Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение вариантов рекомбинантных вирусов осповакцины, экспрессирующих антигены вируса гепатита В

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение вариантов рекомбинантных вирусов осповакцины, экспрессирующих антигены вируса гепатита В"



министерство здравоохранения РОССИЙСКОЙ федерации научно-исследовательский институт МОЛЕКУЛЯРНОЙ биологии ч нпо "ВЕКТОР"

N ^ На ггоавах оукописи

Дмитриев Игорь Павлович

получение вариантов рекомбж1антных е31рус03 осповакцщы, окс1РЕССИРЛ:ш1х антигены 'вируса гепатита в

03. СО,03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Колыкзво - 1994

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте молекулярной биологии Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководители: кандидат биологических наук Беляев A.C. кандидат медицинских наук Игнатьев V.U.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Гайдуль К.В.

кандидат биологических наук Ильичев A.A.

Ведущая организация: Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, Москва.

Защита состоится в

"_" часов на заседании Специализированного

совета К 098.08.01. при Всесоюзном научно-исследовательском институте молекулярной биологии НПО "Вектор" по адресу: 633159, п. Колъцово, Новосибирская область, Новосибирский р-он.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института молекулярной биологии НПО "Вектор"

Автореферат разослан " /"¿¿¿ОЩ 1994г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических ~

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Вирусный гепатит'Б (ГВ) является ол-нрй из наиболее социально значимых инфекций. характеризующейся рысоким процентом неблагоприятных исходов: хронические заболевания печени, цирроз и гепатокаряинома. в результате острых и хронических форм инфекции. Более 300 млн. человек в мире находятся в состоянии хронического вирусоносительства и яеляются резервуаром инфекции. Поэтому разработка методов борьбы с этой инфекцией -олна из важнейших проблем здравоохранения. Поскольку эффективных этиологических средств лечения ГВ не существует, вакцинопрофилак-тика является наиболее эффективным способом контроля и предупреждения этого заболевания.

Разработка вакцины против ГБ долгое время встречала большие трудности в связи с узким кругом хсзяез (человек -и шимпанзе') и безуспешностью культивирования вируса in vitro. Использование методов генной инженерии позволило установить организация генома вируса гепатита Б (ВГВ) (Pasek.' 19791 и обеспечить возможность для разработки рекомбинантных субьединичных и живых вачшш против ГБ.

Изучение иммунитета при ГВ показало, что протективными Факторами иммунитета против БГВ являются гуморальный и клеточный иммунный ответ (Tioilais. 1985) на HBsAsr и preS2 антиген оболочки. НВеА? и НВсАе нуклеокалсила, что свидетельствовало о необходимости включения их в вакцину против ВГВ.

Одними из первых были получены рекомбинантные штаммы вируса осповакшшы (ВОВ) fPaoietti, 1984: Smith, 1983) . экспрессиругсшие ЯЕзАг и Называющие пои иммунизации лабораторных животных появление aHTi5-;:3s-антител. Встройка гена среднего белка оболочки БГВ в

ЕОБ t'Chene, 1987 j приводила к снижению уровня экспрессии HBsAg' in vitro, в тоже время не опубликованы данные о иммуногенности подученного рекомбинантного BOB для приматов.

, леди ц задачи иссдедования. Настоящая работа посвяшена получению рекомбинантных ВОВ. зкспрессируюших гены БГВ; исследованию продукции белков, колируемых этими генами при инфицировании культуры клеток, а также изучению гуморального и клеточного иммунного ответов против антигенов БГВ при иммунизации лабораторных животных.

Основной целью работы является создание штаммов рекомбинантных BOB. Еызываших при иммунизации животных индукцию иммунного ответа против БГВ и перспективных для разработки живой рекомби-нантной вакцины против ГВ.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые по-r/чены рекомбинантные ВОВ эффективно экслрессируюшие HBsAf с рге22-летерминантой. НВсАе- и белок проявляющий антигенную активность HBeAg- БГВ, Эффективная продукция HBsAg с рге52-детерминан-той была достигнута за счет изменения неблагоприятного дйя рибосом млекопитающих природного сайта инициации трансляции рге52-об-ласти .на синтетический. Продукция HBcAg достигалась с гена С. теша как экспрессия с AUG-код она ргеС-последовательности была неэффективной. Удаление из гена С фрагмента i'117-ть 3'-концевых н.п.). кодирующего полиаргининовый тракт белка нуклеокапсида, приводило к синтезу белкового продукта,• который не проявлял НВс-ан-тигенности но реагировал с антителами узнающими эпитопы HBeAg.

Впервые показано, что иммунизация приматов рекамбинантным

штаммом ВОВ V?.532-3 вызывает не только гуморальный но и клеточный иммунный ответ на КБзАсг с рге32-детерминантой. Иммунизация рекомбинантным штаммом v7.SC приводит к индукшш гуморального и клеточного иммунного ответа на НБсАе у линейных мышей, а также гуморального ответа у обезьян.

Полученные рекомбинантные ВОВ у7,532-5 и v7.SC. зкспрессиру-¡ошие соответственно НЕбА? с рге32-летерминантсй и НВсАг являются перспективными кандидатами для создания живой рекомбинантной вакцины против ГВ.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на конференции "Проблемы биотехнологии иммунобиологических и гемот-рансфузионных препаратов" .(Новосибирск, 1988); Всесоюзной конфе-ренпии "Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии" (Тарту. 1988); Всесоюзном совещании (семинаре) "Молекулярная биология. ЯНК-содеряаших вирусов, имекгих практическое значение лля сельского хозяйства и медицины ("Киев. 1990); Всесоюзной школе-семинаре "Молекулярная биология и медицина" (Ленинград, 1990); V конференции Российской АН "Новые набавления биотехнологии" Шушно, 1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ. Получено 2 патента Российской Фелераши и одно авторское свидетельство.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора - "Экспрессия чужеродных генов в составе генома ВОВ", материалов и методов исследования, описания результатов я их обсуждения, выводов и списка шпизуемой литерату-

ры, включающего 179 наименований, забота изложена на 120 страницах машинописного текста, включает 13 рисунков и 10 таблиц.

Использованные сокращения. БДУ -'5-бромдезоксиуридин, БОЕ -бляшксобрасуюшие единицы.- БГБ - вирус гепатита В, ВОВ - вирус ос-повакпины, ГБ - гепатит Б, ДНК - цезоксирибонуклеиновая кислота. РНК - рибонуклеиновая кислота. ЙФА - иммуно-ферментяый анализ. Кон. А- конканавадин А, ОЭМч - вакцина против острого энцефаломиелита человека. РЕТД - реакция бласттрангформаши лимфоцитов. РИА

- радио-иммунометрический анализ. ТК - тимидинкиназа. ак. - аминокислота. п.н. - пар нуклеотшов, м.в. - молекулярный вес. HBcAg

- антиген куклеокапсила вируса гепатита Б, НБеАе - секретируемый антиген ьируса гепатита В. HBsAg- - основной антиген оболочки вируса-гепатита Б.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Введение. Конструирование живых рекомбинантных вакцин на основе ВОВ является перспективным направлением в создании.новых средств профилактики инфекционных заболеваний. Настоящая работа пссвятена получению рекомбинантных БОБ. ' экспрессирующих антигены 3ГБ. Выбор БОБ в качестве вектора обусловлен его способностью инфицировать широкий круг клеточных культур, животных и человека; большой векторной емкостью и возможностью получения живых поливалентных вакцин, а кроме того многолетним опытом вакцинации против оспы.

Конструирование слазмидных Еектооов для интеграции _генов БГВ в геном БОБ. Получение плазмил интеграции проводили на основе

вектора pVARlo (Фодор, . 1987), содержащего ранне-поздний промотор 7.5k и последовательности гена ТК ВОВ, обеспечизаюиие интеграцию чужеродной ЗНК в геноме БОБ.

/ В качестве источника гена 5 с рге32-сбластью использовали ij,лагмиду pLSl (Лунин. 1983), содержащую фрагмент 2НК. кодирующий средний белок ободочки ВГВ субтипа ayw. При конструировании плаз-милного вектора p7,5S2-S для интеграции гена S2-S в геном ВОВ нами была проведена замена природного сайта инициации трансляции рге32-области iGCCAHGG) на синтетический (ATCAUGA) с целью увеличения продукции HBsAet. Поскольку известно, что рибссомы млекопитающих эффективно используют лхя инициации трансляции РНК толы® последовательность A/GNNAUGA/G (КозаЧ, 1984; 1SS6). Источником гена белка нуклеокапсила служила плазмида pGC74 (Борисова, 19В4), содержащая фрагмент ДНК БГВ fayw), кодирующий ген С с сгеС-аб-ластью. Зля получения рексмбинантных ВОН, экспрессируюшк ген нуклеокапсила ВГВ были сконструированы ДЕе плагмкзы интеграции: р7,5ргеС, содержащая полный ген нуклеокапсила и р7,БС. содержащая 3'-конец ргеС-области (18 п.н.) и -ген С. Нелью получения .двух вариантов рексмбинантных ВОВ было сравнение уровня продукции КБсАг с сайта инициации трансляции ргеС-области (ACCAUGC) и непосредственно с гена С. текшего более благоприятный i'G в +1 положении) для рибосом млекопитающих сайт- G6CAUGG. Зля получения рекомои-нантного ВОВ, кодирующего белок, проявлявши! свойства НВеАе была сконструирована плазмида интеграшш р7,5Е, содержащая ген С за исключением 117 З'-концевых нуклеотидов. кодирующих 39 а.к. псли-аргининового тракта-белка нуклеокапсила.

Получение рекомбинантных БОЕ. Бстрсйку гэноз 5Г5 2 гексм ЕОВ "ссеоллли метолом котоанссекшга iNakar.o. 1962) пдазмилясй я ая-

- 5 - j

русной ЛНК в культуре клеток CV-1, инфицированных БОБ. Для встройки использовали клонированный вариант БОВ штамма ЛИЕП Гклон ¡Ш, который был предоставлен доктором Петровым Б.С. Отбор рекомбинантных БОВ fTK~) осуществляли клонированием материала транс-фекшт на клетках таль туры Rat-2iTK-1 с использованием БДУ в качестве селектирующего агента.. Подтверждение- интеграции генов БГБ в геном БОБ проводили методом рестрикшгонного анализа ДНК. Было показано, что встройка генов НТВ произошла, в . HindIIIK-фрагмент ДНК БОВ, о чем свидетельствовало исчезновение этого фрагмента в. Hindi!I-гидролигатах ЛНК рекомбинантных ВОВ и появление новых фрагментов соответствующих по длине HindiIIK-фрагменту со встроенной в него ЛНК ВГВ. На рис.! представлена злектрофореграмма HindIII гидролизатов ГНК рекомбинантных БОВ. Как видно из элект-рофореграммы длинна соответствующих HindIII - фрагментов ДНК. содержащих встройку составляет для V7.5S2-S около 6700 п.н.. для v7,5preC около 5650 п.н.. для v7,5C - 5870 П.Н. ' и 5750 п.н. для v7,5E, что совпадает с расчетными данными. Наличие генов ВГВ в образующихся Hindii¡-фрагментах ДНК рекомбинантных ВОВ было подтверждено блот-гибридизалией с сс°2-Р меченными фрагментами генов 5ГВ. На рис.2 приведена карта генома ВГВ и схема расположения последовательностей SHK ВГВ в ТК-гене полученных рекомбинантных ВОВ.

Синтез белков вируса гепатита В в культуре клеток, инфицированных рекомбинантиыми штаммами БОВ. Для всех полученных рекомбинантных ВОВ была проведена опенка продукции антигенов ВГВ при инфицировании культуры клеток СУ-1. Для этого монослой клеток CV-1 з 6-луночных платах (диаметр лунки 35 мм) инфицировали рекомби-нантным БОБ с множественностью 10 БОЕ на клетку. В качестве отрицательного контроля использовали клетки, инфицированные БОВ ЛИВП.

тыс.

П.H.

j 6,5-> ¡l^-jfrn^^!!^

к 5.0-l 4,6-

м 4. 1->м

I WäüL '

"'У i

.«■j - /

fnM^iVr "fliTita imíiH?**"^i^rj^

<-6.7

-5.0 к -4.ô l

-4,1 m

ftœ.i. Рестрикционный анализ ДНК рекомбинантнш ВОЗ. v7.5S2-S, v7,5E, v7,5C и v7,5preC.

А 1. HindIII-гидролизат ДНК ВОВ (ЛИВП-клон N11.

2. HindIII-гидролизат ДНК фага X.

3. HindIII-гидролизат ДНК v7,5S2-S.

В 1. HindIII-гидролизат ДНК v7,5E.

2. HindIII-гидролизат ДНК v7,5C.

3. HindIII-гидролизат ДНК v7,5preC.

4. HindiI1-гидролигат ДНК BOS (ЛИЕП-клсн Ni).

! /

Х-ОРС

Iеном вируса гепатита В

ТК р7,5к рге-Э2

ТК'

ргв-С

з у7,5Б2-5 /7,5ргеС

v7.bC *7,5Е

Рис.£. Карта генома вируса гепатита В и расположение генов НТВ в гене ТК полученных рекомбинантных ВОВ.

Продукцию 'hSsAz рекомбинантным штаммом v7,5S2-S тестировали э сравнении с рекомбинантным BOB v?,5S, прелоставленным Гашнико-вым П.Б. и зкспрессируюшим только HBsAtr. Определение количества

iBsAg1 в обрагпах культуральной среды и лизатов каетск проводили

/

Методом РИА по калибровке сделанной по разведениям препарата плазменного HBsAg1 с известной концентрацией. Оказалось, что суммарный урогень экспрессии для y7,5S2-S составляет 130-340 нг а зля v7,5S - 165-350 нг HBsAg за 24ч в пересчете на миллион инфицированных клеток. Полученные результаты свидетельствуют, что продукция HBsAg- с измененного сайта инишаши трансляции рг°52-области сохраняется на том .те уровне как с гена 5 iv7,5S), тогда как. при экспрессии с природного сайта инициации трансляции рге52-области (Cheng, 1987) происходило снижение уровня синтеза HBsAg1 на 30%.

Определение ргеБ2-антигена проводили метолом твердофазного РИА. S качестве полложки использовали антитела, полученные при иммунизации кроликов синтетическим пептидом (DPRVRGLYFPAGG-SSSGTV-C), предоставленным доктором Самуковым В. В и содержащим антигенный сайт рге32-области (14-32 а.к.) среднего белка оболочки БГВ (itoh. 1966). Связавшийся антиген выявляли i2ol- меченными антителами к KBsAg. При этом, тестировались только рге52-антиге-ны, связанные с HBsAg-. В качестве отрицательного контроля использовали клетки, инфицированные ВОВ ЛИВП и рексмбинантиым БОБ •/7,55. При этом наблюдалось значительное превышение связывания меченых анти-HBs-антител в образцах клеток, инфицированных штаммом v7,5S2-S по сравнению с контролем. Таким образом, было показано. что рекоыбинаятный штамм '.'7.532-5 синтезирует з культуре клеток белок, который проявляет одновременно антигенные свойства -SsAe' и preS2-антигена соэзнего бедка ссолочки ВГЗ.

ларактеризашя белка оболочки ВГВ, синтезируемого штаммом v7,5S2-S в культуре клеток проводилась методом электрофореза в 12.57. полиакридамидном геле в денатурирующих условиях i'0,iz Яа-лодешшсудьфата) с последующей окраской кумасси-голубым. На злектрофореграмме, представленной на рис. ЗА приведена истина злектрофоретического разделения препаратов рекомбинантного 22-S-белка и плазменного KBsAe в качестве контроля. Для электрофореза использовали препарат очишенного методом афинной хроматографии рекомбинантного SE-S-белка. Как видно из злектрофореграммы, в препарате плазменного HBsAcr присутствует два белка с м.в. .в диапазоне 20-25 кда, что соответствует яегликозилированной форме основного белка оболочки БГВ - полипептиду Р25 fGanem, 1987). При разделении рекомбинантного S2-S-белка было выявлено три полосы соответствующие белкам с.м.в. около 90, 60 и SO кПа. При этом, белок с м.в. 30 кла примерно соответствует гликозилированной форме среднего белка оболочки - гликопротеину 6РЗЗ' fGanem, 1987). Полосы соответствующие белкам с м.в. около 90 и 60 кЛа, тго видимому. являются- продуктами не полной денатурации рекомбинантногс 22-Б-белка и соответствуют тримерной и димерной форме гликопроте-ина SP33.

Налэтие рге52-детешшзанты в рекомбинантном SZ-S-белке выявляли методом иммуноблотинга. Лля этого проводили электрофорез ка^ описано выше, белки с геля переносили на нитроцеллшозную мембра-hv и инкубировали с аффинированными антителами кролика к пептиду preS2i'i4-g2i. Связавшиеся антитела проявляли коньюгатом белка t Staphylococcus aureus с пероксилазой хрена. Из рис. ЗВ видно, чтс все три полосы, выявляемые в препарате рекомбинантного 52-3-белкг взаимодействуют с антителами к рге32-пептилу. Однако, наиболе« сильно проявляется полоса с м.в. около Su кПа, соответствующа!

1 2 3

Л Б В

Рис.3. Изучение рекомбинантного 32-Бтбелка при электрофорезе в 12,57. полиакриламвдном геле в денатурирующих условиях (0,1% На-додецилсульфат).

A. Окпаска кумасси-голубым:

1. Маркер м.е. !к2а;

2. Рекомбинантй ргеБЕ-З-бедог..

3. Плазменный НВзАе.

Б. Иммуноблотинг с антителами к пептиду рге32(14-32; после переноса на нитроцеллюлозу.

B. Окраска на гликопротеины комплексом конканавалин А-пероксидаза после переноса на нитроцеллюлозу.

! - 12 -

мономерной форме среднего белка оболочки БГВ, что, возможно связано с более полной денатурацией препарата.

Гликозидирование рекомбинантного 32-5-белка было показано в эксперименте по переносу белков с геля на нитроцеллюдозную полосу и инкубашш с комплексом конканавалин А-пероксидаза .(рис. ЗБ). При этом так же было установлено, что все три формы 52-5-белка проявляют окраску на гликопротеины.

Полученные результаты свидетельствуют, что при инфицировании юта туры клеток рекомбинантным штаммом у7,532-3 происходит синтез глакопротеина с м.в. около 30 кла. который содержит рге52-детер-минанту и соответствует среднему белку оболочки БГБ.

Изучение белка оболочки БГБ, продуцируемого штаммом v?,532-5 проводили метолом иммуноэдектронной микроскопии. Сетки для злект* ровной микроскопии сенсибилизировали антителами к рге32 (14-32) 5 инкубировали в среде культивирования клеток культуры СУ-1, инфицированных рекомбинантным БОБ. Электронная микроскопия проводи лась в лаборатории доктора Рябчиковой Е.И. Было однозначйо проде монстрировано', что синтезируемый белок подвергается самосборке < частшш НБбАег диаметром около 20 нм, которые содержат рге52-анти ген. Б тех случаях когда сетки обрабатывали отдельно препаратам; кудьтуральной среды- или антител частицы не обнаруживались.

■ Таким образом, изучение экспрессии гена среднего белка оболочки БГБ рекомбинантным штаммом у7,552-5 показало, что проведенное изменение колона инициации трансляции рге£2-области приводит гс эффективной продукции гликопротеина, который подвергается са-мососрке в частицы ИБбАв' с рге52-летерминантой.

Экспрессию белка нуклеокапсида БГБ изучали при инфицировании .-г.'дьтуры клеток СУ-1 рексмбинантными БОБ '/7.5игеС и у7,5С. Тестирование НБсАег 5 образцах кудьтуральной среды и лизатов клеток

провозили метолом конкурентного РИА по , ингибированио связывания анти-НЗс с сорбированным HBcAtr. Определение количества НВсАе в исследуемых образцах проводилось по калибровке сделанной на разведениях препарата НВсАг с известной концентрацией, наработанного в E.coli и предоставленного доктором Пибиногиным Б.В. Выло обнаружено, что штамм v7,5C продуцирует НВсАе в количестве 500 - 700

i

нг/мл/105клеток, в то время как v7,5preC - всего лишь 5-10 нг/мл. При этом продукт гена ргеС-С обнаруживался в среде культивирования и в лизатах инфицированных клеток, а продукт гена С -только в клетках. Таким образом, сравнение уровня экспрессии вариантов гена нуклеокалсида ВГВ показало, что эффективная продукция HBcAg- происходит только с сайта инициации трансляции гена С.

Выявление HBeAg при инфицировании культуры клеток рекомби-нантным штаммом v7,5E проводили метолом ЙФА с использованием диагностического набора для определения НВеАд/анти-НВе f"Abbot", ФРГ). При этом количественное определение уровня экспрессии'HBeAg затруднялось отсутствием в наборе препарата HBeAg с известной концентрацией, а также других его источников. При тестировании образцов культуральной среды и лизатов клеток, инфицированных ятаммом v7,5E оказалось, что НВе - антигенная активность выявляется только в клетках в титре 1:300.

Известно, что ргеС-С-белок ВГВ : направляется в 5ПР клетки сигнальной последовательностью f19 ак.), кодируемой рге-С-об-ластью и подвергается N- и С-конпевому протеолитическому пропес-сингу с образованием секретируемого ИБеАв- iOu, 1986: Yean-rean, 1969j. Тагам образом, отсутствие ргеС-области в вариантах гена нуклеокалсида. экспрессируемых рекомбинантными ВШ v7,5C и v7,5E обуславливает локализацию синтезируемых белковых продуктов внутри клеток. Б свою очередь, удаление из гена С 117-и З'-конпевых -

i - 14 -

нуклеотилов, кодирующих полиаргининовый тракт приводит к изменению конформашш белка нуклеокапсила. При этом белковый' продукт,

продуцируемый рекомбинантным BOB v7,5E теряет НВс-антигенность,

i

что подтверждается отсутствием его взаимодействия с антителами ' к НБсАг, и предпочтительнее реагирует с антителами узнавшими эпито-пы НВеАг i'MacKav, 1981).

Изучение специфического иммунного ответа на антигены ВГВ v лабораторных животных при иммунизации рекомбинантными штаммами ¿03. Основным преимуществом живой вакцины является моделирование естественного инфекционного ппоцесса. При этом иммуногенность загашн на основе рекомбинантных БОБ определяется как уровнем экспрессии, так характером экспрессируемого продукта. Поэтому для изучения иммунобиологических свойств были выбраны рекомбинантныё штаммы V7.5S2-S и V7.S0. эффективно экспрессирующие, соответственно, HBsAz, рге52-антигея и НВсАе. Иммуногенность рекомбинантных штаммов испытывали на мышах линии Balb/c и обезьянах macaca miaiía и таСаса bonnet по индукции специфического гуморального и клеточного иммунного ответа на антигены ВГВ. Иммунизация мышей, проводилась в лозе 10° БОЕ/'животное метолом скарификации кожи у основания хвоста, а обезьян в дозе 107 БОЕ/животное скарификацией участка кожи между лопарками.

Индукцию гуморального иммунного ответа выявляли по появлению з сыворотке иммунизированных животных антител против НВзАг, ргеЗ£-антигена и НВсАг. Наличие в образцах сывороток антител против HBsAg определяли метолом прямого ИФА. а антител протиЕ огеЗЕ-антигена - методами конкурентного РИА. Б качестве отрицательного кснтсоля использовали сыворотки интактных животных и им-■.¡•.•¡¡пспрсяанных пгааысы Л/БП

Изучение гуморального иммунного ответа на поверхностные антигены БГБ при иммунизации мышей показало, что ответ на нБз;,? и рге32-антиген имеет различную динамику. Так антитела, специфичные к рге32-антигену постигают максимальных значений к 34-м суткам, а к HBsAff - на 64-е сутки после иммунизации. Полученные результаты согласуются с. данными о динамике гуморального иммунного ответа при острой инфекции ГБ (Milien, 1S85; Neurath, 1985), заканчивающейся выздоровлением.

Б экспериментах проведенных на приматах (табл. 1) было обнаружено, что анти-рге52-антитела достоверно выявляются у 4-х из 5-и обезьян macaca imiatta. уже через 14 дней после иммунизации штаммом v7,5S2-S. Однако, в отличие от мышей, у обезьян при ол-яогоатяой иммунизации не бшо обнаружено антител против HEsAg1. Поэтому были проведены эксперименты по двукратной иммунизации обезьян macaca bonnet совместно с индийскими учеными из Национального института иммунологии г.Дели. При этом было показано, что повторная иммунизация через 14 дней индуцирует образование анти-HBs антител у 50Х животных.

Индукцию гуморального иммунного ответа у лабораторных животных, иммунизированных рекомбинантным штаммом v7,5C выявляли по появлению в сыворотке как суммарных специфических антител hdothb HBcAsr, так и антител класса IgM. Наличие в образцах сывороток суммарных антител специфичных к HBcAtr определяли метолом конкурентного йФА. Бее животные, начиная со второй недели после иммунизации, отвечали. образованием антител к НВсАе- в течение 11 недель наблюдения у линейных йышей и 19 недель у обезьян macaca ти-latta.

Индукцию анти-НВс класса IgM , которые являются ранними маркерами при инфекции БГВ человека и животных (Murray, 1987), игу-

—- Таблица 1.

Индукция клеточного и гуморального иммунного ответа у обезьян Macaca milatta, иммунизированных рекомбинаитными штаммами ВОВ v7,552-S и v7,5S.

Штамм вируса N "Антитела *"Индексы стимуляции пролиферации лимфоцитов (М4б) Спонтанная прод-ция

против ргеБ2 Титр против ВОВ

Антиген 3Н-Тимидин имп/мин (М4б)

HBsAg preS2 ВОВ оэмч Кон. А

v7,5 S2-S 1 2 3 4 5 6 53 50 <10 <10 21 17 1:150 >1:1500 1:150 >1:1500 1:1500 1:450 2,3+0,3 2,6±0,3 1,0±0,1 3,1±0,4 2,9+0,4 2,1+0,3 1,8±0,2 2.1±0,3 0,8+0,1 2,1+0,2 2,0±0,2 2,0±0,2 1,6+0,2 1,5±0,2 1,0±0,1 1,6±0,2 1,4±0,2 1,640,2 1,0±0,1 0,9±0,1 0,9+0,1 1,0+0,1 0,9+0,1 D,9±0,1 5,540,5 5,040,5 3,940,4 4,6+0,4 4,6+0,4 4,340,4 32664110 27324106 31084108 2467488 33284104 25744104

7 <1 >1:1500 2,0+0,2 1,2+0,1 Г, 6+0,2 1,040,1 5,7+0,6 2692+102

8 <1 1:150 1,8±0,2 1,0±0,1 1,4±0,1. 1,040.1 5,340,5 £7484104

V7.5S 9 <1 1:150 1,2+0,1 1,040,1 1,2±0,1 1,140,1 4,740,5 2486492

10 <1 >1:1500 1,3+0,1 1,1+0,1 1,6+0,2 1,040,1 5,1+0,5 2518498

И <1 1:450 1,6+0,2 1,2+0,1 1,6±0,2 1,140,1 4,840,4 28984104

12 <1 1:1500 1,8±0,2 1,2+0,1 1,5+0,2 1,040,1 4,840,4 31284116

* Приведены данные на 14 сутки после иммунизации. Серопозитивными по анти-ргеБ2 считаются'сыворотки дающие > 10% падения сигнала в конкурентном РИА. ' ** Приведены средние значения (М) для 4-х параллельных определений на 56 сутки после иммунизации, б - среднеквадратичное отклонение.

_ А Т _

J. i

чади при иммунизации обезьян лвсаса mulatta. Выявление ан-ти-КВс.'Ig!,': в образцах сывороток проводили с помсшыо диагностического набора для иммуноферментного определения анти-HBci IsM) '"F.Hcíínann-La Roche & Co. Limited Company, Diagnostica", Швей-нарлл). Определение титра НЪсА^-спелифических IgM-антител показало, что они выявляются в течение 3-х недель после иммунизации, причем максимальные титры приходятся на 2-ю неделю. При этом у 2-х обезьян из 5-и титры составляли 1:2700, у 2-х - 1:8100, к лишь одна отвечала только на 1-ю и 2-ю недели в титре 1:900.

Индукцию клеточного иммунного ответа на антигены ВГВ у иммунизированных животных изучали в РБТЛ (Хоробрых, 1983). Определение индексов стимуляции спленоцитов в ответ на HBsAg, HBcAg и антигены ВОВ у линейных мышей проводили на 21 сутки после иммунизации. Б таблице 2 и 3 приведены индексы стимуляции спленопитов. выделенных у мышей линии Ба1Ь/с после иммунизации рекомбинантными штаммами BOB v7,5S2-S, V7.5C и ВОВ СЛИВГО в качестве контроля. Как видно из таблиц, HBsAg и HBcAg вызывают In vitro пролиферацию клона сенсибилизированных спленоцитов. Это указывает на индукцию специфического клеточного иммунного ответа на указанные антигены ВГВ у мышей, иммунизирозанных рекомбинантными ВОВ по сравнению с контрольными животными, у которых такой пролиферации не было отмечено. ö специфичности иммунного ответа свидетельствует и тот факт, что при стимуляции лимфоцитов гетерологичным антигеном -вакциной ОЗМч, пролиферации также не было выявлено.

Таким образом, показано, что иммунизация лабораторных животных рекомбинантным' штаммом BOB v7,5C вызывает индукцию раннего гуморального иммунного ответа на HBcAg у линейных мышей и приматов и специфического клеточного иммунитета у линейных мышей. Известно, что HBcAg обладает протективными свойствами против ВГВ

Таблица 2.

Индукция клеточного иммунного ответа иа HBsAg при иммунизации мышей линии Balb/c рекомбинантным штаммом v7,5S2-S и БОВ ШЕЛ).

Штамм | зируса

Индекс стимуляции (М±б)

Спонтанная прол-ция

Антиген

-¡эН-Тимидин

HBsAg i BOB i ОЭМч | Кон.A i имп/мин

V7.5S2-S j2,0±0,3 jl,6±0,2 1,0±0,1 7,511,2 1267168

ВОВ ШЕЛ 1,0+0,2 1,710,3 0,910,1 7,3+1,1 1359172

интактлые 1,010,1 0,910,1 1,010,1 7,611,2 1328164

Таблица 3.

Индукция клеточного иммунного ответа на HBcAg при иммунизации мышей линии Balh/c рекомбинантным штаммом v7,5C и ВОВ (ЛИВП).'

Штамм вируса Индекс стимуляции (М1б) Спонтанная прол-ция эН-Тинидин имп/мин

Антиген

HBcAg ВОВ ОЕМч Кон. А

V7.5C 2,310,4 1,7±0,2 0,910,1 7,711,2 1473183

ВШЩШЩ 1.1Ю.2 1,610,2 1,010,1 7,611,1 1582179

¡интактные 0.9Ю.1 1.0Ю.1 1,0Ю,1 7,811,3 1617185

Приведены средние значения (М) для 4-х параллельных определений на 21 сутки после иммунизации, б - среднеквадратичное отклонение.

для шимпанзе (Iwarson, 1985; Murray, 1987), а клеточный иммунитет на этот антиген является фактором пожизненной резистентности против ГВ у переболевших людей fSylvan. 1987; Pontisso, 1987). Поэтому полученные результаты свидетельствуют о перспективности штамма v7,5C для разработки вакшшы.

Изучение индукпии клеточного иммунного ответа на поверхностные антигены БГБ у приматов проводили при иммунизации обезьян пе-саса mulaita рекомбинантными штаммами v7,5S2-S и v7,5S. Б таблице 1 приведены значения индексов стимуляции лимфоцитов в ответ на KEsAg, рге32-антиген и антигены ВОВ на 56 сутки после .иммуниза-ши, Из представленных данных видно, что пролиферация лимфоцитов в ответ на HBsAv у обезьян обеих групп достоверно выше, чем при стимуляции неспецифическим антигеном ("вакцина ОЗМч). Это свидетельствует, о формировании у иммунизированных обезьян клонов специфически сенсибилизированных лимфоцитов. Хотя все обезьяны предварительно были проверены на отсутствие маркеров ВОВ ■ и ■ БГВ, обезьяна N3 не отреагировала на HBs- , preS2- и ВОВ-антигены. Тем не менее, полученные результаты указывают на индукцию специфического клеточного иммунного ответа и формирование иммунологической памяти на HBs-, preS2- и ВОВ-антигены у большинства обезьян, иммунизированных штаммом v7,552-S. При этом у обезьян контрольной группы, иммунизированных штаммом v7,5S не было выявлено пролиферации лимфоцитов на preS2-антиген, а средний индекс стимуляции лимфоцитов на HBsAcr был достоверно ниже i'P=95%). Полученные результаты согласуются с литературными данными о том, что preS2-антиген может стимулировать клеточный иммунный ответ против HBsAg ("Cells, 1984)..

Известно, что клеточный иммунитет на поверхностные антигены ВГВ играет важную роль в выздоровления при инфекции (Milich,

: - го -

1985). а антитела к оге52-детеоминанте могут обеспечить заашту от

I

НТВ (Neurath, 1Ö86; Iton, 1986). Поэтому полученные результаты свидетельствуют о перспективности штамма v7,552-5 для профилактики этого заболевания. '

Б результате проведенного исследования показано, что реком-бинантные штаммы BOB V7.5S2-S и v7,5C обеспечивают индукцию специфического иммунитета против антигенов БГВ при иммунизации мышей и приматов, и, следовательно, могут быть рекомендованы для разработки и внедрения в практику здравоохранения живой рекомбинантной вакцины против БГВ.

ВЫВОДЫ

1. Получены штаммы рекомбинантных ВОВ, содержащие в составе генома ген среднего белка оболочки БГВ - V7.5S2-S и варианты гена нуклеокапсвда: v7,5preC-C, v7,5C и v7,5E.;

2. Впервые показано, что изменение природного сайта инициации трансляции рге52-области приводит к эффективной продукции. HBsAg с рге52-детерминантой рекомбинантным штаммом BOB V7.5S2-S.

3. впервые показана продукция HBcAff рекомбинантным штаммом BOB V7.5C и белка, .проявляющего антигенные свойства HBeAg рекомбинантным штаммом BOB V7.5E.

4. Рекомбинантные штаммы БОБ v7,5S2-S и v7,5C вызывают гуморальный иммунный ответ соответственно на HBsAg-, рге52-антиген и НБсАг при иммунизации линейных мышей и обезьян.

5. Впервые показана индукция клеточного иммунного ответа на HEsaz-, рге£2-антиген и КВсАе у лабораторных животных, иммунизированных оекомбинантными BGB.

• - 2i -

3. Рекомбинантиые etsu.mh Б05 v7,5S2-S и v7,5C являются перспективными зля создания живой рекоыбинантной вакцины лля профилактики заболевания гепатитом Б.

Результаты диссертации опубликованы в слелуших работах:

1. Беляев A.C., Дмитриев Й.П., Игнатьев Г.М., Мизенко Г.А., Путиниева H.H., Сабиров А.Н., Сзмуков В.В., Семенова Л.Н.. Аммо-сов А.Л., Рукавишников М.Ю., Красавина И. Н., Муратов П.Ю., (лиглзи-ксвН.Н., шеЕЛЯгкна Л. Р., Константинов А.П., Сандахчиев Л.С. ге-комбинантиый Еирус осповакникы, зкспрессируюкий средний рге2|£')-3-белок оболочки вируса гепатита 5. Индукция гуморального и клеточного иммунитета при иммунизации лабораторных аивоткых./У ДОКЛ. АН СССР.- 1990.- T.314.- N.2.- С.468-491.

2. Беляев A.C., Xpciiux A.A., Дмитриев И.П. Разработка рексм-бинантных вакцин против кяешеЕого энцефалита и гепатита В.- Сборник материалов конференции "Проблемы биотехнологии иммунобиологических и гемотрзнсфугионных препаратов". Ленинград, 19S«. с.52.

2. Дмитриев й.П., Беляев A.C., Путинцева Н.И., Рукавишников М.Ю., Гайфуялина Л.Р., Агеенко Б.А. Рекоыбивантные вирусы оспо-вакцины, экспрессируюшие гены вирусов клешевого энцефалита и гепатита В.- Сборник материалов Бсесоззной кокференшш 'Тенная к клеточная, инженерия в решении фундаментальных проблей биотехно-лопш". Тарту, 1989. т.1, с.95-101.

4. Муратов П.В., Дмитриев И.П., Беляев A.C. Изучение иммунобиологических сеойств рекомбинантных штаммов осповакцины fv7,522-S и v7r5C), экспрессиру пих антигены вируса гепатита Б.-Тезисы докладов Всесоюзного семинара 'Т.5одекулярная биология и медицина". Ленинград. 1550. с.57.

5. Беляев A.C., Дмитриев И.О., Муратов П.Ю., '¿ролов И.Б.,

Сершшский О.М., Урманов й.Х., Агапов Е.В., Кодыхалов A.A., Нете-сов С.В., Савдахчиев Л.С. Вирус осповакшны, как вектор для создания вакцин. Некоторые итоги и перспективы.- Тезисы докладов V конференции РАН "Новые направления биотехнологии". Пупино. 19S2. с. 51.

5. Нмитриев й.П., Беляев A.C. Рекоыбинантная ллазииляая ЛИК р?;5С, кодирующая антиген вируса гепатита Б, и способ ее конструирования.// Патент Р5 N1651555 от 17.01.1593г., приоритет N46353 "от £7.07.S3.

7. Муратов П.Ю., Дмитриев й.П., Беляев A.C. Штачм рексмбн-нантного вируса осповзкшшы v7,5C, зкспрссскрувший коровий антиген вируса гепатита В.// Заявка на патент РЗ N4928632/14.- приоритет от 17.04.S1 г., положительное решение от 3j.08.S1 г.

.',8. Беляев A.C., Путинцева Н.И., Дмитриев К.П., АммоЬов А.Д., Черный Н.Б., и др. Рекомбияантваз плазмвдная ДНК p7,5S2-S, содержащая pre52-S ген вируса гепатита В, способ ее- получения и втам« рекомЗинантнаго вируса осковакцнны, зкспрессирукгай preS2-S ген Birovca гепатита Б.// Патент РФ N1575575 от 10.01.93г.