Получение и характеристика линий мягкой пшеницы с единичными транслокациями от Triticum timopheevii Zhuk. с использованием молекулярно-генетических методов

Тимонова, Екатерина Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и характеристика линий мягкой пшеницы с единичными транслокациями от Triticum timopheevii Zhuk. с использованием молекулярно-генетических методов
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика линий мягкой пшеницы с единичными транслокациями от Triticum timopheevii Zhuk. с использованием молекулярно-генетических методов"

На правах рукописи

ТИМОНОВА Екатерина Михайловна

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИНИЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ С ЕДИНИЧНЫМИ ТРАНСЛОКАЦИЯМИ ОТ ШТ/СиМ ПМОРНЕЕУПгник. с ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2012

005056913

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор,

Салина Елена Артемовна

Официальные оппоненты: Бадаева Екатерина Дмитриевна, доктор

биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной кариологии и основ клеточной терапии, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, г. Москва

Соколов Виктор Андреевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией цитологии и апомиксиса растений, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский Научно-

Исследовательский Институт Растениеводства им. Н.И. Вавилова Россельхозакадемии, г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится «£)» схмЛ&Ш 2012 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН, в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10, тел/факс: (383) 363-49-06, факс (383) 333-1278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН. Автореферат разослан " (LtHmjiffiJ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Г. М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Одним из наиболее распространенных и вредоносных заболеваний пшеницы является бурая ржавчина, вызываемая базидиальным грибом Puccinia triticina Eriks. При развитии сильной эпифитотии потери урожая зерна в результате поражения растений могут достигать 40-50% (Маркелопа 2011, Roelfs et al. 1992). Наиболее эффективным способом борьбы является создание и культивирование сортов и линий пшеницы, обладающих устойчивостью к бурой ржавчине. Лишь немногие из интенсивно используемых ¿r-генов (генов устойчивости к бурой ржавчине) способны на сегодняшний день обеспечить длительную устойчивость (durable resistance) (Kou, Wang 2010, Qi et al. 1999, Singh et al. 2005). Ранее в ИЦиГ СО РАН была создана коллекция гибридных линий мягкой пшеницы, устойчивых к бурой ржавчине, полученная на основе скрещивания Т. aestivum с T. timopheevii. (Будашкина и др. 1988). Леоновой с соавторами (2008) было показано на двух сестринских линиях, что устойчивость к листовой ржавчине детерминируется тремя локусами QLr.icg-lA, QLr.icg-2A и QLr.icg-SB, картированных на хромосомах 1А, 2А и 5В, соответственно. Создшшые гибридные линии содержали множественные участки интрогрессии от Т. timopheevii, что негативно влияло на формирование количественных признаков и не позволяло оценить вклад отдельных локусов в формирование признаха устойчивости.

Создание и изучение линий мягкой пшеницы, несущих в составе генома только целевой ген (почти изогенные линии) или фрагмент хромосомы дикого или культурного родственного вида, преследует несколько целей. В первую очередь это оценка потенциала гена (или интрогрессивного фрагмента) в формировании изучаемого признака (Салина и др. 2008, Uhrin et al. 2010). Линии, содержащие только целевой ген (или фрагмент хромосомы) от образца - донора признака, могут использоваться в качестве моделей для локализации геноз, изучения их структуры и экспрессии, а также в качестве источника новых генов в селекционном процессе.

Использование маркеров для отбора нужных генотипов растений в беккроссных поколениях (marker assisted backcrossing, MAB) является одним из

новых подходов, который в настоящее время используется для ускорен процессов интрогрессии целевых генов и создания почти изогенных лиш (Со11агс1, МаскШ 2008). Использование молекулярных маркеров позволяет так; контролировать элиминацию генетического материала донора и отбирать генотш с минимальным размером интрогрессивного фрагмента.

Основная цель нашей работы - это создание интрогрессивных линий мягю пшеницы с использованием молекулярно-генетических методов и изучен влияния отдельных участков хромосом ТгШсит ЧторИеел'И 7Ьик. на формирован устойчивости к бурой ржавчине и количественные признаки мягкой пшеницы. Задачи данного исследования:

1) Создание линий мягкой пшеницы с единичными интрогрессивныи фрагментами от Т. ИторкееуЦ или их комбинациями путем контролирован! процессов беккроссирования микросателлитными (ИЯК) маркерами.

2) Молекулярно-цитологический анализ интрогрессивных линий мягю пшеницы. Определение хромосомной локализации и размера интрогрессивш фрагментов в созданных линиях.

3) Оценка интрогрессивных линий мягкой пшеницы на устойчивость бурой ржавчине.

4) Оценка влияния различных фрагментов интрогрессии Т. ИторЬеех'И их комбинаций на хозяйственно-ценные признаки мягкой пшеницы. Научная новизна работы. В результате проведенной работы нами впервые применением отбора с помощью молекулярных маркеров были получены лиш мягкой пшеницы, несущие единичные транслокации от Т. йторкеехи. Вперт показано, что локус (¿1г. перенесенный в геном "мягхой пшеницы I Т. ИторИееуи, обеспечивает устойчивость линий мягкой пшеницы к бур< ржавчине на всех стадиях развития растения. Продемонстрирована эффективное комплексного подхода при использовании молекулярных ЗйЯ-маркеров цитологических методов для анализа форм мягкой пшеницы, полученных участием материала Т. НторИееуп.

Практическая ценность работы. В результате данного исследования получа пять цитологически стабильных линий мягкой пшеницы с единичным транслокациями от Т. ЧторНееуН, обладающие устойчивостью к бурой ржавчин которые могут быть использованы в селекции в качестве доноров устойчивости, ходе данной работы был отработан мегод маркер-ориентированного отбор использование которого позволяет значительно сокращать время получения новь улучшенных генотипов пшеницы. Были отобраны молекулярные маркер! позволяющие эффективно маркировать локусы, контролирующие приза; устойчивости к бурой ржавчине.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1) Локус д1г.^-5В, перенесенный в геном мягкой пшеницы от Т. ИторИее\< обеспечивает устойчивость линий мягкой пшеницы к бурой ржавчине, характерно для Западной Сибири, на всех стадиях развития растения.

2) Комбинация минорных локусов устойчивости к бурой ржавчине QLr.icg-2 и у интрогрессивных линий мягкой пшеницы оказывает сдерживающи эффект на развитие болезни на стадии взрослых растений и не приводит развитию гиперчувствительного ответа.

Личный вклад автора. Основная часть экспериментальной работы и аншп полученных результатов выполнена автором самостоятельно. Данные г

устойчивости на стадии проростков предоставлены сотрудниками ГНУ СибНИИРС Россельхозакадемии Сочаловой Л.А. и Христовым Ю.А. Данные по количественным признакам у интрогрсссивных линий в Омской области 2009-2010 гг. (поле 1) предоставлены сотрудниками ГНУ СибНИИСХ Россельхозакадемии Беланом И.А. и Россеевой Л.П. Данные по микросателлитным маркерам, уточняющие границы интрогрессивных фрагментов, предоставлены Леоновой И.Н. Апробация работы. Результаты работы были представлены на 11 международных и российских конференциях, среди которых 1-ая международная школа-конференция молодых учёных «Генетика и селекция растеиий, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (2008, Москва-Звенигород), 5-ый съезд ВОГиС (2009, Москва), международная конференция «Генетика, геномика и биотехнология растений» (2010, Новосибирск), международная конференция «Green plant breeding technologies» (2 010, Vienna, Austria), международная конференция «Генетические ресурсы и геномика пшеницы» (2011, Новосибирск), 20th ITMI/2ndWGC Joint Workshop (2011, Beijing, China) и другие, a также обсуждались на отчетной сессии ИЦиГ СО РАН (2008, 2011). Публикации. Но результатам исследования опубликовано 17 работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных изданиях, получен патент «Способ создания линий мягкой пшеницы, устойчивых к бурой листовой ржавчине», номер 2407283 RU.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 15 рисунков. Библиографический указатель содержит 280 источииков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. Исходные гибридные линии пшеницы 744-1 и 832-1 (поколение ВС^^-ВСД^о, 2п=42), полученные от скрещивания Т. aeslivum с Т. limopheevii, и их родительские формы сорт мягкой пшеницы Саратовская 29 и тетраплоидный вид Т. limopheevii var. viticulosum были любезно предоставлены Нудаш кипой Е.Б. Линии 744-1 и 832-1 содержали в геноме 5 и 7 интрогрессивных фрагментов от Т. limopheevii, соответственно, и обладали комплексной устойчивостью к бурой и стеблевой ржавчинам, мучнистой росе, пыльной головне, темно-бурой пятнистости и отличались от исходного сорта Саратовская 29 по ряду морфологических и хозяйственно-ценных признаков (Леонова и др. 2002; Leonova et al. 2011). Схема получения серии интрогрессивных линий мягкой пшеницы, содержащих различные комбинации фрагментов генома Т. limopheevii, приведена па рис. 1. В данной работе проводился анализ поколения ВС3 и последующее самоопыление отобранных растений.

Полученные интрогрессивные линии мягкой пшеницы, контрольный сорт Саратовская 29 и исходные гибридные родительские липни 744-1 и 832-1 выращивали на экспериментальном участке ГНУ СнбНИИСХ Россельхозакадемии (г. Омск) в 2009-2010 гг., экспериментальном участке ИЦиГ СО РАН (Новосибирская область) в 2009-2010 гг., и экспериментальном участке ГНУ СИБНИИРС Россельхозакадемии в 2009-2010 it., (Новосибирская область), далее в тексте обозначенных, соответственно, как поле/участок 1, 2 н 3. Растения

выращивали на делянках шириной 50 см, по 20 рядов в каждой и по 30 зерен в ря; с расстоянием между делянками 60 см.

С2Э х Гибридные линии

1 Taestivum- TMmopheovÄ \ (744-1 и 832-1)

F,XC29

BC|F,V-C29 BC2F^C29

BC3F,

беккроссирование растений F,m ВС, Г, на Саратовскую 2Эбезгенотипирования

97 из 160растекий BC2F, генотипированы 75-ю SSR-маркерами; отобраны ß растений (38S2, 3866,3869,5352,6360,5366), беккроссирование на Саратовскую 23, самоопыление

BC-ÍF

'3* 2

BC3F3-BC3F5

178 растений BC3F2 проанализированы 25-ю микросателлитными маркерами; отбор моноинсерционных растений

Рис. 1. Схема получения интрогрессивных линнй Т. aeslivum - Т. timopheevii. Рамкой выделены этапы геяотипирования и самоопыления, выполняемые в данной работе.

Выделение ДНК и микросателлнтный анализ. ДНК выделяли из 5-7- дневкы проростков по методу Плашке с соавторами (Plaschke et al. 1995). В работе был использованы микросателлитные маркеры Xgwm (Ganal," Röder 2007), Xgp (Sourdille et al. 2001), Xcfe (Zhang et al. 2005) и маркер Xstm773-2 (Bariana et a 2001) с известной локализацией в хромосомах Т. aestivum и Т. timopheevii (Salina i al. 2006a). Процедуру полимеразной цепной реакции (ПЦР) осуществляли использованием меченого праймера М13 и немеченых праймеров микросателлитным локусам согласно методике Hayden с соавт. (2002). Разделени фрагментов ПЦР выполняли на автоматическом секвенаторе ABI3100 (Applie Biosystems, ЦКП автоматического секвенирования Д1ПС СО РАН). Разме фрагментов рассчитывали с помощью компьютерной программы Peak Scanm (Applied Biosystems) относительно стандартных образцов ДНК известной длины. Флуоресцентная in situ гибридизация (F1SII). FISH проводили в соответствии ранее опубликованной методикой с использованием зондов Speltl, pScll9.7 локализующихся в основном в хромосомах В- и G-геномов, и pAsl. спецнфичног для хромосом D генома (Салина и др. 1997, Salina et al. 2006b). С-окрашивание. С-окрашивание проводили с соответствии со стандартно методикой согласно Бадаевой с соавторами (1994).

Оценка устойчивости к болезням. Устойчивость интрогрессивных линий н ювенильной стадии и на стадии взрослых растений оценивали у интрогрессивны линий, гибридных родительских линий 744-1 и 832-1 и сорта Саратовская 29 ( качестве контроля). Учет поражения бурой ржавчиной проводили по шкале Майне и Джексона: 0 - иммунный тип; 1 - весьма устойчивый; 2 - умеренно устойчивыГ 3 - умеренно восприимчивый; 4 - весьма восприимчивый (Mains, Jackson, 1926 Устойчивость на стадии проростков оценивали по ранее описанной методик (Михайлова, Квитко 1970). Оценку динамики развития поражения проводил согласно модифицированной шкале КобСа (площадь покрытия листовой пластиш

урединиоспорами) (Peterson et al. 1948). Измерения проводились с интерналом в семь дней с момента появления первых пустул на полях 2 и 3 в 2009-2010 гг. Анализ количественных признаков. Анализ элементов структуры урожая проводили по семи количественным признакам (высота растения, длина колоса, число колосков в колосе, число зерен в колосе, число зерен с растения, масса зерна в колосе, масса зерна с растения, масса 1000 зерен). Признаки оценивались три раза: на участке 1 в2009и2010 годах и на участке 2 в 2010 году. Оценка признаков проводилась для 20 случайно выбранных растений для каждой иптрогрессивной линии и родительских форм.

Статистический анализ. Сравнение количественных признаков проводили посредством однофакторного дисперсионного анализа (Фактор - генотип). Достоверность межгрупповых различий оценивали по критерию множественных сравнений LSD Фишера. Достоверность внутриклассового коэффициента корреляции при оценке влияния окружающей среды (фактор - ноле) на формирование количественных признаков оценивали с помощью критерия Фишера. Статистическую обработку осуществляли с помощью программы Microsoft Excel 2010.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Создание ннтрогрессивных линий с помощью SSR-маркеров. Схема создания шггрогрессивных линий на основе гибридных линий 744-1 и 832-1 представлена на рисупке 1.

Основными факторами, определяющими эффективность отбора гибридных форм с помощью молекулярных маркеров, являются стратегия отбора, схема эксперимента, размер популяции, а также наличие, доступность и расположение маркеров относительного целевого локуса (Frisch et al. 1999а, Hospital et al. 2005). Отбор с использованием маркеров проводился в два этапа. Ранее на первом этапе отбирались растепия из поколения BC2Fi от скрещивания родительских линий 7441 и 832-1 с сортом Саратовская 29 и последующего двукратного беккроссирования. В связи с ограниченным размером популяции не было обнаружено растений, содержащих только 1 или 2 фрагмента генома Т. timopheevii. По результатам SSR анализа было отобрано шесть растений (3862, 3866, 3869, 5352, 5360, 5366), содержащих комбинации из 3-4 ннтрогрессивных фрагментов в хромосомах 1А, 2А, 2В, 5В, 6В, и содержащих локусы устойчивости к листовой ржавчине QLr.icg-5В, QLr.icg-2A и QLr.icg-IA от Т. timopheevii.

В рамках данной работы выполнен второй этап отбора шггро1рессивных линий, содержащих единичные транслокацин генетического материала Т. timopheevii или сочетания из 2-3-х фрагментов, на более поздних этапах беккроссирования (BC5F2) и на более расширенном размере популяции (178 растений). Для анализа линий был использован набор полиморфных SSR-маркеров, отобранных на основе результатов, полученных ранее при анализе гибридных Т. aestirum - Т. timopheevii линий и данных по картированию генома Т. timopheevii (Leonova et al. 2002, Salina et al. 2006a). Всего для генотипирования 178 растений BC3F2 было использовано 25 микросателлитных Xgwm, Xgpw и Хс/с маркеров с известной хромосомной локализацией у Т. aestivum и Т. timopheevii - от 2 до 8 маркеров на хромосомы 1 А, 2А, 2В, 5В, 6В. По результатам генотипирования было отобрано 68 растений для уточнения i-раииц иптрогрессивных фрагментов с

привлечением дополнительных 23 микросателлитных маркеров. ЧисЛ' интрогрессивных фрагментов в потомстве линий BC3F2 составляло от 1 до 4 н геном, при этом у 18 растений генетический материал Т. timopheevii не обнаружен.

Всего было получено 38 линий, содержащих только один интрогрессивньн фрагмент Т. timopheevii, а именно, 26 содержали фрагмент хромосомы 2G, шесть ■ длинного плеча хромосомы 5G, шесть - фрагмент хромосомы 6G. 72 лиши содержали комбинации двух, 38 линий трех и 12 линий четырех интрогрессивньЕ фрагментов хромосом 1 А1, 2А1, 3G, 2G, 5G, 6G в различных сочетаниях.

Использование маркеров позволяет быстро отбирать гомозиготные формы п< целевому гену или по интрогрессивному фрагменту. Были отобраны линии i транслокациями, включающими хромосомы 5В и 6В, в гомозиготном состоянии. I поколении BC3F2 не удалось получить линий, гомозигогных по 2G фрагменту, ■. также потомства, содержащего единичный фрагмент в хромосомах 1А и 2А. Линш гомозиготные по 2G фрагменту были получены после дополнительной самоопыления. В нашей работе успеху получения линий как с единичным! транслокациями, так и с различными комбинациями при небольшом размер< выборки способствовала следующая схема эксперимента: а) предварительное генотипирооание родительских форм и определение хромосомной локализацш интрогрессивных фрагментов, что позволило исключить отбор с помощьн маркеров па стадии ВСЬ взять в анализ выборки небольшого размера на стадии ВС2 и ВС3 (97 и 178 линий, соответственно) и снизить количество маркеров ДЛ1 анализа; б) достаточное число MDPs (marker data points, вычисляемое как чисж маркеров на число растений) (7275 для ВС2 и 4550 для ВС3) для выявлена фрагментов Т. timopheevii различной протяженности у изучаемых линий.

Оценка протяженности интрогрессивных фрагмента» Т. timopheevii у полученных линий мягкой пшеницы. Важной характеристикой создаваемых интрогрессивных линий является стабильность наследования генетического материала от Т. timopheevii при скрещиваниях с мягкой пшеницей. Чем выше рекомбинационная способность гомеологичных хромосом, тем больше вероятность уменьшения протяженности интрогрессивного фрагмента, вплоть до потери перенесенных в геном мягкой пшеницы полезных признаков. В связи с этим актуальным представляется изучение стабильности длины интрогрессивных фрагментов у созданных линий по сравнению с исходными гибридами.

Проведена оценка протяженности фрагментов хромосом 1А', 2A1, 2G, 5G и 6G Т. timopheevii в поколении BC3F2 линий 744-1 и 832-1 (рис. 2). ^прогрессивный фрагмент в хромосоме 1А у исходной линии 832-1 после проведения трех беккроссов уменьшился (до 72 от исходной длины у родительской линии), однако этот процесс не затронул район локуса QLr.icg-lA (рис. 2). Различий по длине фрагмента среди потомства BC3F2 не было обнаружено. Для родительской линии 744-1 показано, что хромосома 1А содержит два транслоцированных фрагмента от Т. timopheevii - небольшой участок в коротком плече хромосомы и фрагмент длинного плеча. После трехкратного беккроссирования произошла элиминация 1 А' фрагмента в коротком плече и уменьшение длины фрагмента в длинном плече с потерей минорного локуса устойчивости к бурой ржавчине QLr.icg-lA. Аналогичная ситуация наблюдалась при оценке протяженности интрогрессивных фрагментов хромосомы 2А" у растений BC3F2 поколения, полученных от линии 832-1: длина фрагмента уменьшалась более чем на половину (рис. 2).

Транслокация фрагмента хромосомы 20 Т. ИторИееуН у линии 832-1 затрагивала полностью короткое и часть длинного плеча хромосомы 2В. В процессе беккроссирования произошло уменьшение длины интрогрессивного фрагмента (рис. 2). У линии 744-1 интрогрессивный фрагмент состоял из длинного плеча хромосомы 20, размер которого не изменился.

* *

1А „ Я

2А

2В

Xgv/m1223b Xgwm90S I Xgpw7072 " Xgwm33a

XgwmOllS ■

Xgwm0497b -Xgwm0633 ■ Xgpw725S ■

Xgwm0750 — у----X.

Xgwtn0726-

Xgwm1115-Xgwm0095 •

XgwmlO^^ — — Xgwm0372 .

Xgwm0312. Xgpw7S01am

Xgwm1128-Xgwm02S7-

Xsim-773-2-Xgwm0120-Xgwm07SS-Xgwm1067-

Xgpw7S01-Xgwm0619-

§ о

tC CD

i s

0 ö

Xgwm234

Xgwm408

шгм-

Xgwm 1246a " Xbarc232 Xwmc640 _ Xgwm! 14 ~ Xgpwb23S -Xgwm605 -

XgwmOSIS Xgwm0361

Xgwm0785

Xgwm1199 XgwmOG 26 XgwmOSS9 XgwmO 119

Рис. 2. Схематическое изображение расположения и размера интрогрессивных фрагментов хромосом Т. limopheevii у линий BC3F2 (темно-серого цвета) и родительских гибридных линий 744-1 и 832-1 (светло-серого цвета) относительно генетических карт ITMI. Порядок маркеров и приблизительные расстояния между ними соответствуют генетическим картам ITMI популяции (Ganal, Röder 2007). QTLs, картированные ранее у линии 832-1, указаны сбоку (Leonova et al. 2008). Стрелки указывают на расположение центромеры. *-транслокация в 2D

Транслокация, затрагивающая хромосому 5В у линии 832-1, находится в теломерной области длинного плеча. У потомства ВС3Р2 произошло незначительное уменьшение протяженности данного фрагмента, которое не затронуло область локализации локуса QLr.icg-5B. Линия 744-1 содержит полностью длинное плечо хромосомы 50 в геноме. Однако в потомстве ВС3Р3 данный фрагмент не сохранился.

Было показано, что у линии 744-1 полностью замещено длинное плечо и большая часть короткого плеча хромосомы 6В фрагментом хромосомы 60. У потомков поколения ВС3Р2 выявлены 2 типа растений, у которых протяженность фрагмента уменьшилась приблизительно на 20% и 50% от исходной длины. Линия

832-1 содержит транслокацию фрагмента длинного плеча хромосомы 6G, расположенную в интервале между микросателлитными маркерами Xgwml 199-Xgwm889. Данный фрагмент полностью элиминировался после трехкратного беккроссирования.

Одним из важных факторов успеха использования отбора с помощью молекулярных маркеров (marker-assisted selection, MAS) для отбора генотипов, содержащих целевые гены и QTLs, является наличие тесного сцепления между молекулярными маркерами и локусами. Эффективность MAS снижается в случае рекомбинации между маркером и целевым локусом. Поэтому для отбора генов и QTLs стараются подбирать маркеры, тесно сцепленные с ними или расположенные по обе стороны локуса. В данной работе использование маркеров позволило показать уменьшение длины интрогрессивных фрагментов хромосом А1 и G г еномов T. timopheevii. Также оказалось, что протяженность G-геномных интрогрессивных фрагментов 2GL и 5GL от T. timopeevii сохранялась практически полностью (рис. 2) после третьего этапа беккроссирования, что характерно для скрещиваний мягкой пшеницы с отдаленными видами и может быть связано со сниженным уровнем рекомбинации (Friebe et al. 1996; Tao et al, 2000).

Использование маркеров позволило отобрать растения с уменьшением интрогрессивных фрагментов А1 генома T. timopheevii, содержащих локусы устойчивости, что невозможно сделать с помощью фенотипического отбора. Для дальнейшего использования созданных линий в качестве доноров интрогрессивных фрагментов от T. timopheevii необходимо в случае А* генома выбирать маркеры, расположенные по обе стороны от целевого локуса. В то время как для маркирования локусов, локализованных в G геноме, достаточно одного маркера, специфичного для данной транслокации.

Цитологический анализ интрогрессивных линий. Ранее было показано, что с помощью молекулярных маркеров не всегда удается выявить транслокации, затрагивающие дистальные районы хромосом мягкой пшеницы (Салина и др. 2008, Ganal, Röder 2007). Это связано с тем, что SSR маркеры, ограничивающие генетические карты хромосом, физически локализуются в субтеломерных районах и не охватывают концевые районы хромосом (Dobrovol'skaya et al. 2007, Ganal, Roder 2007). Кроме того, микросателлитными маркерами невозможно идентифицировать случаи негомологичных транслокаций или сложных перестроек хромосом, связанных с внутрихромосомными инверсиями или слиянием хромосом, что является следствием процессов отдаленной гибридизации злаков. Поэтому для получения наиболее полного представления о структуре генома гибридов и оценки характера интрогрессии было проведен дополнительный анализ интрогрессивных линий методами in situ гибридизации и С-окрашивания. Анализ проводился для 18 линий с единичными транслокациями и 7 линий с двумя и тремя фрагментами, несущими различные комбинации локусов устойчивости (QLr.icg-lA, QLr.icg-2A и QLr.icg-5B) к бурой ржавчине (табл. 1), отобранных по результатам SSR анализа. Использование метода FISH для анализа интрогрессивных линий. У образца Т. timopheevii var. viticulosum, участвовавшего в образовании исходных гибридов, было выявлено 7 участков гибридизации зонда Spelt 1 с субтеломерными районами хромосом 2A'L, 6A'S, ÎGL, 2GL, 4GL, 5GL, 6GS.

Линия 744-1. FISH на метафазных хромосомах родительской гибридной линии 744-1 показала наличие четырех интрогрессивных фрагментов хромосом

Т. timopheevii: 2GL, 4GL, 5GL по наличию сигнала зонда Speltl в субтеломерных районах хромосом мягкой пшеницы и 6G в хромосому 6В, которая определялась косвенным образом по отсутствию сигнала pSc 119.2 в середине длинного плеча хромосомы 6В, что характерно для Т. timopheevii. Среди них 4BS.4BL-4GL транслокация не обнаруживалась с помощью молекулярного анализа. Транслокации фрагментов 2GL и 5GL затрагивают хромосомы 2D и 5D.

Линия 832-1. Цитологическим анализом хромосом линии 832-1 были выявлены транслокации 3BS.3BL-3GL. 4BS.4BL-4GL и 5BS.5BL-5GL, а также фрагмент 1А1 хромосомы Т. timopheevii (рис. 3). Транслокации фрагментов 4GL и 5GL выявлялись благодаря локализации зонда Speltl на длинных плечах хромосом 4В и 5В, соответственно. Фрагменты хромосом 3GL и 1А1 обнаруживались по присутствию сайтов pScl 19.2.

3BS.3BL-3GL

/ 1AS-1AtS.1AtL-1AL

3BS.3BL-3GL

lAS-IA'S.IA'L 1AL

5BS.6BL-5GL

5BS.5BL-5GL

Чь

Ч 'V А

4B5.4BL^GL /

# 3BS.3BL-3GL.

(а) 5BS.5BL-SGL R»^.ilBS.4BL-4GL (6)

>ч

5BS.5BL-5GL

(В)

?Р

" SBS.5BL-5GL 2В ш

П11 5BS.5BL-5QL 21

>r#'iB i -Ч

v*5

ä £

Рис. 3. FISH на метафазных хромосомах гибридной линии 832-1 (а), интрогрессивной линии 5352-171 (б). Зонды Speltl (красный) и pScl 19.2 (зеленый). С-окрашивание интрогрессивной линии 5352-180 (в)

Поколение BC3F2 линий 744-1 и 832-1. В анализ были взяты двадцать пять линий, содержащих в своем геноме от одного до трех интрогрессивных фрагментов от Т. timopheevii по данным SSR-анализа: 1) потомки линии 744-1 (3862-*, 3866-*, 3869-*), 2) потомки линии 832-1 (5352-*, 5360-*, 5366-*), а также родители Саратовская 29, Т. timopheevii и гибридные линии 744-1 и 832-1 (табл. 1).

Таблица 1. Интрогрессивные фрагменты от Т. timopheevi, обнаруженные в линиях мягкой

пшеницы молекулярно-генетическими и цитологическими методами

N Линия SSR анализ FISH С-окрашивание

1 3862-1 2GL 2GL 2GL

2 3862-4 2GL 2GL 2GL

3 3862-5 2GL 2GL 2GL

4 3862-15 2GL 2GL 2GL

5 3862-18 2GL 2GL 2GL

6 3862-20 2GL 2GL, del6BL 2GL, del6BL

7 3869-43 6GL (2)* 6GL 6GL

8 3869-47 6GL (2)* 6GL 6GL

9 3869-50 6GL (1)* 6GL nd

10 3869-51 6GL (2)* 6GL 6GL

11 3869-54 6GL (2)* 6GL 6GL

12 5352-70 1А', 2GS 5GL 5GL 2GS, 5GL

13 5352-73 1А', 2GS 5GL 5GL 2GS, 5GL

14 5352-75 5GL 5GL 5GL

15 5352-79 1А' 5GL 5GL 5GL

16 5352-83 1А', 2A'L - -

17 5352-104 1А', 2A'L - -

18 5360-107 2GS - 2GS

19 5366-146 2A'L, 5GL 5GL 5GL

20 5366-157 5GL 5GL 5GL

21 5366-171 5GL 5GL3GL 5GL

22 5366-180 5GL 5GL 5GL

23 5366-187 5GL 5GL 5GL

24 5360-191/5 2A'L, 5GL 5GL 5GL

25 5360-191/28 5GL 5GL 5GL

26 744-1 1A', 2GL, 5A'L, 5GL, 2GL, 4GL, 2GL, 4GL, 5GL, 6GL

6GL 5GL, 6GL

27 832-1 1A1, 2A'S. 2A'L, 2GS, 1 A', 3GL, 1A1, 2A'S. 2A'L, 2GS,

3A'L, 5A'L, 5GL, 6GL 4GL, 5GL, 4GL, 5GL, 6GL

- интрогрессивные фрагменты не были обнаружены данным методом, nd - анализ не проводился, * - цифры 1 и 2 отмечают разные по длине интрогрессивные фрагменты одной и той же хромосомы в BC3F2 линиях. Жирным шрифтом выделены интрогрессивные фрагменты, выявляемые только одним или двумя методами.

С помощью in situ гибридизации с зондами pScl 19.2 и Speltl были подтверждены транслокации, затрагивающие хромосомы 2G, 5G, 6G у изучаемых интрогрессивных и родительских гибридных линий, выявленные SSR-анализом (табл. 1). Было обнаружено, что транслокация 3BS.3BL-3GL сохранилась в потомстве. С использованием зонда pAsl, специфичного для D генома, показана интрогрессия фрагмента 2GL в 2D хромосому, что невозможно определить с помощью SSR анализа. У линии 3862-20 выявлена делеция длинного плеча хромосомы 6В. Интрогрессивные фрагменты 1А1, 2A'L не выявлялись с помощью

FISH из-за уменьшения размеров фрагментов в процессе беккроссирования и недостаточной маркированности А и А1 геномов.

Использование метода С-окрашивания для анализа интрогрессивных линий. Транслокации, затрагивающие хромосомы G генома, выявлялись более успешно, чем транслокации, затрагивающие А и А' геномы, поскольку хромосомы В и G геномов несут больше гетерохроматина и окрашиваются более интенсивно.

Линия 744-1. С помощью дифференциального С-окрашивания хромосом линии 744-1 были выявлены интрогресснвные фрагменты, детектированные нами с помощью метода FISH: 2GL, 4GL, 5GL и 6GL. Хромосома 2D не выявлена методом С-окрашивания, гак как ее структура была изменена в связи с транслокацией 2DS.2GL. Транслокация 5DS.5GL обнаруживалась по яркому теломерному и интсрстицнальным бэпдам, характерным для длинного плеча 5G хромосомы. Фрагмент 1 А' не выявлялся данным подходом.

Линия 832-1. У линии 832-1 выявлялись транслокации фрагментов 1А1, 2А1, 2GS, 4GL, 5GL. Также у линии 832-1 был обнаружен яркий терминальный бэпд, локализованный на длинном плече хромосомы 6D, нетипичный для данной хромосомы. Это дает нам возможность предположить наличие у данной линии терминальной транслокации хромосомы 6G Т. timopheevii в длинное плечо хромосомы 6D, а не в 6П. Терминальный фрагмент 5GL в хромосоме 5В выявлялся по яркому темному теломерному бэнду. Транслокация 5BS.5BL-5GL была впервые описана Бадаевой с соавт. (Badaeva et al., 1991). В 1994 году Ямамори (Yamamori) была показана связь между устойчивостью к бурой ржавчине сортов мягкой пшеницы с присутствием в их геноме данной транслокации.

Поколение BC3F2 линий 744-1 и 832-1. С-окрашивание выявило транслокации, затрагивающие хромосомы 2G, 5G, 6G у интрогрессивных и родительских линий, выявленные SSR-анализом (табл. 1, рис. Зв). Интрогрессивные фрагменты 1А*, 2AL не выявлялись из-за уменьшения размеров фрагментов в процессе беккроссирования и недостаточной маркированности А и А* геномов. Транслокация 6DS.6DL-6GL не сохранилась в потомстве.

Сопоставление данных трех методических подходов по оценке геномного состава указывает на то, что наиболее точное описание структуры генома и хромосомных перестроек, возникающих при гибридизации видов с частичной гомеологией хромосом, можно дать с использованием только комплексного молекулярно-генетического и цитологического анализов (табл. 1). SSR-анализ позволил точно определить размеры и локализацию 70% интрогрессивных фрагментов. FISH и С-окрашивание оказались более эффективны для выявления терминальных транслокацци, делеций и транслокаций, затрагивающих хромосомы D генома.

Таким образом, среди 25 проанализированных линий встречается 10 различающихся по геномному составу вариантов линий. Следует также отметить, чго линии с транслокациями в хромосомах 5В, 2А и 1А, несут соответственно локусы QLr.icg-5B. QLr.icg-2A и QLr.icg-lA, определяющие устойчивость к бурой ржавчине (Леонова и др. 2008).

Сценка выбранных линий популяции BC3F3 на устойчивость к бурой ржавчине.

Тест tía проростках. Исходный сорт мягкой пшеницы Саратовская 29, взятый в качестве контроля, сильно поражается бурой ржавчиной (балл=4), а гибридные

линии 744-1 и 832-1 практически имуины к этому патогену' (балл=0-1) (табл. 2). В тесте на проростках наиболее устойчивыми оказались линии, содержащие в геноме интрогрессивный фрагмент 5GL от Т. timopheevii с главным локусом устойчивости QLr,icg-5B (табл. 2). Это линии 5352-70, 5352-73, 5352-75, 5352-79, 5366-146, 5366157, 5366-171, 5366-180, 5366-187, 5360-191/5 и 5360-191/28. Все остальные линии не обладали ювенильной устойчивостью и оказались средне- и высоковосприимчивыми (балл=3 и 4). В том числе линии, содержащие в геноме интрогессивные фрагменты только с минорными локусами устойчивости QLr.icg-lA и QLr.icg-2A, также были восприимчивы к патогену (табл. 2).

Оценка устойчивости к бурой ржавчине на стадии взрослых растений в полевых условиях. Поскольку у линий, содержащих одни и те же комбинации интрогрессивиых фрагментов, развитие заболевания должно происходить одинаково, то для оценки устойчивости к бурой ржавчине на стадии взрослых растений было выбрано 8 линий с единичными транслокациями и 7 линий, содержащих различные комбинации интрогрессивиых фрагментов от Т. timopheevii, в том числе с главным (QLr.icg-SB) и мииорными (QLr.icg-lA, QLr.icg-2A) локусами устойчивости к бурой ржавчине (табл. 2). Созданные линии позволяют оценить как индивидуальный вклад главного локуса QLr.icg-5B, так и комбинаций главного и минорных локусов в формирование устойчивости. Кроме того были изучены линии, которые позволили оценить формирование устойчивости в случае комбинации только двух минорных локусов QLr.icg-lA и QLr.icg-2A.

Западно-Сибирская популяция листовой ржавчины представлена физиологическими расами, преодолевающими 28 известных Lr генов устойчивости. Большинство изолятов вирулентны к генам Lr!, 2b, 2с, 3а,3ка, 3bg, 9, 10, 11, 14а, 14b, 15. 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 26, 27+31, 29, 30, 32, 33, 44 и В и авирулентпы к генам Lrl9, 24, 25, 28, 36, 38, 45, 47 (Сочалова, Лихенко 2011).

Оценка устойчивости к бурой ржавчине проводилась в 2009-2010 it. на экспериментальных участках 2 и 3. Для оценки динамики поражения линий возбудителем бурой ржавчины на поле 3 в 2009 и 2010 гг. было проведено несколько измерений с интервалом в семь дней после появления признаков болезни. Развитие бурой ржавчины у анализируемых линий в течение двух сезонов проходило сходным образом. Устойчивость на уровне 0-1 балла по шкале Майнса-Джексона проявили как линии с единичными фрагментами 5G хромосомы, содержащие локус устойчивости QLr.icg-SB (Леонова и др. 2008), так и линии, содержащие этот локус в комбинации с другими фрагментами Т. timopheevii.

Таблица 2. Характеристика линий мягкой пшеницы по устойчивости к бурой ржавчине на стадии проростков и азрослых растений

Интрогрессивные Тест на Поле 2, Поле 3,

№ Линия фрагменты от проростках, 2010, в 2009/2010,

Т timopheevii в баллах баллах в баллах

1 3862-1 2A'L 2GL 3

2 3862-4 2GL 3

3 3862-5 2GL 3 3-4 4/4

4 3862-15 2GL 3 3 4/4

5 3862-18 2GL 3

6 3862-20 20Ь 3

7 3869-43 601. 3

8 3869-47 бв!. 3-4 3 4/4

9 3869-50 бвь 3-4 3 4/4

10 3869-51 бвь 3 3 4/4

11 3869-54 бОЬ 3-4

12 5352-70 1А' 2С8 0-1 0-1 0-1/1

13 5352-73 1А'208 5СЬ 1-2

14 5352-75 5СЬ 1-2, X

15 5352-79 1А' 5СЬ 2 0-1 0-1/1

16 5352-83 1А' 2А'Ь 3 3 3/3

17 5352-104 1А' 2Л'Ь 3 3 3/3

18 5360-107 2С5 3-4 3 4/4

19 5366-146 1.Х 1 1/1

20 5366-157 5СЬ 2

21 5366-171 ЗОЬ 5СЬ 2 0-1 1/1-2

22 5366-180 5СЬ 2, X 0-1 1/1-2

23 5366-187 5СЬ 2

24 5360-191/5 2А'Ь 50Ь 2 1 1/1-2

25 5360-191/28 2 1 1/1-2

26 линия 744-1 1А', 2в, 4С1. 5А1!., 5СЬ, 0-1 0 0/1

27 линия 832-1 1А', 2А\ гея, ЗЛ'Ц ЗО., 40Ц 5А'Ь, 601. 0-1 0 0/0

28 С29 - 4 4 4/4

Жирным шрифтом выделены хромосомы, несущие локусы устойчивости к бурой ржавчине X - гетерогенная реакции

Из литературы известно, что на хромосоме 5В локализовано два Ьг гена: Ьг52, происходящий из генома Т. аехНтт и картированный в коротком плече хромосомы, и геи Ьг18, происходящий из генома Т. НторИееуИ ззр, Ипюркеех'И, который находится в теломерной области длинного плеча (Уатапшп 1994, РпеЬе с! а1. 1996, ШеЬеП е( а1. 2005). На основании данных по происхождению и локализации можно предположить, что локус на хромосоме 5В линии 832-1 является геном Ьг18 или его аллелем. Ранее Леоновой с соавт. (2010) на основании молекулярного анализа и теста на устойчивость с использованием набора рас бурой ржавчины было показано, что ген ЬгТ(2, картированный в области расположения (.}Ьг.1сё-5В локуса, отличается от гена Ьг18 и представляет, по-видимому, новый более эффективный для Западной Сибири аллель данного гена, который также имеет происхождение из генома Т. ИторИееуИ.

Присутствие в геноме линий 5352-83 и 5352-104 фрагментов 1А' и 2А* с минорными локусами устойчивости к бурой ржавчине О/.г. ¡с£-2А и QLr.icg-lA оказывало небольшой сдерживающий эффект на проявление болезни и не

приводило к развитию гиперчувствительного ответа (бапл=3). Однако резкое увеличение числа пустул у линий 5352-83 и 5352-104 началось позже, чем у контрольного сорта и линий, не несущих локусы устойчивости (рис. 4). Поскольку полигенная устойчивость с большей вероятностью будет более эффективной, чем моногенная, данные локусы могут быть использованы в селекционных программах для объединения с другими генами и локусами с целью создания генотипов, обладающих расонеспецифической устойчивостью широкого спектра. Наилучшими характеристиками по устойчивости обладали линии 5352-70 и 535279, содержащие в геноме два локуса дЬг.^-1Л и ()1.г1с?г5В.

шеф

10 О

и / .

/ /'' /■ *

--- — Саратовская 29

----------3869-51(60

------5352-104 (1А'2А'Ц

------------5352-83 (1А'2АТ.)

--5360-191/5 (2АЧ. 5СЬ)

--------5366-180 (5Си

.......— 5352-70 (1А1 гее 5Я.)

-Н

--•'В»

05.07 13.07 20.07 28.07 03.08 Дата оценки

Рис. 4. Динамика развития бурой ржавчины у шести линий мягкой пшеницы с различными интрогрессивными фрагментами Т. НторИееуи в процентах пораженной площади листа в течение вегетационного периода 2010 г. на участке 3

Таким образом, можно сделать вывод, что устойчивость интрогрессивяых линий на стадии проростков коррелировала с устойчивостью на стадии взрослых растений. Полученные результаты дают возможность предположить, что локус <2и.\с%-5В является эффективным на всех стадиях развития растения и его присутствие в геноме достаточно для приобретения растением устойчивости к популяции листовой ржавчины Западно-Сибирского региона России.

Характеристика кнтрогрессивных линий по количественным признакам. Перенос в мягкую пшеницу небольших фрагментов генома отдаленных видов при сохранении генетического окружения коммерческого сорта является обычным подходом для изучения и использования ресурса ценных генов и аллелей, которые присутствуют в геноме диких видов. Анализ количественных признаков у линий проводился на экспериментальных участках 2 в 2010 г. и 1 в 2009 и 2010 гг.

Высота растения. Среднее значение этого параметра варьировало от 103,20±0,75 см на участке 1 в 2009 г. до П9,13±0,58 на поле 2 в 2010 г. Было обнаружено, что линии 3862-5 и 3862-15 с транслокацией 2i.JS.2GL (рис. 2) достоверно ниже (р<0,005 для полей 1 и 2) родительского сорта Саратовская 29 но

высоте. Поскольку создание сортов с короткой соломипой является предпочтительным в селекции на устойчивость к полеганию, эти линии могут иметь практическую ценность в селекционных программах. По литературным данным практически все хромосомы в различной степени оказывают влияние на высоту растения. К настоящему моменту описан 21 ген, определяющий уменьшение высоты у пшеницы, однако, лишь несколько широко используются (Liu et al. 2005).

Длина колоса и число колосков в колосе. Среднее значение длины колоса у изученных линий варьирует от 7,30 до 10,05 см. в 2009 г., от 6,70 до 9,62 см. на поле 1 и от 6,90 до 9,15 см. на поле 2 в 2010 году. По результатам сравнения каждой из анализируемых линий с родительским сортом было обнаружено, что линии 744-1 и 832-1, 5352-70, 5352-104 имеют достоверно большую длину колоса, чем сорт Саратовская 29 (р<0,005). Ни одна из интрогрессивных линий не уступала по числу колосков исходному сорту. Этот показатель был достоверно выше у линий 3862-5, 3862-15 и 5360-107 на участках 1 и 2.

Число зерен в колосе. Обнаружено, что у изученных интрогрессивных линий такой показатель, как среднее количество зерен в главном колосе, колеблется в пределах от 21 до 41 шт. Число зерен в главном колосе, в среднем в повторности, соответствовало уровню родительского сорта Саратовская 29.

Масса зерна в колосе и с растения. Среднее значение массы зерна в колосе у всех линий в основном соответствовало уровню исходного сорта. Наибольшие значения по этому признаку отмечены для линий 3862-5, 3862-15 в условиях поля 1 в 2009 г. и для линий 5352-70, 5352-104, 5360-107 в 2010 г., которые, как было отмечено выше, имеют хорошие показатели и по другим признакам колоса. Однако достоверных отличий для всех изученных линий по двум годам не выявлено.

Масса 1000 зерен. Этот признак также является зависимым от климатических условий и уровня инфекционного фона. По признаку масса 1000 зерен все интрогрессивные линии достоверно не отличались от родительского сорта.

Следует отметить, что у всех изученных линий, за исключением исходных гибридных линий 744-1 и 832-1 с множественными транслокациями, не отмечено отрицательного влияния генома Т. timopheevii на показатели продуктивности, а в некоторых случаях, наоборот, показан положительный эффект.

ВЫВОДЫ

1) Получено 38 линий мягкой пшеницы с единичными транслокациями хромосом 2G, 5G, 6G от Т. timopheevii и 72 линии, содержащие комбинации двух интрогрессивных фрагментов хромосом 1А', 2А1, 3G, 2G, 5G, 6G в различных сочетаниях.

2) Выявлено, что в процессе беккроссирования происходит значительное уменьшение длины интрогрессивных фрагментов 1А1, 2А', 2GS, 6G (30% и более), тогда как размер фрагментов 2GL и 5GL остается практически неизменным (сокращение длины на 5% и менее).

3) Установлено, чго цитологические методы (С-окрашивание, in situ гибридизация) позволяют более эффективно выявлять терминальные транслокации, делеции и транслокации, затрагивающие хромосомы D генома по сравнению с SSR-анализом у интрогрессивных линий Т. aestivum-T. timopheevii

4) Впервые показано, что интрогресснвпые линии мягкой пшеницы, несущи только главный локус QLr.icg-5B, являются устойчивыми к бурой ржавчине н стадии проростков и взрослых растений. Линии, в геноме которых присутствуем комбинация из минорных локусов QLr.icg-2A и QLr.icg-lA, являютс среднечувствительными. Показано, что присутствие в геноме только минорны: локусов QLr.icg-2A и QLr.icg-lA оказывает сдерживающий эффект на развита болезни и пе приводит к развитию гиперчувствительного ответа.

5) Не выявлено негативного влияния интрогрессивных фрагментов 1А1, 2A'L 2GS, 2GL, 5GL, 6G от Т. timopheevii на количественные признаки линий мягко! пшеницы. Показан положительный эффект для транслокации 2DS.2GL Hi снижение высоты у растений и на признаки, определяющие озерненность колоса.

Список публикаций по теме работы Статьи:

1) Тимонова Е М.. Леонова И.Н., Белан И.А., Россеева Л.П., Салима Е.А. Влияние отдельны: участков хромосом Т. timopheevii па формирование устойчивости к болезням i количественные признаки мягкой пшеницы // Вестник ВОГиС (2012), Т. 16 (1), С. 142-159

2) Timonova Е.М.. Leonova I.N., Roder M.S., Salina Е.А. Marker-assisted development am characterization of a set of Triticum aestivum lines carrying different introgressions from T. timopheevii genome // Molecular breeding (2012), DOl: 10 1007/sl 1032-012-9776-x

3) Адонина И.Г., Петраш H.B., Тимонова E M. Христов Ю.А., Салина Е.А. Создание i изучение устойчивых к листовой ржавчине линий мягкой пшеницы с транслокациями о' Aegilops speltoides Tausch 11 Генетика (2012), Т. 48(4), С. 488-494

4) Салина Е.А., Егорова Е.М.. Адонина И.Г., Добровольская О Б , Будашкина Е.Б., Леонов: И.Н. ДНК-маркеры для генотипирования линий мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) с генетическим материалом Aegilops speltoides Tausch и Triticum timopheevii Zhuk // Вестник ВОГиС (2008), Т. 12 (4), С.620-628

Патент:

1) Пат. 2407283 RU, МПК А 01 Н 1/104. Способ создания линий мягкой пшеницы, устойчивых к бурой ржавчине / Салина Е.А., Леонова И.Н., Будашкина Е.Б., Егорова Е М -Опубл. 27.12.2010. - Бюл. №36. Тезисы конференций:

1) Егорова Е.М.. Леонова И.Н., Салина Е.А., Получение интрогресивных линий мягкой пшеницы, содержащих различные фрагменты А' и G геномов тетраплоидной пшеницы Г. timopheevii / Материалы всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск (2007), 16-19 сентября, С. 82-84.

2) Леонова И.Н., Егорова Е М.. Будашкина Е.Б, Салина Е.А., Использование методов «молекулярной» селекции для получения устойчивых к листовой ржавчине линий мягкой пшеницы, содержащих интрогрессии от Triticum timopheevii. / Материалы второй всероссийской конференции «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам», Санкт-Петербург (2008), 29 сентября - 2 октября, С. 153-156.

3) Егорова Е.М., Леонова И.Н., Будашкина Е.Б., Салина Е.А., Получение и анализ линий мягкой пшеницы, содержащих единичные интрогрессивные фрагменты от Triticum timopheevii / V Международная научная конференция «Факторы экспериментальной эволюции организмов», г. Алушта, Украина (2009), 21-25 сентября, Т. 6 С. 298-303

4) Егорова Е.М.. Леонова И.Н., Салина Е.А., Будашкина Е.Б, Использование молекулярно-генетических подходов для получения и характеристики линий Triticum aestivum содержащих единичные участки интрсгресий от Triticum timopheevii / Международная научная школа-конференция "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях", Звенигород (2008), 7-12 декабря, С. 29.

5) Егорова Е.М., Леонова И.Н., Будашкина Е.Б., Салина Е.А., Анализ интрогрессивных линии мягкой пшеницы, содержащих генетический материал Triticum timopheevii, полученных с использованием методов молекулярной селекции / Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, V съезд

Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров, Москва (2009), 21-28 июня Ч 1 С

224. > • > ■

6) Salina Е.А., Leonova I.N., Egorova Е.М., Budashkina E.B., Roder M., Biotechnology for development of resistant wheat genotypes / Proc. of the German-Russian forum Biotechnology GRFB'09, Novosibirsk (2009), 15-19 June, P.43.

7) Egorova E.M., Leonova I.N., Budashkina E.B., Salina E.A. Development and characterization of Triticum aestivum x T. timopheevii near-isogenic introgression lines by using marker-assisted selection / Proc. of the International Conference Plant Genetics, Genomics and Biotechnology Novosibirsk (2010), 7-10 June, P. 60.

8) Egorova E.M., Leonova I.N., Budashkina E.B., Salina E.A. The application of microsatellite markers for development of leaf rust resistant near isogenic lines earning OLr.icg-5B loci /' Proc of International Conference "Green Plant Breeding Technologies", Vienna, Austria (2010) Feb 2-5, P. 46.

9) Salina E.A., Leonova I.N., Egorova E.M., Budashkina E.B., Roder M.S. Development and application of Triticum timopheevii mapping data in wheat resistance management strategies / Proc. of 8th International Wheat Conference, St.Petersburg (2010), June 1-4. P. 468- 469

10)Egorova E„ Leonova I, Budashkina П., Salina E. Application of marker assisted selection for transferring resistance genes from Triticum timopheevii to bread wheat / Proc 20th ITMI/2ndWGC Joint Workshop, Beijing, China (2010), September 1-5, P. 78.

11) Salina E., Dobrovolskaya 0., Timonova E.. Silkova O., Leonova I., Sourdille P Feuillet С Development of molecular and genetic stocks for a physical map of 5B chromosome of common wheat / Proc. of the international Conference "Wheat genetic resources and genomics"

Novosibirsk (2011), August 28-31, p.72

12) Leonova I.N., Timonova E.M., Budashkina E.B., Kalinina N.P., Salina E.A., Development and utilization of leaf rust resistance lines with multiple and single introgressions of the T. timopheevii genome / Proc. of international Conference "Wheat genetic resources and genomics", Novosibirsk (2011), August 28-31, p. 35

Подписано к печати 18.09.2012 г.

Формат бумаги 60/90 1/16. Печ. 1. Уч. изд. 0,7

Тираж 110 экз. Заказ 67

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тимонова, Екатерина Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Использование в селекции диких и культурных сородичей пшеницы в качестве доноров генов устойчивости к патогенам злаков.

1.1.1. Особенности вовлечения родственных видов пшеницы в селекционный процесс.

1.1.2. Примеры использования межвидовой гибридизации в селекции на устойчивость к болезням.

1.2. Краткое описание Т. Нторкееуи, ее сородичей и примеры использования пшениц группы Т1торЬееу1 в селекционных работах.

1.3. Коллекция гибридных линий, созданная в ИЦиГ СО РАН.

1.4. Генетические основы устойчивости к фитопатогенам.

1.4.1. Расоспецифическая, вертикальная устойчивость.

1.4.2. Расонеспецифическая, горизонтальная устойчивость.

1.4.3. Влияние генетического окружения на эффективность генов устойчивости.

1.4.4. Супрессия генов устойчивости.

1.5. Характеристика /?-генов устойчивости.

1.5.1. Классификация 7?-генов устойчивости и типы их взаимодействий с патогенами.

1.5.2. Геномная архитектура Я-генов устойчивости.

1.5.3 Полиморфизм Я-генов устойчивости.

1.6. Маркер-ориентированный отбор/селекция (отбор/селекция с помощью молекулярных маркеров).

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Растительный материал.

2.2. Выделение ДНК из растительного материала.

2.3. Микросателлитный анализ.

2.4. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH).

2.5. С-окрашивание хромосом злаков.

2.6. Оценка устойчивости к бурой ржавчине.

2.6.1. Оценка устойчивости к бурой ржавчине на стадии проростков.

2.6.2. Оценка устойчивости к бурой ржавчине на стадии взрослых растений

2.7. Анализ количественных признаков.

2.8. Статистический анализ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1.1. Создание интрогрессивных линий с помощью SSR-маркеров.

3.1.2. Оценка протяженности интрогрессивных фрагментов Т. timopheevii у полученных линий мягкой пшеницы.

3.2. Цитологический анализ интрогрессивных линий.

3.2.1. Использование метода FISH для анализа интрогрессивных линий.

3.2.2. Использование метода С-окрашивания для анализа интрогрессивных линий.

3.3. Оценка выбранных линий BC3F3 популяции на устойчивость к бурой ржавчине.

3.3.1. Тест на проростках.

3.3.2. Оценка устойчивости к бурой ржавчине на стадии взрослых растений в полевых условиях.

3.4. Характеристика интрогрессивных линий по количественным признакам

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Использование MAS при создании интрогрессивных линий пшеницы.

4.2. Определение хромосомной локализации и размера интрогрессивных фрагментов в созданных линиях.

4.3. Линии пшеницы, содержащие единичные интрогрессивные фрагменты или их комбинации от Т. іїторкееуіі, как источник новых генов, контролирующих хозяйственно-ценные признаки.

4.4. Влияние транслокаций от Т. timopheevii на количественные признаки интрогрессивных линий мягкой пшеницы.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и характеристика линий мягкой пшеницы с единичными транслокациями от Triticum timopheevii Zhuk. с использованием молекулярно-генетических методов"

Актуальность проблемы. Генетическая эрозия, вызванная современными методами культивирования растений, привела к сужению разнообразия мягкой пшеницы Triticum aestivum L. по генам, контролирующим хозяйственно-ценные признаки, в том числе по генам устойчивости к болезням (Fiebe et al. 1996). Для увеличения генетического разнообразия и в качестве источников эффективных генов устойчивости используются сородичи пшеницы — дикие и культурные виды злаков (Friebe et al. 1996, Гончаров 2002). Одним из таких видов является Т. timopheevii Zhuk. (2п=28, геномная формула GGAlAl), обладающий комплексным иммунитетом к желтой, бурой и стеблевой ржавчинам, мучнистой росе, пыльной и твердой головне, фузариозу, гессенской и шведской мухам, клопу-черепашке, зеленоглазке и пьявице (Дорофееев и др. 1979). Вид Т. timopheevii недостаточно использовался в селекционных работах и потенциал этого вида как источника эффективных генов устойчивости еще далеко не исчерпан к настоящему моменту (Broun-Guedira et al. 1996, Будашкина и др. 1988). Однако Т. timopheevii имеет ряд отрицательных качеств, делающих его неудобным для непосредственного использования в селекции. Такими признаками являются пленчатость зерна, ломкость колоса, позднеспелость и полная или реже частичная стерильность F] гибридов от скрещивания с мягкой пшеницей (Дорофеев и др. 1979, Жуковский 1964). Поэтому одной из возможностей использования ценных свойств и генов этого вида является вовлечение в селекционный процесс интрогрессивных линий мягкой пшеницы, полученных путем беккроссирования на второго (рекуррентного) родителя (Friebe at al. 1996, Liu et al. 2006, Qi et al. 2007, Pestsova et al. 2001). Поиск новых и эффективных генов, контролирующих устойчивость к заболеваниям, подбор доноров для селекционных программ и создание новых улучшенных генотипов пшеницы являются неизменно актуальными задачами, направленными на расширение генетического разнообразия сельскохозяйственных культур.

Одним из наиболее распространенных и вредоносных заболеваний пшеницы является бурая ржавчина, вызываемая базидиальным грибом Puccinia triticina Eriks. При развитии сильной эпифитотии потери урожая зерна в результате поражения растений могут достигать 40-50% (Маркелова 2011, Roelfs et al. 1992). Наиболее эффективным способом борьбы является создание и культивирование сортов и линий пшеницы, обладающих устойчивостью к бурой ржавчине. Однако появляющиеся в результате эволюционных процессов новые расы ржавчинных грибов способны быстро преодолевать устойчивость возделываемых сортов, а также приобретать невосприимчивость к применяемым пестицидам. Помимо этого, часто новые сорта, созданные на основе одинаковых генов устойчивости, рекомендуют для выращивания во многих регионах, что может приводить к быстрому накоплению вирулентных рас патогенов и последующему их массовому распространению. Лишь немногие из интенсивно используемых генов устойчивости к бурой ржавчине (Zr-генов) способны на сегодняшний день обеспечить длительную устойчивость (durable resistance) (Kou, Wang 2010, Qi et al. 1999, Singh et al. 2005).

Ранее в ИЦиГ СО РАН была создана коллекция гибридных линий мягкой пшеницы устойчивых к бурой ржавчине, полученная на основе скрещивания T. aestivum с T. timopheevii (Будашкина и др. 1988). И.Н. Леоновой с соавторами (2008) было показано на двух сестринских линиях, что устойчивость к бурой ржавчине детерминируется тремя локусами QLr.icg-lA, QLr.icg-2A и QLr.icg-5B, картированных на хромосомах 1А, 2А и 5В, соответственно. Созданные гибридные линии содержали множественные участки интрогрессии от Т. timopheevii, что негативно влияло на формирование количественных признаков и не позволяло оценить вклад отдельных локусов в формирование признака устойчивости. Тогда как, линии, которые содержали бы только «целевые» локусы в составе единичных участков интрогрессии, могут непосредственно использоваться в селекционном процессе в качестве доноров признаков.

Создание и изучение линий мягкой пшеницы несущих в составе генома только «целевой» ген (почти изогенные линии), или фрагмент хромосомы дикого или культурного родственного вида преследует несколько целей. В первую очередь это оценка вклада гена (или интрогрессивного фрагмента) в формирование признаков (Салина и др. 2008, Uhrin et al. 2010). Помимо этого, линии, содержащие только «целевой» ген (или чужеродныйфрагмент хромосомы) от генотипа-донора, могут использоваться в качестве моделей для картирования генов, изучения их структуры и экспрессии, а также в качестве источника новых генов в селекционном процессе.

Процесс создания интрогрессивных линий с небольшим количеством чужеродного материала в геноме традиционными методами очень трудоемок и может занять продолжительное время. Применение молекулярных маркеров в селекционном процессе снижает временные затраты на 50-70% (Kuchel et al. 2005, Kolmer et al. 2007, Collard, Mackill 2008). Разработка методических подходов и оптимальных схем создания новых генотипов пшеницы, которые могут служить исходным материалом для создания сортов, с использованием молекулярных маркеров, является актуальной проблемой, над которой работают во всем мире (Frish et al. 1999а, 1999b, Randhawa et al. 2009).

Отбор нужных генотипов растений в беккроссных поколениях с помощью молекулярных маркеров (marker assisted backcrossing, МАВ) является одним из новых подходов, который в настоящее время используется для ускорения процессов интрогрессии «целевых» генов и создания почти изогенных линий (Collard, Mackill 2008). Использование молекулярных маркеров позволяет также контролировать элиминацию генетического материала донора и отбирать генотипы с минимальным возможным размером интрогрессивного фрагмента, снижая тем самым вероятность сцепления «целевых» локусов с чужеродными генами, негативно влияющими на формирования хозяйственно-ценных признаков. Кроме того, использование молекулярных маркеров позволяет успешно проводить отбор по генам, фенотипическое проявление которых зависит от условий внешней среды или трудно различимо.

Основная цель нашей работы - это создание интрогрессивных линий мягкой пшеницы с использованием молекулярно-генетических методов и изучение влияния отдельных участков хромосом ТгШсит Иторкевуп ЪЪик. на формирование устойчивости к бурой ржавчине и количественные признаки мягкой пшеницы.

Задачи данного исследования:

1) Создание линий мягкой пшеницы с единичными интрогрессивными фрагментами от Т. иторкееуп или их комбинациями путем контролирования процессов беккроссирования микросателлитными (88Я) маркерами.

2) Молекулярно-цитологический анализ интрогрессивных линий мягкой пшеницы. Определение хромосомной локализации и размера интрогрессированных фрагментов в созданных линиях.

3) Оценка интрогрессивных линий мягкой пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине.

4) Оценка влияния различных фрагментов интрогрессии Т. {¿торкееуН и их комбинаций на хозяйственно-ценные признаки мягкой пшеницы.

Научная новизна работы. В результате проведенной работы нами впервые с применением отбора с помощью молекулярных маркеров были получены линии мягкой пшеницы, несущие единичные транслокации от Т. 1шорНееуИ. Впервые показано, что локус 0Ьглс£-5В, перенесенный в геном мягкой пшеницы от Т. (¿торИевуЦ, обеспечивает устойчивость линий мягкой пшеницы к бурой ржавчине на всех стадиях развития растения. Продемонстрирована эффективность комплексного подхода при использовании молекулярных 88Я-маркеров и цитологических методов для анализа форм мягкой пшеницы, полученных с участием материала Т. ИторкееуП.

Практическая ценность работы. В результате данного исследования получено 5 цитологически стабильных линий мягкой пшеницы с единичными транслокациями от Т. Нторкееуп, обладающих устойчивостью к бурой ржавчине, которые могут быть использованы в селекции в качестве доноров устойчивости. В ходе данной работы был отработан метод маркер-вспомогательного отбора, использование которого позволяет значительно сокращать время получения новых улучшенных генотипов пшеницы. Были отобраны молекулярные маркеры, позволяющие эффективно маркировать локусы, контролирующие признак устойчивости к бурой ржавчине QLrлcg-1А, QLr.icg-2A и

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1) Локус QLr.icg-5B, перенесенный в геном мягкой пшеницы от Т. ИторкееуЦ, обеспечивает устойчивость линий мягкой пшеницы к бурой ржавчине, характерной для Западной Сибири, на всех стадиях развития растения.

2) Комбинация минорных локусов устойчивости к бурой ржавчине ()Ьг. А и QLr.icg-lA у интрогрессивных линий мягкой пшеницы сдерживает развитие болезни на стадии взрослых растений и не приводит к развитию гиперчувствительного ответа.

Личный вклад автора. Основная часть экспериментальной работы и анализ полученных результатов выполнена автором самостоятельно. Данные по устойчивости на стадии проростков предоставлены сотрудниками ГНУ СибНИИРС Россельхозакадемии Сочаловой Л.А. и Христовым Ю.А. Данные по количественным признакам у интрогрессивных линий в Омской области 2009-2010 гг. (поле 1) предоставлены сотрудниками ГНУ СибНИИСХ Россельхозакадемии Беланом И.А. и Россеевой Л.П. Данные по микросателлитным маркерам, уточняющие границы интрогрессивных фрагментов, предоставлены Леоновой И.Н.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 12 международных и российских конференциях, среди которых 1-ая международная школа-конференция молодых учёных «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (2008, Москва-Звенигород), 5-ый съезд ВОГиС (2009, Москва), международная конференция «Генетика, геномика и биотехнология растений» (2010, Новосибирск), международная конференция «Green plant breeding technologies» (2010, Vienna, Austria), международная конференция «Генетические ресурсы и геномика пшеницы» (2011, Новосибирск), 20th ITMI/2ndWGC Joint Workshop (2011, Beijing, China) и другие, а также обсуждались на отчетной сессии ИЦиГ СО РАН (2008, 2011).

Публикации. По результатам исследования опубликовано 17 работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных изданиях, получен патент «Способ создания линий мягкой пшеницы, устойчивых к бурой листовой ржавчине», номер 2407283 RU, от 27 июля 2010.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Тимонова, Екатерина Михайловна

выводы

1) Получено 38 линий мягкой пшеницы с единичными транслокациями хромосом 2G, 5G, 6G от Т. timopheevii и 72 линии, содержащие комбинации двух интрогрессивных фрагментов хромосом 1А1, 2A1, 3G, 2G, 5G, 6G в различных сочетаниях.

2) Выявлено, что в процессе беккроссирования происходит значительное уменьшение длины интрогрессивных фрагментов 1А1, 2А1, 2GS, 6G (30% и более), тогда как размер фрагментов 2GL и 5GL остается практически неизменным (сокращение длины на 5% и менее).

3) Установлено, что цитологические методы (С-окрашивание, in situ гибридизация) позволяют более эффективно выявлять терминальные транслокации, делеции и транслокации, затрагивающие хромосомы D генома по сравнению с SSR-анализом у интрогрессивных линий Т. aestivum-T. timopheevii

4) Впервые показано, что интрогрессивные линии мягкой пшеницы, несущие только главный локус QLr.icg-5B, являются устойчивыми к бурой ржавчине на стадии проростков и взрослых растений. Линии, в геноме которых присутствует комбинация из минорных локусов QLr. icg-2A и QLr.icg-lA, являются среднечувствительными. Показано, что присутствие в геноме только минорных локусов QLr.icg-2A и QLr.icg-lA оказывает сдерживающий эффект на развитие болезни и не приводит к развитию гиперчувствительного ответа.

5) Не выявлено негативного влияния интрогрессивных фрагментов 1А1, 2AlL, 2GS, 2GL, 5GL, 6G от Т. timopheevii на количественные признаки линий мягкой пшеницы. Показан положительный эффект для транслокации 2DS.2GL на снижение высоты у растений и на признаки, определяющие озерненность колоса.

Список публикаций по теме работы Статьи;

1) Тимонова Е.М., Леонова И.Н., Белан И.А., Россеева Л.П., Салина Е.А. Влияние отдельных участков хромосом Т. timopheevii на формирование устойчивости к болезням и количественные признаки мягкой пшеницы // Вестник ВОГиС. 2012. Т.16 (1), С.142-159

2) Timonova Е.М., Leonova I.N., Röder M.S., Salina Е.А. Marker-assisted development and characterization of a set of Triticum aestivum lines carrying different introgressions from T. timopheevii genome // Molecular breeding. 2012. DOI: 10.1007/sl 1032-012-9776-x, published online 5 September

3) Адонина И.Г., Петраш H.B., Тимонова E.M., Христов Ю.А., Салина Е.А. Создание и изучение устойчивых к листовой ржавчине линий мягкой пшеницы с транслокациями от Aegilops speltoides Tausch // Генетика. 2012. Т. 48(4), С. 488-494

4) Салина Е.А., Егорова Е.М., Адонина И.Г., Добровольская О.Б., Будашкина Е.Б., Леонова И.Н. ДНК-маркеры для генотипирования линий мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) с генетическим материалом Aegilops speltoides Tausch и Triticum timopheevii Zhuk. // Вестник ВОГиС. (2008), Т. 12 (4), С.620-628

Патент:

1) Пат. 2407283 RU, МПК А 01 Н 1/104. Способ создания линий мягкой пшеницы, устойчивых к бурой ржавчине / Салина Е.А., Леонова H.H., Будашкина Е.Б., Егорова Е.М. - Опубл. 27.12.2010. - Бюл. № 36. Тезисы конференций: 1) Егорова Е.М., Леонова И.Н., Салина Е.А., Получение интрогресивных линий мягкой пшеницы, содержащих различные фрагменты А1 и G геномов тетраплоидной пшеницы Т. timopheevii / Материалы всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск (2007), 16-19 сентября, С. 82-84.

2) Леонова И.Н., Егорова Е.М., Будашкина Е.Б., Салина Е.А., Использование методов «молекулярной» селекции для получения устойчивых к листовой ржавчине линий мягкой пшеницы, содержащих интрогрессии от Triticum timopheevii. / Материалы второй всероссийской конференции «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам», Санкт-Петербург

2008), 29 сентября - 2 октября, С. 153-156.

2009), 21-25 сентября, Т. 6 С. 298-303

4) Егорова Е.М., Леонова И.Н., Салина Е.А., Будашкина Е.Б., Использование молекулярно-генетических подходов для получения и характеристики линий Triticum aestivum содержащих единичные участки интрогресий от Triticum timopheevii / Международная научная школа-конференция "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях", Звенигород (2008), 7-12 декабря, С. 29.

5) Егорова Е.М., Леонова И.Н., Будашкина Е.Б., Салина Е.А., Анализ интрогрессивных линий мягкой пшеницы, содержащих генетический материал Triticum timopheevii, полученных с использованием методов молекулярной селекции / Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, V съезд Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров, Москва (2009), 21-28 июня, Ч. 1, С. 224.

7) Egorova E.M., Leonova I.N., Budashkina E.B., Salina E.A. Development and characterization of Triticum aestivum x T.timopheevii near-isogenic introgression

8) Egorova E.M., Leonova I.N., Budashkina E.B., Salina E.A. The application of microsatellite markers for development of leaf rust resistant near isogenic lines carriing QLr.icg-5B loci / Proc. of International Conference "Green Plant Breeding Technologies", Vienna, Austria (2010), Feb 2-5, P. 46.

10) Egorova E„ Leonova I., Budashkina E., Salina E. Application of marker assisted selection for transferring resistance genes from Triticum timopheevii to bread wheat / Proc. 20th ITMI/2ndWGC Joint Workshop, Beijing, China (2010), September 1-5, P. 78.

11) Salina E., Dobrovolskaya O., Timonova E„ Silkova O., Leonova I., Sourdille P., Feuillet C., Development of molecular and genetic stocks for a physical map of 5B chromosome of common wheat / Proc. of the international Conference "Wheat genetic resources and genomics", Novosibirsk (2011), August 28-31, p.72

Информация о работе

Тимонова, Екатерина Михайловна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2012
ВАК 03.02.07

Диссертация

Получение и характеристика линий мягкой пшеницы с единичными транслокациями от Triticum timopheevii Zhuk. с использованием молекулярно-генетических методов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы