Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка биокаталитических методов получения бетулиновой кислоты из бетулина

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка биокаталитических методов получения бетулиновой кислоты из бетулина"

На правах рукописи

МИТРОФАНОВ ДМИТРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

РАЗРАБОТКА БИОКАТАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ БЕТУЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ БЕТУЛИНА

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Казань -2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Уфимский государственный нефтяной технический университет"

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Зорин Владимир Викторович

доктор биологических наук, профессор Багаева Татьяна Вадимовна

кандидат технических наук, Кусова Ирина Вальерьевна

Ведущая организация: Институт Биологии УНЦ РАН, г. Уфа

Защита состоится "22" июня 2005 года в 1400 на заседании диссертационного совета Д 212.080.02 при Казанском государственном технологическом университете по адресу 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, 68, зал заседаний Ученого совета (А-ЗЗО)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного технологического университета

Автореферат разослан "20" мая 2005 года

Ученый секретарь диссертационного совета

А. С. Сироткин

<2 О М/УО^Л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Бетулиновая (ЗР-гидрокси-20(29)-лупаен-28-овая) кислота, тритерпеноид лупановой природы, является перспективным противораковым средством, индуцирующим апоптоз (программированную гибель клеток) в злокачественных меланомах, опухолях мозга и ряда других видов рака. Благодаря своей высокой специфичности в отношении раковых клеток, это соединение, в отличие от других противораковых препаратов, не оказывает токсического действия на здоровые клетки человека. На основе бетулиновой кислоты путем ее химической или микробиологической трансформации могут быть получены еще более эффективные противоопухолевые агенты, а также соединения, проявляющие высокую противовирусную активность.

Бетулиновая кислота обнаружена во многих растениях, но низкое содержание делает нерентабельным ее производство выделением из растительного сырья. В то же время в коре белоствольных берез рода Веш1а, являющейся многотоннажным отходом лесохимических производств и деревообрабатывающих комбинатов, в больших количествах (до 35 %) содержится биосинтетический предшественник этого соединения - бетулин (ЗР-гидрокси-20(29)-лупаен-28-ол). Это делает перспективным синтетический путь получения бетулиновой кислоты региоселективным окислением бетулина. Однако эту задачу трудно решить химическими методами из-за отсутствия региоселективных окислителей, способных избирательно окислять оксиметильную группу бетулина, не затрагивая его 3-гидроксигруппу, а также удобных и простых методов парциальной защиты последней.

Перспективным подходом в решении проблем региоселективного синтеза органических соединений является использование методов биотрансформации с применением ферментов и клеток микроорганизмов. В связи с этим актуальным является поиск биокатализаторов и разработка на их основе биокаталитических методов получения бетулиновой кислоты из бетулина.

Целью работы являлась разработка биокаталитических систем и методов получения бетулиновой кислоты биотрансформацией бетулина.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• осуществить скрининг микроорганизмов, способных трансформировать бетулин в бетулиновую кислоту;

• разработать методы получения бетулиновой кислоты с помощью выделенных микроорганизмов;

• исследовать основные свойства перспективных штаммов с целью их предварительной идентификации и оценки патогенно

• разработать методы интенсификации перепек

Диссертационная работа выполнена в соответствии с Федеральной целевой программой «Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки в 2002 - 2006 гг.» (2003 г.) и программой «Катализаторы, химические технологии и материалы» Академии наук Республики Башкортостан (2001 - 2003 гг) Научная новизна. Впервые выделены и идентифицированы микроорганизмы (Pseudomonas sp Н-43, Pseudomonas sp. НС-231, Mycobacterium sp. 1-4-1, Bacillus sp Дю-12), способные окислять бетулин в бетулиновую кислоту. Впервые предложены методы получения бетулиновой кислоты региоселективным окислением бетулина с помощью биокатализаторов на основе клеток микроорганизмов в водной среде, органическом растворителе и двухфазных системах. Показано, что скорость превращения субстрата микроорганизмами и выход целевого продукта существенно зависят от природы растворителя, кислотности реакционной смеси и условий роста культуры

Впервые выявлена способность микроорганизмов гидролизовать З-О-аце-тилбетулин, ацетилировать бетулин и восстанавливать бетулоновую кислоту. Найдены штаммы Pseudomonas sp НС-231 и Pseudomonas sp. НСВ-29, региоселективно ацети-лирукмцие 3-гидроксигруппу бетулина. Впервые предложен однореакторный метод получения бетулиновой кислоты из бетулина с помощью тандема биокатализаторов. Практическое значение. Разработаны методы скрининга микроорганизмов, способных трансформировать бетулин в бетулиновую кислоту, а также региоселективно ацетилировать 3-гидроксигруппу бетулина. Создана коллекция культур микроорганизмов, транформирующих тритерпеноиды лупановой природы (бетулин, бетулиновую и бетулоновую кислоты) в окислительно-восстановительных и обменных реакциях. Предложен однореакторный трехстадийный синтез бетулиновой кислоты из бетулина с помощью тандема биокатализаторов Pseudomonas sp. Н-43 и Bacillus sp Диз-12, обеспечивающий выход целевого продукта на уровне 65 % в течение 50 ч. Разработаны одностадийные биокаталитические методы региоселективного окисления бетулина, позволяющие совмествно получать бетулиновую кислоту с выходом 38 % и бетулиновый альдегид с выходом 56 % в течение 6 ч с помощью штамма Pseudomonas sp Н-43 в покоящихся условиях, а также бетулиновую кислоту с выходом 45 - 50 % в течение 24 -36 ч с помощью штамма Mycobacterium sp 1-4-1 в ростовых условиях.

Результаты научных исследований легли в основу создания новых лабораторных работ и используются в учебном процессе подготовки инженеров по специальности 070100 «Биотехнология» УГНТУ.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на

1 международном конгрййсе'Шиотехнология г состояние и перспективы развития» 1 . -11 im i

• • ,iii 4

•«» w *•<' k . .. ----- ~

Москва, 2002 г.; XXXIX и Х1Л Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2001, 2003); 53 и 54 Научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых УГНТУ (Уфа, 2002, 2003); I и II Всероссийской научной 1п1етег-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био-и органической химии и механики многофазных систем» (Уфа, 2002, 2003); 1У-ом Всероссийском научном семинаре и молодежной научной школе «Химия и медицина» г. Уфа, 2003 г. Публикации: По материалам диссертации опубликовано 13 работ. Структура и объем работы: Диссертация включает введение, обзор литературы (1 глава), посвященный биологической активности бетулиновой кислоты и анализу потенциала микроорганизмов как катализаторов регио- и энантиоселективных процессов ее получения из бетулина, описание объектов и методов исследования (2 глава), изложение и обсуждение результатов (3 глава), выводы и список цитируемой литературы, содержащий 201 ссылку. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка, 12 таблиц и 2 приложения.

При проведении исследований использовались микробиологические и биохимические методы, а также методы тонкослойной хроматографии, жидкостной колоночной хроматографии, ЯМР и УФ- спектроскопии.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Скрининг микроорганизмов - окислителей бетулина в бетулиновую

кислоту

Для скрининга микроорганизмов - трансформаторов бетулина предложен оригинальный метод, основанный на трансформации этого соединения в 0,05 М фосфатном буфере (рН = 7,0), содержащем 0,75 мг/мл субстрата и 3 - 6 % ацетона, с помощью густой суспензии биомассы, выращенной на агаризованной питательной среде без предварительной промывки буфером (500 мг/мл по сырому весу), с последующим анализом хлороформенных экстрактов реакционной смеси методом ТСХ.

В результате тестирования 213 штаммов микроорганизмов, выделенных из почвенных биоценозов, ассимилирующих спирты, целлюлозу или нефть, были выявлены 78 штаммов, образующих бетулиновую кислоту из бетулина.

2. Исследование продуктов окисления бетулина методом ТСХ

С целью выявления штаммов, способных осуществлять региоселективное окисление первичной гидроксильной группы бетулина (1), методом ТСХ была исследована последовательность образования возможных продуктов окисления этого соединения: бетулиново-

го (2) и бетулонового (4) альдегидов, а также бетулиновой (3) и бетулоновой (5) кислот (Рис. 1). Установлено, что только 5 штаммов не накапливают 3-кетосодержащие продукты 4 и 5 в стандартных условиях (Рис. 1, I путь). Это указывает на возможное отсутствие у них ферментов, способных окислять вторичную оксигруппу тритерпеноидов лупаново-го ряда*. В пользу этого свидетельствует также отсутствие бетулоновой кислоты в процессе трансформации экзогенной бетулиновой кислоты этими микроорганизмами.

путь 1 группа потенциально региосепективных штаммов, не окисляющих 3-ОН-группу бетулиновой кислоты (5 штаммов),

путь 2 группа нерегиоселективных штаммов (59 штаммов),

путь 3 группа потенциально региоселективных иггаммов, окисляющих 3-ОН-гуппу бетулиновой кислоты (14 штаммов)

Рисунок 1 - Гипотетическая схема окисления бетулина микроорганизмами

Большинство штаммов (59 штаммов) окисляли 3-ОН-группу бетулина. В реакционных смесях этих микроорганизмов присутствовал бетулоновый альдегид и, как правило, бетулоновая кислота (Рис. 1, 2 путь).

Вместе с тем было обнаружено, чго группа микроорганизмов из 14 штаммов, не накапливала бетулоновый альдегид, хотя и синтезировала бетулоновую кислоту. Особенностью этой группы микроорганизмов являлось также то, что образование бетулоновой кислоты происходило вслед за синтезом бетулиновой кислоты. Это позволило предположить, что окисление 3-ОН-группы тритерпеноида данными микроорганизмами происходит на уровне бетулиновой кислоты, а не бетулина (Рис. 1,3 путь).

* Образцы тритерпеноидов лупанового ряда, использованные в качестве стандартов при идентификации продуктов биотрансформации бетулина были получены от зав лабораторией ИОХ УНЦ РАН профессора Ф 3 Галина

Образование бетулоновой кислоты из бетулиновой подтверждено при исследовании трансформации экзогенной оксикислоты штаммом НС-231, относящимся к данной группе микроорганизмов (Рис. 2).

сн,

Лупеол

-о- бетулиновая кислота;

лупеол; -о- бетулоновая кислота

Условия реакции: 0,05 М фос-фатный буфер (рН = 7) - I мл; субстрат -0,75 мг/мл; биомасса - 500 мг(сырой вес)/мл; ацетон - 6 %; 30 °С

Рисунок 2 - Трансформация бетулиновой кислоты и лупеола штаммом НС-231

Установлено также, что этот штамм не способен трансформировать лупеол -природный негидроксилированный по С28 предшественник лупановых тритерпе-ноидов, что косвенно подтверждает значимость карбоксильной группы для окисления вторичной гидроксигруппы

Исследование динамики образования бетулиновой кислоты региоселективными микрорганизмами 1 и 3 группы, показало, что наиболее эффективно образуется это соединение в присутствии штаммов Т-12, 1-4-1, УЗ-26, 1-Зж, Н-43, НС-231, Д-12, НС-313. Однако следует отметить, что во всех случаях выход целевого продукта находится на низком уровне (8-15 %).

При исследовании экстракта клеток иламма НС-231, обладающего клеточной стенкой грамотрицательного типа, полученного в результате лизиса 3 %-ным раствором КОН, было установлено, что низкий выход бетулиновой кислоты не связан с поглощением ее биомассой. Более вероятной причиной этого является дальнейшая конверсия целевого продукта или побочные модификации субстрата ферментными системами микроорганизма. В пользу последнего свидетельствует присутствие в реакционных смесях других неидентифицированных соединений А и К.

Неидентифицированные продукты А, Б, Д и К были обнаружены также в реакционных смесях и других штаммов.

3. Исследование трансформации бетулоновой кислоты

Учитывая обратимость окислительно-восстановительных реакций, целесообразно было исследовать возможность получения бетулиновой кислоты путем энан-тиоселективного восстановления бетулоновой кислоты с помощью штаммов, окисляющих 3-ОН-группу тритерпеноидов (Рис. 1).

Однако при исследовании такой трансформации бетулоновой кислоты в стандартных условиях с помощью 18 наиболее активных штаммов было установлено, что все они осуществляют политрансформацию этого соединения с образованием бетулиновой кислоты с низким выходом (< 19 %).

4. Исследование микробиологической трансформации бетулина в

хлороформе

Одним из подходов, ведущих к повышению селективности трансформации органических соединений с помощью клеток микроорганизмов, является реализация процесса в органическом растворителе. В результате исследования трансформации бетулина в хлороформе с помощью нативной биомассы найденных микроорганизмов (собранной с поверхности агаризованной среды) было установлено, что большинство биокатализаторов не работает в этих условиях. Вместе с тем, были найдены четыре штамма (1-4-1, НС-231, Диз12, НС-331), нативная биомасса которых конвертировала бетулин в хлороформе. Однако и эти биокатализаторы работали в хлороформе нестабильно.

Более стабильные результаты были получены при использовании обводненной биомассы микроорганизмов (биомасса, разбавленная водой в соотношении 9:1). В этих условиях в продуктах трансформации обнаруживаются только бетулиновая и бетуло-новая кислоты, что свидетельствует о подавлении ряда побочных трансформаций бетулина хлороформом (см. табл. 1).

Таблица

Трансформация бетулина в хлороформе с помощью нативной обводненной биомассы микроорганизмов

Условия реакции: хлороформ

1 мл; бетулин

.„. 1П 0/-

0,75 мг/мл; обводненная биомасса (биомасса-

Штаммы Конверсия Выход продуктов, %

бетулина, % Бетулиновая кислота Бетулоновая кислота

24 ч 48 ч 72 ч 24 ч 48 ч 72 ч 24 ч 48 ч 72 ч

1-4-1 27 40 44 23 36 38 0 0 0

НС-231 100 100 - 35 0 0 62 95 -

Диз-12 74 78 - 27 0 0 68 72 -

НС-313 100 100 - 30 0 0 65 92 -

Бетулиновая кислота как единственный продукт с выходом 36 % образуется только в случае штамма 1-4-1, осуществляющего неполную конверсию субстрата (40 % через 2 суток). Дальнейшее увеличение продолжительности трансформации (до 72 ч) не приводило к существенному увеличению конверсии субстрата и выхода целевого продукта, что, вероятно, связано с инактивацией биокатализатора. Остальные штаммы работали неселективно, но с более глубокой конверсией субстрата (72 - 100 %). Наибольший выход бетулиновой кислоты составлял 27 - 35 %.

5. Исследование трансформации З-О-ацетилбетулина обводненной биомассой штаммов НС-231, НС-313 и Диз 12 в хлороформе Было обнаружено, что обводненная нативная биомасса неселективных штаммов Диз-12, НС-313 и НС-231, способна трансформировать в хлороформе З-Оацетилбетулин, б (Рис. 3).

При использовании штаммов НС-231 и НС-313 в реакционной смеси временно накапливался бетулин (1), что указывает на наличие у них эстеразной активности. В дальнейшем в условиях трансформации бетулин окислялся данными микроорганизмами до бетулиновой (3) и бетулоновой кислоты (5). В тех же условиях при использовании штамма Диз-12 ни бетулин, ни бетулиновая или бетулоновая кислоты не обнаруживались. Инкубирование хлороформенной фазы, содержащей продукты трансформации бетулина биомассой штамма Диз-12, с помощью биомассы штамма НС-231 приводило к образованию бетулиновой кислоты, которая затем окислялась в бетулоновую. Это позволило предположить, что нативная биомасса штамма Диз-12 способна трансформировать субстрат в 3-0-ацетилбетулиновую кислоту.

Рисунок 3 - Гипотетическая схема трансформации З-О-ацетилбетулина микроорганизмами в хлороформе

Полученные результаты легли в основу разработки однореакторного метода получения бетулиновой кислоты с помощью тандема биокатализаторов, осуществляющих последовательное ацнлирование 3-ОН-группы бетулина, окисление оксиметильной группы и снятие защитной ацетатной группы без выделения промежуточных продуктов 6. Разработка стадии ацилирования бетулина

В результате скрининга были найдены 17 штаммов, проявляющих гидролазную активность в отношении З-О-ацетилбетулина. Исследование трансформации бетулина в присутствии винилацетата обезвоженными ацетоном клетками этих микроорганизмов в различных органических растворителях позволило выявить 6 штаммов (НС-319, НС-231, НС-331, НС-451, НСВ-29, Диз-12/1), способных ацетилировать субстрат с образованием З-О-ацетил бетулина в толуоле, хлороформе, этилацегагге, ацетоне и их смеси с изооктаном).

CHjOH

ОАс

СН2ОН

^ 1 " / \ 6 Наиболее активно ацетилировал бетулин штамм НСВ-29 в хлороформе и ацетоне. В хлороформе при избытке винилацетата полная конверсия субстрата происходила через 24 ч (Рис. 4А).

100

100-Г

60-

10 15 Время, ч

з 4 Номер ннш

Условия ацилирования хлороформ - 1 мл; бетулин - 0,75 мг/мл; винипацетат - 250 мг/мл, обезвоженная ацетоном биомасса - 30 мг/мл; 30 °С. Условия гидролиза 0,05 М фосфатный буфер (рН = 7) -1 мл, З-О-ацетилбетулин - 0,75 мг/мл; обезвоженная биомасса - 30 мг/мл; 30 °С

Рисунок 4 - Конверсия субстрата при однократном (А) и многократном (Б) использовании биокатализатора НСВ-29 в процессах ацетилирования бетулина винилацетатом (-о-;о) и гидролиза 3-0-ацетилбетулина(-*-;м)

Введение изооктана в систему с ацетоном (1:1) приводило к положительному синергетическому эффекту: скорость реакции возрастала в 1,9 раза. Однако в системе с хлороформом значительного эффекта от введения изооктана не наблюдалось.

Примечательно, что в двухфазной системе буфер (р№=7,0) - хлороформ (1:1) обезвоженная биомасса штамма НСВ-29 активно (в течение 3 ч) гидролизует З-О-ацетилбетулин до бетулина (Рис. 4А).

Установлено, что биокатализатор на основе штамма НСВ-29 проявляет стабильность в процессе ацилирования бетулина на протяжении 3 циклов (время цикла -24 ч), а в процессе гидролиза - в течение 5 циклов (время цикла - 3 ч) (Рис. 4Б).

Полученные данные показывают, что штамм НСВ-29 может быть использован как компонент тандема биокатализаторов для ацетилирования 3-ОН-группы тритер-пеноида и для снятия защитной группы с З-О-ацетилбетулиновой кислоты.

7. Синтез бетулнновой кислоты трансформацией бетулина с помощью тандема биокатализаторов С помощью тацдема биокатализаторов (штаммов Диз-12 и НСВ-29) был осуществлен однореакторный синтез бетулиновой кислоты из бетулина, включающий ацетили-рование бетулина винилацетатом в хлороформе с помощью обезвоженных ацетоном клеток штамма НСВ-29, окисление ацилированного продукта в присутствии нативной биомассы штамма Диз-12 и гидролиз ацилированного предшественника бетулиновой кислоты в двухфазной системе буфер (рН=7,0) - хлороформ (1:1) (Рис. 5).

обезвоженные ацетоном обводненная нашивная

Рисунок 5 - Схема трансформации бетулина в бетулиновую кислоту с помощью тандема биокатализаторов

Реализация предложенной трехстадийной схемы синтеза бетулиновой кислоты из бетулина позволила получить целевой продукт с выходом 65 % в течение 50 ч 8. Исследование влияния хлороформа на трансформацию бетулина микроорганизмами

С целью разработки эффективного одностадийного метода получения бетулиновой кислоты из бетулина с помощью штамма 1-4-1, осуществляющего неполную конверсию субстрата в хлороформе исключительно в целевой продукт, была исследована трансформация бетулина в двухфазных системах буфер (рН = 7,0) - хлороформ с различным содержанием органического растворителя.

Было обнаружено, что скорость конверсии субстрата в двухфазных системах выше, чем в чистом хлороформе (Рис. 6). При этом существует оптимальная область содержания хлороформа в двухфазной системе (3 %), в пределах которой трансформация бетулина происходит наиболее интенсивно. Вероятно, с одной стороны, она определяется отсутствием токсического действия хлороформа на биокатализатор, а, с

-□- скорость превращения бетулина

-о- выход бетулиновой кислоты

* выход соответствует наибольшему уровню кислоты в реакционной смеси

Условия реакции, растворитель (0,05 М фосфатный буфер, рН = 7 - хлороформ) - I мл, биомасса - 15 чг(асв)'мл, с\б-страт - 0,75 чг 'мл. 30 С

Содержание хлороформа, %

Рисунок 6 - Динамика превращения субстрата и образования бетулиновой кислоты при трансформации бетулина штаммом 1-4-1 в двухфазных системах буфер (рН=7,0) - хлороформ

Однако наибольший выход бетулиновой кислоты, в этих условиях ниже, чем в системах с большим содержанием хлороформа (Рис. 6). При этом образуются дополнительные соединения, основными из которых являются бетулиновый альдегид и неидентифи-

другой стороны, более интенсивным массообменом.

20 40

60 80 100

цированный продукт К. Интересно, что продукт К не накапливается в системах, содержащих свыше 50 % хлороформа, что указывает на возможное избирательное подавление активности фермента(ов), ответственных за его синтез, хлороформом.

Исследование трансформации бетулина другими потенциально региоселек-тивными штаммами в двухфазных системах с 3 %-ным содержанием хлороформа показало, что в этих условиях все штаммы осуществляют политрансформацию бетулина. При этом в двухфазных системах с высоким содержанием хлороформа (50 - 90 %) селективность реакции возрастает, однако скорость трансформации бетулина большинством штаммов резко падает. Относительно высокую активность в системе с 50 %-ным содержанием хлороформа обнаруживали штаммы НС-231, НС-313, УЗ-26 и Н-43, накапливающие бетулиновую кислоту с выходом 12 - 21 %. 9. Исследование влияния рН среды на трансформацию бетулина в двухфазной системе с 50 %-ным содержанием хлороформа

Для региоселективных штаммов НС-231, НС-313, Н-43, УЗ-26, работающих в системе с 50 % хлороформа было обнаружено, что они накапливают бетулиновую кислоту в больших количествах в кислой среде (рН = 5,5), нежели в нейтральной. Наибольший выход бетулиновой кислоты (26 %) был у штамма НС-231 (Рис. 7). Следует отметить, что помимо бетулиновой кислоты микроорганизмы в кислой среде в значительных количествах образуют бетулиновый альдегид. Наиболее активный штамм Н-43 временно аккумулировал до 85 % этого соединения.

-0- НС-231 -■-- Н-43 -4- УЗ-26 -о- НС-313

Условия реакции: 0,05 М фосфатный буфер (рН=5,5) - 0,5 мл; хлороформ - 0,5 мл: биомасса - 15 м1(асв)/мл, субстрат -0,75 мг/мл; 30 °С

Рисунок 7 - Динамика образования бетулиновой кислоты из бетулина в двухфазной системе буфер (рН=5,5) -хлороформ (1:1)

2 4 6 Время, ч

Исследование изменения содержания бетулиновой кислоты в реакционной смеси в ходе трансформации бетулина этими микроорганизмами в кислых условиях показало, что штаммы НС-231, УЗ-26, НС-313 активно синтезируют целевой

продукт, однако быстро конвертируют его (Рис.7) с образованием в качестве основного продукта бетулоновой кислоты.

Напротив, штамм Н-43 значительно медленнее образует и модифицирует бетули-новую кислоту. Учитывая способность этого микроорганизма накапливать бетулино-вый альдегид в большом количестве, следует полагать, что лимитирующей стадией синтеза кислоты является окисление альдегида.

Полученные данные показывают, что для увеличения выхода целевого продукта при окислении бетулина в двухфазной системе буфер (рН=5,5) - хлороформ (1:1) штаммами НС-231, НС-313 и УЗ-26 необходимо блокировать процесс окисления его 3-гидроксигруппы, а в случае штамма Н-43 требуется интенсифицировать процесс окисления альдегидной группы бетулинового альдегида.

10. Определение способа повышения селективности трансформации бетулина в бетулиновую кислоту штаммом НС-231

Известно, что активность дегидрогеназ может ингибироваться продуктами реакции, а также субстратами или их аналогами. В связи с этим для наиболее эффективного в кислых условиях штамма НС-231 была предпринята попытка блокировать окисление 3-ОН группы с помощью ряда циклических спиртов (резорцина, эргостерина, лупеола, циклогексанола) и кетона (циклогексанона)

Действительно, некоторые из этих соединений оказали положительное действие на выход бетулиновой кислоты в процессе трансформации бетулина штаммом НС-231 (Рис 8)

1-контроль 4- резорцин

2 - эргостернн 5-кнклогексанол 3-лупеол 6-циклогексапон

* выход соответствует наибольшему } ровню кислоты в реакционной смеси

Условия реакции. 0,05 М фосфатный буфер (рН=5,5) - 0,5 мл, хлороформ -0,5 мл, субстрат - 0,75 чг/мл; биомасса - 15 мг(асв)/мл, ингибитор -0,5 мг/мл; 30 °С

Рисунок 8 - Влияние циклогексанона и ряда циклических спиртов на выход бетулиновой кислоты при трансформации бетулина штаммом НС-231

Наибольший выход бетулиновой кислоты (33 %) был достигнут при окислении бетулина в присутствии резорцина.

11. Интенсификация окисления бетулина в бетулиновую кислоту штаммом Н-43

С целью ускорения процесса окисления бетулинового альдегида до бетулино-вой кислоты штаммом Н-43 было исследовано влияние добавки бетулина в питательную среду для выращивания биомассы на ее окислительную активность

В результате исследования было обнаружено, что биомасса, выращенная в присутствии бетулина, полностью конвертировала его за 5 ч, в то время как биомасса, полученная культивированием штамма Н-43 на среде без тритерпеноида, к этому времени протрансформировала только около 80 % субстрата (Рис 9). Это указывает на способность бетулина индуцировать синтез ферментов окисления бетулина.

Однако под действием бетулина, вероятно, индуцируются не только целевые ферменты, но и фермент, окисляющий вторичную спиртовую группу тритерпеноида. В пользу этого свидетельствует образование в качестве единственного продукта трансформации бетулоновой кислоты в варианте с биомассой, выращенной в присутствии бетулина (Рис 9). Попытка блокирования окисления 3-ОН-группы индуцированной биомассой с помощью резорцина, эргостерина и лупеола не позволила увеличить выход целевого продукта.

ЮОГ'

X -о

Ш ¿ч

Я .

X 1=

О 8

* X

■ 2

■ 5

■ 5

Я

5 о

80 60 40 20

1- бетулии

2- бетулиновый альдегид

3- бетулиновая кислота

4- бетулоновая кислота

а - питательная среда без бетулина □ - питательная среда с бетулином

Условия реакции 0,05 М фосфатный буфер (рН=5,5) - 0,5 мл; хлороформ - 0,5 мл, субстрат -0,75 мг/мл; биомасса -15 мг(асв)/мл, 30 °С, 5 ч

Рисунок 9 - Трансформация бетулина биомассой штамма Н-43, выращенной на питательной среде с добавлением и бш добавления бетулина

При работе с неиндуцированной биомассой штамма Н-43 увеличение выхода бе-тулиновой кислоты до 33% удалось добиться при использовании в качестве растворителя буфера (рН = 5,5), содержащего 8 % ацетона Более того, было обнаружено, что в этих условиях биомасса штамма Н-43 может трансформировать полностью не только 0,75 г/л, но и более высокие концентрации субстрата - 1,0 г/л. При этом полная конверсия субстрата достигается 3 ч реакции (Рис. 10) К этому времени наблюдается наибольший выход бетулинового альдегида - около 70 %.

-о- бетулнн

бетулнновый альдешд -А- бетулиноваи кислота

Условия реакции' 0,05 М фосфатный буфер (рН=5,5) - 1,0 мл, ацетон - 8 %, субстрат - 1,0 мг/мл, биомасса -15 мг(асв)/мл, 30 °С

Рисунок 10 - Динамика превращения субстрата и образования продуктов при трансформации бетулина штаммом Н-43 в системе буфер (рН=5,5)-ацетон (8%)

В этих условиях отмечено максимальное содержание бетулиновой кислоты (выход 38 %) через 6 ч трансформации при 56 %-ном выходе бетулинового альдегида. Дальнейшее увеличение продолжительности трансформации не приводит к росту выхода целевого продукта. 12. Исследование трансформации бетулина в бетулиновую кислоту штаммом 1-4-1 в ростовой среде

Более высокий выход бетулиновой кислоты был получен с помощью штамма 1-4-1 в ростовых условиях. В отличие от штамма Н-43 этот микроорганизм сохраняет региоселективные свойства в присутствии бетулина в ростовой среде. Было установлено, что бетулин наиболее активно конвертируется трехсуточной культурой. В этих условиях большая часть субстрата трансформировалась к 36 ч (Рис. 11).

Время, ч

12 24 36 48 60 72

Время, ч

-а- бетулнн

-■- бетулиновая кислота

- А - бетулнновый альдегид -о- продую К

Условия реакции; питательная среда

- 20 мл; ацетон - 8 %; биомасса -5,0 мг(асв)/мл; бетулин - 0,75 мг/мл; 30 °С

Рисунок 11 - Трансформация бетулина штаммом 1-4-1 в ростовой среде

Максимальный выход бетулиновой кислоты достигался между 24 и 36 ч трансформации и составлял 45 - 50 %. В этот период трансформации другие соединения (бетулиновый альдегид и продукт К) присутствовали в среде в наименьшем количестве.

13. Исследование основных диагностических и патогенных свойств перспективных микроорганизмов

С целью предварительной идентификации перспективных микроорганизмов до рода были изучены их основные морфологические, цитологические и физиолого-биохимические свойства. По совокупности свойств штаммы Н-43 и НСВ-29 близки по описанию к бактериям рода Pseudomonas, штамм 1-4-1 - к бактериям рода Mycobacterium, а штамм Диз-12 - к бактериям рода Bacillus. В результате исследований, проведенных ФГУП «Иммунопрепарат» установлено, что все штаммы авирулентны для млекопитающих, не проявляют токсигенность.

14. Принципиальная технологическая схема получения бетулиновой кислоты

На рисунке 12 предложена принципиальная технологическая схема получения бетулиновой кислоты микробиологическим окислением бетулина с помощью Mycobacterium sp. 1-4-1 (I) или Pseudomonas sp H-43 (II).

Рисунок 12 - Принципиальная технологическая схема получения бетулиновой кислоты микробиологическим окислением бетулина

Биомассу Pseudomonas sp Н-43 выращивают в ферментере Ф1 в течение 24 ч при температуре 30 - 32 °С, затем осаждают в центрифуге Ц и суспендируют в фосфатном буфере (рН = 5,5) в смесителе Е1. Суспендированная в буфере биомасса поступает в реактор Р1, куда также вводится концентрированный раствор бетулина в ацетоне из емкости Е2 в количестве 8 % от объема реакционной смеси. Реакция протекает в течение 6 ч при температуре 30 °С и аэрации.

При использовании бактерий Mycobacterium sp. 1-4-1 биомассу наращивают в ферментере Ф1 в течение 72 ч, после чего в него подается концентрат бетулина в ацетоне (8 %) для проведения трансформации. Трансформацию проводят при 30 °С и интенсивной аэрации в течение 36 ч.

Стадия выделения целевого продукта из реакционный смеси одинакова для обоих способов получения бетулиновой кислоты. Реакционная масса подается в экстрактор Э1, где подкисляется 5 %-ным раствором соляной кислоты (рН =1-2). Продукты трансформации экстрагируются этилацетагом в течение 2 ч при непрерывном перемешивании. Фазы разделяют, органическую фазу направляют в реактор Р2, куда также подается 10 %-ный раствор гидроксвда калия (1:1) для перевода целевого продукта в водную фазу. Водную фазу с калиевой солью бетулиновой кислоты отделяют в экстракторе Э2 и подкисляют 10 %-ным раствором соляной кислоты до рН = 1 - 2 в реакторе РЗ. Бегулиновую кислоту экстрагируют из водной фазы этилацетагом в экстракторе ЭЗ. Экстракт концентрируют в роторно-пленочном испарителе РПИ1. Бегулиновую кислоту кристаллизуют, отфильтровывают в шенк-фильтре Фш-1 и высушивают в сушильном шкафу СПИ. Полученный препарат бетулиновой кислоты имеет чистоту 95 %. Бегулиновую кислоту более высокой чистоты (98 %) можно получить путем дополнительной очистки колоночной хроматографией через слой силикагеля в колонке К1. Фракции, содержащие бегулиновую кислоту, концентрируют в РПИЗ, кристаллизуют, фильтруют в Фш-3 и высушивают в сушильной установке СШЗ.

При использовании биомассы штамма Pseudomonas sp. Н-43 помимо бетулиновой кислоты может быть получен побочный продукт - бетулиновый альдегид, который в дальнейшем может быть химически доокислен в бегулиновую кислоту кислородом воздуха (Красутский, 2000) Бетулиновый альдегид выделяется из органической фазы экстрактора Э1 путем концентрирования в аппаратах РПИ2, ФШ2 и СШ2.

ВЫВОДЫ

1. В процессе скрининга микроорганизмов-трансформаторов бетулина выделены и идентифицированы штаммы Pseudomonas sp. Н-43 и НС-231, Bacillus sp Диз-12, Mycobacterium sp 1-4-1, конвертирующие субстрат в бетулиновую кислоту. Установлена

зависимость скорости трансформации бетулина найденными микроорганизмами и выхода бетулиновой кислоты от природы растворителя, pH среды и условий выращивания биомассы.

2. Осуществлено региоселективное окисление бетулина в хлороформе с помощью биомассы штамма Mycobacterium sp 1-4-1 с выходом бетулиновой кислоты 36 % за 48 ч трансформации.

3. Показана возможность получения бетулиновой кислоты с помощью штамма Pseudomonas sp HC-23I в двухфазной системе буфер (р№=5,5) - хлороформ (1:1) с выходом 26 % за 4 ч трансформации. Обнаружено, что введение в реакционную смесь лупеола, эргостерина или резорцина приводит к увеличению выхода продукта на 17-30%.

4. Выделен и идентифицирован штамм Pseudomonas sp НСВ-29, обезвоженная (ацетоном) биомасса которого осуществляет региоселективное ацетилирование 3-гидроксигруппы бетулина в хлороформе, ацетоне и их смеси (1:1). Показана стабильность работы данного биокатализатора в процессах ацетилирования бетулина (в течение 3 циклов) и гидролиза З-О-ацетилбетулина (в течение 5 циклов).

5. Предложен однореакторный метод получения бетулиновой кислоты с выходом 65 % трансформацией бетулина в хлороформе в течение 50 ч с помощью тандема биокатализаторов на основе штамма Pseudomonas sp НСВ-29, осуществляющего защиту 3-гидроксигруппы бетулина путем его ацетилирования винилацета-том и последующее снятие ацетильной группы, и штамма Bacillus sp Диз-12, катализирующего окисление оксиметильной группы З-О-ацетилбетулина.

6. На основе штамма Pseudomonas sp Н-43 разработан биокаталитический метод региоселективного окисления бетулина в системе буфер (рН=5,5) - ацетон (8 %), позволяющий синтезировать бетулиновую кислоту с выходом 38 % и бету-линовый альдегид с выходом 56 % в течение 6 ч.

7. Разработан метод получения бетулиновой кислоты с помошью штамма Mycobacterium sp. 1-4-1 в ростовых условиях. Установлено, что трехсуточная культура этого микроорганизма окисляет бетулин в целевой продукт с выходом 45 -50 % в течение 24 - 36 ч.

8. Предложены принципиальные технологические схемы получения бетулиновой кислоты биокаталитическим окислением бетулина с помощью найденных микроорганизмов.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Скрининг микроорганизмов - окислителей бетулина / Д.В. Митрофанов, Н. И. Петухова, Ф. 3. Галин, О. Б. Флехтер, В. В. Зорин // Баш. Хим. Журн. - 2003.- Т. 10, №1. - С. 53-55

2. Поиск микроорганизмов для ацилирования бетулина / Д. В. Митрофанов, Н. И. Петухова, Ф.З. Галин, О.Б. Флехтер, В. В. Зорин // Баш. Хим. Журн. - 2003. - Т.10, №1.-С. 58-60

3. Окисление бетулина микроорганизмами в хлороформе и двухфазной системе - бу-фергхлороформ / Д В. Митрофанов, Н. И. Петухова, Ф. 3. Галин, О. Б. Флехтер, В. В. Зорин //Баш.Хим.Журн,- 2004,- Т.11, №1.-С.42 - 45

4. Микробиологическая трансформация бетулина в продукты с антимеланомной активностью / Д. В. Митрофанов, Н. И. Петухова, О. Б. Флехтер, Ф. 3. Галин, В. В. Зорин // Материалы I межд. конгр. «Биотехнология - состояние и перспективы развития», 14 -19 октября 2002 г., Москва. - 2002.- С. 65

5. Митрофанов Д.В., Семенова И. С., Петухова Н. И. Микробиологическая трансформация тритерпенов // Материалы 53 научн.-техн. конф. студ., асп. и мол. ученых, Уфа, 12-17 апреля 2002 г. - 2002. - С. 1273.

6. Микробиологическое восстановление бетулоновой кислоты / Д. В. Митрофанов, Н. И. Петухова, О. Б. Флехтер, Ф. 3. Галин, В. В. Зорин // Материалы I Всеросс. научн. Интернет-конф. «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем», 25 - 27 декабря 2002 г., Уфа..-

2002.- С. 111

7. Региоселективное ацегилирование бетулина микроорганизмами / О. Г. Полушкина, Д. В. Митрофанов, Н. И. Петухова, В. В. Зорин // Материалы .ХП Межд. научн. студ. конф. «Студент и научн.-техн. прогресс», 24 - 27 апреля 2003 г., Новосибирск. - 2003. - С. 101

8. Биокаталитические системы для ацилирования бетулина / О. Г. Полушкина, Е. В. Комлева, Д. В. Митрофанов, Н. И. Петухова, В. В. Зорин // Материалы 54 научн.-техн. конф. студ., асп. и мол.ученых, Уфа, 1 -10апреля2003 г.-2003.-С. 140-141

9. Новые биокатализаторы для региоселектавного окисления тритерпеноиов / А. Н. Сюндюков, Ю. Р. Рахматуллина, Д. В. Митрофанов, Н. И. Петухова, В. В. Зорин // Там же. - С. 134

10. Региоселективное окисление бетулина микроорганизмами в двухфазных системах / Ю. Р, Рахматуллина, Д.В. Митрофанов, Н.И. Петухова, В.В. Зорин. Н Там же. -С. 139

11. Биокаталитический метод получения бетулиновой кислоты / Д. В. Митрофанов, Н, И. Петухова, О. Б. Флехтер, Ф. 3. Галин, В. В. Зорин // Материалы 4 Всеросс. шк.-семинара «Проблемы создания новых лекарственных средств». - Изд. «Гилем», Уфа.- 2003.- С. 101

12. Микробиологическое окисление бетулина в хлороформе / Д. В. Митрофанов, Н. И. Петухова, О. Б. Флехтер, Ф. 3. Галин, В. В. Зорин // Материалы II Всеросс. научн. Интернет-конф. «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем», 15-31 декабря 2003 г., Уфа. -

2003.- С. 63

13. Синтез бетулиновой кислоты трансформацией бетулина в хлороформе с помощью тандема биокатализаторов / Д. В. Митрофанов, Н. И. Петухова, Ф. 3. Галин, О Б. Флехтер, В. В. Зорин // Там же.- С. 65

Соискатель Л®- Митрофанов

л к

•1

/ 4

»

Формат 60x84/16 Тираж 100. Подписано к печати 19.05.200Ьг. Печать офсетная Услпл } (X). Заказ

Издате н,стно КГСХА/420015 г Казань, ул К Маркса д 65 Лицензия на иэч.'пси.скую деятельность код 221 ИД Кг06342 от 28 П 20011 Отпечатано в типографии КГСХЛ 420015 г Казань, ул К Маркса, д 65 Казанская юс\ дарственная (.ельскочозяйсп псиная академия

05-12117

РНБ Русский фонд

2006-4 5573

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Митрофанов, Дмитрий Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Введение

1.2 Биологическая активность бетулиновой кислоты и ее 11 производных

1.3 Распространение, биосинтез и получение бетулиновой кислоты

1.4 Потенциал микроорганизмов как катализаторов процессов 26 получения бетулиновой кислоты из бетулина

1.5 Особенности трансформации органических соединений с 33 применением клеточных катализаторов

1.6 Направленная трансформация тритерпеноидных соединений 40 Заключение 50 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследований

2.2 Материалы и реагенты

2.3 Методы исследования

2.3.1 Культивирование микроорганизмов

2.3.2 Получение накопительных культур

2.3.3 Выделение чистых культур микроорганизмов

2.3.4 Идентификация микроорганизмов

2.3.5 Исследование окислительной способности микроорганизмов

2.3.6 Определение концентрации биомассы

2.3.7 Трансформация тритерпеноидов покоящимися клетками микроорганизмов

2.3.8 Выделение продуктов трансформации

2.3.9 Трансформация бетулина покоящимися клетками 56 микроорганизмов в хлороформе

2.3.10 Трансформация бетулина покоящимися клетками 57 микроорганизмов в системе 0,05 М фосфатный буфер (рН=7,0) -хлороформ

2.3.11 Трансформация бетулина покоящимися клетками 58 микроорганизмов в системе 0,05 М фосфатный буфер (рН=5,5) -хлороформ в соотношении (97:3) с циклическими спиртами и циклогексаноном

2.3.12 Трансформация в анаэробных условиях

2.3.13 Гидролиз 3 - О - ацетилбетулина

2.3.14 Ацилирование бетулина

2.3.15 Получение бетулиновой кислоты тандемом 60 микроорганизмов

2.3.16 Трансформация бетулина покоящимися клетками 60 микроорганизмов в системе 0,05 М фосфатный буфер - ацетон

2.3.17 Трансформация бетулина в ростовых условиях

2.3.18 Идентификация субстрата и продуктов трансформации

2.3.19 Определение концентрации субстрата и продуктов 62 трансформации

3. РЕЗЕЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1 Разработка метода скрининга микроорганизмов, 63 окисляющих бетулин в бетулиновую кислоту

3.1.1 Поиск штаммов - активных окислителей оксиметильных 63 групп в карбокисльные группы среди музейных микроорганизмов

3.1.2 Исследование влияния бетулина на окисление этанола 65 микроорганизмами

3.1.3 Исследование трансформации бетулина микроорганизмами

3.1.4 Исследование влияния ацетона на трансформацию бетулина 69 штаммом Т

3.1.5 Исследование влияния этанола и бетулина, вводимых в 72 ростовую среду, на окислительные свойства штамма Т

3.2 Скрининг микроорганизмов-трансформаторов бетулина в 74 бетулиновую кислоту среди почвенной микрофлоры

3.3 Исследование продуктов окисления бетулина 76 микроорганизмами

3.4 Исследование трансформации бетулоновой кислоты 82 микроорганизмами

3.5 Исследование микробиологической трансформации 84 бетулина в хлороформе

3.6 Исследование трансформации З-О-ацетилбетулина 86 обводненной биомассой штаммов НС-231, НС-331 и Диз 12 в хлороформе

3.7 Разработка стадии ацилирования бетулина

3.8 Синтез бетулиновой кислоты трансформацией бетулина с 94 помощью тандема биокатализаторов

3.9 Исследование трансформации бетулина региоселективными 96 штаммами в двухфазных системах: буфер (рН=7,0) - хлороформ

3.10 Исследование влияния рН буфера на трансформацию бетулина в двухфазной системе с 50 %-ным содержанием хлороформа

3.11 Исследование трансформации бетулина штаммами НС-231, 100 НС-313, У3-26, Н-43 в кислых условиях

3.12 Поиск способов интенсификации трансформации 102 бетулина в бетулиновую кислоту штаммом НС

3.13 Поиск способов интенсификации синтеза бетулиновой 103 кислоты микробиологическим окислением бетулина штаммом Н

3.14 Исследование трансформации бетулина в 108 бетулиновую кислоту штаммом 1-4-1 в ростовой среде

3.15 Исследование основных таксономических и патогенных 111 свойств перспективных микроорганизмов - окислителей бетулина

3.16 Принципиальные технологические схемы получения 112 бетулиновой кислоты трансформацией бетулина с помощью микроорганизмов

3.16.1 Принципиальная схема получения бетулиновой кислоты с 112 помощью Mycobacterium sp. 1 -4

3.16.2 Принципиальная схема получения бетулиновой кислоты с 117 помощью Pseudomonas sp. Н

3.16.3 Принципиальная схема получения бетулиновой кислоты с 122 помощью тандема биокатализаторов

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка биокаталитических методов получения бетулиновой кислоты из бетулина"

Актуальность работы. Бетулиновая (ЗР~гидрокси-20(29)-лупаен-28-овая) кислота, тритерпеноид лупановой природы, является перспективным противораковым средством, индуцирующим апоптоз (програмированную гибель клеток) в злокачественных меланомах, опухолях мозга и ряда других видов рака. Благодаря своей высокой специфичности в отношении раковых клеток, это соединение, в отличие от других противораковых препаратов, не оказывает токсического действия на здоровые клетки человека. На основе бетули-новой кислоты путем ее химической или микробиологической трансформации могут быть получены еще более эффективные противоопухолевые агенты, а также соединения, проявляющие высокую анти-ВИЧ активность в области наномолярных концентраций.

Бетулиновая кислота обнаружена во многих растениях, но низкое содержание делает нерентабельным ее производство выделением из растительного сырья. В то же время в коре белоствольных берез рода Betula, являющейся многотоннажным отходом лесохимических производств и деревообрабатывающих комбинатов, в больших количествах (до 35 %) содержится биосинтетический предшественник этого соединения - бетулин, Зр-гидрокси-20(29)-лупаен-28-ол. Это делает перспективным синтетический путь получения бетулиновой кислоты региоселективным окислением бету-лина. Однако эту задачу на сегодняшний день не удалось решить химическими методами из-за отсутствия региоселективных окислителей, способных избирательно окислять оксиметильную группу при С17, не затрагивая 3-гидрокигруппу бетулина.

Известные химические методы, основанные на нерегиоселективном окислении бетулина, требуют либо последующего энантиоселективного восстановления 3-кетогруппы в Зр-оксигруппу, что также является весьма сложной задачей, либо предусматривают предварительную защиту исходной Зр-оксигруппы бетулина ацетильной группой, которую также невозможно осуществить региоселективно. Отсутствие региоселективности и, как следствие многостадийность процесса, а также использование дорогостоящих реагентов, токсичных для окружающей среды или запрещенных для производства медицинских препаратов, ограничивают использование таких методов в промышленном производстве бетулиновой кислоты.

Перспективным подходом в решении проблем регио- и энантиоселек-тивного синтеза органических соединений является использование методов биотрансформации с применением ферментов и клеток микроорганизмов, которые могут осуществляться в мягких, экологически безопасных условиях. Такие методы уже используются в промышленном производстве стероидов, также относящихся к классу тритерпеноидных соединений, однако для трансформации бетулина в бетулиновую кислоту они еще не применялись.

Вместе с тем, способность биокатализаторов осуществлять региоселек-тивное ацилирование и окисление различных диолов и полиолов, а также энантиоселективное восстановление карбонилсодержащих органических соединений хорошо известна. В связи с этим актуальным является поиск биокатализаторов и разработка на их основе методов получения бетулиновой кислоты из бетулина.

Цель исследования. Целью работы являлась разработка биокаталитических систем и методов получения бетулиновой кислоты биотрансформацией бетулина. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• осуществить скрининг микроорганизмов, способных трансформировать бетулин в бетулиновую кислоту;

• разработать методы получения бетулиновой кислоты с помощью найденных микроорганизмов;

• исследовать основные свойства перспективных штаммов с целью их предварительной идентификации;

• найти методы интенсификации перспективных процессов. Диссертационная работа выполнена в соответствии с Федеральной целевой программой «Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки в 2002 - 2006 гг.» (2003 г.) и программой «Химия и химические технологии» Академии наук Республики Башкортостан (2001 - 2003 гг).

Научная новизна. Впервые выделены и идентифицированы микроорганизмы, способные окислять бетулин в бетулиновую кислоту (Pseudomonas sp. Н-43, Pseudomonas sp. НС-231, Mycobacterium sp. 1-4-1, Bacillus sp. Диз-12). Впервые предложены методы получения бетулиновой кислоты региоселктивным окислением из бетулина с помощью биокатализаторов на основе клеток микроорганизмов, в водной среде, органическом растворителе и двухфазных системах. Показано, что региоселективность окисления субстрата микроорганизмами и выход целевого продукта существенно зависят от природы растворителя и кислотности реакционной смеси, условий выращивания биомассы.

Впервые выявлена способность микроорганизмов гидролизовать З-О-ацетилбетулин, ацетилировать бетулин и восстанавливать бетулоновую кислоту. Найдены штаммы Pseudomonas sp. НС-231 и Pseudomonas sp. НСВ-29, региоселективно ацетилирующие 3-гидроксигруппу бетулина. Впервые предложен однореакторный метод получения бетулиновой кислоты из бетулина с помощью тандема биокатализаторов.

Практическое значение. Разработаны методы скрининга микроорганизмов, способных трансформировать бетулин в бетулиновую кислоту, а также региоселективно ацетилировать бетулин. Создана коллекция культур микроорганизмов, транформирующих тритерпеноиды лупановой природы (бетулин, бетулиновую и бетулоновую кислоты). Осуществлен однореакторный трехста-дийный синтез бетулиновой кислоты из бетулина с помощью тандема биокатализаторов Pseudomonas sp. Н-43 и Bacillus sp. Диз-12, обеспечивающий выход целевого продукта на уровне 65 % за 50 ч. Разработаны одностадийные биокаталитические методы региоселективного окисления бетулина, позволяющие получать в течение 6 часов бетулиновую кислоту с выходом 38 % и бетулиновый альдегид с выходом 56 % с помощью штамма Pseudomonas sp. Н-43 в покоящихся условиях или 45 - 50 % кислоты за 24 - 36 ч с помощью штамма Mycobacterium sp. 1-4-1 в ростовых условиях.

Результаты научных исследований легли в основу создания новых лабораторных работ и используются в учебном процессе подготовки специалистов по специальности «Биотехнология».

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на I международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» Москва, 2002 г.; XXXIX и XLI Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2001, 2003); 53 и 54 Научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых УГНТУ (Уфа, 2002, 2003); I и II Всероссийской научной Internet-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био-и органической химии и механики многофазных систем» (Уфа, 2002, 2003); IV-ом Всероссийском научном семинаре и молодежной научной школе «Химия и медицина» г. Уфа, 2003 г.

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 13 работ. Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 201 ссылку. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка и 12 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Митрофанов, Дмитрий Владимирович

1.7 Заключение

Было показано, что поиск легко доступного и эффективного противоракового агента избирательного действия по-прежнему является весьма актуальной задачей. Тритерпеноид лупановой группы - бетулиновая кислота хотя и обладает избирательной активностью, в отличие от многих препаратов, однако не является легкодоступным соединением. Это соединение широко распространено в растительном мире, но ее выделение является экономически не целесообразным из-за низкого содержания. Разработанные химические способы получения бетулиновой кислоты из доступного предшественника - бетулина являются многостадийными и трудоемкими, в связи с отсутствием региоселективного окислителя, позволяющего осуществлять одностадийный синтез.

Альтернативным путем получения бетулиновой кислоты может служить биокаталитическое превращение бетулина с помощью ферментов или клеток микроорганизмов.

В связи с этим в обзоре рассматривался биокаталитический потенциал микроорганизмов в отношении ряда веществ, трансформация которых имеет регио- или энантионаправленность. Большее внимание было уделено процессам биокаталитического окисления субстратов. Было показано, что предпочтение при этом отдается технологии, использующей целые клетки микроорганизмов, позволяющих, благодаря сохранению в клетках метаболических процессов практически в нативном состоянии, осуществлять регенерацию коферментов, что обуславливает повышенную эффективность и стабильность процесса. Но эта технология биокатализа имеет ряд недостатков, наибольшую трудность среди которых вызывают такие факторы, как возможность проявление каталитической активности со стороны суммы ферментов, приводящее к политрансформациям субстрата или снижению регио- и энантиоспецифичности, возможность необратимой адсорбции значительных количеств трансформируемых веществ или продуктов микроорганизмами.

Для проведение контролируемой направленной биотрансформации субстрата с максимально возможной каталитической активностью, высокой регио- и стереоспецифичностью и с преимущественным накоплением целевого продукта, были рассмотрены существующие подходы, могущие стать инструментом, позволяющим достигнуть высокого уровня управления процессом биотрансформации.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследований

Объектом исследования служили штаммы микроорганизмов, выделенные из почвенных образцов отобранных на территории деревообрабатывающих предприятий, лесопарковой зоны г. Уфы, в сельских районах и лесных массивах республики Башкортостан и из районов нефтяных месторождений Башкортостана и Тюменской области, а также штаммов, содержащихся в музее кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ.

2.2 Материалы и реагенты

Материалами исследования были тритерпеноиды лупанового ряда -бетулин, бетулиновая и бетулоновая кислоты, лупеол, З-О-ацетилбетулина, бетулиновый и бетулоновой альдегиды. Перечисленные вещества были получены в лаборатории природных соединений ИОХ УНЦ РАН (г. Уфа).

В таблице 1 представлены физические свойства некоторых тритерпеноидов, используемых при исследовании.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Митрофанов, Дмитрий Владимирович, Казань

1. Zuco v., Supino R., Righetti S.C, Cleris L., Marchesi E., Gambacorti- Passerini C , Formelli F. Selectiv cytotoxicity of betulinic acid on tumor cell lines, but not on normal cells // Cancer Lett.- 2002.- V. 175, 1 . -P. 17 - 25

2. Udeani G.O., Zhao G.M., Geun Shin Y, Cooke B.P., Graham J., Beecher C.W., Kinghom A.D., Pezzuto J.M. Pharmacokinetics and tissue distribution of betulinic acid in CD-I mice// Biopharm Dmg Dispos. - 1999.- V. 20.- 8.- P. 379 -83.

3. Fulda S, Debatin K.M. Betulinic acid induces apoptosis through a direct effect on mitochondria in neuroectodermal tumors // Med. Pediatr. Oncol. - 2000.- V. 35.-6.-P. 616-618

4. Chatterjee P., Kouzi S.A., Pezzuto J.M., Hamann M.T. Biotransformations of the Antimelanoma Agent Betulinic Acid be Bacillus megaterium ATCC 13368 // Appl. Environ. Microbiol.- 2000.- V. 66.- P. 3850 - 3855

5. Jaggi M. Betulinic acid derivatives having antiangiogenic activity, processes for producing such derivatives and their use for treating tumor associated angio-genesis // United states patent 6403816. - 6 P.

6. Fulda S., Jeremias I., Steinier H.H., Pietsch Т., Debatin K.M. Betulinic acid: a new cytotoxic agent against malignant brain-tumor cells // Int. J. Cancer.- 1999.-V. 82.-3.-P. 435-441

7. Kim R., Tanabe K., Uchida Y., Manabu E., Inoue H., Toge T. Current status of the molecular mechanisms of anticancer drug-induced apoptosis // Cancer Chemoterapy and Pharmacology.- 2002.- P. 1-18

8. Debatin K-M. Cell death in T- and B-cell development // Ann Hematol.- 2001.-80.-P. 29 -31

9. Marks F., Boukamp P. Signal trunsduction and mechanisms of cell death // J. Cancer Res. Clin. Oncol.- 1997.- 123.- P. 522 -526

10. Самуилов В. Д., Олескин А.В., Лагунова Е.М. Программируемая клеточная смерть // каф. Клеточной физиологии и иммунологии, Биофак МГУ. - С . 24.

11. Nunes G., Benedict М.А., Ни Y., Inohara N. Caspases: The proteases of apoptotic pathway // Oncogen.- 1998.- V.17.- P. 3237 - 3245

12. Galgon Т., Reimschneider S., Wohlrab W. Betulinic acid as an apoptosis iducer in HaCaT cells cultures // Biochemica.- 2000.- 3.- P. 22 - 24

13. Fulda S., Susin S.A., Kroemer G., Debatin K.M. Molecular ordering of apoptosis induced by anticacer drugs in neuroblastoma cells // Cancer Res.-1998.- V. 58.- 19 .- P. 4453 - 4460

14. Fulda S., Scaffidi C , Susin S.A., Krammer P.H., Kroemer G., Peter M.E., Debatin K.M. Activation of mitochondria and release of mitochondrial apopto-genic factors by betulinic acid // J. Biol. Chem.- 1998.- V. 273.- 51.- P. 33942 -33948

15. Wick W., Grimmel., Wagenknecht В., Dichgans J., Weller M. Betulinic acid-induced apoptosis in glioma cells // J. Pharmcol. Exp. Ther.- 1999.- V. 289.-P. 1306-1312

16. Hata К, Hori К, Takahashi S, Differentiation- and apoptosis-inducing activities by pentacyclic triteфenes on a mouse melanoma cell line. J Nat Prod. 2002.-V.65.-5.-P. 645-648.

17. Kim DS, Pezzuto JM, Pisha E, Synthesis of betulinic acid derivatives with activity against human melanoma// Bioorg Med Chem Lett.- 1998.- V. 7.- 13.-P.1707-1712

18. Kouzi S.A., Chatterjee P., Pezzuto J.M., Hamann M.T. Microbial Transfonnations of the Antimelanoma Agent Betulinic Acid // J. Nat. Prod. -2000. - V.63, 12. - P.1653 - 1657

20. Choi Y-H. Planta Medica // - 1988.-V. 47.- P. 511-513

21. Romados S. Use of betulinic acid and its derivatives for inhibiting cancer growth // United states patent 6214814. - 6 P.

22. Romados S. Use of betulinic acid and its derivatives for inhibiting cancer growth and a method of monitoring this // United states patent 6048847/ - 6 P.

23. Ji Z.N., Ye W.C., Liu G.G., Hsiao W.L. 23-Hydroxybetulinic acid-mediated apoptosis is accompanied by decreases in bcl-2 expression and telomerase activity in HL-60 cells // Life Sci.- 2002.- V. 72. - 1.- P. 1- 9

24. Jaggi M. Antiangiogenic activity of betulinic acid and its derivatives // United states patent 6228850. - 7 P.

25. Melzig MF, Bormann H. Betulinic acid inhibits aminopeptidase N activity // Planta Med.- 1998.- 64. - 7.- 655-657

26. Kashiwada, Y., F. Hashimoto, L. M. Cosentino, С H. Chen, P. E. Garrett, and K. H. Lee. 1996. Betulinic acid and dihydrobetulinic acid derivatives as potent anti-HIV agents// J. Med. Chem. - V.39. - P. 1016 - 1017.

27. Sun, I. C , H. K. Wang, Y. Kashiwada, J. K. Shen, L. M. Cosentino, С H. Chen, L. M. Yang, and K. H. Lee. Synthesis and structure-activity relationships of betulin derivatives as anti-HIV agents// J. Med. Chem. - 1998. - V.41. -P.4648 -4657

29. Pengsuparp, Т., L. Cai, H. H. S. Fong, A. D. Kinghom, J. M. Pezzuto, M. Wani, and M. E. Wall. Pentacyclic 1п1ефепе8 derived from Maprounea africana are potent inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase// J. Nat. Prod. - 1994. - V.57. -P.415-418

30. De Clercq E. Highlights in the development of new antivirol agents // Mini Rev. Med. Chem. - 2002. - V. 2. - 2.- P. 163 - 175

31. Phenix B.N., Cooper C , Owen C , Badley A.D. Modulation of apoptosis by HIV protease inhibitors // Apoptosis.- 2002.- V. 7.- P. 295 - 312

32. Richards A.D., Roberts R., Dunn B.M., Graves M.C., Kay J. Effective bloking of lIiv-1 proteinase activity by characteristic inhibitors of aspartic proteinases // FEBS lett.- 1989.- V.247. -P.l 13 - 117

33. Loeb D.D., Hutchinson C.A., Edgell M.H/. Farmerie W.G., Swanstrom R. Mutantional analysis of human immunodeficiency virus tipe 1 protease suggests functional homology with aspartic proteinases // J Virol.- 1989.- V.63.- P.l 11 -

34. Xu, H. X., F. Q. Zeng, M. Wan, and K. Y. Sim. Anti-HIV 1п1ефепе acids from Geum japonicum// J. Nat. Prod. - 1996. - V.59. - P.643 - 645.

35. Enwerem N.M., Okogun J.L, Wambebe CO., Okorie D.A., Akah P.A. Anthelmintic activity of the stem bark extracts of Berlina grandiflora and one of its active principles, betulinic asid // Phytomedicine.- 2001.- V. 8. - 2.- P. 112 —

36. Steele J.C, Warhurst D.C., Kirby G.C., Simmonds M.S. In vitro and in vivo evaluation of betulinic acid as an antimalarial // Phytother. Res.- 1999.- V. 13. -2.-P. 115-119

37. Matsumoto K., Tsuruoka H., Fujiwara N., Nishimori Y., Kenjo Y. Photoaging inhibitor and skin-care preparation //U.S. Patent: 6,207,711.- 2001

38. Pinzaru S.C, Leopold N., Kiefer W. Vibrational spectroscopy of betulinic acid HIV inhibitor and of its birch natural sours // Talanta.- 2002.- V. 57.- P. 625 - 6 3 1 .

39. Chandramu C, Manohar R.D., Krupadanam D.G., Dashavantha R.V. Isolation, characterization and biological activity of betulinic acid and ursolic acid from Vitex negundo L. // Phytother Res.- 2003.- V. 17. - 2.- P. 129 - 134

40. Siddiqui S., Siddiqui В., Shaheen N.A. Begun S. Pentacyclic triteфenoids from the leaves of Plumeria obtisa // Phytochemistry.- 1989.- V. 28.- P. 3143 -3147

41. Majumber R.L., Lahiri S. Chemical constituents of the orchid Lusia indivisa // Indian J. Chem. «B».- 1989.- V.28.- P. 771 - 774

42. Prakash C.V.S., Schilling J.K., Jonson R.K., Kingston D.G. New cytotoxic lupan triteфenoids from the twigs of Coussarea paniculata // J. Nat. Prod.-2003.-V. 66 . -3 . -P .419-422

43. Maurya S.K., Devi S., Panday V.B., Khosa R.I. Content of betulin and betulinic acid, antitumor agent Ziziphus species II Fitoterapia.- 1989.- V. 60.- P. 468-469

44. Kundu A.B., Barik B.R., Mondal D.N., Dey A.K., Baneryi A. Zizibernic acid a pentacyclic triteфenoid of Ziziphus jujuba // Phytochemistry.- 1989.- V. 28.-P. 3155-3158

45. Enverem N.M., Okogun J.I., Wambebe CO., Okorie D.A., Akah P.A. Anthelmintic activity of the Berlina grandiflora and one of its active principles, betulinic acid // Phytomedicine.- 2001.- V. 8. - 2.- P. 112 - 114

46. Матюхина Л.Г., Шмуклер B.C., Рябинин A.A. Тритерпеноиды коры Al- nus subcordata C.A.M. //ЖОХ.- 1965.- T. 35, в. 3.- 579 - 580

47. McCaskill D., Croteau R. Some caveats for bioengineering teфenoid metabolism in plants // TIBTECH.- 1998.- V.16.- P. 349 - 355

48. Hayek E.W.H., Jordis U., Moche W., Sauter F. A bicentennial of betulin // Phytochemistry.- 1989.- V. 28. - 9.- P. 2229 - 2242

49. Shibuya M., Zhang H., Endo A., Shishikura K., Kushiro Т., Ebizuka Y. Two branches of the lupeol synthase gene in the molecular evolution of plant oxi-dosqualene cyclases // Eur. J. Biochem.- 1999.- V. 266. - P. 302-307

50. Eckerman C , Ekman R, Comparison of solvents for extraction and crystallization of betulinol from birch bark waste // Paperri ja Pun.- Pap. Och Tra.-1985.-V.3.-P. 100- 106

51. Kushiro Т., Shibuya M., Ebizuka Y. P-Amyrin synthase. Cloning of oxi- dosqualene cyclase that catalyzes the formation of the most popular triteфene among higher plants // Eur. J. Biochem.- 1998.- V. 256.- P. 238 - 244

52. Haralampidis K., Bryan G., Qi X., Papadopoulou K., Bakht S., Melton R., Osboum A. A new class of oxidosqualene cyclases directs synthesis of antimicrobial phytoprotectants in monocots // PNAS.- 2001.- V.98.- P. 13431-13436

53. Похило Н.Д., Махнев A.К,, Деменкова Л.И., Уварова Н.И. Состав три- терпеноидной фракции экстрактов внешней коры Betula pendula и Betila pubescens // Химия древесины.- 1990.- 6.- 74 - 77

54. Бромштейн А.Л., Лобанова Л.В,, Векслер Т.Е. Разработка отечественных противоопухолевых препаратов на основе биологически активных веществ сульфатного мыла // Тезисы докл. «Лесохимия и орг. синтез».-1994.- Сыктывкар

55. Семенов А.А. Очерк химии природных соединений. Новосибирск: Наука. Сибирская издательская фирма РАН.- 2000. - 664 с.

56. Рощин В. И. Способ получения бетулина // Патент РФ 2184120. - 2001. - 4 С .

58. Нигматуллина Л.P. Синтез новых физиологически активных веществ на основе тритерпеноидов лупанового ряда.- Диссертация на соиск. уч. степени канд. хим. наук.- Уфа, 2002

59. Ruzicka L., Lamberton А.Н. Oxidation of betulin monoacetate with chromium trioxide to acid products // Helv. Chim. Acta.- 1938.- V. 21.- P. 1706 -1717

60. Yao-Chang Xu // J. Org. Chem.- 1996.- V. 61.- P. 9086 - 9089

61. Krasutsky P. A. et. al. Methods for manufacturing betulunic acid // U. S. Pat. No. 6,407,270. - 2002. - 13 P.

62. Krasutsky P. A. et. al. Methods for manufacturing betulunic acid // U. S. Pat. No. 6,232,481 Bl. - 2001. - 7P.

63. Krasutsky P. A. Methods for manufacturing betulunic acid // U. S. Pat. No. US2002/0016482A1.- 2002. - 7 P.

64. Krasutsky P. A. et. al. Methods for manufacturing betulunic acid // U. S. Pat. No. 6,271,405.-2001.-3P.

65. Pezzutto J.M., Kim D.S.H.L. Methods of manufacturing betulinic acid. U. S. Pat. No. 5.804.575. - 1998. - 6 P.

66. UIoH Л.Б., Каплун А.П., Шпилевский A.A., Андия-Правдивый Ю.Э., Алексеева В.Б., Григорьев В.Б., Швец В.И. Синтез бетулиновой кислоты из бетулина и исследование ее солюбилизации с помощью липосом // Орг. химия." 1998.- Т. 24. - 10.- 787 - 793

67. Kim D.S.H.L., Chen Z., Van Tuyen N., Pezzuto J.M., Qiu S., Lu Z.-Z. A concise semi-synthetic approach to the betulinic acid from betulin // Synth. Commun.- 1997.- V. 27. - 9.- P. 1607 -1612

68. Faber K. Biotransformations in Organic Chemistry. Springer, Berlin.- 1997.- 402 p.

69. Santaniello E., Ferraboschi P., Grisenti P., Manzocchi A. The biocatalytic approach to the preparation of enantiomerically pure chiral building blocks // Chem. Rev. - 1992.- V. 92.- P. 1071 - 1140

70. Зорин B.B., Петухова Н.И., Халимова Л.Х. Регио- и стереоселективная биотрансформация органических соединений // Панорама современной химии России. Современный органический синтез: Сб. обзорных статей.-М.: Химия, 2003.-С. 439 - 462

72. Faber K., Patel R. Chemical biotechnology. A happy marriage between chemistry and biotechnology: asymmetric synthesis via green chemistry // Curr. Opion Biotechnol.- 2000.- V. 11. - 5.- P. 517 - 519

73. Rozzell J.D. Commercial scale biocatalysis: myths and realities // Bioorg. Med. Chem.- 1999.- V. 7.- P. 2253 - 2261

74. Ohara S., Ohira T. Plant growth regulation effects of triteфenoid saponins // J. Wood Sci.- 2003.- V.43.- P,59 - 64

75. Chatterjee P., Pezzuto J.M., Kouzi S.A. Glicosidation of betulinic acid by Cunninghamella species // J, Nat.Prod.- 1999.- V.62.- P.761 - 763

76. Riva S, Biocatalytic modification of natural products // Curr. Opin. Chem. Biol,-2001.-V. 5.-P. 106-111

77. Watanabe Y., Minemoto Y., Adachi S., Nakanishi K., Shimada Y,, Matsuno R. Lipase-catalyzed synthesis of 6-0-eicosapentaenoyl L-ascorbate in acetone and its autoxidation. // Biotechnol.Lett. - 2000. - V.22. - P. 637-640

78. King J.W., Shyder J,M,, Frykman H., Neese A. Sterol ester production using lipase-catalyzed reactions in supercritical carbon dioxide // Eur. Food Res. Technol.- 2001,- V. 212,- P. 566 - 569

79. Mozhaev V.V., Budde C.L., Rich J.O., Usyatinsky A.Y., Michels P.C., KJimelnitsky Y.L., Clark D.S., Dordick J.S. Regioselective enzymatic acylation as a tool for producing solution-phase combinatorial labraries // Tetrahedron.-1998.-К 54.-P. 3971-3982

80. Parve O., Jarving I., Martin I., Metsala A., Vallikivi I., Aidnik M., Pehk Т., Samel N. Lipase-catalysed acylation of prostanoids // Bioorg. Med. Chem. Lett.-1999.-V, 9,-P. 1853-1858

81. Ferrero M., Gotor V. Chemoenzymatic transformation in nucleoside chemistry // Monatshefte fur Chemie,- 2000,- V. 131,- P. 585 - 616

82. Yu В., Xing G., Huia Y,, Hanb X. Lipase-catalyzed regioselective acylation of diosgenyl saponins // Tetrahedron Letters. - 2001.- V. 42. - P. 5513 -5516

83. Khmelnitsky Y.L., Budde C , Arnold J.M., Usyatinsky A., Clark D.S., Dordick J.S. Synthesis of water-soluble paclitaxel derivatives by enzymatic acylation // J. Am. Chem. Soc. - 1997. - V.l 19. - P. 11554

84. Patel R.N., Banerjee A., Nanduri V. Enzymatic acetylation of 10- deacetylbaccatin III to baccatin III by C-10 deacetylase from Nocardioides lu-teus SC 13913 // Enzyme Microbial. Technol.- 2000. - V.27. - P. 371 - 375

85. Мубараков A.M., Хабибуллина И.И., Петухова Н.И., Зорин В.В. Синтез эфиров гераниола в присутствии клеток микроорганизмов // Башкирский хим. журн.- 2002.- Т. 10. - 1.- 56 - 57

86. Nakamura К. Highly stereoselective reduction of ketones by Geotrichum candidum/ZJ.Mol. Cat. B: Enzymatic- 1998.-V. 5.-P. 129-132

87. Hummel W. Large-scale applications of NAD(P)-dependent oxidoreduc- tases: recent developments // TIBTECH.- 1999.- V.17.- P. 487 - 492

88. Quiros M., Rebolledo F., Gotor V. Bioreduction of 2 -oxocyclo- pentanecarboxamides: syntheses of optically active 2-aminomethyl- and 2-amino-cyclopentanols // Tetrahedron:Asymmetry.- 1999.- V. 10.- P. 473 - 486

89. Chartrain M., Greasham R., Moore J., Reider P., Robinson D., Buckland B. Asymmetric bioreductions: application to the syntesis of pharmaceuticals // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. - 2001. - V. 11. - P. 503 - 512

90. Van Dik M.S., van Rensburg E., Rensburg I.P.B., Moleleki N. Biotransformation of monoteфenoid ketones by yeasts and yeast-like fungi // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. - 1998. - V. 5. - P. 149 - 154

91. Ахрем A. A., Титов Ю. A. Стероиды и микроорганизмы. М.: «Наука». 1970.-526 с.

92. Скрябин Г. К., Головлева Л. А. Использование микроорганизмов в органическом синтезе. М.: «Наука», 1976. - 335 с.

93. Луста К.А., Решетилов А.Н. Физиолого-биохимические особенности Gluconobacter oxydans и перспективы использования в биотехнологии и биосенсорных системах // Прикл. биохим. и микробиол.- 1998.- Т. 34. - 4.-С. 339-353

94. Romano А., Gandolfi R., Nitti P., Rollini М., Molinari F. Acetic acid bacteria as enantioselective biocatalysts // J. Mol Cat B: Enzym.- 2002.- V.17.- P. 235-240

95. Семина И.Г., Беляева М.И. Микробиологическая трансформация а-хлоргидрина глицерина в соокислительных условиях // Микробиология.-1996.-Т. 65. -6 . -C. 796-800

96. Deppenmeier U., Hoffmeister М., Prust Biochemistry and biotechno- iogical applications of Gluconobacter streins // Appl. Microbiol. Biotechnol.-2002.-P. 1-18

97. Dinarieva Т., Netrusov A. Lactic acid formation by free immobilized cells of an obligate methilotroph // Biotechnol. Prog. - 1991. - V.7. - P. 234 - 236

98. Sakai Y., Tani Y., Kato N. Biotechnological application of cellular functions of the methylotrophic yeast // // J. Mol Cat B: Enzym. - 1999. - V.6. - P. 161-173

99. Shigeno Т., Katayama A., Nakahara T. Production of (S)-(+)-3- hydroxybutyric acid from 1,3-butanediol by resting cells of yeast // Biosci. Biotech. Biochem. - 1992. - V. 56. - 2. - P. 320 - 323

100. Perez H.I., Luna H., Maldonado L.A., Sandoval H., Manjarrez N., Solis Aida., Sanchez R. Oxydation of substituted benzyl alcohols to carboxylic acids by Nocardia corallina B-276 // Biotechnol. Lett. - 1998. - V.20. - P. 77 - 79

101. Adachi О., Moonmangmee D., Toyama H., Yamada M., Shinagawa E., Matsushita K. New developments in oxidative fermentation // Appl Microbiol Biotechnol. - 2003. - V. 60. - P. 643 - 653

102. Hancock R.D., Viola R. The use of microorganisms for L-ascorbic acid production: current status and future perspectives // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2001. - V.56. - P. 567 - 576

103. Matsushita K., Toyama H., Yamada M., Adachi O. Quinoproteins: structure, function, and biotechnological applications // Appl Microbiol Biotechnol. -2002.-V. 58 . -P . 13-22

104. Thumer C , Vela C , Thony-Meyer L., Meile L., Teuber M. Biochemical and genetic characterization of the acetaldehyde dehydrogenase complex from Acetobacter europaeus // Arch Microbiol. - 1997. - V. 168. - P. 81 - 91

105. Borzeix F., Monot F., Vandecasteele J-P. Bi-enzymatic reaction for alcohol oxidation in organic media: from purified enzymes to cellular systems // Enzym. Microbial. Technol. - 1995. - V. 17. - P. 615 - 622

106. Van der Meer, В., Wieb, Fluidity, Shinitzky, M. Biomembranes - Physical Aspects // VCN Publisher. - P. 98-158.

107. Angelova В., H.-P. Schmauder Lipophilic compounds in biotechnology - interactions with cells and technological problems //Journal of Biotechnology. — 1999. -V.67 . -P . 13-32

108. Егоров H.C. Промышленная микробиология // М.: «Высшая школа». - 1989.-687

109. Elmar L. Kannenberg, Karl Poralla. Hopanoid Biosynthesis and Function in bacteria//Naturwissenschaften. - 1999.- V.86. -P . 168-176

110. Vilchezc С , Llopiz P., Neunlist S., Poralla K., Rohmer M., Prokariotic triteфenoids: new hopanoids from nitrogen-fixing Azotobacter vinelandii, Bei-jerinckia indica and Beijerinckia mobilis // Microbiology. - 1994. - V. 140. -P. 2749-2753.

111. Kannenberg EL., Perzl M., HartnerT. The occurrence of hopanoid lipids in Bradyhrizobium bacteria // FEMS Microbiol Lett. - 1995. - V.127. - P. 255-262.

112. Berry AM, Harriot ОТ, Moreau RA, Osman SF, Benson DR, Jones AD, Hopanoid lipids compose the Frankia vesicle envelope, presumptive barrier of oxygen diffusion to notrogenase // Proc Natl Acad Sci USA. - 1993. - V. 90. -P. 6091-6094.

113. Hermann D, Bisseret P, Connan J, Rohmer M, A nonextractable triteфenoid of the hopane series in Acetobacter xylinum // FEMS Microbiol Lett.- 1996.-V. 135.- P. 323-326.

114. Sahm H., Rohmer M., Bringer-Meyer S.., Sprenger G. A., Welle R. Bio- chemestry and physiology of hopanoids in bacteria // Adv. Microbial Physiol. -1993.-V. 35. -P. 247-273.

115. Holland L. Herbert Recent advances in applied and mechanistic aspects of the enzymatic hydrohylation of steroids by whole-cell biocatalysts // Steroids. -1999.-V. 64.- P. 178-186.

116. Roberts S. M., Wan P.W.H. Enzyme-catalysed Bayer-Villiger oxidation // J. Mol. Cat. B: Enzym.- 1998.- V. 4.- P. 111 - 136

117. Biwer A., Antranikian G., Heinzle E. Enzymatic production of cyclodex- trins // Appl. Microbial. Biotechnol.- 2002.- V. 59.- P. 609 - 617

118. Stewart J.D. Organic transformations catalyzed by engineered yeast cells and related systems // Curr. Opinion Biotechnol.- 2000.- V. 11.- P. 363 - 368

119. Stewart J.D. Dehydrogenases and transaminases in asymmetric synthesis // Curr. Opinion Chem. Biol.- 2001.- V. 11.- P. 363 - 368

120. Nakamura К., Fujii М., Ida Y. Stereoinversion of arylethanols by Geotrichum candidum // Tetrahedron: Asymmetry.- 2001.- V.12.- P. 3147 -3153

121. Goswami A., Mirfakhrae K.D., Patel R.N. Deracemization of racemic 1,2- -^ diol by biocatalytic stereoinversion // Tetrahedron: Asymmetry.- 1999.- V.IO.-P. 4239 - 4244

122. Xie S.-X., Ogawa J., Shimizu S. Production of (R)-3-pentin-2-ol through stereoinversion of racemic 3-pentyn-2-ol by Nocardia fusca AKU 2123 // Appl Microbiol Biotechnol.- 1999.- V. 52.- P. 327 - 331

123. Rols, J. L., Condoret, J. S., Fonade, C , and Goma, G. Mechanism of enhanced oxygen transfer in fermentation using emulsified oxygen vectors // Biotechnol. Bioeng. - 1990. - V. 35. - P. 427-435

124. Jia, S., Li, P., Park, Y. S., and Okabe, M. Enhanced oxygen transfer in tower bioreactor on addition of liquid hydrocarbons // J. Ferment. Bioeng. -1996.- V. 8 2 . - P . 191-193

125. A. Hage, H. E. Schoemacer, J. A. Field. Optimization of stereoselective ketone rection by the white-rot fungus Merulius tremellosus ono991 II Appl. Microbiol. Biothenol. - 2001. - V. 57. - P. 79-84.

126. Flores, М. v., Voget, E., and Ertola, R. J. J. Permeabilization of yeast cells (Kluyveromyces lactis) with organic solvents // Enzyme Microb. Technol. -1994.- V. 16 . -P . 340-346

127. Seip, J. E. and Di Cosimo, R. Optimization of accessible catalase activity in polyacrylamide gel-immobilized Saccharomyces cerevisiae II Biotechnol. Bio-eng. - 1992.- V. 4 0 . - P . 638-642

128. Rao, K. J. and Panda, T. Release of periplasmic penicillin amidase from Escherichia coli by chloroform shock // Bioproc. Eng. - 1996. - V.14. - P. 101-

129. S. S Cameotra, R. S. Makkar Synthesis of biosurfoctants in extreme conditions // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1998. - V. 50. - P. 520 - 529.

130. Guerin, W.F., Jones, G.E. Mineralization of phenanthrene by a Mycobacterium sp. // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - V. 54. - P. 937-944.

131. Chevalier, J., Pommier, M.-T., Cremieux, A., Michel, G. Influence of Tween 80 on the mycolic acid composi-tion of three cutaneous corynebacteria // J. Gen. Microbiol. - 1988. - V. 134. - P. 2457-2461.

132. Marchesi, J.R., White, G.F., House, W.A., Russell, N.J. Bacterial cell hy- drophobicity is modified during the biodegradation of anionic surfactants // FEMS Microbiol. Lett. - 1994. - V. 124. - P. 387-392.

133. Laouar, L., Lowe, K.C., Milligan, B.J. Yeast responses to nonionic surfactants // Enz. Microb. Technol. - 1996. - V. 18. - P. 433-438.

134. Chan, E.G., Kuo, J. Biotransformation of dicarboxylic acid by immobilized Cry'ptococcus cells // Enz. Microb. Technol. - 1997. - V. 20. - P. 585-589.

135. Fiechter, A. Biosurfactants: moving towards industrial application // Trends in Biotechnol. - 1992. - V. 10. - P. 208-217.

136. Rosenberg, E. Exploiting microbial growth on hydrocarbons - new markets // Trends in Biotechnol. - 1993. - V. 11. - P. 419-424.

137. Desay, J.D., Banat, LM. Microbial production of surfactants and their commercial potential // Microbiol. Mol. Biol. Reviews. - 1997. - V. 61. - P. 47-64.

138. Kosaric, N. Biosurfactants - production, properties, applications // 8th Eur. Congr. Biotechnol. Abstract book. - 1997. - P. 245.

139. Kondo E, Masuo E 'Pseudo-crystallofermcntation" of steroid: a new process Ibr preparing perdnisolone by a microorganism // J Gen Appi Microbiol , -1961.-V.7.-P.13-117

140. Spassov G, Kmtzfcldt R. Sheldrick W, Wania W. Vlahov R, Snatzke G Crystallographic monitoring of microbiological steroid transformation // Eur J Appi Microbiol Biotechnol. - 1983. - V. 17. - P. 80-84

141. Ohlson S. Larson P, Mosbach К Steroid transformation by living cells immobilized in calcium alginate // Eur J Appi Microbiol Biotechnol . - 1979. -V .7 . -P . 103-110

142. Plesiat P, Nikaido H. Outer membrane of Gram-negative bacteria are permeable to steroid probes // Mol Microbiol. - 1992. - V. 6. - P. 1323 1333

143. Nikaido Н, Sung-Hou Kirn, Rosenberg YE. Physical organisation of lipids in the cell wall of Mycobacterium chelonaec // Mol Microbiol S. - 1993. - V. -P. 1025 1030

144. Vaara M, Plachy WZ, Nikaido H Partitioning of hydro-phobic probes into lipopolisaccharide bilavers // Biochim Bio-physActa. - V.1024. - P. 152-158

145. Gerben M Zijlstra., Comelis D de Gooijer and Johannes Tramper Extractive bioconversions in aqueous two-phase systems // Current Opinion in Biotechnology 1998.-V. 9 . - P . 171-176

146. Freeman A, Woodley JM, Lilly MD. In situ product removal as a tool for bioprocessing // BioTechnology. - 1993. - V. 11. - P. 1007-1012.

147. Daugulis AJ. Integrated reaction and product recovery in bioreactor systems // Biotechnol Prog. - 1988. - V. 4. - P. 113 - 122.

148. Daugulis AJ Integrated fermentation and recovery processes // Curr Opin Biotechnol.- 1991.-V. 5 . - P . 192-195.

149. J.M.S. Cabral *, M.R. Aires-Barros, H. Pinheiro, D.M.F. Prazeres Biotransformation in organic media by enzymes and whole cells Journal of Biotechnology // 1997. - V. 59. - P. 133-143

150. A. K. Гладилин, A. B. Левашов стабильность ферментов в системах с органическими растворителями // Биохимия . - 1998. - 63. - вып. 3. - 408-421

152. Inoue, A. and Horikoshi, K. Estimation of solvent tolerance of bacteria by solvent parameter log P // J. Perm. Bioeng. - 1991. - V. 3. - P. 194-196

153. Sikkema, J., Weber, F. J., Heipieper, H. J., and de Bont, J. A. M. Cellular toxicity of lipophilic compounds: Mechanisms, implications, and adaptations // Biocatalysis. - 1994. - V. 10. - P. 113-122

154. Lehn J. M., Ourisson G. // Bull. Chim. France. - 1962. - 6. - p. 1133

155. Fujioka Т., Kashiwada Y., Kiluskie R. E., Consentino L. M., Ballas L. M., Jang J. В., Janzen W. P., Chen L. S., Lee K. H. // J. Nat. Prod. - 1994. - V. 57. -P. 243-247

156. Практикум no микробиологии. Под ред. Н.С. Егорова // М.: Изд-во МГУ.- 1976.-306с.

157. Определитель бактерий Берги. Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, Уилльямса // М.: Мир - 1997. - TI - 430 с.,Т2 -800

158. Методы общей бактериологии. Под ред. Ф.Герхардта // М.: Мир. - 1984 - Т.1 - с. 54-57, Т.З - с. 263.

159. Кузнецов СИ., Дубинина Г.А. Методы изучения водных микроорганизмов // М.: Наука. - 1989. - с. 287.

160. Практикум по биохимии. Под ред. СЕ. Северина, Г.А. Соловьева // М.: изд-во МГУ. - 1989. - с.93-96.

161. Кочетов Г.А. Практическое руководство по знзимологии // М:Высш. школа.- 1980.-С. 271.

162. Методы общей бактериологии. Под ред. Ф.Герхардта // М.: Мир. - 1984-Т.2-С. 24-25.

163. Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. Справочник биохимика // М.: Из-во „Мир", 1991. 543 с.

164. А. А. Ахрем, А. И. Кузнецова. Тонкослойная хроматография // М.: «Наука».- 1965.-175 с.

165. Смирнов В. В., Киприанова Е. А. Бактерии рода Pseudomonas // Киев: Наук, думка. - 1990. - 264 с.

166. Van den Ban E.C.D., Willemen H.M., Wassink H., Laane C , Haaker H. Bioreduction of carboxylic acids by Pyrococcus furiosus in batch cultures // En-zym Microbial Technol.- 1999.- V. 25.- P. 251 - 257

167. Hage A., Schoemaker H. E., Field J. A. Reduction of aryl acids by white- rot fungi for the biocatalytic production of aryl aldehydes and alcohols // Appl Microbiol Biotechnol.- 1999.- V. 52.- P. 834 - 838

168. Li Т., Rosazza J.P.N. Biocatalytic Synthesis of Vanillin // Appl Environ Microbiol.- 2000.- V. 66, No. 2.- P. 684 - 687

169. Диксон M., Уэбб Э. Ферменты // Изд-во Мир, 1982ю - в 3-х томах

170. Вейганд-Хильгетаг. Методы эксперимента в органической химии // Изд-во «Химия», М.: 1968.-536 с.

171. Брухман Прикладная биохимия. М.:Легкая и пищевая промыш-сть, 1981.-296 с. V