Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм С/Т-13910 регуляторного участка гена лактазы LCT, ассоциированного с первичной гиполактазией у человека, в популяциях Евразии

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм С/Т-13910 регуляторного участка гена лактазы LCT, ассоциированного с первичной гиполактазией у человека, в популяциях Евразии"

На правах рукописи

Соколова Мария Викторовна

Полиморфизм С/Г-13910 регуляторного участка гена лактазы ЬСТ, ассоциированного с первичной гиполактазией у человека, в популяциях Евразии

03 00 15 - генетика 03 00 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ООЗ 1БНЬ.акэ

МОСКВА 2008

003168696

Работа выполнена в лаборатории анализа генома Института общей генетики им Н И Вавилова РАН и на кафедре генетики биологического факультета Московского государственного университета им М В Ломоносова

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Асланян Марлен Мкртычевич

кандидат биологических наук Боринская Светлана Александровна

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Петрин Александр Николаевич Московский Государственный медико-стоматологический университет

доктор биологических наук Муха Дмитрий Владимирович Институт общей генетики им H И Вавилова РАН

Ведущая организация Институт акушерства и гинекология им Д О Отга РАМН

Защита состоится "_ _" _2008 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д 002 214 01 при Институте общей генетики им Н И Вавилова РАН по адресу

119991 ГСП-1, Москва, ул Губкина, д 3 Факс (095)132-89-62

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им НИ Вавилова РАН

Автореферат разослан "_"_2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Полухина Г H

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Генетически детерминированное снижение уровня синтеза фермента лактазы у взрослых (первичная гиполактазия, называемая также непереносимостью лактозы, MIM 223100) ограничивает возможность потребления цельного молока из-за непереносимости молочного сахара Первичная гиполактазия наследуется по аутосомно-редессивному типу и обусловлена изменениями последовательности нуклеотидов в регуляторном участке гена лактазы (Enattah et al, 2002, Tishkoff et al, 2007, Ingram et al, 2007) Употребление цельного молока при гиполактазии приводит к нарушениям пищеварения - вздутию кишечника, расстройствам стула, тошноте, головным болям, неспецифическим абдоминальным симптомам, выраженность и частота проявления которых зависит от характера микрофлоры кишечника, особенностей диеты и индивидуальной чувствительности пациента (Козлов, 1996, Шлейп, 2004) Указанная симптоматика исчезает и состояние здоровья нормализуется у большинства пациентов в течение 2-3 недель после исключения из питания молока и других продуктов, содержащих лактозу (Козлов, 1996)

Согласно данным клинико-биохимических исследований, частота гиполактазии сильно варьирует между разными популяциями, будучи минимальной (2-3%) на северо-западе Европы и достигая максимума (>90%) в популяциях Восточной Азии У народов России частота гиполактазии варьирует от 30-40% у русских, до 90% и более у коренных народов Сибири и Дальнего Востока (Козлов, 1996, Козлов, 1998)

Первичная гиполактазия рассматривается в настоящее время не как болезнь, а как вариант нормы, не требующей иного вмешательства, кроме корректировки диеты Тем не менее, совершенствование методов диагностики и дифференциальной диагностики первичной гиполактазии имеет большое значение по ряду причин Высокая мобильность населения в современном мире приводит к тому, что в регионы с традиционно широким распространением молочных продуктов (и сравнительно малым процентом индивидов с ограниченной активностью лактазы) прибывает большое количество выходцев из областей с преобладанием носителей аллеля, обусловливающего гиполактазию Болезненная реакция на употребление лактозосодержащих продуктов у заметной части мигрантов требует медицинского контроля В современной пищевой промышленности молочный сахар (лактоза) активно применяется при производстве кондитерских и мясных изделий, а также блюд

]

быстрого приготовления (каш, пюре) Содержание лактозы в этих продуктах может в несколько раз превышать ее концентрацию в цельном молоке (Шлейп, 2004)

Клиническая практика требует проведения дифференциальной диагностики гиполактазии у пациентов с целым рядом заболеваний органов пищеварения, при лечении которых традиционно принято назначать молочную диету, что, в случае первичной гиполактазии у пациента, может существенно ухудшить состояние, затруднить диагностику и лечение основного заболевания

Наконец, дифференциальная диагностика первичной гиполактазии важна в педиатрической практике, при обследовании и лечении детей младшего возраста с еще не полностью сформировавшимся лактазным фенотипом Распространенные клинико-лабораторные диагностические методы в последнем случае практически непригодны

Недостатком существующих клинико-биохимических методов диагностики гиполактазии являются инвазивность (при прямом определении активности лактазы в кишечных биоптатах), опасность ухудшения состояния у чувствительных пациентов и высокий уровень ложнопозитивных результатов при обследовании детей (при использовании нагрузочных тестов с лактозой) (Козлов, 1996) Поэтому разработка систем молекулярной диагностики гиполактазии весьма актуальна

Цели исследования

Целью диссертационной работы является выявление географического распределения частот аллелей и генотипов по полиморфизму С/Т-13910 в регуляторном участке гена лакатзы ЬСТ в популяциях Евразии, выявление степени ассоциации генотипа С/С по данному полиморфизиму с первичной гиполактазией в населении РФ, оценка генетической гетерогенности первичной гиполактазии в в населении Евразии, разработка и оптимизация методов молекулярной диагностики первичной гиполактазии

Задачи работы

• Разработать и подобрать оптимальные методы для детекции аллелей и генотипов полиморфизма ЬСТ* С/Т -13910

Определить ассоциацию полиморфизма ЬСТ*С/Т -13910 с фенотипом гиполактазии/персистенции лакгазы в российской выборке

В выборках, представляющих популяции народов Евразии, определить генотипы индивидов по полиморфизму ¿СГ*С/Т-13910, установить частоты аллелей и охарактеризовать географическое распределение частот аллелей и генотипов • Оценить возможную генетическую гетерогенность первичной гиполактазии в российских популяциях, сопоставив частоту предположительно ассоциированного с первичной гиполактазией генотипа С/С полиморфизма ¿С7*С/Г-13910 и установленную ранее фенотшшчески частоту гиполактазии в тех же популяциях

Научная новизна

Подобран оптимальный метод для генотипирования полиморфизма ЬСТ*-С/П3910

Показана ассоциация генотипа С/С по полиморфизму 1СГ*С/Г-13910 в регуляторном участке гена лактазы с фенотипом первичной гиполактазии в выборке жителей европейской части России

Определены частоты аллелей и генотипов полиморфизма ЬСТ* С/Т-13910 в 18 популяциях, представляющих 14 этнических групп Евразии

Показано, что частоты генотипа С/С в популяциях европейской части России, также как и других европейских популяциях, близки к опубликованным частотам гиполактазии, установленным в клинико-биохимических исследованиях для соответствующих народов, тем самым показано, что носительство генотипа С/С является основным генетическим детерминантом развития первичной гиполактазии в популяциях европейской части России

Практическая значимость

Практическая значимость данной работы определяется необходимостью разработки средств молекулярно-генетической диагностики гиполактазии и высокой частотой гиполактазии в российских популяциях (от 35-50% в различных популяциях русских до 80% и более в популяциях коренных народов Сибири и Дальнего Востока) Разработанные методы могут использоваться для ДНК-диагностики первичной гиполактазии в населении европейской части России

Апробация работы

Результаты работы были представлены на следующих российских и международных семинарах, конференциях и съездах

8th Iranian Congress of Biochemistry and First International Congress of Biochemistry & Molecular Biology, Tehran, Iran, 2005, V съезд Российского общества медицинских генетиков, Уфа, 2005, 13-й Международный конгресс по приполярной медицине Новосибирск, 2006, 7th Balkan Meeting of Human Genetics, Skopje, Republic of Macedonia, 2006, Human genome meeting, Helsinki, Finland, 2006

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы», «Результаты», общего заключения, списка опубликованных работ, списка цитируемой литературы (95 ссыпок) и грех приложений Работа изложена на 114 страницах, содержит 19 рисунков и 12 таблиц

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

В работе были использованы две группы образцов из различных популяционных выборок

Первую группу представляли испытуемые добровольцы, у которых была проведена биохимическая диагностика гиполактазии (нагрузочный тест на толерантность к лактозе) и получен 1 мл крови для определения генотипа В эту группу вошли 12 взрослых добровольцев (не моложе 20 лет) жителей г Москва

Вторая группа представляет популяционные выборки суммарной численностью 1171 индивидов, представляющие различные этнические групп, из коллекции лаборатории анализа генома (табл 1) Выборки иранцев и арабов представлены студентами и аспирантами московских ВУЗов В состав иранцев вошли уроженцы центральных, северных и западных регионов Ирана (персы, луры, гилянцы, курды, турки) В состав выборки арабов вошли уроженцы различных стран (Сирии, Ливана, Иордании, Йемена, Палестины, Израиля, Египта)

Все образцы крови были собраны у неродственных индивидов с соблюдением принятой в мире процедуры "информированного согласия" и сбором данных о месте рождения и национальной принадлежности предков двух поколений В исследуемые выборки включались только лица, имеющие предков соответствующей национальной принадлежности на основе данных опроса Забор крови проводился медсестрой

Активность лактазы у испытуемых оценивалась непрямым методом измерение возрастанию уровня глюкозы в крови после лакгозной нагрузки (Козлов, 1996) Данная часть работы выполнялась совместно с д б н А И Козловым (ИОГен РАН и Институт возрастной физиологии РАО)

Для выделения ДНК из образцов крови объемом более 1 мл использовали стандартный фенол-хлороформный метод выделения При объеме образца менее 500 мкл применялся метод с использованием готового набора реагентов DIA/om™ DNA Ргер200, который позволяет выделить ДНК из малых объемов с низкой потерей ДНК

Генотшшрование проводилось с помощью трех различных методов секвенированием по Сенгеру, ПЦР-ПДРФ, лигазной аллель-специфичной реакцией LDR-TaqMan и аллель-специфичной ПЦР «в реальном времени»

Статистические оценки проводили с помощью критерия х2 с использованием программных пакетов "Статистика" и "SPSS"

Табл. 1 Численность щученных выборок

Название Численность (чел.)

Добровольцы 12

Арабы (разные страны) 18

Белорусы 101

Буряты 78

Иранцы 34

Казахи 34

Коми-пермяки 69

Горцы Памира 34

Марийцы горные 53

Русские (Башкирия) 69

Русские (Костромская обл) 102

Русские (Чукотка) 26

Русские Курск 112

Русские Ростов 114

Саамы 64

Удмурты 94

Уйгуры 30

Украинцы 104

Чукчи 35

Итого 1183

Результаты и обсуждение

Для разработки молекулярных методов диагностики гиполактазии, необходимо выявить полиморфизмы, ассоциированные с гиполактазией В связи с тем, что в финской (ЕпайаЬ е1 а1, 2002) и других европейских популяциях полиморфизм ЬСТ*С/Т-13910 ассоциирован с гиполактазией, можно ожидать, что и для российских популяций, по 1файне мере в европейской части, этот полиморфизм также окажется ассоциированным с гиполактазией Установить такую ассоциацию можно двумя способами (1) непосредственно сопоставить генотипы индивидов по полиморфизму ЬСТ*С/Т-\39\0, установленные молекулярными методами, и их фенотипы (наличие/отсутствие гиполактазии), установленные клинико-биохимическим анализом,

б

(2) сопоставить частоты генотипа С/С полиморфизма LCT*C/T-13910 и частоты гиполактазии в одних и тех же популяциях

Оба подхода были использованы в данной работе На первом этапе для исследования были отработаны различные методы генотипирования данного полиморфизма с оценкой их перспективности для популяционных и клинических исследований

3.1. Разработка и характеристика методов генотипирования полиморфизма

ЬСТ*СЛГЛШй 3.1.1. Секвенирование

Для амплификации фрагмента, содержащего целевой участок, с помощью программы Ohgo4 0 была подобрана пара праймеров, соответствующая нуклеотидной последовательности регуляторного участка гена LCT в области -13910 (GenBarik <www nebí nlmjiih gov>, ВАС-клон AC012551), как это было определено (Enattah et al, 2002) (рис 1) Расчетный размер синтезируемого с этих праймеров фрагмента составляет 155 п н

Lactl-for

gagacgatca cgtcatagtt tatagagtgç ataaac^accrt aagttaccat

ttaatacctt tcattcagga aaaatgtact tagaccctac aatgtactag

taggcctctg cgctggcaat acagataaga taatgtagCc cctggcctca

aaggaactct cctccttagg ttgcatttgt ataatqtttg atttttagat

tgttctttga <4- Lactl-rev

Рис.1. Нуклеотидная последовательность участка ВАС-клона АС012551. В

полиморфной позиции С/Т -13910 представлен нуклеотид С Стрелками указаны праймеры, положение праймеров на нуклеотидной последовательности выделено

После ПЦР весь объем реакционной смеси вносили в агарозный гель Полученные фрагменты переосаждали после электрофореза из агарозного геля, проводили дополнительную очистку и использовали для последующего секвенирования по методу Сэнгера (Sambrook et al, 1989) Для секвенирования был выбран праймер Lactl-for, так как при использовании праймера Lactl-rew, при синтезе с которого нуклеотиду С полиморфизма LCT*C/T-13910 соответствует нуклеотид G в синтезируемой цепи, находящийся в конце олиго-G тракта, определение генотипа в некоторых случаях было невозможно в связи с ошибками синтеза олиго-G участка 3.1.2. ПЦР-ПДРФ

Для генотипирования полиморфизма ¿07*0/743910 можно использовать две эндонуклеазы рестрикции CvjJI (Chao et al, 2004) и BsmFl (Bumng et al, 2003),

применение которых для массового анализа нецелесообразно из-за высокой стоимости коммерческих препаратов. Поэтому в работе была использована стратегия модификации праймера, приводящая к появлению сайта рестрикции в продукте амплификации, что позволяет установить аллельное состояние локуса с использованием более доступных эндонуклеаз рестрикции. Из эндонуклеаз рестрикции, участок распознавания которых отличается на один нуклеотид от изучаемой геномной последовательности, была выбрана рестриктаза РярМ, так как при ее использовании некомплементарный нуклеотид находится на максимальном расстоянии от полиморфного сайта.

Для проведения ПЦР был использован модифицированный праймер Ьасг-тос!, соответствующий сайту узнавания в сочетании с праймером ЬасИ-ге\у.

Расчетная длина ПЦР-фрагмента составляет 137 п.н. (рис. 2).

ggnncc сайт узнавания PspN4

aat acagataaga taatgGag Праймер Lact-mod

cgctggcaat acagataaga taatgtagCc cctggcctca Полиморфный сайт

Рис.2. Положение модифицированного праймера (Ьас(-тоё) относительно нуклеотидной последовательности. Подчеркнута полиморфная позиция С; выделена замена в праймере.

Т/Т С/С Т/С М50 Т/С Т/С Т/С С/С С/С С/С

Рис.3. Электрофореграмма продуктов ПДР-ПДРФ анализа полиморфизма С/Т.,то в регуляторном участке гена лактазы LCT. При обработке продукта ПЦР рестриктазой PspNAl аллелю С соответствует два фрагмента размером (115 и 22 п.н., меньший фрагмент не виден на геле), аллелю Т соответствует фрагмент размером 137 п.н.

При наличии нуклеотида С в полиморфной позиции образуется два фрагмента размером 22 и 115 п.н. При наличии в полиморфной позиции Т размер фрагмента не изменяется и составляет 137 п.н. Соответственно, гетерозиготы С/Т имеют все три фрагмента (22 + 115 + 137 п.н.). Размер фрагментов определяли с помощью электрофореза в ПААГ (рис.3). Подбор оптимальных условий рестрикции (время прохождения реакции) осуществлялся на образцах, генотип которых был определен по результатам секвенирования. Результаты генотшшрования обоими методами совпали.

3.1.3. LDR-TaqMan

Генотипирование с помощью метода лигазной аллель-специфичной реакции LDR-TaqMan (Ligation detection reaction - TaqMan Assay) (Borodina et al., 2004) проводилось в Институте молекулярной генетики Макса-Планка в Берлине, Германия, в сотрудничестве с Т.Бородиной и А.Солдатовым. Из 253 образцов, проанализированных и с помощью метода LDR-TaqMan, и ПЦР-ПДРФ, расхождение результатов получено для 24 образцов (9.5%). На результаты генотшшрования методом LDR-TaqMan в значительной мере влияло качество очистки препаратов ДНК. Таким образом, при детекции аллелей полиморфизма С/Т - 13910 гена LCT при массовом генотипировании метод может давать высокий процент ошибок (рис. 4).

4' —

FAM

3' а

2

V

0'

0 12 3

Интенсивность флуоресценции TET

Рис.4. Генотипирование полиморфизма С/Т - 13910 гена LCT с помощью LDR-TaqMan по интенсивности флуоресценции красителей FAM (аллель С) и ТЕТ (аллель Т) , метящих олнгонуклеотиды, соответствующие разным аллелям. Указаны области

неиденгифицируемых генотипов.

314. Аллель-специфичная амплификация в режиме «реального времени»

Метод основан на использовании классической аллель-специфичной ПЦР, однако регистрация накопления продуктов реакции проводится непосредственно во время проведения ПЦР По сравнению с анализом результатов после реакции такой подход позволяет существенно упростить исследование, поскольку не требуется подбор оптимального для дифференциации аллелей числа циклов ПЦР (Кофиади, Ребриков, 2006) Отработка генотипирования с помощью метода аллель-специфичной амплификации в режиме «реального времени» проводилось совместно с И А Кофиади, Д В Ребриковым (ООО «ДНК-технология», Москва) Для 30 образцов (по 10 с каждым возможным генотипом С/С, С/Г, Т/Т), генотипы которых были установлены методом ПЦР-ПДРФ, результаты генотипирования полностью совпали

3.1.5. Сравнительная характеристика методов генотипирования

Сравнение использованных методик показывает, что по точности методы ПЦР-ПДРФ, секвенирования и ПЦР в режиме реального времени сопоставимы Ошибки определения, как правило, обусловлены недостаточным качеством препарата ДНК, а не особенностями каждого из методов Метода ЦЖ-ТадМап позволяет быстро проводить анализ, но оказался наиболее чувствительным к качеству препаратов ДНК и именно для исследуемого локуса дает нестабильные результаты и требует дополнительного оборудования По стоимости методы ПЦР-ПДРФ и аллель-специфичной ПЦР «в реальном времени» сопоставимы друг с другом, и имеют значительное преимущество перед секвенированием (приблизительно в 4 раза ниже) При использовании метода ПЦР «в реальном времени» требуется примерно в 2 раза меньше времени по сравнению с ПЦР-ПДРФ (поскольку результат известен сразу по окончании реакции амплификации) и в 6 раз меньше по сравнению с секвенированием ПЦР-продукта Время, затрачиваемое на проведение реакции (не более 2-х часов для 48 образцов, включая все необходимые контроли) также позволяет рекомендовать аллель-специфичную амплификацию в режиме «реального времени» для проведения масштабных исследований данного полиморфизма

3 2. Исследование ассоциации генотипа С/С полиморфизма ЬСТ*С/ТЛЪ9Ш и фенотипом гиполактазин в выборке добровольцев

Исследование было проведено на выборке 12 добровольцев (возраст обследованных 22-54 года), жителей г Москвы У всех добровольцев было оценено

изменение уровня глюкозы крови после приема 50 г раствора лактозы натощак (медицинские манипуляции проводились д б н А И Козловым)

При этом фиксировался уровень глюкозы в крови натощак и через 40 минут после лактозной нагрузки, возраст обследуемых, национальность родителей и их отношение к молоку Также велся учет клинических симптомов (расстройство стула, вздутие живота, тошнота, изжога, боли различной локализации, общая слабость) в течение 2-3-х часов после употребления раствора лактозы Диагноз пшолактазии ставился на основе сочетания биохимических и клинических показателей, т е возрастания уровня глюкозы крови после нагрузки лактозой менее чем на 1 1 ммоль/л и наличия клинических симптомов При наличии ярко выраженных симптомов диагноз пшолактазии ставился при большем уровне возрастания концентрации глюкозы (Козлов, 1996) У всех испытуемых был определен генотип по полиморфизму ЬСТ*С/Т-13910 Результаты обследования представлены в (табл 2)

По результатам тестирования пшолактазия диагностирована у 7 из 12 испытуемых У всех этих 7 испытуемых установлен генотип С/С по полиморфизму ХСГ* С/Т-13910 Остальные 5 испытуемых, у которых выявлен высокий уровень активности лактазы, оказались гетерозиготами С/Т Таким образом, данные о генетическом контроле пшолактазии, полученные на финской выборке (ЕпайаЬ е1 а1, 2002), подтверждены нами на исследованной российской группе генотип С/С полиморфизму ЬСТ* С/Т-13910 полностью ассоциирован с гиполактазией (7 из 7 случаев), а аллель Т проявляется как доминантный, обуславливая персистенцию лактазы

Табл 2. Фенотип гиполактазии и генотипы по полиморфизму ХСГ*СТ-13910 у индивидов в выборке добровольцев

М Возраст (полных лет) Национальность родителей Уровень сатара (ммоль/л) Наличие симптомов Отношение к молоку/ частота употребления Фесктш Геаотии

ДО лосле изменение кони

1 26 каз/узб 2,7 4,0 13 да редко гиполакгазия С/С

2 22 рус/рус 3,6 2,9 -0,7 да редко гипол астазия С/С

3 45 рус/евр 40 4,5 0,5 да не употребляет пшолактазия с/с

4 37 рус/ рус 3,8 7,0 3,2 нет любит от

5 54 рус/рус 4Л 5,8 1,6 нет любит СП

6 22 рус/бет 44 6,6 22 да не любит гипозаетазня с/с

7 23 рус/ рус 4,4 8,0 36 нет умеренно С/Т

8 26 рус/РУС 4,6 5,6 1,0 да редко гипозакгазия с/с

9 23 рус/рус V 4,8 0,5 да умереннно птопзкъаю с/с

10 21 укр/укр 5,5 6,2 0,7 да не любит пшолактазия с/с

11 22 рус/рус 50 7,5 2,5 нет умеренно от

12 22 рус/рус 4,9 6,5 16 нет умеренно С/Т

3.3. Определение частот аллелей С и Т и генотипов по полиморфизму ЬСТ*С/Т-13910 в выборках, представляющих популяции Евразии

Для каждого индивида в исследованных выборках были установлены генотипы по полиморфизму ЬСТ*С/Т-\Ъ9\0 Всего было установлены генотипы 1171 индивида из 18 популяций, представляющих 14 этнических групп Различные методы генотипирования использовались по мере их отработки, некоторые выборки были проанализированы параллельно двумя методами Установленное распределение частот генотипов и аллелей локуса ЬСТ*С/Т-\Ъ9\0, приведено в табл 3

Эмпирическое распределение частот генотипов соответствует теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди-Вайнберга во всех исследованных выборках, кроме горцев Памира В последнем случае отклонение может объясняться небольшим размером исследованной выборки

Из 14 этнических групп, для которых нами были установлены частоты генотипов, 6 (русские, удмурты, коми, саамы, иранцы, арабы) были исследованы также другими авторами Сравнение полученных данных о частотах генотипа С/С, ассоциированного с гиполактазией в европейских популяциях, приведено в табл 4

В 4 случаях (русские, арабы, иранцы, удмурты) из 6 различия между установленными нами частотами и опубликованными другими авторами для соответствующих групп не достигают статистической значимости Для двух групп (коми и саамов) различия значимы Для группы коми-пермяков нами установлена частота генотипа С/С 0 42 (95% С10 36—0 46), тогда как в работе (ЕптШаЬ е1 а1, 2007) для небольшой выборки коми указана частот данного генотипа 0 70 (95% С1 0 59-0 86), при этом какая именно группа коми была исследована - не указано Согласно ранее опубликованным данным по фенотипам пшолактазии, различные подгруппы коми могут отличаться по частоте этого признака Так, для коми-пермяков была установлена частота гиполактазии 50%, а для коми-юкемцев - 63% (Койоу, 1995) Поэтому указанные различия вполне объяснимы, если исследованы разные группы коми Аналогичная ситуация с саамами Согласно клинико-биохимическим данным в различных подгруппах саамов частота пшолактазии варьирует, будучи самой высокой у саамов-сколтов (60%) и самой низкой у инари-саамов (25%) (Ког1оу, 1995) Различия в частотах гиполактазии могут объясняться разной интенсивностью притока генов от соседних популяций, и разной частотой гиполактазии в популяциях-источниках генов (у русских, финнов, шведов, норвежцев) Поэтому и в этом случае расхождения частот

ТабтЗ. Распределение частот генотипов и аллелей полиморфизма 1СГ*С/Т-13910 в исследованных выборках.___

Популяции Численность выборки Частота генотипов, % (14) Частота аллелей х2

С/С С/Т Т/Т С Т

Русские (Костромская обл) 102 36 2(37) 45 1 (46) 18 6(19) 0 58±0 03 0 42±0 03 0314

Русские (Курск) 112 53 6(60) 38 4(43) 8 0(9) 0 73±0 03 0 27±0 03 0 ПО

Русские (Ростов) 114 53 5(61) 404(46) 61(7) 0 74±0 03 0 26±0 03 0187

Русские (Башкирия) 69 50 7 (35) 42 0 (29) 7 2(5) 0 72+ 0 04 0 28+0 04 0 092

Русские (Чукотка) 26 46 2(12) 38 4(10) 15 4(4) 0 65+0 07 0 35+0 07 0 588

Украинцы 122 41 8 (51) 44 3 (54) 13 9(17) 0 64+0 03 0 36+0 03 0 541

Белорусы 101 39 6 (40) 44 6 (45) 15 8(16) 0 62+0 03 0 38+0 03 0 198

Саамы 64 48 4(31) 42 2 (27) 9 4(6) 0 70+0 04 0 30-4) 04 0 001

Коми-пермяки 69 42 0 (29) 43 5 (30) 14 5(10) 0 64+0 04 0 36±0 04 0 241

Удмурты 94 55 3 (52) 38 3 (36) 6 4(6) 0 74+0 03 0 26+0 03 0 005

Марийцы горные 53 73 6(39) 22 6(12) 3 8(2) 0 S5+0 03 015+0 03 0 721

Казахи 34 79 4(27) 113(6) 19(1) 0 88+0 04 012+0 04 0 765

Уйгуры 30 90 0 (27) 10 0(3) 0 0 95+0 03 0 05+0 03 0 083

Буряты 78 89 7(70) 10 3 (8) 0 0 95+0 02 0 05+0 02 0 257

Чукчи 35 88 6(31) 114(4) 0 0 94+0 03 0 06±0 03 0 129

Горцы Памира 34 88 2 (30) 8 8(3) 29(1) 0 93+0 03 0 07+0 03 4 222

Иранцы 34 912(31) 8 9(3) 0 0 96+0 02 0 04+0 02 0 072

Арабы 18 83 3 (15) 16 6(3) 0 0 92+0 05 0 08+0 05 0 149

Табл 4. Сопоставление установленных частот генотипа С/С по1иморфизма ЬСТ*С/Т-\3910 с опубликованными данными по соответствующим группам_

Данная работа Опубликованные данные

Популяции Числ выборки Частота генотипа ас, % Популяиии Числ выборки Частота генотипа С/С, % Лит ссылка

Арабы (раз'ше страны) 18 83 Арабы 51 82 Enattah et al, 2007

Арабы (Израиль) 136 95 Ingram et al, 2П07

Арабы (Палестина) 19 95 Ingram et al, 2007

Арабы Саудовской Аравии 432 998 Imtiazetal 2007

Иранцы 34 91 Иранды 21 81 Enattah et al 2007

Коми-иермяки 69 42 Коми 10 70 Enattah el al 2007

Саамы (Кольский п-ов) 64 48 Саамы 30 67 Enattah et al, 2007

Удмурты 94 55 Удмурты 30 40 Enattah et al, 2007

Руссхие(Костром ска? обл) 113 36

Русские (Чукотка) 26 46

Русские (Курск) 112 54

Русские(Ростов) 114 54 Русские (регион не указан) 25 58 Dersaglien et aj 2004

генотипа С/С объяснимы, если в данной работе и в работе (ЕпайаЪ а1, 2007) исследованы разные подгруппы саамов

3.4. Сопоставление частот генотипа С/С полиморфизма 1СГ*С7Г-13910 с частотой гиполактазии в соответствующих популяциях.

Мы сопоставили частоты генотипа С/С по полиморфизму ХСГ*С/Г-13910, установленные нами на основе молекулярно-генетического генотипирования, с данными о частотах гиполактазии в аналогичных или наиболее близких к изученным выборкам, полученными ранее на основе клинико-биохимической диагностики гиполактазии (табл 5 ) Установленные нами частоты генотипа С/С весьма близки к частотам гиполактазии, установленным разными авторами на основе данных клинико-лабораторного анализа как тех же групп, которые изучены нами, так и для соседствующих с ними групп иной этнической принадлежности

В изученных нами славянских группах частота генотипа С/С варьирует от 36% -40% в популяциях северных русских, украинцев и белорусов до 50% и более у русских южных регионов, Поволжья и Сибири Это соответствует частотам гиполактазии в соответствующих этнорегиональных группах (габл 5)

Частота генотипа С/С у кольских саамов (48%) (образцы собраны в Ловозерском р-не в 2006 г) идентична опубликованной частоте гиполактазии у кольских саамов (Козлов 1998, Койоу, ЬшЬзуп, 1996)

В исследованных популяциях Волго-Уральского региона (удмурты, коми-пермяки, марийцы) частота генотипа С/С также соответствует установленной ранее частоте гиполактазии Интересно отметить, что по распространенности гиполактазии марийцы резко отличаются от других популяций, населяющих Центральное Поволжье и Приуралье - удмуртов (59%), коми-пермяков (50%) и мордвы (52%) У марийцев гораздо выше доля индивидов, имеющих фенотип гиполактазии 83% среди луговых, и 79% - среди горных марийцев (Тамм и др, 1987) Установленная нами частота генотипа С/С у марийцев (74%) также существенно превышает частоты этого генотипа у коми-пермяков (42%) и удмуртов (55%), что полностью соответствуют опубликованным результатам фенотипических исследований

Установленные частоты генотипа С/С в популяциях казахов, уйгуров, горцев Памира, чукчей соответствуют ожидаемым частотам гиполактазии в населении Центральной Азии и Сибири, хотя не для всех изученных групп можно найти точно соответствующие группы, для которых исследованы частоты гиполактазии

Частота генотипа С/С у горцев Памира (88%) близка к частоте пшолактазии в соседствующей с ними группе таджиков Афганистана (82%) Для проанализированной нами выборки казахов Казахстана частота генотипа С/С составила 79%, что соответствует опубликованным данным по частоте гиполактазии у казахов Китая (76%) Для чукчей частота гиполактазии не известна Наиболее географически и культурно близкой к ним группой, для которой доступны данные о частоте гиполактазии, являются эскимосы Эта частота (81%) близка к установленной нами частоте генотипа С/С у чукчей (89%)

Исключение представляет выборка бурят, для которых установленная нами частота генотипа С/С 0 89 (95% CI 0 84-0 92) значимо отличается от частоты гиполактазии 0 47 (95% CI 0 36-0 60), определенной в 1988 г на основе клинико-биохимических данных для небольшой выборки бурят (Жвавый и др, 1991) Причиной расхождения может быть небольшой размер фенотипированной выборки бурят (19 человек (Жвавый и др , 1991)), либо заниженная оценка частоты пшолактазии у бурят в клинико-биохимическом исследовании, на возможность такого занижения указывал ранее в своем обзоре распространенности гиполактазии А И Козлов (Козлов, 1996, 2004) В пользу последнего свидетельствует и отклонение оценки частоты пшолактазии 47% у бурят от общего географического градиента, и тот факт, что у соседних с бурятами монголов частота гиполактазии составляет 88% (Wang et al, 1984)

Тем не менее, в силу возможной генетической гетерогенности признака персистенции лактазы, нельзя исключить наличие в популяции бурят иных, кроме полиморфизма LCT *С/Г-13910, генетических вариантов, определяющих синтез лактазы у взрослых Это предположение должно приниматься во внимание в свете недавно полученных данных о распространении в африканских и ближневосточных популяциях независимо появившихся мутаций в регуляторном участке гена лактазы, детерминирующих фенотип персистенции лактазы (Tishkoff et al, 2006, Ingram et al, 2007) Если персистенция лактазы 53% в популяции бурят обусловлена наличием иных мутаций, детерминирующих персистенцию лактазы, можно ожидать, что часть (половина или чуть меньше) индивидов с генотипом С/С по полиморфизму LCT *С/Т-13910 будет способна к расщеплению лактозы Чтобы проверить эту гипотезу мы фенотипировали 8 индивидов с генотипом С/С из бурятской выборки по стандартизированной методике (фенотипирование проводилось д б н А И Козловым)

Табл. 5. Частоты генотипа С/С в исследованных популяциях, в сопоставлении с

клинико-эпидемиологическимп данными о частотах гнполактазии

Частоты генотипа С/С Частота фенотипа гиполактазии *

Популяции N Частота, % Популяции N Частота % Р Уа1ие

Украинцы (Вост. Украина) 115 42 Украинцы (Киев) 142 35-40

Белорусы (разл регионы) 101 39 Поляки - 37 ИА

Литовцы — 30-37 ИА

Русские (Кострома) 102 36 Русские (Московская обл) 136 37 0 932

Русские (Курск) 112 54 Русские (Удмуртия) 30 40 ИА

Русские(Ростов) 114 54

Русские (Башкирия) 69 51 Русские Западной Сибири 47 49 КА

Русские (Чукотка) 26 46

Саамы (Кольский п-ов) 64 48 Саамы (Кольский п-ов) 50 48

Удмурты 94 55 Удмурты 75 59 0 897

Коми-пермяки 69 42 Коми-пермяки 112 50 0 580

Марийцы горные 53 74 Марийцы горные 111 79

Марийцы луговые 93 83

Казахи (Казахстан) 34 79 Казахи (Китай) 195 76

Уйгуры (Казахстан) 30 90

Буряты 70 89 Буряты 19 47

Монголы (Китай) 198 88

Чукчи 35 89 Эскимосы Гренландии 170 81 ИА

Горцы Памира 34 88 Таджики (Афганистан) 79 82 0 881

Иранцы 34 91 Иранцы 21 86

Арабы (разные страны) 18 83 Арабы Израиля 75 среднее 76

Ирак 80

Иордания 75

Ливан 78

Йемен 75

Египет 73

Саудовская Аравия 30 17

* Литературные ссылки по частоте гиполактазии приведены в Приложении 2

руковписи

На основании изменения уровня глюкозы крови после нагрузки лактозой у всех 8 индивидов была диагностирована гиполактазия Хотя объем исследованной выборки недостаточен для того статистически достоверного заключения об отсутствии иных кроме LCT *С/Т-13910 полиморфизмов, детерминирующих персистенцию лактазы у бурят, полученные данные свидетельствуют в пользу этой гипотезы

Для двух исследованных нами небольших выборок иранцев и арабов, представляющих группы Ближнего Востока, частота генотипа С/С составила 91% (95% CI 87-96%) и 83% (95% CI 87-97%) соответственно Для иранцев частота близка к опубликованы данным по гинолактазии Однако по крайне мере один индивид с генотипом С/С в обследованной нами выборке любит молоко и потребляет его в больших количествах

Для арабов частоты гинолактазии сильно различаются для разных групп Для большинства групп арабов частота гиполактазии составляет 73-80% (в среднем - 76%), тогда как для арабов Саудовской Аравии составляет 17% (Cook, al-Torki, 1975) Следует отметить, что частота генотипа С/С и в исследованной нами группе, и в группах, исследованных другими авторами превышает 80% (Enattah et al, 2007, Ingram et al, 2007), в том числе и у арабов Саудовской Аравии (Imtiaz et al, 2007) В последней группе распространен другой ассоциированный с гиполактазией аллель T/G-13915, частота носителей которого соответствует установленной ранее частоте персистенции лактазы (Imtiaz et al, 2007) С учетом изложенного можно ожидать, что аллель LCVG -13915 может быть представлен как в арабских, так и в иранских популяциях, и представляет интерес исследование этого вопроса в дальнейшем

3.5. Корреляция частот генотипа С/С и фенотипа гиполактазии в популяциях Евразии

В выборке 25 популяций Евразии, включая 14 из исследованных нами, для которых доступны данные и по частоте генотипа С/С, и по частоте гиполактазии, наблюдается совпадение этих частот (рис 5) Коэффициент корреляции по выборке в целом составляет R=0 865, р<0 001

Для 15 европейских популяций, вошедших в выборку, корреляция составляет R=0 919, р<0 001 Для 10 азиатских популяций корреляция недостоверна (R=0 363, р=0 302) Расходение между частотами генотипа С/С и первичной гиполактазии выявлено у бурят, якутов и уйгуров Полученыне данные соответствуют опубликованным данным о расхождении частот генотипа С/С и частот гиполактазии в этнических группах

Северного Китая Для заключения о генетической гомогенности или гетерогенности детерминации шполактазии в населении Азии необходимо провести дополнительные популяционно-эпидемиологические исследования для уточнения частот гиполактазии и молекулярно-генетический анализ ряуляторного участки гена лактазы у представителей тех выборок, в которых частота генотипа С/С превышает частоту гиполактазии

о"

О

«

с

5

X

0 и

в

1

б У

100'

Коэффициенты корреляции

11 азиатских

популяций

Я=0 363, р=0 302

15 европейских популяций Я=0 919, р<0 001

20 40 60 80 100

Частота гиполактазии, %

Рис 5. Корреляция меязду частотой генотипа С/С и частотой клинически диагностированной гиполактазии в популяциях Евразии.

Популяции Евразии, изученные в данной работе, указаны черными квадратиками, остальные евразийские популяции указаны светлыми квадратиками

Представлены ирландцы, шведы, немцы, финны, украинцы, поляки, французы, русские (Кострома/Московская обл), итальянцы северные, уйгуры, буряты, кольские саамы, коми-пермяки, мордва мокша, мордва эрзя, удмурты, корейцы, казахи, марийцы, ханты и манси, чукчи, горцы Памир/таджики Афганистана, 23 - иранцы, 24 - китайцы, 25 - японцы Ссылки приведены в Приложении 1 и 2 рукописи

Ранее при исследовании выборок финнов и немцев было показано, что генотип С/С по полиморфизму £СТ*С/Т-139\0 является детерминантом пшолактазии Аналогичные результаты получены нами при сопоставлении фенотипов и генотипов в выборке уроженцев европейской части России Установленная в данной работе корреляция частот генотипа С/С и гиполактазии в популяциях европейской части России указывает, что генотип С/С по полиморфизму £СТ*С/Т-\Ъ910 является в них основным, а возможно, единственным детерминантом гиполактазии В этих популяциях определение генотипа С/С по полиморфизму ЬСТ*СК -13910 методами может использоваться как ДНК-диагностика первичной гиполактазии

Заключение

Полученные нами данные о распределении частот ассоциированного в европейских популяциях с пшолактазией генотипа по полиморфизму ЬСТ*С/Т-\29\0 в популяциях Евразии хорошо вписываются в общую картину географической изменчивости частот гиполактазии в популяциях Евразии с повышением ее от 2-6% на Северо-западе Европы у голландцев и датчан до 50-70% на юге Европы и в Волго-Уральском регионе и еще более высокими частотами (до 80% и выше) в коренном населении Сибири и Дальнего Востока (Козлов, 1996, Козлов и др , 1998, ЕпайаЬ ег а1, 2007) Для популяций азиатской части России необходимы дополнительные исследования генетических полиморфизмов, ассоциированных с пшолактазией для того, чтобы определить, является ли дня них полиморфизм £СГ*С/Т-13910 единственным или лишь одним из нескольких, ассоциированных с пшолактазией

Для изученных популяций европейской части России различия мевду частотами клинически диагностированной гиполактазии в популяциях и установленными нами частотами генотипа С/С находятся в пределах статистической ошибки Это позволяет заключить, что генотип С/С по полиморфизму 1СТ*С/Т-\Ъ9\0 в изученных группах является наиболее частым, а возможно единственным, определяющим персистенцию лактазы и способность к усвоению молока взрослыми ДНК-диагностику на носительство генотипа С/С по полиморфизму ХСГ*С/743910 у представителей

европейских популяций России можно рассматривать как предиктивный тест в отношении первичной гиполактазии задолго до ее фенотипического проявления

ВЫВОДЫ

1 На выборке 12 взрослых жителей европейской части России показана ассоциация генотипа С/С по полиморфизму С/Т -13910 гена LCT с фенотипом гиполактазии все 8 индивидов, имеющих генотип С/С поэтому локусу, обладают фенотипом гиполактазии, все 4 индивида с генотипом С/Т по этому локусу обладают фенотипом персистенции лактазы

2 Определены частоты аллелей и генотипов по полиморфизму С/Т -13910 гена LCT в 18 выборках, представляющих 14 этнических групп Евразии (всего 1171 индивид) Частота генотипа С/С, ассоциированного с гиполактазией, в изученных популяциях минимальна для населения Севера-Запада России и растет к Югу и Востоку, составляя в выборках русских 36 - 54% ( в т ч русские Костромы - 36%, , Чукотки - 46%, Башкирии - 51%, Курска - 54%, Ростова - 54%), белорусов - 40%, украинцев - 42%, коми-пермяков - 42%, саамов - 48%, удмуртов - 55%, марийцев -74%, казахов - 79%, горцев Памира - 88%, чукчей 89%, уйгуров - 90%, бурят - 90%, иранцев - 91%, арабов разных стран - 83%

3. Показано, что частоты генотипа С/С по полиморфизму С/Т -13910 гена LCT в популяциях европейской части России совпадают с частотами клинически диагностированной гиполактазии в тех же группах, то есть, что генотип С/С по полиморфизму ОТ -13910 регуляторного участка гена LCT является основным, а возможно, и единственным генетическим детерминантом первичной гиполактазии в популяциях европейской части России

4. Разработаны и проверены 4 метода генотипирования аллельного состояния полиморфизма С/Т -13910 гена LCT По сочетанию точности и простоты оптимальным для тестирования методом является ПЦР-амплификация "в реальном времени" с флуоресцентно меченными аллель- специфическими праймерами

Часть работы выполнена в рамках плановых работ ИОГен РАН по теме РФФИ 04-04-49196а "Мультиплексный анализ SNP по генам общераспространенных и социально-значимых заболеваний в выборках русских, украинцев и белорусов" и РФФИ 05-06-80427-а "Сравнительное исследование особенностей питания и популяционно-генетических характеристик этнотерриториальных групп, относящихся к различным адаптивным типам"

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Соколова М В , Бородина Т А, Гасемианродсари Ф , Козлов А И, Гречанина Е Я, Фещенко С П, Боринская С А, Янковский Н К Полиморфизм ассоциированного с гиполактазией локуса С/Т-13910 гена лактазы LCT у восточных славян и иранцев // Мед Генетика, 2005, № 11, сгр 523-527

2 Боринская С А, Ребриков Д В , Нефедова В В , Кофиади И А, Соколова М В, Колчина Е В, Куликова Е А, Чернышов В Н, Куцев С И, Полоников А В , Иванов В П, Козлов А И, Янковский Н К Молекулярная диагностика и распространенность первичной гиполактазии в популяциях России и сопредельных стран//Молекулярная биология, 2006, Том 40, №6,стр 1031-1036

3 Kozlov A, Vershubsky G, Bormskaya S, Sokolova M, Nuvano V Activity of disacchandases m arctic populations evolutionary aspects disaccharidases in arctic populations J Physiol Anthropol AppI Human Sci 2005 3d,24(4) 473-6

4 Соколова M В , Васильев E В , Козлов А И, Ребриков Д В , Сенкеева С С , Кожекбаева Ж М, Люндуп Н С, Свечникова Н С , Огурцов П П , Хуснутдинова ЭК, Янковский НК, Боринская С А Полиморфизм GT-13910 регуляторного участка гена лактазы LCT и распростораненность гиполактазии в популяциях Евразии // Экологическая генетика, 2007, том 5, № 3, стр 26-35

5 Сокотова М В , Кожекбаева Ж М, Тяжелова Т В , Боринская С А, Янковский Н К ДНК-диагностика гиполактазии в российских популяциях // Материалы конференции "Актуальные проблемы генетики" Москва, 2003, Т 2, стр 39-40

6 Козлов А И, Боринская С А , Соколова М А, Здор Э В Потребление пищевых Сахаров и нарушения обмена углеводов у коренного населения Севера // Материалы 13 Международного конгресса по приполярной медицине (ред Л Е Панин) Новосибирск, 000«РИЦ», 2006 147-148

7 Соколова М В , Бородина Т А, Козлов А И, Гречанина Е Я, Фещенко С П, Боринская С А, Янковский НК Полиморфизм локуса LCT С/Т-13910, ассоциированного с гиполактазией, у восточных славян / Материалы 5-го съезда российского общества медицинских генетиков // Медицинская генетика, 2005 Т 4, №6, С 268

8 Ghasemian Rodsan F, Sokolova M, Kalyma N, Bormskaya S , Yankovsky N Iranian and Pamir populations m Eurasian context allele frequencies of eight loci associated with common diseases // 8th Iranian Congrss of Biochemistry and First International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, Tehran, Iran, September 11-15, 2005 Selected Abstracts Cluneal Biochemistry 2005 V 38 p 857

9 Sokolova M V, Rebnkov D V , Borodma T A, Kozlov AI, Bormskaya S A, Yankovsky NK Hypolactasia-associated polymorphism m lactase gene LCT С/Г-13910 in populations of Russia and neighboring countries // 7th Balkan Meeting of Human Genetics BMHG2006 August 31 - September 2,2006, Skopje, Republic of Macedonia

10 Sokolova M, Kofiadi I , Rebnkov D„ Borodma T , Kozlov A, Bormskaya, Yankovsky N DNA diagnostics of adult-type hypolactasia in populations of Russia and neighboring countries //Human Genome Meeting May 31-June 3 2006, Helsinki, Finland

/

Подписано в печать 21 04 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 297 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соколова, Мария Викторовна

Список использованных сокращений.

Введение.

Актуальность проблемы.

Цели и задачи исследования.

Научная новизна.

Практическая значимость.

1. Обзор литературы

1.1. Генетическая детерминация расщепления молочного сахара у 10 человека.

1.1.1. Лактаза и лактоза.

1.1.2. Гиполактазия.

1.1.3. Возрастные изменения уровня синтеза лактазы.

1.1.4. Генетические полиморфизмы, ассоциированные с гиполактазией.

1.2. Эволюционные аспекты гиполактазии.

1.3. Географическое распределение частот гиполактазии.

1.4. Медицинские аспекты гиполактазии

1.5. Методы диагностики первичной гиполактазии.

1.5.1. Клинические методы.

1.5.2. Молекулярные методы диагностики гиполактазии.

2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Оценка активности лактазы у испытуемых.

2.2.2. Выделение ДНК из цельной крови.

2.2.3. Элюция продукта ДНК-амплификации из агарозных гелей.

2.2.4. Электрофоретический анализ ДНК в горизонтальном агарозном геле.

2. 2. 5. Методы генотипирования.

2.2.6. Статистический анализ данных.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Разработка и характеристика методов генотипирования полиморфизма 60 LCT*C/T-13910.

3.1.1. Секвенирование.

3.1.2. ПЦР-ПДРФ.

3.1.3. LDR-TaqMan.

3.1.4. Аллель-специфичная амплификация в режиме «реального времени».

3.2. Исследование ассоциации генотипа С/С по полиморфизму LCT*C/T

13910 и фенотипом гиполактазии в выборке добровольцев.

3.3. Определение частот аллелей С и Т и генотипов по полиморфизму LCT* С/Т-13910 в выборках, представляющих популяции России и сопредельных стран.

3.4. Сопоставление частот генотипа С/С по полиморфизму Z,CT*C/Tс частотой гиполактазии в соответствующих популяциях.

3.5. Корреляция частот генотипа С/С по полиморфизму £СТ*С/Т-13910 и фенотипа гиполактазии в популяциях Евразии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Полиморфизм С/Т-13910 регуляторного участка гена лактазы LCT, ассоциированного с первичной гиполактазией у человека, в популяциях Евразии"

Актуальность работы

Генетически детерминированное снижение уровня синтеза фермента лактазы у взрослых (первичная гиполактазия, называемая также непереносимостью лактозы, MIM 223100) ограничивает возможность потребления цельного молока из-за непереносимости молочного сахара. Первичная гиполактазия наследуется по аутосомно-рецессивному типу и обусловлена изменениями последовательности нуклеотидов в регуляторном участке гена лактазы (Enattah et al., 2002; Tishkoff et al., 2007; Ingram et al., 2007). Употребление цельного молока при гиполактазии приводит к нарушениям пищеварения: вздутию кишечника, расстройствам стула, тошноте, головным болям, неспецифическим абдоминальным симптомам, выраженность и частота проявления которых зависит от характера микрофлоры кишечника, особенностей диеты и индивидуальной чувствительности пациента (Козлов, 1996; Шлейп, 2004). Указанная симптоматика исчезает и состояние здоровья нормализуется у большинства пациентов в течение 2-3 недель после исключения из питания молока и других продуктов, содержащих лактозу (Козлов, 1996).

Согласно данным клинико-биохимических исследований, частота гиполактазии сильно варьирует между разными популяциями, будучи минимальной (2-3%) на северо-западе Европы и достигая максимума (>90%) в популяциях Восточной Азии. У народов России частота гиполактазии варьирует от 30-40% у русских до 90% и более у коренных народов Сибири и Дальнего Востока (Козлов, 1996; Козлов, 1998)'.

Первичная гиполактазия рассматривается в настоящее время не как болезнь, а как вариант нормы, не требующей иного вмешательства, кроме корректировки диеты. Тем не менее, совершенствование методов диагностики и дифференциальной диагностики первичной гиполактазии имеет большое значение по ряду причин. Высокая мобильность населения в современном мире приводит к тому, что в регионы с традиционно широким распространением молочных продуктов (и сравнительно малым процентом индивидов с ограниченной активностью лактазы) прибывает большое количество выходцев из областей с преобладанием носителей аллеля, обусловливающего гиполактазию. Болезненная реакция на употребление лактозосодержащих продуктов у заметной части мигрантов требует медицинского контроля. В современной пищевой промышленности молочный сахар (лактоза) активно применяется при производстве кондитерских и мясных изделий, а также блюд быстрого приготовления (каш, пюре). Содержание лактозы в этих продуктах может в несколько раз превышать её концентрацию в цельном молоке (Шлейп, 2004).

Клиническая практика требует проведения дифференциальной диагностики гиполактазии у пациентов с целым рядом заболеваний органов пищеварения, при лечении которых традиционно принято назначать молочную диету, что, в случае первичной гиполактазии у пациента, может существенно ухудшить состояние, затруднить диагностику и лечение основного заболевания.

Наконец, дифференциальная диагностика первичной гиполактазии важна в педиатрической практике при обследовании и лечении детей младшего возраста с ещё не полностью сформировавшимся лактазным фенотипом. Распространенные клинико-лабораторные диагностические методы в последнем случае практически непригодны.

Клиническая диагностика гиполактазии возможна на основе как прямых (анализ активности лактазы в биоптатах стенки тонкой кишки), так и косвенных методов. Наиболее точный метод основан на прямом измерении активности лактазы в биоптатах тонкого кишечника, однако он редко применяется из-за инвазивности и слишком высокой сложности. Большее распространение получили косвенные нагрузочные пробы (Arola, 1994).

Среди последних наиболее распространены нагрузочные пробы: определение изменений содержания глюкозы в крови или галактозы в моче, а также содержания водорода в выдыхаемом воздухе после лактозной нагрузки. Эти методы обладают рядом недостатков, ограничивающих возможности их применения.

Специфичность их варьирует от 77 до 96%, а чувствительность от 69 до 94-100%. Недостатками нагрузочных проб являются опасность ухудшения состояния у чувствительных пациентов и высокий уровень ложнопозитивных результатов при обследовании детей (до 30%) (Козлов, 1996). Поэтому разработка систем молекулярной диагностики гиполактазии весьма актуальна.

Выше точки начала транскрипции этого гена выявлен полиморфизм С/Т -13910 (rs4988235), ассоциированный с гиполактазией. Для генотипа С/С по полиморфизму £СГ* С/Т-13910 показана 100% ассоциация с гиполактазией на выборке финнов (Enattah et al., 2002).

Объектом исследования в диссертации явились выборки, представляющие этнорегиональные группы России и сопредельных стран -русские разных регионов (Костромы, Ростова, Курска, Башкирии, Чукотки), украинцы (Восточная Украина), белорусы (различные регионы Беларуси), саамы (Кольский п-ов), марийцы горные (Мари Эл), удмурты (Игринский район Удмуртии), коми-пермяки, казахи (Алма-Ата), уйгуры (Алма-Атинский район), буряты (Улан Удэ и московские студенты уроженцы Бурятии), чукчи (Анадырский район). Были изучены также две небольшие выборки, представляющие популяции Ближнего Востока — московский студенты уроженцы Ирана (персы, луры, гилянцы, курды, турки) и арабы разных стран (Сирии, Ливана, Палестины, Иордании, Йемена, Израиля, Египта).

В диссертационной работе разработаны методы генотипирования полиморфизма £СГ*С/Т-13910 , для которых оценена их специфичность и возможность использования в популяционных исследованиях и клинической практике. Исследовано распределение аллелей и генотипов по полиморфизму LCT*С/Т-13910 в российских популяциях и установлены частоты генотипа С/С, ассоциированного с гиполактазией. Частоты этого генотипа сопоставлены с опубликованными данными по частоте клинико-биохимически диагностированной гиполактазии для тех же популяций.

Цели и задачи исследования

Целью диссертационной работы является выявление географического распределения частот аллелей и генотипов по полиморфизму С/Т-13910 в регуляторном участке гена лактазы LCT в популяциях Евразии; выявление степени ассоциации генотипа С/С по данному полиморфизму с первичной гиполактазией в населении РФ; оценка генетической гетерогенности первичной гиполактазии в населении Евразии; разработка и оптимизация методов молекулярной диагностики первичной гиполактазии.

Задачи работы

• Разработать и подобрать оптимальные методы для детекции аллелей и генотипов полиморфизма LCT* С/Т -13910.

Определить ассоциацию полиморфизма £СГ*С/Т-13910 с фенотипом гиполактазии/персистенции лактазы в российской выборке.

• В выборках, представляющих популяции народов Евразии, определить генотипы индивидов по полиморфизму LCT* С/Т-13910, установить частоты аллелей и охарактеризовать географическое распределение частот аллелей и генотипов.

Оценить возможную генетическую гетерогенность первичной гиполактазии в российских популяциях, сопоставив частоту предположительно ассоциированного с первичной гиполактазией генотипа

С/С полиморфизма LCT*C/T-13910 и установленную ранее фенотипически частоту гиполактазии в тех же популяциях.

Научная новизна

Показана ассоциация генотипа С/С полиморфизма LCT*C/T-13910 в регуляторном участке гена лактазы с фенотипом первичной гиполактазии в выборке жителей европейской части России.

Подобран оптимальный метод для генотипирования полиморфизма LCT*C/T-13910.

Определены частоты аллелей и генотипов полиморфизма LCT*CIТ-13910 в 18 популяциях, представляющих 14 этнических групп России и сопредельных стран.

Показано, что частоты генотипа С/С в большинстве изученных популяциях близки к опубликованным частотам гиполактазии, установленным в клинико-биохимических исследованиях, у соответствующих народов, тем самым показано, что носительство генотипа С/С является основным генетическим детерминантом развития первичной гиполактазии в популяциях европейской части России.

Практическая значимость

Практическая значимость данной работы определяется необходимостью разработки средств молекулярно-генетической диагностики гиполактазии и высокой частотой гиполактазии в российских популяциях (от 35-50% в различных популяциях русских до 80% и более в популяциях коренных народов Сибири и Дальнего Востока). Разработанные методы могут использоваться для ДНК-диагностики первичной гиполактазии в населении европейской части России.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Соколова, Мария Викторовна

ВЫВОДЫ

1. На выборке 12 взрослых жителей европейской части России показана ассоциация генотипа С/С по полиморфизму С/Т -13910 гена LCT с фенотипом гиполактазии: все 8 индивидов, имеющих генотип С/С по этому локусу, обладают фенотипом гиполактазии, все 4 индивида с генотипом С/Т j по этому локусу обладают фенотипом псрсистенции лактазы.

2. Определены частоты аллелей и генотипов по полиморфизму С/Т -13910 гена LCT в 18 выборках, представляющих 14 этнических групп Евразии (всего 1171 индивид). Частота генотипа С/С, ассоциированного с гиполактазией, в изученных популяциях минимальна для населения Севера-Запада России и растет к Югу и Востоку, составляя в выборках русских 36 — 54% ( в т.ч. русские Костромы - 36%, , Чукотки - 46%, Башкирии - 51%, Курска - 54%, Ростова - 54%), белорусов - 40%, украинцев - 42%, коми-пермяков - 42%, саамов - 48%, удмуртов - 55%, марийцев - 74%, казахов -79%, горцев Памира - 88%, чукчей 89%, уйгуров - 90%, бурят - 90%, иранцев - 91%, арабов разных стран - 83%.

3. Показано, что частоты генотипа С/С по полиморфизму С/Т-13910 гена LCT в популяциях европейской части России совпадают с частотами клинически диагностированной гиполактазии в тех же группах, то есть, что генотип С/С по полиморфизму С/Т -13910 регуляторного участка гена LCT является основным, а возможно, и единственным генетическим детерминантом первичной гиполактазии в популяциях европейской части России.

4. Разработаны и проверены 4 метода генотипирования аллельного состояния полиморфизма С/Т -13910 гена LCT. По сочетанию точности и простоты оптимальным для тестирования методом является ПЦР-амплификация "в реальном времени" с флуоресцентно меченными аллель-специфическими праймерами.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю благодарность научным руководителям М.М.Асланяну и С.А.Боринской, заведующему лабораторией анализа генома Н.К.Янковскому, А.И.Козлову и сотрудникам лаборатории анализа генома ИОГен РАН и кафедры генетики биологического факультета МГУ за плодотворные дискуссии и постоянную поддержку в работе.

Заключение

Полученные нами данные о распределении частот ассоциированного в европейских популяциях с гиполактазией генотипа С/С по полиморфизму LCT*С/Т-13910 в популяциях России и сопредельных стран хорошо вписываются в общую картину географической изменчивости частот гиполактазии в популяциях Евразии с повышением ее от 2-6% на Северо-Западе Европы у голландцев и датчан до 50-70% на юге Европы и в Волго-Уральском регионе и еще более высокими частотами (до 80% и выше) в коренном населении Сибири и Дальнего Востока (Козлов, 1996, Козлов и др., 1998; Enattah et al., 2007). Для популяций азиатской части России необходимы дополнительные исследования генетических полиморфизмов, ассоциированных с гиполактазией для того, чтобы определить, является ли для них полиморфизм С/Т-13910 по гену LCT единственным или лишь одним из нескольких, ассоциированных с гиполактазией.

Для изученных популяций европейской части России различия между частотами клинически диагностированной гиполактазии в популяциях и установленными нами частотами генотипа С/С находятся в пределах статистической ошибки. Это позволяет заключить, что генотип С/С-13910 по гену LCT в изученных группах является наиболее частым, а возможно единственным, определяющим персистенцию лактазы и способность к усвоению молока взрослыми. Таким образом, ДНК-диагностику на носительство генотипа С/С локуса С/Т -13910 у представителей европейских популяций России можно рассматривать как предиктивный тест в отношении первичной гиполактазии задолго до ее фенотипического проявления.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соколова, Мария Викторовна, Москва

1. Валенкевич Л.Н., Активность лактазы и синдром непереносимости молока//Клинич.Медицина, 1977,55, 66-70г- ,

2. Козлов А.И., Балановская Е.В., Нурбаев С.Д., Балановский О.П. Геногеография первичной гиполактазии в популяциях Старого Света. Генетика1998,34(4), 551-561.

3. Козлов А.И., Гиполактазия: распространенность, диагностика, врачебная тактика//АрктАн-С, Москва, 1996,-70

4. Таммур Р., Непериносимость лактозы среди детей, подростков и в семьях, имеющих гиполактозию// Tartu, 1991, 23-24

5. Шлейп Т., Осторожно: лактоза! // ВЕСЬ, СПб, 2004,

6. Arola II., Diagnosis of hypolactasia and lactose malabsorption//Scand.J.Gastroenterol.Suppl, 1994,202, 26-35

7. Arola H., Koivula Т., Jokela H., Jauhiainen M., Keyrilainen О., Ahola Т., Uusitalo A., and Isokoski M., Comparison of indirect diagnostic methods for hypolactasia//Scand.J.Gastroenterol., 1988,23(3), 351-357

8. Asmawi M.Z., Seppo L., Vapaatalo H., and Korpela R., Hypolactasia & lactose intolerance among three ethnic groups in Malaysia//Indian J.Med.Res., 2006b, 124(6), 697-704

9. Asmawi M.Z., Seppo L., Vapaatalo H., and Korpela R., Hypolactasia & lactose intolerance among three ethnic groups in Malaysia//Indian J.Med.Res., 2006a, 124(6), 697-704

10. Baiter M., Evolutionary genetics. Are humans still evolving?//Science, 2005,309(5732), 234-237

11. Bayless T.M. and Christopher N.L., Disaccharidase deficiency/Mm. J.Clin.Nutr., 1969,22(2), 181-190

12. Bersaglieri Т., Sabeti P.C., Patterson N., Vanderploeg Т., Schaffner S.F., Drake J.A., Rhodes M., Reich D.E., and Hirschhorn J.N., Genetic signatures of strong recent positive selection at the lactase gene//Am.J.Hum.Genet., 2004,74(6), 1111-1120

13. Bhatnagar S. and Aggarwal R., Lactose intolerance//BMJ, 2007b,334(7608), 1331-1332

14. Boll W., Wagner P., and Mantei N., Structure of the chromosomal gene and cDNAs coding for lactase-phlorizin hydrolase in humans with adult-type hypolactasia or persistence of lactase//Am.J.Hum.Genet., 1991,48(5), 889902

15. Borodina T.A., Lehrach H., and Soldatov A.V., Ligation detection reaction-TaqMan procedure for single nucleotide polymorphism detection on genomic DNA//Anal.Biochem„ 2004,333(2), 309-319

16. Buning C., Genschel J., Jurga J., Fiedler Т., Voderholzer W., Fiedler E.M., Worm M., Weltrich R., Lochs H., Schmidt H., and Ockenga J., Introducing genetic testing for adult-type hypolactasia//Digestion, 2005,71(4), 245-250

17. Buning С., Oekenga J., Kruger S., Jurga J., Baier P., Dignass A., Vogel A., Strassburg C., Weltrich R., Genschel J., Lochs H., and Schmidt H., The

18. C/C(-13910) and G/G(-22018) genotypes for adult-type hypolactasia arenot associated with inflammatory bowel disease//Scand.J.Gastroenterol., 2003,38(5), 538-542

19. Burger J., Kirchner M., Bramanti В., Haak W., and Thomas M.G., Absence of the lactase-persistence-associated allele in early Neolithic Europeans//Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 2007b,104(10), 3736-3741

20. Chao C.K. and Sibley E., PCR-RFLP genotyping assay for a lactase persistence polymorphism upstream of the lactase-phlorizin hydrolase gene//Genet.Test., 2004,8(2), 190-193

21. Coelho M., Luiselli D., Bertorelle G., Lopes A.I., Seixas S., stro-Bisol G., and Rocha J., Microsatellite variation and evolution of human lactase persistence//Hum.Genet., 2005b,117(4), 329-339

22. Cook GC, al-Torki MT.High intestinal lactase concentrations in adult Arbs in Saudi Arabia. //Br Med J. 1975 Jul 19;3(5976): 135-6.

23. Cuatrecasas P., LOCKWOOD D.H., and CALDWELL J.R, LACTASE DEFICIENCY IN THE ADULT. A COMMON OCCURRENCE/ZLancet, 1965,13, 14-18

24. Ellestad-Sayed J.J. and Haworth J.C., Disaccharide consumption and malabsorption in Canadian Indians//Am.J.Clin.Nutr., 1977,30(5), 698-703

25. Enattah N., Valimaki V.V., Valimaki M.J., Loyttyniemi E., Sahi Т., andс

26. Jarvela I., Molecularly defined lactose malabsorption, peak bone mass and bone turnover rate in young finnish men//Calcif.Tissue Int., 2004b,75(6), 488-493

27. Enattah N., Valimaki V.V., Valimaki M.J., Loyttyniemi E., Salii Т., and Jarvela I., Molecularly defined lactose malabsorption, peak bone mass and bone turnover rate in young finnish men//Calcif.Tissue Int., 2004a,75(6), 488-493

28. Enattah N.S., Forsblom C., Rasinpera H., Tuomi Т., Groop P.H., and Jarvela I., The genetic variant of lactase persistence С (-13910) T as a risk factor for type I and II diabetes in the Finnish population//Eur.J.Clin.Nutr., 2004b,58(9), 1319-1322

29. Enattah N.S., Kuokkanen M., Forsblom C., Natah S., Oksanen A., Jarvela I., Peltonen L., and Savilahti E., Correlation of intestinal disaccharidase activities with the C/T-13910 variant and age/AVorld J.Gastroenterol., 2007,13(25), 3508-3512

30. Enattah N.S., Sahi Т., Savilahti E., Terwilliger J.D., Peltonen L., and Jarvela I., Identification of a variant associated with adult-type hypolactasia//Nat.Genet., 2002a,30(2), 233-237

31. Enattah N.S., Sulkava R., Halonen P., Kontula K., and Jarvela I., Genetic variant of lactase-persistent C/T-13910 is associated with bone fractures in veiy old age//J.Am.Geriatr.Soc., 2005,53(1), 79-82

32. Escher J.C., de Koning N.D., van Engen C.G., Arora S., Buller H.A., Montgomeiy R.K., and Grand R.J., Molecular basis of lactase levels in adult humans//J.Clin.Invest, 1992,89(2), 480-483

33. Gregory D.Miller, JudithK.Jarvis, and Lois D.McBean., Handbook of daily foods and nutrition// CRC Press LLC, Rosemont, Illinois, 1999,2nd-448

34. Harvey C.B., Fox M.F., Jeggo P.A., Mantei N., Povey S., and Swallow D.M., Regional localization of the lactase-phlorizin hydrolase gene, LCT, to chromosome 2q21//Ann.Hum.Genet., 1993,57(Pt 3), 179-185

35. Harvey C.B., Wang Y., Hughes L.A., Swallow D.M., Thurrell W.P., Sams V.R., Barton R., Lanzon-Miller S., and Sarner M., Studies on the expression of intestinal lactase in different individuals//Gut, 1995,36(1), 28-33

36. Kerber M., Oberkanins C., Kriegshauser G., Kollerits В., senbach-Glaninger A., Fuchs D., and Ledochowski M., Hydrogen breath testing versus LCT genotyping for the diagnosis of lactose intolerance: A matter of age?//Clin.Chim.Acta, 2007a,383(1-2), 91-96

37. Kozlov A. 1995. The phenocline of primary hypolactasia in Finno-Ugrian populations. Papers on Anthropology VI. Univ. of Tartu, Centre of Physical Anthropology. Tartu,. 111-115.

38. Kristensen V.N., Kelefiotis D., Kristensen Т., and Borresen-Dale A.L., High-throughput methods for detection of genetic variation//Biotechniques, 2001,30(2), 318-22, 324, 326

39. Kruse T.A., Bolund L., Grzeschik K.H., Ropers H.H., Sjostrom H., Noren O., Mantei N., and Semenza G., The human lactase-phlorizin hydrolase gene is located on chromosome 2//FEBS Lett., 1988,240(1-2), 123-126

40. Kuokkanen M., Butzow R., Rasinpera H., Medrek K., Nilbert M., Malander S., Lubinski J., and Jarvela I., Lactase persistence and ovarian carcinoma risk in Finland, Poland and Sweden//Int.J.Cancer, 2005b, 117(1), 90-94

41. KuokkaneniVI., Enattah N.S., Oksanen A., Savilahti E., Orpana A., and Jarvela I., Transcriptional regulation of the lactase-phlorizin hydrolase gene by polymorphisms associated with adult-type hypolactasia//Gut, 2003c,52(5), 647-652

42. Kuokkanen M., Kokkonen J., Enattah N.S., Ylisaukko-Oja Т., Komu H., Varilo Т., Peltonen L., Savilahti E., and Jarvela I., Mutations in the

43. Translated Region of the Lactase Gene (LCT) Underlie Congenital Lactase Deficiency//Am.J.Hum.Genet., 2006,78(2), 339-344

44. Lember M., Torniainen S., Kull M., Kallikorm R., Saadla P., Rajasalu Т., Komu H., and Jarvela I., Lactase non-persistence and milk consumption in Estonia//World J.Gastroenterol., 2006b,12(45), 7329-7331

45. Lewinsky R.H., Jensen T.G., Moller J., Stensballe A., Olsen J., and Troelsen J.T., T-13910 DNA variant associated with lactase persistence interacts with Oct-1 and stimulates lactase promoter activity in vitro//Hum.Mol.Genet., 2005,14(24), 3945-3953

46. Liew M., Seipp M., Durtschi J., Margraf R.L., Dames S., Erali M., Voelkerding K., and Wittwer C., Closed-tube SNP genotyping without labeled probes/a comparison between unlabeled probe and amplicon melting//Am.J.Clin.Pathol., 2007,127(3), 341-348

47. Maiuri L., Rossi M., Raia V., Paparo F., Coletta S., Mazzeo F., Breglia A., and Auricchio S., Morphological method for the diagnosis of human adult type hypolactasia//Gut, 1994,35(8), 1042-1046

48. Mamotte C.D., Genotyping of single nucleotide substitutions//CIin.Biochem.Rev., 2006,27(1), 63-75

49. Montalto M., Curigliano V., Santoro L., Vastola M., Cammarota G., Manna R., Gasbarrini A., and Gasbarrini G., Management and treatment of lactose malabsorption//World J.Gastroenterol., 2006,12(2), 187-191

50. Newcomer A.D. andMcGill D.B., Distribution of disaccharidase activity in the small bowel of normal and lactase-deficient subjects//Gastroenterology, 1966,51(4), 481-488

51. Nilsson Т.К. and Johansson C.A., A novel method for diagnosis of adult hypolactasia by genotyping of the -13910 C/T polymorphism with Pyrosequencing technology//Scand.J.Gastroenterol., 2004,39(3), 287-290

52. Nose O., Iida Y., Kai Ii., Harada Т., Ogawa M„ and Yabuuchi H., Breath hydrogen test for detecting lactose malabsorption in infants and children. Prevalence of lactose malabsorption in Japanese children and adults7/Arch.Dis.Child, 1979,54(6), 436-440

53. Olds L.C. and Sibley E., Lactase persistence DNA variant enhances lactase promoter activity in vitro: functional role as a cis regulatory element/ZHum.Mol.Genet., 2003c, 12(18), 2333-2340

54. Piepoli A., Schirru E.,rMastrorilli A., Gentile A., Cotugno R., Quitadamo M., Merla A., Congia M., Usai S.P., and Perri F., Genotyping of the Lactase-Phlorizin Hydrolase C/T-13910 Polymorphism by Means of a New

55. Rapid Denaturing High-Performance Liquid Chromatography-Based Assay in Healthy Subjects and Colorectal Cancer Patients//J.Biomol.Screen., 2007a,

56. Rasinpera H., Kuokkanen M., Kolho K.L., Lindahl H., Enattah N.S., Savilahti E., Orpana A., and Jarvela I., Transcriptional downregulation of the lactase (LCT) gene during childhood//Gut, 2005c,54(11), 1660-1661

57. Rasinpera H., Saarinen K., Pelkonen A., Jarvela I., Savilahti E., and Kolho K.L., Molecularly defined adult-type hypolactasia in school-aged children with a previous history of cow's milk allergy/AVorld J.Gastroenterol., 2006a,12(14), 2264-2268

58. Rasinpera H., Savilahti E., Enattah N.S., Kuokkanen M., Totterman N., Lindahl H., Jarvela I., and Kolho K.L., A genetic test which can be used to diagnose adult-type hypolactasia in children//Gut, 2004,53(11), 1571-1576

59. Ridefelt P. and Hakansson L.D., Lactose intolerance: lactose tolerance test versus genotyping//Scand.J.Gastroenterol., 2005g,40(7), 822-826

60. Sacerdote C., Guarrera S., Smith G.D., Grioni S., Krogh V., Masala G., Mattiello A., Palli D., Panico S., Tumino R., Veglia F., Matullo G., and Vineis P., Lactase Persistence and Bitter Taste Response: Instrumental

61. Variables and Mendelian Randomization in Epidemiologic Studies of Dietary Factors and Cancer Risk//Am.J.Epidemiol., 2007,

62. Sahi Т., Launiala K., and Laitinen H., Hypolactasia in a fixed cohort of young Finnish adults. A follow-up study//Scand.J.Gastroenterol., 1983,18(7), 865-870

63. Sahi Т., The inheritance of selective adult-type lactose malabsorption//Scand.J.Gastroenterol.Suppl, 1974,30, 1-73

64. Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis Т., Molecular Cloning: A Laboratory manual// Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989,-479

65. Swallow D.M., Poulter M., and Hollox E.J., Intolerance to lactose and other dietary sugars//Drug Metab Dispos., 2001,29(4 Pt 2), 513-516

66. Syvanen A.C., Sajantila A., and Lukka M., Identification of individuals by analysis of biallelic DNA markers, using PCR and solid-phase minisequencing//Am.J.Hum.Genet., 1993,52(1), 46-59

67. The genetic polymorphism of intestinal lactase activity in adult humans// McGraw-Hill, New York, 1989, 2999-3006

68. Troelsen J.T., Olsen J., Moller J., and Sjostrom H., An upstream polymorphism associated with lactase persistence has increased enhancer activity//Gastroenterology, 2003b, 125(6), 1686-1694

69. Wang YG, Yan YS, Xu JJ, Du RF, Flatz SD, Kuhnau W, Flatz G.Prevalence of primary adult lactose malabsorption in three populations of northern China. Hum Genet. 1984;67(1): 103-6.

70. Witte J., Lloyd M., Lorenzsonn V., Korsmo H., and Olsen W., The biosynthetic basis of adult lactase deficiency//J.Clin.Invest, 1990,86(4), 1338-1342

71. Wittwer C.T., Reed G.H., Gundry C.N., Vandersteen J.G., and Pryor R.J., High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen//Clin.Chem., 2003,49(6 Pt 1), 853-860 "

72. Zheng, J., Z. Gong, L. Xue et al. 1988. Lactose malabsorption and its ethnic differences in Hans and Uygurs. Chin. Med. J. 101:284-286.

73. Zhou L., Myers A.N., Vandersteen J.G., Wang L., and Wittwer C.T., Closed-tube genotyping with unlabeled oligonucleotide probes and a saturating DNA dye//Clin.Chem., 2004,50(8), 1328-1335