Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Видовая специфичность и таксономические взаимоотношения видов StY-геномной группы рода Elymus L. Азиатской России

ВАК РФ 03.02.01, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Видовая специфичность и таксономические взаимоотношения видов StY-геномной группы рода Elymus L. Азиатской России"

На правах рукописи

КОБОЗЕВА Елена Валерьевна

ВИДОВАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И ТАКСОНОМИЧЕСКИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ВИДОВ 81У-ГЕНОМНОЙ ГРУППЫ РОДА ЕЬУМт Ь. АЗИАТСКОЙ РОССИИ

03.02.01 - «Ботаника» 03.02.07 - «Генетика»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2014

1 5 КАП 2214

005548019

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Центральном сибирском ботаническом саду Сибирского отделения Российской академии наук.

Научные руководители: доктор биологических наук, с.н.с.

Ведущая организация — ФГБОУ ВПО "Национальный исследовательский Томский государственный университет".

Защита состоится 6 июня 2014 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.058.01 при ФГБУН Центральном сибирском ботаническом саде СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, ул. Золотодолинская, 101. Факс: (383) 330-19-86. E-mail: botgard@ngs.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУН Центральной сибирского ботанического сада СО РАН. Сайт в Интернете: http://www.csbg.nsc.ru.

Автореферат разослан 15 апреля 2014 г.

Агафонов Александр Викторович; доктор биологических наук, с.н.с. Овчинникова Светлана Васильевна.

Официальные оппоненты: Гончаров Николай Петрович

доктор биологических наук, чл.-кор. РАСХН, ФГБУН Институт цитологии и генетики СО РАН, зав. сектором;

Байков Константин Станиславович

доктор биологических наук, с.н.с.

ФГБУН Институт почвоведения и агрохимии СО РАН,

директор.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Ершова Эльвира Александровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Дикорастущие виды трибы ТгШсеае Бит. (Роасеае ВагпЬ.) являются близкими сородичами основных хлебных культур злаков (сортов мягкой и твердой пшеницы, ячменя посевного, ржи посевной) и поэтому привлекают внимание исследователей как богатый резерв для их дальнейшей селекции. Самым крупным в трибе, широко распространенным и обширным по биоразнообразию является род многолетних трав — Е1утиз Ь. Прямые скрещивания хлебных злаков с участием видов Е1утиз к настоящему времени не принесли сколько-нибудь значимых результатов (Ьи й а1., 1990, 1991), поэтому в области селекции на первый план выходят методы генной инженерии. В рамках фундаментальных исследований рода наиболее острыми следует рассматривать вопросы филогении, видообразования и микроэволюции. Именно поэтому задачи таксономии, как инструмента изучения природного разнообразия, остаются чрезвычайно актуальными, так как неадекватная классификация генотипов и неверное определение видовой принадлежности и присвоение таксономического ранга могут привести к ошибочным выводам на любом этапе познания. В связи с такой постановкой проблемы важно отметить необходимость проведения комплексных исследований на основе как традиционных методов систематики растений, так и современных методов экспериментальной биологии и молекулярной генетики.

По результатам цитогенетических исследований видов трибы ТгШсеае известно, что род Е1утиБ б. 1. образован видами с различной геномной конституцией. В Азиатской России распространены виды только трех гапломных комбинаций: БН, ЭУ, вНУ. В отличие от 8Н- и БНУ-геномных видов, БУ-геномная группа видов до сих пор специально не изучалась.

При последней ревизии рода Е1утиз во флоре России была построена общепринятая система, в которой 81У-геномные виды входят в состав двух секций Оои1агсИа (НиБп.) Тгуе1еу и СИпе1утор$1з (Кеузк1) Тгуе1еу, наряду с видами другой геномной конституции. В Азиатской части России распространены только виды из секции йои-1аг<Иа. При этом видовой ранг некоторых близкородственных таксонов вызывает сомнение.

Цель и задачи исследования. Цель работы — комплексное исследование таксономических взаимоотношений и уровней родства 81У-геномных видов рода Е1утиз на территории Азиатской России. Для достижения данной цели нами были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать таксономические взаимоотношения центрально-азиатских видов Е. /еЖзс/гепког, Е. пех^кИ и Е. ргаегирШз, используя сравнительно-морфологический, эколого-географический, биохимический (запасные белки эндосперма) и молекуляр-но-генетический методы.

2. Изучить полиморфизм и специфичность Е. gmelinii на основе морфологических, эколого-географических и биохимических критериев в сравнении с морфологически близкими видами Е. /есПзсИепког и Е. рег^иПпия. Оценить целесообразность отнесения Е. %те1тИ к подсекции СигхаИ.

3. Проследить таксономические связи между видами Е. реп<1иИпт, Е. Ьгаскуро-с1Ш(1е$ и Е. \ernicosus с использованием морфологических, эколого-географических и репродуктивных критериев, биохимических (электрофорез запасных белков эндосперма и гистона Н1) и молекулярно-генетических 188Я-маркеров.

4. Определить уровни морфологической, биохимической и репродуктивной обособленности и таксономический ранг Е. сШаш и Е. атигепз1з.

5. Определить возможность интрогрессии между видами Е. ciliaris и Е. pendulinus в связи с гипотезами происхождения Е. amurensis.

6. Проверить достоверность признака формы верхних цветковых чешуй, как диагностического, для разделения видов с разной геномной конституцией на уровне секции.

7. Провести ревизию и уточнить таксономическую систему изученных видов.

Защищаемые положения:

1. Изучение отношений скрещиваемости между локальными биотипами рода Elymus и их последствий в поколениях является одним из эффективных методов для выявления особенностей внутривидовых и межвидовых взаимоотношений на микроэволюционном уровне.

2. Результаты комплексных исследований таксономических отношений внутри StY-геномной группы рода Elymus на территории Азиатской России позволяют рассматривать их в пределах новой самостоятельной секции и 4 подсекций.

Научная новизна работы. Впервые на основании геномной системы классификации виды StY-геномной группы рода Elymus на территории Азиатской России подверглись тщательному рассмотрению с позиций биосистематики. Впервые были исследованы взаимоотношения видов из различных секций рода, несущих общий геном, с применением комплексного методического подхода, включающего сравнительно-морфологический, эколого-географический, биохимический (электрофорез запасных белков эндосперма), молекулярно-генетический методы и метод гибридизации. У изучаемой группы выявлены наиболее стабильные морфологические признаки, которые могут быть использованы в таксономии. Показано генетическое единство близкородственных видов и вариабельность многих диагностических признаков. На основании полученных данных StY-геномная группа видов выделена в отдельную секцию и построена ее система. Выделены одна новая секция и одна подсекция.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для дальнейшего пересмотра таксономического состава рода Elymus на основе сочетания традиционных и экспериментальных методов исследования. Применение комплексного методического подхода при изучении межвидовой и внутривидовой изменчивости имеет практическое значение при отборе генотипов для интродукции, селекции и сохранения их в генбанках для решения вопросов охраны природного генофонда пшеницевых злаков.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 11 российских и международных конференциях, среди которых: II(IV) Всерос. молодежная научно-практ. конф. "Перспективы развития и проблемы современной ботаники" (Новосибирск, 2010); IV Междунар. конф. "Проблемы изучения растительного покрова Сибири" (Томск, 2010); V Всерос. конф. с международным участием "Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока" (Красноярск, 2010); Всерос. конф., посвящ. 65-летию Центрального сибирского ботанического сада и 100-летию со дня рождения проф. К.А. Соболевской и A.B. Куминовой "Проблемы сохранения растительного мира Северной Азии и его генофонда" (Новосибирск, 2011); Междунар. научн. конф. "Растительный мир и его охрана" (Алматы, Казахстан, 2012); X и XI Междунар. научно-практ. конф. "Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии" (Барнаул, 2011, 2012); Н(Х) Междунар. бот. конф. молодых ученых (Санкт-Петербург, 2012). I научно-практ. конф. "Ботаническое образование в России: прошлое, настоящее, будущее" (Новосибирск, 2013); 7-й Междунар. симпозиум по Пшенице-вым "7th International Triticeae Symposium" (Chengdu, China, 2013); Всерос. конф.

"Растительный мир Северной Азии: проблемы изучения и сохранения биоразнообразия" (Новосибирск, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК.

Структура диссертации. Работа состоит из введения, шести глав, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 227 страницах, включает 35 таблиц и 89 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 240 источников, из них 147 -на иностранных языках.

Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность и благодарность д.б.н., проф. О.В. Дорогиной, акад. РАН П.Г. Горовому (ТИБОХ ДВО РАН), д.б.н. Н.С. Проба-товой (БПИ ДВО РАН), C.B. Асбаганову, к.б.н. Д.Е. Никоновой, к.б.н. Н.С. Звягиной за помощь в проведении исследований и критическое обсуждение результатов.

ГЛАВА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА, ВИДОВОЙ СОСТАВ И РАСПРОСТРАНЕНИЕ St Y-ГЕНОМНОЙ ГРУППЫ РОДА EL YMUS L.

Глава состоит из трех разделов. В первом разделе приводится краткая характеристика рода Elymus, сведения о его объеме, геномном составе и положении рода в трибе Triticeae сем. Роасеае. Рассматривается номенклатура рода Elymus, основанная на традиционных методах и роль геномной системы классификации в систематике рода. Во втором разделе приведен полный исторический обзор рода Roegneria С. Koch, представленного видами с геномом StStYY (Baum et al., 1991), показано положение StY-геномной группы видов внутри рода Elymus, дана морфологическая и эколого-географическая характеристика видов группы. Рассмотрены гипотезы происхождения Y-гаплома. В третьем разделе показана важность сочетания классических (морфологический и эколого-геогафический) и современных (применение белковых и молекулярно-генетических маркеров) методов в комплексном методическом подходе для целей систематики. Рассматриваются методы биосистематики - синтетической, междисциплинарной науки, интегрально сочетающей различные подходы к структуре и эволюции вида (Тахтаджян, 1964, 1970, 1974). Важным направлением биосистематики должно стать специальное изучение структуры и взаимоотношений таксонов видового и подвидового ранга и подтверждение их статуса генетическими методами с акцентом на диагностические признаки. В разделе рассмотрены некоторые факторы, осложняющие разграничение таксонов внутри StY-геномной группы Elymus.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследований послужили коллекции ведущих гербариев России (LE, VLA, NS, NSK, ALTB, ТК, UUH, UUDE). В эксперименте использовались гер-барные образцы и семена, собранные в Сибири и на Дальнем Востоке России лично автором, сотрудниками ЦСБС СО РАН и ИОЭБ СО РАН (г. Улан-Удэ), а также любезно предоставленные шведским ботаником Dr. В. Salomon. Видовая принадлежность материала определялась и уточнялась согласно диагнозам H.H. Цвелева (1976), Н.С. Пробатовой (1985), Г.А. Пешковой (1990), H.H. Цвелева и Н.С. Пробатовой (2010). Морфологические признаки уточнялись и регистрировались на живых особях, выращенных на открытых делянках интродукционной коллекции ЦСБС СО РАН и в условиях климокамеры, в течение всего вегетационного периода.

При составлении морфологической характеристики растений использовали теоретические подходы (классификации) Т.А. Работнова (1950), Т.Н. Серебряковой (1971),

В.Н. Доброхотова и др. (2008). Оценку плотности расположения трихом на органах растения проводили по 6-балльной шкале, составленной по методу Г.Н. Зайцева (1973). Морфологические признаки семян (НЦЧ, ВЦЧ, КЧ) и колосков, узлов стебля были изучены с помощью стерео микроскопа Carl Zeiss Stereo Discovery V4 (с программой AxioVision 4.8). Опушение листа оценивали визуально и при помощи снимков сканирующего электронного микроскопа Hitachi ТМ-1000.

Для электрофореза запасных белков нами была использована методика выделения изолированного эндосперма и экстракции белков из отдельных зерновок многолетних злаков трибы Triticeae (Агафонов, Агафонова, 1992). При выделении гистона HI применялась методика С.М. Розова и др. (1986) с незначительной модификацией для анализа листьев многолетних злаков (Костина, Агафонов, 2002). Ступенчатый SDS электрофорез проводили по методике Laemmli (1970) с модификациями для анализа многолетних пшеницевых злаков (Агафонов, Агафонова, 1992).

Для анализа полиморфизма межмикросателлитных последовательностей ДНК (inter simple sequence repeats, ISSR) тотальную ДНК выделяли из свежих, высушенных в силикагеле или фильтровальной бумаге, листьев. У видов комплекса Е. pendulinus s. 1. тотальную ДНК выделяли по модифицированному методу G. Sun (1997) и при помощи набора Nucleospin Plant II у остальных видов. ПЦР проводили в 25 мкл смеси. Реакция проходила в термоциклере BioRad. Электрофоретическое разделение проводили в 1.5 %-ном агарозном геле, IX ТВЕ-буфере при напряжении 3 В/см. Для флуоресцентной индикации ампликонов использовали краситель SYBR Green.

Для количественной оценки полиморфизма использованных молекулярных маркеров в графическом редакторе строили бинарную матрицу по наличию (1) и отсутствию (0) пептидных компонентов или ПЦР-фрагментов одинакового размера. Кластерный анализ проводили с помощью программы STATISTICA (v. 5.0 и 6.1) и BioNumerics. Для построения дендрограмм по распределению ISSR-маркеров использовали пакет программ TREECON (v. 1.3b).

Гибридизацию растений проводили по разработанной экспресс-методике (Агафонов, 2004). Гибридность особей Fi определяли по морфологическим маркерам. Семенную фертильность (СФ) растений определяли как отношение выполненных зерновок к общему числу цветков в колосе. Оценку наследования морфологических признаков проводили на выборках растений F2, наблюдаемое расщепление по фенотипам проверяли по критерию %2 (хи-квадрат) (Лобашев, 1967) на соответствие типу наследования по законам Менделя.

ГЛАВА 3. ТАКСОНОМИЧЕСКИЕ ОТНОШЕНИЯ МЕЖДУ ВИДАМИ St Y-ГЕНОМНОЙ ГРУППЫ ПОДСЕКЦИИ CUR VA TI РОДА ELYMUS НА ТЕРРИТОРИИ АЗИАТСКОЙ РОССИИ

3.1. Взаимоотношения центрально-азиатских видов Е. fedtschenkoi, Е. nevskii и Е. praeruptus

В Центральной Азии распространена небольшая, но морфологически хорошо отличимая группа видов рода Elymus L., произрастающих на открытых склонах или у границ лесных фрагментов горных хребтов. Эти виды обладают сходными морфологическими признаками, подтверждающими их близкое родство. Главным диагностическим признаком для разделения Е. fedtschenkoi и Е. nevskii является длина остей НЦЧ - 10-25 и 2-7 мм соответственно. При этом были найдены промежуточные между видами формы, длина остей которых составляет 6-10 мм.

Морфологическая дифференциация. Нами был подробно изучен материал Е. fedtschenkoi, Е. nevskii и морфологически близкого среднеазиатского вида Е. praeruptus из горных хребтов Алтая, Тянь-Шаня и Гиссаро-Алая. Ранее предполагалось, что существуют короткоостые формы Е. fedtschenkoi, которые очень трудно отличить от особей Е. nevskii (Salomon, 1994). Коллекционные образцы, определенные как Е. nevskii, могут представлять собой образцы нетипичного К nevskii, безостые формы Е. fedtschenkoi, безостые экземпляры Е. abolinii (Drobow) Tzvelev с более плотными колосьями и широкими пленчатыми колосковыми чешуями (КЧ), а также смесь возможных межвидовых гибридов. По признаку опушения нижних цветковых чешуй (НЦЧ), являющимся диагностическим для большинства видов StY-геномной группы, у видов Е. fedtschenkoi, Е. nevskii и Е. praeruptus обнаружено большое сходство.

Анализ изменчивости запасных белков эндосперма. Учитывая выявленную изменчивость по генетически детерминированным полипептидам запасных белков эндосперма можно предположить, что Е. fedtschenkoi и Е. nevskii в разных точках ареала находятся на разных стадиях микроэволюционной дивергенции. В частности, некоторые биотипы Е. fedtschenkoi могут нести аллель, контролирующий признак резко укороченных остей НЦЧ, то есть, представлять собой его короткоостую форму. В этом случае такие биотипы будут причисляться к таксономически самостоятельному виду Е. nevskii.

Взаимоотношения видов, выявляемые молекулярно-генетическими методами. Для выявления генетического полиморфизма и видовой специфичности у Е. fedtschenkoi, Е. nevskii и Е. praeruptus нами был использован метод молекулярно-генетического анализа изменчивости межмикросателлитных последовательностей ДНК (ISSR). Кроме основных анализируемых видов для сравнения в анализ были взяты образцы реперных видов и неидентифицированных образцов. Праймеры 17899В, Ml, М2, МИ, НВ14 и НВ12 были применены для ПЦР амплификации 48 образцов. В результате было получено 328 бэндов, варьирующих в диапазоне от 200 до 2000 п.н. Консенсусные дендрограммы, построенные методами Neighbor-Joining (NJ) и UPGMA (рис. 1), показали сходный результат.

Как показано на дендрограмме, образцы одного вида из разных мест группировались согласно их видовой принадлежности. При этом в верхней части дендрограммы образцы Е. fedtschenkoi образуют общую кладу с Е. nevskii. Образцы Е. praeruptus составляют отдельную от остальных образцов кладу в нижней части дендрограммы. Таким образом, согласно полиморфизму ISSR-маркеров, Е. fedtschenkoi и Е. nevskii обладают высоким генетическим сходством независимо от места произрастания, тогда как Е. praeruptus генетически отдален от этой пары видов.

Репродуктивные взаимоотношения видов. Высказано предположение, что Е. fedtschenkoi и Е. nevskii в разных точках ареала находятся на разных стадиях микроэволюционной дивергенции. В частности, некоторые биотипы Е. fedtschenkoi могут нести аллель, контролирующий признак резко укороченных остей НЦЧ, то есть представлять собой короткоостую форму, соответствующую Е. nevskii. Созданные нами 2 гибридных растения между биотипами из южного Алтая Е. fedtschenkoi KSA-0938 * Е. nevskii KSA-0935 показали относительно высокий процент семенной фертильности (25.3 и 35.8) по сравнению с родительскими — 61.2 %, что свидетельствует о близком родстве между данными биотипами двух видов. Тогда как Е. praeruptus представляет собой обособленный вид, который является морфологически, репродуктивно и генетически отдаленным от Е. fedtschenkoi и Е. nevskii.

▲ Б. fedtschenkoi

■ Е. nevskii

□ Б. praeruptus

v Е. gmelinii

В Б. pendulinus

- Н10215-2

- Н 102151

- Н10213

Ш Пксаро-Алай

■ Ъаъ-Шга

-Н10293-2 — И10293-1

100г Н10295. 1- Н10295«

Гис с врО-А-1«Л

-KSA-0938

- KSA 0935

а-

- Н 7507.3

- И7507-1

-Н7510

-Н7510

М Гиндукуш ^ Алл

— Н10223

-Н 3283-2

- Н3283-1

)00r Н 102И З L н 10218 2

99.-Н10285-5

1-Н10285 4

_100. Н10287

1Н10287

01-

- АНТ-0951

— KSA-0954

Н1021« Н10285-2 Н10285-1

Гисс ipoA-тай

Рис. 1. Консенсусная дендрограмма NJ, построенная по результатам использования 6 прай-меров. В узлах указаны значения бугстреп поддержки. Шкала вверху - генетические расстояния по Link et al. (1995).

3.2. Внутривидовой полиморфизм по морфологическим признакам и спектрам запасных белков эндосперма Е. };те1тИ

Анализ изменчивости морфологических признаков. Е. %теНпИ — вид Северной Азии с широким ареалом и экологической амплитудой, включающий в себя множество различающихся морфотипов. В результате изучения морфологической изменчивости Е. gmelinii не было выявлено существенных отличий между образцами из Сибири и с Дальнего Востока России. По признакам опушения НЦЧ, опушения верхних цветковых чешуй (ВЦЧ), по коэффициенту соотношения КЧ и НЦЧ, а также опушению верхней и нижней стороны листовой пластинки (ЛП) наиболее изменчивыми были образцы из Бурятии. Растения с волосистыми в разной степени узлами стеблей (УС) произрастают на Дальнем Востоке, в т. ч. на п-ове Камчатка. В Республике Алтай, Красноярском крае, Тыве, Забайкальском крае, частично в Бурятии и Казахстане произрастают образцы с голыми гладкими УС. Сибирские растения Е. %те1ЫИ представлены в основном образцами с опушенными в разной степени члениками колосковой оси (ЧКО), тогда как среди дальневосточных встречались растения как с опушенными, так и с практически голыми ЧКО. Влагалища верхних листьев перед колосом у всех образцов были голыми, гладкими и безреснитчатыми, за исключением образца из Забайкальского края (СН1-0920), у которого обнаружены реснички по краю влагалища. В целом выделились Е. gmelinii с п-ова Камчатка, отличающиеся от остальных по ряду признаков. Морфологически отклоняющиеся формы (МОФ) Е. gmelinii в ряде случаев могут быть сходны с Е. /еШзс1гепкЫ и Е. репсклНпия на одинаковых стадиях онтогенеза, что не исключает возможности участия этих видов в интрогрессивном образовании МОФ.

Анализ изменчивости биохимических признаков. Электрофоретически было изучено 82 образца Е. gmelinii из разных географических точек Азиатской России (от

Зап. Сибири до п-ва Камчатка). По признаку полипептидных спектров запасных белков семян вид обладает определенной специфичностью, но по мере увеличения географической дистанции увеличивается уровень различий между биотипами (рис. 2). При этом взятый в сравнение образец Е. /еЖь-скепко! показал существенные отличия от всех образцов Е. %теЧпп.

кДа St 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 ОЭП

А ВС

Рис. 2. SDS-электрофореграмма запасных белков эндосперма отдельных зерновок природных образцов Е. gmelinii из разных точек Сибири и северной Монголии (А), Хабаровского и Приморского краев (В) и п-ва Камчатка (С). Вариант +Ме (с добавлением 2-меркаптоэтанола).

]

Е. gmelinii имеет сравнительно невысокий уровень изменчивости гистона Н1 у образцов из Южной Сибири. При сравнении Е. gmelinii с образцами Е. pendulinus и Е. amurensis из Приморского края спектры значительно различались.

Высокий полиморфизм генетически контролируемых признаков Е. gmelinii (харак-5 тера опушения НЦЧ и ЛП) свидетельствует о том, что они могут быть использованы для построения внутривидовой таксономической системы, т. е. для выделения подвидов и разновидностей с учетом географической и экологической приуроченности.

ГЛАВА 4. ИЗМЕНЧИВОСТЬ И ТАКСОНОМИЧЕСКИЕ ОТНОШЕНИЯ ВИДОВ ВНУТРИ И МЕЖДУ ПОДСЕКЦИЯМИ PENDULINIИ CILIARES РОДА ELYMUS

4.1. Изменчивость и таксономические взаимоотношения между видами подсекции Pendulini: Е. pendulinus, Е. brachypodioides и Е. vernicosus

Для территории России диагностическими признаками трех видов Е. pendulinus, 1 Е. brachypodioides и Е. vernicosus из подсекции Pendulini (Nevski) Tzvelev в секции Goulardia являются опушение НЦЧ и УС (Цвелев, 2008; Цвел ев, Пробатова, 2010). Разграничение видов на основании эколого-географического критерия и морфологических признаков, которые могут представлять собой проявления популяционной из-v менчивости, является недостаточно обоснованным. Названные виды филогенетиче-{ ски могут быть географическими расами или морфотипами одного крупного поли; морфного вида Е. pendulinus s. 1. (Bothmer et al., 2005). Основная часть ареала вида

находится в Восточной Азии. На территории Азиатской России вид распространен только в южных районах Сибири и Дальнего Востока.

Анализ изменчивости морфологических признаков. По признаку опушения НЦЧ в популяциях Е. репЛиИпия е. 1. Южного Приморья и Горного Алтая были обнаружены как голые и гладкие, безреснитчатые, так и длиннощетинистые, реснитчатые НЦЧ со всеми переходными состояниями (рис. 3).

Рис. 3. Опушение НЦЧ у отдельных растений Е. pendulinus из популяции SAD-07 (Приморский край, окр. г. Владивостока, окр. ж/д ст. Садгород, alt. 25 м N 43°15.73' Е 132°2.48' до побережья Амурского залива, alt. 2 м; N 43° 16.00' Е 32°0.97').

По признаку опушения УС в некоторых популяциях Южного Приморья найдены особи как с голыми, так и с волосистыми в разной степени УС, в том числе с полуопушенными, т. е. ряд популяций формально состоит из трех видов - Е. pendulinus, Е. brachypodioides и Е. vernicosus. Была отмечена изменчивость по опушению ЛП и влагалищ нижних листьев, а также по относительной длине КЧ.

Анализ изменчивости биохимических признаков. Электрофоретический анализ запасных белков эндосперма зерновок у образцов Е. pendulinus, Е. brachypodioides и Е. vernicosus из разных точек ареала не выявил какой-либо специфичности полипептидных спектров. При этом горно-алтайская выборка показала большую однородность по этому признаку, чем образцы из Приморского края.

При сравнении выборочных образцов из Приморского и Алтайского края с образцами из китайских провинций Sichuan и Непал было обнаружено, что российские образцы обладают рядом общих белковых компонентов, но в целом заметно отличаются от всех китайских по наиболее консервативным и наименее подвижным (крупным) субъединицам глютелина. Вместе с тем, на фоне широкого внутривидового полиморфизма у некоторых российских и китайских образцов также отмечены общие компоненты.

Молекулярно-генетический анализ. Молекулярно-генетический анализ изменчивости межмикросателлитных последовательностей ДНК (188Я) с использованием 6 эффективных праймеров выявил высокую дифференциацию образцов из Приморского края и значительно меньшие различия среди горно-алтайских образцов. Очевидно, это связано с тем, что данные таксоны распространены в Приморском крае значительно шире, чем в Горном Алтае. Это проявляется в большем диапазоне всех морфологических характеристик и согласуется с данными по изменчивости запасных белков эндосперма.

Репродуктивные взаимоотношения видов. Результаты межвидовой гибридизации в пяти комбинациях скрещивания показали высокую половую совместимость видов Е. репйиИпиь, Е. brachypodioides и Е. \ernicosus (табл. 1). Показано, что на территории России генотипы разных видов представляют собой единый рекомбинацион-ный генпул независимо от формальной видовой принадлежности. Большинство гибридных растений р! обладали нормально развитыми пыльниками. По каждому анализируемому признаку расщепление в Р2 было статистически проверено при помощи критерия х2- Расщепление признаков в Р2 практически во всех комбинациях скрещивания происходило по моногенному типу, исключением было дигибридное расщепление признака опушения НЦЧ в комбинации скрещивания Е. brachypodioides УЬА-0719 х Е. репёиИпиз УОК-0738 (Р2 = А_В_ - 45 (волосистых) : А_ЬЬ - 12 (щетинистых) : ааВ_ — 6 (шиповатых) : ааЬЬ - 6 (голых гладких), % = 5.434 < х205 = 7.82 при 0.20 > Р > 0.05 — гипотеза дигенного наследования признака верна).

Таблица 1

Наивысшие значения семенной фертильности (СФ) гибридов и уровни половой совместимости Ся биотипов комплекса Е. репйиИпиI с различающейся морфологией в поколениях Р] и Рг

№ п/п Комбинация скрещивания Наивысшие значения семенной фертильности в поколениях, % Уровень половой совместимости Cs

f, nfi f2 Nfj

1 MES-0721 brach * USS-0720 pend 78.8 3 92.4 80 al

2 ВКА-0921 brach х SAD-0842 pend 18/5(#) 2 73.6 14 a2

3 ZAR-0746 brach x SAD-0842 pend 43.0 1 75.0 43 al

4 VLA-0719 brach x VOK-0738 pend 75.9 1 84.2 72 al

5 AUS-1015 pend * VBG-0722 brach 98/18(8) 2 72.2 21 al

6 CHE-1044 verni x AUS-1015 pend 89.0 2 - 78 al

Примечание. Nfi и Nn — число растений, проанализированных в Fi и в F2 соответственно. (#) - дробью обозначено число зерновок всего (N), собранное с числа колосьев (М). Уровни Cs определены согласно А.В. Агафонову (1997), Agafonov & Salomon (2002).

В целом, Е. pendulinus s. 1. имеет обширный ареал, но на территорию Азиатской России заходит только самой северной своей частью. Такие виды всегда обладают широким диапазоном генотипической изменчивости, которая на уровне фенотипов проявляется в непрерывном характере вариабельности. Это может означать, что разделение комплекса Е. pendulinus на несколько таксонов видового ранга (Е. pendulinus, Е. brachypodioides и Е. vernicosus) не оправдано. Вместе с тем, целесообразно выделение ряда внутривидовых таксонов на основе не только четких морфологических признаков, но и с учетом генетического родства между совокупностями особей и локальных популяций.

4.2. Уровни морфологической и биохимической специфичности и репродуктивной обособленности видов подсекции Ciliares: Е. ciliaris и Е. amurensis

Основными морфологическими отличиями видов приморского происхождения Е. ciliaris и Е. amurensis являются: опушение ЛП и НЦЧ, длина КЧ (Невский, 1934). Ранее, согласно Н.С. Пробатовой (1985), наиболее значимым признаком являлось опушение НЦЧ, но в публикации H.H. Цвелева и Н.С. Пробатовой (2010) виды Е. ciliaris и Е. amurensis, составляющие подсекцию Ciliares (Nevski) Tzvelev, в секции Goulardia (Husn.) Tzvelev различаются по опушению ЛП и длине пыльников. На территории Китая, где расположена основная часть ареала Е. ciliaris, он признается как один вид, включающий 6 разновидностей (Chen, Zhu, 2006), в том числе Е. ciliaris var. amurensis (Drob.) S.L. Chen (Chen, 1997), выделенную на основании признаков опушения КЧ и ЛП.

Анализ изменчивости морфологических признаков. По нашим данным, признаки опушения ЛП и длины пыльников широко варьируют. Длина пыльников не может рассматриваться как диагностический признак, поскольку она напрямую зависит от мощности растений и изменяется в зависимости от условий среды и стадии развития. Выявлено, что в прегенеративной стадии розеточные листья у всех изученных растений обладали с обеих сторон опушенными ЛП. Они существенно отличались от состояния ЛП генеративных побегов. Особи могут значительно различаться по характеру опушения ЛП (рис. 4), даже в пределах одной популяции.

VBG 0844 I'eHepBepXH АМ)-0707-11_Генер_Верх11

Рис. 4. Изображение верхней поверхности ЛП на генеративных побегах растений у образцов Е. сШаш (А>ГО-0707-11, АКО-0707-13, УВС-0844) и Е. атигепьгь (МЕ8-0702).

Была обнаружена непрерывная изменчивость по типу, расположению и плотности трихом на НЦЧ. Вариационный ряд в комплексе Е. сШапэ представлен крайними и промежуточными формами от голых, гладких и безреснитчатых НЦЧ до длинно-волосистых с густыми и длинными ресничками. У растений комплекса Е. сШапв е. 1.

форма КЧ варьирует от эллиптически-ланцетной до заостренно-ланцетной. Соотношение длин КЧ и НЦЧ (к) в норме составляет 0.6-0.7 и 0.7-0.8, но нами отмечены и крайние формы с коэффициентом к = 0.5-0.6, и к = 0.8-0.9. В целом, этот признак s также не видоспецифичен по причине его широкой вариабельности.

Анализ изменчивости биохимических признаков. В целом, виды Е. ciliaris и * Е. amurensis обладают полиморфизмом по спектрам запасных белков эндосперма, что дает возможность проследить уровни родственности между биотипами и популяциями. Корре-: ляционной связи между формальной видовой принадлежностью конкретного образца и ! компонентным составом белковых спектров не обнаружено. В отношении различий по составу спектров гораздо сильнее выражен критерий дистанции между популяциями. Кроме того, популяции значительно различались по гетерогенности этого признака.

Уровни репродуктивной обособленности. С целью установления уровней половой совместимости между биотипами комплекса из разных районов Приморского края нами была получена серия внутривидовых и межвидовых гибридов Е. ciliaris х j Е. ciliaris, гибридов Е. ciliaris х Е. amurensis и Е. amurensis х Е. ciliaris. Однако, все растения F] в данных комбинациях, в т. ч. внутривидовая гибридизация образцов из разных популяций (Е. ciliaris * Е. ciliaris), показали полную стерильность особей. Это может означать, что Е. ciliaris как вид является более дифференцированным цитоге-нетически, чем Е. pendulinus.

Таким образом, из результатов морфологического и электрофоретического анализа следует, что Е. ciliaris и Е. amurensis не представляют собой обособленные виды. Все ключевые признаки широко варьируют и встречаются в разных комбинациях. Поэтому мы предлагаем рассматривать эти таксоны в качестве одного вида Е. ciliaris s. 1. При этом Е. amurensis целесообразно признавать в ранге разновидности Е. ciliaris var. amurensis (Drob.) S.L. Chen до выяснения особенностей внутривидовой дифференциации вида в целом.

4.3. Возможность интрогрессии между видами Е. ciliaris и Е. pendulinus в связи с гипотезами происхождения Е. amurensis

Самостоятельность видов Е. pendulinus, Е. ciliaris и Е. gmelinii не вызывает сомнения даже с учетом внутривидового полиморфизма каждого из трех видов. Тем не менее, нельзя исключить межвидовую интрогрессию и дальнейшее формообразование в смешанных популяциях при совместном произрастании разных StY-геномных видов рода Elymus. При описании вида Е. amurensis (Цвелев, Пробатова, 2010) высказывалось предположение о возможном происхождении вида от гибридизации Е. ciliaris х Е. pendulinus. : Противоречивая точка зрения на взаимоотношения названных видов рассматривается нами достаточно критически, поскольку не подтверждена какими-либо экспериментальными данными. В настоящее время точные сведения о взаимоотношениях между видами Е. ciliaris — Е. pendulinus и Е. amurensis — Е. gmelinii практически отсутствовали.

Методологические предпосылки для установления филогении Е. amurensis. Детальный морфологический анализ дальневосточных образцов Е. ciliaris и Е. pendulinus показал наличие стабильных и надежных критериев, по которым различаются два вида (Кобозева, Агафонов, 2011). Вместе с тем, в местах совместного произрастания нами неоднократно были отмечены и собраны межвидовые гибриды, обладающие промежуточными признаками (рис. 5). Изучение таких особей показало их полную стерильность. Три искусственных гибрида, полученных в лабораторных условиях, также показали промежуточные состояния диагностических признаков и полную стерильность особей. Однако, морфологический анализ растений Е. ciliaris и Е. pendulinus не позволяет одно-

значно ответить на вопрос о возможности протекания интрогрессивных процессов, так как для обоих видов характерна изменчивость по гомологичным рядам признаков — опушению ЛП, НЦЧ и ВЦЧ.

Е. ciliaris Е. pendulinus Е. ciliaris х Е. pendulinus

Рис. 5. Фрагменты колосьев двух видов и межвидового гибрида из популяции VOK-07.

Сравнительный анализ по экспериментальным данным. Серия опытов по электрофоретическому анализу полипептидных спектров запасных белков эндосперма показала, что образцы двух видов отчетливо разделились по разным кладам. Сделано заключение о наличии видовой специфичности белковых спектров семян Е. pendulinus и Е. ciliaris. Последствия межвидовой интрогрессии между Е. ciliaris и Е. pendulinus в природных популяциях не обнаружены, несмотря на то, что два вида часто произрастают в общих экотопах в непосредственной близости между особями. Тем не менее, это не означает, что процессы интрогрессии не могут протекать в других точках ареала. Но согласно полученным нами комплексным данным, вероятность такого явления достаточно мала. Что касается происхождения Е. amurensis, то этот таксон, вероятнее всего, представляет собой совокупность морфотипов Е. ciliaris s. 1. (Кобозева и др., 2011), которая не обладает качествами самостоятельного вида. В настоящее время нет никаких оснований предполагать происхождение Е. amurensis от гибридизации хорошо обособленных видов Е. ciliaris и Е. pendulinus.

ГЛАВА 5. Ф ОРМА ВЕРХНИХ ЦВЕТКОВЫХ ЧЕШУЙ У ВИДОВ РОДА EL YMUS С РАЗНОЙ ГЕНОМНОЙ КОНСТИТУЦИЕЙ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ТАКСОНОМИИ

В последнее время, на основании выявления генетических различий между группами видов с разной геномной конституцией, помимо самостоятельного рода Kengyilia было предложено восстановить независимый род Campeiostachys Drobov, с включением в него видов рода Elymus с геномом StHY (Baum et al., 2011). По мнению авторов (Baum et al., 1991; Jensen, Chen, 1992), представители восстановленного рода обладают признаками ВЦЧ, позволяющими отличить их от StY-геномных видов, которые они относят к роду Roegneria. Данный тезис представляется нам довольно сомнительным. Признак формы ВЦЧ изначально был положен в основу разделения родов Elymus и Roegneria (Baum et al., 1991). В род Roegneria были включены виды, имеющие ВЦЧ, короче или равные НЦЧ, и округлую или широко-выемчатую на верхушке форму. Тогда род Elymus должен содержать виды с ВЦЧ, равной по длине НЦЧ, со слегка удлиненной и острой, или усеченной формой. В качестве примера, авторами были приведены рисунки ВЦЧ, характерные для трех видов Roegneria (R. caucasica С. Koch, R. turczaninovii (Drob.) Nevski и R. ciliaris (Trin.) Nevski) и трех

видов Elymus (Е. sibiricus L., E. mutabilis (Drob.) Tzvelev, E. caninus (L.) L.). Позднее было подтверждено существование корреляции между геномной конституцией и формой и размерами НЦЧ и ВЦЧ, в частности, показано, что для StY-геномных видов характерна округлая форма ВЦЧ (Salomon, Lu, 1992).

Для анализа признака были взяты растения (от 6 до 36 особей для разных видов), относящиеся к видам с разными геномами, произрастающие в Азиатской России. Для получения изображений было отобрано по 6 типичных форм каждого вида, различающихся по эколого-географическим характеристикам, а также некоторые МОФ, имеющие признаки межвидовой интрогрессии. По нашим данным, морфология ВЦЧ у большинства видов соответствует вышеупомянутой классификации (Salomon, Lu, 1992). Для StY-геномных видов наиболее характерна широко-округлая и округлая форма ВЦЧ, реже встречается широко-выемчатая и вильчатая форма. Для StH-геномных видов — заостренная, узко-выемчатая, усеченная, а также широко-усеченная и округлая, реже суженно-скошенная и округло-скошенная. Для StHY-геномных, как и для StY-геномных видов, характерна округлая форма ВЦЧ.

Тем не менее, при подробном изучении было обнаружено перекрывание некоторых видов по форме ВЦЧ, относящихся к разным группам по геномной конституции. На основе ранее опубликованных рисунков (Baum et al., 1991; Salomon, Lu, 1992), нами была разработана более полная классификация форм ВЦЧ (рис. 6).

Г\

Рис. 6. Формы ВЦЧ, характерные для видов рода Elymus.

Буквами обозначены формы согласно классификации В. Salomon и B.-R. Lu (1992): А - усеченная форма ВЦЧ, В - острая, С - округло-скошенная, D - широко-округлая, Е - вильчатая, Г - округлая, G - суженно-скошенная. Цифрами обозначены формы, дополняющие классификацию согласно нашим исследованиям: 1 - широко-выемчатая, 2 - узко-выемчатая, 3 - заостренная, 4 -широко-усеченная.

Так, наиболее характерная для StY-геномных видов (Е. pendulinus, Е. nevskii, Е. gmelinii) округлая форма ВЦЧ, также отмечена у Е. caninus (StH) и Е. dahuricus Turcz. ex Grizeb. (StHY). Для видов E. gmelinii (StY) и E. mutabilis (StH) преимущественно характерна округло-скошенная форма ВЦЧ. Соответственно, приурочить определенную форму ВЦЧ к какому-либо виду не представляется возможным в силу внутривидовой изменчивости, проявляющейся под воздействием тех или иных факторов.

ГЛАВА 6. КОНСПЕКТ ВИДОВ РОДА EL YMUS С ГЕНОМОМ StY НА ТЕРРИТОРИИ АЗИАТСКОЙ РОССИИ

Нам представляется целесообразным сохранить единый род Elymus с разделением его на секции и подсекции, отражающие основные филогенетические ветви эволюции и современной его дифференциации. В основу разделения на секции должна быть положена геномная конституция видов, а подсекции должны объединять виды, между которыми сохранилась возможность к ограниченной рекомбинации наследственного материала при смене поколений. При таком построении таксономической системы рода преодолевается основное противоречие, закрепленное в новейшей обработке (Цвелев, 2008; Цвелев, Пробатова, 2010), так как секции Goulardia и Elymus содержат виды с разной геномной конституцией. Предлагается отнести виды с геномом StY в отдельную секцию Gmelinia Kobozeva et Agafonov.

Gen. Elymus L.

Sect. Gmelinia Kobozeva et Agafonov sect, nov., prov. - Typus: E. gmelinii (Ledeb.) Tzvelev.

Колосья прямые или слегка наклоненные с многочисленными колосками, расположенными по одному двумя правильными рядами. Колосковые чешуи эллиптические или ланцетовидные, равны по длине нижней цветковой чешуе или короче ее. Верхние цветковые чешуи равны по длине нижним или немного короче их, расстояние между килями широкое и кили опушены ресничками разной длины.

Subsect. Gmelinia Kobozeva et Agafonov subsect. nov., prov. - Typus: E. gmelinii (Ledeb.) Tzvelev.

Колосья жесткие прямостоячие. Колосковые чешуи ланцетовидно-заостренные, заканчиваются остевидным заострением 1-2 мм дл., шиповатые по жилкам. Нижние цветковые чешуи ланцетовидные, жестко шиповатые по всей поверхности, ости прямые длинные, при созревании отогнутые под прямым углом. Форма верхних цветковых чешуи округлая или вильчатая. Растения плотнодерновинные.

Виды: Е. gmelinii (Ledeb.) Tzvelev.

Subsect. Curvati (Nevski) Tzvelev. - Typus: E. fedtschenkoi Tzvelev.

Колосья прямостоячие, однобокие. Колосковые чешуи широколанцетовидные, заканчиваются остевидным заострением или короткой остью 1-2 мм да., голые, по краю пленчатые. Нижние цветковые чешуи широколанцетовидные, коротко-густошиповатые по всей поверхности, ости прямые, при созревании отогнутые резко вниз. Форма верхних цветковых чешуй округлая. Растения плотно- или рыхлодерновинные, часто с коленчато-согнутыми стеблями.

Виды: Е. fedtschenkoi Tzvelev, Е. nevskii Tzvelev.

Subsect. Pendulini (Nevski) Tzvelev. - Typus: E. pendulinus (Nevski) Tzvelev.

Колосья негустые с расставленными колосками, слегка наклоненные. Колосковые чешуи заостренные, ланцетовидные, голые. Нижние цветковые чешуи

ланцетовидные, редко длиннореснитчатые или длиннощетинистые, ости всегда прямые. Форма верхних цветковых чешуй ладьевидная. Растения рыхлодерно-винные.

Виды: Е. pendulinus (Nevski) Tzvelev s. 1. (incl. E. brachypodioides (Nevski) Peschkova, E. vernicosus (Nevski ex Grubov) Tzvelev).

Subsect. Ciliares (Nevski) Tzvelev. — Typus: E. ciliaris (Trin.) Tzvelev.

Колосья прямые или наклоненные. Колосковые чешуи округлые, эллиптические, по жилкам длинноволосистые или голые. Нижние цветковые чешуи ланцетовидные, густо реснитчатые по краям, на стадии созревания колосьев ости нижних цветковых чешуй отогнуты или загнуты вниз. Форма верхних цвет-1 ковых чешуй округлая. Растения рыхлодерновинные, на первом году вегетации ¡ часто образуют полурозеточные побеги.

j Виды: Е. ciliaris (Trin.) Tzvelev, Е. ciliaris var. amurensis (Drob.) S.L. Chen.

Выводы

1. Результаты электрофоретичеекого анализа запасных белков эндосперма и изучения вариабельности ISSR-маркеров подтвердили предположение о близком родстве Е. fedtschenkoi и Е. nevskii. Созданные гибриды Fi между Е. fedtschenkoi и Е. nevskii из мест с общим произрастанием родительских биотипов показали высокую семенную фертильность. Е. praeruplus оценивается, как наиболее отдаленный от двух предыдущих видов.

2. Наибольшим сходством по морфологическим признакам и компонентам белковых спектров у Е. gmelinii обладали биотипы с близким географическим положением, но по мере возрастания дистанции число общих компонентов уменьшалось, а диапазон морфологической изменчивости расширялся. Данные подтверждают влияние фактора географической изоляции на протекание процессов микроэволюционной дифференциации. Е. gmelinii по всем признакам хорошо отличается от других видов подсекции Curvati, которые в свою очередь имеют близкородственные взаимоотношения, и должен быть выделен из данной подсекции.

3. На основании выявленной изменчивости основных диагностических признаков, белковых и ISSR-маркеров у Е. pendulinus, Е. brachypodioides и Е. vernicosus, а также результатов анализа семенной фертильности полученных гибридов и характера наследования диагностических признаков, показано, что генотипы видов представляют собой единый рекомбинационный генпул. Данную группу видов следует рассматривать в качестве внутривидовых таксонов Е. pendulinus s. 1.

4. По результатам сравнительно-морфологического анализа образцов из разных точек ареала выявлено, что все ключевые признаки Е. ciliaris и Е. amurensis широко варьируют и встречаются в различных комбинациях. Ввиду отсутствия отчетливой видовой специфичности по морфологическим и биохимическим признакам предлагается рассматривать Е. amurensis в ранге разновидности Е. ciliaris var. amurensis (Drob.) С. L. Chen.

5. Высокая видоспецифичность полипептидных спектров запасных белков эндосперма Е. ciliaris и Е. pendulinus из Южного Приморья и абсолютная стерильность межвидовых гибридов F], свидетельствуют о низкой вероятности происхождения Е. amurensis в результате межвидовой интрогрессии.

6. Показано, что виды рода Elymus с различной геномной конституцией имеют изменчивость формы ВЦЧ, причем определенные формы (округло-скошенная и округлая) присутствуют во всех трех геномных группах в пределах Азиатской части России. Отмечен внутривидовой полиморфизм формы ВЦЧ у каждого из видов, позволяющий оценивать геномную конституцию только в качестве ориентировочного критерия.

7. Группа StY-геномных видов рода Elymus представлена на территории Азиатской России 5 видами и 1 разновидностью, выделенными в одну новую секцию Gmelinia, и относящимися к 4 подсекциям: Gmelinia, Curvati, Pendulini, Ciliares.

Исследования проведены при финансовой поддержке: РФФИ (гранты № 08-04-00747, № 11-04-00861, № 12-04-10144); НО "Благотворительный фонд культурных инициатив (Фонд Михаила Прохорова) "; гранта поддержки молодых ученых ведущих высших учебных заведений и научных исследовательских центров компании ОПТЭК, 2012 г. (Carl Zeiss AG, Германия).

Список РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНПЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых изданиях из списка ВАК

1. Кобозева, Е. В. Таксономические взаимоотношения между StY-геномными видами Elymus ciliaris и Е. amurensis (Poaceae) / Е. В. Кобозева, Д. Е. Герус, С. В. Овчинникова, А. В. Агафонов // Turczaninowia. - 2011. - Т. 14, вып. 3. - С. 35-44.

2. Кобозева, Е. В. Изменчивость и таксономические взаимоотношения между StY-геномными видами Elymus pendulinus, Е. brachypodioides и Е. vemicosus (Triticeae: Poaceae) / Е. В. Кобозева, С. В. Овчинникова, А. В. Агафонов // Раст. мир Азиатской России. - 2012. - № 2. - С. 87-93.

Статьи в прочих изданиях

1. Кобозева, Е. В. Таксономические взаимоотношения между StY-геномными видами Elymus ciliaris и Е. amurensis (Poaceae), выявляемые на основе морфологических и биохимических признаков // Перспективы развития и проблемы современной ботаники : материалы II Всерос. молодеж. науч.-практ. конф. (Новосибирск, 5-8 окт. 2010 г.). - Новосибирск, 2010.-С. 128-129.

2. Агафонов, А. В. Дифференциация StY-геномных видов рода Elymus (Poaceae) в Азиатской России по данным морфологии, изменчивости запасных белков эндосперма, гистона HI и ДНК маркеров / А. В. Агафонов, Д. Е. Герус, Е. В. Кобозева // Проблемы изучения растительного покрова Сибири : материалы IV Междунар. конф. - Томск, 2010. - С. 7-9.

3. Кобозева, Е. В. Изменчивость и филогенетические отношения между Elymus pendulinus, Е. brachypodioides и Е. vernicosus (Triticeae: Poaceae), выявляемые методами биосистематики / Е. В. Кобозева, А. В. Агафонов // Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока : материалы V Всерос. конф. с междунар. участием (Красноярск, 23-26 мая 2011 г.). - Красноярск, 2011.-Т. 1,-С. 216-222.

4. Кобозева, Е. В. Существует ли вероятность интрогрессивных процессов между StY-геномными видами Elymus ciliaris и Е. pendulinus (Poaceae) в природных популяциях? / Е. В. Кобозева, А. В. Агафонов // Проблемы сохранения растительного мира Северной Азии и его генофонда : материалы Всерос. конф., посвящ. 65-летию ЦСБС СО РАН и 100-летию со дня рожд. проф. К.А. Соболевской и A.B. Куминовой (Новосибирск, 23-25 авг. 2011 г.). - Новосибирск, 2011. - С. 88-91.

5. Кобозева, Е. В. Внутривидовой полиморфизм по морфологическим признакам и спектрам белков эндосперма StY-геномного вида Elymus gmelinii (Triticeae: Poaceae) / E. В. Кобозева, Д. Е. Герус, А. В. Агафонов // Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии : материалы X Междунар. науч.-практ. конф. (Барнаул, 24-27 окт. 2011 г.). - Барнаул, 2011. - С. 57-59.

6. Кобозева, Е. В. Номенклатура, морфологическая дифференциация и электрофоретиче-кая изменчивость по белкам эндосперма у центрально-азиатских видов Elymus fedtschenkoi,

. nevskii и Е. praeruptus (Triticeae: Poaceae) / E. В. Кобозева, В. Salomon, А. В. Агафонов // астительный мир и его охрана : материалы Междунар. научн. конф. (Алматы, Казахстан, -7 сент. 2012 г.). - Алматы, 2012. - С. 374-377.

7. Кобозева, Е. В. Взаимосвязь формы верхних цветковых чешуй и геномной конститу-ии у видов рода Elymus L. (Triticeae: Poaceae) и их применение для целей таксономии // роблемы ботаники Южной Сибири и Монголии : материалы XI Междунар. науч.-практ. онф. (Барнаул, 28-31 авг. 2012 г.). - Барнаул, 2012. - С. 105-109.

8. Асбаганов, С. В. Полиморфизм ISSR-маркеров у Elymus pendulinus, Е. brachy-odioides, Е. vernicosus (Triticeae: Poaceae) как один из критериев генетической дифферен-иации видов / С. В. Асбаганов, Е. В. Кобозева // II (X) Междунар. бот. конф. молодых уче-ых : материалы конф. (Санкт-Петербург, 11-16 нояб. 2012 г.). - СПб., 2012. - С. 15.

9. Кобозева, Е. В. Видовая специфичность и дифференциация представителей StY-еномной группы видов рода Elymus L. Азиатской России, выявляемые методами стерео- и лектронной микроскопии / Е. В. Кобозева, Д. Е. Никонова (Герус), С. В. Асбаганов // Бота-ическое образование в России: прошлое, настоящее, будущее : материалы I научно-практ. онф. (Новосибирск, 13-15 мая 2013 г.). - Новосибирск, 2013. - С. 43-45.

10. Кобозева, Е. В. Взаимоотношения между центрально-азиатскими видами Elymus edtschenkoi, Е. nevskii и Е. praeruptus (Triticeae: Poaceae), выявляемые на основании межви-овой гибридизации, изменчивости запасных белков эндосперма и молекулярных ISSR-аркеров / Е. В. Кобозева, А. В. Агафонов, В. Salomon // Растительный мир Северной Азии: роблемы изучения и сохранения биоразнообразия : материалы Всерос. конф. (Новосибирск,

1-3 окт. 2013 г.). - Новосибирск, 2013. - С. 66-68.

11. Kobozeva, Е. V. Morphological differentiation, endosperm protein variability, and ISSR arker variation in the Central Asian Elymus fedtschenkoi, E. nevskii and E. praeruptus (Poaceae) / . V. Kobozeva, A.V. Agafonov, B. Salomon // 7 International Triticeae Symposum (Chengdu,

China, June 9-13, 2013): book of abstr. - [S.I.], 2013. - P. 53.

12. Kobozeva, E. V. Relationships among the StY-genome species Elymus pendulinus, E. bra-hypodioides and E. vernicosus (Poaceae) evaluated by morphology, crossing ability and ISSR

markers / E. V. Kobozeva, S. V. Asbaganov, A. V. Agafonov // 7 International Triticeae Symposum (Chengdu, China, June 9-13, 2013) : book of abstr. - [S.I.], 2013. - P. 58.

Подписано в печать 02.03.14. Формат 60х84'Лб. Объем 1,0 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 10.

Центральный сибирский ботанический сад СО РАН. 630090 Новосибирск, ул. Золотодолинская, 101

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кобозева, Елена Валерьевна, Новосибирск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ЦЕНТРАЛЬНЫЙ СИБИРСКИЙ БОТАНИЧЕСКИЙ САД СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

042 ОН 5 8033

КОБОЗЕВА Елена Валерьевна

ВИДОВАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И ТАКСОНОМИЧЕСКИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ВИДОВ 81У-ГЕНОМНОЙ ГРУППЫ РОДА ЕЬУМШ Ь. АЗИАТСКОЙ РОССИИ

03.02.01 - "Ботаника" 03.02.07 - "Генетика"

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.б.н., с.н.с. A.B. Агафонов, д.б.н., с.н.с. C.B. Овчинникова

Новосибирск - 2014

Оглавление

Введение.............................................................5

Глава 1. Общая характеристика, видовой состав и распространение видов StY-геномной группы рола Elymus L.........................................10

1.1. Положение, объем и геномный состав рода Elymus в трибе Triticeae

сем. Роасеае.................................................... 10

1.1.1. Краткая характеристика рода Elymus.............................10

1.1.2. Традиционные подходы в систематике рода.......................11

1.1.3. Роль геномной системы классификации в систематике рода Elymus ... 13

1.2. Состав и общая характеристика StY-геномной группы видов рода Elymus 15

1.2.1. Положение видов StY-геномной группы в роде Elymus..............15

1.2.2. Морфологическая, эколого-географическая характеристика StY-геномных видов и их распространение в Азиатской России......17

1.2.3. История рода Roegneria С. Koch.................................22

1.2.4. Гипотезы происхождения гаплома Y.............................25

1.3. Комплексный подход в применении классических и современных методов систематики и таксономии.................................26

1.3.1. Биосистематический подход к изучению растений и их

видовой принадлежности......................................26

1.3.2. Применение белковых маркеров в биосистематике.................30

1.3.3. Молекулярно-генетические аспекты как современный инструмент

для классификации таксонов рода Elymus........................32

1.3.4. Таксономические трудности видов StY-геномной группы...........37

Глава 2. Материалы и методы..........................................40

2.1. Материалы.....................................................40

2.2. Сравнительно-морфологический анализ.............................41

2.3. Экстракция и электрофорез белков зерновки и гистона HI.............43

2.4. Анализ полиморфизма межмикросателлитных повторяющихся последовательностей (ISSR, inter simple sequence repeats) ДНК..........46

2.5. Статистический анализ...........................................48

2.6. Гибридизация и оценка наследования морфологических

признаков......................................................49

Глава 3. Таксономические отношения между видами

StY-геномной группы подсекции Curvati рода Elymus

на территории Азиатской России................................52

3.1. Взаимоотношения центрально-азиатских видов Е. fedtschenkoi, Е. nevskii и Е. praeruptus....................................................52

3.1.1. Номенклатура и синонимика....................................53

3.1.2. Морфологическая дифференциация..............................54

3.1.3. Анализ изменчивости запасных белков эндосперма................62

3.1.4. Взаимоотношения видов, выявляемые молекулярно-генетическими методами....................................................68

3.1.5. Репродуктивные взаимоотношения видов.........................75

3.2. Внутривидовой полиморфизм по морфологическим признакам

и спектрам запасных белков эндосперма Е. gmelinii...................77

3.2.1. Номенклатура и синонимика....................................77

3.2.2. Анализ изменчивости морфологических признаков.................84

3.2.3. Анализ изменчивости биохимических признаков..................95

Глава 4. Изменчивость и таксономические отношения видов внутри и между

подсекциями Pendulini и Ciliares рода Elymus.................... 106

4.1. Изменчивость и таксономические взаимоотношения между видами подсекции Pendulini'. Е. pendulinus, Е. brachypodioides

и Е. vernicosus................................................. 106

4.1.1. Номенклатура и синонимика...................................106

4.1.2. Анализ изменчивости морфологических признаков................113

4.1.3. Анализ изменчивости биохимических признаков................. 121

4.1.4. Молекулярно-генетический анализ............................. 124

4.1.5. Репродуктивные взаимоотношения видов Е. pendulinus,

Е. brachypodioides и Е. vernicosus...............................129

4.2. Уровни морфологической и биохимической специфичности и репродуктивной обособленности видов подсекции Ciliares:

Е. ciliaris и Е. amurensis......................................... 146

4.2.1. Номенклатура и синонимика...................................146

4.2.2. Анализ изменчивости морфологических признаков................153

4.2.3. Анализ изменчивости биохимических признаков................. 164

4.2.4. Уровни репродуктивной обособленности Е. ciliaris и

Е. amurensis.................................................171

4.3. Возможность интрогрессии между видами Е. ciliaris и Е. pendulinus в связи с

гипотезами происхождения Е. amurensis........................... 176

4.3.1. Методологические предпосылки для установления филогении

Е. amurensis.................................................176

4.3.2. Сравнительный анализ по экспериментальным данным............ 180

Глава 5. Форма верхних цветковых чешуй у видов с разной геномной

конституцией и применение этого признака для целей таксономии

в роде Elymus............................................... 192

Глава 6. Конспект видов рода Elymus с геномом StY

на территории Азиатской России...............................201

Выводы............................................................206

Список сокращений..................................................208

Список литературы..................................................209

Введение

Актуальность проблемы. Дикорастущие виды трибы Triticeae Dum. являются близкими сородичами основных хлебных культур злаков (сортов мягкой и твердой пшеницы, ячменя посевного, ржи посевной) и поэтому привлекают внимание исследователей, как богатый резерв для их дальнейшей селекции. Самым крупным в трибе, широко распространенным и обширным по биоразнообразию является род многолетних трав - Elymus L. Прямые скрещивания хлебных злаков с участием видов Elymus к настоящему времени не принесли сколько-нибудь значимых результатов (Lu et al., 1990, 1991), поэтому в области селекции на первый план выходят методы генной инженерии. В рамках фундаментальных исследований рода наиболее острыми следует рассматривать вопросы филогении, видообразования и микроэволюции. Именно поэтому задачи таксономии, как инструмента изучения природного разнообразия, остаются чрезвычайно актуальными, так как неадекватная классификация генотипов и неверное определение видовой принадлежности и присвоение таксономического ранга могут привести к ошибочным выводам на любом этапе познания. В связи с такой постановкой проблемы важно отметить необходимость проведения комплексных исследований на основе как традиционных методов систематики растений, так и современных методов экспериментальной биологии и молекулярной генетики.

По результатам цитогенетических исследований видов трибы Triticeae известно, что род Elymus s. 1. образован видами с различной геномной конституцией. В Азиатской России распространены виды только трех гапломных комбинаций: SH, SY, SHY. В отличие от SH и SHY-геномных видов, SY-геномная группа видов до сих пор специально не изучалась.

При последней ревизии рода Elymus во флоре России была построена общепринятая система, в которой StY-геномные виды входят в состав двух секций Goulardia (Husn.) Tzvelev и Clinelymopsis (Nevski) Tzvelev, наряду с видами другой геномной конституции. В Азиатской части России распространены

только виды из секции Goulardia. При этом видовой ранг некоторых близкородственных таксонов вызывает сомнение.

Цель и задачи исследования. Цель работы - комплексное исследование таксономических взаимоотношений и уровней родства StY-геномных видов рода Elymus на территории Азиатской России. Для достижения данной цели нами были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать таксономические взаимоотношения центрально-азиатских видов Е. fedtschenkoi, Е. nevskii и Е. praeruptus, используя сравнительно-морфологический, эколого-географический, биохимический (запасные белки эндосперма) и молекулярно-генетический методы.

2. Изучить полиморфизм и специфичность Е. gmelinii на основе морфологических, эколого-географических и биохимических критериев в сравнении с морфологически близкими видами Е. fedtschenkoi и Е. pendulinus. Оценить целесообразность отнесения Е. gmelinii к подсекции Curvati.

3. Проследить таксономические связи между видами Е. pendulinus, Е. brachypodioides и Е. vernicosus с использованием морфологических, эколого-географических и репродуктивных критериев, биохимических (электрофорез запасных белков эндосперма и гистона Н1) и молекулярно-генетических ISSR-маркеров.

4. Определить уровни морфологической, биохимической и репродуктивной обособленности и таксономический ранг Е. ciliaris и Е. amurensis.

5. Определить возможность интрогрессии между видами Е. ciliaris и Е. pendulinus в связи с гипотезами происхождения Е. amurensis.

6. Проверить достоверность признака формы верхних цветковых чешуй, как диагностического, для разделения видов с разной геномной конституцией на уровне секции.

7. Провести ревизию и уточнить таксономическую систему изученных видов.

Защищаемые положения:

1. Изучение отношений скрещиваемости между биотипами видов рода Elymus и последствий гибридизации в поколениях является одним из эффективных методов для выявления особенностей взаимоотношений таксонов на микроэволюционном уровне.

2. Результаты комплексных исследований взаимоотношений видов StY-геномной группы рода Elymus на территории Азиатской России позволяют рассматривать их в пределах новой самостоятельной секции Gmelinia и 4 подсекций.

Научная новизна работы. Впервые на основании геномной системы классификации, виды StY-геномной группы рода Elymus на территории Азиатской России были тщательно изучены с позиций биосистематики. Впервые исследованы взаимоотношения видов из различных секций рода, несущих общий геном, с применением комплексного методического подхода, включающего сравнительно-морфологический, эколого-географический, биохимический (электрофорез запасных белков эндосперма), молекулярно-генетический методы, а также метод гибридизации. У изучаемой группы выявлены наиболее стабильные морфологические признаки, которые могут быть использованы в таксономии. Показано генетическое единство близкородственных видов и вариабельность многих диагностических признаков. На основании полученных данных StY-геномная группа видов выделена в отдельную секцию и построена ее система. Выделены одна новая секция и одна подсекция.

Личный вклад автора. Основная часть работы выполнена автором самостоятельно. Опыты по электрофоретическому разделению гистона Н1 выполнены к.б.н. Д.Е. Никоновой. Также в работу были включены некоторые результаты электрофореза запасных белков эндосперма семян, полученные ранее д.б.н. A.B. Агафоновым и к.б.н. Д.Е. Никоновой. ISSR анализ StY-геномной группы видов был проведен при участии C.B. Асбаганова и к.б.н. Д.Е. Никоновой. Статистическая обработка электрофоретических опытов по теме

взаимоотношения видов Е. ciliaris - Е. pendulinus с использованием программы BioNumerics выполнена С. И. Татьковым .

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для дальнейшего пересмотра таксономического состава рода Elymus на основе сочетания классических и новых (экспериментальных) методов исследования. Применение комплексного методического подхода при изучении межвидовой и внутривидовой изменчивости имеет практическое значение при отборе генотипов для интродукции, селекции и сохранения их в генбанках для решения вопросов охраны природного генофонда пшеницевых.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 11 всероссийских и международных конференциях, среди которых: II (IV) Всерос. молодежная научно-практ. конф. "Перспективы развития и проблемы современной ботаники" (Новосибирск, 2010); IV Междунар. конф. "Проблемы изучения растительного покрова Сибири" (Томск, 2010); V Всерос. конф. с междунар. участием "Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока" (Красноярск, 2010); Всерос. конф., посвящ. 65-летию Центрального сибирского ботанического сада и 100-летию со дня рождения проф. К.А. Соболевской и A.B. Куминовой "Проблемы сохранения растительного мира Северной Азии и его генофонда" (Новосибирск, 2011); Междунар. научн. конф. "Растительный мир и его охрана" (Алматы, Казахстан, 2012); X и XI Междунар. научно-практ. конф. "Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии" (Барнаул, 2011, 2012); II (X) Междунар. бот. конф. молодых ученых (Санкт-Петербург, 2012). I научно-практ. конф. "Ботаническое образование в России: прошлое, настоящее, будущее" (Новосибирск, 2013); 7-ой Междунар. симпозиум по Пшеницевым "7 International Triticeae Symposium" (Chengdu, China, 2013); Всерос. конф. "Растительный мир Северной Азии: проблемы изучения и сохранения биоразнообразия" (Новосибирск, 2013).

Публикации. По материалам диссертации автором опубликовано 14 работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК.

Структура диссертации. Работа состоит из введения, шести глав, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 227 страницах, включает 35 таблиц и 89 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 240 источников, из них 147 на иностранных языках.

Благодарности. Исследования проведены при финансовой поддержке: РФФИ (грант № 08-04-00747, № 11-04-00861, № 12-04-10144), НО "Благотворительный фонд культурных инициатив (Фонд Михаила Прохорова)", гранта поддержки молодых ученых ведущих высших учебных заведений и научных исследовательских центров компании ОПТЭК, 2012 г. (Carl Zeiss AG, Германия).

Искренне благодарю своих руководителей д.б.н. A.B. Агафонова и д.б.н. C.B. Овчинникову, которые направляли меня при выполнении работы и многому меня научили. Выражаю искреннюю признательность моим первым учителям — сотрудникам лаборатории интродукции пищевых растений ЦСБС СО РАН и особенно к.б.н. И.Г. Боярских, за полученный опыт в области интродукции растений и привитый интерес к научной работе.

Считаю своим долгом выразить благодарность проф., д.б.н. О.В. Дорогиной, C.B. Асбаганову, к.б.н. Д.Е. Никоновой, к.б.н. Н.С. Звягиной, Dr. В. Salomon (Swedish University of Agricultural Sciences, Dept. of Plant Breeding and Biotechnology, Alnarp, Sweden) за помощь в проведении исследований и критическое обсуждение результатов, д.б.н. Н.С. Пробатовой (БПИ ДВО РАН) за ценные консультации, ученому секретарю д.б.н. Е.В. Байковой за ценные советы при выполнении работы.

Я признательна кураторам и сотрудникам гербариев научных учреждений Санкт-Петербурга, Владивостока, Новосибирска, Барнаула, Томска, Улан-Удэ за предоставленную возможность работы с коллекциями.

Благодарю сотрудников Алтайского филиала ЦСБС СО РАН "ГорноАлтайский ботанический сад" за помощь в проведении экспедиционных исследований, A.A. Красникова, C.B. Лукьянчикова и И.Г. Селютина за техническую и редакционную помощь при оформлении работы.

Благодарю своих родителей и коллег за постоянную помощь и поддержку.

Глава 1. Общая характеристика, видовой состав и распространение видов 8тУ-геномной группы рода еьтмих Ь.

1.1. Положение, объем и геномный состав рода Elymus в трибе Triticeae сем.

Роасеае

1.1.1. Краткая характеристика рода Elymus

Род Elymus L. (Пырейник) относится к дикорастущим многолетним травам трибы Triticeae Dum. (Пшеницевые) из семейства Роасеае Barnh. (Мятликовые или Злаки). По последним данным в роде насчитывается около 100 видов (Цвелев, Пробатова, 2010), таким образом, Elymus - самый большой род в трибе Triticeae. Представители рода распространены на всех континентах, кроме Антарктиды, не менее половины видов представлены в Евразии, и центральноазиатская часть этого континента считается родиной Elymus. Представители рода встречаются во всех внетропических климатических поясах и на высотах до 5000 м над уровнем моря, а отчасти и в горных районах тропиков (Цвелев, Пробатова, 2010), и занимают самые разнообразные экологические ниши.

Виды рода Elymus - растения 15-200 см высотой, чаще дерновинные, редко короткокорневищные. Стебель прямой, с расставленными узлами и линейными листьями. Колосья прямые или поникающие, обычно линейные имеют по 1, реже 2-3 (4) колоска с нераспадающейся при плодах осью (Цвелев, 1976; Цвелев, Пробатова, 2010). Цветки обоеполые, имеющие короткие ножки, составляющие членистую колосковую ось.

Основная форма опыления у большинства видов рода - самоопыление, но многие виды также способны и к перекрестному опылению (факультативные самоопылители). Самоопыление обеспечивает высокую семенную продуктивность даже при низкой плотности популяции растений, и становится возможным благодаря трём основным факторам: большому количеству пыльцы, которая созревает одновременно с женскими гаметофитами, отсутствию генетических систем самонесовместимости, полиплоидной природе генома,

которая обеспечивает гетерозиготность по большому числу признаков, что помогает лучше приспосабливаться к неблагоприятным условиям среды.

Род является полиморфным и морфологические границы некоторых видов, в силу широкой вариабельности признаков, становятся менее очевидными, в особенности, если перекрываются показатели признаков. Даже внутри одного вида встречается существенное морфологическое разнообразие, вызванное широкой нормой реакции и адаптации к различным условиям среды. Одной из причин существенной вариабельности видов послужила их способность к образованию множества межвидовых и межродовых гибридов. Результаты искусственной гибри�