Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Применение гена Fe-зависимой супероксиддисмутазы для защиты хлоропластов растений томата и табака от окислительного стресса

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Применение гена Fe-зависимой супероксиддисмутазы для защиты хлоропластов растений томата и табака от окислительного стресса"

На правах рукописи

Щ/'

НОДЕЛЬМАН Екатерина Константиновна

ПРИМЕНЕНИЕ ГЕНА Ре-ЗАВИСИМОИ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ХЛОРОПЛАСТОВ РАСТЕНИЙ ТОМАТА И ТАБАКА ОТ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 О ФЕВ 2014

Москва - 2014

005545332

005545332

Работа выполнена в лаборатории клеточной инженерии растений Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук (г. Москва).

Научный руководитель: доктор биологических наук

Петр Николаевич Харченко

Официальные оппоненты: Александр Александрович Соловьев,

доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой генетики и биотехнологии РГАУ МСХА имени К.А. Тимирязева

Галина Николаевна Ралдугина,

кандидат биологических наук, с.н.с. лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации ФГБУН ИФР РАН

Ведущая организация: Национальный исследовательский Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского

Защита состоится « 2 » апреля 2014 г. в « 11 » часов на заседании диссертационного совета Д006.027.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42. Тел. (499)976-65-44, Факс (499)977-09-47; e-mail: iab@iab.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке, ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии. Автореферат размещен <60 ».ШУШЖ014 Г. на сайте www.vniisb.ru

г- /

Автореферат разослан «.О » ffW.{>M/Ztsii£ 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Вера Дмитриевна Вобликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В естественных условиях произрастания растения часто оказываются под действием стрессов, вызываемых засухой, засолением, избыточной освещенностью, высокими или низкими температурами и другими абиотическими факторами. Все абиотические воздействия сопровождаются образованием активных форм кислорода (АФК), токсичных для растительных клеток. Для нейтрализации АФК растения выработали целый ряд защитных механизмов. К ним относятся возрастание активности ферментов таких, как супероксиддисмутаза (ЕС 1.15.1.1, СОД), аскорбатпероксидаза (ЕС 1.11.1.11, АсП), глутатионредуктаза (ЕС 1.6.4.2, ГР) и другие, а также синтез низкомолекулярных антиоксидантов (аскорбат, глутатион, каротиноиды и антоцианины) (Inze D. and Van Montagu M., 1995).

Внедрение генов, кодирующих синтез антиокислительных ферментов, -перспективный способ получения растений, обладающих толерантностью ко многим стрессам (Gusta L.V. et al., 2009; Inze D. and Van Montagu M., 1995). В различных исследованиях было продемонстрировано, что повышенной устойчивостью к окислительному стрессу обладают растения-трансформанты с суперэкспрессией единичных генов супероксидцисмутазы, аскорбатпероксидазы, глутатион-Б-трансферазы, глутатионредуктазы и др. В то же время, остается мало изученным действие окислительного стресса на основные структурно-функциональных системы индивидуальных клеток.

Настоящая работа направлена на решение одной из актуальных проблем современной биотехнологии — изучение клеточных механизмов, обеспечивающих защиту растений от действия оксидативного стресса.

Первичным ответом на действие АФК в клетке является синтез супероксиддисмутаз (СОД) (Fe-SOD, Mn-SOD и Cu/Zn-SOD), основная функция которых заключается в ферментативном превращении супероксида (02~) и воды в перекись водорода (Н202), нейтрализуемую затем другими ферментами, в частности, аскарбатпероксидазой. Хлоропласты наиболее подвержены риску токсических

повреждений, вызываемых АФК, так как молекулярный кислород в процессе фотовосстановления, происходящего в фотосистеме I, получает дополнительный электрон и превращается в супероксид (02"). В геноме арабидопсиса содержится 7 генов, кодирующих различные виды и изоформы СОД. Установлено, что Fe-SOD2 и Fe-SOD3 локализуются в хлоропластах. Показано, что они формируют гетеромерный белковый комплекс с нуклеоидом хлоропластов. Локализация Fe-SOD1, установленная путем трансляционного слияния с GFP белком, свидетельствует о его наличии в цитоплазме и ядре, причем установлено, что экспрессия Fe-SODl в антисенс-ориентации не приводит к нарушению структуры пластид, в отличие от аналогичных экспериментов с Fe-SOD2 и Fe-SOD3 (Myouga et al., 2008). В настоящее время остаются малоизученными многие аспекты, связанные с особенностями влияния локализации продуктов экспрессии введенных генов, а также с влиянием внедренных генов на структурную организацию клеточных компартментов. Исходя из роли супероксиддисмутаз в антиокислительной защите структурной организации пластид, принципиальное значение имеет вопрос - может ли экспрессия цитоплазматической Fe-SOD приводить к изменениям структуры компартментов клетки при перенаправлении ее в хлоропласт.

Цель работы — изучить влияние экспрессии гена Fe-зависимой супероксиддисмутазы с сигнальной последовательностью Rbsc на структурную организацию хлоропластов трансгенных растений табака и томата при действии окислительного стресса.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Получить трансгенные растения томата и табака, экспрессирующие ген Fe-SODl, кодирующий цитоплазматическую Fe-зависимую супероксиддисмутазу из Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. с сигнальной последовательстью гена rbsc гороха (Pisum sativum L.) для локализации продукта в хлоропластах;

2. Измерить активность супероксиддисмутазы у трансгенных растений томата и табака с экспрессией гена Fe-SOD\

3. Изучить влияние экспрессии гена Fe-SODl у трансгенных растений томата и табака на пролиферативную активность клеток меристемы корня;

4. Изучить влияние экспрессии гена Fe-SODl у трансгенных растений томата и табака при таргетинге продукта в пластиды на структурно-функциональную организацию клеток фотосинтезирующих тканей;

5. Изучить влияние экспрессии гена Fe-SODl на физиологические и структурные характеристики трансгенных растений томата при воздействии абиотических факторов (засоление, УФ-радиация), генерирующих образование в клетке АФК.

Научная новизна результатов и практическая значимость работы.

Впервые на основе российского сорта томата и модельного растения табака (Nicotiana tabacum L.) были получены независимые трансгенные линии, содержащие ген Fe-SODl с сигнальной последовательностью, обеспечивающей накопление продукта в пластидах. Впервые продемонстрировано, что экспрессия гена Fe-SODl из Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. в трансгенных растениях томата и табака вызывает увеличение суммарной активности супероксиддисмутазы, а также существенные структурные изменения (размера хлоропластов и структуры ламеллярных тилакоидов, количества и размера крахмальных зерен, пластоглобул, нуклеоидов на один срез) в пластидах клеток фотосинтезирующих тканей, а также пролиферативной активности клеток корня. Установлено, что экспрессия гена Fe-SODl в трансгенных растениях томата вызывает повышение устойчивости к УФ-облучению и солевому стрессу. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют об эффективности применения стратегии изменения таргетинга цитоплазматической супероксиддисмутазы в пластиды. Трансгенные растения табака и томата могут быть использованы не только в различных фундаментальных исследованиях, но иметь и прикладное значение.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на IX молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии» (2009), III Всероссийском симпозиуме «Физиология

трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности» (2010), Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (2010), международной научной конференции "Современные аспекты генетической инженерии растений" (2011), Всероссийской научной конференции с международном участием «Инновационные направления современной физиологии растений» (2013), научной конференции «Физиология растений и микроорганизмов - взгляд в будущее» (2013), а также на X Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (2013).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов, а также списка цитируемой литературы. Работа изложена на 133 страницах, включает 25 рисунков и фотографий, 6 таблиц в тексте диссертационной работы. Библиографический указатель включает 277 источников, из них 259 на иностранном языке.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объект исследования. В экспериментальной работе были использованы асептические проростки томата (Solanum lycopersicum L.) сортов Белый налив 241 и Взрыв, полученные из семян, а также стерильные растения табака обыкновенного {Nicotiana tabacum L.) сорта Самсун.

Регенерация побегов томата in vitro. В качестве эксплантов для индукции регенерации побегов томата сортов Белый налив 241 и Взрыв были использованы семядоли, сегменты гипокотиля и стебля, а также фрагменты настоящих листьев. Культивирование эксплантов осуществляли на модифицированной агаризованной среде MS (Murasighe and Skoog, 1962) с различным содержанием регуляторов роста: 1) 5,0 мг/л 6-БАП, 0,2 мг/л ИУК; 2) 1,0 мг/л рибозид зеатина, 0,1 мг/л ИУК; 3) 2,5 мг/л 6-БАП рибозид, 0,1 мг/л НУК; 4) 5,0 мг/л 6-БАП рибозид, 0,2 мг/л ИУК. Донорные растения и экспланты культивировали в климокамере Fitotron Н-600 при температуре 25°С с 16-часовым световым режимом.

Штамм Agrobacterium tumefaciens и векторная конструкция, используемая для трансформации. Для трансформации использовали штамм Agrobacterium tumefaciens AGL0, содержащий плазмиду pBI-FeSOD. тДНК плазмиды (рис. 1) содержит ген Fe-SODl, кодирующий цитоплазматическую Fe-содержащую супероксиддисмутазу из Arabidopsis thaliana L. с сигнальной последовательностью гена rbsc гороха (Pisum sativum L.), обеспечивающую накопление продукта в пластидах. Ген Fe-SODl находится под контролем сильного конститутивного промотора CaMV 35S и терминатора NOS. Кроме того, тДНК содержит селективный ген nptll, обуславливающий устойчивость к канамицину, под контролем NOS промотора и терминатора.

Рис. 1. Схема области Т-ДНК векторной конструкции pBI-FeSOD.

Обозначения: Fe-SODl - целевой ген, кодирующий Fe-зависимую супероксиддисмутазу; Signal - сигнальная последовательность гена rbsc гороха, направляющая супероксиддисмутазу в хлоропласт; 35S promoter - промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; NOS promoter и NOS terminator — промотер и терминатор гена нопалинсинтазы; nptll - ген неомицинфосфотрансферазы II Е. coli; RB и LB -левая и правая последовательности, ограничивающие Т-область.

Агробактериальная трансформация. Процедура агробактериальной трансформации табака проводилась путем сокультивирования листовых дисков с Agrobacterium tumefaciens по стандартной методике (Дрейпер, 1991). Для последующей регенерации растений табака листовые экспланты помещали на питательную среду MS с добавлением регуляторов роста (1 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л НУК) и селективного агента.

Агробактериальную трансформацию томата осуществляли, как было предложено McCormick с соавторами с внесением некоторых модификаций (McCormick et al., 1986). Прекультивирование эксплантов осуществляли на агаризованной среде MS с добавлением 5 мг/л БАП рибозида и 0,2 мг/л ИУК в темноте в течение 2 суток, после чего лезвием скальпеля на экспланты наносили насечки. Экспланты переносили в колбу с ночной культурой клеток Agrobacterium tumefaciens, разбавленной в соотношении 1:20 жидкой средой MS, с добавлением экссудата табака (Норова, Калиев, 1998). Далее колбу помещали на шейкер и в течение 2 ч осуществляли сокультивирование. Впоследствии экспланты подсушивали на стерильной фильтровальной бумаге и переносили на чашки Петри с агаризованной средой MS. Последующее сокультивирование проводили в темноте при комнатной температуре в течение 2 сут до появления бактериального ореола.

После сокультивирования с агробактерией экспланты отмывали в стерильной дистиллированной воде и помещали на агаризованную среду MS с добавлением 5,0 мг/л 6-БАП рибозида, 0,2 мг/л ИУК и 200 мг/л тиментина с целью подавления роста и размножения агробактерии. При последующем субкультивировании в питательную среду добавляли селективный антибиотик (30 мг/л канамицина во втором пассаже, 50 мг/л - в последующих пассажах). Регенеранты пересаживали индивидуально в пробирки с агаризованной средой MS, содержащей 1/2 макро- и микроэлементов, а также 0,1 мг/л ИМК и 100 мг/л канамицина для инициации корнеобразования. Укоренившиеся на селективной среде побеги клонально размножали методом черенкования. Растения адаптировали к почвенным условиям и выращивали в условиях защищенного грунта.

Молекулярно-генетический анализ. Тотальную геномную ДНК Agrobacterium tumefaciens выделяли с помощью метода, описанного Wise (Wise et al. 2006). Плазмидную ДНК экстрагировали методом щелочного лизиса (Birnboim, Doly, 1979). Выделение тотальной растительной ДНК осуществляли с помощью набора реагентов «Проба ЦТАБ» (ДНК-технология, Россия) по инструкции

производителя. В качестве проб использовали фрагменты молодых листьев массой 100-200 мг.

Присутствие привнесенных целевого и селективного генов осуществлялось с помощью ПЦР. Амплификационная смесь содержала: 100 нг ДНК, 3 mM MgCl2, 250 (iM dNTPs, 0,25 (хМ прямого и обратного праймеров, 1х буфер для ПЦР и 1 ед. Taq-полимеразы. Реактивы для ПЦР были любезно предоставлены лабораторией молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИСБ РАСХН. Синтез олигонуклеотидов был осуществлен ЗАО Синтол (Россия).

Для амплификации последовательности гена Fe-SODl было подобрано два специфических праймера: FeSl (5'_ACCTCCATTCGCACTGGATGCTTT_3') и FeS2 (5 'TTCGGTGATGCAGA ACTCACTGT3'). Размер ампликона составляет 645 п.о. Для проведения ПЦР была использована следующая программа амплификации: 1) 94°С - 3 мин.; 2) 40 циклов: 94°С - 45 сек.; 60°С - 45 сек.; 72°С - 1 мин. 30 сек.; 3) 72°С -10 мин.

Отсутствие бактериальной контаминации полученных трансформантов проверяли с использованием праймеров на нуклеотидную последовательность гена virD2, входящего в состав резидентной Ti-плазмиды: virD2F (5'_GAACCAAGACCCTTCAGCA_3') и virD2R

(5'_ATCCAGGACTATGCCGTGAC_3'). Размер ампликона составляет 491 п.о. ПЦР проводили в условиях, приведенных выше, при температуре отжига, равной 55°С.

Присутствие селективного гена npt II подтверждали с помощью праймеров 5'_AACCAGACCAGACCACGGACCCCGACCTGTCCGGTGCCC_3' и

5'_AACCAGACCAGACCACGGACCCCGCCACACCAGCCGGCC_3'. Размер

амплифицируемого фрагмента составляет 550 п.о. ПЦР проводили при температуре отжига праймеров, равной 60°С.

Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, окрашенным бромистым этидием. Длину амплифицированных участков определяли с помощью маркера GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas, Литва).

Измерение активности антиокислительных ферментов. Исследования интенсивности перекисных процессов и активности антиоксидантных ферментов проводили в гомогенатах и ферментных экстрактах, полученных из листьев контрольных и трансгенных растений. Активность СОД определяли фотохимическим методом, описанным Giannopolitis и Ries (Giannopolitis, Ries, 1977). За одну единицу активности СОД принимали количество фермента, необходимого для 50%-ного ингибирования скорости восстановления нитросинего тетразолия, измеренного при 560 нм. Активность аскорбатпероксидазы (АсП) оценивали по методу Nakano и Asada (Nakano, Asada, 1981) по восстановлению в реакционной среде при 290 нм (коэффициент экстинкции — 2,8 мМ см"1). Активность СОД и АсП определяли из расчета на грамм сырой биомассы листьев. Аналитическая повторность опыта 4-5-кратная. Биологическая повторность 2-3-кратная.

Анализ кислородного газообмена и переменной флуоресценции. Листья контрольных и трансгенных растений томата облучали ультрафиолетом (УФ-А) в течение 40 мин, после чего определяли активность фотосинтетического аппарата путем полярографического определения скорости фотосинтеза по газообмену Ог и методом замедленной флуоресценции. Выделение Ог из листьев проводили в термостатированной ячейке объемом 5 мл со стандартным платиновым электродом Кларка при интенсивности света 1200 мкмоль фотонов м"2 с"1 и температуре 25°С. До начала измерений в раствор добавляли избыточное количество (0,1 мл 0,5М NaHCO-j), необходимое для снабжения фотосинтетической реакции источником углерода.

Активность ФСП измеряли методом переменной флуоресценции. Флуоресценцию возбуждали светом с А.м =480 нм. Интенсивность света на уровне поверхности листа составляла 30 В/м'2. До начала измерений листья выдерживали в темноте в течение 15 мин. Для регистрации использовали интерференционный светофильтр (км = 685, полуширина полосы 10 Нм) и монохроматор (ДА, = 1Нм) с фотоумножителем ФЭУ 119. Сигнал регистрировали с помощью запоминающего

осциллографа (Tektronix, США) или быстро регистрирующего самописца Endim 322-01М (VEBMS, Германия). Измеряли Fo, Fv, и рассчитывали отношение FV/(F0+FV), где Fo - фоновая флуоресценция, a Fv - переменная флуоресценция.

Фиксация биологического материала для проведения электронно-микроскопического анализа. Фрагменты срединной части листа фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида (Merck, Германия) на 0,1 М фосфатном буфере Серенсена (рН 7,2) с добавлением 1,5% сахарозы. После отмывки от фиксирующей смеси растительный материал дофиксировали 1,0% раствором четырехокиси осмия (0s04) (Sigma, США), обезвоживали в этаноле повышающейся концентрации (30, 50, 70, 96 и 100%), окиси пропилена (Fluka, Германия) и заключали в смесь эпон-аралдитных эпоксидных смол. Ультратонкие срезы изготовляли с помощью ультрамикротома LKB-V (LKB, Швеция). Контрастировали препараты уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу (Reynolds, 1963). Исследование препаратов проводили на электронном микроскопе Н-300 и Н-500 (Hitachi, Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ.

Цитофотометрический анализ и определение митотического индекса.

Окрашивали участок корней регенерантов томата и табака, размер которого составлял 1,5 - 2,0 мм, 2% раствором ацетоорсеина. Приготовленные давленые препараты анализировали в микроскопе Olympus ВХ51 (Olympus, Япония), оборудованном камерой Color View II (Soft Imaging System, Германия). Митотический индекс (МИ) рассчитывали по стандартной методике (Паушева, 1988).

Анализ наследования селективного гена npt II в первом трансгенном поколении табака и томата. Анализ наследования гена npt II осуществлялся путем подсчета проростков томата и табака, устойчивых и чувствительных к селективному агенту. Для этого асептические семена культивировали на среде MS с добавлением 100 мг/л канамицина.

Статистическая обработка. Статистическую обработку результатов эксперимента проводили с помощью стандартных пакетов программы Microsoft

Excel 2007. Анализ наследования гена npt II осуществляли с помощью критерия Пирсона (метод хи-квадрат) (Доспехов, 1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение трансгенных растений томата и табака, экспрессирующих ген Fe-SODl. До проведения эксперимента по генетической трансформации томата необходимо было подобрать состав регуляторов роста, входящих в состав питательной среды MS, а также тип экспланта, которые будут применяться для регенерации побегов in vitro. Известно, что экспланты томата, полученные от ювенильных растений, обладают более высоким регенерационным потенциалом по сравнению с эксплантами, полученными от взрослых растений (Корнеева и др., 2005; Bhatia et al., 2004), поэтому в настоящем исследовании для культивирования нами были использованы семядоли, сегменты гипокотиля и стебля, а также фрагменты листовых дисков. В ранее проведенных исследованиях (Парашина, 2008) была изучена регенерационная способность томата сорта Белый Налив и показано, что сорт обладает высокой способностью к регенерации побегов при культивировании эксплантов семядолей, стеблей и листьев на питательных средах с добавлением рибозид зеатина или 6-БАП рибозида в сочетание с низкими концентрациями ауксинов (ИУК, НУК). Поскольку используемые в настоящем исследовании сорта томата выведены на основе сорта Белый налив, было принять решение об использовании 4 вариантов питательных сред, предложенных Е.В. Парашиной (табл. 1). В результате исследования было установлено, что в зависимости от варианта питательной среды и культивируемой ткани частота регенерации изученных сортов варьировала от 18,2 до 90,5%, а количество регенерантов из расчета на один эксплант - от 1,25 до 5,88 шт.

На основании полученных экспериментальных данных для проведения экспериментов по агробактериальной трансформации томата был выбран вариант питательной среды MS, содержащий 6-БАП рибозид и ИУК в концентрациях 5,0 и 0,2 мг/л соответственно.

Таблица / — Изучение регенерационной способности побегов томата сортов Белый налив 241 и Взрыв в культуре in vitro.

Эксплаит Регуляторы роста и концентрация (мг/л) Белый налив 241 Взрыв

Частота регенерации (%) Количество регенерантов на эксплант (шт.) Частота регенерации (%) Количество регенерантов па эксплант (шт.)

лист 6-БАП (5,0) ИУК (0,2) 52,6 3,16±1,43 22,2 1,55±0,95

гипокотиль 35,0 2,41±0,98 33,3 2,2±1,23

семядоли 57,1 3,34±1,47 31,6 1,83±0,75

стебель 61,2 3,11±1,24 47,2 1,25±0,95

лист Зеатин рибозид (1,0) ИУК 0,1 50,5 3.29±1,53 20,8 2,6±1,34

гипокотиль 90,5 3,71±1,65 27,8 2,2±1,09

семядоли 50,0 3,60±1,78 25 3,01±1,33

стебель • 58,8 3,45±1,56 44,4 2,44±1,2

лист 6-БАП рибозид (2,5) НУК0,1 75,0 2,71±1,27 32,3 2,35±0,92

гипокотиль 18,2 3,67±1,79 66,7 5,88±2,70

семядоли 46,7 1,94±0,98 76,5 2,64±1,58

стебель 66,4 2,75±0,87 51,1 2,62±0,64

лист 6-БАП рибозид (5,0) ИУК (0,2) 62,5 3,42±1,34 40,9 2,17±1,13

гипокотиль 63 3,11±1,77 52,9 2,83±1,06

семядоли 50,3 3,28±0,98 63,6 1,43±0,53

стебель 72,31 3,55±1,74 55,2 3,24±1,64

В экспериментах по агробактериальной трансформации с использованием вектора pBI-FeSOD было задействовано 520 и 120 различных типов эксплантов томата сортов Белый налив 241 и Взрыв, соответственно, а также 150 фрагментов листьев табака сорта Самсун. В результате культивирования эксплантов на питательных средах для регенерации и селекции трансгенных побегов было получено 12 и 51 канамицин-устойчивых регенерантов томата сортов Взрыв сортов Белый налив 241, соответственно, а также 45 канамицин-устойчивых регенерантов табака. Трансгенная природа отобранных регенерантов томата и табака была

проверена с помощью ПЦР при использовании специфических праймеров, комплементарных последовательностям целевого (Ре-5001) и селективного (пр1 II) генов. В результате ПЦР с использованием праймеров Ре81 и Ре82 было установлено, что присутствие гена Ре-Б001 было отмечено у 16 регенерантов томата сорта Белый налив 241 (рис. 2А), 4 регенерантов сорта Взрыв (рис. 2В) и 20 регенерантов табака сорта Самсун (рис. 2В). Для всех независимых трансгенных линий томата и табака, содержащих целевой ген, было выявлено присутствие маркерного гена прг II (рис. 2Б, Г).

М 1 2 3 4 5 6 7 8 В 10 |

645 п.о. »» » -¡^."•(¡^ А " ' ж . . у, . , .....-У---УГ К- , Ю 11 XX 13 34 15 1С 17 ХВ 19 645 п.о,_ п—— 1_^ ^

М 1 ! 3 4 5 в 7 8 9 10 11 550 п.о. Щ — — -- — «*> **»*» - Б ■ННННю^ИНмИдДВШ

Рис. 2. Электрофореграммы продуктов амплификации геномной ДНК регенерантов томата сортов Белый налив 241 и Взрыв, а также табака сорта Самсун на присутствие голевого гена Fe-50D/ (А, В) и селективного гена прЬ II (Б, Г):

А: М - молекулярный маркер; 1-7 - прошедшие селекцию на канамицине регенеранты томата сорта Белый налив 241; 8 - отрицательный контроль (Белый налив 241); 9 - Н2О; 10 -положительный контроль (плазмида рВ1-Ре8СЮ).

Б: М - молекулярный маркер; 1-5 - прошедшие селекцию на канамицине регенеранты томата сорта Белый налив 241; 6-8 - прошедшие селекцию на канамицине регенеранты томата сорта Взрыв; 9 - положительный контроль (плазмида рВЬРеБСЮ); 10 - Н2О; 11 - отрицательный контроль (Белый налив 241).

В: М - молекулярный маркер; 1 -10 - прошедшие селекцию на канамицине регенеранты табака; 11 -17 - прошедшие селекцию на канамицине регенеранты томата сорта Взрыв; 18 - отрицательный контроль (томат сорта Взрыв); 19 - положительный контроль (плазмида рВ1-Ре8СЮ). Г: М - молекулярный маркер; 1 - отрицательный контроль (табак сорта Самсун); 2-8 - прошедшие селекцию на канамицине регенеранты табака; 9 — положительный контроль (плазмида рВ1-РеБСЮ).

Отсутствие контаминации регенерантов агробактерией было проверено при постановке ПЦР с использованием специфических праймеров на последовательность гена уг'/'02. Все проанализированные образцы, у которых детектировался фрагмент на последовательность целевого и селективного генов, были свободны от агробактерии. Таким образом, частота трансформации, рассчитанная как отношение независимых регенерантов с подтвержденным присутствием гена Ре-БОВ! к общему количеству культивируемых эксплантов, для табака сорта Самсун и томата сортов Белый налив 241 и Взрыв составила, соответственно, 13,3%, 3,1% и 3,3%.

Трансгенные линии томата и табака были проверены на наличие экспрессии целевого гена методом ОТ-ПЦР, в результате которого было установлено, что экспрессия гена Ре-$001 наблюдалась у 6 из 20 линий табака, у 13 из 16 линий томата сорта Белый налив 241 и у 2 из 4 линий томата сорта Взрыв (рис. 3).

М 1 2 3 4 5 0 7 8 в 10

645 п.о.

1

Г-ч* #1 4

Б

Рис. 3. Электрофореграмма продукта амплификации кДНК трансгенных линий табака и томата на наличие экспрессии гена Ре-Б001:

А: М - молекулярный маркер; 1 - отрицательный контроль (томат сорта Белый налив 241); 2-8 -трансгенные линии томата сорта Белый налив 241; 9 - положительный контроль (плазмидная ДНК).

Б: М - молекулярный маркер; 1 -2 - трансгенные линии томата сорта Взрыв; 3-9 - трансгенные линии табака; 10 - положительный контроль (плазмидная ДНК).

Сравнительный анализ активности антиокислительных ферментов в листьях контрольных и трансгенных растений томата и табака, экспрессирующих ген ¥е-$(Ю1. Для анализа активности СОД были отобраны 3 трансгенные линии томата сорта Белый налив 241 (линии №4, №6, №8) и 2 линии табака (линии №Ь, №10), у которых наблюдалась экспрессия гена Ре-.Б01Л.

Регенераты томата линий №4 и №8 не имели фенотипических отличий от контроля, тогда как регенеранты линии №6 характеризовались низкой скоростью роста в условиях in vitro и измененной формой листовой пластинки. В результате фотохимического исследования было установлено, что трансгенные растения томата и табака отличались от нетрансформированных растений существенным увеличением активности в листьях СОД (рис. 4). Так, по сравнению с контролем экспрессия гена Fe-SODl в растениях томата приводила к увеличению активности СОД в 1,5 - 2,8 раза, а у растений табака — в 1,4 - 1,9 раза. Статистически значимые отличия по активности СОД между трансгенными линиями томата и табака обусловлены различным уровнем экспрессии гена Fe-SODl. Активность СОД в листьях контрольных растений томата и табака была одинаковой и не имела достоверных отличий.

А)

контроль № 4 № 6 № 8

Б)

Рис. 4. Активность СОД в листьях контрольных и трансгенных растений томата (А) и табака (Б), экспрессирующих ген Ре-БОО!.

Листья контрольных и трансгенных растений томата, экспрессирующие ген Ре-5001, были также проанализированы на активность АсП (рис.5).

Установлено, что активность АсП в листьях трансгенных линий томата №6 и №4 идентична активности АсП в листьях контрольных растений. Однако активность АсП трансгенной линии №8 была выше и существенно превышала соответствующее

значение, как у контрольных растений, так и других проанализированных трансгенных линий.

Рис. 5. Активность АсП в листьях контрольных и трансгенных растений томата, экспрессирующих ген Ре-БОП1.

Исследование активности фотосинтетического аппарата. Облучение листьев контрольных растений томата УФ светом приводило к значительному снижению скорости фотосинтеза (на 36% от исходной величины) (рис. 6).

% к контролю по скорости % к контролю по параметрам выделения кислорода замедленной флуоресценции (Fo, Fv, Fv/(Fv+Fo), PS2) ■ контроль №4 »№8

Рис. 6. Активность фотосинтетического аппарата у трансгенных линий томата после облучения УФ светом.

Экспрессия гена Ге-БОВ! способствовала повышению устойчивости фотосинтетического аппарата растений томата к действию окислительного стресса,

вызываемого УФ облучением. Это проявлялось в замедленном снижении скорости фотосинтеза и соответственно, больших значениях по сравнению с контролем. Сравнительная характеристика пролиферативной активности меристемы корня контрольных и трансгенных растений томата и табака, экспрессирующих ген /<е-БОБ!. Установлено, что у двух анализируемых трансгенных линий томата, характеризующихся повышенной активностью СОД, происходит существенное снижение митотической активности клеток корня по сравнению с контролем (рис. 7 А). Значение МИ у трансгенных линий томата №6, №8 составило, соответственно, 3,8% и 4,0%, тогда как у контроля соответствующее значение составило 5,7%.

Рис. 7. Митотический индекс меристемы корня у контрольных и трансгенных растений томата (А) и табака (Б), экспрессирующих ген Ре-Б001.

Как и для трансгенных растений томата, у одной трансгенной линии табака (линия №10) с повышенной активностью СОД значение МИ было существенно меньше, чем у контрольного образца (рис. 7Б). Значение МИ в клетках корня трансгенной линии табака №8 составило 9,4%, что существенно превышало контрольное значение (7,4%). Полученные результаты свидетельствуют, что экспрессия гена Fe-SODi приводит к изменению митотической активности клеток меристемы корня у трансгенных растений томата и табака.

Оценка митотической активности клеток меристемы корня по показателю МИ у контрольных и трансгенных растений томата и табака была также проведена в условиях хлоридного и сульфатного засоления (рис. 8). Установлено, что при культивировании регенерантов контрольных растений томата и табака на питательных средах с добавлением NaCl и Na2S04 происходило существенное уменьшение значения МИ в клетках корня. При этом, как и в контрольных условиях, пролиферативная активность клеток меристемы корня трансгенных линий №6 и №8 была существенно ниже по сравнению с контрольным образцом. МИ клеток корня трансгенной линии табака №10 в условиях хлоридного засоления был сравним с контролем, тогда как в условиях сульфатного засоления - существенно ниже контроля, как ранее было установлено в условиях без засоления. МИ клеток корня трансгенной линии табака №8 достоверно превышал соответствующее значение в условиях хлоридного и сульфатного засоления.

Л-

III

К №6 №8

А) Б)

9 -

1

III

К №10 №8

Рис. 8. Митотический индекс меристемы корня у контрольных и трансгенных растений томата (А, Б) и табака (В, Г), экспрессируюгцих ген Fe-SODl, в условиях хлоридного (А, В) и сульфатного засоления (Б, Г).

Ill

Анализ ультраструктурной организации хлоропластов в клетках листьев контрольных и трансгенных регенерантов томата и табака, экспрессирующих ген Ее-БОШ.

Для анализа ультраструктуры хлоропластов были взяты трансгенные растения томата и табака, отличающиеся увеличением активности антиокислительных ферментов. Результаты электронно-микроскопического исследования показали, что в клетках мезофилла и устьиц контрольных растений томата и табака хлоропласты имеют все характерные для них структурные компоненты. Они содержат граны (около 10—18 штук на площадь сечения хлоропласта), ламеллы гран имеют спаренные мембраны, которые по электронной плотности резко отличаются от торцевых и маргинальных мембран тилакоидов гран и тилакоидов стромы. В строме содержатся пластоглобулы (от 2 до 8 на площадь сечения хлоропласта) и 1-2 крахмальных зерна эллипсоидной формы (рис. 9А, Б; рис. 10А, Б; рис. 12А).

Для сравнительной оценки были использованы линии томата (№6 и №8), отличающиеся активностью АсП. Хлоропласты в клетках мезофилла и устьиц листа трансгенной линии томата №8 имеют характерную овально-линзовидную форму и обладают развитой ультраструктурой гран и ламелл (рис.9В, Г; рис. 10В, Г). Хлоропласты не имеют крахмальных зерен. Размер пластоглобул меньше, чем у контроля. В то же время в клетках ксилемы сосудистого пучка хлоропласты не содержат крахмальные зерна, в них резко уменьшается количество гран и стромальных тилакоидов, а также количество тилакоидов в гранах (рис. 9В, Г; рис. 10В, Г). В хлоропластах клеток устьиц содержится много крупных крахмальных зерен. В клетках этого типа граны резко уменьшаются в размерах за счет снижения количества тилакоидов. Отмечаются небольшого размера единичные пластоглобулы (рис. 9 В, Г).

Тилакоиды гран в хлоропластах клеток аналогичных тканей листа трансгенной линии томата №6 имеют структуру, сходную с контролем. В клетках устьиц располагаются многочисленные крахмальные зерна и различные по размеру пластоглобулы (рис. 9Д). В хлоропластах клеток ксилемы выявлены крупные

пластоглобулы (рис. 9Е; 10Е). Четко сформированные граны в хлоропластах не выявляются. Незначительно повышается количество крахмальных зерен (как правило, 2-3 на органеллу). Наиболее характерное отличие от контроля -дезорганизация тилакоидов стромы, которая выражается в отсутствии упорядоченной ориентации ламелл и их частичной фрагментации. Другим существенном отличием является развитие крупных пластоглобул.

Различия в ультраструктурной организации хлоропластов у контрольных и трансгенных растений табака, экспрессирующих ген Ре-БОВ!, также выражались в сильном увеличении объема единичных пластоглобул, которые можно отчетливо наблюдать в клетках губчатой паренхимы (рис. 11Г, Е). В пластидах клеток устьиц контрольных растений отмечено большое количество крахмальных зерен (рис. 1 1 А).

¿Ш -¿ЛИ

т .....

I :• / ^Я^с-

V

д

—' ... . 'Л I-

Рис. 9. Ультраструктурная организация хлоропластов клеток устьиц (А, В, Д) и ксилемы (Б, Г, Е) листа контрольных (А, Б) и трансгенных регенерантов томата линии №8 (В, Г) и №6 (Д, Е), экспрессирующих ген Ее-Б001. Обозначения: Хл - хлоропласт, К - крахмальное зерно, Гр - грана, Пг - пластоглобула. Масштабная линейка 1 мкм.

Рис. 10. Ультраструктурная организация хлоропластов клеток губчатой паренхимы, примыкающей к сосудистому пучку, (А, В, Д) и ксилемы (Б, Г, Е) листа контрольных (А, Б) и трансгенных регенерантов томата линии №8 (В, Г) и №6 (Д, Е), экспрессирующих ген Ре-8()В1.

Обозначения: Хл - хлоропласт, К - крахмальное зерно, Гр - грана, Пг - пластоглобула, Ла -ламелла, М - митохондрия, Кс - клеточная стенка. Масштабная линейка 1 мкм.

Хлоропласты в клетках губчатой паренхимы трансгенных растений табака характеризуются меньшим количеством гран, а также наличием ламеллярных новообразований в центральной и переферической зоне органеллы. По-видимому, они являются изгибами тилакоидов стромы (рис.11 Г, Б). Подобные структурные изменения хлоропластов у трансгенных растений томата не наблюдались.

Рис. 11. Ультраструктурная организация хлоропластов клеток устьиц (А, Б) столбчатой (В, Г) и губчатой (Д, Е) паренхимы листа контрольных (А, Б) и трансгенных регенерантов табака, экспрессирующих ген Ре-БОВ!. Обозначения: Хл - хлоропласт; К - крахмальное зерно, Гр - грана, Пг - пластоглобула, Ла -ламелла, Лф - ламеллярные формации, М - митохондрия, Кс - клеточная стенка, Яд — ядро, Вв -внутриядерное включение.

Анализ ультраструктурной организации хлоропластов и митохондрий в клетках листьев контрольных и трансгенных регенерантов томата с экспрессией гена выращенных в условиях хлоридного и сульфатного засоления.

Результаты электронно-микроскопического исследования выявили изменения ультраструктуры пластид и митохондрий паренхимных клеток у нетрансгенных растений томата, характерные для действия солевого стресса (рис. 12Г, Ж; рис. 13Г,Ж ). Показано деструктивное влияние хлорида натрия на структурную организацию пластид (изменения формы, увеличение пластоглобул) (рис. 12Г). При

воздействии сульфата натрия пластиды приобрели неправильную угловатую форму, строма хлоропласта становилась более плотной. Крахмальные зерна окружают неравномерные угловатые светлые участки. У некоторых пластид происходит отделение фрагментов стромы, окруженных мембраной и содержащих ламеллярные структуры. Количество пластоглобул не меняется (рис. 12 Ж).

Рис. 12. Влияние хлоридного (Г-Е) и сульфатного (Ж-И) засоления на ультраструктурную организацию хлоропластов в клетках мезофилла листа контрольных (А, Г, Ж) и трансгенных регенерантов томата линии №6 (Б, Д, 3) и №8 (В, Е, И), экспрессирующих ген Бе^ОО!: А-В - контроль без засоления. Обозначения: М- митохондрия, Хл - хлоропласт, К - крахмальное зерно, Пг - пластоглобула, В -вакуоль, Ц - цитоплазма, * - нуклеоид хлоропласта, белая* - кристаллическая структура. Масштабная линейка равна 1 мкм.

Повреждающее действие солевого стресса на митохондрии выражалось в наличии неравномерно расположенных единичных крист, изменении формы органеллы с округлой на сильно изогнутую (образование инвагинаций) (рис. 13Г,Ж). При действии На2804 Митохондрии сохраняли округлую форму и имели более вытянутые одиночные кристы (рис.13Ж).

Рисунок 13. Влияние хлоридного (Г-Е) и сульфатного (Ж-И) засоления на ультраструктурную организацию митохондрий в клетках мезофилла листа контрольных (А, Г, Ж) и трансгенных регенерантов томата линии №6 (Б, Д 3) и №8 (В, Е, И), экспрессирующих ген Ее-5001: А-В - контроль без засоления. Обозначения: М- митохондрия, Хл - хлоропласт, Пк — пероксисома, * - кристаллическая структура. Масштабная линейка равна 1 мкм.

Хлоропласта клеток паренхимы трансгенных линий №6 и №8 существенно отличались как от хлоропластов контроля, так и между линиями. Под действием хлорида натрия пластиды линии №6 теряли характерные крупные пластоглобулы, в результате чего изменялась их форма и размер. В пластидах присутствовал

нуклеоид, крахмальные зерна оставались только в некоторых клетках, а количество гран уменьшается по сравнению с нетрансформированным контролем и линией №8 (рис. 12Д). В условиях сульфатного засоления происходило уменьшение размера хлоропластов трансгенной линии №6. При этом отмечалось сохранение значительного количества крахмальных зерен, формирование пластоглобул (рис. 123).

В отличие от контрольной и трансгенной линий №6, хлоропласта линии №8 в условиях хлоридного засоления сохраняли овально-линзовидную форму. Тилакоиды гран и стромы также имели типичную структуру, в строме наблюдали небольшое количество нуклеоидов и некрупных пластоглобул (рис. 12Е), что свидетельствовало об отсутствии повреждений компартмента. При сульфатном засолении хлоропласта были меньшего размера с незначительным изменением формы, уменьшалось количество гран и тилакоидов в гранах, пластоглобулы становились более мелкими (рис. 12И).

В условиях хлоридного засоления митохондрии линии №6 имеют меньший размер по сравнению с контролем (без засоления) и содержат характерные для контрольных условий кристаллические включения. Кристы четко выражены, имеют ромбовидную форму, плотный матрикс. Схожая картина наблюдалась и в условиях сульфатного засоления (рис. 133)

В условиях хлоридного засоления митохондрии в клетках паренхимы трансгенной линии №8 характеризовались округлой формой, имели развитые кристы большего размера, по сравнению с контролем (без засоления) (рис. 13И). Под действием сульфата натрия митохондрии линии №8 приобретали овальную и продолговатую форму, содержали относительно плотный матрикс с развитой системой крист (рис. 13И).

Таким образом, трансгенные линии томата, экспрессирующие ген РеБОИ! не имеют сильных повреждений в ультраструктурной организации пластид при воздействии окислительного стресса, индуцируемого засолением N82304 и ИаС1 по сравнению с контрольными растениями. Следовательно перенаправление

цитоплазматической СОД в пластиды оказывает защитный эффект на уровне отдельного компартмента.

Анализ наследования гена nptlly трансгенных растений томата и табака, экспрессирующих ген Fe-SODI, поколения Т1. Для оценки характера наследования гена npt II в семенном поколении, полученном от первичных трансформантов, было отобрано по одной трансгенной линии томата и табака. Результаты генетического анализа свидетельствовали, что у исследуемой трансгенной линии томата и табака соотношение проростков, устойчивых к канамицину, к проросткам, чувствительных к канамицину, соответствует 3:1. Полученные результаты свидетельствуют об однолокусной модели наследования селективного гена в растительном геноме.

ВЫВОДЫ

1. Впервые получены трансгенные растения томата и табака, экспрессирующие ген цитоплазматической Fe-зависимой супероксиддисмутазы (Fe-SODI) из Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., снабженный сигнальной последовательстью гена rbsc гороха (Pisum sativum L.) для таргетинга фермента в пластиды.

2. Установлено, что экспрессия гена Fe-SODI приводит к увеличению активности супероксиддисмутазы в листьях трансгенных растениях томата и табака.

3. Показано, что экспрессия гена Fe-SODI изменяет митотическую активность клеток меристемы корня у трансгенных растений томата и табака.

4. Продемонстрировано, что экспрессия гена Fe-SODI при таргетинге продукта в хлоропласт вызывает изменения ультраструктурной организации пластид и митохондрий в клетках фотосинтезирующих тканей трансгенных растений томата и табака.

5. Экспрессия гена Fe-SODI приводит к повышению устойчивости трансгенных растений томата к солевому стрессу и ультрафиолетовому облучению.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Серенко Е.К.(Нодельман), Овчинникова В.Н., Куренина Л.В., Баранова E.H., Гулевич A.A., Майсурян А.Н., Харченко П.Н. Получение трансгенных растений томата с геном Fe-зависимой супероксиддисмутазы // Докл. РАСХН. 2009. №4. С. 12-14.

2. Baranova E.N., Serenko E.K.(NodeIman), Balachnina T.I., Kosobruhov A.A., Kurenina L.V., Gulevich A.A., Maisuryan A.N. Activity of the photosynthetic apparatus and antioxidant enzymes in leaves of transgenic Solanum lycopersicum and Nicotiana tabacum plants with FeSODl gene // Russ. Agricult. Sei. 2010. V. 36. №.4. P. 242-249.

3. Серенко Е.К.(Нодельман), Баранова E.H., Балахнина Т.И., Куренина Л.В., Гулевич АЛ., Кособрюхов АЛ., Майсурян А.Н., Поляков В.Ю. Структурная организация хлоропластов растений томата Solanum lycopersicum, трансформированных геном Fe-зависимой супероксиддисмутазы // Биологические мембраны. 2011. Т. 28. № 3. С. 215-223.

4. Кононенко Н.В., Баранова E.H., Гулевич A.A., Серенко Е.К.(Нодельман), Куренина Н.В., Лаврова Н.В., Трахолисова М.А. Влияние NaCl И Na2S04 на показатели клеточного цикла в корневой меристеме трангенных растений томата // Известия ТСХА. 2013. №6. С. 49-56.

5. Баранова E.H., Серенко Е.К.(Нодельман), Гулевич A.A., Майсурян А.Н. Генно-инженерный подход к повышению устойчивости растений к засолению: проблемы и перспективы // в книге «Проблемы агробиотехнологии» под ред. чл.-корр. РАСХН П.Н. Харченко, М.: 2012. С.49-68.

6. Гулевич A.A., Серенко Е.К.(Нодельман), Баранова E.H., Овчинникова В.Н., Куренина Л.В., Майсурян А.Н., Харченко П.Н. Получение солеустойчивых подвоев для томата и огурца // Тезисы VIII Международного симпозиума

"Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования (Москва, 2009 г) С. 277-279.

7. Кононенко Н.В., Серенко Е.К.(Нодельман), Куренина JI.B., Баранова E.H., Гулевич A.A. Оценка влияния сульфатного засоления на клеточный цикл трансгенных растений табака и томата // Тезисы Всероссийского симпозиума «Растение и стресс» (Москва, 2010 г). С. 193-194.

8. Серенко Е.К.(Нодельман), Баранова E.H., Куренина JI.B., Гулевич A.A., Майсурян А.Н., Кособрюхов A.A., Поляков В.Ю. Структурно-функциональный анализ последствий функционирования цитоплазматической Fe-зависимой супероксиддисмутазы в трансгенных растениях томата при ее таргетинге в хлоропласт // Тезисы III Всероссийского симпозиума «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности» (Москва, 2010 г). С. 74.

9. Серенко Е.К.(Нодельман), Аканов Э.Н., Чеботарева И.Б., Куренина JI.B., Гулевич A.A., Баранова E.H. Анализ показателей темнового дыхания трансгенных растений томата, экспрессирующих Fe-зависимую супероксиддисмутазу // Тезисы докладов Всероссийской конференции «Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва, 2013 г). С. 130.

10. Долгих Ю.И., Гулевич A.A., Серенко Е.К.(Нодельман), Козубенко Ю.С., Осипова Е.С., Куренина JI.B., Майсурян А.Н. Трансформация геном Fe-зависимой супероксиддисмутазы растений томатов и пшеницы // Тезисы международной научной конференции "Современные аспекты генетической инженерии растений" (Украина, Киев, 2011г). С.112.

11. Серенко Е.К.(Нодельман), Аканов Э.Н., Чебатарева И.Б., Куренина JI.B., Гулевич A.A., Баранова E.H. Структурно-функциональные характеристики трансгенных растений томата, экспрессирующих Fe-зависимую супероксиддисмутазу // Тезисы докладов X Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Казань, 2013г). С. 256.

Подписано в печать: 04.02.2014 Объем: 1,0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ №42 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нодельман, Екатерина Константиновна, Москва

ГНУ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

04201456434

На правах рукописи

НОДЕЛЬМАН ЕКАТЕРИНА КОНСТАНТИНОВНА

Применение гена Ее-зависимой супероксиддисмутазы для защиты хлоропластов растений томата и табака от окислительного стресса

Специальность 03.01.06. - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор П.Н. Харченко

Москва - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................9

1.1 Негативное влияние абиотических стрессовых факторов на культурные растения.........................................................................................................................9

1.1.1 Неблагоприятное действие засоления и солевого стресса...........................9

1.1.2 Неблагоприятное действие окислительного стресса и активных форм кислорода..................................................................................................................12

1.2 Получение растений устойчивых к неблагоприятным абиотическим факторам среды...........................................................................................................15

1.2.1 Применение генов, кодирующих ферменты синтеза осмопротекторов... 16

1.2.2 Применение генов, кодирующие LEA белки и пептиды (late embryogenesis abundant protein genes), синтезирующиеся на поздних стадиях эмбриогенеза............................................................................................................20

1.2.3 Применение генов, кодирующих сигнальные и регуляторные молекулы (белки, пептиды, РНК)............................................................................................21

1.2.4 Применение генов, кодирующих ферменты, влияющие на количество, транспорт и восприятие рецепторами растительных гормонов.........................22

1.2.5 Применение генов участвующих в нейтрализации окислительного стресса.......................................................................................................................23

1.2.6 Применение генов, кодирующих, симпортеры, антипортеры, протонные помпы и транспортеры ионов................................................................................25

1.2.7 Применение генов, кодирующих молекулярные шапероны.....................26

1.3 Роль супероксиддисмутазы в регуляции активных форм кислорода.............27

1.3.1 Структура, локализация и функции супероксиддисмутазы.....................27

1.3.2 Активность супероксиддисмутазы в условиях действия неблагоприятных факторов...................................................................................................................28

1.4 Технология получение трансгенных растений семейства Solanaceae (табака и томата).........................................................................................................................29

1.4.1 Использование метода биолистической трансформации..........................30

1.4.2 Использование метода электропорации.......................................................31

1.4.3 Использование метода микроинъекции ДНК..............................................32

1.4.4 Использование метода агробактериальной трансформации.....................33

1.5 Стратегии повышения устойчивости томата к воздействию абиотических стрессов........................................................................................................................37

1.6. Заключение по обзору литературы....................................................................41

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...........................................42

2.1 Растительный материал.......................................................................................42

2.2 Введение томата и табака в культуру in vitro....................................................42

2.3 Конструкция для агробактериальной трансформации растений.....................43

2.4 Агробактериальная трансформация...................................................................45

2.5 Анализ наследования селективного гена npt II в первом трансгенном поколении табака и томата........................................................................................47

2.6 Молекулярно - генетический анализ трансформантов....................................47

2.6.1 Экстракция бактериальной и плазмидной ДНК..........................................47

2.6.2 Экстракция тотальной геномной ДНК растений........................................48

2.6.3 Полимеразная цепная реакция......................................................................48

2.6.4 Выделение РНК и обратная транскрипция..................................................49

2.6.5 Электрофорез продуктов амплификации.....................................................50

2.7 Измерение активности антиокислительных ферментов..................................50

2.7.1 Получение грубых гомогенатов и ферментативных экстрактов...............50

2.7.2 Определение активности ферментов............................................................51

2.7.3 Анализ кислородного газообмена и переменной флуоресценции...........52

2.8 Электронная микроскопия...................................................................................52

2.9 Цитофотометрический анализ.............................................................................54

л

1 4

1

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.............................................................56

I

3.1 Агробактериальная трансформация и отбор генетически модифицированных растений.......................................................................................................................56

3.1.1 Изучение регенерационного потенциала томата сортов Белый................56

налив 241 и Взрыв...................................................................................................56

3.1.2 Первичная оценка трансформантов..............................................................59

3.1.3 Молекулярно-генетический анализ канамицин - устойчивых побегов томата и табака........................................................................................................61

3.1.4 Оценка эффективности агробактериальной трансформации....................63

3.1.5 Анализ экспрессии целевого гена Ге-БОО! методом ОТ-ПЦР.................66

3.1.6 Адаптация и выращивание в условиях защищенного грунта трансгенных растений томата и табака, экспрессирующих ген Ге-ЗОИ!. Анализ семенного поколения.................................................................................................................67

3.1.7 Анализ экспрессии гена Ре-80В1 в первом семенном поколении Т1.....71

3.2 Влияние экспрессии гена Ре-БОй на анатомо-физиологические и биохимические характеристики растений табака и томата...................................73

3.2.1 Анализ активности ферментов трансгенных растений..............................74

3.2.2 Оценка митотической активности клеток трансгенных растений............76

3.2.3 Сравнительный анализ структурной организации хлоропластов в контрольных и трансгенных растениях................................................................79

3.3 Влияние экспрессии гена Ре-8001 на анатомо-физиологические и биохимические характеристики растений томата в условиях стресса.................86

3.3.1 Исследование активности фотосинтетического аппарата.........................86

3.3.2 Оценка цитофотометрических показателей трансгенных растений при солевом стрессе........................................................................................................87

3.3.3 Сравнительный анализ структурной организации хлоропластов в контрольных и трансгенных растениях при воздействии солей........................91

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..............................................................................................................99

ВЫВОДЫ......................................................................................................................103

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.............................................

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

В естественных условиях произрастания растения часто оказываются под действием стрессов вызываемых засухой, засолением, избыточной освещенностью, высокими или низкими температурами и другими абиотическими факторами. Все абиотические воздействия сопровождаются образованием активных форм кислорода (АФК), токсичных для растительных клеток. Для нейтрализации АФК растения выработали целый ряд защитных механизмов. К ним относятся возрастание активности ферментов таких, как супероксиддисмутаза (ЕС 1.15.1.1, СОД), аскорбатпероксидаза (ЕС 1.11.1.11, АсП), глутатионредуктаза (ЕС 1.6.4.2, ГР) и другие, а также синтез низкомолекулярных антиоксидантов (аскорбат, глутатион, каротиноиды и антоцианины) [114].

Внедрение генов, кодирующих синтез антиокислительных ферментов, -перспективный способ получения растений, обладающих толерантностью ко многим стрессам [99, 114]. В различных исследованиях было продемонстрировано, что повышенной устойчивостью к окислительному стрессу обладают растения-трансформанты с суперэкспрессией единичных генов супероксиддисмутазы, аскорбатпероксидазы, глутатион-Б-трансферазы, глутатионредуктазы и др. В то же время, остается мало изученным действие окислительного стресса на основные структурно-функциональных системы индивидуальных клеток.

Настоящая работа направлена на решение одной из актуальных проблем современной биотехнологии — изучение клеточных механизмов, обеспечивающих защиту растений от действия оксидативного стресса.

Первичный ответ на действие АФК к клетке является синтез супероксиддисмутаз (СОД) (Fe-SOD, Mn-SOD и Cu/Zn-SOD), основная функция

л

которых заключается в ферментативном превращении супероксида (О ") и воды перекись водорода (Н2О2), нейтрализуемый затем другими ферментами, в частности, аскарбатпероксидазой. Хлоропласты наиболее подвержены риску токсических повреждений, вызываемых АФК, так как молекулярный кислород в

процессе фотовосстановления, происходящего в фотосистеме I, получает дополнительный электрон и превращается в супероксид (О"). В геноме арабидопсиса содержится 7 генов, кодирующих различные виды и изоформы СОД. Установлено, что Fe-SOD2 и Fe-SOD3 локализуются в хлоропластах. Показано, что они формируют гетеромерный белковый комплекс с нуклеоидом хлоропластов. Локализация Fe-SODl, установленная путем трансляционного слияния с GFP белком, свидетельствует о его наличии в цитоплазме и ядре, причем установлено, что экспрессия Fe-SODl в антисенс-ориентации не приводит к нарушению структуры пластид, в отличие от аналогичных экспериментов с Fe-SOD2 и Fe-SOD3 [167]. В настоящее время остаются малоизученными многие аспекты, связанные с особенностями влияния локализации продуктов экспрессии введенных генов, а также с влиянием внедренных генов на структурную организацию клеточных компартментов. Исходя из роли супероксиддисмутаз в антиокислительной защите структурной организации пластид, принципиальное значение имеет вопрос - может ли экспрессия цитоплазматической Fe-SOD приводить к изменениям структуры компартментов клетки при перенаправлении ее в хлоропласт.

Цель работы - изучить влияние экспрессии гена Fe-зависимой супероксиддисмутазы с сигнальной последовательностью Rbsc на структурную организацию хлоропластов трансгенных растений табака и томата при действии окислительного стресса.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Получить трансгенные растения томата и табака, экспрессирующие ген Fe-SODl, кодирующий цитоплазматическую Fe-зависимую супероксиддисмутазу из Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. с сигнальной последовательстью гена rbsc гороха (Pisum sativum L.) для локализации продукта в хлоропластах;

2. Измерить активность супероксиддисмутазы у трансгенных растений томата и табака, с экспрессией гена Fe-SODl',

3. Изучить влияние экспрессии гена Ре-ЗОИ 1 у трансгенных растений томата и табака на пролиферативную активность клеток меристемы корня;

4. Изучить влияние экспрессии гена Ее-БОИ 1 у трансгенных растений томата и табака при таргетинге продукта в пластиды на структурно-функциональную организацию клеток фотосинтезирующих тканей;

5. Изучить влияние экспрессии гена Ге-$ОВ1 на физиологические и структурные характеристики трансгенных растений томата при воздействии абиотических факторов (засоление, УФ-радиация), генерирующих образование в клетке АФК.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Негативное влияние абиотических стрессовых факторов на культурные

растения

Растения часто подвергаются влиянию неблагоприятных факторов окружающей среды - стрессоров. Стрессоры делятся на абиотические и биотические. К биотическим стрессорам относят воздействие патогенов -бактерий, вирусов, растительноядных насекомых. Абиотическими стрессорами являются засоление почв, водный дефицит, экстремальные температуры, ультрафиолетовая радиация, гипоксия и ряд других [1].

В первую очередь стрессоры угнетают развитие и рост растения, снижают продуктивность. Было выявлено, что урожайность культурных растений обычно составляет всего 20% от максимально возможного уровня [43]. Предполагаемые потери урожая от абиотических стрессов сотавляют: 17 % из-за засухи, 20% за счет засоления почв, 40% из-за повышенных температур, 15% из-за низких температур и 8% за счет других неблагоприятных факторов среды [28,199].

Засоление, затопление, воздействие экстремальных температур, засуха, токсические концентрации тяжелых металлов, высокая кислотность или щелочность почв снижают продуктивность сельскохозяйственных растений в два раза и более [43, 45], а при высокой интенсивности и достаточно долгой продолжительности стресса приводят к их гибели. В соответствии с данными FAO (ООН по вопросам продовольствия и сельского хозяйства) около 22% пахотных земель являются засоленными [78].

1.1.1 Неблагоприятное действие засоления и солевого стресса

Причиной ингибирования роста большинства видов культурных растений и ограничения их урожайности является избыток солей в почвенном растворе [43, 108]. Засоление почвы связано с избыточным количеством натрия, кальция, магния, хлоридов, сульфатов и карбонатов. Если содержание солей более чем 0,20,25%, почва считается засоленной. Прогнозируют, что в связи с засолением через

25 лет 30 % земель станут непригодными для использования в сельском хозяйстве.

Существует несколько причин почвенного засоления. Ранее наиболее распростаненной причиной засоления являлось наличие естественного высокого уровня минеральных солей в почве, реже причиной засоления являлись периодические затопления ряда районов морской или соленой водой. В последние годы основной причиной увеличения количества непригодных или слабо пригодных для сельского хозяйства засоленных земель все чаще становится деятельность человека. Это происходит по причине неконтролируемого использования водных ресурсов, неправильной мелиорации, что вызывает так называемое вторичное засоление [27, 81]. Кроме того, в последнее время ряд авторов утверждает, что дополнительно на эти процессы влияет изменение климата, в результате действия человека, что приводит не только к засолению, но и к опустыниванию огромных районов некогда плодородных территорий [45].

Засоление почвы характерно для большинства регионов, где испарение превышает количество выпадающих осадков. Многие умеренно или сильно солеустойчивые растения могут нормально существовать на соленых почвах. Подобные виды используют различные способы нейтрализации или избежания ионной токсичности и могут поддерживать поглощение воды, поддержание тургора и транспирацию в присутствии высоких концентраций солей [34]. Некоторым видам удается использовать локализацию ионов в специальных компартментах или клетках (специфические вакуоли и солевые железки), препятствовать поглощению токсичных ионов с помощью белковых комплексах на мембранах блокирующих их проникновение, ряду растений также удается избежать других негативных воздействий, вызванных засолением, используя формирование АФК. Чувствительность растений к засолению меняется в зависимости от вида, генотипа и стадии роста [92].

Обычно, засоление почвы связывают с накоплением различных солей натрия. Таким образом, засоление часто именуют хлоридным, сульфатным, содовым или смешанным в зависимости от преимущественного вида солей натрия

в почвенном растворе [103]. В ряде случаев в реальных условиях в разных горизонтах почвы на одном участке могут присутствовать существенно отличающиеся по составу комбинации ионов. При засолении почв это проявляется как токсическое влияние высоких концентраций солей и вызывает изменения в водном балансе растения, существенно влияя на транспирацию, тургор и транспорт воды. Наиболее изученной является реакция на хлоридное засоление. При засолении - ионы Ма+ и С1- оказывают влияние не только на водные оболочки молекул, но также препятствуют нековалентным взаимодействиям между аминокислотами белков. Это приводит к конформационным изменениям и потере функций белков. Высокая концентрация натрия в засоленой почве препятствует накоплению других катионов. Условия засоления могут также вызвать дефицит калия [40].

Засоление оказывает влияние на рост растений, вызывая нарушения, приводящие к дефициту минеральных веществ и токсичность ионнов, может приводить к нарушению физиологических и биохимических процессов метаболизма [164]. В условиях засоления у большинства гликофитов понижается содержание хлорофиллов [86]. Одним из объяснений понижения количества хлорофилла в клетке в условиях засоления может быть активация протеолитических ферментов, ответственных за деградацию хлорофилла [213] Солевой стресс оказывает влияние на содержание каротиноидов, а также на эффективность фиксации углерода, за счет активности рибулозо 1,5- бифосфат карбоксилазы/оксигеназы [68].

Высокие концентрации солей вызывают повреждение мембранных структур и целостность ряда компартментов. Повреждения проявляются в росте проницаемости мембран и утрате спос