Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОЛИСАХАРИДЫ RHIZOBIUM LEGUMIHOSARUM И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ПЕКТИНАМИ РАСТЕНИЙ-ХОЗЯЕВ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ПОЛИСАХАРИДЫ RHIZOBIUM LEGUMIHOSARUM И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ПЕКТИНАМИ РАСТЕНИЙ-ХОЗЯЕВ"

ft-29W3

. oiyäiA. jitamia и овдша даглм имодса ждцвт; yccF ордй1а т1УДогюго ifpACäioro зилмаш ккяшт шэдшюш

и вирусологии им.д, к.зйшиотного

На правах рукописи

• KOÜAJIEjJCKAfl Tawaj'ia (Дихайловна

.УД!- 579.841.31,222 114:581.19

полисахан-1дц rhizobiuu legumih03aruu * и их взщюдкотше с лекгииаж растений-хозяев

03.00,07 - микробиология

Автореферат диссертации на ооисканче ученой степени кандидат« биологических к ауте

Киев - Г980

** ■ Работа выполнена в Институте микробиологии и вирусологии им.Д.К.Заболотного АН УССР

Научной руководитель г доктор биологических неук, профессор ♦ , ЗАХАРОВА И.Я.

Официальные оппоненты: доктор биологических нгук *

АНТИПЧУК А.ф.

кдадидат биологических неук МАЛИЧЕНКОС.М,

Ведущая оргаимзздип: Институт биохимии им. А.Н.Баха АН СССР,

г..Досква

Зоцита состоится о^/ 1988гояа в & - час.

иа заседании специализированного Совета Д 016.06,01 при

Институте микробиологии и вирусологии им•Д.К.Заболотного АН УССР

по адресу: 252 (>27, ГСП, Кие в-1*13, ул.Зайолотиого, 26

С диссертацией можно ознакомиться в 61 Злиотеке Института-микробиологии и вирусологии ии.Д.К.Эшйолотного ДН УССР.

Автореферат диссертации разослан Г9В6 г

Ученый секретарь специализированного Совета нандидат биологических неук

3,А.Коьаленко

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ ' \ .

Актуальность темы. За последнее время резко возрос интерес.

к биологической фиксации азота как экономичному и экологически

чистому источнику азота в земледелии.

Особый интерес представляет сныбиотическая азот^иксация»

осуществляемая клубеньковыми бактериями.и бобовшн растениями,

на дол» которой приходится не менее половины всего биологически

■■■■ 1 * ■ L ■ ' . 1 * фиксируемого- азота* £ля более полного, использования этой аэот-

Зиксируодей системы необходимо детальное исследование всех йак- '

торов, определяющих успешное развитие симбиоза и высокий уровень

аэотЗикоации. . , *

. Согласно, современным представлениям, первыми стадиями раз»

вития бобово-риэоОиального симбиоза является предгоЦекционное

; вз аимоде ист в ие клубеньковых бактерий с■коршат бобовых растений.

, Поедлолагттся, что в 'эточ ■ период,. до накала процчсга ин^ицирова-

нил, проявляется'совместимость симбионтов и вашу» роль в атом

'^•'Играют,' с* одной стороны, поверхностно Локализоввишэ полисахари-

■ ди клубеньковых Дактерий, а с другой - пектины бобовых растений.

j: ■ Соответствие этих компонентов друг другу ло^ит в основе специ$и-

ческого распознавания симбионтов. ,;),о сих пор/ однако, информация

о.лектин-углеводиом вэаимодвпствии нсзит/D значительной мере дис-

,;*;'■; куссионшй м Л рзгментсрныП характер.'Цараду, с рейотами, укаянва»-

щики на важную и дате ключевую- рольлектинов ршэтенин и полнса-

^•■'.харидов бактерия в начальных процессах кооперирования симйионтт,.

Имеются ряд исследований,« которых значение лектин-углевог*юго

1 взаимодействия отрицается или №. признается достаточно вакккм., "

Р^энора и: тост ь'уксп^ридагга! ыщх длиных обьясняетск не только

. ;; сложностьюдопроса, но и, п^ичина-п методического характера. • Не-

' V ' - 2 - •

смотря на значительный прогресс в исследовании химии лектинов бо- 1 бовых, «х биологическая функция и роль в процессах. формирования симбиеткческих структур лишь только наминает изучаться. Почти ив уделялось внимания к природе истинных рецепторов лектинов на по-в'ерхности бактериальной клетки. Установлено, что с лектинами могут реагировать все группы поверхностно локализован*;1« полисахаридов, однако, степень участия каждого из них в процессах узнавания почти не изучена.

Остается также неясный сам механизм установления взаимосвязей партнеров, факторы, определят^ их контактную совместимость в зависимоСти » от »конкретных симбиотическнх пар, в которых учитывались Сы как симбиотические свойства клубеньковых бактерий,. так и физиологические особенности растения-хозяина, пре.зде всего его 'восприимчивость к микросиыбионтем.

Решение этих вопросов будет способствовать более.глубокому , пониманию физиологических 'процессов, ведукртх к установлении эффективного симбиоза.

Цель и эЕ^ачи исследовеш^., Цель настоящей работы закяюча-лась в. выяснении роли полисгосаридов клубеньковых бактерий в начальных стадиях развития симбиоза; являются ли полисахариды рецеп- ' торами лектинов,соответстпуюцих бобовых растений и насколько селективно такое лектин-углеводное взаимодействие для различных симбиотическнх пар. .... В эадоту исследований входило г

1. Вцделение и очистка зкэо- и липополисахсридов семи гатам-мов кь.1«вшо1повах1ш различащихся по симбиотическиы свойствам.

2. Изучение ^язико-химическиххарактеристкд полисахаридов.,

3. Сравнительный анализ моносахаридного состава окэо-нли-пополисахвридоввевязи с симбиотическимисвоДствами. штаммов.

г

; ■. - з-

4. Выделение, очистки лектинов соответствующих бобовик растений и определение их углеводной специфичности.

5. Установление степени лектин-углеводного сродства симбионтов. , .

6. Выявление связи меж^у сиыбиотическими свойствами клубеньковых бактерий и степенью лектин-углеводного сродства симбионтов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Проведено изучение экзополис ах аридов / РЛС / и липопол ис ахаридов / Я1С / клубеньковых бактерий вида КЬ»1ееии1поеагш» - с различными иомби-нациями симбиотических свойств, !&явлены тонкие отличия химического состава акзо- и лнпополисахаридов у бактерий с различной степенью специфичности по отношению к растению-хозяину и контрастюс* по азотфиксирурацеА активности. •

.Показано, что бактериальные полисахариды являются рецепторами лектинов растений-хозяев й установлена селективность лектин -

углеводных взаимосвязей симбионтов, ^явлено, что различия а рте* »■ -

цени лкпополисахарид-лектинового сродства проявляются при сравнении штаммов, отличающихся по азотфиксирупцей активности, а экэо-полиоахарид-* лектиново го сродства - по конкурентоспособности.

О результате проведенной" работо представлено химическое обоснование ^енонена перекатной заражаемости четырех видов бобовых растений одним видом ЕШ.Хвбиа1пова*ш1 , а тмше дано хикичес-кое объяснение существования внутри этого вида более узких групп, приуроченных к домиикрувцему растению-хозяину.

. Новые данные, изложенные в диссертации, вносят определенный вклад в изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе специфического распознавания симбионтов. Они однозначно указывают на, рецепторную роль:бактериальных полисахаридов и позволяют предпо-лспить нал'ичи. ъзаимоепязи иежду*химическим'составом лолиС1л,ари-

дов и с (Абиотическими свойствами бактерий. При подтверидений" йнт ' формативной роли ло.пиеахиридов с привлечениеи - большего количества штаммов, эти 3акты могут быть использованы для научно обосноЬан-ного подбора сиыбиотических пар.' / ■. ' •

, Апробация диссертационной' работы. Основные материалы были доложены на теоретическом семинаре по проблеме физиологии и био-хииии микроорганизмов. Института ыикробиологии и виигсологяи АЛ УССР» УХ Всесоюзном Еаховском'коллоквиуме по аютЛиксации /г.Тбилиси.1У63г,/, У1ст1взде Украинского микробиологического общества /г.Донецк, 1984г./, 16-й конференции й-едерации европейских биохимических обществ /г.Москва, 2-й Всесоюзной

■ - ■ • * * . .' • . научной конференции " Результаты и•перспективы:научных исследований микробных полисахаридов" /г. Ленинград, 1584г;/.:

Публикация рззультатов исследований« По материалам-диссертации.опубликовано 13 работ.

Структура и объем работа. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной частиц обсуждения'полученных результатов, выводов, списка литературы, включающего 223 источника. Материала изложены на 176 страница» машинописного текста, содеркад 16 таблиц и 15 рисунков,

огшсш игшодо ксстутат '■ " '

Объектами. исследоашшй служили семь ттешоп яь. 1«£ш1пов&-гоа,. которые условно были'подразделены на три группы, согласно лх содбиотнческим характеристикам.

. Группа высокоактивню: п^амиов, раэличамцкхоя по степени . специфичности в отношения растения-хозяина: симбионт кормовых бобов /т.97/, симбионт гороха /шт.240/,. симбионт вики /тт.1'15/.

сголЗионт чечевицы /т«7~0/.

^уппа ттаздов клубеньковых бактерий кодовых бобов,контрактных по изот£икйгрущей ш(тивности{ высокоактивный шташ 97, высоко активный штамм 95, средне активный штшм 74, иезктиониЛ (йтшм 87..

Группа штаммов клубейьхових бактерий кормовых Собоь, ралли-чтцихсп по конкурентно¡1 способности: высококонкурентоспособнця ютлд! 97,.эдсококонкурептоспособш!! штамм С7, неконкурентоспособный штши 95,

Выбор микроорганизмов быч обусловлен возможность» на примере' одного вида определить взаимосвязь основных симбнотическкх свойств, микрооргиниэмов с составом и строением полисахаридов и установить активность взаимодействия полисахаридов с лектинаш растений-хозл-ев в различных бобоьо-рмзобиальных парах.

Штьммы и их симбиотические характеристики Йыли предоставлены -лабораторией биологического ызота ВНИИ сельскохозяйственной иикро-биологпи й ^отделок почеегсюй микробиологии Украинского ПЛИ земледелия, за что в»ра*аем глубокую признательность.

*1{ультла1рирацивши наагаризов энной среде с гороховым отваром й паннитон в течение трех суток при 23°С.

:, - Бактериальную массу смывали и центрифугировали при 17000 -КООО тыс об/шш. получали из культуральной жидкости осаждением сернокислым аммонием. / бО^ на-ыцения /, ,<ЦТС бк'страгировали из клеток бах'тз1>кИ 45^ным : водным раствором <!енолн*. ' -. Гель-фильтрацию ЭПС прово/дели на сефадексе 0- скорость олюции - З&л/чею* э*юэпт - вода. Номекулярцую массу [ ссчитиналн по кшиброночноН кривой на оокопо ряда стандартов углеводной природа, - ■

Седиментицконшй иналк-э выполняли на аналитической ультра-И';итри1уге МШ3170в. ¡.¡олм'уляр!^» массу р^считывчли,, исходят ки '

значений коэффициентов седимент ации я диффузии по метолу Сведберга / Ellas, 1961 » Френкель,Iv63 /.

Электрофорез полисахаридов проводили в 5,65¿-hom полиакриламид-ном геле с добавлением 0,5s» додецилсульфата натрия» 1иксацшо углеводных зон и окрашивание их реактивом Шйффа выполняли no Dlrlenso Vдр. /1078/, . .

Шгкий кислотный гидролиз ЛПС осуществляли iJí-tioñ уксусной кис лотой в течение 90 мин. при 100°С.

Гель-фильтрацию частично деград"роваяных полисахаридов проводили на сефадексе G-50 в пиридин-ацетатном буфере / рН 1,5 / / Bchaldt.et al.,4969/.

Количественное содержание углеводов в препаратах определяли по реакции о фенолом и серной кислотой /Cubóle et ai.»1956 /; белки -'по методу Lowry /1961/; нуклеиновые кислоты - по методу Сшгрина /1958/. .

Гидролиз полисахаридов проводили в ампулах при 103-Ю5°С; для определения нейтральных Сахаров и уроноамх кислот - 85í»-tiof) муравьи ной кислотой ' в течение 16ч., а затем 411 трихлоруксусной кислотой 6ч дяя аминосеиаров - 6н соляной кислотой 16ч,

Ноносахаридний состав устанавливав методом восходящей хроматографии на бумаге и газояидкостной хроматографией /Захарова, Косен ко*1982/.

*

Количественное определение.глюкозы и галактозы осуществляли также ферментными методами.

Гексоэаиины определяли в гидролизатах полисахаридов на амкно-кьслотноы анализаторе и аналитическим методом / Joimeon,l97l /; лнровиноградную кислоту - по реакции с 2,4-дикитро£енилгидраэином /Иутиано^а, Ивченко, 1974/; 2-кето-З-дезоксиоктоновую кислоту - используй реакцию о тиобарбитуровой кислотой / Droge et а1И97С/» геп-

тозы — no Oebom /К53/; урановые кислот : - методами хроматографии на бумаге и электрофореза на бумаге.

Лектины получали из семян растений-хозяев исследуемых клу -беньковых бактерий по методике, описаиной Луциком /197-У.'Очистку проводили аффинной хроматосрифией с использованием аффинного сорбента - сефвдеиса q- ICO. Активность лектинов» их углеводную специфичность и минимальные ингибирующие дозы устанавливали по методам, описанным Дуциком с соавторами /IÍ-бО/.

Степень сродства лектинов с полисахагидши определяли tío реакции торможения геыагглютиннрумщей активности лектинов вкзо- и липо-по лис акарид «ли, результата выражали в процентах, а также реакцией кольцепреципитвции, результат которой представляли в виде миниь ль-ной дозы полисахаридов; в мхг/мл, необходимойдляйбраэовшшя кольца при взаимодействии их с О, Iíí-нш раствором лектина. .

. ооюашв РЕЗУЛЬТАТЫ иссладаща 11 *

Физико-тшческая; характеристика якзополисахарндов и

липополис ах аридов исследует« штаммов. tía примере штаммов с различной специфичностью / симбионты "ор-новых бобов, гороха, вики и чечеиицн / была изучена динамика накопления клеточных и внеклеточшсе углеводов в процессе роста культуры. Установлено, что закономерности н;шо1 тения углеводов одинаковы для всех исследуема штаммов, 4орш> кривых накопления npv ципиаяьно ир oí тчимтся друг от друга, Максимальное накопление клеточных и внеклеточных углеводов происходит в ко ni le стдции замедленного рсГота / GO-'u часон ttyj. .тивироважш /,

Из культу pan ыю(1 жидкости бактерип'(1ши видолени и очищени Bi; зопо лис да t\j ^«ди, а на отмытых от ППС бактериальных клеток - лигю полисахарида.

Информация о чистоте и однородности полимеров была получена с помощью различных аналитических методов / ультр<чцентрифугирова-кия, гель-$«льтрацли, электрофореза в ПЛАТ /.

По данным гель-фильтрации и ультрацентрифугирорашш, ГПС всех misMiitos, кроме ыт.720» представляют собой гомогенные полимеры, обладающие различной, s зависимости от штамма, сп^чеиью полнднсперс-* *

мости. ШС шт.720 состоит из двух гегерогликанов с молекулярной массой 5,1*10^ и 2,6*10® соответственно. ¡.1о*еку*'.рная масса шести исследуемых полисахаридов но данным гель-фильтрации составляет / 4,2 - б.З Л105, а по данным ультрацентри^'гиропданя / 4,4'г 9,1 /40^. Блцзк^ значения «олеггуллрньк масс для большинства по- . лимеров указывает на с.чодЫе размеры молекул ГJJC, кеэаансш.го от : симбиотических свойств штатов.

* Данные, полученные при гель-электроч орезе и ультрацентрлфуги-ровании ЛПС, подтвержу,оат мнениеспециачистов о сложности и гетерогенности ЛПС кдубеньков1к бактерий. Установлено, что гетерогенность ЛПС носит интегральный характер и связана как с физическим состоянием молекул / способностью их к агрегации / так й с химическими особенностями, связанными сдлииой поли с а* годных цепей. Тая, при ультрацентриаугировании йодных рас? зоров ЛПС отмечено I - 3 компонента с различными коэффициентами седиментации, Использоаа -ние щелочи и додецилсульфата натрия приводит к разъединении крупных агрегатоа ЛПС до более мелких и к объединению мелких в более* крупные. Наличие отдельных компонентов с низкими знамениями .тентов седиментации / 0,7-1,0з/ позволяет предположить, что часть к хроыолекул ЛПС представлена в виде отдельных субъеданиц. При едектро$ореге в ПЛЛГ ЛПС всех штаммов разделяются на два углеводных компонента с высокой злектрофореткческой подвижностью /Рис.IA Однако; при сходаой.картине разделения,^ из. ЛПС отличаете.-:

по интенсивности окраски зон и скорости их миграции. Согласно с современными представления.™, можно предположить, что быстроиду-щие.компоненты представляют собой два типа молекул ЛПС; а-тип / незамещенный кор-олигосахарид / и йй-тип / кор-олигосакарид с короткими О-специфическими цепями /.Следует отметить,что в группе клубеньковых бактерий кормовых бобов, ЛПС двух активных штаммов близки между собой по картине электрофореза и отличатся от ЛПС неактивного штамма.

шт.87 «т.74 гат.95 шт.97 шт.240 шт.14о шт.720

рис, I. Схема гель-электрс4ореграш липополисахаридов иселедуемпх. штаммов аьЛ»БШв1иоэагип* Относительная интенсивность окраски углеводных зон: а - интенсивная, б - слабоинтенсивная; в ' зона нв-специфической,окраски

.Химический и ноноаахаридный состав полисахаридоа исследуемых ш?га,£моэ НЬ. 1ввиш1поаагил. Йами установлено, чад как "ПС исследуемых штаммов, т*ж и их ЛПС близки меаду собой по химич скопу составу, ¿¡ПО содержат от 33)* до 66^ углеводов, небольшое количество белка - 1,1 - и нук -.'шиповых кислот -0,2 - 0,4«. •

В препаратах ЛПС содержание углеводов более вариабельно - от * 32SS до 74%, содержание белка и нуклеиновых кислот низкое - 1,4 -2,2Я и 0,4-0,9« соответственно. ■ '

Изучение монос ах аридного состава полис ахаридов различных

* ■

штаммов Rbtlegunl&oearua позволило установить, что они очень сходны пс набору моносахаридов и имеют много общего.с. соответствую-щиии полисахаридами других быстрорастущих клубеньковых бактерия, описанных в литературе. '

ЭПС всех штаммов содержат глюкозу, галактозу, манноэу; в не--большом количестве арабиноэу, липобильный сахар со временем удерживания его едетлга полиола по отношению к пентаацзтату рамнита Тра4- 0,92, глюкуроновую "и пировиногродную кислоты и различаются между собой по их количественным соотношениям, а также наличием 'тех или иных липо<1ил ьных с ах аров /. Табл. I /, Следует отметить, что яипофильнЫф сахара обычно не принимаются во внимание при структурных исследованиях полисахаридов, но тлеют, судя по литературным . данным, существенное значение для биологической активности полные--ров. ^

По составу моносахаридов, исследуемые ЭПС очень сходни не только между собой, но и с другими штиагами Rh.leguainoserum, а также с ЭПС Eb.fcrlfolll, .Rh.pbaeeoll, для которых моЛ1Грное соот-. ношение глюкозы,- галактозы, пировиноградиой кислоты составляет 5ili2 /Zevenhuisen, 1981 /. ■

' Сходство, но не идентичность монос ах аридного состава Г-ПС сш-* детельствует о подобии отдельных структурных фрагментов в молеку-ли ЭПС, но в то же время указывает и па существование различив, придающих индивидуальность ка>*дому полисахариду к влиш^их, вероятно, Наела биологическую активность.

ЛИС исследуемых штаммов имеют более богатый моносатаридны;;

Таблица I.

i

Уонос ax аридный состав экзополисахарндов ль. legumino-sarura. / в íS ксухомувесулрепарата /

Моносахарид- шт.87 шт.71 .jit.SS шт.97 шт.240 шт.145 ягг.720 nun состав ■ líp. Ilíp.

Глюкоза 36,3 30,0 20,1 25,4 20,2 19,1 10,9

Галактоза ¿U 6,1 6,0 5,8 2,3 3,3 2,7

Maní юз а 4,1 1.7 . 0,4 1.2 ' i.e г.з 4,2, -

Арабиноза - 0,6 0,5 0,3 0,1 0,1 3,8 - -

Рамиоза - - - . - 0,6 1.8 -

Фукоза - - - - - 4,8 -

НеидектиН к-

цироаашые

сахара: ■

XI ч ctpah0,9¿ •U 0,1 - - 0,2 - - .

10,4 6,1 3,1 2,1 2,4 2,9 Г, 2 -

Х3 cTP(MÜ,G3 - ■ .0,2 - 0,6 - — - -

Пирошшогргдо 0,1 . * " ** ■ 5,7 —

1ал 5,4 6,0 5,3 2,3

кислота . 5,5 5,2 5,6 н.о.

глю1с0(к»|1ш - - ' - 4í2 - и.о.

Галактоз.умин - - - я, г - 11.0.

Рлюкуроиоиш!

кислота + . + + + , + ■ + 4- (1.0.

Молирпн-г

соотношения: . .

глюкоза

галактоза 6;1г2'* 5:1:£ 5tlt2 5(0,5:2 5tI;I 6íIj3

пировипогрэд-

иая кислота

Примечание: - -■.' отсутствие сахара; ц,о. - не определяли^

+ выявлены хроиатогр^Хией на бумаге и влектрофо-, . резом на буи^ге, количественно не определены,- .

состав. Во всех исследуемых ЛПС обнаружены глюкоза, галактоза, иэнноза, при этом содержание глюкозы значительно вше, чем остальных мономеров - 22,0 - 39,8$'. Почти во всех ЛПС присутствуют эра-биноза ифукоэа, рамноза оСнаружена в ЛПС только двух штшмов.

4 В состав ЛПС входят три липсфшьных сахара, - один из них Х2 - Арду- 0,92/ присутствует во всех ЛПС, два других встречаются реже. Сочетание этих трех.Сахаров* индивидуально для'каждого штамма. Во всех изучаемых препаратах ЛПС присутствуют аминосяхара, сре ди них идентифицированы:глюкозшин, галактоз ем ин и хиновоэамин. В составе ЛПС обнаружены также кислые компоненты;глкжуроновая,гал акт уроновая и пировиноградная кислоты - последняя выявлена только в двух препаратах. Общеиэ-мтно, что 2-кето-З-деэоксиоктоновая кислота / КДО / является основным связующим эвеном полис ах аридной и лнпидиой частей ЛПС, однако в исследуемых ЛПС обнаружены лишь следовые количества этого компонента. Во всех препаратах отсутствуют гептоза / Табл.2 Л '

Низкое содержание еминосахаров, отсутствие гептоэ в исследуемых ЛПС по сравнению с ЛПС других бактерий, указывает на существование некоторых отличий в строении их кор-олигосах оридов, особенно части, непосредственно примыкающей к липиду А. Возможно также, что перечисленные мономеры находятся в таких «Торыах или имеют такой тип свяли, коюрый затрудняет их определение традициои но применяемыми методами.

Сравнительный анализ моносахеридиого состава как ШС, так и-ЛПС штаммов с различными симбиотическими свойствами, показал, что при сходных чертах строения полисахариды имеют тонкие отличия, свя данные.с проявлением этих свойств.

При сравнении штаммов по степени специфичности в отношении растения-хозяина нами установлено, что ОПС и ЛПС клубеньковых бак-

- Ш -

Таблица 2,.

доносахаридный состав липополпсахаридов нь.1ев1ш1ш>еагид ■ / в Л к сухому весу препарата / ■

■ . . *

Моносахаридный состав . шт,й7 тт. 74 тт.95 тт.97 •шт.240' шт.145 шт.720

Глюкоза зал 39,8 36,1 20,0 29,2 22,0 31,4

Галактоза х.6 2,1 1,2 5,7 4,8 5»6 1,2 : '

Манноза . 6,0 6,0 2,0 2,8 1,4 . 3,2 ' 1.5

Дра^иноза 0,3 0,3 0,4 0,3; 0,4 0,0

Фукоза 2,5 ■ 1,2 3,9 5,2 6,8

рамноза - . -■ . - . 2,2 - 12,2

НзидентиХи-

цировашые

сахара;

Ч с Трам0,92 3,7 3,4 1,8 1,0 5,2 _ 8,8 5,0 .

Х3 сТрйМ0,б9 . - ■ - 0,2 ■3,6 - * 3,7* 0,2 -

Х4 'с Трш0,4б 0,5 0,2 0,2 0,2 2,2 . 0.4 * •

Глюкозамин 2,5 2,0 2,7 2,7 4,7 . 3,3 .

Гал шсто Э амин 0,6 1.0 0,4 0,2 1.7 0,4

Хиновопамин 0.1 -- 0.4 0,4 0,2 0,8 0,2 '..

Пировинограл" 2,8

ная кислота " . " — ■ - —

IV» 0,1 - 0,1 следа 0,5 следы

Уроновыв

кислоты ■к , " + + + ■ + +"

, Примечание! - отсутствие сахара

+ выявлены хроматографией на бумаге и электрофорезом на бумаге, количественно не определены.

терийс различной специфичность*!) / симбионта гороха, вики,' чечевицы / имеют значительно бйЛыбнй ¡лчличия s моносахаридном составе, чем полиоахарида клубеньковый баятёрмй одного растения-хозяина -кортовых бобов. т'Ы; сПС клубеньковшс бактерий гороха, викии чечевицы имеют paâtnJ'â' молярные соотношения трех основных мономеров глюкозы, галантоэи, пировиноградной кислоты - 5:0,5:2, 5:1:1,

6il:i) соответственно, тбгда как в DUG четких штаммов одного рас*

тения?хозяина вти соотношения близки.или идентичны /6-5/:В SUC клубеньковых бактерий гороха отмечается меньшее содержание галактозы. Отличительной чертой клубеньковых бактерий вики является присутствие в нем глюкозамина, галактоз амина и небольшого количества рамноэЫ( содержание пировиноградной кислоты уменьшено вдвое по сравнению с другими штаммам*. Из двух полисахаридов клу-бёньковых бактерий чечевицы один,подобный £ПС других штаммов, содержи; значительное количество йукоэы, не встречающейся в других полисахаридах, и рамноэу» а второй гетерополисахарид моксно отнести к галактоглюквз!£М / молярное соотношение глюкозы, галактозы 7:1/.

Ввиду сложности строения ЛПС отличия их моносахаридного состава у симбиотичеоки различных иггеммов менее выражены,чем о ЭПС..Тем на ивнее наш установлено, что ЛПС штаммов с различной специфичность» в отношении растения-хозяина имеют некоторые количественные в качественные отличия в моносахаридном составе. Так, заметно отливается от остальных преператов ЛПС клубеньковых бактерий вики-прт сравнительно низком содержании глюкозы для него характерно повышенное содержите галактозы, фукопы, голи юс ах аре J. ЛПС шт, 2-10 В wt.720^/ симбионтов гороха н чечевицы / отличаются от остачьшос штаммов присутствием рамнозы / Z,Z% и I2.2X соответственно /, ЛПС шт.?<ЭЗ'не содержит, кроме того, ^укозы, обниружешойво всех препаратах. MC четырех штатов одного растения-хозяина имеют более

близкий моносахаридный состав н различаются, в основной, по и* количественным соотношением, а также по наличию липсф;льных Сахаров.'

Таким образом; из полученных данных следует, что полисахарида клубеньковых бактерий одного вида яь. 1по еагщ» проявляют как сходство состава, что характерно ,длл бактерий одного вида, так и индивидуальные особенности,^оответствувцие большей илмыеньпей приуроченности бактерий к дощшируяцемурастению-хозяину: кормовым бобш, гороху, вике,.чечевице в перекрестно заражаемой ими группе бобовых растений* '

Для того, чтобы выявить связь,между составом полисахаридов, ¿г другими симбиотическюде свойствами бактерий / азот$иксирупцей ак -тивность» и конкурентоспособностью./, проводили сравнительный. ана - * лиз состава полисахаридов одной узкой,группы бактерий - симбионтов кормовых бобов. .Нами установлено, ,в.ЭПС трех активных штшмов ыолярныэ соотношения основных кемпонентов глхшозы, галактозы, пиро-вииоградной кислоты составляет 3:1:2,.а о ЭПС неактивного - 6:1:2. Это свидетельствует^о, большей сходстве основных стигктуриах фрвг-. , ментов ёПС активных азохфиксаторов и отличие кх от ЭПС неактивного шташа, на под^оряодуюся единицу цепи которого приходится на одну молекулу. глюкозы,больше. Отмечена также:тенденция к снижению содер* жашян;»(но?ы 4,1#, 1,2-0,4« и липо^ильного сахара / Тр^

- 0,62 / 10*4?й, .6,196, 2,1-3,4)4 в ЭПС неактивного, средне активного и двух высокоактивных штаммов соответственно. •

Аналогичные закономерности отмечены и в.ЛПС бактерий, ¿ШС неактивного и среднеактивного штаммов характеризуются большим;содержанием малнозы / 6,054 / и липофИльного сахара / Тр^- 0,93 / ; / 3,4-3,7% / по сравнении с шйокоактивными штаммами и /'¡,0-1,ОС / соответственно.

Нами установлено, ¡что ЛИС исследуемых шт еммов' могут' образо- • *

выдать прочные'комплексы с глшецвми, устойчивые к реДствит детергентов, целостность которых была нарувена лишь в результате мягкого кислотного гидролиза. Поскольку отщепление глюканов удалось достичь лить у четырех препаратах ЛПС, выделенных из наиболее актив- ■ кых штаммов клубеньковых бактерий / тт."¿7, шт. 2-0, лит. 145, игт.Т-ïO/, можно предположить, что лабильность комплекса ЛПС-глюкан так*е играет определенную роль в процессе формирования активных симбио- • тических структур.

Различий в моносахаридном составе 5I1C и JÏ1C конкурентоспособных и неконкурентоспособнего штаммов на денном этапе исследований ; . нами не выявлено.

• 'Ьзаимо действие полисахиридов исследуемых штаммов Rh.leeuaiaoee-run с лектинами бобовых растений. -■ Поскольку всех необходимых для напей работы коммерческих лек-тинов .нет в продаже, нами были виделены и очищены аффинной хрома-тогри$«еЙ яектиш четырех растешй-хозиев; кормовцх бобов, гороха, вили и чечевицы, которые обладали - высокой гемагглютинирующей активностью / Табл.3/.

. Таблица 3..

. Гемагглютинируодая активность лектинов бобовых растений .йекткны Титр геыагглютинации■

Plsua eàtlvus L.

горох' . ' - . I : 1024

Vicie taba L. .

кормовые бобы I í £0*18

Hiúla sativa ti* ;

вика II 2048

Leu» oullnarle U. .

чечевица I ; 4<h>6

Установлено» что все лектины имеат одинаковую угл«воД1?ую специфичность и относятся к группе d-мшшоэо-/ ó-гл^козо /-специ -«{ичных лектинов! наиболее активно они соединяются с d-маинозой, о-глм*оаой, их и ро ил во дни'пг и полимерши, техг(ини •¿-конфнгура?-цию. [lo шюшзльнш ингибнрущим .грзэм пектин чечевицы несколько отличается от остальных лектинов, о» имеет более высокое сродство к кетозам, производным глюкозы, хотя сшой рлякозой шгибируетсл

С Л Dito, ■ ;

На сле.чунс'еч этапе исследований кы поставили з?*дзчу установить, отражаются ли физико-химические различия полссвхвридлв на их асидаэдеЕствин с лектинами растений-хозяев,

Hcc.ni локально, что ЭПС и ЛПС всех иссге^емых итаммоэ клубеньковых бактерий Bi лнюдеЗствуют- о лектиидаи всех четырех расте-янй-хояяев,'одеако активность »того взаимодействия различна в каждой конкретно!! пзре / ТаСл.4 /, Ни один из исследуэикх полисахаридов ме взаимодействует о лектингми других растении, «¿».ример, сой и пшеницы» i '.

Различия во взаимодействии полисахаридов с лектинамч растений хозяев согласуютси с установленными нами физико-химическими осо -СенностЯад полисахаридов, "имическое лодоби^яак ЭПС исследуемых * игггслмоа, .так и ЛПС, проявляется в их способности взаимодействовать с лектинамн всех рйстешй-хозяев, а различия меяду лики - в. различном уровне сродства л дектинем. Подученные результаты могут, ■служить молекулярно-зсгопшеским обоснованием феномена перекрестное .заражаемости целей группы бобовых растения одним вкдом Rb,l«gu-

alDOEaeun. /

Исходя из полученных данных, мы считаем, uto нанальша этапы формирования симбиоза могут происходить как при участии ЛПС; так и ШС. Однако, в. зависимости от подбор а ,симбиотических пер,.в од-1*

Таблица 4.

Степень сродства ш>лисахаридо»Ш1.1е8ит1ло8&тит; с лектинаш растени({-хозяев /;£/

Лектини ', Полисахариды

растений- -

хозяев шт. 87 шт.74' шт. 95 шт. 97 шт.240 шт. 115 ШТ.720

Екзополисакц-иды

Кормовых -

бобов 40 ' 40' 20 . 50 £0 эо - 40 - /' .

Гороха 25 25 • ' 25 25 12 22

Вики 12 . 12 12 12 И 21 22

Чечевицы П . 22 22 II 22 22 - 57 .

. Липополксахаркдо

Кормовых бобов ... 03 ' 44 " 77 68' ' 27 27'

Героха 30 . 44 25 . 30 со . 24- ■

Вики 25 24 21: 32 30 * 50.

Чечевицы ' 20 ; 25 , 20 27 . .27' 22 . 27 ■

них случаях больший сродством по!отношению к лектину. растения-хозяи^ на будут обладать ЛПС клубеньковых бактерий, а в других - ЭПС. Так, в трех-вариантах подбора симбиотических пар большей реакцио)шоспо-■собнасть» обладали ЛПС бактерий,/ взаимодействие с лектинаыи кормовых бобов, гороха, вики /,. а. в четвёртом варианте / вэшмодейотвцч о пектийом чечевицы / - ШС / Рис.2 /. Возмоию, это связано с пд--сугствием фукозы в окЗополисвхаг>идтс,. которая, как известно, мбжет усиливать-с^лдство полисахаридов к лектинш бобових растений.

Наш устаювле'*о, что Наиболее-активно и ЛПС, иОЛС бактерий ■ вида. вь.1«в1ш1п9&ахим связываются с дектииом доминирующего растения-хозяина - полисахариды клубеньковых бактерий кормовых бобов с лектином кормовых бобов, полисахариды клубеньковых бактерий гороха с лектином.гороха. Сродство.полисахаридов к лектккзд недомиш-: рущих растений-хозяев, как правило, было низе. ;*го является хими-

Степень

сродства, *

00

60

40

20

2 3

Лектив Лвктин корковых бобов . гороха

Степень сродства^

60 -

40 -

20

I¡2|3|4

Лвктин вики

1|г|з|4

Лектяи чечевицы

Л

Лектив кормовых бобов

Лектив. , Лектнн Лектив

гороха в яки -чечевицы.

Рис. 2. Степень-сродства полисахаридов антивнцх шташгов 1Ш.1е-6цт1повагил в лектинаиираотений-хозяевг I. ит.97,: 2. шт.240-, 3. штЛ45, 4. шт.720 ЛПС, Б-ЭПС.

ческии подтиб^ ценней существования внутри вида вь.1веиш1ло8агиш более узких групп,.приуроченных к дсшпируичему растенип-хоз«ину.

Чтсби исключить влияние специфичности на рвикционно-

способнасть глнкополимороа, сравнение бактерий, отлкчшцихся по азотйиксируюцед активности и конкурентоспособности проводили на штаммах одной узкоО группы кордовых-бобов. Наглодалась четкая зависимость менду степеньюЛПС-лектииоаого сродства и азотииксирую-в\ей способностью штампов: ЛПС: активных штаммов обладает' более пы- ■ соким сродством и лектину кормовых бобов, чем ЛПС средне активного и неактивного шташов,.Поскольку те ке-высокоактивные штаммы в ларах с недоштнрушрми хозяевами проявят» меньшую степень полиса-харид-лептинового взаимодействия, получешше денные представляют интерео о точки зрения обсуждаемой в 'литературе ; взаимосвязи специфичности, нактивности бактерий.-Обнаруженное нами больше« соответ- . стоив .бактериальных полисахаридов и лектинов растения-хозяев в уз-носпециг'ич'ных парах1, образованных штамма».« с высокой ачог}ихсирую-щей активностью, по сравнению о парами, образованными темн ее штаммами с недоминирущими хозяевами,свидетельствует о существовании: взаимосвязи манду факторами.активности и >т.акторжи специфичности, Вц5окоэф1«и,нв)шй сикбИ63 исмег возш)кнуть только при условии высокой специализации симбионтов,_ закрепленной генетическим соответст-в: ж-растення-хозяина к клубеньковых:бактерий. Нарушения в одном, из симбионтов ведут »'изменению симбиотических взаимоотношений и к* снижению'а^-ектизности: такого симбиоза.

11 группе тташ ^в, сравнивает <ых по конкурентоспособности, были установлены различия в "ЛС-лсктиновом взаимодействии симбионтов: ШС'высококонкурентоспосо'бных штаммов проявляют более сильное сродство к лектину дочи»^)утацего1)астения-хоз.Чина,:чем СПС неконкурентоспособного штамма,. ...-"■•■'.

'/•••' 'V:"/-;'-21;-;•• , '.'.

В целой, наиболее аиоокиы сродством к лектину обладают поли-сая«фида физиологически наиболее активного штемма, оо'ладагацего ■ , как высокой азот^Тиксирую^ей/* так и конкурентной способность».

' Полученные кал! данше. укдадыз аотс я в двухфазную модель присоединения клубеньковых бактерий * к корням бобовых растений.1 Оба типа гликополимеров / ЭПС и ЛПС. / вэаимодеПствуит слектинами растения-хозяина^ однако,.роль 1« в установлении сймбиотическкх кон. тактов, по-видимому,- неравнозначна, - Поскольку обнаружено,. что.ШС- • лектиловое взаимодействие связано с проявлением конкурентоспособ-. ностн,. моагао пре/щадожить, что ЭПС важны на первых этапах кооперирования и участвуют в специфическом присоединении клубеньковых - ■ ■ бактерий к корневому яолоску. ЛПС, 'которые являются ингредаента- -ми клеточной стенки С .ктерий» мдгут быть важны для более ответствен- 1 • иого этапа*кооперирования - прочного прикрепления бактерий, сов-местимих|с'растением, в корневому волоску,- :

. ' - • • швода' . -.'■■-/:.■"■•■.

Воделеш и очищены вкзо- и липополисахарида семи штаммов;' Ми 1ееитЛпоеа гит , различающихся Матду собой по сикбиотическим свойствам / степени специфичности по отношению к растению-хозяину,-^от^иксируюцей- активности и конкурентоспособности /.

2.. Изучены ^изико-химичесше свойства.полиоахаридов.^Покааа-^ ', но, что ЭПС всех исследуемых теаммов являются гомогенными У, кроме ЭПС клубеньковых бактерий чечевицы' /. с молекулярной массой от -у '*, ' 4,2*10^.до"в,3*10® / по данным гель-фшгьтрации / иот4,4;1б5до^] Ъг1*10а / по даншас ультрвдэнтрифугироввния /. * ' •

. . МС.исследуешх: штаммов геЦрогекны; гетерогенность ихСсвкзвь-.!^ на пал 6 физико-химическими свойствами молекул: / способность; к «гре* гадин /; так ид химическими особенноотями, связашыми с дйиной ¡ПО-:':? лисак^ридных цепей,- , ' . ; • г/ . ■.'-.

3. Установлено) что ЭПС исслв^ешх ттшмоа близки, но не • идентичны по набору моносахаридов и отличаются, в основном, по их количественному содер&ению и наличию липо'^ильных Сахаров.

)Е)]С имеют более богатый монооахарэдша состав, они тыа;е как и ЭПС различались, в основном, по количественному Содержанию соха-ров и наличию липо^ильных Сахаров.•

4. Шнвяены тонкие отлнчип химического состава <>ПС и ЛПС у бактерий с различной степенью специфичности по отношению к растет нию-хозяину и контрастных по азотфикси^мцей активности.

5. Выделены к очищены аффинной хроматографией лектины растений-хозяев ! кормовых бобов, гороха, вики и чечевицы. Установлено,-что все они относятся к группе 0-маннозо-/ гкглюкозо /-специфичных ■ лектинов и отличаются по минимальным Ингнбирупцим дозам.

* ■ 6» Установлено; что ЭПС и ЛПС всех исследуемых гетаммов способны оодеить рецепторами лектинов растений-хозяев / кормовых бобов, гороха, вики н чечевицы /;'

- 7* Показано, что наибольшей комплементарностью и ЭПС, и ЛПС' -обладают по отношению к лектину доминирующего растения-хозяина.

■ 8. Выявлено, что различия в степени липополисахарид-лектиново-го сродства проявляются при сравнении штаммов, отличающихся по ' азотфиксирущей активности, а внзополисахарид-лектинового средства - роконкурентоспособности»' ■ V'

.' Наибольшей комплементарностью,по отношению к лектину растения-; хозяина обладают.полисахариды физиологически самого^ активного штам--иа с высокой азотфиксирующей и конкурентной способностью.

* Список райот; опубликованных по теме диссертации! ' 'I, Ковалевская Т.Н.' Изучение полисах;аридов ВЫгоМиа 1евив1по-«мш» // 4 съезд Укр.Сиохииического об-ва /Днепропетровск,1СЗГ/ ■ Тез. докл. - 6^45.' . ; О1' / . * "

2.. Ковалевская Т.а. Физико-химические свойства екэополиоа -харидов и лигшполисахаридов ((ЫхвЫит 1е£шп1повагит // Мсггериалы 3-й Республ.. научн.-теорет. конф» ыоло.-ух ученых микробиологов / Ташкент, К 83 /. - Ташкент, 1993, - С. 38 " • . ;

. 3.Ковалевская Т.М. гЬгзиология образования внеклеточных углеводов кмгоМип 1ееиш1по8£!гша и их.характеристика V/ 6 съезд ; Укр. ■ шкробиол*' об-ва /Донецк, К84 /:■ Тез.-докл. С.65. *

. 4. КоэалевскаяТ.Н., Косенко Л.З. Полисахариды клубеньковых Г бактерий чечевицы // 6 съезд Укр. микробиол.'. об-ва / Донецк, 1994/: Тоэ. докл. - 66. ' • ■ . ■

. .■ 5. Ковалевская Т.Ы. Динамика накопления углеводов различными ■

штаммами НЫгоЫию 1ееиы1гов?хгип1 // Шкробиол» журн» 1984. -" ' 46, ¡1*1. - С. 39-42. , / . .

• '' • б. Косенко Л.В., Воцелко С.К., Ковалевская Т.М. Молекулярная,

масса экзополисахаридов РМгоМия 1вешв1пс1вагига1 . // Никробиол. . - • "журн. - 1584. - 46, - С. 8-12.. ' . -"

7. Ковалевская Т.Ц., косенко Л.В., Воцелко С.К» Гетероген- . ■ * ность липополисахаридов ки1гоЫига1ееиш1поввгши. // Цикробиол,

кур», _ 1984. - 46, те. - С. 14-18. . -' ■ ' ' ;* ''

8. Захарова И.»!., Гсфпстефсий 0.А1, Косенко Л.В., Ковалев- : екая Т.М.,Новикова А.Т. Рецепторы специфического бобово-ризо биального взаимодействия.// Тез* -докл.. 16-й вон^. Федераций евро- .

- деЯских биохим. об-в /Москва, 1984 /Л-Ыосква, 1984. - С. 237.'1* .'' . . 9. Захарова И.Я., Косенко Л.В., Ковалевская Т.М., Берестец-Ч '•

кий О. Д., Новикова А.Т. Полисах аридные * рецепторы специфического// связывания клубеньковых бактерий о бобовыми. растениями; // Тез.( докл. 2-й Зсес; нчучн.'кбнф» / Ленинград, 1984 7. тЛеиингред,. ;>,' 19С4. - с. зз. ' ;'.А-:'.!

10. Новалавскал Т.и., Косе1Шо Л.С.,.'Захарова И.Я. Коносахп-ридный состав экзополиснхаридов перекрестно заражающей группы НЫаоМищ 1е£ио1 по ваг шп //¿¡ивробислогик. - 1985. ■-'54»: ¡И. :

С. 010г614. • ■ : . 'Ч.' ."У- V " "

11. Захарова Н.Л., Косенко Л.С., Ков ал евская Т. К., Берест едкий О.А.» Новикова А. Т. Полно аспида из различных штаммов клубень ковых бйктерий . кормовых бобов, // Микробиология. 1986. * 65, Кэ.

с. .656-661, ! ■ '.-.-Ч .-.•".'';•;V-.

12. Косенко.Л.В., КоиалевснаяТ.!а. Роль микробных,полисахаридов в установлении мол акул ярко-химического соответствие клубень ковых бактерий и бобовых растений // 4-й Симпозиум соц. стран по биотехнологии / Зарна, 1УвС/1,Тез.- докл. - С. .191.'1; " ''' - ; '

13. Косенко ;1.В., Ковалевская Т.14., Захарова И;Я. ,СелектквГ-нйсть взаимодействия ' полисэха^лудав - 1^4воЬ1ии ;1евит1пов»гиш : с' •. / лекткнами растений-хозяев // Микробиология. -1^67. - 5б?; 534.; -:: С.' (&а - 702. ■'' ' . * '' ';

Ш 1Ш94.По,¡¡писано к печати 28.04.68г. Заказ ШЭ?.Тираз Г00 зкэ . WbQ« 1 п,л. Размножено ШП УкрЯШЗ, штЛайаш.