Использование методов молекулярной биологии и генной инженерии для конструирования вакцинных и диагностических препаратов

Беклемишев, Анатолий Борисович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование методов молекулярной биологии и генной инженерии для конструирования вакцинных и диагностических препаратов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Использование методов молекулярной биологии и генной инженерии для конструирования вакцинных и диагностических препаратов"

На правах рукописи

Беклемишев Анатолий Борисович

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ВАКЦИННЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

03.00.04 - биохимия 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН, г. Новосибирск

Научные консультанты:

академик РАЕН, доктор биологических наук, профессор

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Мертвецов Н.П. Панин Л.Е.

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор,

доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Воробьёв А.А. Загребельный С.Н. Щелкунов С.Н.

Ведущая организация: Государственное учреждение Научно-

исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, г. Москва

Защита состоится кг** июня 2004 г. в« 10°° » часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу: Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН

Автореферат разослан

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время известно более тысячи видов вирусов - представителей более 20 семейств, патогенных для человека (Смородинцев, 1984). Не менее многочисленна группа болезнетворных микроорганизмов: патогенных и условнопатогенных бактерий, риккетсий, простейших паразитов, общее число которых достигает 3 тысяч. Благодаря широкому внедрению в вирусологические и микробиологические исследования современных методов молекулярной биологии и генетической инженерии в последние два десятилетия открыты новые возбудители инфекций: вирусы гепатита С (Marwick, 1984; Choo et al., 1989), ВИЧ (Broder, Gallo, 1984; Klatzm'ann et al., 1984; Montagnier et al., 1984; Ratner et al., 1985a), возбудитель болезни Лайма (Burgdorfer et al, 1982), вирус губчатой болезни коров и возбудитель вспыхнувшей в конце 2002 г. в КНР эпидемии тяжелой высококонтагиозной пневмонии (Ksiazek, et al., 2003).

Природное многообразие возбудителей инфекций требует наряду с проведением санитарно-гигиенических и противоэпидемических мер создания средств их специфической профилактики и диагностики. Значение иммунопрофилактики в снижении многих болезней и даже их искоренении (в случае натуральной оспы) общеизвестно. Ведущее место в борьбе с такими инфекциями как, полиомиелит, столбняк, корь, коклюш, дифтерия, туберкулёз и др. занимает вакцинация населения.

Все вакцины, независимо от способа их применения и назначения можно разделить на три больших класса: живые, инактивированные и искусственные (Воробьёв, 1980). В арсенале отечественной иммунопрофилактики фигурируют главным образом живые и инактивированные вакцины. Однако, значительный удельный вес живых вакцин (55%), являющихся наиболее эффективным видом защитных препаратов, порождает большую проблему безопасности вакцинаций (Воробьёв, 1975; Ляшенко, Воробьёв, 1982). Одним из перспективных направлений решения этой проблемы является создание молекулярных и искусственных (рекомбинантных и синтетических) вакцин. Широкие возможности для конструирования таких вакцин открылись в последние 25 лет благодаря развитию методов молекулярной биологии и биохимии белка, прогрессу в области генной инженерии и биотехнологии (Мертвецов, Беклемишев, Савич, 1987).

Вполне понятно, что реализация этих подходов требует больших усилий исследователей различных специальностей: вирусологов, микробиологов, молекулярных биологов, генных инженеров, биотехнологов и химиков. Особую важность и значение эти исследования приобрели в последние 20 лет ввиду изменения эпидемической ситуации в мире. С одной стороны, наблюдается значительное снижение, либо стабилизация ряда особо опасных инфекций, а с другой - появление и распространение ранее неизвестных инфекций (вирусные иммунодефициты и гепатиты, Лайм-боррелиоз, атипичная пневмония и др.). Растёт и заболеваемость туберкулезом, гриппом, госпитальными инфекциями, на уровень эпидемий вышли ВИЧ-инфекции и заболевания вирусными гепатитами. Ряд ведущих специалистов опасается мировой пандемии преодолевающих межвидовой барьер высоковирулентных вирусов гриппа птиц (Chen et al., 2003; Okazaki et al., 2000). Одно из ведущих мест среди возбудителей внутрибольничных инфекций продолжает занимать стафилококковая инфекция (Васильева, 1991). Пищевые отравления, вызываемые стафилококковыми энтеротоксинами, составляют большую часть пищевых отравлений бактериальной этиологии (Reiser et al., 1988; Постовит, 1987). Имевшие совсем недавно в США случаи заболеваний людей, вызванных вирусом оспы обезьян, свидетельствуют об определённой вероятности выхода из пр цац 11 лищшиш шскую орбиту»

высоковирулентных и контагиозных для челове

путан

OS мфвтРЩ

это с особой остротой ставит вопрос о необходимости разработки безопасных вакцин, высокоспецифичных и чувствительных диагностических тест-систем.

Достижения в 80-х годах в области использования вируса осповакцины (ВОВ) в качестве эукариотического экспрессирующего вектора значительно стимулировали всестороннее исследование самого вируса осповакцины. Во-первых, представлял интерес поиск в геноме ВОВ мест, подходящих для встройки чужеродной генетической информации с целью создания поливалентных вакцин. Во-вторых, возник и вопрос о безопасности создаваемых рекомбинантных штаммов ВОВ. Никто не мог гарантировать, что при встройке чужеродной ДНК не появятся варианты высокопатогенного для человека рекомбинанта ВОВ. В третьих, не менее важной проблемой являлось установление роли собственных антигенов ортопоксвирусов в индукции иммунитета. В то время сведения такого рода были весьма ограничены. Все это вместе взятое сдерживало практическое использование уже полученных рекомбинантных штаммов. Назрела острая необходимость выяснения роли отдельных структурных белков ВОВ в индукции иммунитета, установления их локализации в геноме и создания безопасной противооспенной вакцины.

По статистическим данным во время пандемии 1918-1919 гг погибло более 40 миллионов людей, а заболеваемость гриппом составила 500 млн человек. Смертность во время пандемий 1957 (вирус гриппа А подтипа H2N2) и 1968 (H3N2) г.г. была около 6 миллионов. Все это обусловило повышенный интерес к возбудителю этого заболевания, как в научном плане, так и в плане создания эффективных противогриппозных вакцин нового поколения, которые могли бы прийти на смену живым и инактивированным цельновирионным.

Актуальными были и остаются и проблемы диагностики опасных для человека инфекций таких как вирусные гепатиты В и С, туберкулез, клещевой иксодовый боррелиоз, госпитальные инфекции, а также пищевые токсикоинфекции.

В диссертации представлены результаты многолетних исследований, направленных на создание нового поколения вакцин и диагностических препаратов с использованием методов молекулярной биологии, иммунологии, вирусологии и генетической инженерии. Выбор объектов исследований и основные задачи определялись как потребностью здравоохранения, так и специальными Государственными заказами. Работа выполнялась последовательно на базе НПО «Вектор» (п.Кольцово, НСО), Института молекулярной биологии и биохимии АН Каз ССР им. М.А. Айтхожина (г. Алма-Ата), НИБХ СО РАН (г.Новосибирск) и ГУ НИИ биохимии СО РАМН (г.Новосибирск).

Цель исследования: разработать молекулярно-биологические основы для создания прототипов противооспенной и противогриппозной субъединичных вакцин, специфичных и чувствительных методов экспресс-диагностики вирусных гепатитов В и С, туберкулеза, клещевого иксодового боррелиоза, стафилококкового сепсиса.

Задачи исследования:

1. Создать методическую базу для конструирования молекулярных вакцин и диагностикумов, включающую применение и совершенствование молекулярно-биологических и генно-инженерных методов, конструирование специальных векторов для экспрессии генов в клетках Е coli.

2. Исследовать физико-химические, антигенные и иммуногенные (протективные) свойства белков вирусов гриппа и осповакцины и разработать эффективные способы их выделения и очистки

3. Картировать на геноме отдельные гены, кодирующие иммуногенные белки вирусов осповакцины.

4. Сконструировать на основе очищенных протективных антигенов прототипы молекулярных вакцин для специфической профилактики инфекций, вызываемых вирусами гриппа и натуральной оспы.

5. Получить рекомбинантные формы стафилококкового а-токсина для создания на его основе иммуноферментной тест-системы для диагностики стафилококковых сепсисов, а также, в перспективе, иммунизирующих препаратов для получения противостафилококковой гипериммунной донорской лечебной плазмы.

6. Исследовать иммунобиологические свойства стафилококкового энтеротоксина А, получить моноклональные антитела к нему и сконструировать на их основе прототип высокоспецифичной иммуноферментной тест-системы.

7. Сконструировать прототип иммуноферментной тест-системы для диагностики иксодового клещевого боррелиоза на основе рекомбинантных антигенов возбудителя.

8. Разработать высокоспецифичные и чувствительные способы обнаружения возбудителей туберкулёза, гепатитов В и С и иксодового клещевого боррелиоза в биосубстратах на основе использования методов полимеразной цепной реакции и обратной транскрипции.

Научная новизна:

1. Установлены первичные структуры З'-концевой области генома вируса энцефаломиокардита мышей, полноразмерных ДНК-копий мРНК проопиомеланокортина человека, быка и крысы, а также фрагментов генома трёх штаммов вируса гриппа. Выявлено, что гемагглютинин одного из штаммов (А/Алма-Ата/1417/84) имеет 96,12% гомологии с гемагглютинином возбудителя пандемии гриппа 1918-1919.

2. Показано, что белки оболочки вириона ВОВ р12, р19, р20, р35 и р42 являются ранне-поздними, поскольку их синтез в инфицированных клетках наблюдается в условиях ингибирования репликации вирусной ДНК.

3. Установлено, что белок оболочки вируса осповакцины р20 является димером белка р12, а предшественником гликопротеина р35 оболочки вириона является полипептид с молекулярной массой 27 кДа. Предшественники белков оболочки ВОВ р12 и р42, а также белка сердцевины р11 не отличаются по электрофоретической подвижности от зрелых белков вириона.

4. Методом гибридизационной селекции мРНК на фрагментах геномной ДНК ВОВ с последующим иммунохимическим анализом продуктов ее бесклеточной трансляции показано, что расположенный на стыке Hind\\\ Е- и F-фрагментов ген кодирует сердцевинный поздний белок р 11.

6. Впервые проведено иммуноаффинное выделение специфической мРНК, кодирующей белок р35 оболочки вириона ВОВ. Показано, что кДНК, синтезированная на мРНК специфически гибридизуется с геном 26К из левого HindW A-Sa/GI-фрагмента вирусной ДНК.

7. Обнаружен новый вид функциональной активности стафилококкового энтеро-токсина • А, характеризующийся способностью этого токсина индуцировать в условиях in vitro продукцию ИЛ-1 моноцитами периферической крови человека. Токсин проявляет выраженную ИЛ-1-индуцирующую активность в диапазоне концентраций от 100 пг/мл до 100нг/мл.

8. Впервые обнаружено свойство стафилококкового энтеротоксина А неспецифи-чески связываться с Fc-фрагментом иммуноглобулинов различных животных и определена локализация на нём участка связывания Fc-фрагмента. Эффектив-ность связывания токсина с IgM намного ниже, чем с IgG.

9. Впервые при использовании метода иммунизации in vitro получены гибридомы, секретирующие моноклональные антитела lgM-класса против стафилококкового а-токсина.

10. В начале желтушного периода у больных вирусным гепатитом В с большим постоянством, наряду с HBs- и НВе-антигенами, в слюне выявляется и ДНК HBV; в период ранней реконвалесценции у 59,4% больных вирусным гепатитом В в слюне продолжает выявляться НВеАg при отрицательных результатах индикации ДНК HBV, обусловленных, по-видимому, ее низкой концентрацией в исследуемом биосубстрате. Эти данные свидетельствуют в пользу возможной длительной персистенции вируса в слюнных железах и потенциальной эпидемической значимости реконвалесцентов, как источников естественной передачи инфекции для контактирующих с ними лиц.

11. Иксодовые клещи Ixodes persulcatus, распространенные на территории Алтая, Новосибирской и Томской областей, заражены только двумя геновидами Borreha burgdorfen s.l.: B.gannii и B.afzelir, уровень зараженности клещей спирохетами, определявшийся в период с 1999 по 2003 г.г., колебался в пределах 10-40% в зависимости от года наблюдения и ареала распространения.

12. Определены нуклеотидные последовательности кодирующих областей генов ospC и flaB десяти сибирских изолятов Borrelia burgdorfen s.l. и методами компьютерного анализа выявлены потенциальные антигенные детерминанты соответствующих белков.

13. На основе сравнения первичных структур липопротеидов OspC, выведенных из нуклеотидных последовательностей соответствующих генов, установлены филогенетические связи сибирских изолятов боррелий с другими представителями этого вида спирохет.

Практическая значимость:

1. Разработан оригинальный и простой способ разделения белков оболочки и сердцевины

вируса гриппа, а также щадящий метод разделения гемагглютинина и нейраминидазы, который может быть использован как в научных исследованиях, так и в конструировании молекулярных противогриппозных вакцин.

2. Получен образец комбинированной молекулярной вакцины против двух серотипов вируса

гриппа (H1N1 и H3N2), обладающий выраженной протективной активностью, который после проведения полных доклинических и клинических испытаний может быть использован для иммунопрофилактики гриппа.

3. Разработан новый эффективный Способ получения моноспецифических антисывороток,

включающий в себя как модифицированный метод препаративного электрофореза белков, так и особую схему иммунизации животных. Разработанная технология может быть использована в научных исследованиях. Получена коллекция специфических антисывороток ко всем мажорным белкам оболочки вириона, а также к некоторым белкам его сердцевины.

4. Прототип противооспенной вакцины, сконструированной на основе белков оболочки

вируса осповакцины, по данным доклинических испытаний может применяться в качестве превакцины.

5. Иммуноферментная тест-система для определения стафилококкового энтеротоксина А

может использоваться в пищевой промышленности, санитарно-эпидемиологической службе и клинике токсикоинфекций.

6. Разработан высокочувствительный и специфичный метод дифференциального выявления микобактерий туберкулезного комплекса, исключающий получение ложноположительных результатов анализа у недавно вакцинированных BCG людей и животных. Метод может быть применен в практическом здравоохранении для быстрой

диагностики туберкулеза и контроля над эффективностью противотуберкулёзной терапии.

7. Разработан прототип иммуноферментной тест-системы для выявления начальных стадий заболевания иксодовым клещевым боррелиозом, который может быть использован в практическом здравоохранении.

8. Разработаны способы выявления геномных нуклеиновых кислот возбудителей гепатитов В, С и иксодового клещевого боррелиоза, которые могут быть использованы в эпидемиологических и диагностических исследованиях.

9. Предложен оптимальный метод выделения ДНК микобактерий, являющийся быстрым, простым в исполнении и обеспечивающим наибольший выход ДНК. Метод может быть использован в эпидемиологических исследованиях и в ДНК-диагностике туберкулёза.

10. На основе исходной плазмиды pR85 сконструирована серия экспрессирующих векторов, обеспечивающих эффективную индуцируемую экспрессию встраиваемых генов под контролем регуляторной области гена recA Proteus mirabilis.

11. Разработана технология получения рекомбинантных белков в клетках E.coli с использованием сконструированных в данной работе векторов.

12. Получены рекомбинантные штаммы E.coli, обеспечивающие сверхсинтез стафилококкового а-токсина. Рекомбинантный токсин можно использовать как для разработки ингибиторной иммуноферментной тест-системы диагностики стафилококковых сепсисов, так и для получения иммунизирующего препарата в производстве лечебной противостафилококковой гипериммунной сыворотки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный и усовершенствованный комплекс молекулярно-биологических и иммунохимических методов, обеспечивает решение задач, связанных с конструированием молекулярных вакцин, созданием диагностических тест-систем, исследованием первичных структур РНК- и ДНК-содержащих геномов возбудителей инфекций и картированием генов специфических антигенов.

2. Прототипы молекулярных вакцин (противооспенной и противогриппозной), обеспечивают

индукцию защитного иммунного ответа у вакцинируемых животных.

3. Белки оболочки вириона ВОВ р12, р19, р20, р35 и р42 являются ранне - поздними, причём

белок р20 является димером белка р12, а предшественником гликопротеина р35 оболочки вириона является полипептид с мол. массой 27 кДа,

4. Ген, кодирующий сердцевинный белок вириона р11 локализован на стыке

Hindill Е- и F-фрагментов геномной ДНК.

5. Разработана высокоспецифичная иммуноферментная тест-система определения стафилококкового энтеротоксина А в пищевых продуктах.

6. Разработанные методы выявления геномных нуклеиновых кислот возбудителей туберкулёза, гепатитов В, С и иксодового клещевого боррелиоза, характеризуются высокой чувствительностью, специфичностью и простотой исполнения.

7. Слюнные железы больных вирусным гепатитом В, как в начале желтушного периода, так и

в стадии реконвалесценции, могут служить местом персистенции вируса, а сами больные могут являться потенциальными источниками естественной передачи инфекции для контактирующих с ними лиц

8. Способ иммуноферментного выявления в крови пациентов антител к двум антигенам (OspC и FlaB) Borrelia garinii NT 29 позволяет диагностировать начальные стадии заболевания иксодовым клещевым боррелиозом

9. Спирохеты комплекса Borrelia burgdorferi s.l., циркулирующие в популяциях иксодовых клещей Ixodes persutcatus, распространенных на территории Сибири, представлены

только двумя геновидами: Borrelia garinii и Borrelia afzelii,- и составляют отдельную группу, родственную изолятам боррелий, выделенных в Японии и Корее. Заражённость. взрослых клещей колеблется в пределах 10-40% в зависимости от года наблюдения и ареала распространения.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на международных, всесоюзных, всероссийских и региональных научных форумах: II Всероссийской конференции «Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии», С-кт Петербург, 2003; международном конгрессе «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека». Кара-Даг,8-19 июня 2003; XII International Congress of Virology. Paris, France, 27 July - 1 August 2002; Vlth International Potsdam Symposium on Tickborne Diseases. Berlin (Germany), April, 26-27th, 2001; VI RFBR (Basic Research results open for investments) International Conference. Pushino, Russia, 2001; межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные аспекты природноочаговых болезней». Омск, 16-17 октября 2001 г.; 97th International Conference "ATS 200Г.- May 18-23, San Francisco, USA, 2001 ; II International Conference" New Information Technology in Medicine and Ecology". Gurzuf, June 1-9, 2000; IX International Congress of Bacteriology & Applied Microbiology, 16-20 august, 1999, Sydney, Australia; III съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (научная конференция. «Инфекционные болезни: новое в диагностике и терапии». 3-7 июня, 1998 г. Санкт-Петербург; научной конференция "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" 10-11 апреля 1998 г, Новосибирск; II съезде биохимического общества РАН, 19-23 мая, Пущино, 1997 г.; World Congress on Cell and Tissue Culture, 20-25 June, Wastington, 1992; II Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", г.Самарканд, 1991; V Конференции биохимиков республик Ср.Азии и Казахстана, г.Ташкент, 1991; II Всесоюзной Конференции "Бактериальные токсины", 27-30 ноября, Юрмала, 1989; Republ.Sci.conference "Modern problems of physico-chemical biology and biotechnology", sept. 21-23, Alma-Ata, 1989; Международном симпозиуме "Химия и биохимия пептидно-белковых гормонов", Суздаль, 1985; Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии", 22—24 октября, Пущино, 1984; 16-ой конференции ФЕБО, Москва, 1984; IV съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им.Вавилова. Кишинев, 1981; VI рабочем совещании «Внехромосомные генетические элементы: значение для науки и практики» по программе "Плазмида", Москва, 1981; II Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции нуклеиновых кислот и биосинтез белка в растениях", 11-13 октября, Ташкент, 1977; II Конференции биохимиков республик Ср.Азии и Казахстана, Фрунзе, 1976,

По материалам диссертации опубликовано 47 статей (в том числе 9 патентов на изобретение) и тезисы 36 докладов.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 413 страницах, содержит 60 рисунков, 23 таблицы и список цитируемой литературы (962 источника). Работа состоит из введения, трёх глав, заключения и выводов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Создание молекулярно-биологической базы для исследований структурно-функциональной организации патогенных вирусов. При изучении структурно-функциональной организации геномов вирусов и создании молекулярных вакцин одной из задач является идентификация вирусспецифических иммунодоминантных белков и картирование на геноме кодирующих их генов. Известно, что вирусспецифические мРНК составляют очень незначительное количество от суммарных мРНК в инфицированных вирусом клетках. Аналогичная ситуация имеет место и в случае индивидуальных мРНК

клеток эукариот. В связи с этим в данной работе необходимо было предварительно на модельных эукариотических объектах отработать методы выделения индивидуальных мРНК и оценки их трансляционной активности в бесклеточных системах синтеза белка, синтеза на них кДНК и клонирования кДНК в векторах для секвенирования и экспрессии.

В разделе представлены результаты наших ранних исследований по совершенствованию и применению ряда молекулярно-биологических методов для решения различных задач. Среди них такие методы, как: методы бесклеточного синтеза белка и обратной транскрипции РНК, выделения и анализа индивидуальных мРНК и иммуноаффинного выделения специфических полирибосом. Объектами исследования служили мРНК тирозинаминотрансферазы (ТАТ) крысы, проопиомеланокортина (ПОМК) быка, человека и крысы и геномная РНК вируса энцефаломиокардита. Исследованные мРНК эукариотов были весьма удобной моделью для манипуляций с ничтожно малыми количествами мРНК, а также для изучения молекулярных механизмов гормональной регуляции активности генов

В процессе исследований был отработан метод иммунноаффинного выделения специфических полирибосом и мРНК, а кДНК была использована в качестве зонда для определения методом гибридизации концентрации специфической мРНК в тканях. Аналогичная задача, обычно, стоит и при выделении вирусспецифических мРНК на различных стадиях инфекции клеток и определении времени их синтеза.

Результаты этих исследований представлены в диссертации, но в автореферате не приводятся, т.к. не являются основными работами по проблеме.

Исследование структурно-функциональной организации геномов вирусов гриппа и разработка прототипа противогриппозной молекулярной вакцины.

В 1982 г. нами были начаты исследования по разработке образца молекулярной противогриппозной вакцины. В то время для массовой иммунизации населения страны против гриппа был начат выпуск трёх типов убитых вакцин, два из которых являлись цельновирионными и один - представлял собой расщепленную вакцину; выпускалась также издавна применяемая интраназальная вакцина. Что же касается разработок по созданию молекулярных вакцин, то в этом направлении делались только первые шаги, как у нас, так и за рубежом.

Несмотря на то, что молекулярные вакцины могут значительно уступать по иммуногенности вакцинным препаратам полученным на основе живых и инактивированных вирусов, они, однако, обладают рядом преимуществ. Такие вакцины менее реактогенные, менее опасны побочным действием, более стабильны и легко стандартизуемы. Существенным преимуществом молекулярных противогриппозных вакцин может стать возможность конструирования их многокомпонентных форм, включающих очищенные протективные антигены вирионов из различных серотипов и подтипов эпидемических штаммов вируса.

Однако, разработка многокомпонентной, или комбинированной молекулярной вакцины требует выполнения ряда предварительных исследований.

Первой задачей, которую мы поставили перед собой была разработка методов выделения и очистки индивидуальных структурных белков вирионов двух штаммов вируса гриппа (ВГ): А/Ленинград/57/80 (Н!Ы1) и А/Ленинград/ 385/80 (Н3Ы2). Очистка и идентификация структурных белков ВГ включала три этапа:

1. Разделение белков вируса на поверхностные и сердцевинные методом экстракции 0,01 М Ыа-фосфатным буфером, рН 7.2, содержащим 0,85% ЫаО! и 0,3% Тритон-Х-100 с последующим центрифугированием при ЗСОООд (Табл. 1)

2. Очистка структурных белков сердцевины и оболочки вируса методом гельфильтрации

на ультрогеле АсА34 (рис.1) Таблица 1. Разделение белков ВГ на поверхностные и сердцевинные методом экстракции

Условия обработки вируса гриппа Номер фракции Белки Содержание белков во фракциях в % от суммарного белка ВГ

Буфер с 0,3% Тритоном Х-100 (супернатант) 1 НА, ЫА 29,7

Буфер с 0,1% Тритоном Х-100 (супернатант) II ■ 8,8

Буфер с 0.1% Тритоном Х-100 (осадок) III М. МР, Р1-3 48,8

Фракции структурных белков ВГ, полученные обработкой различными концентрациями тритона-Х-100 с последующим центрифугированием анализировали диск-электрофорезом в ПААГ. Анализ белковых фракций показал, что получены индивидуальные белки сердцевины высокой степени чистоты. Выход М и NP-белков составлял 2-4 мг из 40мг суммарных сердцевинных белков вируса. Достаточно хорошее разделение белков после обработки вирионов ВГ 0,3%-ным тритоном-Х-100 давала колоночная хроматография на ультрогеле АсА-34 (рис.1).

Метод получения поверхностных белков вириона ВГ был использован нами для разработки прототипа комбинированной молекулярной противогриппозной вакцины.

Получение образца субъединичной комбинированной противогриппозной вакцины. Анализ иммуногенной активности препарата. Поверхностные белки двух штаммов вируса гриппа, объединяли и сорбировали на гидроокиси алюминия. Иммуногенную активность полученного препарата определяли в опытах на белах беспородных мышах весом 20г. Вакцину вводили внутрибрюшинно в объёме 0,2 мл в дозе 5 мкг белка на мышь. Через месяц проводили повторную вакцинацию. На седьмые сутки после ревакцинации мышей заражали интраназально минимальной инфицирующей дозой (МИД) вируса гриппа А/Ленинград/57/80 (ЫМ). За одну МИД принимали максимальное разведение вируса, способное вызвать развитие инфекции у мышей. На третьи сутки после заражения у мышей извлекали лёгкие, из которых готовили 10%-ную суспензию. Из 10%-ной легочной суспензии готовили 10-кратные разведения и ими заражали РКЭ (на каждое разведение брали по 4 РКЭ). После инкубации в течение 48 часов определяли наличие вируса в аллантоисной жидкости в РГА. При использовании 1 МИД вакцинированные животные были защищены от инфекции. Вирус в легких опытных животных не обнаруживался тогда, как у контрольной группы вирус обнаруживался в 75% животных.

Как можно видеть из табл. 2 прототип вакцины достаточно хорошо защищал животных и от инфицирования 10 МИД.

Таблица 2. Обнаружение вируса в легких иммунных и неиммунных мышей.

Группа животных Наличие вируса гриппа в РКЭ, инфицированных ниже указанными разведениями 10%-ной легочной суспензии мышей вакцинированной и контрольных групп

10"' 102 10"3 10"4 10* 10"6 тт 10"8

Вакциниров энные 2/4 2/4 1/3 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 "

Контрольны е (группа 1) 4/4 4/4 4/4 3/4 3/4 2/4 0/4 0/4

Контрольны е (группа 2) 4/4 4/4 4/4 3/4 2/4 0/4 0/4 0/4

Контрольны е (группа 3) 4/4 4/4 3/4 4/4 4/4 2/4 1/4 0/4

Полученные данные позволяют сделать заключение, что разработан достаточно простой и эффективный способ выделения индивидуальных поверхностных антигенов и их комплекса из вирионов ВГ. На основе гликопротеидов оболочки двух штаммов вируса гриппа был получен образец комбинированной субъединичной вакцины и в экспериментах на животных показана протективная активность препарата. Используя этот подход, на основе поверхностных антигенов ВГ и нуклеокапсидного белка, полученных из различных подтипов вируса, циркулировавших в период эпидемий/пандемий можно сконструировать комбинированные молекулярные вакцины с широким спектром действия.

Пожалуй, одним из подходов в изучении молекулярных механизмов патогенности вирусов гриппа, в выяснении вопросов возникновения новых их подтипов, является сравнительное исследование первичных структур генов вирусов гриппа, циркулирующих в настоящее время и циркулировавших в прошлом в периоды эпидемий и пандемий. Такие

исследования позволят-прогнозировать возникновение новых эпидемий и пандемий в будущем. Быстрое установление первичной структуры генов нового эпидемического штамма вируса гриппа имеет и большое практическое значение, т.к. позволяет ответить на вопрос о филогенетических связях этого штамма с другими эпидемическими вариантами, а также о возможных путях распространения эпидемий.

- Нами в период с 1984 по 1985 и в 1992 г.г. проводились исследования первичных структур фрагментов генома трёх штаммов вируса гриппа:

1) вакцинный штамм Х/Ленинград/54/1 H1N1 подтипа, который является реассортантом штаммов A/PR/8/34 и А/Хабаровск/34457/77, отобранным по антигенным свойствам штамма А/Хабаровск/34457/77;

2) вакцинный штамм А/Киев/59/79/R H1N1 подтипа, являющийся реассортантом вирусов А/Киев/59/79 и A/PR/8/34 и который был отобран по антигенным свойствам штамма А/Киев/59/79;

3) вирулентный штамм А/Алма-Ата/1417/84 (H1N1- серовариант Hsw1N1), выделенный из носоглоточного смыва больной.

В работе по синтезу комплементарных ДНК, их клонированию и отбору клонов мы использовали ранее отработанные методы.

В то время, когда мы начинали эту работу были установлены первичные структуры гена гемагглютинина всего 38 штаммов вируса гриппа А человека подтипа H1N1, циркулировавших в периоды эпидемий с 30-х по 80-е годы. Естественно, что сравнение первичных структур генов штаммов Х/Ленинград/54/1 и А/Киев/59/79/R с имевшимися в то время ограниченными данными по первичным структурам соответствующих генов других штаммов вируса гриппа H1N1 подтипа не могло нам дать какой-либо важной информации, кроме как установления их филогенетических связей (Беклемишев и др., 1984, 1985а-г, 1986а,б). Тем не менее, любая информация о структуре генов ВГ является очень важной, так как после накопления этих сведений можно будет ближе подойти к расшифровке механизмов, лежащих в основе вирулентности, тканевой тропности, трансмиссивности и персистенции вируса гриппа типа А.

На основе сравнения первичных структур опубликованных в то время генов ВГ и установленных нами нуклеотидных последовательностей мы сконструировали ДНК-зонды на отдельные гены ВГ H1N1 подтипа (Петров и др.,1992 а-е). Эти зонды были предназначены для обнаружения ВГ в клинических образцах. Очень интересными оказались результаты, анализа первичной структуры гена гемагглютинина штамма А/Алма-Ата/1417/84.

Анализ первичной структуры гена гемагглютинина штамма А/Алма-Ата/1417/84. В 1984 г. в Алма-Ате от больных гриппом были впервые изолированы штаммы вируса HswINI, антигенно идентичные первому изоляту вируса гриппа A/swine/lowa/15/ЗО (Чувакова и др., 1986). В эпидемиологии гриппа серовариант вируса HswINI как этиологический фактор пандемий занимает особое место. С одной стороны, в результате серологических и молекулярно-биологических исследований было установлено, что возбудителем «испанки» в 1918—1919 гг. был общий предшественник вирусов A/swine/lowa/15/ЗО и A/PR8/34 (Masure, Heijtink, 1983; Nakajima et al., 1984), который переместился затем в популяцию свиней, где циркулирует до настоящего времени, сохраняясь между эпизоотиями в организме переболевших свиноматок (Webster et a!, 1983). Не исключено, что, микроциркуляция вируса HswINI происходит и в популяции людей в виде латентных и персистентных инфекций, о чем свидетельствуют периодические изоляции вирусов, не полностью идентичных свиным прототипным штаммам, от людей, не имеющих контактов со свиньями (De Yong et al., 1986; Patriarca et al., 1984). С другой стороны, не

вызывает сомнений возможность заражения людей гриппом от животных (Dacso et al., 1984; Doudle, Hailwich, 1977; Hmshaw et al., 1978). При этом большинство исследователей считают, что трансмиссия агента от свиней людям представляет собой «тупик», так как такие вирусы недостаточно контагиозны, чтобы вызвать эпидемическую заболеваемость или даже ограниченную передачу вируса от человека к человеку. Однако, как оказалось, пандемический вирус HswINI 1918—1919 гг. выделения, возбудители вспышки гриппа HswINI в Нью-Джерси в 1976 г. и вспышки заболеваний в Алма-Ате в 1984 г., обладали этим свойством, хотя и в различной степени.

Аминокислотные последовательности HAI AL/84 и NJ/76, так же как и НА1 вирусов человека, не содержат потенциального сайта гликозилирования в позиции 276—278, свойственного вирусам гриппа свиней (Luon et al., 1992). По-видимому, гены НА вирусов HswINI, выделенных от человека, имеют общее происхождение, а их столь выраженные различия объясняются эволюцией во времени и пространстве. Таким образом, значительная степень адаптированности НА1 вируса AL/84 к человеческой популяции и установленная ранее гомология значительной части гена НА изолята и штамма A/swine/lowa/15/ЗО - гипотетического возбудителя «испанки» (Демьяненко и др., 1988) позволяют предположить потенциальную способность алма-атинского штамма А/Алма-Ата/1417/84 стать этиологическим фактором новой пандемии в будущем. В пользу такого предположения свидетельствуют также данные о наличии реверсии в антигенно- и функционально-значимом участке и более высокой степени гомологии последовательности НА1 современного варианта подтипа H1N1 - вируса А/Тайвань/1/86 и исследуемого изолята А/Алма-Ата/1417/84. В корректности такого заключения нас убедили результаты сравнения аминокислотных последовательностей генов гемагглютинина вирусов гриппа A H1N1 подтипа, циркулировавших с 30-х по 80-ые годы с опубликованной в 1997 г. Taubenberger и др. (1997) структурой гена гемагглютинина вируса гриппа, вызвавшего пандемию «испанки» в 1918 г. Изолят А/Алма-Ата/1417/84 оказался наиболее близким к возбудителю «испанки». Степень гомологии между гемагглютининами и кодирующими их генами составляет 96,12% и 92,65%, соответственно. Эти результаты заставляют задуматься о механизмах выживаемости эпидемических штаммов ВГ, преодолении ими межвидовых барьеров и о высокой вероятности возврата реликтовых штаммов на «эпидемическую орбиту» (Беклемишев и др., 1993; Чувакова и др., 1994).

Иммунохимическое изучение структурных белков вируса осповакцины и картирование генов белков р11 и р35. Одной из задач нашего исследования, представленного в данном разделе, явилось проведение комплекса физико-химических, иммунохимических и биологических исследований структурных белков вириона вируса осповакцины (ВОВ). Отдельной задачей являлось создание молекулярной противооспенной вакцины. Для выполнения этих задач необходимо было:

1. усовершенствовать существовавший метод выделения и очистки ВОВ и провести фракционирование и электрофоретический анализ его вирионных белков;

2. получить коллекцию моноспецифических антисывороток к структурным белкам вириона ВОВ и провести их иммунохимический анализ;

3. исследовать динамику накопления вирионных белков в инфицированных клетках;

4. картировать гены наиболее интересных структурных белков ВОВ.

5. исследовать иммуногенные свойства структурных белков ВОВ и их комплексов и разработать на основе идентифицированных протективных антигенов прототип молекулярной противооспенной вакцины.

Иммунохимическое изучение структурных белков вируса осповакцины. Когда мы приступали к работе, сведения по иммуногенности белков ВОВ основывались главным образом косвенно на их способности взаимодействовать с вируснейтрализующими или другими типами антител, выделенных у вакцинированных ВОВ животных и человека. При этом данные по прямому определению протективной активности белков ВОВ в литературе отсутствовали.

Выделение индивидуальных белков с помощью препаративного электрофореза в ПААГ в присутствии ионного детергента додецилсульфата натрия приводит к необратимой денатурации белков и, как следствие этого, к потере информационных детерминант у этих белков. В связи с этим нами была изучена возможность выделения поверхностных белков вириона ВОВ с помощью неионных детергентов.

В качестве источника получения вирионных белков использовали штамм Л-ИВП ВОВ, который выращивали на хорионаллантоисных оболочках (ХАО) развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) 10 -12-дневного возраста. Вирус выделяли по методу W. Joklik (1962), модифицированному нами. Модифицированный метод выделения вирионов ВОВ позволял получать препараты высокой степени очистки: 95 - 97%. Суть модификация заключалась в том, что исходный вируссодержащий экстракт ХАО концентрировали в 10 раз высокоскоростным центрифугированием перед первой обработкой его фреоном 113 и еще в 5 раз перед второй обработкой. Благодаря тому, что фреоновой обработке подвергали более концентрированный вируссодержащий материал, достигалось значительно большее обогащение его вирусом, чем в исходном методе. После такой обработки для получения высокоочищенного препарата ВОВ достаточно было однократной седиментации вирионов в

Рис. 3. Электрофореграмма структурных белков ВОВ, выделенного исходным (дорожки 1 - 4) и модифицированным (дорожки 5-8) методами в 13% ПААГ.

1 - суммарные белки вириона, , выделенного исходным методом;

2 • белки сердцевины вириона, выделенного исходным методом:

3 - белки 2-МЭ-фракции вириона, выделенного исходным методом;

4 - белки ЫР-40-фракции вириона, выделенного исходным методом;

5 - белки ЫР-40-фра>ащи вириона, выделенного модифицированным методом;

6 • белки 2-МЭ-фракции вириона, выделенного модифицированным методом;

7 - белки сердцевины вириона, выделенного модифицированным методом;

8 - суммарные белки вириона, выделенного модифицированным методом.

градиенте плотности сахарозы (рис. 3).

1 2 3 4.5 6 7 8

Из очищенных вирионов ВОВ выделяли фракции поверхностных белков с использованием различных детергентов. «2МЭ-фракцию» белков ВОВ получали последовательной экстракцией вирионов осповакцины сначала 0,5% NP-40 с 0.02М 2-МЭ в буфере А при 37°С в течение 1 ч. Нерастворимый материал, который представлял собой сердцевину вириона, осаждали центрифугированием при 20 000д в течение 30 мин через подушку 35% сахарозы. Аналогично проводили фракционирование вирусных белков лаурилсаркозилатом натрия и другими детергентами, которые использовали в двух вариантах: с добавлением 0,01 М 2-МЭ и без него.

На рис. 3 видно, что NP-фракция ВОВ штамма Л-ИВП, полученного модифицированным способом, содержит мажорный белок р35, а также минорные белки р42, рЗЗ, р12, рЮ. В состав 2-МЭ-фракции входят 6 мажорных белков: р12, р19, р20, р35, р42, р61, ряд минорных (рЮ, р14, р24, р26) и небольшое количество белка рЗЗ. Основными мажорными компонентами сердцевины вируса являются, по нашим данным, белки р11, р21, р24, рЗЗ, р59, рбЗ. Кроме этого, в ее состав входит большое количество миноров. Белки ВОВ, выделенные с помощью детергента NP-40 и 2-МЭ, составляют оболочку вириона. Фракция белков, выделенных 0,5% NP-40, оказывается наименее контаминированной минорными белками и содержит 85% белка р35. Другие детергенты не обладали удовлетворительной избирательностью экстракции белков из ВОВ. Исключение составил 0,1 - 0,2% лаурилсаркозилат натрия, который экстрагировал из вириона белок р61.

Обработка вириона кипячением в присутствии 2% ДСН и 5% 2-МЭ не приводит к полной дезагрегации вирусной частицы на отдельные полипептиды, в результате чего в условиях электрофореза с ДСН, многие из них могут находиться частично в виде высокомолекулярных агрегатов. В частности было показано, что мажорный белок оболочки вириона р20 является димером белка р12, причем процесс его димеризации носит обратимый характер в присутствии ДСН и 2-МЭ.

Полученные результаты позволили перейти к следующему этапу работы, необходимому для картированию генов ВОВ: получению моноспецифических антисывороток к структурным белкам вириона и их иммунохимическому анализу.

Получение моноспецифических антисывороток к структурным белкам вируса осповакцины. Попытка выделения индивидуальных белков ВОВ методом препаративного электрофореза на аппарате Umfor (LKB, Швеция) оказалась неудачной вследствие больших потерь белка (-50%).

Существует другой вариант препаративного электрофореза, при котором белковые зоны выявляют непосредственно в полиакриламидном геле, вырезают их и элюируют из них отдельные белки (Pedersen, Eddy, 1974; Hiller, Weber, 1982). Ранее Муравлёвым АИ. и Решетниковым С.С. (ВНИИ МБ, НПО "Вектор") был разработан оригинальный способ окраски белков в полиакриламидном геле. Суть его заключалась в том, что пластину геля вымачивали в 50%-ном водном этаноле для удаления ДСН, выдерживали в 0,1%-ной водной суспензии Кумасси R-250 ярко-синего и отмывали фоновое окрашивание 10%-ным водным этанолом. Важным достоинством этого способа является то, что при этом не происходит необратимой денатурации белков, белки прокрашиваются суспензией Кумасси R-250 только с поверхности геля, процедура выявления занимает всего 2-3 часа и белки при этом не успевают заметно диффундировать.

После выявления белковую зону геля вырезали, измельчали, отмывали связанный с белком краситель 5%-ным водным этанолом и белок элюировали пассивной диффузией в буфере, содержащем ДСН и 2-МЭ. С использованием этой процедуры было проведено препаративное выделение структурных белков из 10 мг ВОВ. Полученными препаратами белков иммунизировали кроликов. Иммунизацию проводили различными способами

(Табл.3). Комбинированная иммунизация животных раствором антигена с адьювантом Фрейнда и антигеном в составе ПААГ оказалась наиболее эффективной.

Таблица 3. Титры моноспецифических антисывороток, полученных разными способами, в реакции РИА._

Антиген Способ иммунизации

Три Три Три инъекции Две инъекции

инъекции инъекции раствора раствора антигена с

раствора раствора антигена в адъювантом и одна

антигена с антигена в составе ПААГ инъекция антигена в

адъювантом составе ПААГ с адъювантом составе ПААГ

Р61 1/20 (-) 1/1024

Р42 1/1024

Р35 (Р) 1/2048

Р35 (МЭ) 1/100 1/100 (-) 1/1024

Р24 1/50 1/1024

Р21 1/512

Р20 1/10 (•) 1/512

Р19 1/50 (-) 1/1024

Р12 1/50 (-) 1/1024

Р11 1/50 1/1024

Кол-во ВОВ, 25 мг 25 мг 10 мг 2,5 мг

из которого

выделены

антигены

Где: (-) - отсутствие специфических антител в сыворотке.

На весь цикл иммунизации было израсходовано всего лишь по 30-70 мкг каждого белка. Это значительно меньше, чем требуется при любом другом способе иммунизации (Pedersen, Eddy, 1974) причем сыворотки в этом случае получаются с более высоким титром.

Таким образом, нами был разработан универсальный высокоэффективный способ получения MAC, включающий в себя как особый метод препаративного электрофореза, так и особую схему иммунизации животных. Этим способом была получена коллекция MAC к основным белкам оболочки вириона ВОВ, а также к ряду белков его сердцевины (АС11, АС12. АС19. АС20. АС24, АС26. AC35(NP), АС35(МЭ), АС35(ВЭМ), АС42. АС61). Получена также антисыворотка к NР40-фракции вируса эктромелии мышей (ВЭМ), реагирующая в РИА с NР40-фракцией ВОВ.

Иммунохимический анализ структурных белков и продуктов бесклеточной трансляции мРНК ВОВ. Иммунохимический анализ белков вириона с помощью полученных MAC включал в себя несколько этапов: 1) проведение детального анализа белка оболочки р35 в составе различных белковых фракций вириона; 2) анализ суммарных белков вириона методом иммуноблоттинга со всеми остальными специфическими антисыворотками; 3) исследование динамики накопления структурных белков ВОВ в инфицированных клетках; 4) анализ продуктов бесклеточной трансляции вирусспецифической мРНК, выделенной из инфицированных клеток на поздних стадиях инфекционного цикла методом иммунопреципитации.

В результате проведённых исследований по этому разделу было установлено следующее

(1) Белок р35 вируса осповакцины в составе NP40- и МЭ-фракций имеет антигенную структуру, отличающуюся как от той, которую он имеет в составе нативного вириона, так и от структуры, которую он приобретает в результате обработки его ДСН и/или фиксации этанолом,

(2) все MAC реагируют с соответствующими полипептидами, взятыми для иммунизации, однако, в ряде случаев наблюдаются антигенные перекресты между некоторыми мажорными белками вириона (рис 4),

(3) белки р42, р20 и р12 представляют собой разные конформационные состояния одного и того же белка, отличающиеся по электрофоретической подвижности,

(4) белки р12, р19, р20, р35 и р42 появляются в клетках через 5-6 часов после начала инфекции (рис 5), причём на их синтез цитозинарабинозид не оказывает никакого влияния Следовательно, мРНК, кодирующие эти белки, являются ранне-поздними, и регуляция их транскрипции не зависит от процесса репликации вирусной ДНК,

(5) продукт бесклеточной трансляции вирусспецифической мРНК с мол массой 27 кДа является предшественником основного белка оболочки вируса осповакцины гликопротеина р35.

(6) предшественники вирионных белков р12 и р42 не отличаются от них по электрофоретической подвижности,

Наличие охарактеризованной таким образом коллекции MAC, а также полученные данные по антигенным свойствам вирионных белков ВОВ, открыли возможности для картирования их генов Ниже приведены результаты исследований по картированию генов структурных белков ВОВ р11 и р35 с использованием различных методических подходов

Рис 4 Иммуноблоттинг

2. ACI2,

3. ACI9

4. АС20,

1. неиммунная кроличья сыворотка

суммарных белков вириона ВОВ со специфическими

антисыворотками,

123456789

5. AC3S(NP) е. АС35(МЭ) 7. АС35(ВЭ).

8. АС42,

9. AC6I

Картирование гена белка р11 сердцевины ВС

ряд работ по изучению свойств мажорного белка вируса осповакцины с мол. массой 11 кДа, однако не было ясно, идет ли речь в работах разных авторов об одном и том же белке, или же в состав вириона входит несколько полипептидов с близкой мол. массой (Hiller, Weber 1982; Wittek, Hanggi, Hiller, 1984; Kao et al., 1981; Kao, Bauer, 1987).

Для того, чтобы внести ясность в этот вопрос, было проведено картирование гена белка, обозначенного в нашей работе как р11 (рис. 3). Картирование проводили с помощью метода гибридизационной селекции мРНК на фрагментах вирусной ДНК с последующей трансляцией ее в бесклеточной белок-синтезирующей системе и иммунохимическим анализом полученных продуктов трансляции (рис. 6.). В результате этих исследований было установлено, что продуктом гена, расположенного на стыке Hmdlll Е- и F- фрагментов ДНК вируса осповакцины является поздний сердцевинный белок р11, не входящий в составе оболочки вириона и не экспонирующийся на его поверхности.

Выделение специфической мРНК с помощью антисыворотки к белку р35 оболочки ВОВ и картирование гена белка р35. Нами была также осуществлена попытка картирования гена белка р35 оболочки ВОВ с помощью иммунохимически выделенной мРНК, кодирующей этот белок. Следует отметить, что в то время в литературе не было описано примеров выделения индивидуальных мРНК ВОВ. Схема картирования генов ВОВ с использованием процедуры иммуноаффинного выделения мРНК была следующей:

1) связывание антителами моноспецифической кроличьей антисыворотки к белку р35 из фракции суммарных полирибосом инфицированных клеток, полирибосом, синтезирующих этот белок;

2) сорбция полирибосом, связавшихся с IgG кролика, на белок А-сефарозе 4В;

3) выделение суммарной РНК из полирибосом, сорбировавшихся на белок А-сефарозе 4В;

4) синтез кДНК на выделенной РНК в присутствии [32Р]-меченных дНТФ;

5) гибридизации с различными фрагментами геномной ДНК ВОВ [32Р]-меченой кДНК, используемой в качестве зонда.

В результате последовательного выполнения всех названных этапов было осуществлено выделение специфической мРНК с помощью антисыворотки к белку р35 оболочки ВОВ (АС35(ВЭМ)). Синтезированная на ней кДНК специфически гибридизуется с геном 26К из левого Hindlll A-SalGI-фрагмента ДНК ВОВ, который, по-видимому, является геном предшественника гликопротеина р35. Полученные результаты были подтверждены иммунохимическим анализом белкового продукта этого гена, синтезированного в бактериальном продуценте.

Изучение иммунологических свойств стафилококкового энтеротоксина А (СЭА). СЭА, являясь высокотоксичным агентом, в то же время, обладает большим разнообразием биологических свойств. В связи с этим первая часть нашей работы была посвящена исследованию некоторых свойств СЭА, имеющих отношение к механизму воздействия на иммунную систему. Известно, что одним из симптомов отравления СЭА является повышение температуры тела. По современным представлениям повышение температуры тела на микробные антигены связано с продукцией ИЛ-1. Мы решили проверить, способен ли СЭА индуцировать синтез ИЛ-1 моноцитами крови человека.

Наши исследования показали, что СЭА в диапазоне концентраций от 100 пг/мл до 100 нг/мл действительно является индуктором синтеза ИЛ-1 моноцитами крови человека, хотя и менее эффективным, чем известный индуктор ИЛ-1 сальмонелезный липополисахарид, содержащийся в фармакологическом препарате - пирогенале (рис.7).

UKVUUK х<0М

Рис. 7.

По сои обсцисс - концентрации индукторов

Индукция синтеза ИЛ-1 моноцитами человека под

действием пирогенала (1) и СЭА (2).

По оси ординат - включение С-тимидина в ДНК тимоцитов

«о» «• и* «' <? лг/мл СЭЛ

« » « И » И НЕ/л» пмропилал

При отработке иммуноферментного анализа СЭА с помощью кроличьей коммерческой антисыворотки мы заметили, что антитела неиммунной сыворотки эффективно связываются с токсином. Мы предположили, что это связывание обусловлено не присутствием специфических антител, а вызывается неспецифическими иммуноглобулинами. Поскольку этот вопрос имел непосредственное отношение к оценке результатов ИФА антител к СЭА, мы провели специальное исследование, выдвинув версию о возможной способности СЭА связывать Fc-фрагмент иммуноглобулина.

Эксперименты с блокированием стафилококковым протеином А (СПА) Fc-фрагментов иммуноглобулинов неиммунной сыворотки кролика подтвердили это предположение, поскольку преинкубация сыворотки с СПА полностью устраняла неспецифическое связывание иммуноглобулинов с СЭА (рис.8). Причем оказалось, что СЭА-связывающая способность иммуноглобулинов у различных животных различается между собой. Так, при использовании амплифицированного ИФА было показано, что наибольшей связывающей способностью отличались мышиные иммуноглобулины, тогда как человеческие иммуноглобулины не связывали СЭА вообще. При более детальном исследовании этого феномена на примере очищенных иммуноглобулинов кролика выяснилось, что ДО значительно сильнее связывают СЭА, чем IgM. Хроматографически чистый Fc-фрагмент ДО также обладает способностью связывать СЭА, хотя и более слабой, чем цельный иммуноглобулин, что является прямым доказательством способности СЭА связывать Fc-

Рис. 8.

Связывание СЭА с

иммуноглобулинами неиммунной сыворотки кролика. По оси ординат - оптическая плотность в % к максимальному уровню связывания. По оси абсцисс - разведение сыворотки. Ъ

1- сыворотка, 2 - сыворотка + СПА, 3 - конъюгат + СПА на пластике, 4 - конъюгат + СПА на БСА, 5 -конъюгат + СПА на СЭА.

Далее нами было установлено, что в связывании СЭА участвуют углеводные компоненты Fc участка ДО и IgM, о чем можно было судить по уменьшению связывания ДО после обработки лизоцимом и блокаде связывания ^ в присутствии лектина КонА (рис.36). При смешивании ДО и СЭА образуется комплекс, в котором после отделения несвязавшегося СЭА гельфильтрацией и несвязавшегося ДО аффинной хроматографией на СПА-сорбенте соблюдается

участок иммуноглобулинов (рис.8).

соотношение lgG:C3A равное 2:1. Присутствие в образовавшемся комплексе IgG и СЭА было доказано с помощью антисыворотки к IgG и СЭА.

Из опытов по конкуренции СЭА с СПА за связывание IgG можно заключить, что участки IgG, ответственные за связывание с этими белками, находятся в одной области Fc-фрагмента и либо идентичны друг другу, либо расположены очень близко и стерически экранируются при связывании с соответствующим лигандом.

Получение и анализ моноклональных антител (МКА) к стафилококковому энтеротоксину А (СЭА). Конструирование иммуноферментной тест-системы на основе МКА. Учитывая исследовательские и прикладные возможно-сти МКА, мы посвятили вторую часть нашей работы получению методом гибридомной технологии стабильных клеточных линий, продуцирующих высокоспецифичные МКА к СЭА, изучению некоторых их свойств и разработке иммуноферментной тест-системы определения СЭА.

Получение МКА к СЭА представляет собой трудоемкий процесс, сопряженный со значительными трудностями ввиду его токсичности и слабой иммуногенности. Кроме того, СЭА обладает стимулирующим действием по отношению к Т-супрессорам. В связи с этим, схема иммунизации и форма предъявления антигена имела важное значение в технологии получения МКА к СЭА. С целью получения высокоактивного иммуногена и снижения токсичности энтеротоксина А его конъюгировали с носителями, применяя различные методы, и использовали различные адъюванты (МДП, ПАФ, НАФ). Так, для первых двух протоколов слияния использовали мурамилдипептид (МДП) Для третьего слияния использовали комплекс СЭА-lgG кролика, приготовленного на основании обнаруженного нами эффекта связывания СЭА с Fc-фрагментами IgG. Для 4-5 протоколов применяли химические конъюгаты СЭА с различными высокомолекулярными носителями (переосажденная целлюлоза, IgM). В 6-м протоколе слияния мышей многократно иммунизировали СЭА в смеси с полным и неполным адъювантом Фрейнда.

В примененных шести схемах иммунизации (табл.4) помимо различных форм представления антигена, варьировало также общее время иммунизации от нескольких суток до нескольких месяцев и были использованы разные способы введения иммуногена (внутриселезеночно, внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно).

Для получения антителосекретирующих гибридом использовали лимфоидные клетки, выделенные из различных источников - из селезенки и лимфатических узлов. В качестве партнера для гибридизации использовали клетки различных мышиных миеломных линий. В результате 6 слияний были выделены для дальнейшего исследования 9 независимых клонированных линий гибридных клеток, продуцирующих антитела к СЭА. Изотипическим анализом установлено, что 7 из них принадлежат к IgM, a 2 к классам IgG-j, lgG3- МКА, продуцируемые отобранными для анализа линиями гибридом (табл. 4.) были исследованы на специфичность в ИФА, а часть (F10D2, F2G7^6) в радиоиммунном анализе. Оказалось, что 7 моноклонов IgM изотипа и 1 моноклон lgG3 изотипа связывались как с СЭА, так и с другими типами энтеротоксинов, такими как СЭВ, СЭС. По-видимому, полученные МКА направлены против общих эпитопов СЭ.

МКА E9D111 gG-j изотипа, полученные после иммунизации многократным введением СЭА в адъюванте Фрейнда в течение длительного периода времени, проявили высокую специфичность к СЭА и не реагировали с СЭВ, C3Cj, C3D, CAT (рис.9). Эти антитела обладали не только высокой специфичностью, но и достаточно высокой аффинностью

(Ка=1,34х108М), что делают их весьма перспективными для создания диагностических тест-систем.

Табл.4. Основные характеристики гибридизации миеломных клеток с лимфоцитами мышей, иммунизированных СЭА

№ протокола слияния Иммунизация Миелома Источник лимфоцитов Эффект гибр. (%) Специф. эффект Моноклоны Класс антител

1 СЭА + МДП, е/бр. NSI Селезенка 4 0 — —

2 СЭА + МДП, в/сел. PAI Селезенка 55 2 406 lgG3

3 СЭА * IgG, в/сел. Крол. PAI Селезенка 6 18 F10D2, F2G7, F2D5 IgM

4 СЭА + цел., п/кож. Х653 Селезенка 25 4 D9B6, В9ВЗ, B3D7, Е5В6 IgM

5 СЭА + IgM-СЭА, в/бр х653 Селезенка 62 0 — —

6 СЭА + ПА®, в/бр. х653 Лимф Узл 85 15 E9D11 IgG,

Эксперименты по разработке различных вариантов иммуноферментной тест-системы для выявления СЭА на основе МКА E9D11 показали возможность получения чувствительных тестов, пригодных для определения СЭА в нанограммовых количествах. Причем большей чувствительностью обладала тест-система на основе реакции ингибирования ИФА (10 нг/мл), чем "сэндвич-ИФА" (150 нг/мл).

Получение моноклональных антител к стафилококковому альфа-токсину > (CAT) методом иммунизации in vitro. Известно, что септические состояния стафилококкового происхождения сопровождаются появлением в крови CAT, который используют в качестве этиологического маркера сепсиса. Между тем в настоящее время отсутствуют коммерческие тест-системы, позволяющие надежно и быстро определить этиологическую природу сепсиса.

Для успешного решения проблемы, связанной с получением представительного набора специфических антител к высокотоксичным для организма антигенам, нами была предпринята попытка получения панели гибридом, продуцирующих МКА к CAT с использованием метода иммунизации in vitro. Однако, все полученные гибридомы оказались исключительно IgM класса с низкой аффинностью. Поэтому, в дальнейших работах, связанных с получением МКА к CAT, мы отказались от данной методики иммунизации и мышиные МКА получали с помощью стандартной гибридомной технологии.

ГЧ«92нм) РиС. 9.

ИФА специфичности МКА £90 И. По оси ординат - оптическая плотность

По оси абсцисс - типы СЭ, иммобилизованных на пластике К'Желатина.

СЭЛ СЭВ СЭС, COD CAT К

Удалось получить одну гибридому, показывающую при длительном культивирование стабильную антителопродукцию и хорошие ростовые свойства. Данную гибридому ДЗ клонировали 5 раз, затем подвергнули препаративному накоплению в культурапьной среде. Установлено, что оптимальная концентрация нСАТ необходимая для сенсибилизации планшет составляет 5 мкг/мл. С помощью непрямого ИФА определяли титр культурального супернатанта. который составил 1/78 тыс.

При определении изотипа МКА ДЗ было установлено, что продуцируются антитела, относящиеся к lgG1 классу.

При проверки специфичности МКА ДЗ в ИФА исследовали на связывание с стафилококковым энтеротоксином А (СЭА) (рис.416). Результаты показывают высокую специфичность к а-токсину, что также было подтверждено в иммуноблоттинге связывание МКА ДЗ из культуральной жидкости с полосой соответствующий нСАТ. Для анализа связывания ДЗ с рекомбинантным а-токсином мы использовали непрямой и ингибиторный варианты ИФА. При нейтральном и щелочном рН МКА ДЗ хорошо связывается с иммобилизованным рСАТом. Активность и рабочее разведение сульфатной фракции МКА ДЗ с рСАТом было также определено в непрямом ИФА.

При разработке иммуноферментной тест-системы был испытан вариант постановки "ингибиторный". Ингибиторный вариант ИФА заключается в способности свободного рСАТа подавлять связывание МКА ДЗ с иммобилизованным рСАТом. По степени подавления этой реакции можно количественно судить о наличии его в пробе. Сначала была определена оптимальная концентрация рСАТ (2-4 мкг/мл) и рабочее разведение МКА ДЗ (0,35 мкг/мл), соответствующее разведению при котором оптическая плотность реакционый среды составляет половину от максимального значения в непрямом ИФА. В ингибиторном ИФА свободный рСАТ в различных концентрациях инкубировали в ячейках с иммобилизованным рСАТ совместно с МКА ДЗ. После 2-ух часовой инкубации связавшиеся антитела выявляли антивидовым конъюгатом. По степени торможения реакции связывания судили о наличии рСАТ в растворе. Чувствительность данной системы составила 0,15 мкг/мл.

Таким образом, нами получен пилотный вариант иммуноферментной тест-системы для выявления CAT в различных растворах. Потребуются дальнейшая доработка системы и ее клинические испытания.

Разработка метода обнаружения вирусов гепатита В и С в биосубстратах методом ПЦР. Проблема вирусных гепатитов, и в первую очередь гепатитов В и С, является одной из самых острых проблем медицины. Заболеваемость населения гепатитами В и С превышает заболеваемость такими высококонтагиозными инфекциями, как корь, ветряная оспа,

инфекционный паротит и краснуха, вместе взятыми (Львов, 1995; Соринсон, 1997). Не лучшим образом обстоит дело и с гепатитом С. На сегодняшний день остаются важными и нерешёнными в полной мере вопросы лечения, иммунопрофилактики (в случае гепатита С) и массовой экспресс-диагностики вирусных гепатитов. Требуется и всестороннее исследование возможных естественных путей передачи инфекции. Настоятельная необходимость решения этих задач диктуется также увеличением числа больных инаппарантными формами инфекции, у которых заболевание своевременно не распознается клинически и не верифицируется серологически. Такие больные представляют наибольшую эпидемическую значимость.

В данном разделе будут представлены результаты исследований, начатых в 1987 г. и направленных на разработку методов ДНК-диагностики вирусных гепатитов В и С. Мы поставили перед собой задачу сконструировать систему одновременной

(однопробирочной) детекции геномных нуклеиновых кислот вирусов гепатита В и С, основанную на амплификации нуклеотидных последовательностей методом nested-RT-PCR. Ориентация на этот метод ПЦР-детекции было обусловлено тем, что использование двухраундовой ПЦР в клинике затруднено вследствие высокой трудоемкости, длительности анализа и возрастания риска контаминации проб ампликонами

Выбор праймеров и определение чувствительности метода анализа. Успех разработки ПЦР-теста во многом определяется правильным выбором праймеров. На основе сравнения нуклеотидных последовательностей геномов HBV и HCV, экстрагированных из геномного банка (GenBank) были подобраны праймеры к консервативным областям геномов. Одной из проблем, возникающих при выборе праймеров для одновременной ПЦР на двух и более ДНК (РНК) - мишенях является выбор подходящих длин амплифицируемых мишеней для последующей простой идентификации ампликонов после их разделения в агарозных или ПААГ гелях. Кроме того, необходимо было подобрать праймеры для двух мишеней таким образом, чтобы они имели равные или близкие температуры отжига с соответствующими матрицами. Это необходимо было соблюсти как для пар наружных, так и внутренних праймеров. Был подобран также оптимальный метод одновременного выделения РНК и ДНК из клинических образцов. За основу был взят ранее описанный метод (Chomczynsky, Sacchi. 1987), но мы проводили процедуру выделения не при кислых рН, а при нейтральных. Этот метод давал высокий выход и РНК и ДНК, но был более быстрым и простым в исполнении. Этот метод выделения может применяться для массовых анализов.

Была определена чувствительность однопробирочной «гнездовой» ПЦР (в качестве детектируемой матрицы-мишени использовали клонированный в плазмиде фрагмент генома HCV) (рис. 11 ). Как можно видеть из рис.11 нижний предел чувствительности составил 102 копий мишени. Это вполне удовлетворительная чувствительность. Полученные результаты позволили нам перейти к испытанию разработанного нами способа на клинических образцах. Работа проводилась на образцах сыворотки крови и слюны больных вирусными гепатитами из 333 окружного военного госпиталя.

1 2 3 4 5 6 7 Рис. 11. Определение чувствительности метода

ПЦР. Ампликоны. полученные при однопробирочной — • — •- - — 1 tгнездовой» ПЦР на плазмидной ДНК содержащей

' вставку кДНК фрагмента генома HCV.

— Дорожки: (1) - только наружные праймеры; (2 - 5)-

***** iO5, 1<f, iO5 and 1(f копий молекул-мишеней.

,„ J : . соответственно; (б) - только внутренние

LmJ ■,_) . < праймеры; (7) - маркеры молекулярных масс (pBSII-

--SK* digested by НаеШ)

В целях решения основной задачи исследований - сравнительного анализа частоты обнаружения различных маркеров инфицирования ВГВ в сыворотке крови и слюне пациентов была отобрана группа больных с предварительным диагнозом вирусный гепатит в количестве 96 человек мужского пола в возрасте 18-20 лет (военнослужащие срочной службы). Больные поступали в инфекционное отделение госпиталя на 1-9 день желтушного периода (в среднем 2,9±1,9 день). Диагноз вирусного гепатита устанавливали на основании типичных клинических признаков и результатов лабораторного обследования больных. Этиологический диагноз у больных вирусными гепатитами обосновывали результатами тестирования сыворотки крови на наличие маркеров инфицирования - вирусных антигенов и специфических антител. Кроме того, было обследовано 32 донора крови. В целях уточнения частоты выявления индивидуальных специфических антигенов вируса гепатита В в слюне и крови в различные периоды инфекционного процесса 42 больных было протестировано на наличие НВеАд и 32 из них - на наличие НВеАд.

По данным тестирования сыворотки крови и слюны обследуемого контингента лиц на содержание НВеАд наблюдалось заметное совпадение данных как по положительным, так и по отрицательным результатам. Так, среди больных с серологически подтвержденным ОВГВ НВеАд обнаруживался в сыворотке крови в 83,3% случаев, а в слюне - в 85,7%. При микст-инфекции ВГ(В+С) НВеАд был выявлен в сыворотке крови у 73,1 % больных, а в слюне - у 84,6%. В контрольной фуппе наблюдали 100% совпадение результатов. Полученные данные свидетельствуют о высокой чувствительности, специфичности и диагностической значимости использованного метода выявления НВеАд в слюне.

Параллельное исследование в этом периоде заболевания сывороток крови и проб слюны на наличие в них НВеАд показало более частое обнаружение этого антигена в слюне больных, по сравнению с сывороткой крови. Так, в крови больных ОВГВ НВеАд обнаруживался у 31,3% случаев, больных ВГ (В+С) - у 50,0%, а в слюне - у 84,4 и 78,6% соответственно.

На стадии ранней реконвалесценции НВеАд чаще обнаруживался в сыворотке крови -у 59,5% переболевших ОВГВ и реже - в слюне - у 23,8% (Табл. 19). Аналогичная картина наблюдалась и у перенесших микст-гепатит (В+С) - 61,5% и 42,3% соответственно. Иная закономерность была выявлена при исследовании сыворотки крови и слюны реконвалесцентов на наличие НВеАд. Так, в сыворотке крови НВеАд у перенесших ОВГВ был выявлен только у 3,1%, тогда как в слюне - у 59,4%, а у реконвалесцентов после микст-инфекции ВГ(В+С) - у 21,7% и 69,6% соответственно.

Проведенные исследования показали высокую информативность ИФА при исследовании слюны как биосубстрата для обнаружения как НВеАд, так и НВеАд. Результаты выявления вирусспецифических маркеров гепатита В в слюне позволяют рассматривать ее как удобный биосубстрат при обследовании больных на инфицированность ВГВ, что согласуется с данными, полученными другими авторами (Асратян и др., 1997).

В наших исследованиях обращает на себя внимание высокая частота выявления в слюне больных НВеАд, показателя репликации вируса гепатита В, как в начале желтушного периода, так и у перенесших острый ВГВ. Наличие же НВеАд в слюне больных в различные периоды инфекционного процесса наводит на мысль о возможной репликации и персистенции вируса гепатита В в клетках слюнных желез, обеспечивающей "ускользание" вируса от иммунного ответа.

Для подтверждения потенциальной инфекционности крови и слюны больных ОВГ В эти биосубстраты, взятые в параллельных пробах у 13 пациентов, были также исследованы с

помощью ПЦР на наличие ДНК вируса гепатита В. Было установлено, что в разгар заболевания ДНК HBV выявляется не только в сыворотке крови (в 84,6% случаев), но и в слюне (46,2%), а в периоде ранней реконвалесценции ДНК ВГВ была обнаружена в крови только у одного больного, а в слюне - не выявлена.

Меньшая частота выявления ДНК ВГВ в слюне, по всей видимости, обусловлена низкой концентрацией в ней вируса (на 3 порядка ниже, чем в сыворотке крови), также как и вслучае ВГС (Roy et al., 1991). Поэтому в анализируемых пробах слюны чаще всего наблюдалась слабоположительная реакция. Использование слюны для диагностики вирусных заболеваний (в частности ВГВ) может стать весьма удобным альтернативным подходом при внедрении неповреждающих методов в диагностических целях при достижении достаточной чувствительности используемых тест-систем (Chaita et al., 1995; Richards etal., 1996).

На основании полученных данных нами была также высказана гипотеза о возможной репликации персистенции ВГВ в клетках слюнных желез, однако это предположение требует дальнейших подтверждений.

. Метод двух-раундовой однопробирочной ПЦР был испытан на 37 клинических образцах от больных с острыми и хроническими формами гепатита С. РНК HCV была обнаружена у 21 пациента, причем у 6 пациентов РНК HCV была единственным маркером инфицирования. Антитела к HCV были определены у 19 больных, совпадение наличия РНК HCV и антител к HCV выявлено у 15 больных. У 4 серопозитивных пациентов РНК HCV не выявлена. Полученные результаты позволяют надеяться на успешное применение разработанной тест-системы для диагностики острых и хронических форм инфекций HCV и HVB, оценки эффективности противовирусной терапии и выявления HCV и HVB виремии у доноров крови.

Таким образом, нами разработан простой, быстрый и высокочувствительный способ детекции РНК HCV и ДНК HBVB сыворотке крови и слюне, позволяющий максимально уменьшить контаминацию анализируемых образцов.

Все исследования по этому разделу, связанные с ИФА проводились д-ром Н.Г.Жевачевским.

Разработка способа дифференциального выявления геномных ДНК M.tuberculosis и

M.bovis.

При разработке любой тест-системы, предназначенной для выявления возбудителя инфекции методом ПЦР или ОТ-ПЦР, принципиальное значение имеет правильный выбор нуклеотидных последовательностей генома возбудителя, служащих в качестве мишеней для амплификации. Такие мишени должны быть строго специфичны для конкретного вида патогенов, консервативны и присущи геномам всех изолятов данного вида.

Для создания тест-системы диагностики туберкулёза, основанной на методе ПЦР, в качестве мишеней для амплификации выбирали две нуклеотидные последовательности, с таким расчетом, чтобы одна из них позволяла выявлять все виды микобактерий МТК, а другая позволяла дифференцировать виды M. tuberculosis и M.bovis.

Кроме того, дифференциация видов M.tuberculosis и M.bovis может быть полезной с точки зрения эпидемиологии, а также вследствие природной устойчивости M.bovis к пиразинамиду - антибактериальному средству, широко используемому при лечении туберкулеза (Liebana et al. 1996).

Поскольку за период времени, в который выполнялась данная работа (1995-2000 г.г.) сведения о распространенности различных видоспецифичных нуклеотидных

последовательностей в геномах представителей МТК дополнялись и уточнялись, данная работа фактически состоит из двух основных частей.

Первая часть данной работы представляет собой разработку метода дифференциальной детекции представителей МТК на основе nested ПЦР фрагментов нуклеотидных последовательностей инсерционного элемента /S611G и гена белка MTP4G (Беклемишев, Хорошева, 1QQB).

Белок MTP4G является антигеном, специфичным для вида M.tuberculosis (Falla, Parra et al, 1QQ1). Ген этого белка (mtp4G) также является специфичным для геномов вида M.tuberculosis, встречается в большинстве его изолятов, и отсутствует в геномах Mbovis и M.bovis BCG (Vera-Cabrera et al, 1QQ7). Ген mtp4G встречается также в некоторых изолятах M.afncanum (Liebana et al, 1QQ6).

Нуклеотидная последовательность гена mtp4G была использована в данной работе в качестве генетического маркера, амплификация которого позволяет судить о принадлежности возбудителя к виду М tuberculosis или Мafncanum.

Инсерционный элемент IS611G специфичен для геномов всех представителей МТК. Количество IS611G варьирует от 1 до 1Q копий на геном (van Soolingen et al, 1QQ1). При сравнении сообщений об определении его структуры, можно сделать вывод о том, что его нуклеотидная последовательность консервативна (Thierry et al, 1QQG, McAdam et al, 1QQG, Hermans etal, 1QQ1).

Фрагмент данного инсерционного элемента мы использовался в работе в качестве диагностической мишени, характерной для всех представителей МТК.

В дальнейшем, в литературе появились сведения о том, что инсерционный элемент IS611G присутствует в некоторых изолятах Mycobactenum ulcerans и Mycobactenum gilvum (Liebana et al, 1QQ6), а также были идентифицированы отдельные изоляты Мtuberculosis, не содержащие IS611G в своих геномах (Liebana et al, 1QQ6, Moatter et al, 1QQB).

Вторая часть данной работы представляет собой разработку метода выявления ДНК возбудителей туберкулеза на основе многоцикловой однопробирочной мультипраймерной амплификации фрагментов нуклеотидных последовательностей делеционной области RD1 и гена mtp4G совместно с ДНК внутреннего стандарта (Беклемишев и др., 2GG1)

Геномный фрагмент RD1 размером Q.S kb, включающий в себя ген белка Esat-6, присутствует в геномах лабораторных штаммов M.tuberculosis и Мbovis, но делетирован в геномах всех штаммов M.bovts BCG (Mahairas et al, 1QQ6). Кодируемый этим геном белок ESAT-6 является секретируемым ранним антигеном специфичным для всех видов МТК, за исключением штаммов M.bovis BCG (Harboe et al, 1QQ6).

Участок данной области генома мы использовали в качестве диагностической мишени, характерной для всех представителей МТК.

В качестве второй диагностической мишени, амплификация которой позволяет судить о о принадлежности возбудителя к виду M.tuberculosis, была использована нуклеотидная последовательность гена mtp4Q.

Такая структура работы позволила нам сравнить два подхода к построению ПЦР-диагностикумов туберкулеза, встретиться с решением интересных методологических проблем и выработать некоторые методические рекомендации для разработки способов выявления ДНК возбудителей туберкулеза на основе метода ПЦР.

Выбор оптимального метода выделения ДНК из микобактерий. Поскольку в клинических образцах обычно присутствует малое количество микобактерий, то для достоверного их обнаружения методом ПЦР необходимо наиболее полно выделить из них

геномную ДНК и минимизировать присутствие в препаратах ДНК примесей ингибиторов термостабильной ДНК-полимеразы. В данной работе были апробированы и сравнены по двум параметрам: количеству выделенной ДНК и ее пригодности для амплификации семь способов изоляции ДНК из микобактерий, основанных на разрушении клеточной стенки и мембраны бактерий обработкой:

(1) лизоцимом, неионными детергентами и протеиназой К (Folguerra et al, 1993),

(2) лизоцимом, додецил-сульфатом натрия (SDS) и протеиназой К (Kocagoz et al, 1993),

(3) эмульсифицированием с хлороформом (Wilson et al, 1993),

(4) кипячением (Kocagoz et al, 1993),

(5) 6M гуанидинизотиоцианатом и тритоном Х-100,

(6) 6М гуанидинизотиоцианатом без добавления детергента (Wilson et al, 1993)

(7) 6М перхлоратом натрия (Морозов, 1998).

Проводили выделение ДНК каждым из указанных выше методов из равных аликвот суспензии культивированных микобактерий M.tuberculosis. Препараты ДНК, получение при применении каждого из методов испытывали на пригодность для амплификации в системе ПЦР. Ни в одном из препаратов ДНК не было замечено ингибирования активности термостабильной ДНК-полимеразы при проведении амплификации участка инсерционного элемента /S6110 игенат£р40.

По данным электрофореза в агарозном геле только хлороформный метод позволял изолировать ДНК из микобактерий достаточно полно (Рис. 12). Этот факт был подтверждали результатами нескольких повторных экспериментов.

123456789

Рис. 12. Элекрофореграмма препаратов ДНК, выделенных из микобактерий М bovis 8CG различными способами. Электрофорез в 0,4% агарозном геле, в 1хТАЕ-буфере, при 8 V/cm. Дорожки.

1-препарат ДНК бактериофага /I

2- препарат ДНК, выделенной методом кипячения

3- -'< использованием обработки лизоцимом и ДСН,

4- -"-с использованием перхлората натрия,

5 • злектрофоретическое распределение ДНК, выделенной с использованием хлороформа,

6- препарат ДНК выделенной с использованием лизоцима и неионных детергентов,

7--"-с использованием гуанидинизотиоцианата,

В ••"•с использованием гуанидинизотиоцианата и тритона Х-100 9 • продукты гидролиза ДНК бактериофага рэндонуклеазой рестрикции НтсШ.

Метод выделения ДНК с использованием хлороформа является достаточно простым и удобным. Процедура выделения ДНК занимает 20-30 мин и позволяет избежать ферментативной обработки, применения дорогостоящих реагентов и применения фенольной

экстракции. При тестировании препаратов ДНК, выделенных из культивированных клеток M.tuberculosis этим методом, в системе ПЦР не было замечено ингибирования Taq-ДНК-полимеразы в диапазоне концентрации ДНК от 10 до 107 геномов на одну реакционную смесь. Таким образом, хлороформный метод выделения ДНК представляется, на наш взгляд, наиболее удобным для использования в ПЦР-диагностике туберкулёза в медицинской практике.

Разработка метода дифференциальной детекции микобактерий туберкулёзного комплекса на основе двухраундовой ПЦР. В качестве нуклеотидных

последовательностей-мишеней для амплификации в первом раунде ПЦР в данном способе анализа использовали консервативный участок инсерционного элемента IS6110 размером 315 п.н. ( позиции нуклеотидов с 965 по 1280), а также фрагмент нуклеотидной последовательности, содержащей ген mtp40 размером 556 п.н. ( с - 55-го нуклеотида по отношению к первому нуклеотиду кодирующей области по 501 нуклеотид). Результирующие ампликоны после завершения второго раунда амплификации представляют собой фрагмент гена mtp40 размером 436 п.н. (с - 2-го по 434 нуклеотид), и участок инсерционного элемента IS6110 размером 219 п.н. (с 965 по 1184 нуклеотид). Одновременную амплификацию обеих мишеневых последовательностей проводили в две стадии. На обеих стадиях (раундах) состав реакционной смеси и условия проведения ПЦР были оптимизированы для достижения максимального уровня амплификации (Беклемишев, Хорошева. 1998). Для определения чувствительности этого способа детекции ДНК была проведена двухстадийная амплификация фрагмента IS6110 на ДНК, выделенной хлороформным методом из 1-5, 10, 100, 1000 и 10000 микобактерий вакцинного препарата M.bovis BCG, смешанных с мокротой здорового человека. Было установлено, что чувствительность способа достаточно высока и позволяет обнаружить в реакционной смеси ДНК, выделенную из не менее, чем 10 микобактерий.

Выбранный метод выделения ДНК из микобактерий и подобранные условия одновременной двухраундовой амплификации ДНК-мишеней были применены для анализа клинических образцов (мокрота, моча, промывные воды желудка) от 22 пациентов, полученных из ЦКБ СО РАН. Продукты коамплификаций двух мишеней анализировали электрофорезом в 1.5% агарозном геле. Результаты анализа представлены на рисунке 13.

Как видно на электрофореграмме результатов анализа, в препаратах ДНК 5-ти образцов (№№ 1,5,7,15 и 16) были выявлены нуклеотидные последовательности геномов МТК, о чём свидетельствуют наблюдаемые на электрофореграмме полосы ампликонов соответствующего размера (436 п.н. и 219 п.н.), причём в препарате ДНК образца №1 содержится геномная ДНК из M.bovis, так как на электрофореграмме обнаруживается только одна полоса, соответствующая ампликону размером 219 п.н. В препаратах ДНК остальных образцов ( №№ 5,7,15 и 16) присутствует ДНК M.tuberculosis, так как на электрофореграмме выявляются две полосы, соответствующие ампликонам с размерами 436 п.н. и 219 п.н.

При сравнении полученных результатов с данными культивирования и микроскопии микобактерий из этих же клинических образцов было показано, что положительные результаты ПЦР-анализа согласуются с данными либо клинического обследования, либо микробиологического анализа, что свидетельствует о специфичности разработанного метода и его высокой чувствительности. Не было получено ни одного ложно-положительного и ни одного ложноотрицательного результата.

Дорожки

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 1314 15 16 IT '

Рис 13

Эпектрофореграм ма продуктов деухраундовой

-А t~r IT <

- ^ - * V-

Размер ДНК 436 пн 219 пн

образцов Электрофорез

проводили в 2% агарозном геле, в 1х ТАЕ-буфере, при 8 V/cm

последовательное тей геномов МТК, полученных при проведении ПЦР на препаратах

суммарной ДНК, выделенных из клинических

значимых нуклеотидных

амплификации двух диагностически

Дорожки

1-22 - продукты амплификации препаратов ДНК выделенных из клинических образцов

23 • продукты гидролиза ДНК плазмиды рВ1ие$спрШ вк* рестриктазой НаеШ

24 - продукты гидролиза ДНК бактериофага А рестриктазами Нтй/// и ЕсоН!

области RD1 размером 544 п н (позиции нуклеотидов с 4271 по 4822 включающий в сеоя ген белка Esat-б, и участок гена mtp40 размером 402 п н (с 30-го нуклеотида по отношению к первому нуклеотиду кодирующей области по 431 нуклеотид)

Условия проведения амплификации оптимизировали так, чтобы получать равноценную наработку обоих нуклеотидных последовательностей в общей реакционной смеси Для сохранения активности Taq-полимеразы проводили денатурацию при температуре в среднем на 2-4°С ниже, чем обычно, что стало возможным осуществить без снижения специфичности после добавления в реакционную смесь 10% глицерина Начиная с 6-го цикла стало допустимым проводить денатурацию при 90-92°С, 40 сек на первом шаге каждого цикла Отжиг праймеров проводили при температуре на 4-8°С ниже расчетной В результате стало возможным проводить амплификацию в течение 51 цикла без исчезновения активности фермента и, как следствие, повысить чувствительность способа детекции ДНК Оптимизация условий проведения реакции позволила нам получать сбалансированную амплификацию обоих диагностических мишеней совместно с ДНК внутреннего стандарта в течение не менее 51 цикла

Для определения чувствительности разработанного способа ПЦР-детекции был использован препарат ДНК Мtuberculosis в разведениях, соответствующих 25, 50, 100 и 1000 геномов в 5-ти мкл, вносимых в реакцию амплификации При приготовлении разведений к растворам ДНК добавляли ДНК-носитель (ДНК фага X) до концентрации 100 нг/мкл с целью предотвращения сорбции ДНК на стенках пробирок Амплификацию проводили в течение 51 цикла в присутствии 20 копий ДНК внутреннего стандарта Результаты амплификации приведены на рисунке 14

Как видно из полученных результатов, предлагаемый метод выявления ДНК микобактерий туберкулезного комплекса, основанный на одновременной амплификации фрагмента области RD1 геномов микобактерий и участка гена mtp40 совместно с ДНК

Рис.14.

Эпектрофореграмма продуктов одновременной амплификации фрагмента области RDI геномов микобактерий (ампликон размером 544 п.н.) и участка гена mtp40 (ампликон размером 401 п.н) и ДНК внутреннего стандарта (ампликон размером 231 п.н.), проведенной на различных разведениях ДНК

M.tuberculosis. Электрофорез проводили в 5% ПААГ, в 1хТВЕ-буфере, при 8 V/cm.

Дорожки: амплификация диагностических мишеней Е и М, совместно с ДНК внутреннего стандарта при внесении в реакционную смесь (1) -25 копий геномной ДНК M.tuberculosis,; (2) - 50 копий геномной ДНК M.tuberculosis; (3) • 100 копий геномной ДНК M.tuberculosis; (4)- 1000 копий геномной ДНК M.tuberculosis.

внутреннего стандарта, позволяет выявлять от 25 микобактериальных геномов, взятых на анализ. Это соответствует 500-м микобактериям МТК в анализируемом клиническом образце, выявляемым данным методом.

Разработанный метод дифференциального выявления геномных ДНК возбудителей туберкулеза при помощи однораундовой многоцикловой мультиплексной ПЦР. обладает следующими достоинствами: а) чувствительность анализа является достаточно высокой; б) проведение реакции в один раунд дает возможность значительно снизить риск контаминации образцов ампликонами и получения ложно-положительных результатов; в) использование в каждом анализируемом образце ДНК внутреннего стандарта позволяет контролировать прохождение реакции, и исключать ложно-отрицательные результаты, возникающие обычно за счет присутствия примесей, ингибирующих активность термофильной ДНК - полимеразы; г) использование оптимального метода выделения ДНК из микобактерий клинических образцов позволяет выделять ДНК с минимальными потерями и без значительных затрат времени. Кроме того, оригинальный подбор диагностических мишеней обеспечивает, а) высокую специфичность анализа;

б) дает возможность дифференцирования по результатам полимеразной цепной реакции микобактерий вида M.bovis, что представляется важным с точки зрения планирования антибактериальной терапии, и с точки зрения эпидемиологических исследований; в) позволяет не выявляеть при анализе ДНК M.bovis BC6, непатогенного вакцинного штамма, что также является преимуществом при проведении исследования образцов на наличие ДНК МТК.

Дорожки:

1 2 3 4 5

Испытание разработанного способа выявления ДНК на клинических образцах, содержащих лекарственно- устойчивых возбудителей туберкулёза.

Выбранный оптимальный метод выделения ДНК из микобактерий и разработанный метод выявления ДНК туберкулезного комплекса были использованы для выявления ДНК МТК в клинических образцах (мокрота, кровь, моча, промывные воды желудка), полученных от 37 пациентов полученных из ЦКБ СО РАН. Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 1,5% агарозном геле. Сравнение результатов детекции микобактерий разработанным способом с данными культивирования клинических образцов, а также с клиническими диагнозами показал, что разработанный способ выявления возбудителей туберкулеза в клинических образцах не уступает микробиологическим методам в специфичности, и превосходит метод микроскопического исследования по чувствительности. Кроме того разработанный способ выявления возбудителей туберкулеза превосходит метод культивирования микобактерий на селективной среде по скорости проведения анализа.

В целом можно говорить о том, что разработанный метод дифференциального выявления геномных ДНК возбудителей туберкулеза, основанный на однораундовой многоцикловой мультиплексной ПЦР, достаточно эффективен и удобен, обладает требуемыми специфичностью и чувствительностью и может применяться для клинической лабораторной диагностики туберкулеза.

Разработка иммуноферментного способа диагностики иксодового клещевого боррелиоза, основанного на рекомбинантных антигенах.

Лайм-боррелиоз (ЛБ), вызываемый спирохетами трёх геновидов комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato (s I.) является острым, с переходом в хроническую форму, природно-очаговым заболеванием. Природные очаги этой инфекции в России существуют повсеместно, от Прибалтики до Дальнего Востока, и во многих случаях они совмещены с очагами клещевого энцефалита. Ежегодно в России регистрируется до десяти тысяч случаев этого заболевания, однако, по оценкам специалистов, значительная часть (80-90% случаев) остается невыявленной. В первую очередь это связано с отсутствием в стране доступной и надежной иммуноферментной тест-системы диагностики иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ). Закупаемая в России тест-система, производимая фирмой "Dako" (Дания) недостаточно чувствительная и дорогая. В то же время своевременная диагностика ранних стадий ИКБ крайне важна, поскольку позволяет эффективно купировать заболевание антибиотикотерапией. тогда как лечение хронических форм весьма затруднительно, занимает длительное время и требует значительно больших доз дорогостоящих антибиотиков.

Когда мы приступали к работе, практически отсутствовали данные по распространённости спирохет Borrelia burgdorferi s.l. на территории Сибири, а в стране имелась только одна диагностическая система выявления возбудителя - РНИФ.

Определение зараженности клещей спирохетами Borrelia burgdorferi sensu lato, собранных на территории Сибири. Первоочередной задачей, которую требовалось решить, явилась оценка зараженности клещей-переносчиков спирохетами 8. burgdorferi s.l. На территории Сибири единственным переносчиком возбудителя ИКБ, представляющим опасность для людей, является Ixodes persulcatus. Клещей собирали на территориях предгорной части Алтая, лесопарковой зоны Новосибирского Научного Центра, южных частях Томской области и Хабаровского края, а также на острове Сахалин. Генотипирование боррелий проводили no Postic et al. (1994). По данной схеме,

амплификации подвергается участок межгенной области генов рибосомапьных РНК 23в(т)-5в(п1), после чего ампликонь гидролизуют рестриктазой Тги 91 (Mse I) и гидролизат анализируют электрофорезом в ПААГ. Выявляемый таким способом полиморфизм, коррелирует с геновидовой и штаммовой принадлежностью боррелийй.

Первичные структуры синтезированных праймеров и температуры плавления их с соответствующими участками ДНК-мишени приведены ниже: РЯ126 - 5'-

осаАоттсасаааАа-з1, тт=бб.1ес; РЯ127 - з'-ТССТАООСАТТСАССАТАОАСТСТТ-З',

т=63°С. В отличие от исходной методики мы подобрали праймеры, имеющие близкие значения температур плавления. Стандартные результаты типирования спирохет, относящихся к комплексу B.burgdorferi е.!. приведены на рисунке 15.

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Размер ДНК, (п.н.) <—108 <—68 -4—57 +—50

"20

Рис. 15 ПДРФ анализ ампликонов nUrtмежгенной области ДНК Borrelia burgdorferi sensu lato Дорожки:

1-4,6 и 8-13 • продукты гидролиза рестриктазой Mse I ампликонов, ситезированных на rri-rrl области образцов ДНК, выделенных из клещей I. persulcatus; 1,2,4,11,12,13 - В. garinii NT 29; 3 - В. garinii NT 29 + В. afzelir, 6, 8.10 - В. garinii 200475, 9 - В. afzelii-,

5 - продукты гидролиза рестриктазой Mse I ампликонов, ситезированных на rrf-nl области ДНК В. afzelii АСА-1, испльзуемой в качестве референсного препарата;

7 • ДНК pBlueScnpt II SK1*' гидролизованная Hae III, в качестве маркерной.

Зараженность взрослых голодных клешей /. persulcatus различными геновидами в. burgdorferi s.l., составила в 1999 году -14%, в 2000 году -15.8%, в 2001 году - 38%, в 2002 году-15%. По регионам зараженность составляла: Томск- 29%, Новосибирск-14%, Алтай - 8.6%. При этом основная масса исследованных боррелий, была определена как варианты В. gariniiio и реже Bonelia afzelii. Другие геновиды комплекса Borrelia burgdorferi s.l., насчитывающего на сегодняшний день 10 геновидов и несколько геномных групп, в исследованных нами регионах не обнаружены. Генотипирование культур дальневосточных боррелий, показало такое же соотношение основных геновидов, как и в Западной Сибири.

Конструирование рекомбинантных штаммов Е.со//, продуцирующих антигены OspC и фрагмент FlaB новосибирского изолята B.garinii NT29

Целью исследований по данному разделу работы являлось клонирование в клетках E.coli генов антигенов B.burgdorferi s.l., вызывающих сильный иммунный ответ на ранних стадиях развития инфекции. Наиболее сильный иммунный ответ у человека вызывают OspC, FlaB (Р41), OspA, OspB, P93, P39 (BmpA), P35 (BBK47), DbpA, P66, а также ряд других белков, обладающих помимо иммуногенности высокой изменчивостью, что затрудняет их использование в диагностических целях.

В настоящей работе нами выбраны белки OspC и фрагмент FlaB, как наиболее подходящие для создания иммуноферментной тест-системы для диагностики начальных стадий ИКБ. Оба выбранных антигена вызывают появление специфичных IgM в течение первого месяца с момента заражения. Данные белки видоспецифичны и присутствуют во всех без исключения патогенных штаммах B.burgdorferi s.l. В качестве экспрессирующего вектора был использован pREB9-6H, который позволяет осуществлять эффективную наработку рекомбинантных белков в E.coli (в том числе, и токсичных для нее), с последующей быстрой и простой очисткой методом аффинной хроматографии на никель-хелатных сорбентах.

Фрагмент гена flaB западносибирского изолята B.garinii NT29, кодирующий консервативный участок флагеллярного белка, амплифицировали методом ПЦР с использованием праймеров PR87 и PR88. PR87 5'GTTAACGGCACATATTCAGATGC3' Tm=62.8°C; PR88 5'GAGGTGACCTAAATTTGCCCTTTGATC3' Tm=68.5 °C. На 5'-конце праймера PR88 был предусмотрен сайт узнавания рестриктазой Eco 065I (сайт подчеркнут), необходимый для клонирования ампликона в экспрессирующем векторе pREB-6H по этому сайту.

Клонирование этого фрагмента в экспрессирующем векторе проводили по следующей схеме: а) ампликон фрагмента гена flaB гидролизовали рестриктазами Ира I и Eco 065I; б) рекомбинантную плазмиду, содержащую полноразмерную копию структурной области гена альфа-токсина S. aureus (CAT,), использовали в качестве матрицы для амплификации этого гена с использованием праймеров PR22: 5'-GGAATTCATGAAAACACGTATAGTC-3' и PR31: 5'-AGGTCACCATTTGTCATTTCTTC I Hill llC-3'. на 5'-концах которых находились

дополнительные нуклеотидные последовательности с сайтами узнавания для эндонуклеаз рестрикции Eco RI и Есо 0651, соответственно. Полученный ампликон гидролизовали рестриктазами Eco RI и Ssp I, продукты гидролиза разделяли электрофорезом в 5% ПААГ и фрагмент размером -96 п.н., кодирующий сигнал пептидазы 2 предшественника альфа-токсина Staphilococcus aureus (CAT) и шесть первых аминокислотных остатков зрелого CAT, элюировали из геля; в) очищенные рестрикты, полученные на стадиях (а) и (б), лигировали по тупым концам с помощью Т4 ДНК-лигазы. Лигазную смесь подвергали амплификации (12 циклов) в системе ПЦР, используя праймеры PR22 и PR88. Продукт амплификации гидролизовали рестриктазами Eco RI и Eco 065I, и лигировали с вектором pREB9-6H, предварительно гидролизованным теми же рестриктазами; г) На завершающем этапе лигазной смесью трансформировали клетки £ coli шт. С 600 с спользованием электропорации и проводили селекцию клонов.

В результате реализации вышеописанной схемы клонирования ожидалось, что в процессе экспрессии гибридного гена будет синтезироваться химерный полипептид, способный подвергаться нормальному процессингу и, как результат этого, в периплазму клетки Е. coli будет секретироваться специфичный для представителей комплекса B.burgdorferi s.l. фрагмент флагеллярного белка Р41. Выделение целевого продукта из бедной собственными белками периплазмы, представляет значительно более простую задачу, чем выделение из суммарного лизата.

В результате трансформации клеток E.coli лигазной смесью было получено около 10000 клонов', устойчивых к ампициллину. 46 клонов дали положительный сигнал на

наличие вставки ожидаемого размера. Эти клоны были исследованы на способность отвечать на индукцию налидиксовой кислотой повышенным синтезом рекомбинантных полипептидов с расчетной массой ~27 кДа (непроцессированный химерный белок) и -25 кДа (зрелый белок, содержащий наряду с первыми шестью N-концевыми аминокислотными остатками зрелого CAT аминокислотную последовательность, кодируемую клонированным фрагментом гена ЛаВ. Анализ полипептидного состава индуцированных и неиндуцированных клонов методом денатурирующего электрофореза в ПААГ показал, что в семи клонах наблюдается индуцируемый синтез белка ожидаемого размера (-27 кДа). Один из этих клонов, F-7, был использован в последующих экспериментах. Ожидаемая первичная структура гена, клонированного в составе вектора pREB9-6H в клоне F-7, была подтверждена секвенированием вставки ДНК по методу Сэнгера. Индукцию экспрессии клонированного химерного гена в клоне F-7 осуществляли налидиксовой кислотой (50 мкг/мл) от двух до шестнадцати часов после достижения плотности культуры 0.8-1.2 ое. (OD,9s)- Выход рекомбинантного белка составлял примерно 8-12% от суммарного клеточного белка Е. coli. С помощью аффинной хроматографии лизата индуцированных клеток на Ni2*-хелатном сорбенте достигалась 95%-ная очистка рекомбинантного антигена, включающего все варианты процессинга.

Индуцируемые полипептиды обнаруживаются главным образом в растворимой форме в цитоплазме и только в следовых количествах в периплазме. Сильный сигнал связывания специфических антител дают и два полипептида цитоплазматической фракции,' один из которых соответствует по размерам химерному белку-предшественнику, а другой -низкомолекулярному продукту посттрансляционной модификации первого. В периплазматической фракции и культуральной жидкости белки, специфически связывающиеся с антителами сывороток больных КБ не выявлялись.

Полученные результаты позволили сделать вывод о перспективности использования рекомбинантных полипептидов клона F-7, содержащих антигенные эпитопы фрагмента флагеллярного белка Р41 B.garinii NT29 для серодиагностики начальных стадий Лайм-боррелиоза.

В связи с тем, что ген ospC, значительно более изменчив чем ЛаВ, на первом этапе необходимо было оценить эту изменчивость в сибирских популяциях В. burgdorferi. С помощью культивирования на среде BSKII были получены изоляты боррелий, выделенные из отдельных клещей, собранных в Западной Сибири и на Дальнем Востоке. Препараты ДНК, выделенные из каждой культуры боррелий, служили матрицей для амплификации структурной области гена ospC. Амплификацию гена проводили в присутствии праймеров: PR56 S'-ATGAAAMGAATACATTAAGTGCGATATT-3 и

PR57 5-TTAAGGi Hill IGGACTTTCTGC-3', Наработанные ампликоны были просеквенированы и проведено сравнение их нуклеотидных последовательностей.

Установленные нуклеотидные последовательности были также сравнены со всей, имеющейся к настоящему времени, базой данных по ospC - около 350. При этом распределение последовательностей по группам в основном совпало с результатами полученными при ПДРФ анализе межгенной области 5S-23S-pPHK. Исключение составил лишь Новосибирский (cG-NSK-20-97) изолят, определенный ПДРФ как NT29 (Bonrelia garinii), а по структуре гена ospC и белка OspC оказавшейся ближе к Borrelia afzelii. Была проведена оценка профилей гидрофильное™ белков, соответствующих установленным нуклеотидным последовательностям с использованием программ «PC/Gene» и «Anthepro», а также выявлены основные антигенные Т-эпитопы.

При клонировании структурной области гена ospC • в клетках-£-col¡ использовали стратегию, близкую выше описанной для гена flaB

ЬКЬЛНОТЕКА 1 С. Петербург 1 _O» 309 »ÍT t

B.gannii NT29 проводили в два раунда. В первом раунде, проведенном с праймерами PR56 и PR57 методом ПЦР, осуществляли препаративную наработку ампликона. Во втором раунде, состоящем из 8 циклов, в нуклеотидную последовательность ампликона вводили по 5м и 3" концам сайты узнавания для рестриктаз Есо RI и Есо 0651, соответственно проводя ПЦР в присутствие праймеров PR47 5'-CGGAATTCATGAAAAAGAATACATTAAGTGC-3' и PR48 5'-TTGGTGACCAGGTTTTTTTTGGACTTTCTGC-31. После второго раунда ПЦР, продукт амплификации гидролизовали рестриктазами Есо RI и Есо 0651, и лигировали с вектором pREB9-6H, предварительно гидролизованным теми же рестриктазами. Лигазной смесью трансформировали клетки Е. coli шт. BL21 с использованием электропорации и проводили селекцию клонов. Из 50000 клонов устойчивых к ампициллину было проанализировано около 200, 13 из которых, продуцировали белок ожидаемого размера в ответ на индукцию налидиксовой кислотой. Также была клонирована структурная область гена ospC шт. АСА1 (клон А89). На этом клоне была проведена работа по анализу экспрессии рекомбинантного белка (рис. 53). Основная масса продукта выявляется в цитоплазме в растворимой форме. Количество индуцируемого полипетида составляло около 10-12% от суммарного клеточного белка. Рекомбинантный белок очищали с использованием аффинной хроматографии на Ni2*-NTA-cop6eHTe. Чистота выделенного препарата составляла около 95 %. Результаты были подтвеждены на клоне (С25), содержащим новосибирский вариант ospC.

Разработка прототипов иммуноферментных тест-систем для диагностики начальных стадий Лайм-боррелиоза.

При конструировании диагностических тест-систем, использовали очищенные аффинной хроматографией рекомбинантные антигены OspC и фрагмент FlaB. Определение оптимальной концентрации антигенов производили стандартным методом. Было установлено, что 0.5 мкг препарата на лунку является оптимальной дозой антигенов.

На основе композиции рекомбинантных антигенов OspC и Fla , фрагмента флагеллярного белка р41 В gannii мы разработали экспериментальную серию ИФА тест-системы для обнаружения суммарных антител к возбудителю ИКБ.

Для оценки чувствительности и специфичности иммуноферментной тест-системы были использованы две контрольные (положительные и отрицательные) панели сывороток крови. Чувствительность тест-системы определяли тестированием 16 контрольных положительных сывороток крови от больных ИКБ. Диагноз ИКБ у всех больным был установлен на основе анамнеза (укус клеща), данных клинического обследования, а также лабораторно подтвержден положительной реакцией в РНИФ с корпускулярным антигеном В burgdorferi Ip21. Для исследования в ИФА были отобраны образцы с титрами в РНИФ 1\20 и выше.

Для проверки специфичности иммуноферментной тест-системы использовали 16 контрольных отрицательных сывороток (10 сывороток здоровых доноров и 6 сывороток больных сифилисом). Донорские сыворотки крови были отрицательными при исследовании в РНИФ с корпускулярным антигеном B.burgdorferi Ip21.

По результатам испытаний экспериментальной серии ИФА тест-системы для определения суммарных антител к возбудителю ИКБ чувствительность составила 76,1% , а специфичность 57,2%. Некоторое снижение показателя специфичности по сравнению с вариантами ИФА, в которых используется каждый из этих антигенов в отдельности, объясняется суммированием неспецифических реакций. В то же время, специфичность реагирования с сыворотками крови от доноров составляет 87%, что позволяет говорить об удовлетворительных диагностических показателях тест-системы. '

С помощью разработанной ИФА тест-системы исследовано 132 сыворотки людей, пострадавших от укусов клеща в сезон 2002-2003 гг. на территории Новосибирской области и выявлены 63 положительных сывороток.

Результаты ИФА с использованием рекомбинантных антигенов OspC и Fla были сравнимы с исследованиями данных сывороток с помощью НРИФ. Всего нами исследовано 46 сывороток больных ИКБ: 32- в остром периоде; 14- в подостром периоде болезни. Сыворотки 10 больных, взятые в остром периоде с 1-го по 14-й день заболевания оказались отрицательными как в ИФА, так и в НРИФ. При обследовании 22 сывороток взятых от больных на 15-30 день от начала заболевания положительные результаты выявлены в ИФА в 17 сыворотке (77,2%), а в н-РИФ -15 сыворотке (68,2 % ). Из сывороток крови, полученных от больных с подострой формой заболевания в ИФА положительных сывороток 10 (71,4%) и 8 - (57,1%) в НРИФ. Сопоставление результатов исследования сывороток крови от больных ИКБ методом ИФА и НРИФ выявило совпадение положительных находок в 71,7% случаев. В 28,2% случаев (4 сывороток) образцы от больных ИКБ были позитивны только в ИФА.

Таким образом установлено, что ИФА тест-система для определения суммарных антител к возбудителю ИКБ, основанная на двух антигенах (OspC и Ra), обладает удовлетворительными показателями чувствительности и специфичности при диагностике ИКБ. Для повышения чувствительности и специфичности тест-системы необходимо использовать комбинации из большего числа антигенов возбудителя ИКБ.

Получение рекомбинантных штаммов E.coli, продуцирующих стафилококковый а-токсин.

Большинство патогенных штаммов золотистого стафиллококка продуцируют о-токсин (CAT), который считается основным фактором патогенности этого микроорганизма.

Получение мутантной формы CAT, не обладающей летальной активностью, является в то же время и важной прикладной задачей, поскольку мутантный белок может быть использован для создания эффективной противостафилококковой вакцины. Первые положительные результаты в этом направлении уже получены (Menzies, Kernodle, 1996).

В данном разделе работы мы планировали получение рекомбинантного штамма E.coli с высокой продукцией CAT для обеспечения дальнейших исследований, направленных на получение и анализ мутантных форм токсина и локализации функционально-значимых участков этого белка, а также для возможного получения в перспективе иммунизирующего препарата для получения лечебной гипериммунной сыворотки.

Первым шагом в этом направлении было конструирование плазмидного вектора, обеспечивающего эффективную индуцируемую экспрессию клонированных генов, с получением полипептидов в форме, удобной для последующей очистки. Анализ экспрессии структурной области генов а-токсина в клетках E.coli. Для

клонирования и экспрессии структурной области гена CAT была сконструирована векторная молекула pREB. pREB является вектором кассетного типа, обеспечивающим индуцируемую экспрессию клонипрованных в нем генов и сконструирован на основе ранее полученной плазмиды pR85, предназначенной для экспрессии чужеродных генов под контролем регуляторной области гена recA Proteus mirabilis. Вектор позволяет осуществлять встройку структурной области генов по сайтам рестрикции EcoR1 и ВатН\ или BsO. По

сайтам Есо R1 и Eco 52 1 возможна встройка нуклеотидных последовательностей, кодирующих сигнальные пептиды различных белков-предшественников, процессируемых с участием пептидазы первого типа.

Структурные области гена CAT, кодирующие как зрелый, так и незрелый токсин были амплифицированы методом ПЦР с использованием термостабильной ДНК полимеразы Tet-Z. Выбор олигонуклеотидов-праймеров проводили с помощью программы OLIGO (версия 3.3). Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных для амплификации структурной области гена hla S.aureus, приведены ниже: PR22F: 5- GGAATTCATGAAAACACGTATAGTC-31 PR23R: 51 AGGATCCTTAATTTGTCATTTCTTCTT З1 PR31R: 5' AGGTCACCATTTGTCATTTCTTCTTTTTTTTC З1

Праймер PR22F (прямой) и обратные праймеры PR23R и PR31R предназначены для амплификации и последующей встройки структурной области гена hla S.aureus в экспрессирующий вектор pREB-6His по сайтам EcoRI (PR22F) и BamHI (PR23R) или BstEII (PR31R). В случае применения праймера PR31R обеспечивалась состыковка гена с нуклеотидной последовательностью вектора, кодирующей 6-ти гистидиновую АК-последовательность в С-концевой области экспрессируемого белка. Аналогичным способом был получен ампликон нуклеотидной последовательности , кодирующей сигнальный пептид нуклеазы Serratia marcescens. Ампликоны были клонированы в плазмиде pREB . правильность встройки проверяли рестрикционным анализом и секвенированием по методу Максама- Гилберта.

Рекомбинантными плазмидами трансформировали клетки Е. coli шт. (CSH36 , С600 , BL 21, SG20050). Клоны отбирали на селективных агаризованных средах, содержащих 5% эритроцитов кролика. Выросшие колонии многократно пересевали. Установлено, что рекомбинантные плазмиды стабильно поддерживаются при пересевах колоний. В связи с тем, что при выращивании колоний наблюдались выраженные зоны лизиса эритроцитов, возможно было полагать, что продуцируемый ими CAT секретируется во внеклеточную среду. Была исследована локализация рекомбинантного белка в клеточных фракциях. Наблюдался эффективный синтез CAT, который обнаруживался сначала в периплазме, а затем уже в культуральной жидкости и цитоплазме (рис.58).

Рис. 16. Динамика накопления рекомбинантного CAT в субклеточны, фракциях и в культуральной жидкост1

ж *г

Секреция CAT в периплазму и культуральную среду свидетельствует о правильности процессинга белка-предшественника. Следует заметить, что процессинг рекомбинантного предшествнника CAT, состоящего из сигнальной последовательности нукпеазы Serratia marcescens и последовательности зрелого CAT, по-видимому, несколько отличается от такового у природного CAT, либо вообще не происходит. Такое заключение можно сделать во-первых, на основании отсутствия гемолитической активности у этого гибридного белка, во-вторых, гибридный CAT имеет больший молекулярный вес (рис. 59).

Рис. 59. Электрофореграмма белков лизатов клонов №6 (S-SAT) UNS 9 (SA) Еcoli BL21. содержащих в составе рекоибинантной плазмиды pREB-SH структурную область зрелого CAT, состыкованную с ливером нукпеазы Seratia marcescense (клон №б) или полную структурную область гена предшественника CAT (клон №9).

Следует отметить и тот факт, что рекомбинантные токсины как содержащие 6-ти гистидиновую аминокислотную последовательность на С-конце молекулы, так и несодержащие обладали приблизительно сходной гемолитической активностью. Наличие 6-ти гистидиновой последовательности на С-конце было подтверждено с помощью афинной хромотографии на Ni-NTA сорбенте. Уровень синтеза рекомбинантного CAT составлял 15-20мг на 1 литр культуры.

Особый интерес, представляет гибридный рекомбинантный CAT, содержащий чужеродную«сигнальную последовательность. Поскольку этот полипептид не обладает цитолитической активностью он, вероятно, мог бы быть использован в качестве иммунизирующего препарата для получения лечебной гипериммунной сыворотки.

В дальнейшем экспрессирующий вектор pREB был использован нами для получения рекомбинантных антигенов.

Конструирование серии векторов для экспрессии в клетках E.coli. В векторной молекуле pREB терминатор транскрипции был удалён на 565 п.о. от терминатора трансляции, в результате чего происходил синтез более длинных транскриптов с с клонируемого целевого гена. Кроме того, сайт связывания рибосом находился на не оптимальном расстоянии от инициирующего ATG кодона. В связи с этим мы попытались получить производные вектора pREB, которые бы обеспечивали более высокой уровень экспрессии клонируемых в них генов. Планировалось последовательно выполнить следующие этапы:

1) клонировать и экспрессировать в векторе pREB структурную область мутантного гена зелёного флуоресцентного белка GFP; при дальнейших манипуляциях с плазмидным вектором по уровню экспрессии гена GFP можно было бы судить о результатах реконструкции.

2) увеличить расстояние между SD-сайтом и ATG кодоном до оптимального

3) поменять SD-участок регуляторной области гена гесА на SD-область сильного искусственного промотора Ptaq, дополнив конструкцию энхансером трансляции TIR из экспрессирующего вектора pGreenTIR.

Все эти этапы нами были выполнены и был получен новый экпрессирующий вектор pRAC, который обеспечил трёх-кратное увеличение синтеза GFP, по сравнению с исходным вектором pREB (рис. 60). Предполагается использовать этот вектор в дальнейшей работе для экспрессии целевых антигенов.

Рис. 60. Динамика накопления GFP в клетках E.coli, трансформированных различными экспрессирующими векторными конструкциями. Е.Ф. - единицы флюорисценции. 15(-)~ контрольная культура pREB-GFP-F1-DHFR'TO-BHis;

15(+) - индуцированная культура pREB-GFP-Fb DHFR-T0-6His;

68(-) -контрольнаякультура pREB-GFP-F2-DHFR-T0-6His;

68(+) - индуцированная культура pREB-GFP-F2-DHFR-T0-6His;

1(-) - контрольная культура pREB-GFP-F2-T0-6His;

1(+) - индуцированная культура pREB-GFP-F2-T0-6His;

2(-) - контрольная культура pRAC; 2(+) - индуцированная культура pRAC.

Таким образом, в процессе выполнения этих работ были получены следующие

результаты:

1. Сконструирована серия векторов кассетного типа, обеспечивающих индуцируемую

экспрессию клонированных в них генов.

2. Получено штаммы Е. coli, эффективно продуцирующие два рекомбинантных варианта

стафилококкового альфа-токсина в форме, удобной для быстрой очистки.

Выводы

2. Установлены первичные структуры З'-концевой области генома вируса энцефаломиокардита мышей, полноразмерных ДНК-копий мРНК проопиомеланокортина человека, быка и крысы, а также фрагментов генома трёх штаммов вируса гриппа. Гемагглютинин одного из штаммов (А/Алма-Ата/1417/84) имеет 96,12% гомологии с гемагглютинином возбудителя пандемии гриппа 1918-1919.

3. Ген, кодирующий сердцевинный белок вириона р11 локализован на стыке HindiU Е- и F-фрагментов геномной ДНК вируса осповакцины.

4. Стафипококковый энтеротоксин А в диапазоне концентраций от 100 пг/мл до 100 нг/мл индуцирует продукцию ИЛ-1 моноцитами человека в условиях in vitro. Энтеротоксин обладает способностью связываться с IgG и IgM кролика и других животных в области Fc-фрагмента.

5. Слюнные железы больных вирусным гепатитом В, как в начале желтушного периода, так и в стадии реконвалесценции, могут служить местом персистенции вируса, а сами больные могут являться потенциальными источниками естественной передачи инфекции для контактирующих с ними лиц.

6. Спирохеты комплекса Borrelia burgdorferi s.l., циркулирующие в популяциях иксодовых клещей Ixodes persulcatus, распространенных на территории Сибири, представлены только двумя геновидами: Borrelia garinii и Borrelia afzelii,- и составляют отдельную группу, родственную изолятам боррелий, выделенных в Японии и Корее. Заражённость взрослых клещей колеблется в пределах 10-40% в зависимости от года наблюдения и ареала распространения.

7. Разработанный способ разделения белков оболочки и сердцевины вируса гриппа, а также щадящий метод разделения гемагглютинина и нейраминидазы позволяет получать индивидуальные высокоочищенные нативные белки вириона и их комплексы.

8. Способ получения моноспецифических антисывороток, включающий в себя как модифицированный метод препаративного электрофореза белков, так и особую схему иммунизации животных является универсальным и пригодным для любых исследуемых белков.

9. Белки оболочки вириона ВОВ р12, р19, р20, р35 и р42 являются ранне-поздними, поскольку их синтез в инфицированных клетках наблюдается в условиях ингибирования репликации вирусной ДНК.

10. Образец комбинированной молекулярной вакцины против двух серотипов вируса гриппа (Н1Ы1 и Н3Ы2), обладает выраженной протективной активностью. После проведения полных доклинических и клинических испытаний он может быть использован для иммунопрофилактики гриппа.

11. Прототип противооспенной вакцины, сконструированной на основе белков оболочки вириона осповакцины, по данным доклинических испытаний может быть использован в качестве превакцины.

12. Разработанные методы выявления геномных нуклеиновых кислот возбудителей туберкулёза, гепатитов В, С и иксодового клещевого боррелиоза, характеризуются высокой чувствительностью, специфичностью и простотой исполнения.

13. Способ иммуноферментного выявления в крови пациентов антител к двум антигенам (ОврО и ПаВ) Borreita gannii N1 29 позволяет диагностировать начальные стадии заболевания иксодовым клещевым боррелиозом.

14. Метод выделения ДНК микобактерий с использованием хлороформной экстракции, является быстрым, простым в исполнении и обеспечивает наибольший выход ДНК, пригодной для анализа методом ПЦР. Метод может быть использован в эпидемиологических исследованиях и в ДНК-диагностике туберкулёза. -'*

Список ОСНОВНЫХ публикаций по теме диссертации:

1. Беклемишев А.Б., Н.Г. Филимонов. Полипептидный синтез на рибосомах эмбрионов пшеницы, направляемый глобиновой м-РНК ретикулоцитов кролика.// Известия АН КазССР, 1974.Ж.0.60-62 .' ' 'л

2. Головин С.Я., А.Б. Беклемишев, Н.ГШертвецов, И.Л.Кофман, ЮАПанков. Выделение'и • идентификация матричной РНК, кодирующей полипептид-предшественник р-липотропного и кортикотропного гормонов. Синтез комплементарной ДНК.// ДАН СССР, 1981, т. 261, N4, с.1009-1012.

3. Петров НА, В.Е.Чижиков, В.М.Блинов, В.А. Каргинов, Н Н. Микрюков, В.В. Гуторов, М.П. Гришаев, А. Б. Беклемишев, С.К. Василенко. Нуклеотидная последовательность З'-концевой области РНК вируса энцефаломиокардитаУ/ Биоорган, химия, 1984, т.10, N2, с.274-279

4. Блинова Н.Н., И.В. Фролов, А.Б. Беклемишев, Н.П. Мертвецов. Изменение содержания кодирующей тирозинаминотрансферазу матричной РНК в печени крыс при индукции гидрокортизономУ/ Биохимия 1984, Т. 49, № 3, с. 470-478.

5. Якубов ЛА, И.М. Савич, А.Б. Беклемишев. Очистка нейраминидазы вируса гриппа на иммуносорбентеУ/ Биохимия 1984. т.49, N10, с. 1588-1593

6. Беклемишев А.Б., В.М. Блинов, С.К. Василенко, С.Я. Головин, В.В. Гуторов, ВА Каргинов, Л.В. Мамаев, Н.Н. Микрюков, С.В. Нетёсов, ВА Петренко, НА Петров, Л.С. Сандахчиев. Синтез полноразмерной ДНК-копии гена гемагглютинина вируса гриппа А Н11\11-подтипа, ее клонирование и определение первичной структуры.// Биоорган. химия, 1984, т.10, N11, с. 15351543

7. Беклемишев А.Б., В.М. Блинов, С.К. Василенко, С.Я. Головин, ВА Каргинов, Л.В. Мамаев, Н.Н. Микрюков, С.В. Нетёсов, В.А. Петренко, НА Петров, И.В. Фролов. Синтез, клонирование и определение первичной структуры полноразмерной ДНК-копии гена нейраминидазы вируса гриппа А подтипа Н1Ж7/ Биоорган, химия, 1985, т.11, N5, с.628-635

8 Беклемишев А Б, В М Блинов, С К. Василенко, С Я Головин, В А Каргинов, Л В Мамаев, Н Н Микрюков, С В Нетёсов, В А Петренко, Н А Петров, И В Фролов Синтез, клонирование и определение первичной структуры полноразмерной ДНК копии гена белка NP вируса гриппа АУ/ Биоорган химия, 1985, т 11, N5, с 636 640

9 Беклемишев А Б, В М Блинов, С К. Василенко, С Я Головин, В А Каргинов, Л В Мамаев, Н Н Микрюков, С В Нетёсов, ВЛ Петренко, Н А Петров, И В Фролов Синтез, клонирование и определение первичной структуры полноразмерной ДНК копии фрагмента 8 генома вируса гриппа АУ/Биоорган химия, 1985, т 11, N5, с 641-645

10 Головин С Я , Л В Мамаев, А. Б Беклемишев, ВЛ Каргинов, И В Фролов, А А. Колыхалов, В А. Петренко, Н П Мертвецов, И В Морозов, Г Ф Сиволобова, Ю А Панков Клонирование ДНК, комплементарной мРНК проопиомеланокортина (ПОМК) быка и определение ее первичной структуры Изв СО АН СССР, сер биол , 1985, N2, с 140-143

11 Беклемишев А Б, В М Блинов, С К. Василенко, С Я Головин, В А Каргинов, Л В Мамаев, С В Нетёсов, Н А. Петров, П Ф Сафронов Первичная структура полноразмерной ДНК-копии нейраминидазы вируса гриппа А/Киев/59/79(Н1 М).// Биоорган химия, 1985, т 11» N10, с 1423-1426

12 Беклемишев АБ, ВМ Блинов, С К Василенко, С Я Головин, В А Каргинов, Л В Мамаев, С В Нетёсов, Н А Петров, П Ф Сафронов, И В Фролов Первичная структура полноразмерной ДНК-копии гена гемагглютинина вируса гриппа А/Киев/79 (H1N1 )7/ Биоорган химия 1986, т12, N3, с 375-381

13 Беклемишев А.Б, В М Блинов, С К Василенко, С Я Головин, В А Каргинов, Л В Мамаев, С В Нетёсов, НА Петров, П Ф Сафронов Первичная структура полноразмерной ДНК-копии гена белка NP вируса гриппа А/Киев/59/79 (H1N1 )7/ Биоорган химия 1986, т12, N3, с 369374

14 Мертвецов Н П , С Я Головин, А Б Беклемишев, ВА Каргинов, Л В Мамаев Клонирование ДНК комплементарной мРНК проопиомеланокортина гипофиза быка, крысы и человека Гормональная регуляция содержания мРНК ПОМК в гипофизе крысы // Биохимия 1987, т 52, N5, с 707-714

15 Головин С Я , В А Каргинов, А А Бондарь, А Б Беклемишев, М К Чехранова, Н П Мертвецов, ЮА. Панков Синтез, клонирование и определение первичной структуры ДНК комплементарной мРНК проопиомеланокортина из гипофиза человека// Биоорган химия, 1987, т13, N4, с 562 564

16 Беклемишев А Б, С Я Головин, А А. Ильичев, Л В Мамаев, В Н Красных, В А Каргинов, Ю А. Панков, Н П Мертвецов Экспрессия в клетках Escherichia coll нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей липотропный гормон быка// Мол генетика, микробиол и вирусол , 1987, N10, с 19-23

17 Мертвецов Н П , А Б Беклемишев, И М Савич Современные подходы к конструированию молекулярных вакцину/Изд'Наука" Сибирское отд. Новосибирск, 1987 208 с

18 Ямщикова ГВ, МА Урманова, ЕГ Балзовская, ЕЙ Рябчикова, А Б Беклемишев, В Я Тихонов Исследование белок-синтезирующего аппарата культуры клеток ВНК-21 клон 13 и ее крупноклеточного клона С-9У/ Цитология, 1989, т 31, N6, С 685-689

19 Дедкова Л М , И М Савич, А Б Беклемишев Методы выделения и очистки нейраминидазы из вирионов гриппа// В кн "Методы мол биологии, биохимии и биотехнологии растений". Алма-Ата, 1988, с 103-108

20 Исин Ж М , Т И Тугамбаев, Р Т Тлеулиева, Н Н Беляев, Н Г Филимонов, А Б Беклемишев Интерлейкин-1-индуцирущая активность полисахаридсодержащих антигенов клеточной стенки Yersima pestis // Ж микробиол , 1989, N11, с 71 -75

21 Петров Н А, С В Нетесов, С Я Головин и др Рекомбинантная плазмидная ДНК pBRI NS/3 -молекулярный зонд для индикации гена NS вируса гриппа А // Авт свидетельство SU №1793734 от 8 10 92

22 Петров Н А, С В Нетесов, С Я Головин и др Рекомбинантная плазмидная ДНК pBRI-M/4 -молекулярный зонд для индикации гена М вируса гриппа АУ/ Авт. свидетельство SU №1793733 от 8 10 92

23 Петров Н А, С В Нетесов, С Я Головин и др Рекомбинантная плазмидная ДНК pBRI-NA/5 • молекулярный зонд для индикации гена NA вируса H1N1, HoN17/ Авт Свидетельство SU №

1793735 от 8 10 92

24 Петров Н А , С В Нетесов, С Я Головин и др Рекомбинантная плазмидная ДНК pBRI РА/8 -молекулярный зонд для индикации гена РА вируса гриппа АУ/ Авт свидетельство SU №1793737 от 8 10 92

25 Петров Н А, С В Нетесов, С Я Головин и др Рекомбинантная плазмидная ДНК pBRI-PB2/9 -молекулярный зонд для индикации гена РВ2 вируса гриппа А// Авт свидетельство SU №

1793736 от 8 10 92

26. Петров НА, СВ. Нетесов, С.Я. Головин и др. Рекомбинантная плазмидная ДНК pBRI-PB1/1G-молекулярный зонд для индикации гена РВ1 вируса гриппа А.// Авт. свидетельство SU № 1793738 от З.Ю.92 ' '

27. Mуравлев А И., НА Чикаев, Н.А. Нетесова и др. Выделение специфической мРНК с помощью антисыворотки к белку рЗ0 оболочки вируса осповакцины и картирование гена белка рЗб.// Биополимеры и клетка, 199G, т.6, N6, с.83-89.

2B. Беклемишев А Б., Ярмолинская E.В., Н.Г. Филимонов,' НА. Mартакова. Способ иммобилизации ДНК на полистирольных планшетах.// Авт. свидетельство SU №1679770 от 22^0.91

29. Беляев Н Н., ЛА Хегай, Г.К. Закирьянова, Р.Т. Тлеулиева, А.Б. Беклемишев. Стафилококковый энтеротоксин А связывается с IgG в области Fc-фрагмента // Иммунология,

30. Беляев Н.Н., Г.К. Закирьянова, Г.О. Костин, Р.Т. Тлеулиева, А.О. Агашкин, Д.Г. Навасардянц, Ю В. Eзепчук, А.Б. Беклемишев. Получение моноклональных антител к стафилококковому альфа-токсину при использовании техники иммунизации in vitro.// Бюлл. экспер. биол. мед. 19916, Т.112, №7,с.7З-76.

31. Тлеулиева Р.Т., Н.Н. Беляев, Г К. Закирьянова, M^. Бейлбаева, А.Б. Беклемишев. Получение и свойства моноклональных антител к стафилококковому энтеротоксину АУ/ Известия АН КазССР,1991 ,Ж,с.З6-41.

32. Беклемишев А.Б, Л M. Назарова, Н.Г. Филимонов, В.M. Блинов, АА Гринёв, З.К Чувакова, EB. Ким, Г.Н. Mукажанова. Синтез, клонирование и определение первичной структуры полноразмерной ДНК-копии гена гемагглютинина вируса гриппа А/Алма-Ата/Ш?^ (H1N1 -серовариант Hsw1 N1)7/ Mол. генетика, микробиол. и вирусол., 199З, N1, с.24-27. ;

33. Чувакова З.К, А.Б. Беклемишев, Л M. Назарова, Н.Г. Филимонов, В M. Блинов, АА Гринёв, EB. Ким, Г.Н. Mукажанова. Анализ аминокислотной последовательности тяжелой субъединицы гемагглютинина вируса гриппа А/Алма-Ата/Ш?^// Вопросы вирусол. 1994. N1. с 30-34.

З4 Mуравлёв А.И., А.П. Агафонов, С.С. Решетников, И А. Лавриненко, И О. Чешенко, А Б. Беклемишев. Протективная активность белков оболочки вируса осповакцины, выделенных с использованием неионных детергентов.// Вопросы вирусол. 199Ö, N4, с 1Ö4-1ÖB.

З0. Беклемишев А Б, Н П. Пичко, А.Ю. Карягин. Способ получения натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенилового эфира биотина.//Патент РФ, № 2Ю2З96 от 2G.G1.199B г.

36. Беклемишев А.Б., E.M. Хорошева. Дифференциальное выявление возбудителей туберкулеза в клиническом материале с использованием двухстадийной полимеразной цепной реакции. Бюл. Сиб. отд-ния РAMН. 199B, №З, с.76^4

37. Лукашев В А, А.Б Беклемишев. Возможные механизмы патогенного воздействия стафилококкового альфа-токсина на организм человека// Бюл.Сиб.отд-ния РAMН. 199B, №З, с.70-76

38. Палецкая Т.Ф., И В. Тимофеев, Н.Г. Перминова, А В. Beklemishev. Роль герпес-вирусной инфекции 6-го и 7-го типа у больных рассеянным склерозом.// Бюл.Сиб.отд-ния РAMН. 199B, №З, с.89-94

39. Zhevachevsky N.G., N.Yu. Nomokonova, A.B. Beklemishev, G.F. Belov. Dynamic study of HBsAg and HBeAg in saliva samples from patients with HBV infection: diagnostics and epidemiological significance.// J. Med. Virology, 2GGG, V.61. N4, P. 433-438.

4G. Беклемишев А.Б., E.M. Хорошева, Н Ю. Номоконова, А.Н. Шкунов, А П. Огиренко. Выявление микобактерий туберкулезного комплекса методом полимеразной цепной реакции с одновременной идентификацией вида M.tuberculosisT/ Клиническая лабораторная диагностика, 2GG1, №7, С.50-54

41. Беклемишев А Б. E.M. Хорошева, Н.Ю. Номоконова. Способ обнаружения ДНК микобактерий туберкулёзного комплекса с дифференциальным выявлением ДНК Mycobactenum tuberculosis и набор реагентов для его осуществления.// Патент РФ, № 21B3B38 BI от 27 G2.2GG1 г.

42. Иванов ИД., А.Б. Беклемишев. Клонирование и анализ экспрессии фрагмента гена fla b новосибирского изолята Borrelia gannn NT29 в клетках E.coli и исследование антигенных свойств рекомбинантного белка // Бюл. Сиб. отд-ния РAMН. 2GG2, №1, С. 97-Ю2.

43. Лавриненко И.А., Н.П. Пичко, А.Б. Беклемишев , А.П. Дунтау, E3- Mедведева. Ген mtp4G как мишень для дифференциальной детекции изолятоа возбудителей туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью методом полимеразной цепной реакции.// Бюл.Сиб отд-ния РAMН. 2003. №2, С.84-89

44. Morozova G.V., Dobrotvorsky А К., Livanova N.N, Tkachev S E., Bakhvalova V.N., Beklemishev A.B, Cabello F.C. PCR Detection of Borrelia burgdorferi sensu lato, tick-borne encephalitis virus and human granulocytic erlichiosis agent in Ixodes persulcatus ticks from Western Siberia, Russia // J. Clm. Microbiol. 2GG2, V.4G, N1G. P. 3802-3804

45 Livanova, N N , О V Morozova, IV Morozov, А В Beklemishev, F Cabeflo, А К Dobrotvorsky Characterization of Borrelia burgdorfen sensu lato from Novosibirsk Region (West Siberia, Russia) Based on Direct PCRV/ Europ J Epidemiol, 2003, Vol 18, № 12 - P 1155-1158

46 Beklemishev А В , А К Dobrotvorsky, A V Pitenna.1 D Ivanov, N Yu Nomokonova, N N Livanova Detection and typing of Borrelia burgdorfen sensu lato genospecies in Ixodes persulcatus ticks in West Siberia, Russia.// FEMS Microbiol Lett 2003 У227, N 2, - P 157-161.

47 Беклемишев А Б, Иванов \ЛД Рекомбинантная плазмидная ДНК, обеспечивающая синтез иммунодоминантного белка Borrelia garmii NT29, используемого для диагностики Лайм-боррелиоза (варианты)// Приоритетная справка на изобретение Номер заявки 2003131242, дата приоритета от 23 октября 2003 г

Тезисы докладов

1 Азимуратова Р Ж, А Б Беклемишев, М 3 Турарбеков Сравнение структурной целостности и функциональной активности полирибосом пшеницы, выделенной различными методами7/Тезисы докладов II Конференции биохимиков республик Ср Азии и Казахстана, Фрунзе, 1976, с 12-13

2 Беклемишев А Б, М А Шманов Трансляция запасных и новосинтезированных мРНК на ранних этапах прорастания зародышей пшеницы.// Тезисы докладов II Всесоюзного симпозиума "Структура и функции нуклеиновых кислот и биосинтез белка в растениях", Ташкент, 11-13 октября 1977, с 8-9

3 Беклемишев А Б, А Г Блинов, Н П Мертвецов Экспрессия ДНК бактериофагов и плазмид в бесклеточной системах транскрипции трансляции II Тезисы докладов VI рабочего совещания «Внехромосомные генетические элементы значение для науки и практики» по программе "Плазмида", Москва, 1981, с 27-28

4 Мертвецов Н П , Н Н Блинова, А Б Беклемишев, С Я Головин, Н А Ильдуганова, Р И Салганик Влияние кортизола на процессы транскрипции и трансляции в клетках печени крыс.// Тезисы докладов IV съезда Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им Вавилова Кишинев, 1981. ч 1, с 162-163

5 Мертвецов Н П , Н Н Блинова, И В Фролов А Б Беклемишев Влияние гидрокортизона на синтез специфической кодирующей тирозинаминотрансферазу мРНК в печени крыс Тезисы докладов 16 ой конференции ФЕБО, Москва, 1984, С 425, ХХ-064

6 Беклемишев А Б , Головин С Я , Мамаев Л В , Фролов И В , Нетесов С В , Савич И М Герасимова Л М, Стефанович Л Е, Мертвецов Н П Смолина М П Подходы к конструированию молекулярных вакцин против вируса гриппа.// Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии", Пущино, 22—24 октября 1984, с 55

7 Мертвецов Н П, С Я Головин, Л В Мамаев. А. Б Беклемишев, В А Каргинов, Г Ф Сиволобова, Ю А Панков Клонирование ДНК, комплементарной мРНК проопиомеланокортина гипофиза быка Гормональная регуляция содержания мРНК ПОМК в гипофизе крысы// Тезисы докладов Международного симпозиума "Химия и биохимия пептидно белковых гормонов", Суздаль, 1985

8 Belyaev N N , R T Tleulieva, L A Khegai, G К Zakiryanova, А В Beklemishev IgG binding in Fc-fragment region with staphyiococcal enterotoxin A (SEA) together with the identification of binding site by monoclonal antibodies to SEAV/ Abstracts of Republ Sci conference "Modern problems of physico-chemical biology and biotechnology", sept 21 -23,1989, Alma Ata - p 100

9 Filimonov N G , N A Martakova, N N Belyaev, R T Tleulieva, E V Yarmolmskaya, A V Ananjm, А В Beklemishev Cloning of DNA, complementary to mRNA of human interleukm 1, and constraction of molecular probes on their basis.// Abstracts of Republ Sci conference "Modern problems of physico-chemical biology and biotechnology", sept 21-23,1989, Alma-Ata - p 65

10 Muravlev A J , N A Netesova, G G Prikhodyoko, О I Ryazankma, А В Beklemishev, EG Malyigm Localization of the gene coding for p11 protein from the vaccinia virus core// Abstracts of Republ Sci conference "Modern problems of physico-chemical biology and biotechnology", sept 21 -23,1989, Alma Ata-p 45

11 Беляев H H , P T Тлеулиева, Л.А Хегай, Г К Закирьянова, А Б Беклемишев Связывание стафилококкового энтеротоксина А с Fc фрагментом иммуноглобулина G // Тезисы докладов II Всесоюзной Конференции "Бактериальные токсины', 27-30 ноября 1989, г Юрмала с 13

12 Тлеулиева Р Т, Н Н Беляев, Г К Закирьянова, М Л Бейлбаева, А Б Беклемишев Получение и свойства моноклональ-ных антител к стафилококковому энтеротоксину А (СЭА) // Тезисы докладов II Всесоюзной Конференции "Бактериальные токсины", 27-30 ноября 1989, г Юрмала-с 134

13. Беклемишев А.Б., Г.О.Костин, Е.ПДельвер, Е.В.Ярмолинская, Н.Г.Филимонов. Определение первичной структуры гена стафилококкового альфа-токсина //Тезисы докладов II Всесоюзной Конференции "Бактериальные токсины", 27-30 ноября 1989, г.Юрмала с.11

14. Назарова Л.М., А.Б.Беклемишев, Н.Г. Филимонов, А О. Агашкин, Е В. Ярмолинская. Индикация вирусов гепатита А и Б с использованием методов молекулярной гибридизации и амплификации ДНКУ/ Тезисы докладов II Всесоюзного симпозиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", г.Самарканд, 1991.

15. Беклемишев А.Б., Л.М Назарова, Н.Г.Филимонов, В.М.Блинов, АА Гринев, З.К. Чувакова, Е В. Ким, Г.Н. Мукажанова. Полная нуклеотидная последователь-ность гена гемагглютинина вируса гриппа А/Алма-АтаЛ417/84(Н1 М1)-серовариант Hsw1N1.// Тезисы докладов II Всесоюзного симпозиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", г.Самарканд, 1991, с. 105

16. Беляев Н Н., Г.К.Закирьянова, Р.Т.Тлеулиева, Г.О.Костин, А.О. Агашкин, ДГ. Навасардянц, Ю.В. Езепчук, А.Б. Беклемишев. Использование метода иммунизации In vitro для получения гибридом, секретирующих моноклональные антитела к стафилококковому альфа-токсину.// Тезисы докладов V Конференции биохимиков республик Ср.Азии и Казахстана, г.Ташкент, 1991.С.356

17. Belyaev N.. G. Zakiryaniva, A. Beklemishev. Histamme-induced contra-supression In bone marrowy/ Abstracts of World Congress on Cell and Tissue Culture. 20-25 June, 1992, Wastmgton.'ln vitro cellular and developmental biology, part II, March, 1992."

18. Иванов ИД., Т.П.Камынина, Л Б Логвиненко, В.И.Офицеров, А.Б.Беклемишев. Экспрессия гена, кодирующего иммунодоминантный белок В burgdorfen в клетках E.coh.// Тезисы докладов Второго съезда биохимического общества РАН, 19-23 мая 1997 г., Пущино. С.498

19. Камынина Т.П., А.Б Беклемишев. Секреция рекомбинантного белка альфа-токсина S aureus в культуральную среду из клеток Ecolii/ Тезисы докладов Второго съезда биохимического общества РАН, 19-23 мая 1997 г., Пущино. С. 502

20. Беклемишев А.Б., Е.М.Хорошева, Н Ю Номоконова. Разработка и клинические испытания тест-системы для дифференциаль-ного полуколичественного определе-ния патогенных микобактерий в клинических образцах методом полимеразной цепной реакции.// Научная конференция "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" 10-11 апреля 1998 г, Новосибирск. Тезисы докладов, с. 170-171

21. Номоконова НЮ., В А Рихтер, Н.ПЖевачевский А.Б Беклемишев. Быстрый высокочувствительный способ детекции вируса гепатита С в сыворотке крови. Научная конференция "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" 10-11 апреля 1998 г, Новосибирск. Тезисы докладов, с.171

22. Беклемишев А.Б., Н Ю.Номоконова , В АРихтер, Н.ГЖевачевский. Высокочувствительный, полуколичественный способ одновременного выявления геномов вирусов гепатита С (HCV) и В (HBV) в сыворотке крови.// Ill съезд Итало-Российского общества по инфекционным болезням. Научная конференция. «Инфекционные болезни: новое в диагностике и терапии». 3-7 июня, 1998 г. Санкт-Петербург. Тезисы докладов, с. 10

23. Иванов И.Д., А.В.Питерина, Н.П.Пичко, А.КДобротворский, А.Б Беклемишев. Эффективный способ определения зараженности клещей и животных спирохетами группы геномовидов Borrelia burgdorferi sensu latoi/ III съезд Итало-Российского общества по инфекционным болезням. Научная конференция. «Инфекционные болезни, новое в диагностике и терапии». 3-7 июня, 1998 г. Санкт-Петербург. Тезисы докладов, с. 35

24. Blinov V., A.Beklemishev, l.lvanov, Llvanov, J Dunn. The role of Ca2+ -binding domain of OspA proteins from different Borrelia burgdorfen sensu lato genomospeciesV/ IX International Congress of Bacteriology & Applied Microbiology, 16-20 august, 1999, Sydney, Australia. P.89

25. Beklemishev A., V.BIinov, l.lvanov, A.Pitenna, N.Nomokonova, Llvanov, J.Kieleczawa, J.Dunn. Molecular and genetic studing of Siberian and Far Easten isolates of Borrelia burgdorferi sensu lato for elaboration of Lyme-borreliosis diagnostic testy/ Advanced research workshop "Assessment of sponsored biological research in Russia for the new millennium", September 2-4,1999, Novosibirsk, Russia.

26. Khorosheva E M., A.B. Beklemishev. Differential detection of tuberculosis agent by multiplex PCR // Abstracts of II International Conference * New Information Tecnology in Medicine and Ecology". June 1-9,2000, Gurzuf. Ukrama,. P. 108-109

27. Klotchkova E.G., A.B. Beklemishev, E.M. Khorosheva, N.Yu. Nomokonova, I.A. Lavrmenko, N P. Pichko, A.P. Dountau. Elaboration of two complementary highly specific methods for diagnosis of tuberculosisJ/ Abstracts of 97th International Conference "ATS 2001".- May 18-23, San Francisco, USA, 2001. In: Am. J. Resp. Cnt. Care Med 2001, V. 163. N. 5. P. A 670

28. Beklemishev, A.B., I.D. Ivanov, V.S. Karavaev. Elaboration of recombmant proteins-based assays for serodiagnosis of Lyme disease.// Abstracts of VI RFBR (Basic Research results open for investments) International Conference. Pushmo, Russia, 2001.-P.7-8

29. Beklemishev A.B., А К. Dobrotvorsky, N.N. Livanova, I.D. Ivanov, A.V. Piterma, LI. Ivanov. Different genospecies of Borrelia burgdorferi sensu lato dominate in Ixodes persulcatus ticks in West Siberia 'and Far East, Russia.// Abstracts of Vlth International Potsdam Symposium on Tick-borne Diseases. Berlin (Germany), April, 26-27th, 2001. N16.

30. Ivanov I D., V.S Karavaev, A B. Beklemishev. Elaboration of ELISA-based test for Lyme disease.// Abstracts of Vlth International Potsdam Symposium on Тюк-borne Diseases. Berlin (Germany),

- April, 26-27th, 2001.

31. Ливанова Н.Н., А К. Добротворский, ИД. Иванов, А В. Питерина, А Б. Беклемишев. Об уровне зараженности таежного клеща Ixodes persulcatus Schulze спирохетами Borrelia burgdorferi sensu lato на юге Западной Сибири// Межрегиональная научно-практическая конференция «Актуальные аспекты природнооча-говых болезней». Омск, 16-17 октября 2001 г. Тезисы докладов, С. 107-108

32. Добротворский А К., Бахвалова В.Н., Ливанова Н.Н., Ткачев С.Е., Матвеева В.А., Матвеев Л.Э., Беклемишев А Б., Морозова О.В. Характеристика возбудителей клещевых боррелиозов и клещевого энцефалита Западной Сибири// Клещевые боррелиозы. Мат. науч.-практ. конф.-Ижевск, 2002.-С. 126-129

33. Беклемишев А Б., СВ. Чересиз, ИА Лавриненко, И.Н. Ивлева. Разработка биосенсорной тест-системы для оценки мутагенного воздействия ионизирующих излучений и химических соединений на генетический аппарат клетки// Международный конгресс «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека». Кара-Даг, Украина, 8-19 июня 2003 г.Тезисы докладов, С. 28-30.

34. Беклемишев А.Б., И.Д Иванов, B.C. Караваев. Разработка иммуноферментной тест-системы диагностики Лайм-боррелиоза на основе рекомбинантных антигенов Borrelia garmii NT29// Российско-Казахстанский международный семинар «Новые технологии XXI века в медицине». Караганда. 5-6 мая 2003 г. Тезисы докладов, С. 28-29.

35. Беклемишев А.Б., Е М. Хорошева, Н.Ю. Номоконова, И А. Лавриненко. Разработка и клинические испытания тест-системы для дифференциального полуколичественного определения ДНК возбудителей туберкулёза в клинических образцах методом полимеразной цепной реакции Российско-Казахстанский международный семинар «Новые технологии XXI века в медицине». Караганда, 5-6 мая 2003 г. Тезисы докладов, С. 29-30.

36. Тлеулиева Р.Т., Беклемишев А Б, Камынина Т.П, СидороваЮ.Н., Синенко С.А, Беляев Н.Н. Получение моноклональных антител к стафилококковому а-токсину (CAT), рекомбинантного CAT и разработка на их основе иммуноферментной тест-системы.// Медицинская иммунология. 2003, Т.5, № 3-4. С.323. Материалы II Всероссийской конференции «Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии»

Подписано к печати "17" июня 2004г. Тираж 100 экз. Заказ № 1291. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 356-600

113357

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Беклемишев, Анатолий Борисович

Введение

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные направления иммунопрофилактики инфекций.

1.2. Формирование новых направлений в иммунопрофилактике и диагностике инфекций в 70-х - 80-х годах

1.3. Современные направления в области вакцинологии

1.4. Молекулярные методы в диагностике инфекций

1.5. Структурные белки вируса осповакцины, локализация кодирующих их генов в вирусном геноме

1.5.1. Структурные белки вируса осповакцины.

1.5.2. Картирование генов в геноме вируса осповакцины.

1.6. Общая характеристика стафилококковых токсинов

1.7. Структура и биологические свойства стафилококкового энтеротоксина типа А (СЭА).

1.8. Использование моноклональных антител в изучении функционально значимых участков стафилококковых токсинов и создании диагностических тест-систем.

1.9. Биология и эпидемиология микобактерий туберкулезного комплекса.

1.10. Применение методов молекулярной биологии к эпидемиологии туберкулеза

1.11. Современные способы обнаружения микобактерий. Недостатки и преимущества.

1.12. Эпидемиология клещевого боррелиоза

1.13. Патогенез и клиника клещевого боррелиоза

1.14. Молекулярно-биологические характеристики спирохет В. burgdorferi sensu lato

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы, приборы, оборудование

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Приборы и оборудование

2.1.3. Ферменты

2.1.4. Использованные в работе штаммы микроорганизмов

2.1.5. Векторные ДНК и рекомбинантные плазмиды, содержащие клонированные фрагменты ДНК

2.1.6. Животные

2.1.7. Клеточные линии

2.1.8. Сыворотки и антигены

2.1.9. Питательные и конденционированные среды

2.1.10. Буферные среды и системы

2.2. Молекулярно-биологические методы исследования

2.2.1. Методы работы с РНК

2.2.2. Методы выделения препаратов ДНК

2.2.3. Анализ и очистка ДНК методами гель-электрофореза

2.2.4. Амплификация ДНК и РНК в системе ПЦР или ОТ-ПЦР

2.2.5. Секвенирование ДНК

2.2.6. Филогенетический анализ геномных последовательностей

2.3. Иммунохимические методы исследовании

2.3.1. Иммунизация животных

2.3.2. Определение концентрации иммуноглобулинов

2.3.3. Получение 1дв и 1дМ

2.3.4. Получение Яс-фрагментов кролика

2.3.5. Приготовление СПА - сорбента

2.3.6. Иммуноферментный анализ

2.3.7. Радиоиммунный анализ (РИА)

2.3.8. Иммунохимический анализ продуктов бесклеточной трансляции

2.3.9. Иммуноблоттинг

2.4. Методы гибридомной технологии т

2.4.1. Приготовление иммуногенных форм токсичных антигенов

2.4.2. Иммунизация мышей для получения гибридом

2.4.3. Гибридизация клеток и клонирование гибридом

2.4.4. Культивирование гибридом

2.4.5. Криоконсервация и размораживание клеток

2.4.6. Выделение моноклональных антител (МКА)

2.4.7. Мечение МКА

2.4.8. Определение изотипов тяжелых цепей МКА

2.4.9. Определение константы связывания МКА с антигеном

2.5. Генно-инженерные методы

2.5.1. Методы работы с бактериями

2.5.2. Ферментативная обработка препаратов ДНК

2.5.3. Введение радиоактивной метки в ДНК

2.5.4. Клонирование ДНК в составе бактериальных векторов

2.5.5. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е.соН

2.6. Методы работы с белками

2.6.1. Выделение рекомбинантных белков

2.6.2. Определение концентрации растворимого белка

2.6.3. Анализ белков методом электрофореза в ПААГ

2.7. Специальные методы анализа

2.7.1. Инфицирование культур клеток вирусами

2.7.2. Культивирование и очистка вируса осповакцины и эктромелии

2.7.3. Культивирование и очистка вируса гриппа

2.7.4. Культивирование МЛиЬегси^э на твердой питательной среде

2.7.5. Фракционирование вирионных белков ВОВ и ВЭМ

2.7.6. Препаративный электрофорез белков ВОВ

2.7.7. Дегликозилирование белков

2.7.8. Выделение моноцитов из крови человека и индукция синтеза интерлейкина

2.7.9. Биологическое тестирование интерлейкина

2.7.10. Контроль пролиферации спленоцитов

2.7.11. Приготовление комплекса СЭА-lgG

2.7.12. Обработка IgG лизоцимом

2.7.13. Обработка IgM Кон А

2.7.14. Сбор клещей Ixodes persulcatus

2.7.15. Культивирование спирохет В.burgdorferi sensu lato

2.7.16. Генотипирование спирохет B.burgdorferi s.l.

2.7.17. Оценка иммуногенности препаратов индивидуальных белков ВОВ и их комплексов

2.7.18. Испытания прототипов вакцины на животных

ГЛАВ А 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Создание молекулярно-биологической базы для исследований структурно-функциональной организации патогенных вирусов.

3.1.1. Метод бесклеточных белок-синтезирующих систем.

3.1.2. Метод синтеза кДНК в системе обратной транскрипции.

3.1.3. Выделение и анализ индивидуальных мРНК из клеток эукариот.

3.2. Исследование структурно-функциональной организации геномов вирусов гриппа и разработка прототипа противогриппозной молекулярной вакцины.

3.2.1. Получение образца субъединичной комбинированной противогриппозной вакцины. Анализ иммуногенной активности препарата.

3.2.2. Анализ первичной структуры гена гемагглютинина штамма А/Алма-Ата/1417/84.

3.3. Иммунохимическое изучение структурных белков вируса осповакцины и картирование генов белков р

3.3.1. Иммунохимическое изучение структурных белков вируса осповакцины

3.3.2. Картирование гена белка р11 сердцевины ВОВ

3.3.3 Выделение специфической мРНК, кодирующей белок р35 оболочки ВОВ и картирование гена белка р

3.4. Конструирование прототипа молекулярной противооспенной вакцины

3.4.1 Характеристика антигенных и протективных свойств комплексов белков вируса осповакцины.

3.4.2. Характеристика безвредности и реактогенности препаратов вакцины против оспы.

3.5. Изучение иммунологических свойств стафилококкового энтеротоксина А (СЭА)

3.6. Получение и анализ моноклональных антител (МКА) к стафилококковому энтеротоксину А (СЭА). Конструирование иммуноферментной тест-системы на основе МКА.

3.7. Получение моноклональных антител к стафилококковому альфа-токсину (CAT) методом иммунизации in vitro.

3.7.1 Свойства моноклональных антител к CAT

3.7.2. Разработка иммуноферментного метода определения CAT в крови больных с септическим процессом.

3.8. Разработка метода обнаружения вирусов гепатита В и С в биосубстратах методом ПЦР

3.8.1. Выбор праймеров и определение чувствительности метода анализа

3.8.2. Испытание разработанного метода детекции вирусов гепатита В и С на клинических образцах

3.9. Разработка способа дифференциального выявления геномных ДНК M.tuberculosis и M.bovis

3.9.1. Разработка метода дифференциальной детекции микобактерий туберкулёзного комплекса на основе двухраундовой ПЦР.

3.9.2. Разработка способа дифференциального выявления ДНК М.tuberculosis и М,bovis на основе многоцикловой однораундовой ПЦР.

3.9.3. Испытание разработанного способа выявления ДНК на клинических образцах, содержащих лекарственно-устойчивых возбудителей туберкулёза

3.10. Разработка иммуноферментного способа диагностики иксодового клещевого боррелиоза, основанного на рекомбинантных антигенах

3.10.1. Определение зараженности клещей, собранных на территории Сибири

3.10.2. Конструирование рекомбинантных штаммов E.coli, продуцирующих антигены OspC и фрагмент FlaB новосибирского изолята B.garinii NT

3.10.3. Разработка прототипов иммуноферментных тест-систем для диагностики начальных стадий Лайм-боррелиоза

3.10.4. Оптимизация наработки и выделения рекомбинантных антигенов из штаммов-продуцентов E.coli

3.11. Получение рекомбинантных штаммов E.coli, продуцирующих стафилококковый а-токсин

3.11.1. Анализ экспрессии структурной области генов а-токсина в клетках E.coli

3.11.2. Конструирование серии векторов для экспрессии в клетках E.coli

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование методов молекулярной биологии и генной инженерии для конструирования вакцинных и диагностических препаратов"

В настоящее время известно более тысячи видов вирусов - представителей более 20 семейств, патогенных для человека (Смородинцев, 1984). Не менее многочисленна группа болезнетворных микроорганизмов: патогенных и условнопатогенных бактерий, риккетсий, простейших паразитов, общее число которых достигает 3 тысяч. Благодаря широкому внедрению в вирусологические и микробиологические исследования современных методов молекулярной биологии и генетической инженерии в последние два десятилетия открыты новые возбудители инфекций: вирусы гепатита С (Marwick, 1984; Choo et al., 1989), ВИЧ (Broder, Gallo, 1984; Klatzm'ann et al., 1984; Montagnieret al., 1984; Ratner et al., 1985a), возбудитель болезни Лайма (Burgdorfer et al, 1982), вирус губчатой болезни коров и возбудитель вспыхнувшей в конце 2002 г. в КНР эпидемии тяжелой высококонтагиозной пневмонии (Ksiazek, et al., 2003 ).

Вполне понятно, что реализация этих подходов требует больших усилий исследователей различных специальностей: вирусологов, микробиологов, молекулярных биологов, генных инженеров, биотехнологов и химиков. Особую важность и значение эти исследования приобрели в последние 20 лет ввиду изменения эпидемической ситуации в мире. С одной стороны, наблюдается значительное снижение, либо стабилизация ряда особо опасных инфекций, а с другой - появление и распространение ранее неизвестных инфекций (вирусные иммунодефициты и гепатиты, Лайм-боррелиоз, атипичная пневмония и др.). Растёт и заболеваемость туберкулезом, гриппом, госпитальными инфекциями, на уровень эпидемий вышли ВИЧ-инфекции и заболевания вирусными гепатитами. Ряд ведущих специалистов опасается мировой пандемии преодолевающих межвидовой барьер высоковирулентных вирусов гриппа птиц (Chen et al., 2003; Okazaki et al., 2000). Одно из ведущих мест среди возбудителей внутрибольничных инфекций продолжает занимать стафилококковая инфекция (Васильева, 1991). Пищевые отравления, вызываемые стафилококковыми энтеротоксинами, составляют большую часть пищевых отравлений бактериальной этиологии (Reiser et al.,1988; Постовит, 1987). Имевшие совсем недавно в США случаи заболеваний людей, вызванных вирусом оспы обезьян, свидетельствуют об определённой вероятности выхода из природы на «эпидемическую орбиту» высоковирулентных и контагиозных для человека мутант-ных вариантов покс-вирусов. Всё это с особой остротой ставит вопрос о необходимости разработки безопасных вакцин, высокоспецифичных и чувствительных диагностических тест-систем.

Актуальность темы. Достижения в 80-х годах в области использования вируса осповакцины (ВОВ) в качестве эукариотического экспрессирующего вектора значительно стимулировали всестороннее исследование самого вируса осповакцины. Во-первых, представлял интерес поиск в геноме ВОВ мест, подходящих для встройки чужеродной генетической информации с целью создания поливалентных вакцин. Во-вторых, возник и вопрос о безопасности создаваемых рекомбинантных штаммов ВОВ. Никто не мог гарантировать, что при встройке чужеродной ДНК не появятся варианты высокопатогенного для человека рекомбинанта ВОВ. В третьих, не менее важной проблемой являлось установление роли собственных антигенов ортопоксвирусов в индукции иммунитета. В то время сведения такого рода были весьма ограничены. Всё это вместе взятое сдерживало практическое использование уже полученных рекомбинантных штаммов. Назрела острая необходимость выяснения роли отдельных структурных белков ВОВ в индукции иммунитета, установления их локализации в геноме и создания безопасной противооспен-ной вакцины.

По статистическим данным во время пандемии 1918-1919 гг погибло более 40 миллионов людей, а заболеваемость гриппом составила 500 млн человек. Смертность во время пандемий 1957 (вирус гриппа А подтипа Н2Ы2) и 1968 (НЗЫ2) г.г. была около 6 миллионов. Всё это обусловило повышенный интерес к возбудителю этого заболевания, как в научном плане, так и в плане создания эффективных противогриппозных вакцин нового поколения, которые могли бы прийти на смену живым и инактивированным цельновирионным.

Актуальными были и остаются и проблемы диагностики опасных для человека инфекций таких как вирусные гепатиты В и С, туберкулёз, клещевой иксодовый боррелиоз, госпитальные инфекции, а также пищевые токсикоин-фекции.

Цель исследования: разработать молекулярно-биологические основы для создания прототипов противооспенной и противогриппозной субъединичных вакцин, специфичных и чувствительных методов экспресс-диагностики вирусных гепатитов В и С, туберкулёза, клещевого иксодового боррелиоза, стафилококкового сепсиса. Задачи исследования:

1. Создать методическую базу для конструирования молекулярных вакцин и диагностикумов, включающую применение и совершенствование мо-лекулярно-биологических и генно-инженерных методов, конструирование специальных векторов для экспрессии генов в клетках Е.соН.

2. Исследовать физико-химические, антигенные и иммуногенные (протек-тивные) свойства белков вирусов гриппа и осповакцины и разработать эффективные способы их выделения и очистки.

3. Картировать на геноме отдельные гены, кодирующие иммуногенные белки вирусов осповакцины.

6. Исследовать иммунобиологические свойства стафилококкового энтеро-токсина А, получить моноклональные антитела к нему и сконструировать на их основе прототип высокоспецифичной иммуноферментной тест-системы.

8. Разработать высокоспецифичные и чувствительные способы обнаружения возбудителей туберкулёза, гепатитов В и С и иксодового клещевого боррелиоза в биосубстратах на основе использования методов полиме-разной цепной реакции и обратной транскрипции.

Научная новизна работы.

1. Установлены первичные структуры З'-концевой области генома вируса энцефаломиокардита мышей, полноразмерных ДНК-копий мРНКпроопио-меланокортина человека, быка и крысы, а также фрагментов генома трёх штаммов вируса гриппа. Выявлено, что гемагглютинин одного из штаммов (А/Алма-Ата/1417/84) имеет 96,12% гомологии с гемагглютинином возбудителя пандемии гриппа 1918-1919.

3. Установлено, что белок оболочки вируса осповакцины р20 является ди-мером белка р12, а предшественником гликопротеина р35 оболочки вириона является полипептид с молекулярной массой 27 кДа. Предшественники белков оболочки ВОВ р12 и р42, а также белка сердцевины р11 не отличаются по электрофоретической подвижности от зрелых белков вириона.

4. Методом гибридизационной селекции мРНК на фрагментах геномной ДНК ВОВ с последующим иммунохимическим анализом продуктов ее бесклеточной трансляции показано, что расположенный на стыке НтсИП Е- и Р-фрагментов ген кодирует сердцевинный поздний белок р11.

6. Впервые проведено иммуноаффинное выделение специфической мРНК, кодирующей белок р35 оболочки вириона ВОВ. Показано, что кДНК, синтезированная на мРНК специфически гибридизуется с геном 26К из левого Hindlll A-SalGI-фрагмента вирусной ДНК.

7. Обнаружен новый вид функциональной активности стафилококкового энтеротоксина А, характеризующийся способностью этого токсина индуцировать в условиях in vitro продукцию ИЛ-1 моноцитами периферической крови человека. Токсин проявляет выраженную ИЛ-1-индуцирующую активность в диапазоне концентраций от 100 пг/мл до 100 нг/мл.

8. Впервые обнаружено свойство стафилококкового энтеротоксина А неспецифически связываться с Fc-фрагментом иммуноглобулинов различных животных и определена локализация на нём участка связывания Fc-фрагмента. Эффективность связывания токсина с IgM намного ниже, чем с IgG.

9. Впервые при использовании метода иммунизации in vitro получены гибридомы, секретирующие моноклональные антитела lgM-кпасса против стафилококкового а-токсина.

10. В начале желтушного периода у больных вирусным гепатитом В с большим постоянством, наряду с HBs- и НВе-антигенами, в слюне выявляется и ДНК HBV; в период ранней реконвалесценции у 59,4% больных вирусным гепатитом В в слюне продолжает выявляться НВеАд при отрицательных результатах индикации ДНК HBV, обусловленных, по-видимому, ее низкой концентрацией в исследуемом биосубстрате. Эти данные свидетельствуют в пользу возможной длительной персистенции вируса в слюнных железах и потенциальной эпидемической значимости реконвалесцен-тов, как источников естественной передачи инфекции для контактирующих с ними лиц.

11. Иксодовые клещи Ixodes persulcatus, распространенные на территории Алтая, Новосибирской и Томской областей, заражены только двумя генови-дами Borrelia burgdorferi s.l.: B.garinii и B.afzelir, уровень зараженности клещей спирохетами, определявшийся в период с 1999 по 2003 г.г., колебался в пределах 10-40% в зависимости от года наблюдения и ареала распространения.

12. Определены нуклеотидные последовательности кодирующих областей генов ospC и flaB десяти сибирских изолятов Borrelia burgdorferi s.l. и методами компьютерного анализа выявлены потенциальные антигенные детерминанты соответствующих белков.

Практическая значимость работы:

1. Разработан оригинальный и простой способ разделения белков оболочки и сердцевины вируса гриппа, а также щадящий метод разделения гемагг-лютинина и нейраминидазы, который может быть использован как в научных исследованиях, так и в конструировании молекулярных противогриппозных вакцин.

2. Получен образец комбинированной молекулярной вакцины против двух серотипов вируса гриппа (H1N1 и H3N2), обладающий выраженной протективной активностью, который после проведения полных доклинических и клинических испытаний может быть использован для иммунопрофилактики гриппа.

3. Разработан новый эффективный способ получения моноспецифических антисывороток, включающий в себя как модифицированный метод препаративного электрофореза белков, так и особую схему иммунизации животных. Разработанная технология может быть использована в научных исследованиях. Получена коллекция специфических антисывороток ко всем мажорным белкам оболочки вириона, а также к некоторым белкам его сердцевины.

4. Прототип противооспенной вакцины, сконструированной на основе белков оболочки вируса осповакцины, по данным доклинических испытаний может применяться в качестве превакцины.

5. Иммуноферментная тест-система для определения стафилококкового энтеротоксина А может использоваться в пищевой промышленности, санитарно-эпидемиологической службе и клинике токсикоинфекций.

10. На основе исходной плазмиды plL-2/21 (SU1761805 А1 ) сконструирована серия экспрессирующих векторов, обеспечивающих эффективную индуцируемую экспрессию встраиваемых генов под контролем регуляторной области гена recA Proteus mirabilis.

Основные положения, выносимые на защиту:

2. Прототипы молекулярных вакцин (противооспенной и противогриппозной), обеспечивают индукцию защитного иммунного ответа у вакцинируемых животных.

3. Белки оболочки вириона ВОВ р12, р19, р20, р35 и р42 являются ранне -поздними, причём белок р20 является димером белка р12, а предшественником гликопротеина р35 оболочки вириона является полипептид с мол. массой 27 кДа,

4. Ген, кодирующий сердцевинный белок вириона р11 локализован на стыке Hindlll Е- и F-фрагментов геномной ДНК.

6. Разработанные методы выявления геномных нуклеиновых кислот возбудителей туберкулёза, гепатитов В, С и иксодового клещевого боррелио-за, характеризуются высокой чувствительностью, специфичностью и простотой исполнения.

7. Слюнные железы больных вирусным гепатитом В, как в начале желтушного периода, так и в стадии реконвалесценции, могут служить местом персистенции вируса, а сами больные могут являться потенциальными источниками естественной передачи инфекции для контактирующих с ними лиц

9. Спирохеты комплекса Borrelia burgdorferi s.l., циркулирующие в популяциях иксодовых клещей Ixodes persulcatus, распространенных на территории Сибири, представлены только двумя геновидами: Borrelia garinii и Borrelia afzelii,- и составляют отдельную группу, родственную изолятам боррелий, выделенных в Японии и Корее. Заражённость взрослых клещей колеблется в пределах 10-40% в зависимости от года наблюдения и ареала распространения.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Беклемишев, Анатолий Борисович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В разделе 3.1. представлены результаты наших ранних исследований по совершенствованию и применению ряда молекулярно-биологических методов: метода бесклеточного синтеза белка, метода обратной транскрипции РНК и клонирования кДНК, методов иммуноаффинного выделения специфических полирибосом и белков и др. Комплекс этих методов был использован в наших последующих работах, направленных на изучение структурно-функциональной организации геномов патогенных вирусов, картирование их генов, кодирующих протективные антигены, иммунохимиче-ское исследование антигенов патогенных микроорганизмов и создание прототипов молекулярных вакцин и диагностических препаратов.

В процессе выполнения работ по конструированию молекулярной противогриппозной вакцины были разработаны оригинальные простые и эффективные способы выделения и очистки структурных белков вирионов вируса гриппа. На основе гликопротеидов оболочки двух штаммов вируса гриппа был получен образец комбинированной субъединичной вакцины и в экспериментах на животных получены предварительные результаты по изучению иммуногенной активности препарата. Используя этот подход, на основе поверхностных антигенов ВГ и нуклеокапсидного белка, полученных из различных подтипов вируса, циркулировавших в период эпидемий/пандемий можно сконструировать комбинированные молекулярные вакцины с широким спектром действия. Вполне понятно, что такая вакцина является дорогой и может быть использована главным образом для вакцинации научного и медицинского персонала, связанного по роду своей деятельности с гриппозной инфекцией, а также в качестве превакцины для иммунодефицитных лиц. Следующим шагом в этом направлении может быть химический синтез олигопептидов, содержащих основные антигенные детерминанты белков-иммуногенов различных серотипов ВГ и, в случае достижения положительного эффекта при применении такой уже синтетической вакцины, перспективным направлением становится создание с помощью генно-инженерных методов микробиологического продуцента для промышленного производства комбинированной молекулярной вакцины.

Большой раздел исследований посвящен структурнофункциональному изучению вируса осповакцины и созданию прототипа противооспенной вакцины. Вирус осповакцины является одним из наиболее сложно устроенных вирусов эукариот. Исследование его генетического аппарата требует применения комплекса самых тонких и сложных биохимических и молекулярно-биологических методов. Как уже отмечалось выше, получение сколь-нибудь значимых и имеющих практическое применение результатов в этой области возможно лишь при проведении широкомасштабных работ достаточно большими группами исследователей. В представленной работе как раз и ставилась задача создания необходимой научной и экспериментально-методической основы для осуществления таких работ по картированию генов структурных белков вируса осповакцины.

Поставленная задача решалась проведением, в первую очередь, комплексного анализа достаточно обширного круга белков оболочки внутриклеточной формы вириона ВОВ. В связи с этим работа была начата с усовершенствования и стандартизации процедуры выделения вирусного препарата. Разработанный модифицированный способ очистки вирионов отличается высокой стабильностью и воспроизводимостью получаемых при этом результатов в отношении их белкового состава. Способ позволяет эффективно проводить наработку больших количеств вируса (более 100 мг) и, таким образом, осуществлять значительные циклы исследований на одном вирусном препарате. Помимо этой работы, очищенный таким способом вирус был использован для выделения препаративных количеств белков оболочки вириона, а также его фракций, растворимых в ЫР40 и ЛСН, с целью изучения их иммуногенных свойств.

Проведенный электрофоретический анализ вирионных белков ВОВ позволил выявить у них ряд неописанных ранее особенностей, в частности, связанных с их способностью агрегировать в условиях электрофореза, и некоторые другие.

Большое значение на первом этапе работы имела разработка высокоэффективного и достаточно универсального способа получения моноспецифических антисывороток, позволившего получить их коллекцию ко всем основным белкам оболочки вириона, а также к некоторым вирусным белкам, полученным с помощью бактериальных продуцентов.

С помощью полученных в этой работе антисывороток был проведен иммунохимический анализ белков вириона и продуктов бесклеточной трансляции вирусспецифической мРНК. Более детально были изучены антигенные свойства белка р35 оболочки вириона, что оказалось весьма существенным для последующей интерпретации результатов по картированию его гена, а также по определению его иммуногенных свойств. Были выявлены антигенные гомологии между некоторыми белками оболочки ВОВ, изучена динамика накопления белков вириона в инфицированных клетках, проведена идентификация в продуктах бесклеточной трансляции вирусспецифической мРНК полипептидов-предшественников ряда структурных белков ВОВ.

Таким образом, осуществленные на первом этапе данной работы методические разработки, а также проведенный комплексный анализ структурных белков ВОВ послужили необходимой основой для картирования их генов с использованием различных методических подходов.

Методом гибридизационной селекции вирусной мРНК было показано, что продуктом картированного ранее на стыке Hindlll Е- F-фрагментов ДНК ВОВ гена является строго сердцевинный белок р11, а не оболочечный, как это предполагалось. Установление этого факта является весьма ценной информацией, поскольку оно предотвращает проведение некоторых заведомо нецелесообразных экспериментов, основанных на имевшихся ошибочных данных.

Успешное проведение иммунохимического выделения специфической мРНК вируса осповакцины дало принципиально новую возможность для картирования генов его структурных белков.

Полученные в этой работе результаты дают возможность продолжить исследования как структурных белков вируса осповакцины, так и организации их генов в вирусном геноме.

Прежде всего, представляет интерес дальнейшее изучение антигенных свойств основных оболочечных белков ВОВ с помощью моноспецифических антисывороток, а также исследование роли каждого из них в процессе мофогенеза вириона в инфицированных клетках методами иммунной электронной микроскопии.

Полученные антисыворотки могут быть использованы также в изучении других имеющих народно-хозяйственное значение поксвирусов и, конечно, в продолжении картирования генов стуктурных белков ВОВ. С другой стороны, уже полученные результаты по локализации ряда вирусных генов предоставляют возможность для использования их в качестве мест встройки чужеродной генетической информации, а также более глубокого изучения природы кодируемых ими белков.

Таким образом, настоящая работа внесла свой вклад в структурно-функциональное изучение генома ВОВ и открыла перспективу для дальнейших исследований в этой области.

Специальное внимание в работе было уделено иммунобиологическому изучению стафилококкового энтеротоксина А (СЭА). СЭА, как и другие энтеротоксины особенно в последнее время приковывает внимание специалистов различных областей медицины и биологии: клиницистов и иммунологов, бактериологов и молекулярных биологов. Это связано прежде всего с большим разнообразием биологических свойств СЭА. Являясь высокотоксичным агентом, он, в то же время, обладает выраженными иммуномодули-рующими свойствами - может стимулировать или супрессировать иммунитет. В настоящее время существует мнение, что его различные иммунологические и токсические эффекты определяются различными эпитопами молекулы СЭА, Помимо фундаментальных аспектов исследования антигенной структуры СЭА и молекулярных механизмов его взаимо-действия с клетками-мишенями существует постоянный практический интерес к СЭА. Это прежде всего проблема индикации СЭА в пищевых продуктах, культуре стафилококка и клиническом материале от больных с пищевой интоксикацией. Вторая, более новая, прикладная - использование СЭА или его фрагментов в качестве избирательных иммуномодуляторов и даже неспецифических противоопухолевых препаратов.

В связи с этим наша работа была посвящена исследованию некоторых ранее неизвестных свойств СЭА, имеющих отношение к механизму его воздействия на иммунную систему, а также получению и характеристике моноклональных антител к СЭА и их использованию для конструирования тест-системы и эпитопного анализа СЭА. Было, в частности, установлено, что СЭА действительно является индуктором синтеза ИЛ-1 в моноцитах крови человека в диапазоне концентраций от 100 пг/мл до 100 нг/мл, хотя и уступает известному индуктору ИЛ-1 сальмонелезному липосахариду, содержащемуся в фармакологическом препарате - пирогенале. Впервые была обнаружена способность СЭА неспецифически связываться с Рс-фрагментами иммуноглобулинов животных, причём в связывании СЭА участвуют углеводные компоненты Яс-участка 1дО и 1дМ.

Из опытов по конкуренции СЭА с СПА за связывание 1дв можно заключить, что участки 1дО, ответственные за связывание с этими белками, находятся в одной области Рс-фрагмента и либо идентичны друг другу, либо расположены очень близко и стерически экранируются при связывании с соответствующим лигандом. Причем СПА-связывающий сайт 1дО обладает большим аффинитетом к лиганду, чем сайт, связывающий СЭА. Возможно также, что СПА имеет больше сайтов связывания с 1дС, чем с СЭА. Так, по литературным данным, СПА имеет 5 сайтов связывания с 1дО (Мокв е1 а1., 1986). В наших экспериментах комплекс 1дС-СЭА состоял из двух молекул 1дв и одной молекулы СЭА.

Проведенный нами подробный иммунохимический анализ природы связывания СЭА с Рс-фрагментом иммуноглобулина наводит на мысль об аналогии с СПА, а также со стрептококковым протеином С, которые хорошо известны как высокоаффинные Рс-связывающие реагенты. В связи с этим можно предположить, что СЭА, попадая в организм животного, связывается с неспецифическими иммуноглобулинами хозяина в области Рс-фрагментов и тем самым экранируется ими, и ускользает от иммунологического контроля иммунной системы.

Учитывая исследовательские и прикладные возможности моноклональ-ных антител (МКА), специальное внимание в работе было уделено получению методом гибридомной технологии стабильных клеточных линий, продуцирующих высокоспецифичные МКА к энтеротоксину А стафилококка, изучению некоторых их свойств и разработке иммуноферментной тест-системы определения СЭА.

Получение МКА к СЭА представляет собой трудоемкий процесс, сопряженный со значительными трудностями ввиду его токсичности и слабой иммуногенности. Кроме того, как было показано (Platsoucas et al., 1986), СЭА обладает стимулирующим действием по отношению к Т-супрес-сорам. В связи с этим, схема иммунизации и форма предъявления антигена, по-видимому, имела важное значение в технологии получения МКА к СЭА.

Сравнение различных схем иммунизации позволило выбрать наиблее оптимальную для высокотоксичных белков. В результате работы была получена гибридома, продуцирующая моноклональное антитело E9D11 IgGi изотипа, которое проявило высокую специфичность к СЭА и не реагировало с СЭВ, СЭС^, C3D, CAT, хотя серологический анализ различных типов СЭ показывает существование общих эпитопов у разных пар и имеются идентичные эпитопы для пар СЭА-СЭЕ и СЭВ-СЭС (Езепчук, 1985, Thompson et al., 1985). Это антитело обладало не только высокой специфичностью, но и достаточно высокой аффинностью (Ка=1,34х108 М) к СЭА что делает его весьма перспективным для создания диагностических тест-систем. Было отмечено, что максимальное значение Ка достигает 10^ М-1,а низкие значения Ка= 105-М~1 (Егоров, Диков, 1982).

Эксперименты по разработке различных постановочных вариантов иммуноферментной тест-системы для выявления СЭА на основе МКА E9D11 показали возможность получения чувствительных тестов, пригодных для определения СЭА в нанограммовых количествах. Причем большей чувствительностью обладала тест-система на основе реакции ингибирова-ния ИФА (10 нг/мл), чем "сэндвич-ИФА" (150 нг/мл).

В перспективе планируется апробировать сконструированные тест-системы выявления СЭА для практического использования в пищевой промышленности. Следует подчеркнуть, что весьма перспективным для конструирования иммуноферментных тест-систем для выявления стафилококковых эетеротоксинов являются МКА, подобные 4С6, поскольку они специфичны к общим для всех СЭ антигенным детерминантам.

Три раздела исследований посвящены разработке методов диагностики вирусных (HBV и HCV) и бактериальных инфекций с использованием двух подходов: один основан на обнаружении геномных нуклеиновых кислот возбудителей инфекций методами ПЦР или ОТ-ПЦР, другой - на выявлении антител в крови к антигенам, полученным генно-инженерными методами.

Разработанный метод обнаружения геномных нуклеиновых кислот вирусов гепатиов В и С с использованием однопробирочной «гнездовой» ПЦР обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Использование этого метода значительно снижает риск перекрёстной контаминации ампликонами, которая имеет место в случае применения двух-раундовой ПЦР. Кроме того, этот метод, как и методы ПЦР-детекции патогенных микобактерий и возбудителей клещевого боррелиоза может быть трансформирован в формат, пригодный для проведения ПЦР в реальном времени. Применение в разработанных способах ПЦР-детекции внутреннего положительного контроля (ДНК ВК) прохождения ПЦР позволяет регистрировать возможные случаи ингибирования Тая-полимеразы в анализируемых образцах и, следовательно, отслеживать ложноотрицательные результаты анализа.

Методы диагностики, основанные на ПЦР, в силу своей дороговизны, конечно, не могут использоваться в массовых анализах, но являются незаменимыми для осуществления контроля за прохождением курса лечения, могут быть использованы в качестве подтверждающего диагностического теста, а также для выявления вирусов в банках донорской крови и в препаратах, получаемых из крови.

Разработанный в данной работе способ диагностики начальных стадий клещевого боррелиоза, основанный на иммуноферментном анализе, имеет удовлетворительную специфичность и чувствительность. Однако, несомненно, требуется его дальнейшее совершенствование. Реальный путь к этому - введение в тест-систему большего числа различных специфических антигенов боррелий. Кроме того, заманчивым представляется создание стриппового варианта тест-системы с использованием ранних и поздних антигенов, который позволит как-то судить о стадии заболевания ИКБ.

377

Информация о работе

Беклемишев, Анатолий Борисович
доктора биологических наук
Новосибирск, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Использование методов молекулярной биологии и генной инженерии для конструирования вакцинных и диагностических препаратов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Использование методов молекулярной биологии и генной инженерии для конструирования вакцинных и диагностических препаратов - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы