Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение рекомбинантных факторов роста мышц

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение рекомбинантных факторов роста мышц"

На правах ткописи

003448303

КУЗНЕЦОВА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФАКТОРОВ РОСТА МЫШЦ

Специальность: 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 в О'/.Г 7ППГ,

Москва 2008

003448903

Работа выполнена в ВНК «Биохимия мышц» Института биохимии им. А.Н. Баха Российской Академии Наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

А.Б. Шевелев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

С.В. Маш ко

кандидат биологических наук

В.Г. Лунин

Ведущая организация:

Центр биоинженерии Российской Академии Наук Защита диссертации состоится » 2008 года в ^ часов

минут на заседании диссертационного совета Д 006.027.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская ул., д. 42; тел.: (495) 97665-44; факс: (495) 977-09-47; e-mail: iab@iab.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Автореферат диссертации разослан .» Ofy 2008 г.

Р,

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.027.01, кандидат биологических наук С.А. Мелййова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В связи с накоплением больших массивов данных о последовательностях геномных ДНК получение и тестирование не охарактеризованных в биохимическом отношении факторов роста мышц и других белков, лишенных ферментативной активности, может рассматриваться в качестве типовой задачи биотехнологии. В этой связи большую актуальность приобретает систематизация существующих подходов к решению этой задачи в виде универсальной платформы, позволяющей облегчить выбор наиболее быстрого и продуктивного метода получения ранее не исследовавшегося ростового фактора в нативной форме. В свою очередь, расширение спектра доступных для физиологических экспериментов ростовых факторов создает основу для направленного воздействия на рост и развитие мышечной ткани при лечении наследственных и возрастных миодистрофий, в спортивной медицине, при посттравматическом восстановлении и в зоотехнике.

Развитие мышц контролируется как минимум двумя регуляторными системами, которые условно можно назвать миостатин-фоллистатиновая и IGF-соматотропиновая. Ключевыми регуляторными факторами миостатин-фоллистатиновой системы являются миостатин - мощный эндогенный ингибитор роста мышц и его физиологический блокатор фоллистатин. Повышение концентрации миостатина в организме является непосредственной причиной возрастной и наследственных миодистрофий, а генетические дефекты в гене миостатина, напротив, приводят к появлению особей с увеличенной мышечной массой (Lee and McPherron, 2001). Имеющиеся данные свидетельствуют, что снижение уровня миостатина не приводит к нежелательным для здоровья последствиям, поэтому воздействия, направленные на удаление миостатина из организма, могут оказаться перспективными при лечении миодистрофий и в спортивной медицине, а также в зоотехнике. Традиционно для удаления нежелательных факторов из

кровотока используется гемосорбция на иммобилизованных антителах. Однако получение антител против миостатина технически невозможно по причине полной инвариантности миостатина у всех позвоночных. В качестве альтернативы антителам могут быть использованы природные лиганды миостатина - фоллистатин или пропептид миостатина, с которыми он формирует прочные нековалентные комплексы.

Инсулиноподобный фактор роста (IGF) и гормон роста (соматотропин) известны в качестве важнейших позитивных регуляторов мышечных волокон. Недавно в поперечно-полосатых мышцах был обнаружен новый продукт гена IGF, который формируется путем альтернативного сплайсинга. Новая изоформа детектируется только в работающих или поврежденных мышцах, поэтому она получила название механического фактора роста MGF (mechano growth factor). С помощью синтетического MGF и техники ДНК-доставки показана уникальная избирательность действия этого фактора на пролиферацию миобластов - клеток-предшественников мышечной ткани (Yang and Goldspink, 2002). Исследования в данном направлении открывают широкие перспективы медикаментозной стимуляции роста мышц, причем высокая избирательность действия MGF обещает отсутствие нежелательных побочных эффектов. Тем не менее, до настоящего времени исследование физиологической роли и возможностей практического применения MGF ограничено отсутствием рекомбинантных продуцентов этого фактора.

Цель п задачи исследования. Целью работы было создание современной и максимально универсальной схемы получения рекомбинантных факторов роста мышц при помощи экспрессии в Е. coli, оценка нативности пространственной структуры и естественной физиологической активности полученных препаратов.

В число поставленных задач входило- на примере модельного объекта TNF-a разработать унифицированную схему рекомбинантной продукции и ренатурацин белков, не обладающих ферментативной активностью;

- разработать дизайн рекомбинантных продуцентов факторов роста мышц - MGF, MSTN, пропептида MSTN, MSTN-связывающего домена FSTN;

- разработать системы очистки, ренатурацни, оценки функциональной активности полученных рекомбинантных белков in vitro и in vivo,

- получить аффинные сорбенты на основе FSTN и пропептида MSTN для удаления избытка миостатина из крови больных миодистрофией, охарактеризовать емкость и специфичность сорбентов.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В результате исследований модельного объекта TNF-a была показана практическая применимость метода сульфонатных производных на этапе солюбилизации тел включения и отработки процедуры ренатурацни по сравнению с методом разрыва дисульфидных связей восстановлением. Отработана методика очистки рекомбинантного белка из тел включения при помощи хроматографии в денатурирующих условиях: выявлено преимущество нецеллюлозных матриц (например, ТоуоРеаг]) над целлюлозными (например, Sepharose); показана целесообразность проведения хроматографии при пониженной концентрации мочевины (4 М), связанная с повышением выхода хроматографии и облегчением процедуры ренатурацни разбавлением. Функциональный тест на стандартной клеточной линии L929 впервые показал биологическую активность белка TNF-a, лишенного 18-ти а.о. с N-конца, предположительно участвующих в образовании тримерной формы белка.

Путем ренатурацни in vitro впервые получен полноразмерный механический фактор роста MGF, ранее изучавшийся только в форме

транскриптов й синтетических фрагментов. Разработана оригинальная методика тестирования выхода ренатурации MGF, основанная на сочетании обращеннофазной ВЭЖХ и функционального теста на клеточных линиях. Впервые количественно измерена цитопролиферативная активность рекомбинантного MGF на линии нормальных (неиммортализованных) миобластов человека.

Использование зеленого флуоресцирующего белка 6-His-GFP (традиционно служащего для маркирования субклеточных структур in vivo) в качестве N-концевого трансляционного тага для экспрессии в Е. coli впервые позволило добиться получения зрелого миостатина человека в форме растворимого продукта. Устойчивость пространственной структуры бифункционального белка 6-His-GFP-MSTN и наличие у него характерной для MSTN димерной организации подтверждены фактом сохранения флуоресцентных свойств белка в условиях денатурирующего электрофореза в 12,5% ПААГ.

Впервые предложен способ синтеза MSTN-связывающего домена фоллистатина в виде слитого белка с б-His-GFP. Показана высокая эффективность трезилового реагента для получения активированных сефарозных матриц, пригодных для иммобилизации денатурированных рекомбинантных белков с последующей ренатурацией in situ. С использованием рекомбинантного белка 6-His-GFP-FSTN, иммобилизованного на Sepharose 4В в денатурирующих условиях, впервые получен аффинный сорбент, по специфичности, емкости и гидродинамическим характеристикам пригодный для удаления миостатина в условиях гемосорбции.

Апробация работы. Полученные в ходе выполнения работы препараты факторов роста мышц были использованы в Институте Медико-биологических проблем РАН при выполнении государственных программ МОН РФ «Управление функциональным состоянием человека с целью

повышения работоспособности в экстремальных условиях (в том числе в космическом полете)» и «Медицинские и молекулярно-биологические технологии повышения работоспособности человека в условиях напряженных физических нагрузок». Материалы диссертации были рассмотрены на межлабораторном семинаре ВНК «Биохимия мышц» и лаборатории регуляции биосинтеза белка 11 июня 2008 года.

Структура работы. Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста, включая 37 рисунков и 5 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов работы, выводов и списка цитированной литературы (168 источников).

Список сокращений, использованных в автореферате: IGF -

ннсулиноподобный фактор роста; MGF - механический фактор роста; TNF-a - фактор некроза опухолей a; MSTN - миостатин; FSTN - фоллистатин; GFP зеленый флуоресцирующий белок из Aquorea victoria; а.о. -аминокислотный остаток; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ПААГ - полиакриламидный гель, ActD - актиномицин D.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для экспрессии в Е. coli использовались векторные системы на основе промотора Т7 (рЕТ23, Novagen) и промотора Т5 (pQE30, Invitrogen). Для препаративной хроматографии использовались сорбенты DEAE-ToyoPearl, Q-Sepharose, S-Sepharose и система высокого давления Pharmacia.

Процедуру ренатурации проводили по принципу одноступенчатого разбавления солюбилизированных в хаотропном агенте рекомбинантных белков. Панель буферов для ренатурации была приготовлена согласно протоколу (http V/www. athenaenvironrnental.com/). Концентрацию общего

белка, оставшегося в растворе после отделения агрегатов, определяли по модифицированному методу Лоури. Сигнал, полученный при определении биологической активности в клеточной системе, нормировали на концентрацию белка, оставшегося в растворе.

Для определения биологической активности TNF-a использовали стандартный тест на индукцию апоптоза на клетках линии L929, обработанных актиномицином D (Kramer and Carver, 1986). Определение биологической активности MGF проводилось при помощи цитопролиферативного теста на линии нормальных (неиммортилизованных) миобластов человека (Шишкин и др., 2004). Аналитическая обращеннофазная ВЭЖХ препаратов MGF проводилась на колонке Armsfer-S1-IOO-C8 PR (250x3x4 мм). Элюцию проводили линейным градиентом ацетонитрила (17-30% за 30 мин) в присутствии 0,1% трифторуксусной кислоты при скорости потока 0,8 мл/мин.

Концентрация белка-лиганда при синтезе аффинных сорбентов для удаления миостатина составляла 10 мг на 1 мл трезил-активированной смолы Sepharose 4В. Концентрацию белка-зонда 6His-GFP-MSTN во фракциях, полученных при хроматографии на сорбентах, определяли при помощи иммуноблоттинга и ИФА с аффинно очищенными кроличьими антителами против стыка GFP и MSTN. ИФА представлял собой вариант «сэндвич», анализ проводился на планшетах, активированных 6His-GFP-FSTN. Концентрация белка в единичной точке измерялась путем серийного разведения антител в 8-ми лунках планшета с шагом в 2 раза.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка методической платформы для получения рскомбинантных факторов роста на модели ТОТ-а человека

ТОТ-а человека является традиционным объектом рекомбинантной экспрессии (Шингарова и др., 1996), благодаря чему его физико-химические (прежде всего, спектральные) характеристики хорошо изучены, есть полные данные о пространственной структуре, в том числе, в виде комплекса с рецептором; отработаны методики тестирования биологической активности. Однако технология ренатурации ТИБ-а на практике не применяется и в литературе описана недостаточно. Поэтому этот белок был выбран в качестве модели для создания методической платформы, позволяющей до начала экспериментальной работы выбрать наиболее быстрый способ получения ростового фактора в нативной, биологически активной форме.

Был создан рекомбинантный продуцент ТЫР-а на основе Е. сок, обеспечивающий выход продукта в виде телец включения с выходом до 200 мг/л, что позволило добиваться значительного обогащения продукта путем водной экстракции на стадии фракционирования телец включения. Тем не менее, отработка следующей стадии процесса - ренатурации, потребовала предварительной очистки от небелковых клеточных компонентов путем хроматографии в денатурирующих условиях. Для проведения хроматографии тела включения должны быть солюбилизированы в хаотропном агенте с одновременным разрывом дисульфидных связей. Обычно последняя задача решается путем восстановления белка меркаптанами, однако полностью восстановленный белок неустойчив в присутствии кислорода. Этого недостатка лишены сульфонатные производные белка, полученные путем сульфитолиза. При сравнении эффективности очистки и выхода денатурирующей хроматографии ТМР-а в форме восстановленных и сульфонатных производных (рис. 1) было выявлено, что сульфитолиз тел включения влечет образование нескольких изоформ белка, отличающихся изоэлектрической точкой. Вероятно, это

7

связано с неполной модификацией дисульфидных групп и, как следствие, на хроматограмме детектируется несколько пиков. Поэтому в дальнейшем при получении Т№-а мы пользовались процедурой восстановления при помощи ДТТ.

Рис. 1 Сравнение эффективности очистки ТОТ-а в денатурирующих условиях в форме восстановленных и сульфонатных производных: а) профиль хроматографии восстановленного Т№-а в денатурирующих условиях на ОЕАЕ-ТоуоРеаг1, б) профиль хроматографии сульфированного Т№-а в денатурирующих условиях на ОЕАЕ-ТоуоРеаг1.

В процессе отработки методики хроматографии в денатурирующих условиях выявлено преимущество нецеллюлозных матриц (например, ТоуоРеаг1) над целлюлозными (например, ЗерЬашзе). Также показана целесообразность проведения хроматографии при минимальных поддерживающих концентрациях хаотропного агента (4 М мочевина), связанная с повышением выхода хроматографии и облегчением процедуры ренатурации методом разбавления.

Очищенное в результате хроматографии восстановленное производное ТМР-а использовалось для оптимизации процедуры ренатурации методом

разбавления на панели из 15 стандартных буферов. Эффективность ренатурации TNF-a оценивалась с помощью цитотоксического теста на стандартной клеточной линии мышиной фибросаркомы L929 (рис. 2).

Параллельно со зрелым полноразмерным TNF-a методика получения белка была воспроизведена на ранее не охарактеризованном производном TNF-a, лишенном 18-ти природных а.о. с N-конца белка. По данным литературы, удаленные остатки участвуют в образовании тримерной формы белка, что необходимо для его функционирования (Шингарова и др., 1998). Однако полученные результаты цитотоскического теста показали, что активность усеченного варианта TNF-a незначительно отличалась от

Рис. 2 Цитотоксический эффект ренатурированного TNF-a на линии L-929: 1 -клетки L-929, 2-клетки в присутствии ActD, 3 -контрольный препарат TNF-a («Рефарм»), 4 -усеченный вариант TNF-a, ренатурированный в буфере №7, 5- усеченный TNF-a, ренатурированный в буфере №13, 6 -полноразмерный TNF-a, ренатурированный в буфере №13.

2. Получение механического фактора роста мышц (MGF)

С целью создания рекомбинантного продуцента был сконструирован синтетический ген, кодирующий зрелый MGF и имеющий оптимизированный для Е. coli кодоновый состав. Уровень накопления целевого белка при культивировании нового штамма достигал 120 мг на литр культуры. Первые этапы очистки MGF совпадали с разработанной

активности полноразмерного белка.

А595

1,8 1,6 1,4 1,2 1

0,8 0,6 0,4 j-0,2 -

О -0,2

схемой для TNF-a. Различия появились на стадии подготовки образцов к хроматографии в денатурирующих условиях, что обусловлено разницей в изоэлектических точках белков. Солюбилизация в денатурирующих условиях проводилась в присутствии восстановителя при рН 8,2 либо с помощью сульфитолиза дисульфидных связей при рН 8,8. Однако основные свойства MGF требовали использования для его очистки катионообменника, максимальная емкость которого достигается при кислых значениях рН буфера нанесения. Обнаружилось, что при доведении рН денатурированного препарата MGF до 5,0 происходит резкое снижение растворимости белка, что влечет за собой потери до 95%. Однако сильнощелочное значение изоэлектрической точки MGF позволило вести катионообменную хроматографию при рН 7,0. Полученный препарат, свободный от нуклеиновых кислот, был подвергнут ренатурации по стандартной методике, ранее предложенной для IGF. С целью оптимизации условий ренатурации было проведено предварительное тестирование биологической активности ренатурированых препаратов при помощи цитопролиферативного теста на линии нормальных (неиммортализованных) миобластов человека (рис. 3).

Рис. 3 Сравнение

А595

0,16 0*14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0

т

й

биологической активности препаратов \ТСР, очищенных в восстановительных (заштрихованные столбцы) и окислительных (прозрачные столбцы) условиях.

0,25

0,5 1 3 MGF, мкг/мл

10 10

Препарат, полученный при помощи восстановления, в диапазоне концентраций от 3 до 5 мкг/мл ускорял рост культуры по сравнению с контролем. Активности препарата, полученного при помощи сульфитолиза, оказалась существенно ниже. Поэтому для дальнейших экспериментов использовался только «восстановленный» препарат.

Выбранный препарат МвБ наносили на катионообменник Б-сефароза в нативных условиях для очистки от неренатурированного или мисфолдированного белка. Было обнаружено, что МвБ элюируется с колонки в виде двух дискретных пиков, при содержании ИаС1 в буфере для элюции около 320 и 360 мМ (рис. 4). Фракции, соответствующие этим пикам, были собраны в виде двух препаратов, в дальнейшем обозначавшихся как «кислая» (фракции 6-8) и «щелочная» (фракции 11,12) изоформы.

Рис. 4 ПЛАГ-электрофорез фракций, _ содержащих МОР, полученных при

хроматографии в нативных условиях.

«Кислая» изоформа - фракции 6-8; ____< «щелочная» изоформа-фракции 11,12

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12

Обнаруженное разделение одинакового по первичной структуре белка на два пика может быть объяснено различиями в полученной после ренатурации конформации. Методика тестирования выхода активного МвР в результате ренатурации основывалась на сочетании обращеннофазной ВЭЖХ и функционального теста на клеточных линиях. Тестирование биологической активности достоверно показало наличие физиологического эффекта в отношении миобластов «щелочной», но не «кислой» изоформы (рис. 5).

%

МОЯ, мкг/мл

Рис. 5 Сравнение биологической активности препаратов МОЯ (заштрихованные столбцы - «кислая» изоформа, прозрачные столбцы - «щелочная» изоформа)

При концентрации в ростовой среде 0,5 мкг/мл и выше «щелочная» изоформа МвР достоверно положительно влияла на рост миобластов. При высоких концентрациях видимое отсутствие действия МОР объясняется, по-видимому, ингибирующим действием компонентов буфера, в котором вносили фактор.

Исследования обоих препаратов методом обращеннофазной ВЭЖХ показали практически полную гомогенность «щелочной» изоформы, тогда как на хроматограмме «кислой» изоформы наблюдается три пика, средний из которых по времени удержания соответствует единственному пику «щелочной» изоформы (рис. 6). Таким образом, «щелочная» изоформа представляет собой практически гомогенный нативный МОР.

a) lili

О 10 20 30 мин 0 10 20 30 мин

Рис. 6 Профиль обращеннофазной ВЭЖХ препаратов MGF на сорбенте окгил-Armsfer-Si-I00-C8 PR: а) «кислая» изоформа (пик 2 - нативный MGF), б) «щелочная» изоформа (пик 1 - нативный MGF).

Разработка тест-системы определения биологической активности факторов роста мышц и анализ концентрационной зависимости получаемого в ней сигнала усложняются несколькими факторами. Во-первых, существует минимальная доза засева клеток на лунку планшета, ниже которой клетки утрачивают способность к пролиферации. Для нормальных миобластов такая доза составляет около 60% поверхности лунки. Во-вторых, хотя МСБ ускоряет пролиферацию миобластов, но, с учетом высокой плотности засева и феномена контактного торможения роста при достижении монослоя, прирост их биомассы не может превышать 30-35% от начального уровня. В третьих,

13

разброс детектируемого сигнала в пределах повторности находится на уровне около 5%. В четвертых, МвР, являясь высоко специфичным для мышечной ткани регулятором роста и не будучи достаточно изученным в физиологической отношении, не может тестироваться на иммортилизованных клеточных линиях, которые могут обладать искаженной гормональной чувствительностью. Таким образом, единственным критерием, позволяющим полуколичественно оценивать уровень удельной активности препарата, является метод качественной детекции эффекта в серии его разведений со снижающейся концентрацией.

3. Получение аффинных сорбентов для удаления миостатина.

Перспективным способом воздействия на мышечную массу наряду с использованием МСБ является снижение концентрации миостатина в организме. Традиционно для решения подобных задач используется гемосорбция на иммобилизованных антителах. Однако получение антител против миостатина технически невозможно по причине полной инвариантности миостатина у всех позвоночных. Эта проблема может быть решена путем создания аффинных сорбентов для гемосорбции миостатина на базе его природных лигандов - пропептида миостатина и фоллистатина.

Для повышения выхода биосинтеза белков и облегчения детекции в процессе очистки в качестве трансляционного тага для экспрессии в Е. соИ был использован зеленый флуоресцирующий белок б-Шв-СРР. При этом белок-таг находился в И-концевой, а целевые продукты зрелый миостатин (МБТЫ), пропептид миостатина (ргоМЗТИ) и активин-связывающий домен фоллистатина - в С-концевой части слитого бифункционального белка (рис. 7).

промотор Т5

6 His

GFP 16 кДа

MSTN 12 кДа

промотор Т5

б His

вектор pUK2I

GFP 16 к Да

proMSTN 40 кДа

промотор Т5

6 His

вектор pQE30

GFP 16 кДа

FSTN 6 кДа

Рис. 7 Схемы плазмидных конструкций, использованных для получения рекомбинантного миостатина и его природных лигандов в виде бифункциональных слитых белков с б-Мэ-СРР.

В последовательность гена пропептида миостатина была введена мутация Asp72AIa, придающая ему дополнительную устойчивость к протеолизу. Белок 6His-GFP-MSTN был получен в Е. coli в нативной форме и очищен в одну стадию при помощи металлоаффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе (рис. 8).

кДа 45

35

25

Рис. 8 ПААГ-электрофорез слитого белка 6His-GFP-MSTN, очищенного с помощью металлоаффинной хроматографии.

6His-GFP-MSTN

6His-GFP

М 1 2

Лиганды миостатина были получены в виде тел включения и очищены хроматографией на ОЕАЕ-ТоуоРеаг1 в денатурирующих условиях. Ренатурация рекомбинантных белков традиционным способом разбавления или диализа не проводилась. Вместо этого для предотвращения агрегации денатурированного

полупродукта в процессе рефолдинга in vitro была проведена его иммобилизация на носителе.

Наиболее распространенным способом иммобилизации белков является активация целлюлозных матриц циан-бромидом. Однако этот способ дает низкие выходы при работе с денатурированными белками, растворенными в мочевине. Эту проблему удалось устранить за счет активации матрицы трезиловым реагентом (рис. 9).

Рис. 9 Схема активации сефарозной матрицы и иммобилизации белка при помощи трезилового реагента.

К преимуществам использования трезилового реагента относятся проведение реакции иммобилизации в мягких физиологических условиях и возможность активации не только агарозных, но и высокосшитых сефарозных матриц. Подобные матрицы не подвержены компрессии под действием высокого давления, необходимого для хроматографии такой вязкой жидкости, как плазма крови.

Ренатурация иммобилизованных белков проводилась in situ путем удаления мочевины из омывающего буфера. Факт ренатурации подтверждался в экспериментах по определению емкости и специфичности сорбентов.

Исследования проводились с помощью полученного слитого белка-зонда -бИз-СРР-МБТЫ в присутствии 10% плазмы крови, что обеспечивало избыток конкурента на 4 порядка и имитировало условия гемосорбции. В качестве отрицательного контроля использовалась сефарозная матрица без лиганда. На колонки, содержащие по 1 мл сорбентов, были нанесены аликвоты ОРР-миостатина, содержащие 10 мкг и 0,1 мкг. Результаты хроматографии представлены на рис. 10, в нижней части которого в процентах от исходного отображено количество белка в проскоке, в верхней - количество белка в элюате.

элюция %

проскок %

ШЗ Сефароза 4В

Ш рэты

■ ргоМЭТЫ

......■...................

Ун

------- 1 ......

10 мкг 0,1 мкг

: х ЭРР-МвТЫ ОРР-МБТЫ

Рис. 10 Исследования емкости и специфичности аффинных сорбентов в отношении белка-зонда 6Н13-ОРР-М8Т1Ч. Количество белка в проскоке и элюате указано в процентах от исходного.

Детекция бН^-СЗРР-МЗ'Ш проводилась при помощи ИФА с антителами, избирательно детектировавшими белок-зонд. Было показано полное удаление внесенного миостатина на обоих сорбентах.

В большинстве экспериментов общее содержание бШя-ОРР-МЗТК во всех фракциях, полученных при хроматографии на сорбентах, не достигало 100%. Это может быть обусловлено как необратимым связыванием белка-зонда на колонке, так и его деградацией в процессе эксперимента за счет

протеолитической активности плазмы. Можно предполагать, что, используя более высокие концентрации 6His-GFP-MSTN, можно было бы достичь минимизации этого нежелательного эффекта. Однако мы предпочли достаточно низкие концентрации белка-зонда, стремясь воспроизвести соотношение между миостатином и балластным белком крови в реальных условиях гемосорбции. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что сорбент на основе 6His-GFP-FSTN обладает более высокой емкостью в отношении 6His-GFP-MSTN по сравнению с сорбентом на основе 6His-GFP-proMSTN: его связывающая способность в отношении миостатина может быть оценена на уровне не ниже 10 мкг на 1 мл сорбента. На основании литературных данных концентрацию миостатина в крови можно оценить на уровне не выше 300 мкг/л крови. Емкость сорбента, необходимого для очистки 5 л крови одного человека, должна превышать 1,5 мг. Таким образом, для обработки всего объема крови человека достаточно 150 мл сорбента. Эти показатели свидетельствуют о пригодности разработанных материалов для удаления миостатина из плазмы пациентов с помощью гемосорбции.

Заключение

По результатам проведенной работы мы предложили и на ряде примеров доказали практическую применимость методической платформы, позволяющей получать ранее не исследовавшиеся ростовые факторы в нативной форме последовательным или параллельным применением четырех схем:

1-я схема «Прямая ренатурация» включает в себя два способа разрыва дисульфидных связей, хроматографию в денатурирующих условиях, сочетание нескольких методов тестирования выхода ренатурации. Применимость схемы ограничена белками с небольшим числом дисульфидных связей, не склонных к агрегации. Ее преимуществом является простота и стандартность используемых приемов, возможность получения высокоочищенного препарата в короткий срок.

2-я схема «Экспрессия в нативной форме» основана на использовании

белков-тагов. Конкретным вкладом нашей работы в разработку этой схемы

18

является введение в практику препаративной биотехнологии зеленого флуоресцентного белка, несущего на N-конце гексагистидиновый таг. Бифункциональные белки, содержащие эту модификацию GFP в качестве N-концевого компонента, могут синтезироваться клетками Е. coli с высоким выходом, не образуя тел включения. Процедура очистки таких белков облегчается возможностью визуального наблюдения за распределением целевого продукта между фракциями. Ранее GFP использовался преимущественно для прижизненного маркирования субклеточных структур и не применялся при создании рекомбинантных продуцентов биоактивных белков и пептидов. Преимущество схемы - исключение слабо стандартизуемой стадии ренатурации и тестирования нативности продукта.

3-я схема «Парная экспрессия» включает в себя получение рекомбинантной пары «лиганд - растворимый рецептор» с последующей иммобилизацией одной составляющей на носителе. Универсальность этой схемы обусловлена тем, что каждый ростовой фактор имеет один или более рецепторов, передающих сигнал внутрь клетки-реципиента. Высокая консервативность позволяет находить в последовательностях геномов гены рецепторов даже тех ростовых факторов, биохимические исследования которых не проводились. Данная схема может быть пригодна для получения как самого ростового фактора, так и связывающего домена его рецептора в препаративных количествах.

4-я схема получения новых ростовых факторов «Природный лиганд и рекомбинантный рецептор» основана на иммобилизации на носителе в денатурирующих условиях одной из составляющих пары «лиганд -растворимый рецептор», полученной при помощи рекомбинантной экспрессии. Этот подход к ренатурации экстраклеточных доменов рецепторов может рассматриваться как наиболее универсальный, поскольку он полностью исключает агрегацию белка при удалении денатуранта вне зависимости от его физико-химических свойств. Второй компонент пары «лиганд-рецептор» может быть очищен с помощью аффинной хроматографии биологических жидкостей на синтезированном сорбенте.

Выводы

1. По результатам исследований модельного белка ТОТ-а разработана универсальная платформа, состоящая из четырех альтернативных схем и обеспечивающая получение в физиологически активной форме ранее не исследовавшихся факторов роста мышц.

2. На примере механического фактора роста (МОБ) доказана эффективность схемы «Прямая ренатурация». Впервые получен препарат полноразмерного биологически активного белка.

3. На примере зрелого миостатина человека доказана эффективность схемы «Экспрессия в нативной форме». За счет использования в качестве трансляционного тага зеленого флуоресцентного белка впервые получен бактериальный продуцент, синтезирующий миостатин непосредственно в нативной конформации.

4. На примере пропетида миостатина человека и МЗТИ-связывающего домена фоллистатина доказана применимость схем «Парная экспрессия» и «Природный лиганд и рекомбинантный рецептор».

5. Впервые созданы аффинные сорбенты на основе иммобилизованного фоллистатина и пропептида миостатина, пригодные для удаления избытка миостатина из крови больных миодистрофией.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Суровцева Е.В., Кузнецова Т.В., Хоменков В.Г., Домогатский С.П., Шевелев А.Б. Новый штамм-продуцент фактора некроза опухолей человека па основе Е. coli. Биоорганичсская химия. МАИК "Наука-интерпериодика", 2005, Т. 31, №5, с. 426-432.

2. Кузнецова Т.В., Шевелев Б И., Керученько Я.С., Шевелев А.Б. Новая тест-система для количественного определения содержания TNF-альфа в образцах крови человека. Вестник Московского Университета, 2008, Т. 49, сер. 2, №2, С. 102-108.

3. Kuznetsova T.V., Schulga A A., Wulfson A.N., Keruchenko J.S., Ermolyuk Y.S., Keruchenko I.D., Tikhonov R.V., Lisitskaya K.V., Makarov A.A., Chobotova K., Khomenkov V.G., Khotchenkov V.P., Popov V.O., Kirpichnikov M.P., Shevelev A.B. Producing luiman mechano growth factor (MGF) in E. coli. Protein Expr. Purif. 2008, 58, P. 70-77.

4. Шевелев А.Б., Хоменков В.Г., Кузнецова T.B., Ковалев Л.И., Лагодная H.B. Создание продуцента миостатина в виде слитого белка с 6His-GFP на основе Е. coli и изучение его иммуногенности. Сборник статей «Медико-биологические технологии повышения работоспособности в условиях напряженных физических нагрузок». Министерство образования и науки Российской Федерации, Москва, 2004, С. 140-150.

5. Суровцева Е.В., Кузнецова Т.В., Шевелев А.Б. Использование рекомбинантной технологии для изучения взаимодействия рецепторов и их лигандов на примере TNF и TNFR1. Тезисы конференции «Перспективные

направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 2005, С. 72.

6. Kuznetsova Т.У., Kukhtenkova E.V., Keruchenko Y.S., Shevelev A.B. Affinity sorbents for extracorporal myostatin hemosorption. // 2nd Eastern European Conference on Rare Diseases and Orphan Drugs "FOSTERING RESEARCH ON RARE DISEASES IN EASTERN EUROPEAN COUNTRIES". Plovdiv, Bulgary, 2006, P. 62.

7. Кузнецова T.B., Кухтенкова E.B., Керученько Я.С., Керученько И.Д., Ковалев Л.И., Шевелев А.Б. Аффинные сорбенты для экстракорпоральной гемосорбции миостатина. Тезисы конференции «Юбилейные научные чтения, посвященные 110-летию со дня рождения проф. H.A. Преображенского». Москва, 2006, С. 32.

Типография МГУ 119991, ГСП-1, Ленинские горы, д 1,стр 15 Заказ № 2293 Тираж 100 экз

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кузнецова, Татьяна Владимировна

1 Введение

2 Обзор литературы

2.1 Активин - фоллистатиновая система регуляции роста и 12 дифференцировки мышц

2.1.1 Миостатип как член семейства активин-подобных белков 13 (TGFfi)

2.1.2 Структура и механизм действия фоллистатина

2.1.3 Ингибины

2.1.4 Передача сигнала активипа

2.2 IGF-соматотропиновая система регуляции роста и 33 дифференцировки мышц

2.2.1 Структура и механизм действия гормона роста - 33 соматотропина

2.2.2 Структура и механизм действия инсулиноподобного 38 фактора роста (IGF)

2.2.3 Механический фактор роста - продукт альтернативной 42 сплайсоформы гена IGF

2.2.4 Исследования взаимодействий фоллистатин- 44 миостатиновой и IGF-I-соматотропиновой систем регуляции роста мышц

2.3 TNF-a как модельный объект для разработки методики 46 получения рекомбинантных факторов роста

2.3.1 Роль TNF-a в защите от инфекционных и онкологических 47 заболеваний

2.3.2 Структурно-функциональная организация TNF-a и его 50 рецепторов

2.3.3 Экспериментальные способы получения TNF-a и 60 тестирование его активности in vivo

2.3.4 Использование колебаний уровня TNF-a для диагностики и 63 особенности тест-систем для выявления TNF-a в биологических жидкостях

2.4 Экспериментальные методы воздействия на систему регуляции роста мышц

2.4.1 Гистологическая структура мышечной ткали и ее 66 свойства в качестве объекта физиологических воздействий

2.4.2 Силовая тренировка и разгрузка

2.4.3 Методы электростимуляции мышц

2.4.4 Фармакологические методы стимуляции мышечной 71 гипертрофии

Материалы и методы

3.1 Генноииженерное конструирование

3.1.1 Выделение плазмидной ДНК (вариант минипреп)

3.1.2 Выделение геномной ДНК из селезенки человека и мыши

3.1.3 Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля

3.1.4 Переосаждение ДНК

3.1.5 Обработка ДНКрестриктазами

3.1.6 Постановка ПЦР

3.1.7 Электрофорез ДНК

3.1.8 Секвенирование ДНК

3.1.9 Сборка конструкцииpTNFa иpTNF short

3.1.10 Сборка конструкцииpT-MGF

3.1.11 Сборка конструкции pQE30-GFP, pQG-FSTN, pUG- 82 proMSTN, pQE-GFP-MSTN

3.2 Культивирование клеток Escherichia coli и первичная 82 переработка биомассы

3.2.1 Поддержание штаммов Е. coli

3.2.2 Трансформация плазмидными конструкциями и 83 поддержание плазмидных продуцентов

3.2.3 Культивирование и первичная переработка биомассы 84 штаммов, продуцирующих рекомбинантный белок в форме тел включения

3.2.4 Культивирование и первичная переработка биомассы 85 штаммов, продуцирующих рекомбинантный белок в растворимой форме

3.3 Физико-химические методы очистки и характеристики 86 рекомбинантных белков

3.3.1 Денатурирующий белковый электрофорез в ПААГ

3.3.2 Методика колориметрического определения содержания 87 белка по модифицированному методу Лоури с бицинхониновой кислотой

3.3.3 Солюбилизация тел включения в денатурирующих 88 условиях

3.3.3.1 Восстановление внутримолекулярных дисульфидных 88 связей при помощи ДТТ

3.3.3.2 Разрыв дисульфидных связей в белках смесью 89 тетратионата и сульфита натрия (сульфитолиз)

3.3.4 Хроматография в денатурирующих условиях

3.3.5 Ренатурация рекомбинантных белков

3.3.5.1 Ренатурация TNF-a

3.3.5.2 Ренатурация MGF

3.3.6 Хроматография в неденатурирующих условиях

3.3.7 Металлоаффинная хроматография

3.3.8 Высокоэффективная жидкостная хроматография

3.3.9 Идентификация белков по первичной структуре методом 93 MALDI-TOF

3.4 Иммунохимические методы характеристики рекомбинантных 93 белков

3.4.1 Получение антител

3.4.2 Твердофазный иммуноферментный анализ

3.4.2.1 Твердофазный иммуноферментный анализ типа 94 «сэндвич» для выявления сывороточного TNF-a

3.4.2.2 Твердофазный иммуноферментный анализ типа 95 «сэндвич» для выявления б-His-GFP-MSTN

3.5 Получение и тестирование аффинных сорбентов для удаления 96 миостатииа

3.6 Исследования биологической активности рекомбинантных 97 белков на культурах клеток эукариот

3.6.1 Цитотоксический тест с TNF-a на клеточной линии L

3.6.2 Тестирование биологической активности MGF по 98 стимулированию пролиферации культивируемых линий нормальных миобластов человека

Результаты и их обсуждение "

4.1 Разработка методической платформы для получения 99 рекомбинантных факторов роста на модели TNF-a человека

4.1.1 Экспрессия гена TNF-a человека в Е. coli

4.1.2 Солюбилизация тел включения, содерэюащих 109 рекомбинантный белок TNF-a

4.1.3 Ионообменная хроматография рекомбинантных белков в 112 денатурирующих условиях

4.1.4 Ренатурация белков in vilro методом разбавления

4.1.5 Ионообменная хроматография рекомбинантных белков в 119 нашивных условиях

4.1.6 Оценка эффективности ренатурации рекомбинантного 121 TNF-a методом определения биологической активности

4.1.7 Разработка твердофазной иммунохимической тест- 125 системы для определения содержания TNF в биологических жидкостях

4.2 Получение механического фактора роста мышц (MGF)

4.2.1 Экспрессионная конструкция pT-MGF для получения MGF 131 в клетках Е. coli

4.2.2 Хроматографическая очистка и биологическая 133 активность MGF

4.3 Получение аффинных сорбентов для удаления миостатина

4.3.1 Получение активин-связывающего домена фоллистатина 142 и пропептида миостатина

4.3.1.1 Получение рекомбинантного продукта конструкции 142 pQG-FSTNl

4.3.1.2 Получение рекомбинантного продукта конструкции 145 р UG-proMSTN

4.3.2 Хроматографическая очистка лигандов миостатина 148 б-His-GFP-FSTN и 6-His-GFP-proMSTN

4.3.3 Иммобилизация 6-His-GFP-proMSTN и б-His-GFP-FSTN на 149 сефарозе 4В

4.3.4 Получение миостатина в виде слитого белка в клетках 150 Е. coli

4.3.5 Определение емкости и спег{ифичности сорбентов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение рекомбинантных факторов роста мышц"

Развитие мышц контролируется как минимум двумя регуляторными системами, которые условно можно назвать миостатин-фоллистатиновая и IGF-соматотропиновая. Ключевыми регуляторными факторами миостатин-фоллистатиновой системы являются миостатин — мощный эндогенный ингибитор роста мышц и его физиологический блокатор фоллистатин. Повышение концентрации миостатина в организме является непосредственной причиной возрастной и наследственных миодистрофий, а генетические дефекты в гене миостатина, напротив, приводят к появлению особей с увеличенной мышечной массой (Lee and McPherron, 2001). Имеющиеся данные свидетельствуют, что снижение уровня миостатина не приводит к нежелательным для здоровья последствиям, поэтому воздействия, направленные на удаление миостатина из организма, могут оказаться перспективными при лечении миодистрофий и в спортивной медицине, а также в зоотехнике. Традиционно для удаления нежелательных факторов из кровотока используется гемосорбция на иммобилизованных антителах. Однако получение антител против миостатина технически невозможно по причине полной инвариантности миостатина у всех позвоночных. В качестве альтернативы антителам могут быть использованы природные лиганды миостатина - фоллистатин или пропептид миостатина, с которыми он формирует прочные нековалентные комплексы.

Инсулиноподобный фактор роста (IGF) и гормон роста (соматотропин) известны в качестве важнейших позитивных регуляторов мышечных волокон. Недавно в поперечно-полосатых мышцах был обнаружен новый продукт гена IGF, который формируется путем альтернативного сплайсинга. Новая изоформа детектируется только в работающих или поврежденных мышцах, поэтому она получила название механического фактора роста MGF (mechano growth factor). С помощью синтетического MGF и техники ДНК-доставки показана уникальная избирательность действия этого фактора на пролиферацию миобластов - клеток-предшественников мышечной ткани

Yang and Goldspink, 2002). Исследования в данном направлении открывают широкие перспективы медикаментозной стимуляции роста мышц, причем высокая избирательность действия MGF обещает отсутствие нежелательных побочных эффектов. Тем не менее, до настоящего времени исследование физиологической роли и возможностей практического применения MGF ограничено отсутствием рекомбинантных продуцентов этого фактора.

В качестве модельного объекта для разработки схемы получения рекомбинантных ростовых факторов и их блокаторов был выбран TNF-a (tumor necrosis factor а). Данный выбор обусловлен наличием плазмидной экспрессионной конструкции с геном TNF-a и стандартного метода исследования физиологической активности на клеточной линии L-929.

Цель и" задачи исследования. Целью работы было создание современной и максимально универсальной схемы получения рекомбинантных факторов роста мышц при помощи экспрессии в Е. coli, оценка нативности пространственной структуры и естественной физиологической активности полученных препаратов.

В число поставленных задач входило:

- на примере модельного объекта TNF-a разработать унифицированную схему рекомбинантной продукции и ренатурации белков, не обладающих ферментативной активностью;

- разработать дизайн рекомбинантных продуцентов факторов роста мышц - MGF, MSTN, пропептида MSTN, MSTN-связывающего домена FSTN;

- разработать системы очистки, ренатурации, оценки функциональной активности полученных рекомбинантных белков in vitro и in vivo;

- получить аффинные сорбенты на основе FSTN и пропептида MSTN для удаления избытка миостатина из крови больных миодистрофией, охарактеризовать емкость и специфичность сорбентов.

2 Обзор литературы

В представленном ниже обзоре литературы основное внимание уделено фундаментальным проблемам регуляции роста, развития, ремоделирования и деградации мышц. В частности, уделяется внимание организации и взаимодействию двух систем регуляции роста мышц: миостатин - фоллистатиновой и IGF-соматотропиновой. В основе рассматриваемых моделей лежат данные, полученные при помощи всех возможных современных методов исследования: молекулярное моделирование лиганд-рецепторных взаимодействий, клеточные модели in vitro, физиологические эксперименты на животных и человеке, транскриптомный анализ и популяционно-генетические исследования.

На примере фактора некроза опухолей рассматриваются методологические проблемы получения и тестирования структурной аутентичности и физиологической активности факторов роста мышц, в том числе ранее не охарактеризованных. В заключение дается обзор методов физиологического воздействия на мышцы в экспериментальных условиях, в частности, животные модули с нарушенными и введенными генами, различные способы доставки ростовых факторов (в том числе, ДНК-доставка), электрическая стимуляция, силовая тренировка и разгрузка.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Кузнецова, Татьяна Владимировна

6 Выводы

1. По результатам исследований модельного белка ЮТ-а разработана универсальная платформа, состоящая из четырех альтернативных схем и обеспечивающая получение в физиологически активной форме ранее не исследовавшихся факторов роста мышц.

2. На примере механического фактора роста (МОР) доказана эффективность схемы «Прямая ренату рация». Впервые получен препарат полноразмерного биологически активного белка.

3. На примере зрелого миостатина человека доказана эффективность схемы «Экспрессия в нативной форме». За счет использования в качестве трансляционного тага зеленого флуоресцентного белка впервые получен бактериальный продуцент, синтезирующий миостатин непосредственно в нативной конформации.

4. На примере пропетида миостатина человека и МЭТИ-связывающего домена фоллистатина доказана применимость схем «Парная экспрессия» и «Природный лиганд и рекомбинантный рецептор».

5. Впервые созданы аффинные сорбенты на основе иммобилизованного фоллистатина и пропептида миостатина, пригодные для удаления избытка миостатина из крови больных миодистрофией.

5 Заключение

По результатам проведенной работы мы предложили и на ряде примеров доказали практическую применимость методической платформы, позволяющей получать ранее не исследовавшиеся ростовые факторы в нативной форме последовательным или параллельным применением четырех схем:

1-я схема «Прямая ренатурация» включает в себя два способа разрыва дисульфидных связей, хроматографию в денатурирующих условиях, сочетание нескольких методов тестирования выхода ренатурации. Применимость схемы ограничена белками с небольшим числом дисульфидных связей, не склонных к агрегации. Ее преимуществом является простота и стандартность используемых приемов, возможность получения высокоочищенного препарата в короткий срок.

2-я схема «Экспрессия в нативной форме» основана на использовании белков-тагов. Конкретным вкладом нашей работы в разработку этой схемы является введение в практику препаративной биотехнологии зеленого флуоресцентного белка, несущего на N-конце гексагистидиновый таг. Бифункциональные белки, содержащие эту модификацию GFP в качестве N-концевого компонента, могут синтезироваться клетками Е. coli с высоким выходом, не образуя тел включения. Процедура очистки таких белков облегчается возможностью визуального наблюдения за распределением целевого продукта между фракциями. Ранее GFP использовался преимущественно для прижизненного маркирования субклеточных структур и не применялся при создании рекомбинантных продуцентов биоактивных белков и пептидов. Преимущество схемы - исключение слабо стандартизуемой стадии ренатурации и тестирования нативности продукта.

3-я схема «Парная экспрессия» включает в себя получение рекомбинантной пары «лиганд - растворимый рецептор» с последующей иммобилизацией одной составляющей на носителе. Универсальность этой схемы обусловлена тем, что каждый ростовой фактор имеет один или более рецепторов, передающих сигнал внутрь клетки-реципиента. Высокая консервативность позволяет находить в последовательностях геномов гены рецепторов даже тех ростовых факторов, биохимические исследования которых не проводились. Данная схема может быть пригодна для получения как самого ростового фактора, так и связывающего домена его рецептора в препаративных количествах.

4-я схема получения новых ростовых факторов «Природный лиганд и рекомбинантный рецептор» основана на иммобилизации на носителе в денатурирующих условиях одной из составляющих пары «лиганд -растворимый рецептор», полученной при помощи рекомбинантной экспрессии. Этот подход к ренатурации экстраклеточных доменов рецепторов может рассматриваться как наиболее универсальный, поскольку он полностью исключает агрегацию белка при удалении денатуранта вне зависимости от его физико-химических свойств. Второй компонент пары «лиганд-рецептор» может быть очищен с помощью аффинной хроматографии биологических жидкостей на синтезированном сорбенте.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кузнецова, Татьяна Владимировна, Москва

1. Aggarwal В.В., Kohr W.J., Hass P.E., Moffat В., Spencer S.A., Henzel W.J., Bringman T.S., Nedwin G.E., Goeddel D.V., Harkins R.N. Human tumor necrosis factor. Production, purification, and characterization. J Biol Chem. 260(4):2345-2354, 1985

2. Aktas O., Prozorovski Т., Zipp F. Death ligands and autoimmune demyelination. Neuroscientist. 12(4):305-316, 2006

3. Anderson N.G. Growth hormone activates mitogen-activated protein kinase and S6 kinase and promotes intracellular tyrosine phosphorylation in 3T3-F442A preadipocytes. Biochem J. 284:649-652, 1992

4. Ashkenazi A., Dixit V.M. Death receptors: signaling and modulation. Science. 281(5381):1305-1308, 1998

5. Athenaes//Protein refolding manual: http: //www.athenaes.com/ ProteinRefPDF.pdf

6. Bailey J.L., Cole R.D. Studies on the reaction of sulfite with proteins. J Biol Chem. 234(7):1733-1739, 1959

7. Baker J., Liu J.P., Robertson E.J., Efstratiadis A. Role of insulin-like growth factors in embryonic and postnatal growth. Cell. 75(l):73-82, 1993

8. Banner D.W., D'Arcy A., Janes W., Gentz R., Schoenfeld H.J., Broger C., Loetscher H., Lesslauer W. Crystal structure of the soluble human 55 kd TNF receptor-human TNF beta complex: implications for TNF receptor activation. Cell. 73(3):431-445, 1993

9. Beutler B.A., Milsark I.W., Cerami A.J. Cachectin/tumor necrosis factor: production, distribution, and metabolic fate in vivo. J Immunol. 135(6):3972-3977, 1985

10. Bilezikjian L.M., Corrigan A.Z., Blount A.L., Chen Y., Vale W.W. Regulation and actions of Smad7 in the modulation of activin, inhibin, and transforming growth factor-beta signaling in anterior pituitary cells. Endocrinology. 142(3):1065-1072, 2001

11. Brojatsch J., Naughton J., Rolls M.M., Zingler K., Young J.A. CAR1, a TNFR-related protein, is a cellular receptor for cytopathic avian leukosis-sarcoma viruses and mediates apoptosis. Cell. 87(5):845-855, 1996

12. Campbell G.S., Pang L., Miyasaka T., Saltiel A.R., Carter-Su C. Stimulation by growth hormone of MAP kinase activity in 3T3-F442A fibroblasts. J Biol Chem. 267(9):6074-6080, 1992

13. Carbo N., Busquets S., van Royen M., Alvarez В., Lopez-Soriano F.J., Argiles J.M. TNF-a is involved in activating DNA fragmentation in skeletal muscle. Br J Cancer. 86(6): 1012-1016, 2002

14. Carter-Su C., Schwartz J., Smit L.S. Molecular mechanism of growth hormone action. Annu Rev Physiol. 58:187-207, 1996

15. Carter-Su C., Smit L.S. Signaling via JAK tyrosine kinases: growth hormone receptor as a model system. Recent Prog Horm Res.53:61-82; discussion 82-83, 1998

16. Cerletti N., McMaster G.K., Cox D Shmitz A., Mayback B. Nowel process for the production of biologically active dimeric protein. Патент WO/1996/003432, 1996

17. Chan W. A method for the complete S sulfonation of cysteine residues in proteins. Biochemistry. 7(12):4247-4254, 1968

18. Charge S.B., Rudnicki M.A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Ref. 84(l):209-238, 2004

19. Cho B.N., McMullen M.L., Pei L., Yates C.J., Mayo K.E. Reproductive deficiencies in transgenic mice expressing the rat inhibin alpha-subunit gene. Endocrinology. 142(1l):4994-5004, 2001

20. Chong H., Pangas S.A., Bernard D.J., Wang E., Gitch J., Chen W., Draper L.B., Cox E.T., Woodruff T.K. Structure and expression of a membrane component of the inhibin receptor system. Endocrinology. 141(7):2600-2607, 2000

21. Coerver K.A., Woodruff T.K., Finegold M.J., Mather J., Bradley A., Matzuk M.M. Activin signaling through activin receptor type II causes the cachexia-like symptoms in inhibin-deficient mice. Mol Endocrinol. 10(5):534-543, 1996

22. Cooper R.N., Tajbakhsh S., Mouly V., Cossu G., Buckingham M., ButlerBrowne G.S. In vivo satellite cell activation via Myf5 and MyoD in regenerating mouse skeletal muscle. J Cell Sci. 112: 2895-2901, 1999

23. Cowley D.J., Mackin R.B. Expression, purification and characterisation of recombinant human proinsulin. FEBS Lett. 402(2-3):124-130, 1997

24. Cross D.A., Alessi D.R., Cohen P., Andjelkovich M., Hemmings B.A. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by insulin mediated by protein kinase B. Nature. 378(6559):785-789, 1995

25. Darzynkiewicz Z., Williamson B., Carswell E.A., Old L.J. Cell cycle-specific effects of tumor necrosis factor. Cancer Res. 44(l):83-90, 1984

26. De Paolo L.V. Inhibins, activins, and follistatins: the saga continues. Proc Soc Exp Biol Med. 214(4):328-339, 1997

27. De Paolo L.V., Bicsak T.A., Erickson G.F., Shimasaki S., Ling N. Follistatin and activin: a potential intrinsic regulatory system within diverse tissues. Proc Soc Exp Biol Med. 198(1):500-512, 1991

28. Dedieu S., Dourdin N., Dargelos E., Poussard S., Veschambre P., Cottin P., Brustis J.J. Calpain and myogenesis: development of a convenient cell culture model. Biol Cell. 94(2): 65-76, 2002

29. Dull T.J., Gray A., Hayflick J.S., Ullrich A. Insulin-like growth factor II precursor gene organization in relation to insulin gene family. Nature. 310(5980):777-781, 1984

30. Eck M.J., Beutler B., Kuo G., Merryweather J.P., Sprang S.R. Crystallization of trimeric recombinant human tumor necrosis factor (cachectin). J Biol Chem. 263(26):12816-12819, 1988

31. Eck M.J., Sprang S.R. The structure of tumor necrosis factor-alpha at 2.6 A resolution. Implications for receptor binding. J Biol Chem. 264(29): 17595-17605, 1989

32. Erkut Z.A., Endert E., Huitinga I., Swaab D.F. Cortisol is increased in postmortem cerebrospinal fluid of multiple sclerosis patients: relationship with cytokines and sepsis. Mult Scler. 8(3):229-36, 2002

33. Florini J.R., Ewton D.Z., Coolican S.A. Growth hormone and the insulinlike growth factor system in myogenesis. Endocr Rev. 17(5):481-517, 1996

34. Gaddy-Kurten D., Tsuchida K., Vale W. Activins and the receptor serine kinase superfamily. Recent progress in hormone research. 50:109-129, 1994

35. Gaunt T.R., Cooper J.A., Miller G.J., Day I.N., O'Dell S.D. Positive associations between single nucleotide polymorphisms in the IGF2 gene region and body mass index in adult males. Hum Mol Genet. 10(14): 1491-501,2001

36. Ghezzi P., Cerami A. Tumor necrosis factor as a pharmacological target. Mol Biotechnol. 31(3):239-244, 2005

37. Glass D.J. Signalling pathways that mediate skeletal muscle hypertrophy and atrophy. Nat Cell Biol. 5(2):87-90, 2003

38. Goldspink G, Jonnson I. Use of the insulin-like-growth factor I isoform MGF for the treatment of neurological disorders, патент W0/2001/036483, 2001

39. Goldspink G. Cloning of local growth factors involved in the determination of muscle mass. Br J Sports Med. 34(3): 159-160, 2000

40. Goldspink G. Muscle growth and muscle function: a molecular biological perspective. Res Vet Sci. 60(3): 193-204, 1996

41. Gray P.C., Greenwald J., Blount A.L., Kunitake K.S., Donaldson C.J., Choe S., Vale W. Identification of a binding site on the type II activin receptor for activin and inhibin. J Biol Chem. 275(5):3206-3212, 2000

42. Grounds M.D., White J.D., Rosenthal N., Bogoyevitch M.A. The role of stem cells in skeletal and cardiac muscle repair. J Histochem Cytochem 50(5): 589-610, 2002

43. Guo Q., Kumar T.R., Woodruff T., Hadsell L.A., DeMayo F.J., Matzuk M.M. Overexpression of mouse follistatin causes reproductive defects in transgenic mice. Mol Endocrinol. 12(1):96-106, 1998

44. Harrington A.E., Morris-Triggs S.A., Ruotolo B.T., Robinson C.V., Ohnuma S., Hyvonen M. Structural basis for the inhibition of activin signalling by follistatin. EMBO J. 25(5): 1035-10345, 2006

45. Hejnaes K.R., Bayne S., Norskov L., Sorensen H.H., Thomsen J., Schaffer L., Wollmer A., Skriver L. Development of an optimized refolding process for recombinant Ala-Glu-IGF-1. Protein Eng. 5(8):797-806, 1992

46. Hill J.J., Davies M.V., Pearson A.A., Wang J.H., Hewick R.M., Wolfman N.M., Qiu Y. The myostatin propeptide and the follistatin-related gene are inhibitory binding proteins of myostatin in normal serum. J Biol Chem. 277(43):40735-40741, 2002

47. Hjalmarsson S., Akesson R. Morden Kjeldahl procedure. Int. Laboratory 3. 70-76, 1983

48. Holt R.I., Simpson H.L., Sonksen P.H. The role of the growth hormone-insulin-like growth factor axis in glucose homeostasis. Diabet Med. 20(1 ):3-15,2003.

49. Huang H., Potter C.J., Tao W., Li D.M., Brogiolo W., Hafen E., Sun H., Xu T. PTEN affects cell size, cell proliferation and apoptosis during Drosophila eye development. Development. 126(23):5365-5372, 1999

50. Huet C., Li Z.F., Liu H.Z., Black R.A., Galliano M.F., Engvall E. Skeletal muscle cell hypertrophy induced by inhibitors of metalloproteases; myostatin as a potential mediator. Am J Physiol Cell Physiol. 281(5):C1624-1634, 2001

51. Ji S., Losinski R.L., Cornelius S.G., Frank G.R., Willis G.M., Gerrard D.E., Depreux F.F., Spurlock M.E. Myostatin expression in porcine tissues: tissue specificity and developmental and postnatal regulation. Am J Physiol. 275(4 Pt 2):R1265-1273, 1998

52. Jin H.J., Dunn M.A., Borthakur D., Kim Y.S. Refolding and purification of unprocessed porcine myostatin expressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 35(1):1-10, 2004

53. Kastner S., Elias M.C., Rivera A.J., Yablonka-Reuveni Z. Gene expression patterns of the fibroblast growth factors and their receptors during myogenesis of rat satellite cells. J Histochem Cytochem. 48(8): 1079-1096, 2000

54. Kaufmann U., Martin B., Link D., Witt K., Zeitler R., Reinhard S., Starzinski-Powitz A. M-cadherin and its sisters in development of striated muscle. Cell Tissue Res. 296(1): 191-198, 1999

55. Kirk S., Oldham J., Kambadur R., Sharma M., Dobbie P., Bass J. Myostatin regulation during skeletal muscle regeneration. J Cell Physiol. 184(3):356-363, 2000

56. Klein R., Clarke I.J., Hedger M.P., Robertson D.M. Plasma follistatin concentrations increase following lipopolysaccharide administration in sheep. Clin Exp Pharmacol Physiol. 23(8):754-755, 1996

57. Kocamis H., Killefer J. Myostatin expression and possible functions in animal muscle growth. Domest Anim Endocrinol. 23(4):447-454, 2002

58. Kramer S.M., Carver M.E. Serum-free in vitro bioassay for the detection of tumor necrosis factor. J Immunol Methods. 93 (2):201-206, 1986

59. Le Roith D., Bondy C., Yakar S., Liu J.L., Butler A. The somatomedin hypothesis: 2001. Endocr Rev. 22(l):53-74, 2001

60. Lee S.J., McPherron A.C. Regulation of myostatin activity and muscle growth. Proc Natl Acad Sci USA. 98(16):9306-9311, 2001

61. Lefaucheur J., Sebille A. Muscle regeneration following injury can be modified in vivo by immune neutralization of basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta 1 or insulinlike growth factor I. J Neuroimmunol. 57(1-2): 85-91, 1995

62. Lewis K.A., Gray P.C., Blount A.L., MacConell L.A., Wiater E., Bilezikjian L.M., Vale W. Betaglycan binds inhibin and can mediate functional antagonism of activin signaling. Nature. 404(6776):411-414, 2000

63. Li M.D., DePaolo L.V., Ford JJ. Expression of follistatin and inhibin/activin subunit genes in porcine follicles. Biol Reprod. 57(1): 112111, 1997

64. Liu F., Pouponnot C., Massague J. Dual role of the Smad4/DPC4 tumor suppressor in TGFbeta-inducible transcriptional complexes. Genes Dev. 11(23):3157-3167, 1997

65. Liu J.P., Baker J., Perkins A.S., Robertson E.J., Efstratiadis A. Mice carrying null mutations of the genes encoding insulin-like growth factor I (Igf-1) and type 1 IGF receptor (Igflr). Cell. 75(l):59-72, 1993

66. Marcell T.J., Harman S.M., Urban R.J., Metz D.D., Rodgers B.D., Blackman M.R. Comparison of GH, IGF-I, and testosterone with mRNA ofreceptors and myostatin in skeletal muscle in older men. Am J Physiol Endocrinol Metab. 281(6):E1159-1164, 2001

67. Martino G., Consiglio A., Franciotta D.M., Corti A., Filippi M., Vandenbroeck K., Sciacca F.L., Comi G., Grimaldi L.M. Tumor necrosis factor alpha and its receptors in relapsing-remitting multiple sclerosis. J Neurol Sci. 152(1):51-61, 1997

68. Massague J. How cells read TGF-beta signals. Nat Rev Mol Cell Biol. 1(3): 169-178, 2000

69. Massague J. The transforming growth factor-beta family. Annu Rev Cell Biol. 6:597-641, 1990

70. Massague J., Chen Y.G. Controlling TGF-beta signaling. Genes Dev. 14(6):627-644, 2000

71. Massague J., Wotton D. Transcriptional control by the TGF-beta/Smad signaling system. EMBO J. 19(8): 1745-1754, 2000

72. Mather J.P., Moore A., Li R.H. Activins, inhibins, and follistatins: further thoughts on a growing family of regulators. Proc Soc Exp Biol Med. 215(3):209-222, 1997

73. Mather J.P., Woodruff T.K., Krummen L.A. Paracrine regulation of reproductive function by inhibin and activin. Proc Soc Exp Biol Med. 201(1): 1-15, 1992

74. Mathews L.S., Vale W.W. Expression cloning of an activin receptor, a predicted transmembrane serine kinase. Cell. 65(6):973-982, 1991

75. Matzuk M.M., Finegold M.J., Su J.G., Hsueh A.J., Bradley A. Alpha-inhibin is a tumour-suppressor gene with gonadal specificity in mice. Nature. 360(6402):313-319, 1992

76. Matzuk M.M., Kumar T.R., Bradley A. Different phenotypes for mice deficient in either activins or activin receptor type II. Nature. 374(6520):356-360, 1995b

77. Matzuk M.M., Lu N., Vogel H., Sellheyer K., Roop D.R., Bradley A. Multiple defects and perinatal death in mice deficient in follistatin. Nature. 374(6520):360-363, 1995a

78. McMullen M.L., Cho B.N., Yates C.J., Mayo K.E. Gonadal pathologies in transgenic mice expressing the rat inhibin alpha-subunit. Endocrinology. 142(11):5005-5014, 2001

79. McPherron A.C., Lee S.J. Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene. Proc Natl Acad Sci USA. 94(23): 12457-12461, 1997

80. Michel U., Farnworth P., Findlay J.K. Follistatins: more than follicle-stimulating hormone suppressing proteins. Mol Cell Endocrinol. 91(1-2):1-11, 1993

81. Miller K.J., Thaloor D., Matteson S., Pavlath G.K. Hepatocyte growth factor affects satellite cell activation and differentiation in regenerating skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol. 278(1): 174-181, 2000

82. Morton C.C., Byers M.G., Nakai H., Bell G.I., Shows T.B. Human genes for insulin-like growth factors I and II and epidermal growth factor are located on 12q22-q24.1, llpl5, and 4q25-q27, respectively. Cytogenet Cell Genet. 41 (4):245-249, 1986

83. Naismith J.H., Devine T.Q., Brandhuber B.J., Sprang S.R. Crystallographic evidence for dimerization of unliganded tumor necrosis factor receptor. J Biol Chem. 270(22):13303-13307, 1995

84. Nilsson K, Mosbach K. Immobilization of enzymes and affinity ligands to various hydroxyl group carrying supports using highly reactive sulfonyl chlorides. Biochem Biophys Res Commun. 102(1): 449-457, 1981

85. Patrick J.S., Lagu, A.L. Determination of recombinant human proinsulin fusion protein produced in Escherichia coli using oxidative sulfitolysis and two-dimensional HPLC. Anal Chem. 64(5):507-511, 1992

86. Phillips D.J., de Kretser D.M. Follistatin: a multifunctional regulatory protein. Front Neuroendocrinol. 19(4):287-322, 1998

87. Piek E., Heldin C.H., Ten Dijke P. Specificity, diversity, and regulation in TGF-beta superfamily signaling. FASEB J. 13(15):2105-2124, 1999

88. Radaelli G., Rowlerson A., Mascarello F., Patruno M., Funkenstein B. Myostatin precursor is present in several tissues in teleost fish: a comparative immunolocalization study. Cell Tissue Res. 311(2):239-250, 2003

89. Reed C., Fu Z.Q., Wu J., Xue Y.N., Harrison R.W., Chen M.J., Weber I.T. Crystal structure of TNF-alpha mutant R31D with greater affinity for receptor R1 compared with R2. Protein Eng. 10(10): 1101-1107, 1997

90. Robertson T.A., Maley M.A., Grounds M.D., Papadimitriou J.M. The role of macrophages in skeletal muscle regeneration with particular reference to chemotaxis. Exp Cell Res 207(2): 321-331, 1993

91. Rotwein P., Pollock K.M., Didier D.K., Krivi G.G. Organization and sequence of the human insulin-like growth factor I gene. Alternative RNA processing produces two insulin-like growth factor I precursor peptides. J Biol Chem. 261(11):4828-4832, 1986

92. Salmon W.D., Daughaday W.H. A hormonally controlled serum factor which stimulates sulfate incorporation by cartilage in vitro. J Lab Clin Med. 49:825-826, 1957

93. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory press. New York. 1989

94. Schmalbruch H., Lewis DM. Dynamics of nuclei of muscle fibers and connective tissue cells in normal and denervated rat muscles. Muscle Nerve. 23(4): 617-626, 2000

95. Schnapp J, Shalitin Y. Immobilization of enzymes by covalent binding to amine supports via cyanogen bromide activation. Biochem Biophys Res Commun. 70(1):8-14, 1976

96. Schulze-Osthoff K., Ferrari D., Los M., Wesselborg S., Peter M.E. Apoptosis signaling by death receptors. Eur. J. Biochem. 254(3):439-459, 1998

97. Scott K.A., Moore R.J., Arnott C.H., East N., Thompson R.G., Scallon B.J., Shealy D.J., Balkwill F.R. An anti-tumor necrosis factor-a antibody inhibits the development of experimental skin tumors. Mol Cancer Ther. 2(5):445-451,2003

98. Setareh M., Schwarz H., Lotz M. A mRNA variant encoding a soluble form of 4-IBB, a member of the murine NGF/TNF receptor family. Gene. 164(2):311-315, 1995

99. Shimasaki S., Koga M., Esch F., Cooksey K., Mercado M., Koba A., Ueno N., Ying S.Y., Ling N., Guillemin R. Primary structure of the human follistatin precursor and its genomic organization. Proc Natl Acad Sci U S A. 85(12):4218-4222, 1988

100. Sidhu R.S., Bollon A.P. Tumor necrosis factor analogs: identification of functional domains. Anticancer Res. 9(6):1569-1576, 1989

101. Sidis Y., Schneyer A.L., Sluss P.M., Johnson L.N., Keutmann H.T. Follistatin: essential role for the N-terminal domain in activin binding and neutralization. J Biol Chem. 276(21): 17718-17726, 2001

102. Smith C.A., Farrah T., Goodwin R.G. The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: activation, costimulation, and death. Cell. 76(6):959-962, 1994

103. Snow M.H. An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats. Cell Tissue Res. 186(3): 535-540, 1978

104. Sorichter S., Mair J., Koller A., Muller E., Kremser C., Judmaier W., Haid C., Calzolari C., Puschendorf B. Creatine kinase, myosin heavy chains and magnetic resonance imaging after eccentric exercise. J Sports Sci. 19(9): 687-691,2001

105. Souza S.C., Frick G.P., Yip R., Lobo R.B., Tai L.R., Goodman H.M. Growth hormone stimulates tyrosine phosphorylation of insulin receptor substrate-1. J Biol Chem. 269(48):30085-30088, 1994

106. Spangenburg E.E., Booth F.W. Multiple signaling pathways mediate LIF-induced skeletal muscle satellite cell proliferation. Am J Physiol Cell Physiol. 283(1):204-211, 2002

107. Sporn M.B., Roberts A.B. TGF-beta: problems and prospects. Cell Regul. l(12):875-882, 1990

108. Stallings-Mann M.L., Ludwiczak R.L., Klinger K.W., Rottman F. Alternative splicing of exon 3 of the human growth hormone receptor is the result of an unusual genetic polymorphism. Proc Natl Acad Sci USA. 93(22): 12394-12399, 1996

109. Stambolic V., Suzuki A., de la Pompa J.L., Brothers G.M., Mirtsos C., Sasaki T., Ruland J., Penninger J.M., Siderovski D.P., Mak T.W. Negative regulation of PKB/Akt-dependent cell survival by the tumor suppressor PTEN. Cell. 95(l):29-39, 1998

110. Stiles B., Gilman V., Khanzenzon N., Lesche R., Li A., Qiao R., Liu X., Wu H. Essential role of AKT-l/protein kinase B alpha in PTEN-controlled tumorigenesis. Mol Cell Biol. 22(11):3842-3851, 2002

111. Strongin A.Y., Collier I., Bannikov G., Marmer B.L., Grant G.A., Goldberg G.I. Mechanism of cell surface activation of 72-kDa type IV collagenase. Isolation of the activated form of the membrane metalloprotease. J Biol Chem. 270(10):5331-5338, 1995

112. Takahashi A., Kureishi Y., Yang J., Luo Z., Guo K., Mukhopadhyay D., Ivashchenko Y., Branellec D., Walsh K. Myogenic Akt signaling regulates blood vessel recruitment during myofiber growth. Mol Cell Biol. 22(13):4803-4814, 2002

113. Takeda K., Akira S. STAT family of transcription factors in cytokine-mediated biological responses Cytokine Growth Factor Rev. 11(3): 199-207, 2000

114. Tartaglia L.A., Ayres T.M., Wong G.H., Goeddel D.V. A novel domain within the 55 kd TNF receptor signals cell death. Cell. 74(5):845-853, 1993

115. Thies R.S., Chen T., Davies M.V., Tomkinson K.N., Pearson A.A., Shakey Q.A., Wolfman N.M. GDF-8 propeptide binds to GDF-8 and antagonizes biological activity by inhibiting GDF-8 receptor binding. Growth Factors. 18(4):251-259, 2001

116. Tortoriello D.V., Sidis Y., Holtzman D.A., Holmes W.E., Schneyer A.L. Human follistatin-related protein: a structural homologue of follistatin with nuclear localization. Endocrinology. 142(8):3426-3434, 2001

117. Tsuchida K., Arai K.Y., Kuramoto Y., Yamakawa N., Hasegawa Y., Sugino H. Identification and characterization of a novel follistatin-like protein as a binding protein for the TGF-beta family. J Biol Chem. 275(52):40788-40796, 2000

118. Wada M.R., Inagawa-Ogashiwa M., Shimizu S., Yasumoto S., Hashimoto N. Generation of different fates from multipotent muscle stem cells. Development. 129(12): 2987-2995, 2002

119. Walsh S., Metter E.J., Ferrucci L., Roth S.M. Activin-type II receptor B (ACVR2B) and follistatin haplotype associations with muscle mass and strength in humans. J Appl Physiol. 102(6):2142-2148, 2007

120. Welt C., Sidis Y., Keutmann H., Schneyer A. Activins, inhibins, and follistatins: from endocrinology to signaling. A paradigm for the new millennium. Exp Biol Med (Maywood). 227(9):724-752, 2002

121. White J.D., Bower J.J., Kurek J.B., Austin L. Leukemia inhibitory factor enhances regeneration in skeletal muscles after myoblast transplantation. Muscle Nerve. 24(5): 695-697, 2001

122. Wildbaum G., Youssef S., Karin N. A targeted DNA vaccine auguments the natural immune response to self TNF- a and suppresses ongoing adjuvant arthritis. J Immunol. 165(10):5860-5866, 2000

123. Wolfman N.M., McPherron C., Pappano W.N., Davies M.V., Song K., Tomkinson K.N., Wright J.F., Zhao L., Sebald S.M., Greenspan D.S., Lee

124. S.J. Activation of latent myostatin by the BMP-l/tolloid family of metalloproteinases. Proc Natl Acad Sci USA. 100(26): 15842-15846, 2003

125. Yang J., Ratovitski Т., Brady J.P., Solomon M.B., Wells K.D., Wall R.J. Expression of myostatin pro domain results in muscular transgenic mice. Mol ReprodDev. 60(3):351-361, 2001

126. Yang S., Alnaqeeb M., Simpson H., Goldspink G. Cloning and characterization of an IGF-1 isoform expressed in skeletal muscle subjected to stretch. J Muscle Res Cell Motil. 17(4):487-95, 1996

127. Yang S.Y., Goldspink G. Different roles of the IGF-I Ec peptide (MGF) and mature IGF-I in myoblast proliferation and differentiation. FEBS Lett. 522(1-3):156-160, 2002

128. Кэролл С.Б., Логон А. Получение и очистка поликлональных антител к гетерологичным фрагментам гибридных белков, содержаих Р-галактазидазу. Новое в клонировании ДНК. Методы. Мир, 1989

129. Мальцев К.В., Вульфсон А.Н., Иванов В.Т. Метод получения проинсулина человека. Патент РФ № 2045535, 1995

130. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. Наука. 2000

131. Суровцева Е.В., Кузнецова Т.В., Хоменков В.Г., Домогатский С.П. Создание нового штамма-продуцента фактора некроза опухолей человека на основе Е. coli. Биоорг. хим. 31(5):474-481, 2005

132. Шингарова Л.Н., Сагайдак Л.Н., Турецкая Р.Л., Недоспасов С.А., Есипов Д.С., Коробко В.Г. Мутанты фактора некроза опухолей человека: получение и некоторые свойства. Биоорг. хим. 22(4):243-251, 19968 Благодарности

133. Автор выражает признательность руководству ФЦП «Повышение работоспособности мышц в экстремальных условиях» за предоставленное материальное обеспечение экспериментов.