Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение островковых плёнок золота для высокочувствительного иммуноанализа

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Получение островковых плёнок золота для высокочувствительного иммуноанализа"

2549

» * ■ ' і ••• > /"Сс..*..

Яа правах рукописи

ч

ПЕСТОВСКИЙ ЮРИЙ СЕРГЕЕВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ ОСТРОВКОВЫХ ПЛЁНОК ЗОЛОТА ДЛЯ ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО ИММУНОАНАЛИЗА

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -2011

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Курочкин И.Н.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Швядас В.К. доктор биологических наук, профессор Свешников П.Г.

Ведущая организация: Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН

Защита состоится «¿У"» декабря 2011 года в 1500 час на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 25 ноября 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук Сакодынская И.К.

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА 2011

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) обладает очень высокой чувствительностью и в ряде случаев позволяет обнаруживать одиночные молекулы' Получение конъюгатов антител с ГКР-активными наноструктурами привело к возникновению нового типа иммуноанализа, который на несколько порядков превосходит по чувствительности широко применяемый в настоящее время иммуноферментный анализ. Данное обстоятельство имеет особую важность в связи с тем, что большинство белков плазмы крови присутствуют в очень низких концентрациях. Следовательно, с увеличением чувствительности метода круг определяемых белков значительно расширяется2 Кроме того, разведение исходных биологических образцов приводит к уменьшению вклада неспецифических взаимодействий и влияния интерферентов. В последние годы также наблюдается тенденция использования спектроскопии ГКР для визуализации конъюгатов наночастиц с антителами в живых тканях3, что открывает перспективы их дальнейшего использования для направленной фототермической терапии'1 Таким образом, актуальность задач, связанных с созданием и оптимизацией условий для реализации максимально возможных факторов усиления ГКР, не вызывает сомнений.

Существует возможность многократного увеличения сигнала красителя в спектре ГКР путем агрегации наночастиц, на поверхности которых он иммобилизован. Недостатком такого подхода является увеличение погрешности получаемых результатов, поскольку агрегация наночастиц представляет собой статистический процесс. Поэтому область применения такого подхода в основном ограничивается качественным анализом.

Другая возможность увеличения сигнала в спектре ГКР связана с оптимизацией размера наночастиц. Например, для золотых наночастиц оптимальный размер составляет около 50 нм5 Широко распространенным методом увеличения размеров наночастиц является автометаллография осаждение металла на поверхности наночастиц путем восстановления его ионов. Существует также метод, основанный на ферментативной генерации восстановителя и называемый ферментативной

1 C.R. Yonzon, D. A. Stuart, X. Zhang, A.D. McFarlard, C.L. Haynes, R.P. Van Duyne. Towards advanced chemical and biological interactions // Talanta, Nanoscience and Nanotcchnology. - 2005. -V.67(3) - P.438-448.

2 A.I. Archakov, Y.D. Ivanov, A.V. Lisi Isa, V.G. Zgoda. A FM fishing nanotechnology is the way ta reverse the Avogadro number in proteomics // Proteomics. - 2007. - V. 7. - P. 4-9.

3 K.K. Maiti, U.S. Dinish, C.Y. Fu, J-J. Lee, K.-S. Soh, S.-W. Yun, R. Bhuvanesvari, M. Olivo, Y.-T. Chang.

Development of biocompatible SERS nanoiag with increased stability by chemisorption of reporter molecule Jar in vivo cancer detection II Biosensors and Bioelectronics. - 2010. - V.26. - P. 398-403.

A Л.А. Дыкман, В.А. Богатырев. Ианочастицы золота: получение, функционалиэация, использование я биохимии и иммунохимии // Успехи химии. - 2007. - Т. 76. - №2. - С. 199-213.

металлографией, позволяющий расширить возможности получения наночастиц оптимального размера.

Для дополнительного увеличения фактора усиления в последнее время используют плазмонный резонанс с применением островковых пленок. Специально оптимизированные плазмонные подложки позволяют увеличить интенсивность электромагнитного поля на несколько порядков. Так как сигнал комбинационного рассеяния пропорционален четвертой степени интенсивности локального электромагнитного поля, он потенциально может быть усилен в сто и более миллионов раз6 Иммобилизация золотых наночастиц с последующим проведением автометаллографии позволяет создавать островковые пленки, не прибегая к напылению золота, представляющему собой высокотехнологичный процесс, осуществление которого в больших масштабах затруднительно.

Цель работы заключалась в исследовании возможности применения автометаллографии для получения золотых наночастиц оптимального размера и островковых пленок золота, а также в демонстрации применимости полученных результатов в высокочувствительном иммуноанализе на примере определения приона. Прноны - это белковые патогены, вызывающие ряд неизлечимых в настоящее время заболеваний центральной нервной системы человека и животных7 Создание высокочувствительных методов определения прионов необходимо для их ранней диагностики выявления зараженных биоматериалов, что может ограничить их распространение.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Исследование процесса агрегации золотых наночастиц полиэлектролитами методами спектрофотометрии, сканирующей электронной микроскопии и спектроскопии ГКР

2. Спектрофотометрическое исследование закономерностей роста золотых наночастиц в растворе в процессе восстановления золотохлористоводородной кислоты пероксидом водорода для получения наночастиц оптимального размера, которые могут быть использованы в иммуноанализе.

s Климов В.В. Наноплазмоника. М.: Фиэматлит, 2009.

'' А.К. Sarycliev and V.M. Shalaev. Elecirodynamics ofMelamalerials. World Scientific. 2007.

7 ВС Рукосуев, A.A. Жаворонков. Прионоиые болезни и амшюидоз головного мозга // Архив патологии.

1999. - T 2. - С. 50-55, И.А. Завалишин, И.Е. Шитикова, Т.Д. Жученко. Прионы и приониые болезни Н Клиническая Микробиология и Аннмикробняя Химиотерапия. - 2000. - Т. 2. - №2. - С. 12-19; Блинникова O.E. Трансмиссивный алигоформные энцефалопатии // Новый Хирургический Архив. -2001.-Т. 1. - №2, -С. 1457-1465.

3. Исследование закономерностей роста иммобилизованных золотых наночастиц, приводящего к формированию островковых пленок, в процессе восстановления золотохлористоводородной кислоты пероксидом водорода методами спектрофотометрии, электронной микроскопии и атомно-силовой микроскопии (АСМ).

4. Исследование возможности получения островковых пленок для высокочувствительного иммуноанализа напылением золота на различные поверхности.

5. Использование островковых пленок для высокочувствительного определения прионов.

Научная новизна работы состоит в следующем:

1. Обнаружено, что ферментативная металлография позволяет получить островковые пленки с более широким диапазоном свойств, чем автометаллография.

2. Установлено, что агрегация золотых наночастиц полиэлектролитами протекает воспроизводимо и приводит к повышению их ГКР-активности.

3. Показано, что автометаллография приводит к дальнейшему повышению ГКР-активности агрегатов золотых наночастиц.

Практическая значимость результатов:

1. Предложено использование полиэлектролитов для воспроизводимого получения стабильных растворимых агрегатов золотых наночастиц, применение которых повысит чувствительность иммуноанализа применением спектроскопии ГКР.

2. Предложен способ дополнительного усиления сигнала ГКР конъюгатов при проведении иммуноанализа на нитроцеллюлозной тест-полоске путем добавления к их раствору золотых наночастиц размером 45 нм и предварительной обработки нитроцеллюлозы полиэлектролитом.

3. Разработаны новые методы получения ГКР-активных островковых пленок золота. На примере определения прионов показана их применимость для высокочувствительного иммуноанализа.

Апробация работы: основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих конференциях: «Биокатализ-2009», Архангельск, СГМУ, 18-24 июня 2009 г.; II Фестивале научно-технического творчества молодежи Западного административного округа, Москва, МИТХТ имени М.В.Ломоносова, 29 мая 2010 г.- Ill Фестивале научно-технического творчества молодежи Западного административного округа, Москва, МИТХТ имени

М.В.Ломоносова, 28 мая 2011 г. IV международной конференции «Современные достижения бнонаноскопни», Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, 15-18 июня 2010 г V международной конференции «Современные достижения бионаноскопии», Москва, МГУ имени М.В.Ломоносова, 15-17 июня 2011 IV Конгрессе с международным участием «Опухоли головы и шеи», Иркутск, 2-4 сентября 2011 г.; II Международной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина», Московская область, 19-24 сентября 2011 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них -статья и 6 работ в материалах научных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, 5 глав экспериментальной части, общих выводов и списка литературы, включающего 181 наименование. Диссертация изложена на 175 страницах машинописного текста. Работа содержит 61 рисунок и 6 таблиц.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулирована цель дана общая характеристика работы, включая научную новизну и практическую значимость полученных результатов, сформулированы научные положения, выносимые на защиту. Литературный обзор

Рассмотрен процесс роста золотых наночастиц при восстановлении золотохлористоводородной кислоты. Кратко рассмотрено применение различных восстановителей. Описано влияние ПАВ на данный процесс. Обсуждается механизм восстановления золотохлористоводородной кислоты пероксидом водорода. Рассмотрены протекающие в системе побочные процессы, а также сложности, возникающие при интерпретации спектральных данных о составе системы.

Кратко изложены физические принципы методов спектроскопии комбинационного и гигантского комбинационного рассеяния. Рассмотрены методы получения наноструктурированных поверхностей. Описано применение спектроскопии ГКР в иммуноанализе и при регистрации других биоспецифических взаимодействий. Экспериментальная часть

В данной главе описаны примененные в настоящей работе методы анализа: атомно-силовая микроскопия (АСМ), элеюронная микроскопия, спектрофотометрия, спектроскопия ГКР. Подробно изложены экспериментальные условия. Описаны методики приготовления образцов и обработки полученных данных.

Результаты и обсуждение

Целью настоящей работы является исследование возможности применения автометаллографии для получения золотых наночастиц оптимального размера и островковых пленок золота, а также демонстрация применимости полученных результатов в высокочувствительном иммуноанализе на примере определения приона. Поскольку агрегаты золотых наночастиц обладают повышенной ГКР-активностью по сравнению с одиночными наночастицами, в настоящей работе была также исследована агрегация золотых наночастиц в различных условиях.

Исследование закономерностей роста золотых наночастиц при восстановлении золотохлористоводородной кислоты пероксидом

водорода

Для изучения влияния концентрации пероксида водорода на распределение растущих наночастиц по высоте образцы слюды с иммобилизованными золотыми наночастицами были проинкубированы с растворами, содержащими пероксид водорода, золотохлористоводородную кислоту и хлорид цетилтриметиламмония в качестве ПАВ. Восстановление золотохлористоводородной кислоты пероксидом водорода описывается следующим уравнением:

AuCLf + г/2 Н202 -» Аи + 4СГ + j/o2 + ЗЬГ

При повышении концентрации пероксида водорода высота наночастиц

увеличивается (рис. 1), а их количество остается постоянным.

40

35

30

2 25 г

§ 20 о

о 15

10 5 0

1.00Е-06 1.00Е-05 1.00Е-04 1.00Е-03 1.00Е-02 1.00Е-01

Концентрация, М

Рис. 1. Зависимость высоты иммобилизованных золотых наночастиц от концентрации пероксида водорода после проведения реакции восстановления золотохлористоводородной кислоты в течение 10 мин.

С целью более детального исследования закономерностей роста золотых наночастиц была изучена кинетика данного процесса при трех концентрациях пероксида водорода. Зависимость объема наночастиц от времени проведения реакции имеет сигмоидальную форму (рис. 2). Данный вывод также подтверждается последовательным сканированием одного и того же участка поверхности непосредственно в условиях проведения реакции с использованием жидкостной ячейки

Время, мин

Рис. Зависимость объема наночастиц, вычисляемого из их высоты, от времени проведения реакции восстановления золотохлористоводородной кислоты при различных концентрациях пероксида водорода.

Количество объектов в ходе автометаллографии не изменяется. Возникновения наночастиц в рассматриваемых условиях не происходит, что следует из контрольных экспериментов.

Е2 I

БВв-1 лая I 380 I

288 J

1HR I

8-Р

В

688 588 488-Э8В-2881888-■

Рис. 3. АСМ-изображения золотых наночастиц на поверхности модифицированной аминогруппами слюды, полученные в жидкостной ячейке в различные моменты времени: а) до начала процесса; б) после 28 мин реакции; в) после 39 мин реакции; г) после 52 мин реакции.

Для выяснения условий протекания процесса в кинетическом режиме была проанализирована зависимость полидисперсности наночастиц от времени автометаллографии. В качестве количественной характеристики полидисперсности был использован показатель полидисперсности. Для его вычисления на каждой гистограмме распределения объектов по высоте находили интервал высот, соответствующий 80% отраженных на данной гистограмме объектов и содержащий основной максимум. В данный интервал не попадало 10% объектов в области больших высот и 10% объектов в области малых высот. Величина разности высот, соответствующих границам данного интервала, принималась в качестве значения показателя полидисперсности.

Поскольку 20% объектов при вычислении показателя полидисперсности не принимаются во внимание, на его значение не влияют случайные выбросы. Кроме того,

188 286

показатель полидисперсности не зависит от шага, выбираемого при построении гистограммы распределения объектов по высоте.

При концентрации 5-Ю"5 М Н2О2 изменения показателя полидисперсности не наблюдается. Теоретические расчеты по методу броуновской динамики показывают, что постоянная полидисперсность указывает на кинетический режим протекания процесса* При больших концентрациях пероксида водорода (б-Ю^М, 2-Ю"2 М) показатель полидисперсности зависит от времени протекания процесса.

Предложен также альтернативный метод обработки гистограмм распределения объектов по высоте путем их аппроксимации плотностью вероятности нормального распределения. Правомерность такой аппроксимации была доказана с применением критериев Шапиро-Уилка, Жака-Бера и Лилиефорса9 Среднее нормального распределения практически совпадает с положением максимума распределения объектов по высоте, и для него наблюдается та же зависимость от концентрации пероксида водорода и времени проведения процесса. Площадь под кривой соответствует количеству частиц в области рассматриваемого максимума, и ее зависимости от концентрации пероксида водорода и времени проведения процесса не наблюдается. Дисперсия нормального распределения, как и показатель полндисперсности, не зависит от времени проведения автометаллографии при 510"5 М Н2О1, однако при более высоких концентрациях пероксида водорода эта зависимость обнаруживается. Таким образом, параметры, вычисляемые каждым из предложенных методов, аналогичны, и при исследовании влияния автометаллографии на распределение золотых наночастиц по высоте могут быть использованы оба рассмотренных метода.

Проведено спектрофотометрическое исследование процесса восстановления золотохлористоводородной кислоты пероксидом водорода при наличии золотых наночастиц в растворе, что необходимо для разработки методик их увеличения до оптимального для ГКР размера. Несмотря на то, что при росте золотых наночастиц в растворе происходят те же химические процессы, что и при росте иммобилизованных золотых наночастиц, различия этих процессов очень велики. В частности, при автометаллографии в растворе существует возможность диффузии реагентов и продуктов реакции во всех направлениях относительно поверхности растущих наночастиц, а также роста наночастиц во все стороны.

* К V Mayan, R. Sureslikumar, В. Lin. Influence of Surface Reaction Rale on the Size Dispersion of Inierfaci Naiuislructures II J. Phys. Chem. B.-2003.-V. 107(38).-P. 10513-10520. Вычисления проводились с использованием программ Origin 7.5 и MATLAB 5.

Процесс сопровождается ростом оптической плотности раствора и смещением максимума поглощения в длинноволновую область (рис. 4). Кинетические кривые, полученные при длине волны 520 или 550 нм, выходят на насыщение. Возникновения наночастиц в процессе автометаллографии не происходит. Скорость реакции, определяемая по линейному участку кривой, линейно зависит от концентрации пероксида водорода.

—0 мин

— 3 мин

— 7 мин —15 мин —19 мин

— 23 мин

— 27 мин

— 31 мин

450

500 550 600

Длина волны,нм

Рис. 4. Зависимость спектра поглощения золотых наночастиц размером 10 нм от времени при восстановлении золотохлористоводородной кислоты 2-Ю-2 М Н2О2.

Так как пероксид водорода может генерироваться ферментативным путем, на его примере был также исследован рост золотых наночастиц в процессе ферментативной металлографии, что позволяет провести сравнение двух методов увеличения наночастиц.

При ферментативной генерации пероксида водорода системой глюкозооксидаза-глюкоза зависимость скорости реакции от концентрации глюкозы проявляется только при концентрациях более 0.01 М.

Исследование роста золотых наночастиц, иммобилизованных на поверхности

слюды, при восстановлении золотохлористоводородной кислоты пероксидом водорода,

генерируемым ферментативным путем, показало, что вид распределения объектов по

высоте для случаев добавленного и ферментативно генерируемого пероксида водорода

различается. При 0.01 М глюкозы высота наночастиц, как и в случае

автометаллографии, увеличивается. При 0.1 М глюкозы положение основного

максимума распределения наночастиц по высоте остается неизменным и возникает

дополнительный максимум. Таким образом, зависимость распределения наночастиц по

высоте от концентрации глюкозы при ферментативной металлографии сложнее, чем от

11

концентрации пероксида водорода в случае автометаллографии, и возможности ферментативной металлографии в области создания островковых пленок также более многообразны.

Все полученные кинетические кривые роста золотых наночастиц выходят на

насыщение, то есть процесс прекращается. Расчеты показали, что это не связано с

исчерпанием реагентов. Выход кривых на насыщение объясняется тем, что помимо

10

восстановления золотохлористоводороднои кислоты в рассматриваемом системе

может протекать сопропорционирование нульвалентного золота и тетрахлораурат-

иона", приводящее к уменьшению размера наночастиц. Было показано, что падение

оптической плотности раствора в результате сопропорционирования наиболее сильно

проявляется для наночастиц малого размера.

Агрегация золотых наночастиц под действием полиэлектролитов и при контакте с модифицированными поверхностями Проведено спектрофотометрическое исследование процесса агрегации,

протекающего в растворе наночастиц, содержащем полиэлектролит (табл. 1), при

различных концентрациях полюлектролитов, температурах и временах инкубации. Во

всех случаях наблюдается изменение спектра поглощения и смещение максимума в

длинноволновую область. Получены стабильные агрегаты наночастиц, которые могут

быть использованы для получения островковых пленок или для получения конъюгатов

с антителами.

Таблица 1. Характеристики используемых полиэлектролитов.

Полиэлектролит Молекулярная масса, кДа Среда

ПДДА 200 - 350 водный раствор

полиэтиленимин 750

полианетолсульфонат натрия 10

хлорид поли-w-винилбензилпиридина 116

хитозан 500 4% CHjCOOH

Бромид поли-4-винилбензилпиридина 276 вода этанол 1:1

10 M. Zayats, R. Baron, I. Popov, I. Willner. Biocatalytic Growth of Ait Nanoparticles: From Mechanistic Aspects to Biosensors Design // Nanoletters. -2005. - V. 5. - No. 1. - P. 21-25.

11 Perez-Juste, L.M. Liz-Marzan, S. Camie, D.Y.C. Chan, P. Mulvaney. Electric-Field-Directed Growth of Gold Nanorods in Aqueous Surfactant Solutions // Adv. Fund. Mater.-2004. - V. 14. - No. 6. - P. 571-579;G. Kawamura, M. Nogami. Application of a conproportionation reaction to a synthesis ofshape-controlled gold nanoparticles // Journal of Crystal Growth. - 2009. - V. 311. - No. 19. - P. 4462-4466.

Иммобилизация наночастиц на модифицированную аминогруппами поверхность стекла также сопровождается их агрегацией. Положение максимума поглощения полученных островковых пленок чувствительно к наличию адсорбированных веществ, что может использоваться для их определения12 Автометаллография вызывает смещение максимума поглощения иммобилизованных наночастиц в длинноволновую область и рост оптической плотности образца, то есть ее действие на находящиеся в растворе и иммобилизованные наночастицы одинаково.

Методом сканирующей электронной микроскопии проведено исследование агрегации золотых наночастиц, протекающей в процессе их иммобилизации на поверхности кремния и алюминия, модифицированные полиэлектролитами. Получены как двумерные, так и трехмерные агрегаты; в ряде случаев преобладают одиночные наночастицы.

Поскольку визуальный анализ десятков изображений по количеству одиночных и входящих в состав агрегатов наночастиц затруднителен, был предложен метод их полуавтоматической обработки. В качестве параметра сравнения была выбрана максимальная площадь сечения объектов, что позволяет отличать одиночные наночастицы от агрегатов и сравнивать суммарные площади тех и других объектов на разных изображениях. При этом необходимо только выбрать положение секущей плоскости. Все остальные стадии расчета были автоматизированы.

Таким образом, показана возможность использования электронной микроскопии в качестве количественного метода сравнения островковых пленок, полученных агрегацией золотых наночастиц в процессе иммобилизации, применимых для использования в спектроскопии ГКР. Анализ полученных данных показал, что наиболее высокая поверхностная концентрация наночастиц и агрегатов достигается при использовании хлорида полидиметилдиаллиламмония (ПДЦА).

Автометаллография вызывает превращение агрегатов в островковую пленку (рис. 5), которая многократно превосходит исходные агрегаты по способности усиления сигнала в спектре ГКР.

12 Z. Cao, F.-C. Gong, M.Tu, M.-X. Zeng, X.-X. Huang, L. Zhang, S.-Z. Tan. L.-X. Sun, N. Gu. Preliminary Recognition of c-Myc Gene Protein Using an Optical Biosensor with Gold Colloid Nanoparticles Based on Localized Surface Plasmon Resonance // Analytical Letters. - 2009. - V. 42. - No. 17. - P. 2820-2837.

Млч л» 7н их т> - 1.1 пик 1 |1т бирра 40-30-87 срусл-авмби н-

снг - 10.00 к\/ а|11Ч1ММ-- iii1н1 |1ш |).|||- :'| а|11 лмп (.им v.«- 1.1и|-4ш!1 ш1| пи 1111 / 16.шш пин н»1м> н|!«|и|;||ип Гнн-Ауч Чу\1|-т /.мкш/ ть

Рис. 5. Изображение участка поверхности модифицированного аминогруппами кремниевого образца с иммобилизованными золотыми наночастицами размером 10 нм после автометаллографии (2-10"2 М ЬЬСЬ, 30 мин).

Исследование возможностей увеличения интенсивности сигнала в спектре ГКР путем повышения суммарной концентрации наночастиц Подбор условий иммобилизации красителя 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной

кислоты) (ДТНБ) на поверхность золотых наночастиц показал, что интенсивность

характеристического максимума в спектре ГКР зависит от состава выбранного

раствора. Повышение концентрации ДТНБ приводит к возрастанию интенсивности

сигнала. Некоторые часто используемые компоненты буферных растворов, в частности,

трис, дестабилизируют наночастицы. Наиболее высокая интенсивность достигается при

проведении иммобилизации в насыщенном водном растворе при отсутствии солей.

Наиболее простым методом увеличения интенсивности сигнала является

повышение концентрации наночастиц в наносимом на поверхность образца растворе,

однако при высоких концентрациях наночастиц с иммобилизованным красителем

возрастает разброс значений сигнала, измеряемых в различных точках образца. Для

решения этой проблемы можно дополнительно наносить наночастицы, не содержащие

иммобилизованного красителя, что приводит к повышению интенсивности сигнала, не

сопряженному с ростом разброса его значений. Агрегация наночастиц при их

нанесении на нитроцеллюлозу, обработанную ПДЦА, приводит одновременно к их

концентрированию и росту числа зазоров, что в дополнение к рассмотренному эффекту также вызывает значительное усиление сигнала.

Исследование возможности применения островковых пленок для увеличения сигнала в спектре ГКР

Для создания островковых пленок обычно проводят напыление золота на

выбранную подложку. Слюда, нитрид кремния и стекло оказались неприменимыми вследствие высокого фона. Слой золота, напыленный на поверхность некоторых используемых в иммуноанализе мембран13, плавится даже при малой мощности возбуждающего лазера, что делает их использование невозможным. Только на нитроцеллюлозе с напыленным слоем золота при нанесении золотых наночастиц с иммобилизованным красителем были подобраны условия получения спектров, в которых не происходит плавления золота и в спектрах ГКР наблюдается интенсивный характеристический максимум красителя, иммобилизованного на добавленных наночастицах. При этом наблюдается усиление ГКР Помимо этого, в спектрах комбинационного рассеяния нитроцеллюлозы при выбранных параметрах получения спектров собственные максимумы отсутствуют, а максимум в спектрах ГКР легко отделяется от максимума ДТНБ и более чем на порядок уступает ему по интенсивности. Усиление сигнала в спектре ГКР происходит даже при использовании сплошного слоя золота на инертной поверхности, но островковые пленки обладают большей способностью его усиления.

Иммобилизация немодифицированных золотых наночастиц размером 10 нм на поверхность алюминия, предварительно обработанную ПДДА, с последующим проведением автометаллографии позволяет создать островковую пленку, которая при иммобилизации на нее наночастиц с иммобилизованным красителем вызывает значительное усиление сигнала. Фактор усиления зависит от природы противоиона, присутствующего в растворе полиэлектролита. При использовании К1 интенсивность сигнала в 12 раз выше (рис. 6).

Существует возможность дальнейшего усиления сигнала в спектре ГКР, связанная с предварительным напылением диоксида церия, обладающего поликристаллической структурой, на поверхность алюминия, что позволяет получить развитую поверхность. Затем проводится нанесение ПДДА, иммобилизация наночастиц и автометаллография. В случае иммобилизации золотых наночастиц размером 20 нм, содержащих иммобилизованный ДТНБ, на поверхность с напыленным диоксидом церия, на которую затем нанесен ПДДА в присутствии К1, автометаллография приводит к увеличению интенсивности сигнала в 7 раз.

" Напыление производилось в Институте теоретической и прикладной электродинамики РАН.

120000 100000

я

5 soooo

£

x

U Л

о 60000

г

о

X

X ш

Е 40000 S

20000

О

Рис. 6. Интенсивность сигнала образцов, представляющих собой поверхность алюминия, последовательно инкубировавшуюся с растворами: 10.98 мг/мл ПДДА в присутствии 20 мМ КІ; золотыми наночастицами размером 10 нм или 45 нм; раствором ПДДА того же состава; золотыми наночастицами размером 45 нм с иммобилизованным ДТНБ. Правый столбец соответствует случаю, когда наночастицы размером 10 нм после иммобилизации подверглись автометаллографии (2-Ю-2 М Н2О2, 30 мин).

Высокочувствительное определение приона с использованием

спектроскопии ГКР Применимость разработанного метода усиления сигнала в спектре ГКР с

использованием островковых пленок в иммуноанапизе была показана на примере

определения прионов. Для данной цели были получены конъюгаты золотых наночастиц

размером 45 нм с красителем ДТНБ и моноклональными антителами к приону (рис. 7).

Смещение максимума поглощения в длинноволновую область на каждой стадии

получения конъгагатов свидетельствует об успешной иммобилизации всех

компонентов на поверхность наночастиц14. Полученные конъюгаты обладают

высокоинтенсивным характеристическим максимумом в спектрах ГКР (рис. 8). При

нанесении на нитроцеллюлозу их определение с помощью спектроскопии ГКР по

крайней мере на 3 порядка более чувствительно, чем визуальное определение их

окраски. Проведено исследование стабильности конъюгатов в различных буферных

растворах, что позволило оптимизировать условия проведения иммуноанапиза.

14 C. Song, Z. Wang, J. Yang, R. Zhang, Y. Cui. Preparation of 2-mercaprobenzothiazole-labeled immuno-Au aggregates for SERS-based immunoassay II Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. - 2010. - V. 81. - P. 285288.

автометаллография

Рис. 8. Спектры ГКР нитроцеллюлозы с нанесенным конъюгатом золотых наночастиц размером 45 нм с антителами к приону (красный); с немодифицированными золотыми наночастицами (серый).

Рис. 9. Спектры ГКР образца с прионом (красный) и без него (фиолетовый) после проведения иммуноанализа на мембране.

Полученные конъюгаты были использованы для определения рекомбинантного фрагмента приона, адсорбированного на мембране из раствора с концентрацией 50 нг/мл (рис. 9). Выбранная концентрация приона позволяет независимо определять

его методом иммуноферментного анализа, что позволило подтвердить его адсорбцию на мембране.

Проведено определение рекомбинантного приона, адсорбированного на поверхности алюминия из раствора того же состава. Адсорбция приона доказана методом иммуноферментного анализа.

Таким образом, найдены оптимальные условия для высокочувствительного определения приона, адсорбированного на различных поверхностях, с использованием спектроскопии ГКР и иммуноферментного анализа.

Выводы

1. Обнаружено, что золотые наночастицы размером 45 нм вызывают усиление сигнала в спектре ГКР красителя, иммобилизованного на поверхности наночастиц того же размера.

2. Впервые процесс агрегации золотых наночастиц полиэлектролитами исследован в двух вариантах: в растворе и на поверхности подложек. Агрегация наночастиц вызывает усиление сигнала ГКР иммобилизованного на них красителя.

3. Предложен метод автоматизированной обработки изображений поверхностей иммобилизованными наночастицами и агрегатами, полученных с помощью сканирующего электронного микроскопа, обеспечивающий возможность их высокопроизводительного скрининга.

4. Методом автометаллографии с использованием пероксида водорода в качестве восстановителя получены островковые пленки золота, превосходящие по способности усиления сигнала в спектре ГКР все исследованные аналоги.

5. На примере определения приона показана применимость разработанного метода усиления сигнала в спектре ГКР с помощью осгровковых пленок в иммуноанализе.

Основные публикации по теме диссертации

1. Пестовский, Ю.С. Исследование закономерностей роста золотых наночастиц, иммобилизованных на поверхности слюды, при восстановлении золотохлорисговодородной кислоты пероксидом водорода Ю.С. Пестовский, И.А. Будашов, И.Н. Курочкин. Российские нанотехнологии. - 2011. - Т.6. - №3-4. - С.46-50.

2. Пестовский, Ю.С. Исследование трансформации иммобилизованных золотых наночастиц в процессе автометаллографии методом атомно-силовой микроскопии / Ю.С. Пестовский, И.Н. Курочкин. // Вестник МИТХТ. - 2011. Т. VI. - №1. - С. 119.

3. Pestovsky, Y.S. Budashov, I.A. The investigation of the growth mechanism of metal nanoparticles by gold enhancement. International conference "Biocatalysis-2009: Fundamentals & Applications" - Abstracts. 2009. Р.6Э-64.

4. Пестовский, Ю.С. Будашов, И.А., Курочкин, И.Н. Исследование закономерностей роста золотых наночастиц, иммобилизованных на поверхности слюды, при восстановлении тетрахлорзолотой кислоты пероксидом водорода. Четвертая международная конференция

"Современные достижения бионаноскопии" Сборник тезисов. Москва-2010.

С. 55.

5. Пестовский, Ю.С. Будашов, И.А. Получение золотых наночастиц для высокочувствительного иммуноанапиза на основе ГКР. Пятая международная конференция "Современные достижения бионаноскопии" Сборник тезисов. Москва-2011. С. 35.

6. Пестовский, Ю.С., Будашов, И.А. Высокочувствительное определение прионового белка с использованием спектроскопии ГКР. // Тезисы 2 международной школы "Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина" 2011. С. 92-93.

Подписано в печать: 24.11.2011

Заказ № 6349 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499)788-78-56 www.autoreferat.ru

2011248389

2011248389