Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка биотехнологических методов в роде Cucumis и анализ полученных форм растений

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка биотехнологических методов в роде Cucumis и анализ полученных форм растений"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інсиітуг клітинної біології та генетичної інженерії

На правах рукопису УДК 577.21+573.6+582.982

Калина Марія Петрівна

РОЗРОБКА БЮТЕХНОЛОПЧНИХ МЕТОДІВ У РОДІ СисиШБ ТА АНАЛІЗ ОТРИМАНИХ ФОРМ РОСЛИН

03.00.25 - "клітинна біологія"

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуті я наукового ступеня кандидата біологічних наук

КиТп - 1996

Роботу виконано у відділі клітинної селекції Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України.

Науковий керівник -

член-кореспондент НАН України та УААН, доктор біологічних наук Сидоров Володимир Анатолієвич

Офіційні опоненти

доктор біологічних наук, професор

Кунах Шктор Анатолиевич

кандидат біологічних наук Погребняк ІІаталія Яківна

Провідна організація - Інститут фізіології рослин та ' генетики НАН України

Захист відбудеться 'іл.оЛ _ 1996 року

год. на засіданні спеціалізованої ради Д.01.19.01 клітинної біології та генетичної інженерії НАН України- за адресою: 252143, Кнїп-143, вул. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України.

Автореферат розіслано _ 199С р.

Вчений секретар спеціалізованої ради,

кандидат біологічних наук І/і Л.ІІ.Малишсва

///ІД/'

Інституту

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ііа протязі всієї історії людство постійно хвилювала проблема виробництва необхідних для життя продуктів харчування. За допомогою селекційних методів вдалося створити сорти рослин, які відповідають умовам навколишнього середовища, мають підвищену якість та врожайність.

Рід Cucumis належить до родини гарбузових і нараховує близько 40 видів. Незважаючи на те, що основні культивовані види цього роду огірок посівшій (Cucumis sativus L.) та диня (Cucumis meló L.) не мають такого важливого значення як зернові або бобові, вони відіграють значну роль в сільському господарстві і здобули поширення в тропічних, субтропічних та помірних зонах обох півкуль. У роді Cucumis можна виділити чотири перехресно-стерильні групи, при чому огірок посівшій с статево-несумісним із більшістю нидів даного роду. Генетичний потенціал диких та малокультивованих видів цього роду включає стійкість до багатьох захворювань і шкідників, до несприятливих умов навколишнього середовища. Але, в цілому, значна кількість важливих агрономічних ознак залишається нереалізованою через статеву несумісність. Використання біотехішлоіічиих методів, таких як соматична гібридизація, генетична трансформація, а також явища сомаклональної мінливості могло б привести до значного розширення можливостей традиційної селекції.

Конструювання рослин за допомогою біотехнологічннх методів перш за все вимагає регенерації рослин in vitro. Сьогодні, загдяки технології культури тканин і клітин стало можливим регенерувати in vitro сотні видів рослин, проте для представників роду Cucumis надійної регенераційної системи не розроблено. Частота регенерації рослин дині та огірка як з протопластів, так і з експлантатів різних

органів не дозволяє ефективно використовувати ці види у дослідах по генетичній трансформації та соматичній гібридизації. Багатьма авторами було показано, що генетичні фактори в роді Cucumis відіграють вирішальну роль в компетентності до регенерації і що здебільшого генотип визначає ступінь успіху в отриманні регенерантів. Тому, надзвичайно важливим завданням постає вміння, маніпулюючи екзогенними факторами добитися реалізації всього морфогенетичного потенціалу, що закладений в рослинах даного роду, створити високоефективну систему регенерації і, як наслідок, генетичної трансформації та соматичної гібридизації.

Мста та заплання роботи. Мптою даної роботи була розробка біотехнологічних методів в роді Cucumis та аналіз отриманих форм рослин.

До конкретних завдань роботи входило:

1. Розробити методики виділення, культивування і регенерації рослин із протопластів огірка посівного. ■

2. Розробити методики регенерації рослин із експлантатів дині.

3. Провести гістологічний аналіз процесу регенерації та цитогенетичннй аналіз регенерантів дині.

4. Отримати на основі розроблених методик рослини дині, трансформовані за допомогою Agrobacterium tumefaciens.

5. Провести аналіз відібраних трансформантів для доказу їх

трансгенної природи. .

Наукова новизна. Розроблено високоефективну методику виділення, культивування і регенерації рослин із мєзофільних протопластів огірка. Вперше отримано калусні лінії та органогенез із протопластів пелюсток огірка.

Розроблено високоефективну методику регенерації рослин для різних за своїм морфогснегичним потенціалом генотипів дииі.

Вперше отримано трансгснні рослини дині, що містять

нослідоішість гену бета-глюкоронідази з рослииішм ііітроном Р1У2.

Практична цінність. Створені нами методики »»ділення протопласті і) огірка та регенерації рослин можуть никориетонунаїися для отримання соматичних гібридів і трансгешшх рослин з цінними сільськогосподарськими ознаками (стійкість до вірусних та грибних інфекцій, комах, несприятливих умов навколишнього середовища).

Розроблена нами методика виділення та культивування протопластів із пелюсток огірка може бути використана для дослідження біогенезу хлоропластів та хромонластів, а також відкриває нові можливості для вивчення процесів, що приводять до реалізації тотипотентності клітини.

На основі розробленої нами системи регенерації рослин із сім'ядольних експлантатів різних генотипів дині буде проводитись генеіични трансформація дині для отримання рослин із важливими сільськогосподарськими ознаками. Ця методика дозволяє також отримувати і (.-триплоїди дині, які характеризуються підвищеною якістю плодів. '

Отримані результат по відновленню експресії трансгенів шляхом їх демепі./юклішя 7а по експресії ієну бега-глкжоронідази, що містить іптроіїну послідовність, можуть бути використані для вивчення явища "мовчання" ¡(продукованих генів та для більш ефективного отримання трансі енних рослин із стабільною експресією.

Основні положення, які внносяться на захист:

1. Розроблена методика виділення і культивування протопластів огірка посівного дає можливість з високою ефективністю отримувати морфологічно нормальні регенеранти.

2. Методи культури тканин in vitro дозволяють із високою частотою регенерувати рослини із сім'ядольних експлантатів дині, різних за своїм морфогенетичним потенціалом генотипів.

3. Розроблена методика регенерації дає можливість ефективно використовувати в генетичній трансформації за допомогою A.tumefaciens генотипи дині, які значно відрізняються за регнеранійною здатністю.

Апробація роботи. Результати роботи були представлені на II Міжнародному симпозіумі "Напрямки в біотехнології рослин" (Москва, 1993), на IV Евронсйському Конгресі з клітинної біології (Прага, Чехія, 1994), на Міжнародному симпозіумі по генетичній інженерії та біотехнології рослин (Київ, 1994), на Кейстоунському симпозіумі по молекулярній та клітинній біології (Хілтон Хед Айленд, США, 1995), на "Plant Genome IV" (Сан Дієго, США, 1996) та на наукових семінарах відділу клітинної селекції Інституту клітинної біології та генетичної інженерії ПАН України.

Публікації. Основні результати дисертації відображені в 8 друкованих працях, список яких наводиться в кінці автореферату.

Структура та об'єм роботи. Дисертація включає в себе вступ, огляд літератури, матеріали та методи, результати, обговорення, висновки та список літератури, що містить 206 бібліографічних посилань, з яких 201 іноземні. Роботу викладено на 148 сторінках машинописного тексту, серед яких 24 малюнки і 6 таблиць.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Насіння огірків Cucumis sativus L. (інбредна лінія 294 партенокарпного огірка, створена Н.В.Конаревою в Інституті овочівництва та баштанництва УААН) стерилізували в 15%-ному розчині гіпохлориту натрію з наступним триразовим відмиванням в стерильній дистильованій поді. Рослини вирощували нри 25-26® С, освітленості 4-5 клк та 16-годшшому фотоперіоді на середовищі, яке містило солі Мурасіге та Скуга (1962), вітаміни по Морелю (1951), 2% цукрози та 0.7% агару. Насіння дині (Cucumis melo L., сорт Крипнчанка, люб'язно наданий тим же Інститутом, та сорти Галія і Пандор, фірма "Нунхемс-Заден", Нідерланди) стерилізували та пророщували за тих же умои.

Мезофільиі протопласти огірка ішділялн за допомогою ферментної суміші, що містила 0,6% целюлази, 0,2% целюлізину,

0,15% драііселази та 0,6% мацеро.інму, за стандартною методикою (Сидоров та ін. 1985), модифікованою відповідно умов експерименту. Протопласти культивували у модифікованому середовищі КЛ (Nagy, Malina, 1976), яке містило 3 мг/л ЮК та і мг/л Н А11 в темноті при 26^ С. Через 4 тижні мінікодоиії переносили на модифіковане агаризонане середовище MC, доповнене

0,5 мг/л 2,4-Д і t мг/л 2іІІ і культивували або при тих же умовах, або на світлі при 26^ С. Для індукції ембріогенезу протоклони переносили на середовище MC, доповнене 2,5 мг/л 2,4-Д і 1-4 мг/л кінетину. і вирощували 4 тижні на світлі. Регенеранти отримували на безіормопа.тьному середовищі MC із вітамінами Мореля. .

Ферментна суміш для виділення протопластіп із пелюсток огірка складалася з 0,4% целюлази, 0,(5% целюлізниу та 0,4% мацерозиму. Культивування протопластіп проводили за ішіт'оипсапою методикою.

Z-b-UW ■

Для злиття протопластів використовували мезофільні протопласти огірка та сім'ядольні протопласти дині. . Останні виділяли за допомогою ферментної суміші, що містила 0,5% целюлізину та 1,25% пектинази. Перед злиттям протопласти огірка інактивували 10 мМ розчином йодоацетату на протязі 20 хвилин при 4® С. Протопласти дині опромінювали дозою 1000 Гр (9 Грхв'1 мСо). Злиття протопластів проводили за методикою, описаною раніше (Мепсгеї в/., 1981). Культивування проводили в умовах, описаних вище для мезофільних протопластів огірка.

Для дослідів по регенерації рослин дшіі насіння після стерилізації звільняли від насінниу оболонок, видаляли зародок і використовували сім'ядольні експлантати розміром приблизно 2x3 мм. Експлантати культивували на середовищі МС, доповненому БАП (1 мг/л), АБК (0, 0,3 мг/л), ЮК (0, 0,1, 0,3, 0,85 мг/л) та проліном (0 або 10 мМ), при 25-26^ С, освітленості 2 клк і 16-годишюму фотоперіоді. Утворені нагони вкорінювали на безгормональному середовищі МС при оснітленності 4-5 клк.

При статистичній обробці експериментальних даних використовували стандартні методики обробки результатів (Лакин, 1990).

Гістологічний аналіз процесу регенерації у дині проводили за методикою, описаною раніше (Паушева, 1974). '

' Цнтогенетичний аналіз регенерантів дині проводили на давлених препаратах кінчиків корінців, фіксованих в оцтовому алкоголі (3:1) та пофарбованих в 1%-иому розчині оцтового орсеїпу (Паушева, 1974).

Генетичну трансформацію дині проводили за допомогою штаму ЛдгпЬасІегіит Іитс[асіспз ІЛІА4404. Використовували плазміду рШ121 (^^топ еЬ аі., 1986), що містить гени нсоміцнп фосфотрансферази II та бета-глкжуронідази, і плазміду рЗЗБОиБШТ

(Vancanneyt et at., 1990), яка містить ген nptll га ген бета-глюкуроиідази з рослинним інтроном PIV2. Всі бактерії вирощували на середовищі LB (Маниатис и др., 1984) з додаванням селективної концентрації антибіотиків.

Генетичну трансформацію дині проводили шляхом кокультивування сім'ядольних експлантатів ' з нічною культурою A.tumefaciens. Селекцію трансформации вели на середовищах, які містили 150 мг/л канаміцинсульфату для сортів Пандор та Кршшчанка і 200 мг/л для сорту Галія.

Аналіз трансформантів за допомогою тесту на GUS-активність проводили за прийнятою методикою (Jefferson et al., 1987). Обробку трансформантів деметилюючим агентом 5'-азацитидіном проводили при використанні концентрацій 10, ЗО, 60 і 100 мкМ у селективному середовищі.

Сумарну рослинну ДНК виділяли за прийнятою методикою (Murray .Thompson, 1980), Блотинг-гібридизацію за Саузерном проводили на нейлонових фільтрах по методиці Чача та Гілберта (1984).

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

1. Виділення та культивування протопластів огірка та регенерація з них рослин. .

Протопласти.пнділяли із листя постійно культивованих in vitro рослин огірка лінії 294. Вихід мезофільних протопластів огірка становив 1-5х106 протопластів на 1 г листя. Густина висіву протопластів критично впливала на ініціацію першого поділу та на ефективність утворення колоній. При густині висіву 0.5x10^ протопластів/мл перші поділи спостерігалися на 5-6 день. Ефективність висіву становила 23,0+2,1%. За даними Коліїн-Хойманс (1988) культивування в агарозних дисках дозволяє досягти значно кращих результатів, ніж при культивуванні у рідкому середовищі (ефективність висіву становила 33-42% проти 2%, відповідно), проте частота регенерації була надзвичайно низькою. В наших дослідах культивування протопластів в твердому середовищі вело до утворення колоній, не здатних до регенерації, тому ми користувались рідким середовищем.

Вирощування утворених мініколоній на середовищі, яке містить 0,5 мг/л 2,4-Д та 1 мг/л 2іІ1, в темноті створювало передумови для успішної регенерації рослин. Утворення ембріоїдів відбувалося при переносі калусів на середовище МС, доповнене 2,5 мг/л 2,4-Д та 4 мг/л кінетику. Регенерація починалася через 2-8 тижнів після переносу клонів на безгормональне середовище і становила близько 50%, що значно перевищує опубліковані раніше результати (Trulson, Shahin, 1986; Punja et al., 1990; Garsia-Sogo ct al., 1992). Більшість отриманих регенерантів морфологічно не відрізнялася під рослин, вирощених з насіння. Вони мали добре розвинену коренену систему і були здатні до цвітіння in vitro.

Необхідно зазначити дна суттених моменти для успішної регенерації рослин із протопластіи огірка посінпот. По-перше, потрібно зиест до необхідного мінімуму іпірошунакпя культур на гормональних середоііиіцах. Критичним моментом для переносу на безгормоналі.ііе середошіще бу» початок упюрення жоигих осередків на блідожонтому або білому желатиноподібному ка.іусі. При цьому иаж.ішю переноси і и кожен протоклоп іпдинідуальпо по мірі досягнення ним цісї стадії. По-друге, щоб уникнути супресії розпитку ііпннх нагонін, необхідно своєчасно підсаджувати найбільш розітнені рослинки.

За таких умов розроблена нами методика дозволяє через 3-4 місяці після ниділепня протопласті!] отримувати нелнкі кількості ¡нчсисриіі гін. Регенераційна здатність ка.іусіи зберігалася не меш/іе одною року.

.'і використанням цієї методики із незначними змінами у складі формені ної суміші ми виділяли і кульмінували прошпластн із пеліосіок' C.suticus. іі наших дослідах пелюстки виявилися кращим джерелом протопластін порівняно з листям, про ІЦО СВІДЧИТЬ ЯК ІШХІД протопласті» (5x10^ на t г пелюсток і 1-5x10б на 1 г листя), так і ефекіинніеїт. висіву (Зй,Оі4,2 "<> проти 2(>,0j_2, Г’о д ія мезофі.тьних протопласті»). Калуспі клони, що шіроіцуііалнся на гормональних ссредоппшах к темноті, при переносі їх па безгормональпе сгрглптпис бу.ні .цінні до рп.іопчіе.іу. ІІри їх культи») нанні на сші.іі у інорюїіа. піся комнакіні іемно.іелеііі колонії, що вказує на уторений хлорофілу іа хлоропласті». Ці колонії далі припиняли еиііі розцінок. Сисіема кульїурп проіопластін із пелюсток огірка прокопує чудові можливості для підбору окремих гібридних продукті» злиття протопласті» за рахунок наяпності природного візуального маркера у одною з партнері», а саме жо итого забарвлення upoum.iacii». Крім цього, Смітом і Батлером (1971)

і * О >с№

було показано, що під час розвитку квіток огірка у пелюстках відбувається конверсія хлоропластів у хромопласт«, і що у зрілих жоптих пелюстках містяться тільки хромонласти. Тому розроблена нами методика культипунання пелюстконих протопластів огірка може бути використана для дослідження біогенезу хлоропластів та хромолластів, а також конверсії хромопласти/хлоропласти.

2. Регенерація із сім'ядольних експлантатів дині.

Для регенерації рослин дині С.теїо найкращим вихідним матеріалом виявилися сім'ядолі зрілих насінин. Багато дослідників звертали увагу на те, що генетичні фактори значно впливають на ефективність процесу регенерації в роді Cucumis і, зокрема, у дині (Colijn-Hooymans et al., 1988, 1992; Oridate et al., 1992 та інші). Щоб визначити, наскільки процес регенерації є генотнповозалежним, нами були відібрані три сорти дині - Пандор, Галія та Крнннчанка, які значно розрізняються за здатністю до калусоутворення та морфогенезу. Під час попередніх досліджень реакції сім'ядольних експлантатів на різні ростові регулятори (всього було проаналізовано 236 поживних середовищ - дані не наводяться) ми визначили,, що найбільш важливу роль у цих процесах у дині відіграють БАП, ЮК та АБК.

Всі три генотипи дині по-різному реагували на зміну складу регенераційних середовищ. Додавання ЮК (0,1-0,85 мг/л) зовсім не впливало на частоту калусоутворення на сім'ядольних експлантатах сорту Кршшчлпка, який характеризувався надзвичайно активним формунапням калусу (до 100%) і у відсутності ЮК, але мало позитивний вплив як на частоту експлантатів, що формують нагони, так і на ефективність регенерації, проте тільки при концентраціях, но нищих 0,3 мг/л (табл. 1). Для сорту Галія иідішщсііпи концентрації ЮК в середовищі прямо корелювало із

>!• .

збільшенням кількості експлантаті її, що утворювали калус, нрн цьому частота та ефективність регенерації зменшувалися (табл. 1). Н цих умонах спостерігалося уповільнення диференціації та шиндкості росту пашиш. Для сорту Пандор інтенсивність формування калусу на окремих експлантатах (іула. церенажно вищою, ніж в контрольних експериментах. Тут ми також спостеріїали негативний пплип підшіїцеппх концентрацій ЮК на процеси диференціації і на ефективність регенерації н цілому (табл. 1).

Вплив проліну на процеси формування калусу також був генотииовозалежиим. Для сортів Крипичапка та Галія додавання проліну в середовище помітно зменшувало інтенсивність калусоугворення. Із зростанням концентрації ІОК ефект проліну сіавав менш помітним. Найбільш яскраво вплив проліну на процеси ка.туеоу пюрення можна спостерігані на прикладі сорту Пандор, де у всіх випадках додаваная н середовище проліну викликало повне приї іичення формування калусу (табл. І). Додавання проліну у середовище, як показав і іілолої ічнніі аналіз процесу регенерації, позіїїпвпо вилітало на формування цінових бруньок і розвиток нормальних пагонів, що відрізнялися по формі під нагонів, уторених на середовищах без проліну. Позитивний ефект проліну на морфогепепічпі процеси може бути пов'язаний і.ч регуляцією ним метаболізму пуринів під час диференціації (Shetty et al., 1992).

Таблиця 1. Калусоутиорення та реіенерація сім'ядольних експдаїїгагіп сорту Крииичанка на- поживних середовищах із різним вмістом ІОК та проліну

Сорт/ середовище* Кількість експлантатів, що утворюють калус, % Інтенсивність калусоутво-реимя в балах^ Кількість експлантатів з регенерантами о/ /о Ефективність регенерації в балах^ Рейтинг середо- вища

Крннії'іаііка МИ 100,0+0,0 3 41,7+4,5 3 4

МІМ 100,0+0,0 4 84,6±9,1 5 5

МИ 1а 54,6±6,4 1 81,8+8,7 6 1

МН2 100,0+0,0 3 100,0+0,0 7 3

90,9+9,1 2 90,9±8,3 4 2

мнз 100.0+0,0 3 91,7+8,0 2 7

МВЗа 100,0+0,0 2 100,0+0,0 1 6

Гал і я

МИ 50,014,5 4 100,0+0,0 5 1

мш 83,318,1 4 83,3±8,1 3 3

Мі) 1а 100,0±0,0 1 100,010,0 3 4

МВ2 100,0±0,0 3 70,0+6,7 4 2

МВ2а 100,0+0,0 2 75,0+7,1 2 5

МВЗ 100,010,0 4 80,3+7,8 2 7

МВЗа 100,010,0 2 66,7+5,8 1 6

Наидор МВ 63,6+9,3 1 100,010,0 7 1

МВ1 25,0+4,5 2 100,0+0,0 5 3

МИІа 0 0 100,010,0 6 2

МВ2 16,7±2,1 1 92,816,4 4 4

МВ2а 0 0 100,0+0,0 3 5

МВЗ 46,2+7,4 3 100,010,0 1 7

МВЗа 0 0 91,3+5,6 2 6

1 - опис середовищ дивись у таблиці 2.

2 - інтенсивність калусоутворення оцінювалася по 4-бальпій

шкалі, де 0 - відсутність калусу, 4 - рясний калус.

З - ефективність регенерації оцінювали в балах по кількості нагонів на експлантат, ступеню їх диференціації та по швидкості їх росту.

Таблиця 2. Склад пожшших середовищ (мг/л), використаних для . регенерації різних coprin дині'.

1 - в основі використовуваних середовищ було середовище Мурасії'о та Скуіа (1962) з 2% цукрози. Всі середовища авіоклавувалн при І20()С на ироіязі 20 хвилин.

2 - ЛІЗ К стерилізували фільїруианням і додавали в авіоклавовані середовища, охолоджені до 45-50^С.

В цілому ііешлогічнин аналіз показав, що процес регенерації у дині за них умов іде шляхом органогенезу.

Відповідно до наших даних ми визначили, що найкращими регенераційними середовищами для соріів Галія та Ііандор с егредошпце МС, що місті!) 1 мі/.'] (>/\И, а для сорту Кршшчанка -І мг/л !)ДН, 0,1 мг/л ЮК, 0,3 мг /л АГ>К та 10 мМ проліну. Через 3-4 тижні культивування па цих середовищах на сім'ядольних експлантатах різних сортів дині з високою частотою (до 100"о) формувалися нагони, які вкорінювалися нрн переносі на безгормональнс середошице МС.

Цитогеиетачний аналіз показав, що серед регенерантів, крім диплоїдів, значну частину становлять тетраплоїди (3 з 10 для сорту Пандор, 6 із 10 для Галії та 4 з 9 для Криничанки). Оскільки тетраплоїди дині мають плоди кращої якості, ніж диплоїди (Robinson, Whitaker, 1978), це яшнце може бути використане у селекції дині.

3. Генетична інженерія в роді Cucumis.

Злиття протопластів C.sativus та С.теїо. Нами зроблена спроба отримати соматичні гібриди огірка та дині з використанням розробленої нами системи виділення ме.юфільппх протоплетів огірка та регенерації з них рослин. Протопласт огірка перед злиттям інактивуиали 10 мМ розчином нодоацетату па протязі 20 хн. при 4®С. Виділені протопласти дині були опромінені дозою 1000 Гр, що повністю припиняло їх поділ. Частота злиття становила близько 45%. Протопласти культивували при густіші 3-4x10'V'm.’i. Через 7-8 дній спостерігали перші поділи. На протязі 3-4 тижнів формувалися компактні мініколонії розміром до 1 мм. Система подвійної інактивації перед злиттям (Sidorov et al., 1У81) виключає можливість розвитку непбридпих продукті», що було Підтверджено контрольними дослідами. Таким чин ом, нами була показана принципова можливість отримання гібридів огірка та дшіі.

Генетична трансформація .піні. Л ін генетичної трансформації дині ми використовували три сорти Галій, ГІандор та Кріїничанка. При визначенні чутливості сім'ядольних експлантаті» до селективного агенту було »становлено, що реакція на капаміцпи е генотнновозалежноіо і що селекційними концентраціями для сорті» Пандор та Крніпічанка е 150 мі. л, а для Галії - 200 мі л капам ііиіпу. .

Ірансформапію проводили за допомогою A.iumefaciens із плазмідами рВІІ21 (Jefferson et а!., 1986) та p.'i5SGUSINT

(Vancamieyt et at., 1990). Оскільки процес регенерації у дииі відбувається у строк, який може бути недостатнім для повної

елімінації агробактерій, а також, що експресія гену бета-глюкуроиідазн може відбуваїися н нгробактеріях (Vnncanneyt ct cil., 1990), щоб уникнути невірної оцінки результатів тесту на GUS-активиість, ми використовували плазміду p35SGUS!NT, яка

відрізняється від рВІ 121 наявністю рослинного інтрону PIV2 у послідовності gus- гену. Оскільки прокаріоти не мають еукаріотичного апарату сплайсингу, в агробактеріях такий модифікований дня-ген не ексирссусться.

Після кокультивування сім'ядольних експлантатів з аі робакіеріями у місцях розрізів через 2-3 тижні почали формуватися численні бруньки та наїоші. З одного експлантату можна було отримані під 1 до 10 рослин, від 39,3_Ь5,5% до

7.),3±ЮДІ°<; експлантаті» різних сорті» утворювали пагони.

Морфологічно нормальні рослини із добре розвиненою кореневою системою були відібрані для доказу їх трпнегештої природи.

Наявність gus-\n\y визначали за допомогою гістохімічного тесту на GUS-активність. Всі проаналізовані лінії, що були отримані після трансформації плазмідого p35SGUSINT, виявилися GUS-тюзи і пвнмміі. В тоіі же час, тільки дві лінії з числа трансформованих рВІ121 дали голубе забарвлення. Значна невідповідність результатів цього тесгу дозволила припустиш, що в останньому випадку акіивніїль gus-гену може бути репресована.

Яшпце "мовчання'' чужерідних генії» у трансгсппих рослинах за останні роки стало об'єктом значного інтересу як вчених, так і працівників біотехнолоіічпнх компаній. Показовим щодо стану проблеми с заголовок статті Фпіпсгана та Макілроя (199't), що може

бути перекладений як "Інактивація траисгенів: рослини

захищаються!". Одним із механізмів, що частково або повністю ¡«активують трансгени, е метилюїзання цитозинів по CpG та CpNpG сайтам. Використання 5’-азацитидіну, який є деметилюючим агентом, дозволяє підновити активність траисгенів (Amazini et al., 1984; Weber et al.', 1990 та in.). У зв'язку а цим, користуючись методиками, запропонованими цими авторами, ми висадили бруньки рослин, що виявилися GUS-нсгатншшми, та контрольних рослин на середовище MC, доповнене 0, 10, 30, 60 та 100 мкМ 5’-азацитидіну. Аналіз на й-і'і день культивування не дав GUS-нознтнвиої реакції'. Після 15 днів культивування з 10 повторно проаналізованих ліній 8 дали голубе забарвлення при використанні всіх вищевказаних концентрацій. Контрольні рослини були GUS-нсгативнимп як при шірощупашіі у присутності 5'-азацптндіну, так і без нього.

Звертає на себе увагу тс явище, що псі нзяті для аналізу рослини, трансформовані p35SGUSINT, яка містить ^до-гсн з інтроном PIV2, на відміну від рВІ121, були GUS-позитивпимн. Інтрон PIV2 є інтроном рослинного походження і має приблизно 80% АТ (Vancanneyt et al., 1990). Меііср та Хаидмап (1994) зробили припущення, що трансгени можуть мегилюкатнся, оскільки розпізнаються як чужорідна ДНК, можливо через тс, що вміст GC в трансгені відрізняється від контекстної рослинної ДНК. Тому, можна припустити, що наявність в ^мл-іччіі нлазміди p3.5SG(JSINT рослинного інтроиу PIV2, багатого на АТ, робить дану конструкцію більві надійною для отримання траисгспннх рослин із стабільною експресією іптродуковапого гена.

Для подальшого доказу того, що відселсчстовапі на каїїачіцпні GUS-позитивні рослини е траистсшіими, ми застосували метод блотинг-гібридизації за Саузсрпом. Сумарну ДНК рослин дикі, трансформованих плазмідами рВП21 та p3.)SG{/S!NT. а також

контрольних нетранеформованих рослин розщеплювали рестриктаиами Pst І, Ват НІ і Sac І. Далі її гібридизували в одному випадку із міченим Pst І Pst І фрагментом плазмідн рНП21, що містіпь більшу частішу гену неомщин фосфшраіісфсрази II. Результати блотииг-гібридизаци наведені ла малюнках 1 і 2 . ДІ1К всіх трансформованих рослин гібридизується з зондом, тоді як ДІІК контрольних нетрансформоианих рослин із ним не гібридизується.

Для визначення наявності інтегрованого гену бета-глюкуронідази перевар сумарної ДНК гібридизували із міченим Ват Hi-Sec І фрагментом плазміди рВІ121, що містить ген бета-глюкуронідази. Результати блотинг-гібридизації наведені па малюнку

3. Вони свідчать, що підібрані рослини є трансгенними і містять gtis-гсн. ДМК контрольних нетранеформованих рослин із зондом не гібридизується.

Оскільки значну частішу регенерантів дині становили тетранлоїди, ми визначили рівень нлоїдності отриманих трансгениих рослин. Були виявлені як диплоїдні, так і тетраилоїдні трансформанта.

І 2 3 4 б в 7 8 в 10 11 13 13 14 16 їв 17

=|1

—ОБ

Мал. 1. Блотинг-гібридизація за Саузерном Pst l-Bam НІ-5ас І перевару сумарної ДНК ліній дині, які отримані за допомогою трансформації A. tümefaciens (плазміда рВ1121) з Pst І -Pst I-фрагментом плазміди рВІ12і, що містить послідовність гену npt II:

1, 10, 16 - ДНК контрольних нетрансформованих рослин дині сортів Галія, Криничанка, Пандор, відповідно;

2-5, 6-9, 11-15 - ДНК трансгенних ліній сортів Галія, Криничанка, Пандор, відповідно;

17 - 5 х препарат Pst J-Pst І фрагменту плазміди рВІ121, що містить ген npt II, змішаний з відповідною кількістю контрольної ДНК, виділеної з нетрансформованих рослин дині.

1 2 3 4 5 в 7 8 9 10 11

-23.1

-05

Мал. 2. Результати блотинг-гібридизаціТ за Саузерном Pst I-Ват НІ-5яс І перепару сумарної ДНК ліній дині, які отримані за допомогою трансформації A.tumefaciens (плазміда p35SGUSINT) з Pst l-Pst І фрагментом плазміди рПІ121, іцо містить послідовність гену nptlІ:

І - 5 х препарат Pst І Pst І фрагменту плазміди рВИ21;

2, И - ДНК контрольних нетрансформовлиих рослин дині сортів Галія та Наадор, відповідно;

3-6, 7-10 - ДНК трансгенних ліній сортіп Галія та Пандор, підновідпо.

1 2 3 4 б 6 7 8 Є 10 11 18 13 14 15 їв 17

—23.1

—9.4

—65

—43

-23

-2.0

ф т т т

■ —05

Мал. 3. Результати блотшіг-гібриднзації за Саузсрном Pst I-Ват HI-Söc І перевару сумарної ДНК ліній дині, які були отримані шляхом трансформації A.tumefaciens (ила.адіда рВІ121) з Ват Ш-Sac І фрагментом плазмідн рВ1121, який містить послідовність gus-геиу:

1, 17 - ДНК летраисформонаних рослин сортіп Галія та Пандор, відповідно;

2 - 5 х препарат Ват Hl-Sac І фрагменту илазміди рШ121;

3-9, 10-16 - ДНК трансгсишіх ліній сортів Галія та Пандор, відповідно.

висновки

1. Розроблено високоефективну методику регенерації рослин І.) протопластів огірка посівного (Cucumis salivas L.).

2. иозроблено систему реіснерації рослий in сім'ядольних експлантатів різних за своїм морфогенетичним потенціалом генотипів дііні (Cucumis melo L.). Процес регенерації відбувається шляхом органогенезу. Використання сім’ядолей як джерела експлантатів приводить до регенерації як днплоїдцих, так і тетраплоїдних рослин.

3. Розроблена система регонграції дозволяє ефективно отримувати траисгенні рослини методом трансформації за доіюмоюю Agrnbacterium tumefacíais геногинін дині, які значно відрізняються за реїопераційною здатністю. Показано, що реакція на селективний аіенг канамішін є теноншоиозалежною. Підтверджена інтеграція генів ітсоміцин фосфотрапсферази П та бета-глюкуроиідази в іеном груїг/формоиаїшх рослин.

•і. Показала можливість відновлення експресії "мовчазних" трансгенів, а саме гену бета-глюкуроиідази, шляхом деметилювання за допомогою 5’-азацнтидіну. .

5. Показана можливість використання геїіу бета-глюкуроиідази

з інтропом P1V2 для от[)нмання трансгенних рослин дині із стабільною експресією цього гену.

Список робіт, опублікованих по темі дисертації:

1. Дуплий В., Калина М., Сидоров В. Регенерация растений из мезофильных протопластов огурца Cucumis sativus L.//Физиология и биохимия культурных растений.-1994.-26, N 6.- с.559-563.

2. Дуплий В., Калина М., Днркс Р., Ледовский С., Сидоров В.

Влияние азотного питания и абсцизовой кислоты на соматический ембриогеиез у огурца// Работы молодых ученых Института

овощеводства и бахчеводства.-1995.-с.55-57.

3. Kalyna М., Duplij V., Tulmans С., Dirks R., Sidorov V. High frequency embryogenesis in cucumber (Cucumis sativus L.) // Plant Cell Reports.-1996.-in press.

4. Kalyna М., Sidorov V., Dirks R.// Development of cell culture technologies in Cucumis//Second Symposium "Trends in Plant Biotechnology". Moscow.-1993.-p.374.

5. Kalyna М., Duplij V'., Sidorov V. Embryogenesis of Cucumis sativus L.// Cell Biology International.-1994.-18, N5.-p.587.

6. Kalyna М., Duplij V., Sidorov V. Factors influencing the

morphogenetical potencial of diverse cultivare of melon//

International Symposium "Plant Biotechnology and Genetic

Engineering". Kiev.-1994.-p.92.

7. Kalyna M. Petal protoplast culture system - a novel approach to study plastid biogenesis// Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology. South Carolina,USA.-1995. In: Journal of Cellular Biochemistry.-1995.-21 A.-p.451.

8. Kalyna М., Butsko E., Sidorov V. Agrobacterium tumefaciens mediated production of transgenic muskmelon plants // Plant Genome-IV Abstracts, San Diego, USA.-1996.-p. 117.

Kalyna M.P. Development of biotechnologies in Cucumis and analysis of new forms of plants.

Thesis for a scientific degree of Candidate of biological scicncics, Institute of Cell Biology and Genetic. Engineering, Kiev,

The results of 8 scientific publications are defended. The thesis deals with the development of plant bioterbnology methods in genus Cucumis. A highly efficient procedure for the plant regeneration from mcsophyll protoplasts of cucumber (Cucumis sativus L.) has been developed. Factors influencing the morphogenetic potencial of diverse cultivare of melon (.Cucumis mclo L.) have been determined and rapid and efficient system for plant regeneration from cotyledon explants of melon has been established. Histological analysis has shown that regeneration occurs via oiganogenesis. Both diploid and tetraploid plants were found ainoung regenerants. Using this regeneration system transgenic plants of melon containing neomycin phosphotransferase II and beta-glucuronidase genes have been obtained by Agrobacterium tumefacicns-mcdiMvd transformation. Transgenic melon plants with intron-containing gus-gcnc have been produced using the same methods. GUS histochemical assay and Southern blotting hybridization have confirmed transformation of these plants.

Калина МЛІ. Разработка биотехнологических методов в роде Cucumis и анализ полученных форм растений.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.25 - клеточная биология, Институт клеточной биологии и генетической инженерии, Киев, 1996.

Защищается 8 научных работ по теме диссертации. Диссертационная работа посиящена разработке биотехнологических методов в роде Cucumis и анализу полученных форм растений. Была разработана высокоэффективная методика регенерации растений из мезофильных протопластов огурца (Cucumis sativus L.). Изучены факторы, влияющие на реализацию морфогенетического потенциала различных генотипов дыни (Cucumis melo L.), и разработана быстрая и эффективная система регенерации растений из семядольных эксплантатов дыни. Гистологический анализ показал, что процесс регенерации идет путем органогенеза. Как диплоидные, так и тетраплоидные растения были обнаружены среди регенерантов. На основе этой системы регенерации методом трансформации с помощью Agrobacterium tumefaciens были получены трансгенные растения дыни, содержащие гены неомиаин фосфотрансферазы II и бета-глюкуронидазы. Были также получены растения дыни, содержащие ген бета-глюкуронидазы с интроном PIV2. Трансгепная природа отселектированных на канамицине растений была доказана с помощью теста на GUS-активность и блоттинг-гибридизации но Саузерну.

Ключові слова: огірок, диня, протопласти, регенерація,

соматична гібридизація, генетична трансформація, Agrobacterium.