Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический и биохимический анализ мутантов Arabidopsis thaliana (L. ) Heynh с измененной чувствительностью к окислительному стрессу

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маманова, Лира Бакиевна, Москва

Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова Биологический факультет

На правах рукописи УДК: 575.174.015.3:582.739

Маманова Лира Бакиевна

Генетический и биохимический анализ мутантов АгаЫёор$1§ №аНапа (Ь.)НеупЬ с изменённой чувствительностью к окислительному стрессу

Специальность 03.00.15 - "Генетика"

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

ШлЦ

Научный руководитель -кандидат биологических наук доцент Т.А. Ежова

Москва -1999

СОДЕРЖАНИЕ.

Стр.

Список сокращений. 5

Введение. 6

Глава I. Литературный обзор. 8

1.1. Окислительный стресс. 8

1.1.1. Активные радикалы кислорода, вызывающие окислительный стресс. 9

1.1.2. Окислительный стресс, вызванный гербицидами. 10

1.1.2.1. Норфлуразон. 10

1.1.2.2. Плюмбагин. 12

1.1.2.3. Ацифлуорфен. 12

1.2. Антиоксидантные защитные системы растительных клеток. 14

1.2.1. Ферментативные системы защиты от окислительного стресса. 15

1.2.1.1. Супероксиддисмутазы. 15

1.2.1.2. Каталазы. 16

1.2.1.3. Пероксидазы. 18

1.2.1.3.1. Функциональные особенности и внутриклеточная локализация аскорбатпероксидаз (АРХ). 19

1.2.1.3.2. Функциональные особенности и внутриклеточная локализация гваяколпероксидаз. 20

1.2.2. Неферментативные системы защиты от окислительного стресса. 21

1.3. Использование трансгенных растений для изучения физиологичесских и генетических механизмов устойчивости растений к окислительному стрессу. 23

1.4. Использование мутантов для изучения физиологических и генетических механизмов устойчивости растений к окислительному стрессу. 29 1.4.1. Мутанты, чувствительные к озону. 30 (.4.2. Мутанты, чувствительные к ультрафиолету (УФ). 30

1.4.3. Мутанты, чувствительные к кадмию. 31

1.4.4. Мутанты с изменённой чувствительностью к фитопатогенам. 32

1.4.4.1. Мутанты, конститутивно зкспрессирующие иммунный ответ и реакцию "гиперчувствительности". 33

1.4.4.2. Мутанты с конститутивным иммунным ответом, но без некротичесских пятен. 34

1.4.4.3. Мутанты, не имеющие иммунного ответа. 34

I.4.5. Мутанты, толерантные к гербицидам. 35

Экспериментальная часть. 40

Глава И. Материалы и методы. 40

II.1. Растительный материал. 40 Н.2. Методы. 41

11.2.1. Выращивание арабидопсис в асептической и почвенной культуре. 41

11.2.2. Метод отбора устойчивых к норфлуразону растений A.thaiiana. 41

11.2.3. Метод определения чувствительности к НФ. 42

11.2.4. Метод отбора чувствительных к плюмбагину мутантов и определения чувствительности к плюмбагину. 42

11.2.5. Метод отбора ацифлуорфеновых мутантов и определения чувствительности к ацифлуорфену. 43

11.2.6. Метод определения чувствительности к параквату. 43

11.2.7. Метод определения чувствительности к паклобутразолу. 44 ¡1.2.8. Метод регистрации замедленной флуоресценции хлорофилла. 44

11.2.9. Метод электрофоретического выявления изоформ пероксидаз (РХ)

и супероксиддисмутаз (SOD). 45

11.2.10. Метод определения активностей изоформ пероксидаз и супероксиддисмутаз. 47

11.2.11. Морфологическая характеристика растений. 49

11.2.12. Метод сканирующей электронной микроскопии. 49

11.2.13. Методы статистического анализа. 50

11.2.14. Методы генетического анализа. 50

Глава ill. Результаты и обсуждение. 52 111.1. Создание селективных систем для отбора мутантов с изменённой

чувствительностью к агентам, вызывающим окислительный стресс. 52

111.1.1. Влияние на проростки A.thaliana агентов, ингибирующих биосинтез пигментов в растениях. 53

111.1.2. Влияние на проростки A.thaliana редокс-циклических агентов. 57 IH.1.3. Влияние салициловой кислоты на проростки A.thaliana. 64 lit. 2. Изучение толерантных к норфлуразону мутантов A.tha!iana. 65

111.2.1. Получение мутантов, толерантных к норфлуразону. 65

111.2.2. Фенотипический и генетический анализ мутантов A.thaliana, толерантных

к норфлуразону. 67 IH.2.2.1. Морфологические особенности карликовых мутантов, толерантных к

норфлуразону. 67

111.2.2.2. Генетический анализ карликовых мутантов. 72

111.2.2.3. Морфологические особенности некротических мутантов. 82

111.2.2.4. Генетический анализ некротических мутантов. 83

111.2.2.5. Мутанты nfz12, nfz18, nfz24, толерантные к НФ. 84

111.2.2.6. Генетический анализ мутанта nfz24. 89

111.2.3. Изучение перекрёстной устойчивости к параквату мутантов, толерантных к норфлуразону. 91

111.2.3.1. Влияние параквата на растения расы Dijon и карликовых мутантов, толерантных к норфлуразону. 92

111.2.3.2. Влияние параквата на растения расы Dijon и мутантов nfz18 wnfz24. 93

111.2.3.3. Влияние параквата на растения расы Dijon и некротических мутантов. 94

111.2.4. Влияние параквата на замедленную флуоресценцию хлорофилла в листьях растений расы Dijon и мутантов, толерантных к норфлуразону. 95 III. 3. Изучение мутантов с изменённой чувствительностью к плюмбагину. 98

111.3.1. Отбор мутантов с изменённой чувствительностью к плюмбагину. 98

111.3.2. Морфологические особенности плюмбагиновых мутантов. 100

111.3.3. Генетический анализ мутантов. 103

111.3.4. Изучение чувствительности плюмбагиновых мутантов к параквату. 104 III. 4. Изучение мутантов с изменённой чувствительностью к ацифлуорфену. 105

III .4.1. Отбор мутантов с изменённой чувствительностью к ацифлуорфену. 105

ili.4.2. Фенотипическое и генетическое изучение мутантов. 108

IH.4.2.1. Пигментные мутанты. 108

111.4.2.2. Некротический мутант. 114

111.4.2.3. Мутант с нормальными зелёными листьями. 114 IH.5. Изучение аитиоксидантных ферментов в мутантах с изменённой чувствительностью к норфлуразону. 115

111.5.1. Изучение активности SOD и РХ у мутантов, толерантных к норфлуразону. 115

111.5.1.1. Изучение активности SOD и РХ на разных стадиях онтогенеза. 115

111.5.1.2. Влияние норфлуразона на активность SOD и РХ. 120

111.5.2. Анализ изоферментного состава РХ. 124 Ш.5.3. Изучение изоформ SOD. 130 HI.5.4. Влияние норфлуразона и параквата на относительную активность отдельных изоформ SOD и РХ. 133

Заключение. 139

Выводы. 145

Список публикаций по теме диссертации. Список литературы.

146 147-162

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

АБК - абсцизовая кислота

АЦ - ацифлуорфен

ГАз - гибберелловая кислота

ЗФ - замедленная флуоресценция

ИУК - индолилуксусная кислота

НУК - нафтилуксусная кислота

НФ - норфлуразон

ОС - окислительный стресс

ПААГ - полиакриламидный гель

ПК - паракват

ПЛ - плюмбагин

CK - салициловая кислота

УФ - ультрафиолет

ФС1 - фотосистема I

ФСН - фотосистема II

ЭМС - этилметансульфонат

ЭТЦ - электронно-транспортная цепь

ALS - ацетолактатсинтаза

АРХ - аскорбатпероксидаза

CAT - каталаза

GR - глютатионредуктаза

GST - глютатион-в-трансфераза

Pcb - паклобутразол

PDS - фитоиндесатураза

РРОХ - протопорфириногеноксидаза

РХ - пероксидаза

Rf - электрофоретическая подвижность ROI - активные формы кислорода SAR - системная приобретённая устойчивость SOD - суперокиддисмутаза

Введение.

Окислительный стресс (ОС) обусловлен токсическим действием на клеточные структуры активных форм кислорода, перекисей и различных радикалов, образующихся как в процессе жизнедеятельности растений (в частности, при фотосинтезе), так и под воздействием целого ряда стрессовых факторов внешней среды. В клетках растений имеются защитные механизмы, устраняющие токсичные радикалы и обеспечивающие адаптацию к экстремальным условиям. В том числе, важную роль в нейтрализации токсичных радикалов и перекисей играют ферменты антиоксидантной защитной системы - супероксиддисмутазы (SOD), пероксидазы (РХ), катапазы (CAT), глутатионредуктазы (GR), глутатионтрансферазы (GST) и др. Вместе с тем, генетические и физиологические механизмы восприятия растениями стрессового сигнала и его передачи на уровень регуляции действия генов антиоксидантной защитной системы остаются мало исследованными. Эффективными подходами для изучения этих вопросов являются: (1) создание и физиолого-биохимический анализ трансгенных растений с изменённой экспрессией генов антиоксидантной защитной системы; (2) получение и изучение мутантов с изменённым ответом на окислительный стресс. Последний подход является особенно ценным для выявления новых генов, отвечающих за развитие устойчивости к окислительному стрессу у растений.

Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. является модельным генетическим объектом. Короткий жизненный цикл (1,5 - 2 месяца), высокая плодовитость (до 1000 семян с одного растения), миниатюрность растений, позволяющая выращивать их в пробирках в лабораторных условиях, а также мелкий размер семян, дающий возможность анализировать на одной чашке Петри более 1000 проростков, позволяют считать A.thaliana наиболее удобным объектом для получения мутантов, с изменённой чувствительностью к окислительному стрессу. Для получения таких мутантов в качестве селективного агента могут быть использованы гербициды, вызывающие образование активных радикалов кислорода и гибель растений в результате окислительного стресса. Получение мутантов, резистентных к гербицидам, представляет не только научный интерес, но имеет большое практическое значение: небольшой размер генома A.thaliana (около 120 000 т.п.н.) и малое количество повторяющихся последовательностей повышают эффективность экспериментов по клонированию генов, что позволяет использовать гены A.thaliana

для создания устойчивых к гербицидам форм хозяйственно ценных растений (11 I., е! а1., 1992).

Данное исследование направлено на выделение, а также генетическое и физиолого-биохимическое изучение мутантов А.НчаНапа с изменённой чувствительностью к гербицидам с целью идентификации генов, участвующих в адаптивном ответе на окислительный стресс. Задачами работы являлось:

1. Создание надёжных селективных систем для отбора мутантов с изменённой чувствительностью к ОС. И выделение таких мутантов.

2. Фенотипическая характеристика полученных мутантов и их генетический анализ.

3. Изучение перекрёстной устойчивости к другим агентам.

4. Анализ активности ферментов антиоксидантной системы защиты у растений дикого типа и мутантов в нормальных условиях и при воздействии стресса.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. Окислительный стресс.

Окислительный стресс в растениях может вызываться целым рядом разнообразных абиотических и биотических факторов (Рис.1).Каждый из них тем или иным способом приводит к образованию вредных для растений производных кислорода (ROI - reactive oxygen species), которые являются сильными окислителями: дигидроперекиси водорода Н2О2, гидроксильного радикала - ОН, супероксидного аниона - О'г, синглетного кислорода - 102 (Mehdy М.С., 1994; Bartoz G., 1997).

Биотические и абиотические -----> Озон, ультрафиолет, засуха, стрессовые воздействия тепловой и холодовой стрессы, соли,

р-окисление жирных кислот, фотосинтез,

окислительное фосфорилирование, фотодыхание, старение и др. i

ROI (H202,0H\ 0"2,102. ОН)

окислительный стресс i

адаптивный ответ

Рисунок 1. Возникновение окислительного стресса у растений (Vernooij В., et al.,

4

Фитопатогены, тяжелые металлы, гербицида, засоление и т.д.

1994).

Возникновение окислительного стресса может быть вызвано разными путями, в зависимости от стрессового фактора. При разных стрессовых воздействиях (и

эндогенных, и экзогенных) в развитии окислительного стресса могут принимать разные активные радикалы кислорода.

1.1. Активные радикалы кислорода, вызывающие окислительный стресс.

Большое число химически активных и потому токсичных форм кислорода возникает в процессе фотосинтеза в хлороппастах. Синглетный кислород представляет собой высокоэнергетическое электронное состояние, образующееся в результате переноса энергии электрона от триплетно возбужденных молекул хлорофилла (3Р) на атом кислорода.

Р------>1р—->3Р, 3Р+02------>р+1о2

Эффективными источниками синглетного кислорода являются также предшественники хлорофилла - протохлорофилл, протофеофитин, протопорфирин, мезопорфирины.

Синглетный кислород играет ключевую роль среди активных форм кислорода. Он является сравнительно устойчивым продуктом, способным выходить из компартмента, где он непосредственно генерируется, обладает высокой реакционной способностью и сильным поражающим воздействием на белки, липиды и хлорофилл (Гольдфельд М.Г., Карапетян Н.В., 1989).

Во время кислородного дыхания при работе митохондриальной электрон-транспортной цепи кислород (02) может акцептировать электрон на ферредоксине и превращаться в суперокисдрадикал (0"2). Супероксидрадикал под действием фермента супероксиддисмутазы восстанавливается в перекись водорода (Н2О2). Оба эти ROI хотя и влияют на определенные клеточные структуры и процессы, не являются очень токсичными соединениями. Но в присутствии тяжелых металлов происходит реакция Хаббера-Вайса (Bowler М., et al., 1992): Fe^Fe3*

Н202+0"2------------>0H"+02+0H

В результате этой реакции образуется гидроксиланион, молекулярный кислород и гидроксилрадикап, представляющий собой крайне реакционно-способное и токсичное соединение. Основной мишенью гидроксилрадикала оказываются липиды мембраны, содержащие ненасышенные жирные кислоты; гидроксилрадикап вызывает цепную реакцию перекисного окисления липидов и жирных кислот, в результате которой при действии даже небольшого количества гидроксилрадикала

пораженными оказываются обширные участки мембран. Продуктом перекисного окисления липидов является токсичное соединение малондиальдегид (Гольдфельд М.Г., Карапетян Н.В., 1989). Таким образом, гидроксилрадикал (наряду с синглетным кислородом) является наиболее реакционно-способным агентом среди вызывающих окислительный стресс.

1.2. Окислительный стресс, вызванный гербицидами.

Агентами, вызывающими ОС являются многие гербициды. Хотя гербициды, имеющие разную химическую природу, оказывают влияние на самые разные биохимические процессы в клетках растений, гибель растений под действием гербицидов в большинстве случаев связана именно с окислительным стрессом. Рассмотрим механизмы действия на растения тех гербицидов, которые используются в данной работе.

1.2.1. Норфлуразон.

Гербицид норфлуразон относится к группе пиридазинонов, многие из которых, как и сам норфлуразон, широко применяются в сельском хозяйстве. Эта группа гербицидов названа обесцвечивающими, поскольку их действие приводит к уменьшению содержания хлорофиллов вследствие их фотодеструкции.

^-УН-СНз

а

Норфлуразон обладает множественными действиями на растение:

1. блокирует биосинтез каротиноидов;

2. ингибирует фотосинтетическую цепь переноса электронов;

3. вызывает изменение жирнокислотного состава липидов.

Основным эффектом норфлуразона на растения является ингибирование биосинтеза каротиноидов в хлоропластах растений. Норфлуразон блокирует синтез каротиноидов на стадии десатурации (дегидрирования) фитоина в фитофлуин,

ингибируя посредством неконкурентного связывания фермент фитоин-десатуразу, являющуюся ключевым ферментом биосинтеза каротиноидов (Рис.2). В результате этого происходит накопление бесцветного фитоина и недостаток каротийоидов в хлоропласте (Fraser P.D., et al., 1993; Chamovits D., et al., 1990).

Мевалонат -> фарнезил пирофосфат -» геранилгеранил пирофосфат энт-каурен 4 4* I

АБК фитоин ГА

4» офитоин-десатураза <=*нофлуразон

фитофлуин

4-

р-каротин 4-

АБК

Рисунок 2. Схема биосинтеза каротиноидов в растениях (Pecker I., et al., 1992). Принятые обозначения: <=*- ингибирование.

Следует отметить, что каротиноиды являются предшественниками для синтеза абсцизовой кислоты (АБК), а предшественник фитофлуина - геранилгеранил-пирофосфат является также предшественником синтеза еще одного класса фитогормонов - гиббереллинов (ГА) (Рис.2).

Другое действие норфлуразона заключается в том, что он блокирует перенос электронов по ЭТЦ ФСИ в её акцепторной части. Полной блокировки при этом не происходит. Третье действие норфлуразона заключается в ингибировании образования полиненасыщенных жирных кислот в галактолипидах хлоропластов. Исследования, выполненные на водорослях Spirufina pfatensîs и Monodus subterraneus показали, что наиболее чувствителен к действию НФ, является переход линолевой кислоты в линоленовую кислоту (Cohen Z., et al., 1990).

В конечном счёте обесцвечивание и гибель растений под действием норфлуразона связана с накоплением кислородных радикалов и триплетов хлорофилла, способствующих протеканию процессов окислительной деструкции хлорофилла, свободно-радикального окисления компонентов растительной клетки.

Эти эффекты обусловлены повышенной чувствительностью пигментного аппарата к свету из-за резкого уменьшения содержания каротиноидов, так и из-за подавления активности фотосинтетического переноса электрона, когда энергия света, поглощенного молекулами хлорофилла, не может быть использована в реакционных центрах и поэтому ведёт к фотодеструкции пигментов хлоропластов.

1.2.2. Плюмбагин.

Плюмбагин (5-гидрокси-2 метил-1.4-нафталендион) - вещество, относящееся к классу нафтохинонов. Хиноновые гербициды осуществляют подавления транспорта электронов на уровне связанного пластохинона. На свету акцепторный комплекс ФСН обратимо связывает несколько молекул хинона, вытесняя эндогенный ппастохинон, при этом полностью подавляя дальнейшее восстановление пластохинонового пула и перенос восстановительных эквивалентов далее в электронно-транспортную цепь. Плюмбагин способствует образован