Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм и специфичность запасных белков эндосперма у представителей рода пырейник (EL YMUS L. )

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм и специфичность запасных белков эндосперма у представителей рода пырейник (EL YMUS L. )"

РГБ ОД

? ОЕ8 В9В

На правах рукописи

АГАФОНОВ Александр Викторович

ПОЛИМОРФИЗМ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЗАПАСНЫХ БЕЛКОВ ЭНДОСПЕРМА У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА ПЫРЕЙНИК (Е/.УШ8 I.)

03.00.05 - Ботаника 03.00.15- Генетика

ДИССЕРТАЦИЯ

в виде научного доклада на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК 1996

Работа выполнена в Центральном Сибирском Ботаническом саду Сибирского Отделения РАН, Новосибирск.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

B. Т. Бакулин,

кандидат биологических наук

C. Е. Пельтек.

Ведущая организация: Сибирский Институт Физиологии и Биохими! растений СО РАН (г. Иркутск).

Защита состоится ¿Г иМ ^ 1996 г. в Ю_ часов на заседани диссертационного совета Д 002.90.01 по защите диссертаций на соис кание степени доктора наук при Центральном Сибирском Бота ническом саду СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, Золе тодолинская, 101.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомитьс в библиотеке Центрального Сибирского Ботанического сада СО РАН.

Диссертация в виде научного доклада разослана: аи&^Ьз, 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Э. А. Ершова

Актуальность проблемы. Род Пырейник (Elymus L.) является наиболее крупным в трибе Пшеницевые (Triticeae Dum.) семейства Злаковые (,Poaceae Barnh.) и включает в себя более 150 самоопыляющихся, относительно короткоживущих и исключительно полиплоидных видов многолетних трав с различной геномной конституцией [Цвелев, 1976; Löve, 1984; Dewey, 1984]. На территории бывшего СССР произрастает свыше 50 видов, большое количество подвидов и разновидностей [Черепанов, 1981] с широким диапазоном изменчивости. Многие виды представляют интерес как кормовые интродуценты [Макарова, 1974; Денисов, 1980] и как потенциальные доноры полезных признаков для улучшения хлебных культур [Lu, Bothmer 1990,1991; Dong et al., 1992].

Однако сведения о внутривидовых пределах изменчивости и общем потенциале рода во многом противоречивы. Трудно поддаются таксономической обработке многие природные образцы, не разработаны вопросы индивидуальной идентификации особей и генотипов, крайне мало сведений о наследственной природе признаков, как диагностических, так и хозяйственно-ценных. Все вышесказанное осложняет рациональное использование обширного генофонда рода Пырейник в интродукционных, селекционных и природоохранных программах.

Известно, что запасные белки эндосперма хлебных (однолетних) злаков трибы характеризуются значительным внутривидовым полиморфизмом и независимостью компонентного состава белков на элек-трофореграммах от условий произрастания [Elton, Ewart, 1962; Shewry, 1978; Созинов, 1985]. Доступность семенного материала и высокая воспроизводимость результатов электрофоретического анализа делают белки эндосперма удобными генетическими маркерами для идентификации сортов зерновых, установления их генеалогии и микроэволюционных преобразований. Однако для решения аналогичных задач у многолетних представителей трибы, как дикорастущих, так и интродуцированных, этот метод пока не получил широкого применения.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение полиморфизма и специфичности запасных белков эндосперма у некоторых видов Пырейника (Elymus) в сравнении с другими многолетними представителями трибы Пшеницевые (Triticeae).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Исходя из методик, применяемых в исследованиях зерновых культур, разработать электрофоретический метод идентификации генотипов многолетних трав трибы Triticeae, основанный на регистрации компонентов спектра запасных белков индивидуальной зерновки.

2. Провести сравнительное изучение белковых спектров у видов Е/уян/э и других представителей трибы с разными типами опыления и геномной конституцией.

3. Исследовать полиморфизм и видовую специфичность белков эндосперма у природных, селекционных и сортовых образцов БН-ге-номных видов Пырейника: П. сибирского (Е1ути5 з'/Ыпсиэ), П. шерохо-ватостебельного (£. иасЬусаи1из) и П. новоанглийского (£. поуае-ап-дНае). Два последних вида известны у селекционеров под общим тривиальным названием "пырей бескорневищный".

Научная новизна. Разработан и защищен авторским свидетельством СССР (№ 1546022 от 1990 г.) эффективный способ экстракции запасных белков из изолированного эндосперма мелких зерновок, положенный в основу элекгрофоретического метода идентификации генотипов многолетних злаков трибы Пшеницевые (ТгШсеае).

Показано, что для многолетних видов с перекрестным типом опыления характерна значительная изменчивость белковых спектров у зерновок, взятых с одного растения. У самоопыляющихся видов все зерновки с индивидуальных растений в норме имеют идентичные спектры.

Общее распределение белковых компонентов по относительной электрофоретической подвижности (ОЭП) и молекулярным массам (\/\/т) отражает геномную конституцию таксонов.

Впервые проведен электрофоретической анализ полиморфизма по запасным белкам проламин-глютелинового комплекса у природных и селекционных образцов нескольких видов Е/утиэ, а также показана возможность использования для этих целей зерновок из гербарных листов после многолетних сроков хранения.

Теоретическое и практическое значение работы. Разработанная и апробированная методика идентификации генотипов у многолетних Пшеницевых и результаты, полученные на модельных объектах трибы, могут быть использованы для решения следующих задач.

1. Регистрация идентичности и уровня гетерогенности коллекционных образцов в генбанках и семенотеках.

2. Изучение диапазона изменчивости, процессов гибридизации и интрогрессии в природных и интродукционных популяциях.

3. Выявление филогенетических связей в родовых комплексах и прогнозирование скрещиваемости у биотипов с различающимися эко-лого-географическими и морфологическими характеристиками.

4. Маркирование базисных геномов, отдельных хромосом и генетических систем, контролирующих конкретные признаки.

Защищаемые положения.

1. Электрофорез запасных белков из изолированного эндосперма является наиболее доступным, экономичным и в то же время высокоразрешающим способом идентификации генотипов у многолетних трав трибы Пшеницевые (Triticeae).

2. Электрофоретические спектры запасных белков отражают геномную конституцию и преимущественный тип опыления таксонов.

3. Высокий уровень изменчивости и независимость компонентного состава белков от условий произрастания свидетельствуют о множественном аллелизме генов, контролирующих проламин-глютелиновый комплекс зерновки у представителей рода Пырейник (Elymus).

Публикации и апробация работы. Автором опубликовано 34 работы, из них 18 — по теме диссертации. Результаты исследований были представлены на IV Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987), на V съезде ВОГиС им. Вавилова (Москва, 1987), на IV Всесоюзном совещании по хемоси-стематике и эволюционной биохимии высших растений (Москва, 1990), на 72 ежегодном совещании Тихоокеанского Отделения Американской Ассоциации по развитию науки (Логан, штат Юта, США, 1991), на VIII Международном симпозиуме по генетике пшеницы (Пекин, 1993), на 1 и 2 Международных симпозиумах по Пшеницевым (Хелсинборг, Швеция, 1991; Логан, Юта, США, 1994).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовались семена дикорастущих растений рода Пырейник, собранные в различных географических точках Евразии и Северной Америки, коллекционные и сортовые образцы из следующих источников:

1. Центральный Сибирский Ботанический сад СО РАН, Новосибирск (далее сокращено БС).

2. Западно-Сибирский Селекцентр СибНИИСХоза, Омск(ЗСС).

3. Forage and Range Research Laboratory, Logan, Университет штата Юта, США (LC).

4. Department of Plant Breeding Research, Svalov, Шведский Аграрный Университет, Швеция (SD).

Пырейник сибирский Elymus sibiricus L. (SSHH-геном, 2n=28): природные популяции Алтайская-I (окр. с. Топучее Шебалинского р-на), Алтайская-И (окр. с. Каярлык Онгудайского р-на), Тувинская (окр. г. Ту-ран, Тува). Для сравнительного анализа были взяты отдельные зерновки

12-ти образцов из географически разнесенных точек азиатской части СССР и 4-х гербарных листов, собранных сотрудниками ЦСБС в разных районах Тувинской АССР в 1972-1975 гг.

П. шероховатостебельный Е. trachycaulus (Link) Gould ex Shinners и П. новоанглийский Е. novae-anqliae (Scribn.) Tzvel. (SSHH-геном, 2n=28): 1. Заносные образцы: окр. г. Владивосток и Новосибирского Академгородка. В каждом из пунктов были собраны растения двух видов, различающихся по признаку "голая/волосистая ось колоска" (Цвелев, 1977), здесь и далее "фенотипы I и II". 2. Сортовой образец из ЗСС "Первомайский", семена фенотипов I и II. 4. Образцы из LC: D-3270, Юта (фенотип II); PI—232170, Колорадо (фенотип I); PI-372650, Аляска (фенотип II); D-1877, Краснодарский кр., СССР (фенотипы I и II).

Кроме вышеназванных видов Пырейника, электрофоретическое изучение запасных белков проводили у следующих представителей рода из авторских сборов (указана гаплоидная геномная формула):

SH-геномные виды: П. собачий Е. caninus (L.) L., П. преддерновин-ный Е. praecaespitosus (Nevski) Tzvel., П. волокнистый Е. fibrosus (Schrenk) Tzvel.

SY-геномные виды: П. Гмелина Е. gmelinii (Ledeb.) Tzvel., П. реснитчатый Е. ciliaris (Trin.) Tzvel., П. повислый Е. pendulinus (Nevski) Tzvel., Е. nei/s/c/V Tzvel., E. fedtschenkoi Tzvel.

SHY-геномные виды: П. даурский E. dahuricus Turcz. ex Griseb., П. поникший E. nutans Griseb.

SYP-геномный вид П. Баталина E. batalinii (Krasn.) Löve = Elytrigia batalinii (Krasn.) Nevski.

В сравнительные анализы были взяты образцы семян других пред-ставителй трибы Пшеницевые:

1. Авторские сборы Agropyron cristatum (L.) Beauv. (РР-геном), Elytrigia geniculate (Trin.) Nevski, E. repens (L.) Nevski (SSX-геном), Psathyrostachys juncea (Fish.) Nevski (N-геном), Hordeum jubatum L. (НН-геном);

2. Образцы из SD: Hordeum brevisubulatum (Trin.) Link (НН-геном), H. roshevitzii Bowden, H. bogdanii\N\\. (Н-геном).

Простые (базисные) геномы обозначали согласно классификации Дьюи [Dewey, 1984] с последующими уточнениями [Jensen, Chen, 1992], латинские названия растений приведены в соответствии с литературными данными на период публикации работ.

Процедура получения изолированного эндосперма [Агафонов, Агафонова, 1989] была единой для приготовления и разделения белковых

экстрактов в алюминий-лактатной [Bushuk, Zillman, 1978] или SDS-гелево-буферной системе [Leammly, 1970] соответственно с модификациями [Агафонов, Агафонова, 1990а; 19926]. Для разделения белков SDS-электрофорезом из каждой отдельной зерновки получали два типа экстракта; с восстанавливающим агентом 2-меркаптоэтанол (вариант +Ме) и без него (вариант -Me). Маркерами молекулярных масс служили стандартные наборы белков. Семена линии ALT-8401 Е. sibiricus использовали в каждом опыте в качестве внутреннего стандарта (St).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Повышение разрешающей способности электрофоретического метода для таксономических и генетико-селекционных исследований многолетних злаков трибы Пшеницевые

Существенной причиной, затрудняющей электрофорез запасных белков многолетних трав, является малая масса зерновок. Стандартная процедура приготовления белкового экстракта из муки отдельных зерновок оказалась малопригодной, т. к. с уменьшением общей массы растет относительная доля органических соединений оболочки, влияющих на экстрактивные и электрофоретические свойства белков.

Разработанная методика экстракции заключалась в следующем: зерновки размачивали в воде в течение суток, удаляли препаровальной иглой зародыш и выдавливали полужидкий эндосперм массой от 0,1 мг и выше. Соответственно, было уменьшено количество экстрагирующего раствора, что позволило повысить концентрацию белков в экстракте.

В лаборатории университета штата Юта, г. Логан, США (Forage and Range Research Laboratory) нами изучалось влияние разных способов экстрагирования на качество электрофореграмм. Объектом служили семена трех видов Пырейника — П. сибирского (Е. sibiricus), П. шеро-ховатостебельного (£. trahycaulus) и П. даурского (Е. dahuricus). Проверялись три типа белковых экстрактов SDS-буфером после 12 часов экстрагирования при 4° С:

1. Гомогенизация сухих зерновок с мелким стеклянным порошком.

2. Гомогенизация зерновок после замораживания жидким азотом.

3. Получение изолированного эндосперма из размоченных зерновок. Электрофореграммы 1-го и 2-го типа экстрактов у всех трех видов прочитывались с искажениями, в то время как 3-му типу соответствовало

вполне удовлетворительное разделение белковых компонентов, позволяющее идентифицировать индивидуальные биотипы [Bennett et al., 1991; 1994]. Аналогичный результат был получен при экстракции проламинов разными экстрагирующими агентами у других многолетних представителей трибы: Житняка гребенчатого (A. cristatum), Пырея коленчатого (Е. geniculate), Ломкоколосника ситникового (Р. juncea) [Агафонова, Агафонов,1991]. Первоначальные электрофоретиче-ские свойства запасных белков сохраняются в зерновках в течение 10-20 лет в зависимости от условий хранения. Более длительные сроки хранения, как показали наши опыты с зерновками из гербарных листов некоторых видов Пырейника, приводят к размыванию полос на геле. В большей степени подвержены деструкции белки, соответствующие быстромигрирующим компонентам.

Специфичность электрофоретических спектров запасных белков у представителей трибы Пшеницевые с разными типами опыления

Индивидуальный электрофоретический анализа семян природных образцов Пырейника показал, что зерновки с одного растения практически полностью идентичны по белковым спектрам, независимо от того, произрастали растения одиночно или в составе плотной микропопуляции семейного типа. Так, при анализе двух зерновок с каждого растения у дальневосточных образцов П. реснитчатого Е. ciliaris (35 растений) и П. повислого Е. pendulinus (23 растения) обнаружилась полная идентичность спектров внутри пар при значительных различиях между особями одного вида [Агафонов, Агафонова, 19906]. Такая же картина наблюдалась у горно-алтайских образцов Е. pendulinus и Е. gmelinii [Агафонова, Агафонов, 1991], а также у многих видов из Тянь-Шаня (Е. nevskii, Е. nutans, Е. fedtschenkoi, Е. tschimganicus, Е. praecaespitosus). Высокий уровень гомозиготности дикорастущих особей, очевидно, объясняется преимущественным самоопылением, как основной формой размножения Пырейника.

Были отмечены отдельные случаи неполного совпадения белковых спектров (различия по 2-А компонентам) у сестринских зерновок П. сибирского из Горного Алтая, П. шероховатостебельного из Новосибирского Академгородка и высокогорного вида П. сизейшего (Е. glaucissimus) из Тянь-Шаня, что свидетельствует о возможности переопыления, обеспечивающего некоторый уровень гетерозиготности в природных популяциях Пырейника. Напротив, все изученные образцы

92.5 84.0

58.0 46.0-

36.5

30.0-

I-Ii__JI_Ii_ii_i

kD 1 2 3 4 5

Рис. 1. Электрофоретические спектры белков сестринских зерновок эндосперма у многолетних представителей трибы Triticeae. Вариант +Ме. Перекрестноопыляющиеся виды f 1 —4): 1. Agropyron cristatum. 2. Elytrigia repens. 3. Elytrigia geniculata. 4. Psathy-rostahys juncea. 5. Самоопыляющийся вид Hordeum jubatum

перекрестноопыляющихся видов Agropyron Gaertn., Elytrigia Desv., Psathyrostachys Nevski характеризуются значительной изменчивостью компонентного состава белков, даже если зерновки отобраны с одного колоса [Агафонова, Агафонов, 1991; Agafonova, Agafonov, 1991] (Рис. 1).

Геномная формула центральноазиатского вида Пырей Баталина (Elytrigia bataiinii = Elymus batalinii) образована S-, Y- и Р-геномами [Jensen, 1990]. Геномы S и P имеют происхождение от перекрестноопыляющихся видов рода Pseudoroegneria (в отечественных источниках Elytrigia) и Agropyron, и только геном Y характерен для самоопыляющегося рода Elymus. Основным свидетельством самоопыления, как основного типа размножения, являются мелкие пыльники данного вида.

С 4 растений Е. batalinii, произрастающих на близком расстоянии (луговой склон ущелья в Центральном Тянь-Шане), было взято для анализа

по 5-8 зерновок. Все сестринские зерновки были идентичны при значительных различиях между растениями [Агафонов, Агафонова, 1990в]. Этот факт, на наш взгляд, является важным аргументом в пользу выделения этого вида из перекрестноопыляющегося рода Elytrigia. В настоящее время SYP-геномные виды, к которым относятся Е. batalinii и Е. alatavicus, ранее включенные в род Elymus, предлагается относить к самоопыляющимуся роду Kengyilia Yen ex Yang [Yang et al„ 1992].

Было проанализировано по 3-5 зерновок с одного колоса из каждого образца трех видов Hordeum из SD. Для самоопыляющихся видов Н. roshevitzii (6 обр. из Китая) и Н. bogdanii (7 обр. из Китая, Пакистана и Ирана) различия внутри выборок сестринских семян отмечены только у 3 образцов (1-2 белковых компонента), в то время как для перекрестноопыляющегося Н. brevisubulatum (10 обр. из разных точек Центральной Азии) характерна значительная изменчивость белковых спектров внутри каждой выборки и, следовательно, высокий уровень гетерозиготности по соответствующим аллельным локусам [Agafonova, Agafonov, 1991].

Специфичность электрофоретических спектров запасных белков у представителей трибы Пшеницевые с разной геномной конституцией

Сравнительное изучение проламиновой фракции запасных белков в алюминий-лактатной электрофоретической системе показало, что наличие того или иного генома накладывает отпечаток на распределение компонентов проламина на спектре. Как известно, проламины пшеницы (глиадины), разделенные в кислом геле, объединяют в зоны a-, ß-, у- и со-глиадинов. Ранее высказывалось мнение, что для прола-минов всех представителей трибы Пшеницевые характерно сходное распределение компонентов, и для их регистрации может быть применена единая номенклатура, разработанная автором для хлебных культур [Конарев, 1983]. Результаты наших исследований не подтверждают этот тезис. Каждому таксону трибы (Agropyron cristatum, Elytrigia sp., Psathyrostachys juncea, Hordeum sp., виды Elymus с разным геномным составом) как в алюминий-лактатной, так и в SDS-системе, свойственно специфическое распределение белковых компонентов на электрофореграммах, обусловленное их свойствами на молекулярном уровне. При этом зоны группирования белков у многолетних представителей трибы совершенно не совпадают с зонами глиадинов пшеницы

[Агафонова, Агафонов, 1991]. По нашему мнению, множественный ал-лелизм молекулярных форм проламиновых белков не позволяет вести регистрацию отдельных компонентов спектра иначе, чем через величину относительной электрофоретической подвижности (ОЭП) в сравнении с высоковоспроизводимым спектром-стандартом.

Внутривидовая изменчивость проламинов Пырейника сибирского (Е. sibiricus L.), выявляемая методом электрофореза в алюминий-лактатной гелево-буферной системе

Отдельные компоненты спектра обозначались символом ELY (от латинского названия рода) с указанием величины относительной электрофоретической подвижности (ОЭП), установленной в сравнении со спектром линии ALT-8401. Наиболее подвижный компонент этой линии обозначен ELY-100. Соответствующим образом обозначены остальные белки. В порядке уменьшения электрофоретической подвижности компоненты объединили в условные зоны а-, р- и у-про-ламинов с границами в точках 46 и 81 единиц ОЭП. Подобная номенклатура, впервые предложенная для глиадинов пшениц [Woychik et al., 1961], не потеряла своего значения и до настоящего времени ввиду удобства при анализе проламиновых спектров.

Было изучено 3 природных популяции — по одной зерновке с растения [Агафонов, Агафонова, 1990а]. Индивидуальным анализом семян Алтайской-1 (57 зерновок) выявлены различия по двум альтернативным компонентам ELY-24 и ELY-25 (соответственно 12 и 37 зерн.) или их отсутствию (8 зерн.). В выборке семян из популяций Ал-тайской-И (96 зерн.) обнаружена значительная изменчивость во всех белковых зонах. Выявлены определенные сочетания проламиновых компонентов (фенотипы) в пределах каждой из зон. Ряд компонентов (ELY-23 и ELY-29 в зоне а и четыре в зоне р) были отмечены во всех зерновках. В выборке семян из Тувинской популяции (32 зерн.) изменчивость отсутствовала. Высокая однородность выборок из Тувинской и Алтайской-1 может объясняться происхождением этих популяций от единичных растений в условиях преимущественного самоопыления. Были проанализированы отдельные зерновки из гербарных листов, собранных в разных районах Тувы. С каждого листа отбиралось по 4 зерновки. Спектры проламинов у зерновок с одного листа были полностью идентичны, что подтверждает преобладание в естественных условиях самоопыленных растений. Однако отличия между разными образцами оказались весьма значительными. Общая совокупность

компонентов свидетельствует о множественном аллелизме проламин-кодирующих генов даже в пределах небольшой части ареала Пырейника сибирского.

Для оценки диапазона внутривидовой изменчивости П. сибирского по составу проламинов был проведен сравнительный анализ зерновок от растений из 12 географических точек азиатской части СССР. Из них два образца (алтайский-ll и восточно-казахстанский) были размножены на экспозициях ЦСБС и всесторонне изучались в качестве кормовых интродуцентов [Агафонов, 1983; 1991].

Общая совокупность проламиновых белков П. сибирского представляет собой почти непрерывный диапазон изменчивости по элек-трофоретической подвижности, но при этом сохраняется видовая особенность группирования компонентов в соответствии с зонами а, р и у. В то же время каждая конкретная популяция обладает, по-видимому, только ей свойственным набором проламинов, что позволяет проводить индивидуальную идентификацию генотипов. Сделан вывод, что широкий внутривидовой полиморфизм отражает относительно малое давление естественного отбора на молекулярные формы проламиновых белков, вновь образующиеся мутационным и рекомбинационным путем.

Изменчивость проламинов комплекса Е. trachycaulus — Е. novae-angliae с различным происхождением

В отдельных зерновках изученных образцов комплекса П. шерохо-ватостебельный — П. новоанглийский (далее — П. шероховатосте-бельный) выявляется от 14 до 18 компонентов проламина [Агафонов, Агафонова, 19906]. Последние, как и у П. сибирского, обозначались символом ELY с указанием величины относительной элекгрофорети-ческой подвижности (ОЭП), установленной в сравнении со спектром-стандартом АПТ-84-01. Условные зоны а, [3 и у с границами в точках 46 и 81 ед. ОЭП, на которые были подразделены компоненты П. сибирского могут быть выделены и у П. шероховатостебельного, но зону (3, видимо, целесообразно подразделить на подзоны р, и Рп. Зерновки с одного растения были полностью идентичны по спектрам проламина (за исключением образца ACD-8606, характеризующегося изменчивостью по 2 компонентам) независимо от того, произрастали растения одиночно или в составе группы растений, часто образующих микропопуляцию семейного типа.

Если рассматривать вышеназванные фенотипы I и II (соответствующие двум таксонам видового ранга) как самостоятельные виды,

+ н

ELY

• Ш »- « ы .

23.0

25 5

29.0

*«mt 1mi 32 5

*т* 1мяв

47.0

57 0

мМ' I« «» »

**** ***

^ fit «

64 0 68 0

76 0 82.0 87 0

95 0 1000

Pn

j59

Pi

f"

a

1,0,

1 2345678 St 1 2 345678

Рис. 2. Электрофоретические спектры проламинов Е. касНусаи/иэ. Зерновки индивидуальных растений с фенотипом I (2-4) и фенотипом II (1, 5-8). 1,2 — окр. г. Владивосток. 3 — сорт "Первомайский". 4-8 — окр. г. Новосибирск

то можно было бы ожидать значительного несовпадения в компонентном составе проламина вследствие эволюционной дивергенции. В действительности наблюдалось перекрывание спектров (Рис. 2). Так, для двух образцов с разными фенотипами зерновок из Владивостока характерно не менее 8 компонентов, идентичных по ОЭП. Сходство спектров было обнаружено у разных фенотипов из отдаленных мест произрастания и из сортового образца, особенно по у-зоне (биотипы 1 и 3, 2 и 5) и по р-зоне (1 и 4, 3 и 8).

При изучении выборки из сорта "Первомайский" одной из задач было проследить распределение компонентов проламина у различных фенотипов зерновок. Было проанализировано по 22 зерновки фенотипов I, II и промежуточного, названного фенотипом III. Всего во всех выборках было зарегистрировано 35 компонентов, различающихся по ОЭП. Из них в выборке фенотипа I в разных сочетаниях присутствовало 33 компонента, у фенотипа II — 28 и у фенотипа III — 31.

Общий состав проламиновых белков у сортовых семян во многом совпадает с таковым у заносных сибирских и дальневосточных образцов. На наш взгляд, это может свидетельствовать о едином первоначальном

происхождении сибирского генофонда П. шероховатостебельного ("эффект основателя"). Вероятнее всего, таким основателем явились кормовые сорта или селекционные формы "пырея бескорневищного", интродуцированные из Северной Америки.

Исходя из сходства компонентного состава проламина у различных образцов двух вышеназванных таксономических видов представилось целесообразным провести генетический анализ отличительного признака. У гибридных растений F-i (£. trachycaulus х Е. novae-angliae, VLA-8602 х ACD-8606) проявляется морфологический признак, соответствующий промежуточному фенотипу III. Расщепление в F2 показало, что диагностический признак "длинные волоски на оси колоска" контролируется одним локусом с неполным доминированием [Агафонов, Агафонова, 1992а].

В отдельном опыте анализировалось по три зерновки из образцов из LC. Для сравнения в опыт были взяты 2 зерновки новосибирского ACD-8606. Аборигенные американские коллекционные образцы различались между собой в гораздо большей степени, чем сибирские природные и сортовые. В то же время, образец D-1877, собранный ранее в СССР, по 7-8 компонентам совпадал с новосибирским. Первая и третья зерновки из D-1877 по белковому спектру не отличались, хотя имели ярко выраженные фенотипы I и II. Зерновки внутри образцов различались 1-2 компонентами, но общих проламинов у американских образцов не обнаружено.

Суммарный состав проламиновых белков у сибирских биотипов значительно менее разнообразен по сравнению с таковым у образцов из LC, что согласуется с данными о заносном происхождении П. шероховатостебельного на Евразиатском континенте.

SDS-электрофорез белков эндосперма у представителей

рода Пырейник (Elymus) с различной геномной конституцией

Считается, что основную массу белков эндосперма у злаков трибы Пшеницевые, в том числе у многолетних, составляют проламины и глюте-лины. Функционально активные белки (ферменты, ингибиторы и т. д.) относятся, как правило, к легкорастворимым фракциям альбуминов и представлены в зерновках в относительно меньших количествах [Созинов, 1985].

Была предпринята попытка изучить специфичность белков эндосперма у некоторых видов Пырейника с использованием SDS-электрофореза [Агафонов, Агафонова, 19926; Agafonova, Agafonov, 1993]. В данной электрофоретической системе разделение проходит главным

образом в соответствии с молекулярными массами белковых молекул [Leammly, 1970].

Электрофорез белковых экстрактов проводился в двух вариантах. В отсутствие 2-меркаптоэтанола, разрушающего четвертичную структуру глютелинов (вариант -Me), последние остаются в стартовых карманах и на гелях проявляются преимущественно проламины. Обработка части экстракта меркаптоэтанолом (вариант +Ме) приводит к появлению на гелях субъединиц глютелина, а также влияет на электро-форетическую подвижность некоторых проламиновых компонентов.

У всех изученных представителей рода Пырейник молекулярные массы белков эндосперма Wm распределены преимущественно в диапазоне от 25 до 85 kD (= кд). Сопоставление белковых спектров SH-геномных видов пырейника показало, что практически все проламино-вые компоненты 40-55 кд являются инвариантными, т. е. сохраняют неизменной ОЭП после обработки меркаптоэтанолом. При этом в указанной зоне появляется ряд новых компонентов, представляющих собой, вероятнее всего, субъединицы глютелина. Белки 28-40 кд в варианте +Ме меняют свою ОЭП, что может свидетельствовать о наличии в молекулах остатков цистеина, образующих внутренние S-S-связи (цистин).

В целом для SH-геномных видов характерно сходство в структуре белковых спектров, особенно в варианте +Ме. Двумерный электрофорез проламинов П. сибирского (линия ALT-8401) показал, что белки зоны 28-40 кд, выявляемые в варианте -Me, соответствуют а- и р-зонам проламина, а компоненты выше 40 кд — у-зоне. Исключение составляет белок ELY-47, имеющий наивысшую молекулярную массу и обнаруженный у многих образцов П. сибирского. Этот полипептид после обработки 2-меркаптоэтанолом (+Ме) изменяет свою ОЭП в сторону уменьшения, что соответствует молекулярной массе около 84 кд. Возможно, это объясняется тем, что естественная упаковка молекул, обеспеченная внутренними связями, является более компактной, чем после денатурации в присутствии восстанавливающего агента. Аналогичным образом ведут себя высокомолекулярные компоненты проламина у других образцов Пырейника сибирского (отмечены звездочками).

В сравнении с зерновками П. сибирского анализировались 8 природных образцов П. даурского (Е. dahuricus, SHY-геном) из Алтая, Тянь-Шаня и Приморья, 8 обр. П. поникшего (Е. nutans, SHY-геном) из Центральной Азии и Китая и 7 обр. П. реснитчатого (Е. ciliaris, SY-геном). Из 35 образцов П. реснитчатого в анализ были взяты только различающиеся между собой по составу белков — 6 из Приморского края и 1 полученный из КНДР (Рис. 3, корейский биотип не показан).

84' 584636.530-

1 2, 3,4 7567,12345678,12 3456,

. --«' к»*»*».,

> • ¡шиф т**>»

" " * " ^ ® L* «инкS3 ^

« ' ** * — «.fe^^n

I_IL_

ко Б! А В С

Рис. 3. Электрофоретические спектры белков эндосперма у видов Пырейника с разной геномной конституцией. Вариант +Ме. А — Е. в/Ыпсиз (геном ЭЭНН): 1. А1Т-8401, Горный Алтай, с. Топучее. 2. КАг~7Э31, Восточный Казахстан, с. Катон-Карагай. 3. TI.IV-8401, Тува, г. Туран. 4. ВКА-8603, г. Братск. 5. МС-8523, Якутия, п. Сангар. 6. В1.А-8807, г. Благовещенск. 7. КЕО-8402, Прим. край, Заповедник "Кедровая Падь". В — Е. ЬаЬипсиэ (геном БЗННУУ): 1. вАС-8914, Горный Алтай, п. Усть-Сема. 2. В1Ю-8704, Зап. Тянь-Шань, Киргизия, п. Кировское. 3. ВАР^-8825, Центр. Тянь-Шань, Киргизия, п. Барскаун. 4. СН1-8533, Читинская обл., г. Краснокаменск. 5. гЕ.Ы!917, Амурская обл., г. Зея. 6. АНЕ>-8706, Прим. край, г. Арсеньев. 7. АМ1-8616, Прим. край, п. Анисимовка. 8. БНА-8409, г. Владивосток. С — Е. сШаив (геном БЭУУ), Приморский край: 1. МЕ£>-8745, п. Ан-дреевка. 2. 51_А-8637, п. Славянка. 3. \ZLA-8631, ст. Океанская. 4. У1_А-8635, Дальневосточный Ботанический сад. 5. \/1_А—8630, ст. 2-я Речка. 6. АЫ1—8616, п. Анисимовка

В варианте -Me белки П. даурского делятся на 3 отчетливые зоны — 28—40 кд (наиболее выражены и изменчивы), зона 40-50 кд, относительно обедненная компонентами, и группа наиболее консервативных белков около 60 кд, возможно, не являющихся собственно запасными.

В варианте +Ме в зоне от 50 до 84 кд появляется ряд новых компонентов, часть которых представляют собой субъединицы глютелина, а некоторые, видимо, следует отнести к проламинам, изменившим ОЭП после разрушения внутренних дисульфидных связей. При этом инвариантный проламиновый компонент 50 кд, обнаруженный у алтайских и тяньшан-ских образцов, точно совпадает по ОЭП с субъединицей глютелина у двух дальневосточных (указаны стрелками). Это явление можно расценивать как свидетельство единого происхождения некоторых проламиновых и глютелиновых полипептидов [Payne, Corfield, 1979; Jackson et al., 1983].

Общее распределение белков П. реснитчатого по молекулярным массам в варианте -Me близко к таковому у П. даурского, но в зоне, соответствующей молекулярной массе около 40 кд, присутствует специфическая группа компонентов. Для варианта +Ме также характерно изменение ОЭП большинства проламиновых компонентов и появление субъединиц глютелина. Белковые группы 40 кд и 40-50 кд сливаются в одну зону с большим количеством белков и высокой степенью изменчивости. Пара высокомолекулярных глютелиновых субъединиц (около 70 кд) присутствует у всех приморских образцов, но не обнауружена у северо-корейского. Наиболее консервативный полипептид с массой 58 кд также отнесен нами к субъединицам глютелина.

Пырейник поникший (Е. nutans) габитуально весьма близок к П. сибирскому, особенно по морфологии колоса, но имеет геномную конституцию SSHHYY, цитогенетически тождественную П. даурскому [Lu, 1993]. Белковые спектры зерновок П. поникшего из разных географических точек совпадают по некоторым компонентам и имеют выраженную видоспеци-фичную структуру. Их главное визуальное отличие от спектров двух вышеназванных видов состоит в большем числе компонентов во всех зонах и в отсутствии выраженных границ между зонами [Agafonova et at., 1994].

Наибольшее сходство отдельных особей в распределении белков на электрофоретических спектрах характерно для видов или видовых комплексов, представляющих собой единый Рекомбинационный Ген-пул [Agafonov, Agafonova, 1993; 1994]. К таковым относятся Е. sibiricus, комплекс Е. trachycauluslE. novae-angliae, а также группа таксономических видов с противоречивыми диагнозами у разных авторов Е. dahu-ricus, Е. excelsus, Е. tangutorum, Е. franchetii, Е. woroschilowii.

ВЫВОДЫ

1. Способ экстракции запасных белков из изолированного эндосперма повышает разрешающую способность электрофоретического метода идентификации генотипов у многолетних злаков трибы Пшеницевые (Triticeae).

2. Сухие зерновки сохраняют электрофоретические свойства запасных белков в первоначальном виде 10-20 лет, и только более длительные сроки хранения (от 20 до 100 лет) приводят к размыванию полос на геле. В большей степени подвержены деструкции белки, соответствующие быстромигрирующим компонентам.

3. Для перекрестноопыляющихся таксонов трибы (представители родов Agropyron, Elytrigia, Psathyrostachys, вид Hordeum brevisubu-latum) характерна высокая изменчивость белковых спектров у зерновок,

взятых с одного растения. У видов с преимущественным самоопылением (все представители рода Elymus, виды Hordeum jubatum, Н. bogdanii, Н. roshevitzii) сестринские зерновки в норме имеют идентичный состав белковых компонентов.

4. Полное совпадение спектров запасных белков у сестринских зерновок всех изученных образцов Elytrigia batalinii (Krasn.) Nevski (= Elymus batalinii (Krasn.) Love) подтверждает гипотезу о самофертильности этого вида и правомерность его выделения из рода Elytrigia.

5. Каждая популяция П. сибирского (Е. sibiricus) обладает специфическим компонентным составом проламинов с разной степенью внут-рипопуляционной изменчивости. Общая совокупность электрофорети-ческих компонентов свидетельствует о множественном аллелизме проламинкодирующих генов.

6. Сходство компонентного состава проламинов у П. шерохова-тостебельного (Е. trachycaulus) и П. новоанглийского (Е. novae-angliae) и моногенное наследование отличительного диагностического признака дают основание считать их одним видом с приоритетным названием Elymus trachycaulus (Link.) Gould ex Shinners.

7. Состав проламинов сибирских образцов П. шероховатостебель-ного менее разнообразен по сравнению с таковым у аборигенных образцов из Северной Америки (LC), что согласуется с данными о заносном происхождении этого вида на Евразиатском континенте.

8. С помощью SDS-электрофореза выявляются отличия в распределении запасных белков по молекулярным массам Wm у видов Пырейника с различной геномной конституцией.

9. Близкий к П. сибирскому по морфологии колоса П. поникший (Е. nutans), имеющий геномную конституцию SSHHYY (2п=42), характеризуется спектром запасных белков, отличающимся по электрофо-ретическим характеристикам от спектров SH-геномных видов и П. даурского (Е. dahuricus), также имеющего геном SSHHYY.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Агафонов А. В. Метод оценки фенотипического выражения признака остистости у волоснеца сибирского (Elymus sibiricus L.). // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. — 1983. — №6, —С. 34-36.

2. Агафонова О. В., Агафонов А. В. Возможность белкового маркирования дикорастущих кормовых злаков с использованием электрофоретических спектров ферментов и проламинов. // Тезисы докладов V съезда ВОГиС им. Вавилова (Москва, 1987). — Москва, —1987.—Т. IV, Ч. 3, —С. 11-12.

3. Агафонов А. В., Агафонова О. В. Способ идентификации генотипов многолетних злаков трибы Пшеницевые (Triticeae). // А. с. СССР № 1546022. — 1989. — 4 с.

4. Агафонов А. В., Агафонова О. В. Внутривидовая изменчивость проламинов пырейника сибирского, выявляемая методом одномерного электрофореза II Генетика. — 1990а. — Т. 26, № 2. — С. 304-311.

5. Агафонов А. В., Агафонова О. В. Электрофоретические спектры проламина у образцов пырея бескорневищного различного происхождения. // Генетика. — 19906. — Т. 26, №11, —С. 1992-2001.

6. Агафонов А. В., Агафонова О. В. Проламины многолетних злаков трибы Triticeae Dummort. как генетические маркеры внутривидовой изменчивости и микроэволюционных процессов в природе и при интродукции. II Тезисы докладов IV Всесоюзного совещания по хемосистематике и эволюционной биохимии высших растений (Москва, 1990 г.). — Москва. — 1990в. — С. 6-8.

7. Агафонова О. В., Агафонов А. В. Повышение разрешающей способности электро-форетического метода для таксономических и генетико-селекционных исследований многолетних злаков трибы Пшеницевые (Triticeae). —1991.—Деп. ВИНИТИ № 2467-В91.

8. Агафонов А. В. Дифференциальная С-окраска хромосом пырейника (волоснеца) сибирского (Elymus sibiricus L.). // Цитология и генетика. — 1991. — Т. 25, № 2,— С. 24-28.

9. Bennett J. Н., Sajid М., Agafonov А. V., Agafonova О. V. Electrophoretic characterization of genotypes in the U. S. Living Collection of Perennial Triticeae grasses: Effects of preparation and extraction procedures on seed prolamine spectras. // Abstracts of 72nd Annual Meeting of the Pacific Division of American Association for the Advancement of Science (Logan, Utah, 1991). — Utah State University, USA. —1991. — V. 10, Part 1,— P. 29.

10. Agafonov A., Agafonova O. About the necessity of establishment of the prioretic criterions of Triticeae species. // Abstracts of 1st International Triticeae symposium (Helsinborg, Sweden, 1991). Copenhagen, Denmark. — 1991. — Abstr. L1.4.

11. Agafonova O., Agafonov A. Prolamine-giuteline complex of endosperm storage protein as an indication of microevolutional processes in Triticeae grasses // Programme of 1st International Triticeae symposium (Helsinborg, Sweden, 1991). Copenhagen, Denmark. —1991. — Abstr. P2.16.

12. Агафонов А. В., Агафонова О. В. Моногенное наследование некоторых морфологических признаков у пырейника шероховатостебельного (Elymus trachycaulus), имеющих диагностическое значение в систематике // Сибирский биологический журнал. — 1992а. — Вып. 3. — С. 3-6.

13. Агафонов А. В., Агафонова О. В. SDS-электрофорез белков эндосперма у представителей рода пырейник (Elymus L.) с различной геномной структурой // Сибирский биологический журнал. — 19926. — Вып. 3. — С. 7-12.

14. Agafonov А. V., Agafonova О. V. The strategy of Reproductive Gene Pools (RGP) and Introgressive Gene Pools (IGP) in the biosystematic treatment of Elymus species. // Abstracts of VIII International Wheat Genetics symposium (Beijing, China, 1993). — 1993,—Abstr. 103.— P. 47.

15. Agafonova О. V., Agafonov A. V. SDS-Electrophoresis of endosperm protein in Elymus species with different genomic constitution. II Abstracts of VIII International Wheat Genetics symposium (Beijing, China, 1993). — 1993.— Abstr. 42. — P. 20.

16. Agafonova О. V., Agafonov A. V., Kostina E. V. Are there three levels of endosperm protein electrophoretic specificity in Elymus species? // Abstracts of 2nd International Triticeae symposium (Logan, Utah, USA, 1994). — 1994. — Abstr. A30. — P. 40.

17. Agafonov A. V., Agafonova О. V. The Principle of Recombination Gene Pools (RGP) and Introgression Gene Pool (IGP) in the biosystematic treatment of Elymus species. // Abstracts of 2nd International Triticeae symposium (Logan, Utah, USA, 1994). —1994. — Abstr. A31. — P. 41.

18. Bennett J. H., Agafonov A. V., Agafonova О. V., Jensen К. B. Chemotaxonomy of Triticeae grasses: Characterization of true breeding lines and hybrid crosses. // Abstracts of 2nd International Triticeae symposium (Logan, Utah, USA, 1994). — 1994. — Abstr. A57. — P. 27.