Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и использование люминисцентных методов для экологического мониторинга биосистем

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и использование люминисцентных методов для экологического мониторинга биосистем"

РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ

Экологический факультет

с."}

На правах рукописи

< V У

I

МАРЕНКОВ Вадим Сергеевич

РАЗРАБОТКА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ МЕТОДОВ ДЛЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА БИОСИСТЕМ

03.00.16 — Экология

ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1999

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и на кафедре системной экологии экологического факультета Российского университета дружбы народов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук C.B. Котелевцев, доктор химических наук, профессор В.П. Зволинский

Ведущая организация Институт глобального климата и экологии Росгидромета и РАН

Защита диссертации состоится «_» декабря 1999 г. в 15ÛÛ часов

на заседании диссертационного совета К 053.22.29 в Российском университете дружбы народов по адресу: 113093, г.Москва, Подольское шоссе, д. 8/5, экологический факультет РУДН.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в Научной библиотеке (пом. 4) Российского университета дружбы народов по адресу: 117923, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Диссертация в виде научного доклада разослана «_» ноября

1999 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Для решения проблем охраны окружающей среды и обеспечения устойчивого развития общества необходимо формирование экологического мониторинга. Под понятием «мониторинг» обычно имеют в виду систему наблюдений за состоянием объекта и динамикой происходящих в нем изменений, которые используют для упреждающего прогноза возможных негативных воздействий различных факторов на окружающую среду и человека. Действенность экологического мониторинга определяет эффективность обратной связи: результаты наблюдений необходимо принимать во внимание при оптимизации производственных объектов, режимов их работы, нормировании выбросов, оценке сроков восстановления нарушенных компонентов окружающей природной среды.

При биомониторинге определение степени опасности среды для биоты не требует предварительной идентификации действующих факторов и осуществляется путем наблюдения за поведением отдельных организмов, популяций и биоценозов. Способы наблюдения за живыми системами не должны влиять на их жизнедеятельность. Последю-му условию в большой степени удовлетворяют бесконтактные (дистанционные) люминесцентные методы.

Несколько десятилетий назад, когда начиналась настоящая работа, стало совершенно очевидно, что практическое использование этих методов тормозится недостатком аппаратуры и методических приемов люминесцентного анализа живых систем. Причем для экологических целей была необходима портативная аппаратура, которую можно было бы использовать в условиях близким к полевым.

Одна из принципиальных сложностей конструирования такой аппаратуры состояла в том, что интенсивность люминесценции живых систем in vivo крайне низка. Она составляет 10"п-10"13 лм, что приблизительно сравнимо с излучением свечи, находящейся на расстоянии километра от наблюдателя.

Поэтому целью работы стали разработка и применение люминес-цирующих тест-систем для экологического мониторинга, а также аппаратуры для измерения слабых световых потоков от биологических объектов.

В задачи исследования входили:

1) отработка методов регистрации спонтанной хемилюминесцен-ции биообъектов и способов ее усиления;

2) выяснение информационной значимости динамики откликов биологических объектов, контролируемых люминесцентными методами, на повреждающие воздействия (температура, влажность, засоление, интоксикация и др.);

3) выбор кинетических и других характеристик флуоресценции и замедленной люминесценции для диагностики состояния ассимиляционного аппарата растений.

Научная новизна. На большом биологическом материале в лабораторных и полевых условиях в различных регионах страны исследованы возможности и перспективы применения комплекса люминесцентных методов для экомониторинга. Показано, что по уровню и кинетическим характеристикам флуоресценции и замедленной люминесценции фотосинтетического аппарата растения можно экс-прессно регистрировать ранние стадии отклика растения на нарушение условий существования (температура, водообеспеченность, засоление, инфицирование, токсиканты и др.). Анализ кинетики развития хемилюминесцентной вспышки, индуцированной у клеток КМПО4, позволил зафиксировать конформационные перестройки у белков цитоплазматической мембраны, вызванные солевым и температурными факторами. Совершенствование метода измерения спонтанной хемилюминесценции у растительных организмов и количественного анализа уровня антиоксидантов в тканевых экстрактах по тушению электрохемилюминесценции открыло дополнительные возможности для наблюдения за развитием окислительного стресса в поврежденных тканях. Методом замедленной люминесценции показано, что у воздушно-сухих семян (стандартного тест-объекта для изучения действия электромагнитных излучений, проникающей радиации, гербицидов и др.) можно контролировать возникновение «скрытых» повреждений, а также выделять из популяции семена, наиболее чувствительные к внешним воздействиям.

Практическая значимость работы. Разработан, изготовлен и предложен для практического использования комплекс аппаратуры для надежной регистрации слабых световых потоков от биологических объектов. Апробация предложенной аппаратуры и методов люминесцентного анализа показали, что они могут быть применены для экологическою мониторинга среды с использованием биологических объектов. Надежность разработок удостоверяют 7 авторских свидетельств о способах и устройствах для оценки состояния растительных организмов и токсичности водной среды, а также акты об их внедрении. Рекомендуемые в работе методические приемы гарантируют определение во внешней среде количеств веществ, опасных для жизнедеятельности биоты, и в комплексе с другими методами предсказывать вероятные последствия нарушений экологической обстановки.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на симпозиуме «Сверхслабые свечения в биологии», Москва, 3-6 июня 1969 г.; Национальной конференции Румынии по биофизике, Бухарест, 25-27 мая 1971 г.; семинаре на ВДНХ, Москва, 4-7 марта 1971 г.; IV Международном биофизическом конгрессе, Москва, 7-14 августа 1972 г.; Первом Всесоюзном симпозиуме по биофизике растений, Краснодар, 1974 г.; Всесоюзном совещании по хемилюми-

несценции, Запорожье, 22-25 сентября 1976 г.; Втором Всесоюзном симпозиуме по молекулярной и прикладной биофизике сельскохозяйственных растений, Кишинев, 16-18 ноября 1977 г.; Международной конференции «Вода и ионы в биологических системах», Бухарест, 1980 г.; конференции «МГУ — сельскому хозяйству», Москва, декабрь 1982 г.; симпозиуме «Люминесцентные методы исследования в сельском хозяйстве и перерабатывающей промышленности», Минск, 23-27 сентября 1985 г.; Международной конференции по клинической хемилюминесценции, Берлин, 25-28 апреля 1994 г.; III Межвузовской конференции «Актуальные проблемы экологии», Москва, 10-11 июня 1997 г.

Публикации. Основные результаты исследований опубликованы в 35 печатных работах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Разработка экспресс методов и аппаратуры

В работе рассмотрены некоторые биотест-системы, которые в настоящее время используют для контроля состояния окружающей природной среды. Они основаны на явлении люминесценции живых организмов, а также люминесценции модельных систем. Люминесценция живых объектов может быть спонтанной за счет эндогенных окислительных процессов (хемилюминесценция) или индуцирована внешним облучением.

Флуоресценция хлорофилла in vivo (свечение листьев) известна очень давно (Стоке, 1852). Длительное свечение фотосинтезирующих организмов было зарегистрировано сто лет спустя (Стрелер, Арнольд, 1951). Спонтанное свечение непигментированных тканей растений открыто в 1954 г. (Колли, Факчини), а животных — в 1961 г. (Тарусов, Поливода, Журавлев). Замедленная люминесценция у воздушно-сухих семян — объекта широко используемого в качестве биотеста, была обнаружена в 1980 г. (Веселова и др.). Электрохемилюминесценция (свечение при электролизе неорганических и органических веществ в растворах) была использована в биологических исследованиях для определения антиоксидантов (Клипсон и др., 1965; Кочур, Маренков, 1972).

Люминесцентные методы основаны на взаимодействии света с живыми организмами. Они принадлежат к тем немногим методам, которые позволяют на целых клетках, тканях и органах наблюдать за функциональными изменениями биомембран клеток и процессами их деструкции. Высокая чувствительность и безинерционность люминесцентных методов делает возможным изучение быстрых реакций биосистемы в ответ на изменение внешней среды.

Имеется обширная литература о природе люминесценции живых систем и практическом использовании этого явления (Люминесцентные методы исследования в сельском хозяйстве и перерабатывающей промышленности, Минск, 1985; Комплексные методы контроля качества природной среды. Симпозиум специалистов стран — членов СЭВ, Москва, 1986; обзор В.А. Веселовского и Т.В. Веселовой «Люминесценция растений», 1990 и др.). Знакомство с ней показало, что возможность люминесцентного анализа для решения прикладных проблем реализовалась в недостаточной степени. Удельный вес прикладных работ был заметно ниже, чем чисто исследовательских. Одна из причин — недостаток аппаратуры для люминесцентного анализа и методических разработок.

Сложность конструирования приборов для наблюдения люминесценции состоит в низком уровне световых потоков от биологических объектов, который, например, в случае спонтанного свечения непигментированных тканей составляет 103-104 квантов с см2 в секунду.

Оказалось, что существующее промышленное оборудование с использованием фотоумножителей для регистрации сцинтилляции, вызванных ионизирующими излучениями, мало пригодно для наблюдения люминесценции живых объектов, как из-за конструктивных особенностей, так и самого принципа регистрации сверхслабых световых потоков. Последние, в отличие от сцинтилляции, регистрируются как отдельные кванты, которые на выходе фотоумножителя создают одно-элеюронные импульсы. Сцинтилляции от ионизирующих частиц дают мощные многоэлектронные импульсы, для измерения которых используют менее чувствительные устройства. Промышленные установки для измерения излучения от радиоактивных источников (например, ССД, ССС и другие) не рассчитаны на работы с живыми объектами, испускающих слабые потоки света.

Поэтому в настоящей работе большое внимание было уделено конструированию аппаратуры для регистрации слабой люминесценции от биологических объектов и устройств, позволяющих модифицировать состояние биообъектов непосредственно перед окном фотоумножителя. Была разработана аппаратура для регистрации сверхслабых световых потоков в импульсном режиме (счет единичных квантов).

На рис. 1 представлена блок-схема установки для измерения слабых свечений в кванто-метрическом режиме (Маренков, 1974), предназначенной для измерения спонтанной и возбужденной при электролизе хемилюминесценции. Прибор состоит из высоковольтного стабилизатора для питания фотоумножителя, импульсного усилителя, интегратора, микроамперметра и усилителя постоянного тока для согласования выхода интегратора с низкоомным входом самописца. Для регулирования температуры объекта был разработан специальный электронно-механический блок.

Рис. 1. Блок-схема установки для регистрации спонтанной и возбужденной при электролизе хемилюминесценции:

ВС — высоковольтный стабилизатор, ФЭУ — фотоумножитель, УИ — усилитель импульсов

Для регистрации замедленной люминесценции, которая более интенсивна по сравнению со спонтанной хемилюминесценцией, были разработаны установки, работающие в токовом режиме. Для наблюдения замедленной люминесценции в виде постоянного уровня свечения были созданы модификации механического фосфороскопа Бекке-реля: с одним и двумя вращающимися дисками, а также цилиндрический фосфороскоп. Применение синхронных механических затворов для перекрывания освещения и открывания фотоумножителя помогло уменьшить интервал времени между окончанием освещения и началом регистрации свечения, что позволило наблюдать кривые затухания послесвечения в широком временном диапазоне. Использование фосфороскопов с вращающими секторными дисками или цилиндрами со щелевыми отверстиями позволяло измерять как стационарную интенсивность, так и кривые затухания послесвечения в области КН-Ю"1 с. На рис. 2 приведена блок-схема установки для регистрации короткоживущих компонентов замедленной люминесценции на основе цилиндрического фосфороскопа.

Флуоресценция фотосинтетических объектов на 4-5 порядков более интенсивна по сравнению с замедленной люминесценцией, что позволило разработать установки, где регистрация свечения осуществлялась фотодиодом.

Положительные результаты использования люминесцентных методов для оценки состояния биологических объектов поставили задачу создания портативных приборов, позволяющих работать в полевых условиях. Были использованы как импульсный, так и токовый режимы регистрации свечения. Особое внимание было уделено конструированию камер для объектов и устройств для регулирования температуры объекта (рис. 8, Маренков, 1974).

компонентов послесвечения:

1 — объект, 2 — фотоумножитель, 3 — фосфороскоп, 4 — источник света, 5 — конденсоры, 6 — тепловой фильтр, 7 — светофильтр, 8 — фотозатвор, 9 — лампа ИСШ-1003М, 10 — переключатель, 11 — питание ФЭУ, 12 — усилитель постоянного тока, 13 — самописец, 14 — усилитель переменного тока, 15 — осциллограф, 16 — блок питания лампы, 17 — блок поджига лампы

II. Спонтанная биохемилюминесценция

Растительные непигментированные ткани спонтанно излучают свет в видимой части спектра (400-700 нм) крайне низкой интенсивности. Эмиттеры возбуждаются за счет энергии, выделяемой при эндогенных окислительных процессах (биохемилюминесценция). На основе этого явления были разработаны способы определения устойчивости растений к различным абиотическим и биотическим факторам (Тарусов, Веселовский «Сверхслабые свечения растений и их прикладное значение», 1978). Нами были предложены устройства для измерения сверхслабого свечения (биохемилюминесценции) биологических субстратов (1972 г.; Авт. свидетельства №457892, 1189225). Особенностью этого метода анализа стала возможность проведения опытов на целом растении (проростке), без предварительного механического или химического нарушения его жизнедеятельности.

Исследование температурных зависимостей спонтанной биохемилюминесценции проростков подтвердило положение о связи максимумов свечения (критические точки на термограммах) с устойчивостью растений к высоким и низким температурам и позволило предположить, что один из максимумов при отрицательной температуре обусловлен выделением тепла в момент кристаллизации межклеточной воды (Джанумов, Маренков и др., 1971).

Снятие термограмм свечения оказалось чувствительным приемом, позволяющим обнаружить даже незначительное воздействие на растение. Рис. ЗА демонстрирует изменение температурной зависимости

свечения корней проростков в норме и после обработки парами наркотического агента (этиловый спирт). Снижение термостабильности растительной клетки мы объяснили «разрыхлением» наркотиком ли-пидной фазы ее мембраны (Веселовский, Маренков, 1971).

Б

. ..............

) 200 400 600 800 Время, с

Рис. 3. А. Зависимость уровня спонтанной хемилюминесценции корней гороха от температуры без предварительного воздействия (1) и после 15-минутного экспонирования в парах спирта (2). Б. Спонтанная хемилюминесценция корней гороха при добавлении к ним воды (1) и 2,5% раствора декстрана (осмотический

шок) (2)

Следующий биохемилюминесцентный прием, который нашел практическое применение, был основан на возникновении «вспышки» свечения при повреждении клетки. Вспышка возникала при механическом повреждении, под влиянием солей, неэлектролитов, ионов тяжелых металлов, спиртов, поверхностно-активных веществ и др. Как видно из рис. 3Б свечение резко увеличивается в начале воздействия (секунды), а затем достаточно долго (десятки секунд) затухает.

Изучение спонтанной биохемилюминесценции показало что это явление может быть использовано для установления in vivo момента необратимого разрушения липопротеинового комплекса биомембран. Возрастание свечения (первая фаза реакции) свидетельствовало об альтерации биомембран, сопровождаемой образованием перекиси водорода, ингибированием дыхания и обратимой задержкой роста (Джанумов, Маренков и др., 1971). Ингибирование биохемилюминесценции в присутствии повреждающего фактора свидетельствовало о возникновении необратимых повреждений в клеточных структурах.

В этих исследованиях было использовано созданное нами специальное электронное оборудование, позволяющее проводить линейное изменение температуры объекта и ее контроль.

Были разработаны две схемы регулирования температуры объекта. Первая схема состояла из столика с объектом, через который протека-

ла охлаждающая смесь; при этом одновременно столик мог подогреваться. Соотношение потоков тепло-холод обеспечивало необходимую температуру объекта. Хладагент (этиленгликоль : вода =1:1) охлаждали в резервуаре большого объема при помощи испарителя от бытового холодильника. От контрольного регулирующего термистора на объекте и задающего устройства сигнал разбаланса подавался на усилитель, питающий термоэлемент. В зависимости от величины разбаланса ток через подогревательный элемент изменялся и температура объекта в камере восстанавливалась. Эта система позволяла изменять температуру объекта с разными скоростями в диапазоне от — 30°С до +70°С с точностью ~0,2°С.

Для тех же целей было созданд портативное устройство, в котором в качестве термостолика использовали полупроводниковый холодильник (ТОС-1). Последний позволял линейно изменять температуру объекта от —10°С до +60°С. Величина предельного охлаждения зависела от температуры воды, циркулирующей через столик.

III. Биохемилюминесценция, инициируемая КМ11О4

Уровень спонтанного излучения большинства организмов настолько низок, что его регистрация представляет непростую методическую задачу. Для увеличения интенсивности свечения используют активаторы биохемилюминесценции: в систему вводят вещества с высоким квантовым выходом излучения (люминол и др.) или ускоряют скорость окислительного процесса, например, добавкой в среду перекиси водорода. Последняя взаимодействует с очень многими компонентами клетки и быстро разрушается в присутствии ионов переменной валентности и каталазы. Перекись водорода — неспецифический активатор биохемилюминесценции.

Нами в качестве инициатора биохемилюминесценции был использован другой окислитель — 0,1%-ный водный раствор КМПО4. Было известно, что перманганат при взаимодействии с белками образует комплекс Мп3+ с карбоксильными группами, окислительный распад которых приводит к возникновению возбужденного состояния (Мп2+—белок)* и последующему излучению квантов хемилюминес-ценции в красной области спектра (широкая полоса с максимумом 715 нм) (Лебедев, Цибанова, 1977).

В опытах с суспензией бактерии Escherichia coli нами было показано (Veselovsky, Lebedev, Marenkov, Veselova, 1981), что наблюдаемая кинетика биолюминесценции информирует о проникновении окислителя в клетку (рис. 44). Быстрая вспышка (1\) и медленная фаза (/2) отражают количество доступных для окислителя карбоксильных групп белков, соответственно на внешней и внутренней стороне цитоплаз-матической мембраны. Время достижения максимума медленной фазы зависит от проницаемости мембраны для окислителя. У мертвых кле-

ток медленная фаза отсутствует, так как все карбоксильные группы белков сразу доступны для окислителя из-за нарушения целостности мембраны. Структурные изменения поверхности цитоплазматической мембраны при действии различных факторов изменяют количество доступных для окислителя карбоксильных групп на внешней и внутренней стороне мембраны. Это позволяло регистрировать функциональные и денатурационные переходы в белках, а также кооперативные изменения количества кислых групп белков цитоплазматической мембраны (рис. 4Б), ее проницаемость и термостабильность под влиянием внешних факторов (температура, действие солей, токсикантов и др.).

ч 60

0 ef

| 40 5 а

и U

1 20

с: =

и X О К

и о

Время, с Концентрация NaCl, М

Рис. 4. А. Кинетика КМпС^-индуцированной люминесценции живых (.0 и мертвых (2) бактерий Е. coli. 1\ и Ii — интенсивности биохеми-люминесценции в первом и втором максимуме, соответственно. Б. Влияние возрастающих количеств NaCl на интенсивность био-хемилюминесценции в максимуме /2

Таким образом этот метод позволяет проводить интегральную количественную оценку выживаемости бактерий под влиянием различных обработок и может быть использован как критерий степени очистки воды, например, при ее озонировании или обработке дезинфицирующими веществами.

IV. Электрохемилюминесцентная модель для определения антиоксизантов

Антиоксиданты — вещества контролирующие в клетке уровень свободно-радикальных реакций, играют важнейшую роль в поддержании ее гомеостаза, защищают клетку от окислительного стресса (Бур-лакова, 1968; Козлов, 1973). Последний возникает в ответ на действие неблагоприятных факторов внешней среды различной природы. Как

правило, антиокислительные свойства биосубстратов оценивают по их способности тормозить свободно-радикальные реакции в простых модельных системах (Шляпинтох и др., 1966; Славинский, Петрусевич, 1969; Бурлакова и др., 1971; Агавердиев, 1972 и др).

Нами была предложена электрохимическая модель (Кочур, Ма-ренков, 1972), обладающая высокой чувствительностью к основным липорастворимым антиоксидантам. Электропроводность системы, состоящей из равных объемов ацетона и хлороформа с добавкой 10"3 М малеиновой кислоты, обеспечивала необходимую интенсивность хе-милюминесценции при малых величинах электрического тока.

Хемилюминесценцию, возникающую в результате электролиза модельной смеси, регистрировали с помощью высокочувствительной фотометрической установки. В связи с тем, что незначительные колебания тока в электролитической ячейке вызывали заметные флуктуации интенсивности хемилюминесценции, нами был разработан специальный стабилизатор тока на полупроводниковых триодах, который поддерживал на заданном уровне и плавно регулировал величину тока в диапазоне от 1 мкА до 50 мкА при изменении сопротивления раствора от 0 до 10 Мом. В течение 10 часов работы изменение величины тока не превышало 0,1%. Стабилизатор позволял длительное время поддерживать свечение на постоянном уровне.

Интенсивность хемилюминесценции в системе ацетон—хлороформ—малеиновая кислота в широких пределах была пропорциональна величине протекающего через раствор тока. Введение в электролитическую ячейку антиоксидантов тушило хемилюминесценцию. После израсходования исследуемого антиоксиданта (индукционный период) хемилюминесценция восстанавливалась до исходного уровня. Длительность индукции была пропорциональна концентрации антиоксиданта в системе. На рис. 5А представлена зависимость продолжительности периода индукции от концентрации природного антиоксиданта — а-токоферола. Аналогичные результаты были получены для других антиоксидантов: фенола, резорцина, пропилгаллата, липоевой кислоты, пирогаллола, кризола и др.

На рисунке 5Б показано, что в присутствии окисленного антиоксиданта а-токоферола — а-токоферилхинона, индукционная фаза исчезала. Восстановление а-токоферилхинона в а-токоферол приводило к восстановлению 70-80% исходной антиокислительной активности а-токоферола. а-Токоферилацетат также не проявлял антиокислительных свойств. Метод оказался чувствителен только к веществам, обладающим антиокислительными свойствами.

Изучение антиокислительных свойств а-токоферола этим методом показало, что во фракции общих липидов антиокислительную активность удавалось зарегистрировать при экспериментальном гиперви-таминозе Е у животных (Кочур, Маренков, 1972).

1Л 1

. 0,8 ; о,б

' 0,4

о а о

А

г~ — /— /—

.1 / 4

/

40 80

Время, мин

120

и 1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

у— Б /— /—

1 И'

40 80 Время, мин.

120

О

О

Рис. 5. А. Кинетика электрохемилюминесценции в системе ацетон-хлороформ—малеиновая кислота без а-токоферола (/) и с а-токо-феролом в концентрации 10"6 М (2), Ю-5 М (5) и 10-4 М (4). Сила тока 50 мкА. Б. Изменение продолжительности индукции ингибиро-ванной электрохемилюминесценции при добавлении в электролитическую ячейку Ю-4 М а-токоферола (3), а-токоферилхинона, полученного предварительным окислением 10"4 М а-токоферола (1) и вновь восстановленного из а-токоферилхинона (2)

Этим же методом исследовали физико-химические изменения (уровень радикалообразования, антиокислительную активность) в нерве при проведении возбуждения в различных условиях и при блокировании проведения. Установлено, что метанольные липидные вытяжки из безмякотных нервов крабов обладают антиокислительной активностью и что уровень антиоксидантов в нервах краба, как и в миелини-зированных нервах лягушки повышается при проведении возбуждения. Обнаружена корреляция между изменением этих параметров и интенсивностью работы нерва. Если раздражение наносили на нерв, в котором создавали блок проведения, корреляция нарушалась. Частотная зависимость изменения количеств антиоксидантов в нервах краба носила сложный характер: было выявлено два максимума повышения антиокислительной активности при частотах стимуляции 50 и 100 имп/с (Коссова, Маренков, Колье, 1971).

Приведенные результаты свидетельствовали о возможности использования электрохемилюминесцентного метода для оценки антиокислительной активности компонентов биосистемы и их изменений при действии внешних факторов.

V. Замедленная люминесценция воздушно-сухих семян

Семена растений, как правило, широко используют как тест-объекты для изучения биологического действия факторов разной природы (ионизирующая радиация, электромагнитные и магнитные поля,

лазерное излучение, гербициды и др.). Качество семян (жизнеспособность и всхожесть) обычно определяют прямым проращиванием или используют косвенные биохимические (восстановление тетразола) и физико-химические (утечка электролитов) методы. Косвенные методы достаточно продолжительны и сопряжены с разрушением семян. Кроме того эти приемы могут быть использованы только однократно, а значит, следить за динамикой изменения состояния семени практически невозможно.

Нами был предложен метод экспрессной оценки качества семян, основанный на измерении уровня их замедленной люминесценции (фосфоресценция при комнатной температуре) (Авт. свидетельство № 1047431, 1981). Чувствительность метода столь велика, что позволяет регистрировать свечение от отдельного семени.

Сопоставление замедленной люминесценции воздушно-сухих семян с их всхожестью при естественном и ускоренном старении показало, что одновременно с уменьшением всхожести семян увеличивается интенсивность их фосфоресценции. Когда семя погибало, его свечение вырастало втрое по сравнению со свечением семян со 100%-ной всхожестью.

Наблюдаемое возрастание свечения семян при снижении их всхожести отражает происходящие в нативной структуре семени изменения. Оказалось, что уровень свечения семян, в основном, определяет их влажность. Сильнейшим тушителем фосфоресценции при комнатной температуре воздушно-сухих препаратов является вода. Естественно было предположить, что увеличение свечения поврежденных семян связано со снижением их влажности. Прямые определения влажности показали, что падение всхожести семян коррелирует с уменьшением их влажности, которое обусловлено снижением водо-удерживающей способности биополимеров. Жизнеспособные воздушно-сухие семена содержат 10-12% воды, которая вся находится в связанном состоянии (Аксенов, 1985). Потерявшие всхожесть семена имеют обычно влажность около 6%, то есть переход из жизнеспособного состояния в мертвое сопровождается потерей половины связанной воды. Предложенный нами метод позволял определять изменения влажности не только семян, но и разных биополимеров на такую небольшую величину, как 0,2%. По чувствительности и точности метод превосходит большинство существующих в настоящее время способов определения влажности биопрепаратов.

На рис. 6А показано, как падает уровень свечения семян с увеличением их влажности, а на рис. 6Б рост замедленной люминесценции при потере семенами гороха всхожести под влиянием температурного фактора.

Предложенный нами метод позволил разделить партию воздушно-сухих семян на три фракции: хорошо всхожие сильные семена — 1-я фракция; живые, но ослабленные и не всхожие — 2-я фракция и мертвые — 3-я фракция. Оказалось, что более чувствительными к раз-

личным стимулирующим воздействиям (лазерное облучение, ионизирующая радиация, СВЧ, прогревание и др.) являются ослабленные семена из второй фракции. Именно эти семена целесообразно использовать в качестве тест-объектов. Поэтому при подготовке семян для выяснения уровня загрязнения среды (электромагнитные поля, радиационный фон и др.) из партии воздушно-сухих семян необходимо отбирать фракцию ослабленных семян по уровню замедленной люминесценции. Слабые неповреждающие воздействия обычно улучшают качество ослабленных семян, что выражается в снижении уровня свечения и росте всхожести. Напротив, сильные воздействия убивают семена и уровень их свечения вырастает.

10 12 14 16 18 20 Влажность семян, %

0 20 40 60 80 100 Всхожесть семян, %

Рис. б. А. Соотношение между влажностью и уровнем замедленной люминесценции для семян различных растений (О — горох, х — пшеница, □ — соя, Д — огурцы). Б. Соотношение между всхожестью семян гороха и уровнем их замедленной люминесценции (усредненные кривые, записанные на регистрирующем приборе)

По уровню замедленной люминесценции можно оценивать состояние биообъектов с низкой влажностью, например, лиофильно высушенных культур микроорганизмов (Веселова и др., 1990).

VI. Флуоресценция фотосинтетического аппарата растительных организмов

Флуоресценция пигментного аппарата обусловлена преимущественно хлорофиллом а. Она зависит от активности фотосинтетического аппарата и под влиянием внешних факторов изменяется вместе с фотосинтетической функцией. Поэтому наблюдение за флуоресценцией позволяет характеризовать состояние растительных организмов и по его изменению судить об экологической обстановке окружающей среды.

Для измерения флуоресценции нами был разработан малогабаритный флуориметр (Маренков, 1976) для работы в лабораторных и полевых условиях. В нем возбуждение флуоресценции листьев или суспензии водорослей осуществляли синим светом (светофильтр СЗС-22) через конический световод, в конец которого был вмонтирован фотоприемник флуоресценции — красный светофильтр (КС-18) и фотодиод. Регистрация флуоресценции фотодиодом исключила необходимость высоковольтного стабилизатора напряжения, а использование усилителя с преобразователем типа МДМ позволило довести технические параметры флуориметра до характеристик стандартных лабораторных приборов.

Прибор позволял надежно регистрировать основную характеристику флуоресценции интактных организмов — так называемую индукцию флуоресценции. Если фотосинтетический аппарат находился в темноте, то после включения света необходим некоторый период времени для достижения максимального значения фотосинтетической активности, называемый индукционной фазой. В это время интенсивность флуоресценции изменяется обратно пропорционально уровню фотосинтеза. На рис. 1А показаны типичные индукционные кривые флуоресценции и выделения кислорода листом элодеи. Сразу после включения света, когда уровень фотосинтеза минимален (практически отсутствует выделение кислорода), флуоресценция максимальна. Возрастание скорости выделения кислорода сопровождается снижением уровня флуоресценции. При максимальной скорости выделения кислорода — уровень флуоресценции минимален. В качестве показателя активности фотосинтетического аппарата использовали величину «тушения» флуоресценции во время индукционной фазы (т.е. разность между максимальным уровнем флуоресценции и стационарным уровнем), отнесенную к максимальному уровню флуоресценции — (ФЛМакс ~ ФЛстац)/ФЛмакс- Эта величина тем больше, чем выше интенсивность фотосинтетических процессов.

Для оценки нативного состояния водной экосистемы — водоема определяли активность фотосинтетического аппарата водорослей или водных растений. В качестве тест-объектов использовали зеленые, сине-зеленые, красные водоросли, водные растения или фитообрастания.

Как показано на рис. 7Б, между количеством клеток водорослей и максимальным уровнем флуоресценции существует линейная зависимость. Поэтому отношение разности между максимальным и стационарными уровнями флуоресценции к ее максимальному значению сразу после включения возбуждающего света может служить показателем фотосинтетической активности «средней» клетки.

Для проверки возможностей флуоресцентного метода исследовали влияние различных концентраций токсиканта, например, тетрафени-лоловохлорида (С2Н5)з8пС1 на тест-объекты: элодея, зеленые нитчатые водоросли, фитопланктон и пластины обрастания. Реакция тест-объектов на токсикант была различной. Малая концентрация токсиканта (10"7 мг/л) подавляла фотосинтез на 20% у элодеи и организмов,

растущих на пластинах, а у фитопланктона и зеленых нитчатых водорослей — на 50%. При больших концентрациях (Ю-3 мг/л) реакция тест-систем изменилась. Если у элодеи фотосинтетическая активность была близка к контролю, то у организмов на пластинах обрастания последняя фактически отсутствовала. Эти наблюдения показали, что люминесцентный метод можно использовать для объективного подбора чувствительных биологических тест-объектов и оценки состояния того или иного водоема.

©

80 7 70

л А ■ б и * 65

i i s"— i и

60 • \ / 2 5 о i 60 о

п « 55

40 \ / 4 о о. о 1 50

V/ 3 ч о Ж I 45

20 2 к I40

1 я X о 1 35

0 Л....... 0 X 30

-0,5 0,5 1,5 2,5 3,5 Время, мин.

4,5

1 3 5 7 9 Число клеток, х 10/мл

Рис. 7. А. Изменение уровня флуоресценции (7) и выделения кислорода (2) листом элодеи после включения света — индукционная фаза фотосинтеза. Б. Соотношение между количеством клеток водорослей в суспензии и максимальным уровнем ее флуоресценции

VII. Замедленная люминесценция пигментного аппарата растительных организмов

Замедленная люминесценция (3JI) хлорофилла а отличается от флуоресценции способом возбуждения молекулы пигмента. При флуоресценции возбужденный уровень молекулы заполняется при прямом поглощении квантов света пигментом или миграции энергии от соседних молекул, поглотивших квант, а в случае замедленной люминесценции — за счет энергии, выделяемой в темновых обратных фотохимических реакциях. Замедленную люминесценцию можно регистрировать в широкой временной области от микросекунд до нескольких минут (и даже часов) после прекращения облучения.

Для регистрации замедленной люминесценции высших растений в миллисекундной области нами в 1969 г. была создана стационарная установка на основе однодискового фосфороскопа Беккереля, позволяющая наблюдать различные характеристики свечения (его зависи-

мость от уровня возбуждающего света, кинетику затухания свечения в области от 0,1 мс до нескольких минут, индукционные кривые) в широком диапазоне температур от —20°С до +70°С. Принципиальная схема установки дана на рис. 8 (Маренков, 1974). По такому же принципу были построены портативные полевые установки для регистрации замедленной люминесценции фотосинтезирующих биообъектов.

тированных органов растений:

А. Устройство для регулирования температуры объекта: 1 — компрессор холодильного агрегата, 2 — сосуд с хладагентом (этиленгликоль—вода) и испаритель холодильника, 3 — центробежный насос, 4 — камера объекта, 5 — кремниевый управляемый вентиль, 6 — питание усилителя и нагревателя, 7 — реохорд, 8 — мотор Уорена, 9 — усилитель, 10 — самописец для записи температуры. Б. Схема камеры объекта и фосфороскопа: 1 — вращающийся диск фосфороскопа, 2 — ФЭУ, 3 — лампа накаливания осветителя, 4 — коллиматор, 5— камера объекта со спиралью нагревателя и и-образная трубка для хладагента, <5-7 — крышка камеры с двумя термисторами, 8— самописец

для регистрации ЗЛ

С помощью этих установок были изучены температурные зависимости замедленной люминесценции листьев различных растений (горох, пшеница, хлопчатник, виноград, яблоня, земляника и др.). На термограммах ЗЛ листьев этих растений (рис. 9А и Б) зарегистрирован один максимум в области высоких температур и двойной максимум при низких температурах.

Максимум замедленной люминесценции в области высоких температур связан с термоинактивацией пигментной системы хлоропла-стов (Джанумов, Маренков и др., 1971). Была выяснена причина возникновения двойного максимума замедленной люминесценции при отрицательных температурах. Одновременная запись уровня люминесценции и температуры выявила, что один из низкотемпературных максимумов возникает в момент кратковременного повышения температуры листа при кристаллизации воды в листе (в точке криоскопии).

•с

31 ' 2 1

50 9 8 7 6 45

0 -1

-2 -3

300 200 100 0 100 200 300 Время охлаждения или нагревания, с

Рис. 9. А, Б. Температурная зависимость интенсивности послесвечения листа озимой пшеницы сорта «Ульяновка», выращенной в люминостате (А) и в полевых условиях (январь) (Б):

1 — изменение температуры, 2 — изменение послесвечения

В. Биокинетический интервал жизнеспособности некоторых растений, определенный по методу послесвечения:

1 — традескация, 2— хлопчатник 108-Ф, 3— огурцы «Успех», 4 — горох «Балва», 5— кукуруза «Синтетикум», 6— бобы «Афганские 1779», 7 — люпин «Киевский быстрорастущий», 8— пшеница «Альбидум», 9 — рожь «Вятка Московская»

Другой — низкотемпературный максимум, условно названный «физиологическим», появляется в результате разной температурной зависимости быстрого и медленного компонентов замедленной люминесценции (неодинаковой зависимости от температуры процессов в фотосистеме II) (Джанумов, Маренков и др., 1971).

Наши исследования показали, что термограммы замедленной люминесценции позволяют определить биокинетическую зону различных видов и сортов сельскохозяйственных растений и ее изменение в процессе вегетационного периода под влиянием внешних факторов (обезвоживание, засоление), а также в периоды входа и выхода из состояния покоя. На рис. 9В приведены температурные области жизнедеятельности некоторых растений, определенные этим методом.

На листьях земляники путем регистрации замедленной люминесценции было показано, что на нарастающую засуху растение реагирует двухфазно. Характер ответа зависит как от степени обезвоживания, так и скорости дегидратации тканей растения. Метод позволял наблюдать разницу в реакции отдельных сортов растений на водной дефицит.

Поскольку возбужденные молекулы хлорофилла а генерируются в ходе рекомбинации первичных продуктов фотосинтеза, то этот процесс зависит от различных этапов фотосинтеза. Изменение фотосинтеза водоросли под действием токсикантов, естественно, отражается на уровне замедленной люминесценции и позволяет обнаруживать токсические примеси в воде.

В качестве тест-объекта мы использовали одноклеточные зеленые водоросли (Chlorella vulgaris, 234 и Scenedesmus quadricauda (Тиф) Breb.). Они хорошо изучены, отработаны методы их культивирования. Клетки водорослей обладают хорошей продуктивностью и сохраняют свои свойства в течение ряда лет.

Мы установили, что наиболее целесообразно в таких исследованиях регистрировать короткоживущий компонент свечения со временем жизни в несколько миллисекунд и медленный, затухающий — в десятки секунд. Для наблюдения медленного компонента замедленной люминесценции были использованы два типа установок. В наиболее простой установке закрепленная на подставке кювета с водорослями после освещения механически перемещалась к окну фотоумножителя. Другой вариант установки представлен на рис. 10.

Сама установка состоит из культиватора, представляющего собой стеклянный цилиндрический сосуд с конической нижней частью. По U-образной трубке, находящейся внутри культиватора, циркулирует вода из ультратермостата. Из нижней части культиватора суспензия клеток подается с помощью воздушного насоса во внешний контур с измерительными кюветами и возвращается в культиватор через отверстие в средней его части. Воздух, очищенный ватными фильтрами и простерилизованный облучением в кварцевой трубке бактерицидной лампой БУВ-30, подается в культиватор через воздушный насос и отверстие в нижней части культиватора.

Регистрацию долгоживущих компонентов замедленной люминесценции осуществляли в проточной системе, в которой суспензия водорослей из освещенной камеры перекачивали в темную камеру, расположенную перед фотоумножителем. Регистрацию люминесценции осуществляли через 0,5 с после облучения суспензии.

Рис. 10. Схема установки для исследования замедленной люминесценции синхронной культуры клеток хлореллы:

1— культивационный сосуд, 2— фосфороскоп, 3, 4, 5— проточные кюветы, 6— воздушный насос, 7— обратный холодильник, 8 — сосуд со стерильной средой, 9 — стерильные ватные фильтры, 10 — электромагнитный клапан, 11 — ловушки, 12 — стеклянный смеситель, 13 — блок стерилизации воздуха, 14 — блок управления

Использование установок для регистрации медленного компонента ЗЛ оказалось перспективным для выявления действия гербицидов и других фитотоксических веществ, влияющих на метаболизм водорослей и рост их культур.

Результаты исследования влияния на свечение хлореллы гербицидов, применяемых в сельском хозяйстве, и некоторых близких к ним по химической природе соединений, не обладающих гербицидной активностью приведены в таблице (Маторин, Маренков и др., 1987). В опытах использовали растворы чистых препаратов гербицидов, которые добавляли к суспензии клеток хлореллы. Время одного определения составляет всего несколько минут, а объем исследуемой пробы — не более 1 мл. В таблице приведены значения концентраций гербицидов, снижающих интенсивность замедленной люминесценции клеток хлореллы на 50%. Видно, что неактивные производные триазина и

мочевины в концентрациях ниже 10~3 М не влияют на интенсивность свечения. В то же время активные производные мочевины (диурон, монурон, фенурон и метурин) и триазина (прометрин, атразин, атра-тон, пропазин и симазин), а также препараты других классов (дикрил, 2,4 Д, ДНОК, гексимур, пирамин, рандокс и ратидан) в концентрациях от 10"7 до 10"5 М уменьшают интенсивность свечения вдвое.

Концентрация гербицидов, снижающая интенсивность замедленной флуоресценции на 50%

Препарат Конц-ия, М Препарат Конц-ия, М

Неактивные соединения мочевины 10"3 Пропазин 310"5

Активные гербицидные препараты ю-7 Симазин 210-5

Диурон 5-10-7 Дикрил ю-6

Монурон ю-6 2,4 Д 4-Ю-5

Фенурон ю-5 ДНОК 3-Ю-5

Метурин ю-5 Гексимур 10-5

Триазин 2-Ю"7 Пирамин 10-5

Прометрин ю-6 Рандокс 10-5

Атразин 10-5 Ратидан 2-10-5

Атратон 10-5

Приведенные данные показывают, что метод регистрации замедленной люминесценции хлореллы позволяет определять токсичность большой группы гербицидов. Причем активные производные мочевины и триазина, наиболее широко применяемые в сельском хозяйстве для борьбы с сорняками и устойчивые во внешней среде (в почве они могут сохранятся от нескольких месяцев до нескольких лет), можно выявить в минимальных количествах — от 10"7 до 10"5 М. Это открывает возможность по изменению люминесцентных параметров водоросли в присутствии гербицида определять его остаточные количества и, таким образом, характеризовать устойчивость гербицида к разрушению, контролировать пути его распространения и накопления в различных природных средах (Маторин, Маренков и др., 1987).

Кроме того метод может быть использован для выявления фито-токсических концентраций тяжелых металлов, а также некоторых других загрязнителей (Маренков, 1986, Маренков и др., 1987, 1991). В отличие от химических методов рассматриваемый прием универсален, не требует предварительной идентификации агента и позволяет сделать заключение о степени его опасности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для мониторинга за состоянием окружающей природной среды широко используют тест-организмы. Наблюдение за поведением последних является прямым и объективным способом выяснения опасности загрязнения среды для биообъектов. Биоиндикация — универсальный метод, так как он не требует предварительной идентификации вредного начала. Она основана на определении выживаемости тест-организмов (нахождение среднестатистической характеристики — 50%-ной летальной концентрации ЛК50) или регистрации угнетения у них какой-либо важной физиологической функции (эффективная концентрация, снижающая функцию на 50% — ЭК50). Естественно стремление экологов и токсикологов использовать в своей работе простые, дешевые тест-системы и методы наблюдения за их поведением, не снижая при этом качества исследования.

Настоящая работа была начата более двух десятилетий назад. Нас интересовала возможность применения люминесцентного анализа для контроля за состоянием преимущественно растительных организмов с целью изучения закономерностей их реагирования на изменение окружающей среды. В это время исследования в данном направлении только начинались как в нашей стране, так и за рубежом (обзоры: Та-русов, Веселовский, 1978; Веселовский, Веселова, 1990). Знакомство с публикациями свидетельствовало о том, что возможности люминесцентных методов для решения прикладных задач, в частности, для экомониторинга окружающей среды в нашей стране реализуются плохо. И одна из главных причин — недостаток аппаратуры для люминесцентного анализа и методических разработок для ее использования.

В настоящее время техническая задача в основном решена. И, как мы пытались показать выше, в ее решении есть и наша заслуга. Мы сконструировали и изготовили целый ряд устройств для надежной регистрации слабых световых потоков от живых организмов. Были созданы стационарные приборы и их портативные полевые аналоги для измерения спонтанной и индуцированной хемилюминесценции, флуоресценции и замедленной люминесценции организмов, принятых в качестве тест-объектов для экомониторинга. В конструкции приборов были предусмотрены возможности реализации специфических условий работы с биологическими объектами (непосредственно перед детектором излучений — фотоумножителем — изменять их температуру, влажность, снабжение кислородом, добавлять солевые растворы или токсиканты и др.).

Люминесцентное свечение клеток и тканей информирует о работе определенных звеньев живой системы. В нашу задачу не входило выяснение тех процессов, в результате которых генерируются возбужденные состояния и испускаются кванты света.

Мы преследовали цель по люминесцентной реакции живого тест-объекта на вредный агент диагностировать его состояние и на этом

основании судить об опасности для биоты происходящих во внешней среде изменений. Такой прием называют «функциональной» диагностикой. Его мы сочетали с использованием так называемых дополнительных функциональных нагрузок. С их помощью оказалось возможным выявлять «скрытые» нарушения у испытуемого объекта. Для этого у тест-организма, подвергнутого действию вредного агента, регистрировали термограммы люминесценции (дополнительное действие теплового фактора), а также анализировали переходный процесс активации фотосинтетического аппарата (колебания люминесценции во время лаг-фазы фотосинтеза, так называемые индукционные кривые), сразу после начала его освещения. Быстрый нагрев биообъекта и нахождение «критической» температуры, выше которой свечение тушится, позволял регистрировать такую важную особенность поведения живой системы в экстремальных условиях, как реактивное изменение ее термоустойчивости.

Описанный выше электрохемилюминесцентрый метод определения биоантиоксидантов и последующая его модификация (Даллакян и др., 1975) стали у многих авторов важным инструментом исследования роли антиоксидантов в устойчивости организмов к воздействиям разной природы. Количественное определение антиоксидантов оказалось необходимым для диагностики окислительного стресса на клеточном уровне, который, как выясняется в последние годы, сопровождает многие болезни и процесс старение растений и животных.

Регистрация спонтанной хемилюминесценции — прямой метод наблюдения за развитием в клетках растения и животного окислительного стресса. Уровень свечения информирует о количестве активных форм кислорода, возникающих в ходе метаболических процессов. Особенно важна регистрация первичной вспышки хемилюминесценции в момент взаимодействия вредного агента с клеткой, так как она несет информацию о степени опасности контакта тест-объекта с этим веществом.

Замедленная люминесценция воздушно-сухих семян, как было выяснено, является фосфоресценцией при комнатной температуре (Веселовский, Веселова, 1990). Метод был использован для установления причины стимуляции семян (увеличения всхожести) под влиянием воздействий разной природы (ионизирующая радиация, лазерное излучение, прогревание и др.) в малых дозах. Стимуляция всхожести лучше выражена у партии семян низкого качества. Причиной стимуляции является снижение проницаемости оболочек семени и клеточных мембран для воды, что уменьшает повреждение семени во время его гидратации при проращивании.

Сконструированная и изготовленная нами люминесцентная аппаратура, а также отработанные на кафедре биофизики биологического факультета МГУ методические приемы были многократно испытаны в различных регионах Советского Союза и за рубежом. Испытания проводили на разном биоматериале несколько исследовательских групп в лабораторных и полевых условиях.

В Северо-Кавказском Зональном НИИ садоводства и виноградф-ства мы регистрировали (г. Краснодар, 1972 г.) замедленную люминесценцию листьев винограда (Vitis L.) и земляники (Fragaria L.) во время засухи. Наблюдаемые двухфазные изменения замедленной люминесценции позволили рекомендовать этот метод для оценки засухоустойчивости растений.

В Ташкентском НИИ селекции и семеноводства хлопчатника (1971-1978 гг.) было показано, что по замедленной люминесценции листьев хлопчатника (индукционные и световые кривые, а также термограммы) можно раньше, чем визуальным способом обнаружить заболевания растений вертициллезным и фузариозным вилтом, а также сравнивать растения по вилтоустойчивости.

На высокогорной Памирской биостанции (Сиа-Кух, 2500 м над уровнем моря, Таджикистан, 1986-1991 гг.) исследовали люминесцентные свойства мутантов Arabidopsis thaliana (L) Heynh. В частности, по световым кривым замедленной люминесценции был проведен отбор теневыносливых мутантов. Такие растения необходимы для использования в опытах на космической станции, где экономия энергетических ресурсов — задача первостепенной важности.

Во время экспедиции по Черному морю (1984 г.) с помощью портативного флуориметра было обнаружено отсутствие токсичности для водорослей морской воды, поднятой с глубинных горизонтов 200, 1000 и 2000 м после удаления из нее сероводорода.

На этом же приборе исследовали сбросные воды рисовых чеков в дельте Волги в районе Астрахани (1985 г.), которые содержали в своем составе «сатурн» и другие гербициды, а также смывы с удобряемых полей, расположенных вдоль берегов. Сбросные воды в четырех пунктах, судя по люминесцентной реакции культуры хлореллы, имели разную токсичность. Подавление фотосинтетической активности водорослей составляло 60, 42, 37 и 20% по сравнению с контролем. Согласно руководству по биотестированию, в первом пункте вода была высокотоксичной, в двух других — токсичной, а в последнем — слаботоксичной.

На озере Байкал в районе Целлюлозно-бумажного комбината (ЦБК) при помощи электрохемилюминесцентной установки было обнаружено, что забираемая комбинатом из озера вода содержала много фенолов от собственных сбросов комбината. Последнее могло быть причиной ухудшения качества выпускаемой кордовой целлюлозы.

Пожалуй наиболее тщательную проверку наши методы и приборы прошли в районах, загрязненных нефтепродуктами. Первые испытания прошли на месте катастрофы танкера «Глобе Асими» в порту Клайпеда (лето 1982 г., полгода после аварии). В Куршском заливе исследовали состояние макроводоросли Cladophora sp., а в Балтийском море — фитопланктон на станциях, расположенных в 30-40 км от места разлива мазута. Оценка состояния макроводоросли Cladophora sp. и фитопланктона методом замедленной люминесценции показала, что организмы нормально фотосинтезировали. Этот вывод о состоянии

биоты согласовался с результатом определения концентраций нефтепродуктов в донных отложениях на месте аварии танкера и в прилегающих акваториях. На большинстве станций содержание нефтепродуктов не превышало 0,001%, то есть находилось на уровне фона.

Для сравнения было проверено состояние макроводоросли Clado-phora sp. в районе дока, где место стоянки судов в бухте хронически загрязняется нефтепродуктами и сбросами органической и неорганической природы судостроительного завода. Метод замедленной люминесценции показал крайне плохое состояние популяции водоросли в этом районе, фотосинтез был существенно подавлен и можно было прогнозировать, что большая часть растений в ближайшее время погибнет.

Были проведены исследования в районе старых небольших месторождений нефти, разрабатываемых с прошлого века (Бориславский и Битовский районы, Прикарпатье). Около старых скважин и колодцев с высоким содержанием в почве, воде и атмосфере углеводородов кустарники и травы имели здоровый вид и по фотосинтетической активности не отличались от растений из «чистых» мест.

В Колхидской низменности (Западная Грузия) у выросших в местах сжигания разлившейся нефти злаков (щетиник — Setaria Beauv. и ежовник — Echinochloa Beauv.) фотосинтетическая активность была ниже, чем у тех же злаков на контрольных участках. Зеленые нитчатые макроводоросли Cladophora sp. из дренажного канала, по которому за два месяца до начала опытов стекала нефть из разорвавшегося нефтепровода, имели нормальную фотосинтетическую активность. Анализировали состояние водоросли на 300 м выше стока нефти (контроль) и на 2000 м ниже. Пребывание собранных водорослей в лаборатории (неоптимальные условия: более высокая температура и худшая аэрация из-за отсутствия протока воды) ухудшало их состояние в течение нескольких суток. Водоросли из «грязного» участка теряли фотосинтетическую активность значительно быстрее, чем контрольные. По-видимому, контакт с нефтью все же оставлял в растениях «скрытые» нарушения, которые проявлялись под влиянием неблагоприятных условий (дополнительная функциональная нагрузка).

В зоне южной тайги (Западное Приуралье, Пермская область) определяли фотосинтетическую активность проростков злака костреца безостого (Bromopsis Fourr.), выросших на почвах, загрязненных нефтью за год до опытов. Нефть вносили из расчета 8, 16 и 24 литра на м2. В момент диагностики содержание нефти в почве было в 100, 250 и 500 раз выше, чем на контрольном участке. Семена, высаженные в почву с максимальным содержанием нефти, проросли, но через короткое время проростки погибли. Проростки, выросшие на почве с нефтяной нагрузкой 16 литров на м2, имели приблизительно вдвое меньшую фотосинтетическую активность по сравнению с контролем. В варианте 8 литров на м2 выросли нормально фотосинтезирующие растения. Вероятно в течение года после загрязнения почвы произошло ее самоочищение за счет физико-химических и микробиологических процес-

сов. Скорость самоочищения зависит от многих факторов: типа почв и растительности, состава нефтепродуктов, климатических условий и др. Важно установить пределы загрязнения, выше которого экосистема становится неспособной к самовосстановлению. По нашим данным загрязнение ландшафта нефтью в количестве 16 литров на м2, судя по люминесцентным характеристикам, являлось критическим. Причем непосредственной причиной страдания растений скорее всего были не сами углеводороды нефти, а вызванные ими нарушения физической структуры почвы. Последняя под действием нефтепродуктов превратилась в «лунный» грунт и растения страдали от недостатка влаги.

Полевые наблюдения при помощи люминесцентных методов за поведением растительных организмов в неблагоприятных условиях, позволило сделать нам некоторое обобщающее заключение.

Во-первых, в природных условиях любые люминесцентные характеристики варьируют значительно сильнее, чем в лабораторных опытах. Воспроизводимость данных улучшается, если взятые с поля или водного бассейна образцы подвергать предварительной адаптация в лабораторных условиях.

Во-вторых, период «страдания» растения с летальным исходом в природных условиях, видимо, сравнительно небольшой. Поэтому, когда к испытанию растений приступают через некоторый срок после того, как они подверглись воздействия неблагоприятного фактора, то, как правило, приходиться иметь дело со здоровыми или выздоравливающими образцами. Поврежденные растения уже погибли и исчезли из популяции. Оставшиеся в живых растения, естественно, имеют нормальные функциональные показатели. В этой ситуации для выявления «скрытых» нарушений у испытываемого организма необходимо прибегать к приему дополнительных функциональных нагрузок. Однако это усложняет диагностическую процедуру, а интерпретация результатов не всегда может быть однозначной.

И, наконец, третье. Использование люминесцентных методов, как и любых других приемов функциональной диагностики, по-видимому, наиболее целесообразно в момент контакта тест-объекта с вредным началом или сразу после прекращения его действия. В этом случае велика вероятность констатировать возникновение нарушений в живой системе прежде, чем появятся их видимые морфологические проявления. Видимо такой путь использования люминесцентных методов может принести наибольшую пользу для развития методов экомониторинга.

ВЫВОДЫ

На биологических объектах разной степени сложности исследовали возможность и перспективы применения люминесцентных методов для контроля за функциональным состоянием живых систем и экомониторинга.

1. Разработан, изготовлен и предложен для использования в лабораторных и полевых условиях комплекс аппаратуры для надежной регистрации слабых световых потоков от биологических объектов.

2. Апробация стационарных и портативных приборов для люминесцентного анализа показала, что они могут быть использованы для экологического мониторинга. Биотестирование с использованием люминесцентных приемов дает лучшие результаты, если определения проводят на стандартных объектах. Для выявления «скрытых» повреждений у тест-организмов целесообразно применять дополнительные «функциональные нагрузки».

3. Путем регистрации флуоресценции и замедленной люминесценции фотосинтетического аппарата растений можно экспрессно контролировать ранние стадии отклика растения на изменение внешних условий (температура, водообеспеченность, засоление, инфекция, токсиканты и др.) и на этом основании судить о степени воздействия на организм.

4. Показано, что КМп04-индуцированная хемилюминесцентная реакция биообъектов информирует о функциональных и денатураци-онных перестройках в клеточных мембранах живых клеток. Этот метод может быть использован для характеристики состояния бактериальных культур и оценки степени воздействия на них различных гербицидов.

5. По уровню замедленной люминесценции семян (фосфоресценция при комнатной температуре) можно характеризовать их качество (жизнеспособность и всхожесть) в воздушно-сухом состояния без проращивания, а также выделять из популяции ослабленные (наиболее чувствительные) семена. Последние целесообразно использовать в качестве тест-объектов для исследования биологического действия факторов окружающей среды.

6. Способы регистрации спонтанной биохемилюминесценции и электрохемилюминесцентного определения количества антиоксидан-тов, разработанные в нашей лаборатории, позволяют анализировать развитие клеточного окислительного стресса при повреждениях.

Основные работы по теме диссертации

1. Маренков B.C., Погосян С.И., Веселовский В.А. Техника регистрации сверхслабых световых потоков // Симпозиум «Сверхслабые свечения в биологии»: Тез. докл. — М.: Изд-во Моск. ун-та, 1969. — С. 41-42.

2.ДеевЛ.И., Маренков B.C., Серяков В.Н. Импульсный амперометри-ческий метод определения кислорода в тканях животных // Доклады МОИП за 1969 г. «Общая биология». — М.: Изд-во Моск. ун-та, 1971. — С. 13-15.

Ъ.Джанумов Д.А., Веселовский В. А., Тару сов Б. Н., Маренков B.C., Погосян С.И. Изучение температурной устойчивости растений методами спонтанной и фотоиндуцированной хемилюминесценции // Физиология растений. - 1971. - Т. 18. - Вып. 3. - С. 588-593.

4. Маренное B.C. Приборы и оборудование для экспресс-анализа устойчивости сельскохозяйственных растений // Докл. на семинаре ВДНХ. 4-7 марта 1971 г. - М„ 1971. - С. 2.

5. Веселовский В.А., Маренков В. С. Хемилюминесцентный метод определения прочности биомембран клетки // Национальная конференция по биофизике Румынии. Бухарест, 25-27 мая 1971 г.: Тез. докл. — Бухарест,

1971. - С. 31-32.

6.ДеевЛ.И., Маренков B.C., Соболев А.С. Исследование эритрограмм с помощью автоматической регистрирующей установки // Доклады МОИП за 1970 г. «Общая биология». — М.: Изд-во Моск. ун-та, 1972. — С. 32.

7. Джонумое Д.А., Тарусов Б.Н., Веселовский В. А., Маренков B.C., Пого-сян С.И. Исследование устойчивости растительных организмов хемилюми-несцентным методом // Доклады МОИП за 1970 г. «Общая биология». — М.: Изд-во Моск. ун-та, 1972. — С. 23-24.

8. Коссова Г.В., Маренков B.C., Колье О.Р. Исследование антиокислительной активности липидной фракции нервных волокон травяного краба // Доклады МОИП за 1971 г. «Общая биология». — М.: Изд-во Моск. ун-та,

1972. - С. 58-60.

9. Ко чур Н.А., Маренков B.C. Электрохемилюминесцентный метод определения липорастворимых антиоксидантов // Биоантиокислители в регуляции окислительных процессов в клетке. Тр. МОИП. Т. 39. — М., 1972. — С. 228-230.

10. Маренков B.C. Метод регистрации сверхслабой хемилюминесценции живых клеток // Тез. докл. IV Международного биофизического съезда. Москва, 7-14 августа 1972 г. - М„ 1972. - ЕХХШаЗ/7. - С. 369.

11. Бурлаков а Е.В., Вагин Ю.Е., Козлов Ю.П., Колье О. Р., Коссова Г. В., Маренков B.C., Свердлова Е.А., Федоров Г.Е. О механизме блокирования проведения возбуждения в нерве // Тез. докл. IV Международного биофизического съезда. Москва, 7-14 августа 1972 г. — М., 1972. — ЕХП-ХШаЗ/11. — С. 237-238.

12. А. с. № 457892 с приоритетом от 6 июля 1972 г. Устройство для измерения сверхслабого свечения биологических субстратов / Маренков В. С. и соавторы.

13. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Гриненко В.В., Маренков B.C., Поспелова Ю. С., Фисенко В.Ю. Длительное послесвечение листьев земляники при разных уровнях оводненности // Физиология растений. — 1973. — Т. 20. — Вып. 2. - С. 229-232.

14. Маренков B.C. Особенности конструирования аппаратуры для регистрации сверхслабых световых потоков // Сверхслабые свечения в медицине и сельском хозяйстве. — М.: Изд-во Моск. ун-та, 1974. — С. 162-168.

15. Маренков B.C., Подъяпольский К. Стабилизатор светового потока в ультрафиолетовой области // Материалы Первого Всесоюзного симпозиума «Биофизика растений». — Краснодар, 1974. — С. 229-230.

16. Маренков B.C. Методы и аппаратура для регистрации биохемилю-минесценции // Всесоюзное совещание по хемилюминесценции. Запорожье, 22-25 сентября 1976 г.: Тез. докл. — Запорожье, 1976. — С. 95.

17. Маренков B.C. Отечественные и зарубежные хемилюминометры // Тез. Второго Всесоюзного симпозиума по молекулярной и прикладной биофизике сельскохозяйственных растений. 16-18 ноября 1977 г. — Кишинев, 1977. - С. 23.

18. Маторин Д.Н., Маренков B.C., Добрынин СЛ., Ортеидзе Т.В., Венедиктов П. С. Установка для регистрации замедленной флуоресценции фото-синтезирующих организмов с импульсным режимом освещения // Научные доклады высшей школы. Биологические науки. — 1978. — № 11. — С. 127-130.

19. Веселовский В.А., Лебедев B.C., Маренков B.C., Веселова Т.В. Хеми-люминесцентный анализ индуцированных ионами конформационных изменений белков поверхности бактерий // Вода и ионы в биологических системах: Материалы Международной конференции. — Бухарест, 1980. — С. 174.

20. Veselovsky V.A., Lebedev V.S., Marenkov V.S., Veselova T.V. Chemilumi-nescent probe studies of ion-induced conformational changes of in vivo surface proteins in bacteria // Studia biophysica. — 1981. — Vol. 85. — N 3. — Microfiche 1/51-58. - P. 209-210.

21. A. c. № 1047431 с приоритетом от 13 июля 1981 г. Способ определения влажности семян растений и устройство для его осуществления / Веселовский В.А., Веселова Т.В., Шеберлайн В., Маренков B.C., Рубин А.Б.

22. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Маренков B.C., Рубин A.B., Козырь В.И. Радикалорекомбинационная люминесценция семян растений и пути практического ее использования // МГУ — сельскому хозяйству: Тез. конф. Декабрь 1982 г. — М.: Изд-во Моск. ун-та, 1982. — С. 140-141.

23. А. с. № 1131488 с приоритетом от 31 декабря 1982 г. Способ определения жизнеспособных семян растений / Веселовский ВА., Веселова Т.В., Бочваров П.З., Маренков B.C., Рубин А.Б.

24. А. с. № 1160998 с приоритетом от 31 декабря 1982 г. Способ определения устойчивости свеклы к циркоспорозу / Веселова Т.В., Вышкина Т.В., Веселовский В.А., Маренков B.C., Корниенко A.B.

25. А. с. № 1189225 с приоритетом от 2 января 1984 г. Камера для регистрации сверхслабого свечения биологических субстратов / Медведев В.М., Разумный A.A., Северин Н.Ф., Журавлев А.И., Маренков B.C.

26. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Маренков B.C. Использование замедленной люминесценции семян для оценки их качества // Люминесцентные методы исследования в сельском хозяйстве и перерабатывающей промышленности: Материалы симп. Минск, 23-27 сентября 1985 г. — Минск, 1985. - С. 57-59.

27. Маренков B.C. Фотоумножители // БМЭ. 3-е издание. Том 26. — М.: Изд-во «Советская энциклопедия», 1985. — С. 1218-1219.

28. Маренков B.C. Портативный флуориметр для изучения индукции флуоресценции хлорофилла // Биохемилюминесценция в сельском хозяйстве. - М„ 1986. - С. 14-15.

29. Журавлев А.И., Маренков B.C. Измерение спонтанной непрерывной биохемилюминесценции методом Б.Н. Тарусова // Биохемилюминесценция в сельском хозяйстве. — М., 1986. — С. 5-8.

30. Веселовский В.А., Веселова Т.В., Дмитриева А.Г., Маренков В. С. Биотестирование природных вод при помощи полевого портативного флуори-метра // Методы биоиндикации и биотестирования природных вод. — Л.: Гидрометеоиздат, 1987. — С. 58-63.

31. Маторин Д.Н., Венедиктов П.С., Маренков B.C., Попов И.В. Применение метода регистрации замедленной флуоресценции для биотестирования загрязненности природных вод гербицидами и фитотоксическими веществами // Методы биоиндикации и биотестирования природных вод. — Л.: Гидрометеоиздат, 1987. — С. 18-25.

32. А. с. № 1515105 с приоритетом от 10 ноября 1987 г. Способ оценки токсичности жидкости / Веселовский В.А., Веселова Т.В., Рубин А.Б., Мацкив-ский В.И., Чередников А.В., Хомяков Г.В., Маренков B.C.

33. А. с. № 1659797 с приоритетом от 1 марта 1991 г. Способ определения концентрации хлорофилла и устройство для его осуществления / Маренков B.C. и соавторы.

34. Chukaev S.A., Sergeev P.V., Gukasov V.M., Belykh A.G., Shovkoplyas Yu.A., Marenkov V.S. New chemiluminescent method of prediction of the organism resistance to physical training // Abstracts of International Conference on Clinical Chemiluminescence (ICCC). Berlin, April 25-28 1994. — P-Ell.

35. Маренков B.C., Козлов Ю.П. Разработка и внедрение биохемилюми-несцентных методов в экологии // Актуальные проблемы экологии: Материалы III Межвузовской конференции. Москва, 10-11 июня 1997 г. — М., 1997. - С. 3.

Маренков Вадим Сергеевич (Россия)

Разработка и использование люминесцентных методов для экологического мониторинга биосистем

Разработан, изготовлен и предложен для практического использования комплекс аппаратуры для надежной регистрации слабых световых потоков от биологических объектов. На большом биологическом материале в лабораторных и полевых условиях в различных регионах страны исследованы возможности и перспективы применения люминесцентных методов для экомо-ниторинга. Показано, что рекомендуемые в работе методические приемы гарантируют определение во внешней среде количеств веществ опасных для жизнедеятельности биоты и позволяют предсказывать в комплексе с другими методами вероятные последствия нарушений экологической обстановки.

Marenkov Vadim Scrgejevich (Russia)

Development and use of the luminescent methods for ecological monitoring of biosystems

The complex of instrumentation for reliable recording of weak luminous fluxes from biological objects is designed, made and offered for practical use. The capabilities and prospects of application of luminescent methods for ecomonitoring are explored on large amount of the biological material in laboratory and field requirements in various regions of the country. It was shown that the methodical receptions, advisable in these researches, guarantee definition in exterior medium of amounts of substances dangerous to vital activity of living organisms and allow to predict in a complex with other methods the probable consequences of ecological situation disturbances.