25-30.

45. Мовсесянц А.А. Вопросы экстренной профилактики бешенства. Medi.ru «Подробно о лекарствах» Бюллетень вакцинация. Бешенство, №1, (37), январь февраль 2005.

46. Недосеков В.В., Вишняков И.Ф., Груздев К.Н. Изучение влияния антигена на формирование антирабического иммунитета. Мат. Международной научно-практической конференции посвящена 40-летию ВНИИВВиМ. Покров, 1998, 239.

47. Немечек С. Введение в нейробиологию. Прага. Авиценум. 1978, с. 413.

48. Николлс, Джг, Мартин А.Р., Валлас Юж. В., Фукс П.А. От нейрона к мозгу, перевод с 4-го английского издания. Москва, 2003, 670.

49. Носик Н.Н., Косякова Н.П. Противовирусный иммунитет. Кн. Медицинская вирусология, МИА, Москва, 2008, 92-101.

50. Орлякин Б.Г. Противовирусный иммунитет. Труды международной научно-проивод. конференции, посвященной 50-летию ВНИИВВиМ, Покров, 2008, 176-183.

51. Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Роль денатурированных клеток в регуляции иммунного ответа. М. Иммунология. 2002, 5. 313-321.

52. Петров Р.В., Дурянин Р.А., Василенко A.M. с соавт. Эндорфиноподобные свойства костномозгового стимулятора антиридуцентов. Доклад акад. Наук СССР, 1982, т. 265, 2, 501-503.

53. Полюшкина Г.С., Горкунов А.А. эпизоотологическая ситуация по бешенству в Московскойц области и пути её улучшения. Вопросы вирусологии, 1998, 1, 47-48.

54. Пухов В.А., Иванов B.C. О спонтанном сверхслабом свечении культуры клеток ВНК-21/13, инфицированных вирусом бешенства. Мат. 4-ой всесоюзной вирусол. конференции «Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии». Владимир. 1976, ч.2, 152-153.

55. Родни Уиллоби. Излечимо ли бешенство? Ж. В митре науки (08), август 2007, 41-47.

56. Романцов М.Г., Ершов Ф.И., Голубев С.Ю. с соавт. Индукторы интерферона. Ж. Иммунология. 1998, 6, 43.

57. Селимов М.А. Современная эпизоотологическая ситуация и перспективы элиминации бешенства. Вопрос вирусологии. 1998, №5, 195-198.

58. Селимов М.А. «Бешенство», М. Медицина, 1978.

59. Селькова Е.П., Яковлева В.Н., Симененко Т.А. с соавт. Оценка профилактического эффекта амиксина в отношении острых респираторных инфекций. ЖМЭИ, 2001, 3, 42-46.

60. Тайгомбаева B.C. К оценке различных схем иммунизации людей культуральной антирабической вакциной. Актуал. Вопр. Профилактю инфекц. Заболев. Материалы республиканской научно-практической конференции Фрунзе, 1986, 95-100.

61. Тарусов Б.Н., Доскач Л.Е. Энегоинформационный аспект проблемы адаптации и устойчивости биологических систем. Вкн. Сверхслабые свечения в биологии. Москва. 1969.

62. Тарусов Б.Н., Иванов И.И., Петрусевич Ю.М. Сверхслабое свечение биологических систем. Москва, 1967.

63. Тимофеев — Ресовский И.В., Лучник Н.В. О классификации возможных путей воздействия на общий эффект облучения. Труды и-та биологии УФ АН СССР, 1957, 13, 57-69.

64. Федоров Ю.М., Жилина Н.Я., Хадарцев О.С. с соавт. Информационный бюллетень «Бешенство», Москва, 1999.

65. Феннер Ф. Мак-Ослен Б., Миме С., Сэмбрук Д., Уайт Д. Биология вирусов животных, т.2, М.Мир, 1977, 338-339.

66. Хисматуллина Н.А., Чернов А.Н., Юсупов Р.Х., Равилов А.З., Иванов А.В., Зайдуллин М.Ш. Эпизоотологическая ситуация и профилактика бешенства лисиц на территории Татарстана. Ветеринарный врач 2005, №1, 53-58.

67. Хозинский В.В., Сошенко Ю.В. Механизм иммуносепрессивного действия антирабического иммуноглобулина полученного из сыворотки лошадей. Матер. Научной конференции «Современные проблемы рабиологии»., Москва, 1998, 29-30.

68. Хоитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология, Москва, «Медицина», 2000, главы 7-9.

69. Шевелев А.С. Забарьерные органы и проблема иммунологического надзора. Иммунология. 1984, 3, 5-10.

70. Шестопалов A.M., Рассадкин Ю.Н., Аксенов В.И., Устинова Е.Н. Бешенство в Новосибирской области. Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири и Дальнего Востока: Научная конференция. Новосибирск, 1998, 82-83.

71. Шестовалов A.M., Аксенов В.И., Рассадкин Ю.Н., Устинова Е.Н,. Обстановка по рабической инфекции в Новосибирской области. Журнал Микробиология, 199, 5, 115-116.

72. Шестопалов A.M., Кисурина М.И., Груздев К.Н. Бешенство и его распространение в мире. Гл. Вопр. вирус., 2001, 2, 7-12.

73. Штерн JI.C. Гемато энцефалический барьер. М - JI, Биомедгиз, 1935, 544.

74. Arya S.A. Therapeutic failures with rabies vaccine and RIG. Clin. Infect.Dis.-1999 29 - 6.- P. 1605.

75. Bourhy H., Cowley J.A., Larrous F. et al Phylogenetic relationships among rhabdoviruses inferred using the L-palymerase gene. J Gen. Virol. 2005 V86, 28492858.

76. Cawley R., Heaton P.R. Isolation of European bat lissavirus in the U.K// International Rabies Meeting: Abstrcts. Paris, 1997, 403.

77. Cooper N.R., Nemerow G.R., The role of antibodu and complement in the control of viral infections// Invest. Dermatol.-1984, V. 83, 121-127.

78. Deschaux P. // Neuro immunologie: Le systeme immunitaire est-il orrgane sensorial? // Arch. Int. physoil. et biochim., 1988, 96,3, 78-89.

79. Diggelman H., Weissman C. Rifampicin inhibits focus formation in chick fibroblaste infected whis Rousa sarcoma virus. / Nature, London, 1969, 224, 12771279.

80. Finke S., Konzelmann K.K., Replication strategies of rabies virus// Vir. Res., 2005, Vol. 111-P, 120-131.

81. Gacouin A., Bourhy H. et al. Human rabies despite postexposure vaccination. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.-1999, v. 18.- N.3. P. 233.

82. Gribencha S.V., Gribanova L.V., Malkov G.B. et al. population structure of some street rabies virus strains// Arch. Virol., 1989, V 104, 347-350.

83. Jackson A.C., Zhen F.F., Pathogenesis of rabies./ J. Neurovirol- 2005, Vol 11,74-75.

84. Henderson S., Leibnitz G., Turbull M. et al False positive human immunodeficiency virus seroconversion is not incommon following rabies vaccination // Clin. Diagn. Immunol. - 2002, V4, 942-943.

85. Hooper D.G. The rade of immyne responses in the patologenesis of rabies. J. Neurovirol. 2005. Vol. 11, 88-92.

86. Hooper P.T. A new Lyssavirus — the first endemic rabies related virus recognired in Australia// Bull. Just. Pasteur., 1997, V. 95, 4. 2009-2018.

87. Kim I.J., Flano E., Woodland D.L., Blackman M.A.// Antibody- mediated contol of persistent gammaherpesvirus infection// J. Immunol-2002, V.168, 8. 39583964.

88. Knobel D.L. et al. Переоценка бремени бешенства в Африке и Азии. Бюллетень ВОЗ, 2005, 360-368.

89. Krueger R.F., Mayer G.D. Tilorone hydrochloride: an orally active antiviral agent, Science, 169, 1213.

90. Lee B.O., Rangel Moreno J. et al// CD4 T-cell-independent antibody response promotes resolution of primary influenza onfection and helps to prevent reinfection // J. Immunol., 2005, Vol 175, 9, 5827-5838.

91. Leibowitz S., Hughjer R.A. Immunology of the nervous system. London, 1983-p 304.

92. Neri P., Bracci L., Rustici M. et al. Sequence homology between HIV-1 gp 120, rabies virus glucoprotein and snake verom neurotoxine. Is the nicotinic acetylcholine receptor an HIV receptor?// Arch. Virol. -1990-Vol.l90-Vol-l 14-p. 265-269.

93. Popp F. A. Photon Storage in Biologicaal Systems In: Electromagnitis Bio-Information. Proceadisings of the symposium, Marburg, September 5, 1977 -Baltimore, 1979.

94. Renox G., Renox M, Biziere КУ/ Brain neocortex and imuthiol regulate the expression of MHC antigens on mouse T lymphocytes // Immunopharmcol. and Immunotoxicol., 1988, 10№ 2, 219-229.

95. Report of the First WHO Consultation on monoclonal antibodies for rabies diagnosis and reseach, Geneva, 16-18 September, 1982.

96. Report of the Second WHO Consultation on monoclonal antibodies for rabies diagnosis and reseach, Tonbach, 27-28 may 1984.

97. Report of the Third WHO Consultation on monoclonal antibodies for rabies diagnosis and reseach, Paris, 12 June 1985.

98. Report of the Fourth WHO Consultation on monoclonal antibodies for rabies diagnosis and reseach, St Simons Island, GA, 26-28 may 1986.

99. Report of the Tifth. WHO Consultation on monoclonal antibodies for rabies diagnosis and reseach, Geneva, 3 march 1989.

100. Report of the Sixth WHO Consultation on monoclonal antibodies for rabies diagnosis and reseach, Philadelphia, PA, 2-3 April, 1990.

101. Rotivel V, Goudal M, Wirth S. Rabies is a risk for traveling children. Arch. Pediatr. 1998, № 5, 561-567.

102. Selimov M.A., Tatarov A.G., Botvnkin A.D. / Rabies related Yuli virus identification with a panel of monoclonal antibodies // Acta Virol.-1989, 542-545.

103. Sequetin Cunha Elenice M., Lara Maria do Carmo et al// Jsolamento do virus da raiva em Artibens fimbroitus no Estado de San Paulo// Rev. Saude Publica -2005-39, 4, 683-684.

104. Shlyakhov E., Blancou J., Rubinstein E. Vaccines against anthrax in animals, from Louis Pasteur to our day// Rev. Sci Tech 1996- Vol 25, 3, 853-862.

105. Srinivasan A., Burton E.C., Kuehnert M. et al Transmission of rabies from on organ to four transplantant recipient//N. Engl. J. Med, 2005, V. 352 p. 11031111.

106. Suntha-rasamai P., Warrell M., Viravan charisis et al. Purified chick embryo cell regimen for post-exposure prophylaxis.// Epidemiol, and Indefec., 1987, 99, 3, 755-765.

107. Tordo N., Benmansoor A.,. Calisher C. et al. Rhabdoviridae. In: Virus Taxonomy Eight Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses/

108. C.M. Fauguet, М.А. Mayo, J. Maniloff, U. , Desselberger L.A. Ball (eds) Elsevier Academic Press, 2005, 623-644.

109. Tsiand H. Current concepts in rabies// Adv. Virus Res, 1995, V.2.-p.2-3.

110. Veterinary public Health Human rabies in the Americas// Weekly Epidemiol. Rec. WHO, 1995-70, 3, 264-266.

111. Wagner R., Rose S. Rabdoviridae: the viruses and their replication. In. Virology/ B.N. Fields, D.M. Knipe, p.M. Howley (eds). N.Y.: Lippincatt - Raven publ., 1996, 11121-1159.

112. Whitby J.E., Johnstone P., Parsons G. et al/ Ten eyar survey of British basts for the existence of rabies// Veter. Rec. - 1996- Vol. 139, 20,491-493.

113. Wilde H., Sirikawin S. Sabcharoen A. et al. Failure of postexposure treatment of rabies in children. Clin. Infect. Sis.-1996- Vol. 22, p. 228-232.

114. Willoughby R.E., Treves K.S., Hoffman G.M. et al Survival after treatment of rabies with induction of coma// N. Engl. J Med. 2005, Vol. 352, 2508-2410.

115. WHO Expert Consultation on Rabies: first resport. WHO technical report serier.-2004-N 931-18 p.

116. Zinkernagel R.M., La Marre A., Ciurea A. et al// Neutralizing antiviral antibody responses// Abv. Immunol. 2001, Vol. 79, p. 53.1. Инструкция

117. По применению референс-сыворотки антирабической сухой (организация-производитель ВНИТИБП; п. Биокомбинат, Щелковского района1. Московской области)1. Общие сведения.

118. Референс-сыворотка антирабическая сухая.

119. Препарат представляет собой лиофилизированную сыворотку крови крупного рогатого скота, гипериммунизированного инактивированной антирабической вакциной из штамма «Щелково-51». Содержание нейтрализующих антител к вирусу бешенства не ниже ЮМЕ/см3.

120. По внешнему виду референс-сыворотка представляет собой сухую аморфную массу серовато-белого цвета с желтовато-коричневым оттенком легко растворимую в дистиллированной воде.

121. Референс-сыворотка пригодна для применения в течение 5 лет со дня изготовления при условии хранения в сухом, темном помещении при температуре от -20 до -40°С.

122. Восстановленная до исходного объема сыворотка может храниться при -20°С не более года.

123. Флаконы с нарушением целостности, без этикетки, содержащие плесень или посторонние примеси, не разбивающиеся при встряхивании хлопья, с истекшим сроком годности бракуют и утилизируют кипячением в течение 15 мин.1.. Биологические свойства.

124. В реакции нейтрализации (РН) на белых мышах или в культуре клеток определяют и сравнивают конечные разведения испытуемых образцов и референс-сыворотки, обеспечивающие защиту 50% животных от вируса бешенства (KPso)1.I. Порядок применения.

125. Референс-сыворотка предназначена для использования в качестве контроля при определении в сыворотках крови животных специфической активности антирабическихантител в РН в международных единицах.

126. Постановка РН на белых мышах. Подготовка референс-сыворотки.

127. Сухую референс-сыворотку восстанавливают до первоначального объема, указанного на этикетке, стерильной дистиллированной водой, после чего разводят 1:1 ООстерильным физраствором (рН 7,2-7,4). Подготовка испытуемых образцов сыворотки.

128. Испытуемые образцы прогревают в течение 30 минут при 5б°С, а затем охлаждают до 15~20°С.

129. Порядок постановки реакции.

130. КР5о референс-сыворотки и испытуемых образцов рассчитывают по следующей формуле:50. (показатель смертностинепосредственно ниже 50%)lg обратной + г .

131. KPso величины (Показатель (Показатель . х &кРатности' разведенияисходного смертности смертности кразведения непосредственно непосредственновыше 50%) ниже 50%)

132. КР50 антилогарифму полученной величины.

133. Аналогично рассчитывают титр вируса CVS в рабочем разведении, который должен находиться в пределах 30-300 ЛД5о/0,03 см3. Все мыши, инъецированные смесью вируса с разведениями отрицательной контрольной сыворотки должны погибнуть.

134. Специфическую активность сыворотки в международных единицах рассчитывают по формуле:А1. С = ~~ х Y Б

135. А — КР50 испытуемой сыворотки; В КР50 референс-сьшоротки;

136. Y показатель специфической активности референс-сыворотки в международных единицах — МЕ/см3 (указано на этикетке);

137. С показатель специфической активности испытуемой сыворотки в международных единицах — МЕ/см3.

138. Постановка РН в культуре клеток. Реакция нейтрализации проводится в культуре клеток ВНК-21/13 против вируса бешенства штамм CVS-11. Подготовка референс-сыворотки.

139. Восстановленную до исходного объема, указанного на этикетке, стерильной дистиллированной водой референс-сыворотку разводят до активности 0,5 МЕ/см3. Подготовка испытуемых образцов сыворотки.

140. Испытуемые образцы прогревают в течение 30 минут при 56°С, а затем охлаждают до 15-20°С.

141. Порядок постановки реакции.

142. Наблюдение проводят за всей поверхностью каждой лунки. Результат оценивается качественно (плюс или минус): отсутствие флуоресцирующих клеток отрицательная лунка; наличие флуоресцирующих клеток (одна клетка или более) - положительная лунка.

143. Специфическую активность испытуемых сывороток в международных единицах определяют аналогично титрованию на белых мышах.1.. Меры личной профилактики.

144. Реакцию нейтрализации проводят в специализированных лабораториях подготовленные специалисты, вакцинированные против бешенства, с соблюдением техники безопасности.

145. Запрещается прием пищи и воды в помещении, где проводится работа.

146. При попадании компонентов реакции на кожу или слизистые оболочки рекомендуется промыть место контакта большим количеством водопроводной воды с мылом, кожу можно обработать 70% этиловым спиртом.

147. Предметы, контактирующие с вирусом бешенства и зараженными белыми мышами, кипятят в течение 15 минут или дезинфицируют 3% раствором перекиси водорода и моют водой с моющими средствами. Мышей после опыта кремируют.

148. Референс-сыворотку хранят в местах, недоступных для детей.

149. Рекомендовано ФГУ ВГНКИ к регистрации в Российской Федерации. Регистрационный номер ffPjP- У-/, T-JoPjQ1. ОКП 93 8855 СОГЛАСОВАНО:еляпоклонов 200&г.1. Группа Р-31 УТВЕРЖДАЮ:

150. Директор Всероссийского научно-исследоват^янекого-и технологического инся^и^гаЛиологи^еской промьи1. А.Я^Самуйленк : 2007 г.

151. РЕФЕРЕНС-СЫВОРОТКА АНТИРАБИЧЕСКАЯ СУХАЯ

152. ТЕХНИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ ТУ 9388-131-00494i89-051. Срок введения с

153. Без ограничения срока действия1. СОГЛАСОВАНО:

154. Директор ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для^цщотных и кормов»»1. А.Н.Панин1. Ш документеа ;f/.j1. V'XX'V,1. РАЗРАБОТЧИКИ

155. Ведущий научный сотрудник отдела вирусных лекарственных ередств для животных ФГУ ВГНКИ z^py —-— АА.Елаков М ЖЖггууг 4 2007 г.

156. Заведующий отделом противовирусных препаратов ГНУ ВНИТИБП

157. Jj/р у В.С.Иванов «/#у> 2007 г.

158. Ведущий научный сотрудник отдела противовирусных препаратов ГНУ ВНИТИБП

159. Н.М.Пухова «Д МаагуЯс, 2007 г.

160. Аспирант ГНУ* «/Ъ^^Цугуи а,-2007г.1. ИНСТРУКЦИЯ

161. ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮ РЕФЕРЕНС-СЫВОРОТКИ АНТИРАБИЧЕСКОЙ СУХОЙ1. Щелково- 2007 г.