Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм ферментов метаболизма ксенобиотиков и антиоксидантной защиты и развитие гепатотоксических реакций у больных туберкулёзом легких

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм ферментов метаболизма ксенобиотиков и антиоксидантной защиты и развитие гепатотоксических реакций у больных туберкулёзом легких"

005002737

На правах рукописи

Кудряшов Алексей Владимирович

ПОЛИМОРФИЗМ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА КСЕНОБИОТИКОВ И АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ И РАЗВИТИЕ ГЕПАТОТОКСИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ У БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЁЗОМ ЛЕГКИХ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 НОИ 2011

Новосибирск - 2011

005002737

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Вавилин Валентин Андреевич Научный консультант:

доктор медицинских наук Колпакова Татьяна Анатольевна Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Гимаутдинова Ольга Ивановна кандидат медицинских наук Воронцова Елена Владимировна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт хи> мической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Защита состоится « 6 » декабря 2011 в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 011.034.01 в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биохимии Сибирского отделения РАМН (630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2; тел.: 8 (383) 333-54-81).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института биохимии Сибирского отделения РАМН

Автореферат разослан «31 » октября 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Г.С. Русских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. По данным ВОЗ ежегодно в мире заболевают туберкулёзом 9,4 миллиона и умирают 1,3 миллиона человек (http://www.who.int/tb/publications/global_report/2010/en/index.html). Заболеваемость туберкулёзом органов дыхания в России в 2010 году составила 67,31 на 100 тысяч населения (http://12.rospotrebnadzor.ru/diretions/profilaktika/48877/). Одной из основных проблем, связанных с лечением больных туберкулёзом, является рост распространенности лекарственно-устойчивых штаммов микобак-терий туберкулёза (МБТ), достигающей в'России 30% у больных с впервые выявленным туберкулёзом легких и 60% у больных с рецидивами (Стрелис и со-авт., 2009). Распространение устойчивых штаммов МБТ требует усиления режимов терапии, что приводит к росту числа побочных реакций на противотуберкулезные препараты (ПТП). Наиболее частыми побочными реакциями является гепатотоксические (ГТР), их частота развития достигает 47% (Huang, 2007). Проявления ГТР варьируют от повышения уровня трансаминаз до развития тяжелого гепатита, заканчивающегося смертельным исходом (Полунина, 2005). Поражения печени с функциональной недостаточностью часто развиваются на фоне дозозависимого повышения уровня трансаминаз (Russmann et al., 2009). При исследовании причин возникновения ГТР большое внимание придаётся метаболизму ПТП. Биологические эффекты химических соединений в значительной мере зависят от их структурных изменений, возникающих в результате метаболизма. Последний, осуществляемый ферментами биотрансформации ксенобиотиков (ФБК), характеризуется большой межиндивидуальной вариабельностью, достигающей 103-104 (Guengerich, 2003), которая главным образом обусловлена генетическим полиморфизмом ФБК. Поэтому прилагаются активные усилия по поиску полиморфных вариантов генов ФБК, обусловливающих риск побочных эффектов лекарств.

Изониазид является основным препаратом при лечении туберкулеза. В его метаболизме важную роль играет N-ацетилтрансфераза 2 (NAT2). Большинство исследователей сходятся во мнении, что пациенты с генотипом медленного ацетилирования более предрасположены к ГТР, по сравнению с быстрыми ацетиляторами (Ohno et al., 2000; Huang et al., 2002; Higuchi et al., 2007; Lee et al., 2010). Тем не менее, существуют работы, обозначившие фенотипически быстрых ацетиляторов как группу риска развития ГТР при лечении туберкулеза (Mitchell et al., 1976), либо не обнаружившие ассоциаций с генотипом NAT2 (Roy et al., 2001; Yamada et al., 2009). Противоречия могут быть следствием по-пуляционных различий и внешних условий, поэтому необходимо анализировать эти ассоциации в каждой конкретной популяции. Кроме того, показано неполное соответствие генотипа NAT2 фенотипу ацетилирования (Cascorbi et al., 1995, Le Marchand et al., 1996). Поэтому существует проблема выбора между генетическими и фенотипическими маркерами в прогнозировании ГТР.

Кроме NAT2 важную роль в метаболизме изониазида играет цитохром Р450 2Е1 (CYP2E1). CYP2E1 окисляет метаболит изониазида - ацетилгидразин

- с образованием токсических метаболитов (Roy, 2008). Показана связь отдельных полиморфизмов CYP2E1 с ГТР. Однако имеющиеся в литературе данные противоречивы (Huang et al., 2003; Bose et al., 2010), а в популяциях России эта связь остается неизученной.

Поскольку образование реактивных метаболитов и вызываемый ими окислительный стресс в клетках печени является конечным результатом взаимодействия противотуберкулёзных препаратов с ФБК, большую роль в защите от гепатотоксичности могут играть ферменты антиоксидантной защиты, в частности, глутатион S-трансферазы (GST). Из экспрессируемых в печени изофер-ментов GST потенциально важными могут быть GSTM1 и GSTT1, для которых описан нуль-полиморфизм, проявляющийся полным отсутствием белков (Sei-degard et al., 1988; Pemble et al., 1994). Также важна GSTA2 как представитель наиболее экспрессируемого в печени подсемейства (более 3 % цитозольного белка), для которой установлен полиморфизм, проявляющийся изменением экспрессии (Ning, 2004), и GSTP1, представленная в печени в небольшом количестве (Nishimura et al., 2006), но играющая важную роль в регуляции ответа организма на окислительный стресс и апоптоза через пути сигнальной транс-дукции. (Adler et al., 1999; Bernardini et al., 2000). В литературе мы не обнаружили исследований связи полиморфизма GSTA2 и GSTP1 с токсичностью ПТП, а полиморфизм GSTA2 в популяциях России не определялся вообще. В немногочисленных работах по изучению связи с гепатотоксичностью ПТП нуль-полиморфизма GSTM1 и GSTT1 авторы выявляют ассоциации либо для делеции GSTM1 (Roy et al., 2001; Huang, et al., 2007), либо GSTT1 (Leiro et al., 2008).

Таким образом, развитие ГТР зависит от функционального взаимодействия ферментов, участвующих в наработке токсических метаболитов и детоксификации их и/или устранении последствий вызванного ими окислительного стресса. Изучение роли фармакогенетических и фенотипических особенностей пациента расширит возможности прогнозирования и профилактики лекарственных осложнений при терапии туберкулеза.

Цель исследования - выявление полиморфных вариантов генов ферментов, участвующих в биотрансформации противотуберкулёзных препаратов и антиоксидантной защите, а также особенностей фармакокинетики, ассоциированных с гепатотоксическими реакциями при лечении больных туберкулёзом.

Задачи:

1. Охарактеризовать активность N-ацетилтрансферазы 2 и амидазы по фар-макокинетике изониазида и пиразинамида у больных туберкулёзом легких.

2. Определить частоты полиморфных вариантов генов NAT2, CYP2E1, GSTA2, GSTM1, GSTT1, GSTP1 в исследуемой выборке больных.

3. Определить соотношение генотипов NAT2 и фенотипов ацетилирования.

4. Проанализировать связь сывороточных активностей аланинаминотранс-феразы и аспартатаминотрансферазы с фармакокинетическими параметрами изониазида и пиразинамида.

5. Проанализировать связь полиморфных вариантов генов NAT2, CYP2E1, GSTA2, GSTM1, GSTT1 и GSTP1 с повышением уровней аланинаминотрансфе-разы и аспартатаминотрансферазы.

Научная новизна исследования. Впервые в России охарактеризована частота встречаемости полиморфных вариантов 63G>C 5 экзона, 83А>С 7 эк-зона гена GSTA2 и-71 G>T, С>Т(F421F) гена CYP2E1.

Предложен новый метод определения полиморфизмов 313A>G и 341С>Т гена GSTPI с использованием аллель-специфичной ПЦР с последующим ПДРФ-анализом. Данный метод позволяет определить сцепление локусов 313 и 341. Разработаны новые способы определения полиморфизмов 63G>C 5 экзона, 83А>С 7 экзона гена GSTA2 и -71G>T, 7632Т>А , С>Т{F421F) гена CYP2E1 с помощью ПДРФ-анализа. Предложен новый способ определения полиморфизма 341Т>С гена NAT2 с использованием аллель-специфичной ПЦР.

Впервые путем анализа связи полиморфных вариантов генов ферментов, участвующих в метаболизме противотуберкулезных препаратов и антиокси-дантной защите с гепатотоксическими реакциями в условиях интермиттирую-щего и ежедневного приема ПТП показано, что эта связь меняется в зависимости от режима терапии. Впервые в мире показано, что генотип 63СС 5 экзона GSTA2 предрасполагает к развитию гепатотоксических реакций при интермит-тирующем приеме противотуберкулезных препаратов, при ежедневном приеме этот генотип напротив связан с устойчивостью к развитию гепатотоксических реакций. Впервые в мире показано, что генотип GSTP1*A/B предрасполагает к развитию гепатотоксических реакций у больных с интермиттирующим режимом терапии, при ежедневном режиме терапии этот генотип не проявляет себя. Впервые в России показано, что генотип CYP2E1*7632TA связан с усилением гепатотоксических реакций. Также впервые в России показано, что гомозиготная делеция GSTTI предрасполагает к гепатотоксическому действию противотуберкулёзных препаратов при их ежедневном приеме.

Практическая значимость работы. Предложены новые способы определения полиморфизмов генов NAT2, CYP2E1, GSTA2, GSTP1, которые могут применяться в исследованиях, связанных с изучением функциональных проявлений полиморфизмов, а также в популяционно-генетических и генетико-эпидемиологических исследованиях.

Найденные достоверные ассоциации генетических и фенотипических маркеров с гепатотоксическими реакциями при лечении туберкулёза могут быть использованы для прогнозирования и профилактики лекарственного поражения печени у пациентов с интермиттирующим и ежедневным режимом терапии. Результаты работы могут быть использованы в учебно-методическом процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Медленный метаболизм пиразинамида и изониазида предрасполагает к гепатотоксическому действию противотуберкулёзных препаратов при ежедневном режиме терапии.

2. Носители генотипов NAT2, кодирующих фенотип медленного ацетилиро-вания, и генотипа -7632ТА CYP2E1 более подвержены гепатотоксическому действию противотуберкулёзных препаратов.

3. Наличие полиморфных вариантов генов глутатион S-трансфераз, уменьшающих их экспрессию и активность, усиливает гепатотоксическое действие противотуберкулёзных препаратов. Их значение более выражено при интер-митгирующем приеме и уменьшается при увеличении дозовой нагрузки при ежедневном приеме.

4. Сочетание полиморфных вариантов N-ацетилтрансферазы 2 и цитохрома Р450 2Е1, усиливающих генерацию токсичных метаболитов противотуберкулёзных препаратов и вариантов глутатион S-трансфераз А2 и PI, ослабляющих антиоксидантную защиту, способствует развитию гепатотоксических реакций.

Апробация работы. Материалы исследования были представлены на 3-й международной конференции «Basic Science for Medicine», (Новосибирск, 2007); на XII Международной Экологической Студенческой Конференции «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2007); на XLVI Международной Научной Студенческой Конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2008); на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); на конференции «Ehrlich II - 2nd World Conference on Magic Bullets» (Nürnberg, 2008); на научно-практической конференции с международным участием, посвященной 25-летию кафедры клинической фармакологии ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова Росздрава (2 тезиса, Москва, 2009); на межрегиональной научно-практической конференции «Молекулярные основы персонификации лекарственной терапии» (Новосибирск, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 2 в рекомендованных ВАК журналах и 1 статья в сборнике.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и список литературы, включающий 28 отечественных и 206 иностранных источников. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками, содержит 27 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Больные туберкулёзом легких, не состоящие в родстве между собой, 145 человек в возрасте от 17 до 74 лет, 98 мужчин и 47 женщин, наблюдались в клинике ФГУ «Новосибирский НИИ туберкулёза». Схема исследования представлена на рис. 1. Все больные были изначально разделены на две группы по режиму терапии. Пациенты I группы (75 человек, 18-74 года, 47 мужчин, 28 женщин) принимали противотуберкулёзные препараты в интермитгирующем режиме 2 раза в неделю. Изониазид 12 мг/кг и рифампицин 10 мг/кг вводили внутривенно-капельно, пиразинамид 25 мг/кг и этамбутол 20 мг/кг принима-

лись внутрь (per os), стрептомицин 16 мг/кг вводили внутримышечно. Пациенты II группы (70 человек, 17-60 лет, 51 мужчина, 19 женщин) ежедневно принимали внутрь изониазид 10 мг/кг, пиразинамид 25 мг/кг и рифампицин 10 мг/кг, стрептомицин 16 мг/кг вводили внутримышечно. Клиническое наблюдение и сбор материала осуществлялись под руководством д.м.н. Колпаковой Т.А. в терапевтических отделениях НИИ туберкулёза. Определение маркеров гепатотоксичности - сывороточных активностей аланинаминотрансферазы (AJIT) и аспартатаминотрансферазы (ACT) производилось там же. Активности этих ферментов определялись при поступлении и в плановом порядке через один месяц после начала лечения, либо ранее при появлении симптомов ГТР. Пациенты, не имеющие данных по активности AJIT и ACT, либо имеющие значения АЛТ и/или ACT более 50 ед/л при поступлении, исключались из расчетов, включающих эти показатели. В расчетах, включающих АЛТ, использовали данные по 66 пациентам с интермиттирующим приемом ПТП и 54 пациентам с ежедневным приемом ПТП. В расчетах, включающих ACT, были взяты данные по 54 пациентам с интермиттирующим и по 52 пациентам с ежедневным приемом ПТП. Определение фармакокинетики изониазида и пиразинамида, а также генетического полиморфизма N-ацетилтрансферазы 2 (NAT2), глутатион S-трансферазы PI (GSTP1), глутатион S-трансферазы А2 (GSTA2), глутатион S-трансферазы Ml (GSTM1), глутатион S-трансферазы TI (GSTT1) и цитохрома Р450 2Е1 (CYP2E1) проводилось по месту выполнения работы в лаборатории метаболизма лекарств и фармакокинетики НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН. Фармакокинетика пиразинамида и его метаболита - пирази-ноевой кислоты была определена у 37 пациентов с интермиттирующим приемом ПТП и 52 пациентов с ежедневным приемом ПТП. Фармакокинетика изо-низида была определена только у пациентов с интермиттирующим приемом ПТП (52 чел). Разделение ПТП производили с помощью градиентной ион-парной обращенно-фазовой ВЭЖХ по методу Кожановой Л.А. (ЗАО Институт хроматографии «Эконова»), Калибровку проводили по внешним стандартам. Для построения калибровочного графика проводился регрессионный анализ в программе Statîstica. Для расчета фармакокинетических параметров использовалась программа ASKID (Дорохов, Холодов, 1996).

Выделение ДНК из цельной крови осуществляли стандартным фенол-хлороформным методом. Определение полиморфных вариантов 111Т>С, 190С>Т, 191G>A, 282С>Т, 434А>С, 481 ОТ, 590G>A, 803A>G, 857G>A и 859Del гена NAT2; -1293G>C (PstI), -10530T (Rsal), -71G>T, 7632T>A (Dra I) и ОТ (Phe421Phe) гена CYP2E1, 63G>C 5 экзона (rs2180314) и 83A>C (rs6577) 7 экзона гена GSTA2 определяли методом ПДРФ с помощью опубликованных (Lum, Marchand, 1998; Никишина, 2007) и оригинальных способов. Замену 3411>С гена NAT2 определяли с использованием аллель-специфичной ПЦР. Полиморфные варианты 313A>G (rsl695) и 34ЮТ (rsl 138272) гена GSTP1 определяли собственным методом, в котором сначала проводили аллель-специфичную ПЦР, позволяющую определить генотип по замене 34ЮТ, а за-

тем обработку продуктов ПЦР эндонуклеазой рестрикции В$1МА1 с последующим разделением продуктов гидролиза в 12% полиакриламидном геле. Данный метод позволяет определить сцепление локусов 313 и 341. Для определения полиморфизма числа тандемных повторов в промоторе СУР2Е1 использовали метод Ни ^ а1. (1999). Делеционный полиморфизм ОБТМ1 и СБТТ] определяли с использованием ПЦР с детекцией в реальном времени по протоколу "ТаяМап" по методике, предложенной ВгазсЬ-АпёегБеп е1 а1. (2004) и ВесНа§а е! а1. (2008).

Группа 1 Группа II

(интермиттирующий прием) (ежедневной прием)

клиническим этап

биохимический этап

Рис. 1. Схема организации исследования.

Для анализа соответствия распределения генотипов равновесию Харди-Вайнберга использовали программу Hwe_win (M. Фрейдин, Томск, 1999). Отношения шансов для генотипов рассчитывали с использованием программы Epi Info 6. Для анализа остальных результатов использовали программу Statistica V. 9.1. Достоверность увеличения AJIT и ACT в процессе лечения определяли по критерию Вилкоксона. Достоверность различий АЛТ и ACT между подгруппами определяли по критерию Манна-Уитни. Достоверность корреляции фарма-кокинетических параметров с активностями трансаминаз определяли по критерию Спирмена. Значения р<0,05 признавали статистически достоверными.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Параметры фармакокинетики пиразинамида и их соотношение с биохимическими маркерами развития гепатотоксических реакций. Распределение большинства фармакокинетических параметров пиразинамида не соответствовало нормальному (табл. 1). При анализе корреляций фармакокинетических параметров пиразинамида с активностями АЛТ и ACT на 1 месяце лечения, была обнаружена только достоверная обратная корреляция клиренса с активностью ACT на 1 месяце лечения в группе с ежедневным приемом ПТП (г = -0,311; р = 0,0424). Остальные корреляции не были достоверными (р > 0,05).

Поскольку в распределении фармакокинетических параметров не удавалось выделить четкой антимоды, для усиления чувствительности поиска связи

фармакокинетики пиразинамида с повышением AJIT и ACT в процессе лечения, мы сравнили пациентов с клиренсом выше 75% квартиля и ниже 25% квартиля, условно обозначенных нами как «быстрые метаболизеры» и «медленные метаболизеры» пиразинамида. В группе с интермиттирующим приемом достоверного повышения АЛТ или ACT не было выявлено ни у «быстрых», ни у «медленных метаболизеров». В группе с ежедневным приемом достоверное повышение АЛТ и ACT в процессе лечения наблюдалось только у «медленных метаболизеров» (р = 0,005, табл. 2).

При сравнении активностей трансаминаз на 1 месяце лечения у «быстрых» и «медленных метаболизеров» пиразинамида по критерию Манна-Уитни в группе с интермиттирующим приемом ПТП достоверных различий не наблюдалось. В группе с ежедневным приемом ПТП сывороточная активность ACT была достоверно выше у пациентов с медленным метаболизмом пиразинамида по сравнению с пациентами с быстрым метаболизмом (р = 0,0073, табл. 2). Таким образом, медленный метаболизм пиразинамида связан с более сильным повреждением печени при приеме ПТП, но эта закономерность проявляется только при ежедневном режиме терапии. Для пиразинамида предполагаются два механизма токсичности: первый проявляется за счет его метаболита - пирази-ноевой кислоты, вызывающей уменьшение мембранного потенциала (Григорян, Салов, 1976). Второй механизм связан с тем, что пиразинамид является структурным аналогом никотинамида (Фисенко, 2006), и поэтому может ингибиро-вать ферменты, использующие никотинамид в качестве кофактора. Более высокие активности сывороточных трансаминаз у «медленных метаболизеров» пиразинамида указывают на важную роль второго механизма токсичности. Роль механизма токсичности, связанного с уменьшением мембранного потенциала, подтверждал тот факт, что пациенты с более высоким средним временем удержания пиразиноевой кислоты имели более высокие значения АЛТ.

Фармакокинетика изониазида и её соотношение с биохимическими маркерами развития гепатотоксических реакций у больных с интермиттирующим приемом ПТП. Распределение большинства фармако-кинетических параметров изониазида являлось бимодальным, в связи с этим мы выделили группы фенотипически быстрых (БА) и медленных (МА) ацетилято-ров. Пациенты со значениями клиренса >3,5 мл/мин/кг были отнесены к фенотипу быстрого ацетилирования, а пациенты со значениями < 3,5 мл/мин/кг - к фенотипу медленного ацетилирования. При анализе повышения активностей АЛТ и ACT в динамике лечения, у МА наблюдалось достоверное повышение АЛТ по критерию Вилкоксона (р — 0,014), тогда как у Б А достоверного повышения АЛТ не наблюдалось. Повышение активности ACT было на грани статистической достоверности у МА (р = 0,053) и не достигало статистической достоверности у БА (р = 0,66, табл. 3).

Полиморфизм N-ацетилтрансферазы 2 и биохимические маркеры развития гепатотоксических реакций. Распределение генотипов NAT2 соответствовало распределению Харди-Вайнберга для всех исследованных полиморфиз-

Таблица 1. Фармакокинетические параметры пиразинамида

Группа Фармакокинетический параметр Медиана 25% квартиль 75% квартиль Минимум Максимум

Интерм. прием (N = 37) Клиренс, мл/мин/кг 0,782 0,688 1,01 0,449 2,11

Константа элиминации, ч"1 0,096 0,080 0,122 0,042 L 0,249

Время полуэлиминации, ч 7,17 5,69 8,61 2,78 16,5

АиС, мкг/мл/ч 426 331 484 158 743

Ежедн. прием (N-52) Клиренс, мл/мин/кг 0,986 0,748 1,32 0,161 2,28

Константа элиминации, ч"1 0,101 0,080 0,123 ■0,027 0,354

Время полуэлиминации, ч 6,81 5,635 8,625 1,96 26

АЦС, мкг/мл/ч 422 315,5 497,5 182 894

Таблица 2. Активности АЛТ и ACT в динамике лечения у «быстрых» (БМ) и «медленных (ММ) метаболизеров»

пиразинамида

п) С Фено- N АЛТ (ед/л): медиана (границы интерквартильных отрезков) р по Вил- р по Манна-Уитни N ACT (ед/л): медиана (границы интерквартильных отрезков) р по Вил-коксону р по Манна-Уитни

а. тип При поступ- На 1 месяце коксону При поступле- На 1 месяце ле-

лении лечения нии чения

Иьггерм БМ 6 13,5 (9-22) 28,5 (6-73) 0,21 0,77 7 23(19-38) 31 (18-58) 0,50 0,23

ММ 9 13(10-17) 15(12-27) 0,21 8 19(17-24) 22,5(18,5-26,5) 0,29

прием всего 30 14 (10-22) 19,5 (14-42) 0,016 - 29 23 (19-34) 23(18-43) 0,20 -

Ежедн. БМ 10 21 (18-24) 20(12-36) 0,48 0,054 10 26 (20-31) 25(20-33) 0,68 0,0073

ММ 10 12(11-16) 36 (28 - 78) 0,0051 10 21,5 (20-26) 46,5 (33-76) 0,0051

всего 45 18(12-24) 27(19-52) 0,00012 - 43 23(18-28) 33(23-41) 0,000093 -

Таблица 3. Активности АЛТ и ACT в динамике лечения у быстрых (БА) и медленных (МА) ацетиляторов изониазида

Фенотип N АЛТ (ед/л): медиана (границы интерквартильных отрезков) Р N ACT (ед/л): медиана (границы интерквартильных отрезков) Р

При поступлении На 1 месяце лечения При поступлении На 1 месяце лечения

БА 19 15(10-22) 15(10-43) 0,87 19 24 (20-29) 22(16-37) 0,66

МА 26 15,5(12-33) 21,5(17-35) 0,014 21 21 (18-35) 27(20-32) 0,053

Всего 45 15(12-25) 20(14-35) 0,047 40 23(19-30) 23(18-34,5) 0,23

Примечание: р - уровень значимости различий по критерию Вилкоксона

мов. Однонуклеотидные полиморфизмы 111Т>С, 190С>Т, 19Ю>А, 434А>С, и делеция 859 нуклеотида не встречались в исследуемой выборке, предположительно, из-за их крайне низкой частоты в европеоидных популяциях. Частоты аллелей и генотипов NAT2 соответствуют их частотам в других европеоидных популяциях России и мира (García-Martín, 2009).

Поскольку полиморфизм NAT2 влияет на фенотип ацетилирования, а следовательно, и на токсичность, мы проанализировали связь повышения AJIT в процессе лечения с генотипом NAT2. Для анализа были взяты три несинонимичные, функционально значимые и встречающиеся с большой частотой в популяции замены: 341Т>С, 590G>A и 857G>A. Встречавшиеся в исследуемой выборке с ненулевой частотой замены 282С>Т, 48¡C>T\i 803A>G сами по себе не имеют выраженных функциональных проявлений, сцеплены с тремя вышеперечисленными заменами, крайне редко встречаются отдельно (http://louisville.edu/medschool/pharmaco1ogy/consensus-human-arvlamine-n-acetvlt ransferase-gene-nomenclature/nat pdf files/Human NA Т2 alleles.pdf) и поэтому в этом анализе не использовались. При сравнении активностей трансаминаз в динамике лечения по критерию Вилкоксона, в группе с ежедневным приемом наблюдалось достоверное увеличение активностей AJIT для генотипов 341СС7 590GG/857GG (р=0,012), 341TT/590AA7857GG (р=0,028), кодирующих фенотип медленного ацетилирования. В группе с интермитгирующим приемом повышение активности трансаминаз не достигало статистической достоверности, за исключением АСТ у пациентов с генотипом 341СС; 590GG; 857GG (р = 0,036).

Учитывая литературные данные о влиянии замен 341Т>С, 590G>A и 857G>A на фенотип ацетилирования (Hein, 2009), мы разделили пациентов на генетически быстрых, средних и медленных ацетиляторов. К быстрым ацетиля-торам относили только гомозиготные генотипы по аллелю «дикого типа» (отсутствие указанных замен); к средним - генотипы, включающие гетерозиготы только по одной из указанных замен; к медленным - генотипы, включающие мутантные гомозиготы по указанным заменам, а также гетерозиготы хотя бы по двум перечисленным заменам. У генетически медленных ацетиляторов наблюдалось достоверное повышение AJIT в процессе лечения как в группе с интермитгирующим (р=0,046), так и в группе с ежедневным приемом (р=0,000088). У средних ацетиляторов достоверное повышение AJIT отмечалось только в группе с ежедневным приемом ГГГП (р=0,027), у быстрых не наблюдалось вообще (табл, 4).

Полученные нами результаты подтвердили отмеченную в большинстве работ предрасположенность генетически и фенотипически медленных ацетиляторов к ГТР. Это объясняется тем, что статус медленного ацетилирования приводит к увеличению доли изониазида, подвергающейся гидролизу с образованием сильного гепатотоксина - гидразина. Кроме того, медленные ацетиляторы с меньшей скоростью превращают гидразин в ацетилгидразин, а ацетилгидра-зин - в относительно нетоксичный диацетилгидразин, что также увеличивает долю токсичных метаболитов изониазида.

Соотношение генотипов ]Ч-ацетилтрансферазы 2 и фенотипов ацети-лирования у пациентов с интермиттирующим приемом противотуберкулезных препаратов. Определение генотипа является менее трудоемким, более производительным, дешевым и, в силу этого, более привлекательным методом для индивидуализации терапии, чем определение фармакокинетики. Однако существует проблема частичного несоответствия генотипа и фенотипа, особенно для ферментов биотрансформации, для которых возможна индукция или ин-гибирование внешними факторами. Поэтому мы проанализировали распределение генотипов ЫАТ2 в диаграмме клиренса изониазида (Рис. 2). Для гена ИАТ2 были взяты замены 341Т>С, 5900А и 857в>А. Видно, что все гомозиготы по аллелю «дикого типа» являются фенотипически быстрыми ацетилято-рами, кроме того, к быстрым ацетиляторам относятся гетерозиготы <557(3А. В число медленных ацетиляторов попали мутантные гомозиготы 341СС и 590АА, а также гетерозиготы по заменам 341 и 857 одновременно. Среди остальных генотипов встречаются как быстрые, так и медленные ацетиляторы. Точность предсказания фенотипа по генотипу составила 86,5%.

о

Фенотип

быстрого

ацетилирования

<г~аитимода

Фенотип

медленного

ацетилирования

Рис. 2. Распределение генотипов ШТ2 в диаграмме клиренса изониазида (Ы - 52).

Фенотип ацетилирования определялся нами по клиренсу изониазида, характеризующему скорость его метаболизма ИАТ2. Элиминация изониазида в большей степени определяется его метаболизмом и в меньшей степени экскрецией. Наблюдаемое несоответствие некоторых генотипов фенотипу может объясняться ингибированием/индукцией фермента трудно учитываемыми внешними факторами (диета, сопутствующие заболевания). Поэтому наши данные указывают на то, что генетические тесты ИАТ2 более приемлемы для первичной корректировки доз в целях повышения безопасности терапии, тогда как для повышения эффективности предпочтительны фармакокинетические оценки.

Соотношение биохимических маркеров развития гепатоток-сических реакций и полиморфизма цитохрома Р450 2Е1. Распределение генотипов СУР2Е1 соответствовало распределению Харди-Вайнберга для всех

исследованных полиморфизмов. Частоты аллелей и генотипов CYP2EI примерно соответствуют их частотам в других европеоидных популяциях России и мира (Марусин и соавт., 2007; Neafsey et al., 2009).

При рассмотрении полиморфизмов CYP2E1 по отдельности, в группе с интермиттирующим приемом увеличение AJIT и ACT в процессе лечения почти нигде не достигало статистической достоверности, хотя наибольший подъем наблюдался у пациентов с гетерозиготным генотипом 7632ТА (р = 0,14), у четверти таких пациентов активность AJIT на 1 месяце лечения превышала верхнюю границу нормы. В группе с ежедневным приемом у пациентов с этим генотипом наблюдалось почти самое высокое и к тому же достоверное (р = 0,051) повышение АЛТ. Несмотря на то, что и во всей группе в целом повышение также было достоверно, медиана АЛТ на первом месяце лечения у пациентов с генотипом 7632ТА была в 2 раза выше, чем в среднем по группе и превышала верхнюю границу нормы.

Далее были проанализированы комбинации полиморфных вариантов CYP2E1, усиливающих согласно литературным данным экспрессию CYP2E1 (Neafsey et al., 2009) и, следовательно, токсичность, и те, для которых в предшествующих исследованиях показана ассоциация с гепатотоксичностью (Huang et al., 2003; Bose et al., 2011). Исходя из этого, были составлены комбинации генотипов, потенциально усиливающих токсичность. В группе с интермиттирующим приемом для таких комбинаций генотипов увеличение активностей трансаминаз было выше, чем в среднем по группе, но не достигало статистической достоверности. В группе с ежедневным приемом эта закономерность подтверждалась, причем повышение АЛТ достигало статистической достоверности, а значения 75% квартиля превышали верхнюю границу нормы (табл. 5).

CYP2E1 вносит вклад в токсичность изониазида, окисляя ацетилгидразин с образованием гепатотоксинов (Roy et al., 2008), следовательно, увеличение активности этого фермента должно проявляться усилением токсичности ПТП. Генотип CYP2E1*7632TA показал наибольшую связь с гепатотоксическими реакциями при терапии туберкулеза. Это согласуется с результатами, полученными Bose et al. (2011) в индийской популяции. Несмотря на отсутствие функциональных проявлений полиморфизма 7632Т>А in vivo (Kim and O'Shea, 1995; Lucas et al., 1995; Carrière et al., 1996), возможно сцепление этого полиморфного варианта с другими функционально значимыми полиморфизмами CYP2E1.

Соотношение биохимических маркеров развития гепатотоксических реакций и полиморфизма глутатион S-трансферазы А2. Распределение генотипов GSTA2 соответствовало распределению Харди-Вайнберга. Между заменами 63G>C 5 экзона и 83А>С 7 экзона гена GSTA2 наблюдалось достоверное неравновесие по сцеплению (л/2 = 11,58, р < 0,01). Пациенты, имеющие генотип 63GG/83AC в исследуемой выборке отсутствовали, хотя при случайном распределении должны встречаться с частотой 3,12%. Частоты аллелей и генотипов GSTA2 примерно соответствуют их частотам в других европеоидных популяциях (Landi et al., 2007) (табл. 6),

Таблица 4. Активности АЛТ и ACT в динамике лечения у генетически быстрых (БА), средних (СА) и медленных (МА) ацетиляторов

Группа Генотип Час- N тота, % АЛТ (ед/л): медиана (границы интерквартильных отрезков) Значение Р N Частота, % АСТ(ед/л): медиана (границы интерквартильных отрезков) Значение р

При поступлении На 1 месяце лечения При поступлении На 1 месяце лечения

Интерм. прием БА 6 9,1 20(14-27) 30,5(15-43) 0,17 3 5,56 23 (14-23) 16(16-43) 0,59

СА 26 39,4 18(13-27) 16,5(12-26) 0,94 22 40,74 24 (20 - 30) 21 (18-28) 0,26

MA 34 51,5 14,5(12-25) 20,5(14-34) 0,046 29 53,70 22(19-33) 27(18-32) 0,016

Всего 66 100 16,5(12-27) 19(14-34) 0,052 54 100 23 (19-30) 23(18-31) 0,22

Ежедн. прием БА 3 5,55 27(14-29) 29(12-33) 0,65 3 5,77 25(18-26) 30(23-42) 0,11

СА 17 31,5 20(17-29) 25 (20-48) 0,027 16 30,77 24(20,5-31) 32,5(20-43,5) 0,01

MA 34 62,95 15,5(11-21) 31 (20-65) 0,000088 33 63,46 22(18-26) 37(27-49) 0,00003

Всего 54 1 100 18(12-24) 27,5 (20-52) 0,000005 52 100 23 (18-28) 35(24,5-45) 0,000003

Таблица 5. Активности АЛТ и ACT в динамике лечения у больных с разными комбинациями генотипов CYP2E1

Группа Комбинация генотипов АЛТ (ед/л): Медиана (границы интерквартильных отрезков) Значение р ACT (ед/л): Медиана (границы интерквартильных отрезков) Значение Р

При поступлении На 1 месяце лечения При поступлении На 1 месяце лечения

Интерм. прием 7632TA, -1293GG, -1053CC 23 (8-35) 41,5(17-52) 0,17 33 (20-39) 32(29-37) 0,50

7632TA или 6/8, при этом остальные wt 23 НО-34,5) 41,5 (24,5-52) 0,27 20(14-33) 29(21 -32) 0,59

7632ТА или -71TG или 6/8, при этом -1293GG, -1053СС 27,5 (9-41) 28(16-52) 0,20 29(18-36,5) 26,5(19,5-34,5) 1,00

7632ТА или -71TG при этом 6/6.-1293GG, -1053СС 33,5(10-43) 37,5(16,5-53) 0,01 33 (20-35) 29 (21-37) 0,59

7632ТА или -71TG или 6/8 при этом по остальным полиморфизмам wt 23(10-34,5) 41,5 (24,5 - 52) 0,27 20(14-33) 29(21-32) 0,59

Во всей группе 16,5(12-27) 19(14-34) 0,052 23(19-30) 23(18-31) 0,22

JS 3 5 S g S 7632ТА, -1293GG, -1053СС 16,5(11-21) 57(28,5-76,5) 0,012 21 (17-25) 38(37-39) 0,028

7632ТА или 6/8, при этом остальные wt 14(11-19) 62 (25-78) 0,028 20(17-22) 38(37-38) 0,043

7632ТА или -71TG или 6/8, при этом -1293GG, -1053СС 17(12-23) 34,5 (25-75) 0,0003 23(20-25) 37,5(32-39) 0,093

7632ТА или -71TG при этом 6/6, -1293GG, -1053СС 17(12-21) 49 (25 - 78) 0,0058 23(20,5-25) 35 (28,5-38) 0,26

a Ë ¿5 7632ТА или -71TG или 6/8 при этом по остальным полиморфизмам wt 14(11-19) 62(25-78) 0,028 20(17-22) 38(37-38) 0,043

Во всей группе 18(12-24) 27,5(20-52) 0,000005 23(18-28) 35 (24,5-45) 0,000003

Примечание: в таблицах 4 и 5 р - уровень значимости различий по критерию Вилкоксона

В группе с интермиттирующим приемом достоверное увеличение активности AJIT и ACT по критерию Вилкоксона наблюдалось только у пациентов с генотипом 63СС 5 экзона (р = 0,038, табл. 7). Этот результат согласуется с тем, что экспрессия вариантов GSTA2, содержащих Serl 12 (63G), в 4 раза выше, чем экспрессия вариантов, содержащих Thrl 12 (63Q (Ning et al., 2004). Скорее всего, более низкая экспрессия треонинового варианта приводит к ослаблению защиты от окислительного стресса и, следовательно, к усилению токсичности. В группе с ежедневным приемом достоверное повышение AJIT и ACT наблюдалось для всех генотипов (р < 0,05) за исключением AJIT у пациентов с генотипом 83АС7 экзона (р = 0,35, табл. 7).

Соотношение биохимических маркеров развития гепатотокснческих реакций и полиморфизма глутатион S-трансфераз Ml и Т1. Частоты генотипов GSTT1 соответствовали, а генотипов GSTMI не соответствовали распределению Харди-Вайнберга (р = 0,035), с несколько большей частотой гомозигот «дикого типа». При анализе связи делеционного полиморфизма GSTM1 с повышением сывороточных активностей трансаминаз, в группе с интермиттирующим приемом не наблюдалось достоверного увеличения активностей AJIT и ACT ни для одного из генотипов GSTM1, в то время как в группе с ежедневным приемом активности AJIT и ACT достоверно увеличивалась у всех пациентов, за исключением гомозигот по аллелю «дикого типа» GSTM1 *1/1 (табл. 8).

При анализе связи делеционного полиморфизма GSTT1 с повышением активности AJIT и ACT, в группе с интермиттирующим приемом достоверное увеличение АЛТ наблюдалось только у пациентов с гомозиготной делецией этого гена (р = 0,047), тогда как при ежедневном приеме достоверное повышение активностей АЛТ и ACT происходило у всех пациентов за исключением пациентов с гомозиготной делецией GSTT1 (табл. 9).

Поскольку мы предполагали взаимосвязь генотипов GSTT1 и GSTM1 при развитии гепатотоксичности, были рассмотрены пациенты с гомозиготной делецией двух этих генов одновременно. Тем не менее, у таких пациентов, ни при интермиттирующем (N=5, р=0,6858) ни при ежедневном приеме (N=4, р=0,0679) не было обнаружено достоверного повышения активности АЛТ. Также не было обнаружено и достоверного повышения ACT, ни при интермиттирующем (N = 4, р=1,00) ни при ежедневном приеме ПТП (N = 4, р=0,0679).

В целом можно отметить, что делеционный полиморфизм GSTM1, по-видимому, не влияет на предрасположенность к гепатотоксичности в исследуемой популяции, тогда как гомозиготная делеция GSTT1 связана с небольшим, но статистически достоверным повышением активности АЛТ в процессе лечения при интермиттирующем приеме ПТП. При ежедневном приеме наблюдается обратная картина - наибольшее повышение активности АЛТ наблюдается у пациентов с гомозиготным генотипом по аллелю «дикого типа» GSTT1*1/1. По-видимому, в случае высокой лекарственной нагрузки, слишком большая экспрессия глутатион S-трансфераз проявляет себя негативно из-за чрезмерного расходования пула глутатиона в процессах биотрансформации, создавая его от-

носительный дефицит для других критически важных процессов в этих условиях, в частности, для восстановления белков.

Таблица 6. Частоты встречаемости аллелей и генотипов 08ТА2 у

" =145)

SNP N Частота, %

63G>C 5 экзона Аллель G 106 38,1

С 172 61,9

Генотип GG 21 15,1

GC 64 46,0

СС 54 38,9

83А>С 7 экзона Аллель А 264 95,0

С 14 5,0

Генотип АА 125 89,9

АС 14 10,1

СС 0 0,0

63G>C 5 экзона и 83А>С 7 экзона Гаплотип 63G-83A 172 61,9

63G-83C 0 0,0

63С-83А 92 33,1

63С-83С 14 5,0

Генотип 63G-83A/63G-83A 53 38,3

63G-83A/63G-83C 0 0,0

63G-83A/63C-83A 57 41,0

63G-83A/63C-83C 9 6,2

63G-83C/63G-83C 0 0,0

63G-83C/63C-83A 0 0,0

63G-83C/63C-83C 0 0,0

63С-83А/63С-83А 15 11,0

63С-83А/63С-83С 5 3,3

63С-83С/63С-83С 0 0,3

University, USA).

Таблица 7. Активности АЛТ и ACT в динамике лечения у больных с разными генотипами GSTA2

с с

>1 &

Генотип GSTA 2

АЛТ (ед/л) медиана (граница ин-терквартильных отрезков)

при поступлении

На 1 месяце лечения

Значение р

ACT (ед/л): медиана (граница интерквартильных отрезков)

при поступлении

На 1 месяце лечения

Значение р

63 GG

14(9-33)

20(11-42)

0,33

19(17-22)

20(17-23)

0,74

63GC

18(13-27)

16,5(13,5-24,5)

0,78

25(20-34)

23(18-31)

0,47

s s

R. В " К

63СС

17(12-25)

22(16-35)

0,042

23(18-27)

27,5(19-32)

0,039

83 АА

16(12-26)

18(13,5-33,5)

0,11

23 (19-29)

23(18-31)

0,33

83АС

22,5(10-33)

27,5(15-72)

0,25

19(14-34)

17(16-41)

0,35

16,5 (12-27)

19 (14-34)

0,052

23(19-30)

23(18-31)

0,22

63GG

14,5(12-19)

68(25-118)

0,0051

22(17-22)

42(38-63)

0,0077

63 GC

20(12-25)

25(20-42)

0,010

24(18-28)

32(23-38)

63СС

18(11-23)

27(13-40)

0,0096

23(20-30)

33(24-48)

0,0065 0,013

83АА

18(12-22,5)

26(19,5-55)

0,000008

23(18-28)

34,5(24-42)

0,000023

83АС

19,5 (12-29)

30(24-32)

0,35

24(18-27)

36,5 (30-76)

0,047

18(12-24)

27,5 (20 - 52)

0,000005

23(18-28)

35(24,5-45)

0,000003

Примечание: р - уровень значимости различий по критерию Вилкоксона.

Группа Генотип N Частота, % АЛТ (ед/л): Медиана (границы интерквартильных отрезков) Значение Р N Частота, % АСТ(ед/л): Медиана (границы интерквартильных отрезков) Значение р

При поступлении На 1 месяце лечения При поступлении На 1 месяце лечения

Иитерм прием 1/1 10 15,4 17(12-23) 19(16-34) 0,41 7 13,2 24(23-38) 31 (23-38) 0,35

1/0 19 29,2 14(10-35) 21 (12-35) 0,33 15 28,3 22(18-27) 23(17-30) 0,93

0/0 36 55,4 17,5(12-25) 20(13,5-32,5) 0,20 31 58,5 22(19-31) 21 (18-30) 0,46

всего 65 100,0 17(12-27) 20(14-34) 0,067 53 100,0 23(19-29) 23(18-31) 0,27

Ежедн прием 1/1 9 18,0 21 (19-25) 20 (20-32) 0,16 8 16,3 21 (17-25) 34 (21,5-48) 0,075

1/0 18 36,0 15,5(13-21) 32,5(21 -78) 0,0014 18 36,7 23,5 (18-26) 37,5 (27-49) 0,0003

0/0 23 46,0 16(11-20) 28 (19-52) 0,0009 23 47,0 22(17-28) 34 (24-39) 0,0035

всего 50 100,0 17(12-21) 29,5 (19-58) 0,000002 49 100,0 22(18-27) 35(24-48) 0,000002

Примечание: здесь и в таблице 9 р - уровень значимости различий по критерию Вилкоксона.

Таблица 9. Активности АЛТ и ACT в динамике лечения у больных с разными генотипами GSTT1

Группа Генотип N Частота, % АЛТ (ед/л): Медиана (границы интерквартильных отрезков) Значение р N Частота, % ACT (ед/л): Медиана (границы интерквартильных отрезков) Значение р

При поступлении На 1 месяце лечения При поступлении На 1 месяце лечения

Ин- терм прием 1/1 22 33,3 18,5(13-23) 20,5(16-43) 0,10 19 35,2 27 (20-39) 31 (22-53) 0,087

1/0 33 50,0 16(12-27) 17(13-28) 0,83 25 46,3 22(19-28) 20(17-25) 0,38

0/0 11 16,7 12(10-22) 21 (14-35) 0,047 10 18,5 19,5(17-23) 21 (18-30) 0,20

всего 66 100 16,5(12-27) 19(14-34) 0,052 54 100 23(19-30) 23(18-31) 0,22

Ежедн прием 1/1 21 38,9 19(12-22) 36 (23-75) 0,0011 20 38,5 23,5 (20,5-27) 36(27-44,5) 0,0017

1/0 24 44,4 17,5(11,5-22,5) 25(19,5-36,5) 0,0086 24 46,1 23(19-30,5) 36(27-51,5) 0,0019

0/0 9 16,7 15(12-24) 21 (19-49) 0,093 8 15,4 19(17,5-24) 25 (20,5 - 33,5) 0,091

всего 54 100 18(12-24) 27,5 (20 - 52) 0,000005 52 100 23(18-28) 35(24,5-45) 0,000003

Соотношение биохимических маркеров развития гепатотоксическнх реакций и полиморфизма глутатион S-трансферазы Р1. Распределение генотипов GSTP1 соответствовало распределению Харди-Вайнберга. Частоты аллелей и генотипов (табл. 10) примерно соответствуют таковым в европеоидных популяциях мира (Watson et al., 1998) и России (Vavilin et al., 2003; Скворцова и со-авт., 2006), однако частота замены 313A>G несколько превышает значение в русской популяции Башкортостана (Korytina et al., 2009). Интересно, что в исследуемой выборке аллель D (37ЗА, 341Т) не встречался и все носители замены 341С>Т5ыт носителями аллеля С (313G, 341Т), тогда как в работе Korytina et al., (2009) среди русских он встречался с частотой 5,16%. Во всей группе с ин-термитгирующим приемом не наблюдалось достоверного увеличения активностей AJIT и ACT. При рассмотрении нуклеотидных замен по отдельности только у пациентов с генотипом 3I3AG наблюдалось достоверное повышение активности АЛТ (р = 0,0094). При анализе нуклеотидных замен с учетом сцепления, только у пациентов с генотипом А/В наблюдалось статистически достоверное увеличение активностей АЛТ (р =0,011) и ACT (р = 0,048). При ежедневном приеме достоверное повышение АЛТ и ACT наблюдалось почти для всех генотипов GSTP1, а также во всей группе в целом без учета генотипов (табл. 11).

Отношения шансов для различных генотипов ферментов биотрансформации и антиоксидантной защиты. Для усиления чувствительности поиска связи полиморфизма ФБК с повышением активности АЛТ в процессе лечения, мы при расчете отношений шансов сравнили пациентов, имеющих показатели АЛТ на первом месяце лечения выше 75% квартиля с пациентами, имеющими АЛТ ниже 25% квартиля. У пациентов с генотипом 7632ТА гена CYP2E1 при ежедневном приеме ПТП риск более сильного повышения АЛТ был достоверно выше (р = 0,039), однако отношение шансов было неопределенным из-за нуля в одной из ячеек четырехпольной таблицы.

В группе с интермиттирующим приемом пациенты с генотипом GSTP1 *А/В в подгруппе с АЛТ более 75% квартиля встречались достоверно чаще, чем в подгруппе с АЛТ менее 25% квартиля (0111=10,00, ДИ: 1,12123,38, р=0,036). При объединении генотипов GSTPI*A/B и GSTP1*B/B и сравнении их с генотипом GSTP1 *А/А выявлено еще большее отношение шансов и более высокая статистическая достоверность (0111=11,25, ДИ: 1,28-136,55, р=0,015). Таким образом, в нашем исследовании выявлено, что генотип А/В связан с усилением токсичности ПТП при интермиттирующем приеме. Вероятнее всего, это связано с ролью GSTPI в регуляции путей сигнальной трансдук-ции и апоптоза. Известно, что разные полиморфные варианты гена GSTP1 по-разному влияют на апоптоз и жизнеспособность клеток (Holley et al., 2007). Возможно, несмотря на гибель клеток при действии ПТП в основном по пути некроза, при более слабом воздействии (интермиттирующем приеме) возможен и апоптоз, в связи с чем и проявляется регуляторная роль полиморфных вариантов GSTPI. При ежедневном же приеме большая лекарственная нагрузка предполагает только путь некроза, и вклад полиморфных вариантов GSTP1 в развитие ГТР не проявляется, что подтверждается нашими результатами.

Таблица 10. Частоты встречаемости аллелей и генотипов ОБТР1 у больных туберкулезом лёгких (М = 145)_

S N Р Аллель/генотип N Частота, %

А 190 68,3

О в 88 31,7

< АА 64 46,0

Ав 62 44,6

Св 13 9,4

С 249 89,6

Н Т 29 10,4

и СС 1И 79,9

ч- ст 27 19,4

тт 1 0,7

А (31 ЗА, 341 С) 19 0 68,4

В (3130,341 С) 59 21,2

С (31 Зв, 341Т) 29 10,4

Н О (31 ЗА, 341Т) 0 0,0

и А/А 64 0,460

m А/В 39 0,281

К А/С 23 0,165

о А А/О 0 0,000

< В/В 8 0,058

СЛ В/С 4 0,029

В/О 0 0,000

С/С 1 0,007

С/О 0 0,000

ыо 0 0,000

Таблица 11. Активности AJ1T и ACT в динамике лечения у больных с разными

генотипами GSTP1

| Группа 1 SNP Генотип СЗТТЧ АЛТ (ед/л): медиана (граница ин-терквартилътшх отрезков) Значение P ACT (ед/л): медиана (граница интерквартильных отрезков) Значение р

при поступлении на 1 месяце лечения при поступлении на 1 месяце лечения

| Интермиттирующий прием о а 313АА 15(10-20) 14(12-23) 0,82 22,5(19-25) 21,5(17-25) 0,72

313 АС 17(12-25) 23(16-42) 0,0094 23(17-32) 27(18-37) 0,18

313Св 27,5(17-39) 22(18,5-33) 0,72 33,5(20-47) 47 (28-66) 0,18

— н т Л С1 341 СС 16(12-27) 19(13-33) 0,060 22(18-27) 23 (18-30) 0,11

341 СТ 21,5(12-24,5) 20(15,5-47) 0,69 29 (22 - 39) 31 (18-47) 0,93

341ТТ - - - - . .

313АХ5И 341 ОТ А/А 15(10-20) 14(12-23) 0,82 22,5(19-25) 21,5(17-25) 0,72

А/В 17(12-25) 25 (16-35) 0,010 21 (16-30) 26(18-32) 0,048

А/С 21,5(12-24,5) 20(15,5 - 47) 0,69 29(22-39) 31 (18-47) 0,93

В/В 27,5(17-39) 22(18,5-33) 0,72 33,5(20-47) 47 (28 - 66) 0,18

в/с - - - - - -

с/с - - - - - -

всего 16,5(12-27) 19(14-34) 0,052 23 (19-30) 23(18-31) 0,22

I Ежедневный прием О 313АА 17,5(11,5-24,5) 32,5 (22,5-61,5) 0,0005 23,5(17,5-28) 37(31 -52,5) 0,0004

313AG 15(11-20) 25 (20 - 58) 0,0003 20(18-24) 33 (24-38) 0,002

3I3GG 21 (18-36) 15(13-27) 0,74 30(23-35) 23(20-41) 0,87

СП о 341CC 16,5(11,5-22,5) 28,5 (20 - 62) 3,000004 22,5(18-27) 36(27-48) 0,000003

341 СТ 20(18-33) 23(19 - 32) 0,48 24 (20-31) 27(20-33) 0,48

341ТТ 29(-) 23 (-) - ЗО(-) 59 (-) -

ГЛ ТГ —- m сл А/А 17,5(11,5-24,5) 32,5 (22,5-61,5] 0,0005 23,5(17,5-28) 37 (31 -52,5) 0,0004

А/В 14(11-21) 23,5(19,5-71,5) 0,0047 20(18-24) 35(24-39) 0,002

А/С 20(14-20) 31 (20-52) 0,028 22 (20-26) 32 (20 - 34) 0,028

В/В 19(15-20,5) 21 (14-43) 0,27 23,5 (22,5-27,5) 28 (20,5 - 38) 0,47

В/С 39 (36-42) 10.5(8-13) 0,18 38(35-41) 21,5(20-23) 0,18

с/с 29(-) 23 (-) - 30(-) 59(-) -

всего 18(12-24) 27,5 (20 - 52) 3,000005 23 (18-28) 35 (24,5-45) 0,000003

Примечание: р - уровень значимости различий по критерию Вилкоксона.

В группе с ежедневным приемом пациенты с генотипом 63СС 5 экзона GSTA2 встречались достоверно реже в группе высоких значений AJIT, чем пациенты с генотипом 63GG (ОШ = 0,00, ДИ: 0,00-0,55, р=0,007). Также пациенты с генотипом 63СС и 63GC встречались достоверно реже в подгруппе с высокими значениями AJIT по сравнению с пациентами с генотипом 63GG (ОШ = 0,00, ДИ: 0,00-0,64, р=0,015). Очевидно, здесь действует такая же закономерность, что и для GSTT1, и, по-видимому, при увеличении лекарственной нагрузки слишком высокая активность глутатион S-трансфераз перестает быть благоприятным фактором. Кроме этого, возможен компенсаторный механизм. Существует неравновесие по сцеплению между GSTA2 и GSTA1 в европеоидных популяциях: имеющий высокую экспрессию вариант GSTA1/*A сцеплен с низкоэкспрессирующимся вариантом GSTA2*63C, а имеющий низкую экспрессию вариант GSTA1/*B - с высокоэкспрессирующимся вариантом GSTA2*63G (Ning et al., 2004). Возможно, что в группе с ежедневным приемом пациенты с вариантом GSTA2*63C являются также носителями GSTA1/*A и высокая экспрессия GSTA1 позволяет лучше справляться с токсичностью при высоких лекарственных нагрузках.

Комбинации генотипов ферментов метаболизма ПТП и антиокси-дантной защиты и развитие гепатотоксических реакций. Усиление продукции токсичных метаболитов ПТП в сочетании с ослабленной антиоксидантной защитой должно проявляться усилением гепатотоксических реакций у больных туберкулезом. Для выявления этой закономерности был проведен анализ активностей AJIT в динамике лечения для различных комбинаций генотипов ферментов метаболизма ПТП и антиоксидантной защиты. В этом анализе в комбинации включались генотипы, для которых были получены достоверные ассоциации с усилением ГТР.

При интермиттирующем приеме ПТП у пациентов, имеющих генотип медленного ацетилирования в сочетании с генотипом GSTP1 *А/В или GSTPI *В/В и генотипом 63СС 5 экзона GSTA2, наблюдалось достоверное повышение активностей AJIT в динамике лечения (р = 0,021, табл. 1&). При ежедневном приеме ПТП наиболее сильное повышение активностей AJIT наблюдалось у пациентов, имеющих генотип медленного ацетилирования в сочетании с генотипами CYP2E1*7632TA (р = 0,018) или 63GG 5 экзона GSTA2 (р = 0,028, табл. 11).

Таким образом, при интермиттирующем режиме терапии ослабленная ан-тиоксидантная защита в сочетании с усиленной продукцией токсичных метаболитов ПТП проявляются усилением ГТР. При ежедневном приеме ПТП наиболее сильное поражение печени отмечено у пациентов с усиленной продукцией токсичных метаболитов в сочетании с генотипом 63GG, кодирующем высокую экспрессию GSTA2.

Таблица 11 Активности АЛТ в динамике лечения у пациентов с комбинациями _генотипов ферментов метаболизма ПТП и антиоксидантной защиты

d С С Комбинация генотипов N АЛТ (ед/л): медиана (граница интерквартильных отрезков) Значе-

при поступлении На 1 месяце лечения ние р

МА, имеющие генотип GSTP1*A/B или GSTP] *В/В 18 14(12-25) 24,5 (17 - 35) 0,042

S я CYP2E1 * 7632ГА, имеющие генотип GSTP1 *А/В или GSTP1*B/B 2 23,5 (12-35) 52 (50-54) 0,18

& МА, имеющие генотип CYP2E1 *7632ТА 4 10(8-23) 25(16,5-43,5) 0,27

S МА, имеющие генотип 5Ех+63СС GSTA2 16 14(12-30) 25(16-35) 0,036

<Ц н в МА, имеющие генотип GSTP1 *А/В или GSTP1 *В/В и генотип 5Ех+63СС GSTA2 8 12(12-21) 28(15,5-44,5) 0,021

МА с гомозиготной делецией GSTT1 6 13(12-25) 31 (21-35) 0,075

CYP2E1 *7632ТА с гомозиготной делецией GSTT1 0 . _

Всего 66 16,5(12-27) 19(14-34) 0,052

МА, имеющие генотип GSTP1 *А/В или GSTPI *В/В 11 13(11-19) 21 (19-65) 0,013

5 CYP2E1 *7632ТА, имеющие генотип GSTP1 *А/В или GSTP1*B/B 6 13,5(11-19) 57 (25 - 78) 0,028

Я о, МА, имеющие генотип CYP2E1 *7632ТА 8 13,5(11-18) 70 (36-78) 0,012

с МА имеющие генотип 5Ех+63СС GSTA2 11 16(11-20) 31 (13-40) 0,021

5 МА имеющие генотип 5Ex+63GG GSTA2 6 14,5(12-18) 68 (21 -83) 0,028

А И МА имеющие генотип GSTP1 *А/В или . GSTP1 *В/В и генотип 5Ex+63GG GSTA2 3 15(10-19) 21 (20-78) 0,11

Всего 54 18(12-24) 27,5(20-52) 0,000005

Примечание: МА - генетически медленные ацетиляторы, р - уровень значимости различий по критерию Вилкоксона.

ВЫВОДЫ

1. Медленная элиминация пиразинамида и изониазида предрасполагает к токсическому действию комбинации изониазида, пиразинамида, рифампицина и стрептомицина при ежедневном режиме терапии.

2. При определении однонуклеотидных замен 341Т>С, 590G>A и 857G>A гена NAT2 точность предсказания фенотипа ацетилирования составляет 86,5%. Все гомозиготы по аллелю «дикого типа» NAT2 и гетерозиготы 857GA являются фенотипически быстрыми ацетиляторами, а гомозиготы 341СС и 590АА и гетерозиготы одновременно по 341 и 857 заменам - фенотипически медленными ацетиляторами; другие генотипы проявляются фенотипами и медленного, и быстрого ацетилирования.

3. Носители генотипов медленного ацетилирования NAT2, CYP2E1*7632TA, гомозиготной делеции GSTTJ, 63СС 5 экзона GSTA2 и GSTP1*A/B или *В/В более подвержены гепатотоксическому действию комбинации изониазида, пиразинамида, рифампицина, этамбутола и стрептомицина при интермиттирующем режиме терапии.

4. При ежедневном приеме комбинации изониазида, пиразинамида, рифампицина и стрептомицина повышение активностей трансаминаз выше верхней гра-

ницы нормы чаще происходит у пациентов с генотипами медленного ацетили-рования NAT2, CYP2E1*7632TA и 63GG 5 экзона GSTA2.

5. Генотипы, для которых была выявлена связь с гепатотоксическими реакциями при их индивидуальном анализе, в комбинации обусловливают еще более выраженную подверженность токсичности при любом режиме терапии.

Практические рекомендации. Для прогнозирования возможности развития гепатотоксических реакций у больных туберкулезом при интермиттирующем и ежедневном приеме противотуберкулёзных препаратов наиболее информативно определение полиморфных вариантов 341Г>С, 590G>A, 857G>A гена NAT2, 7632Т>А гена CYP2E1, 63G>C 5 экзона GSTA2, а также фенотипа медленного ацетилирования.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Вавилин В.А., Колпакова Т.А., Макарова С.И., Кожанова JI.A., Мутайхан Ж., Никишина М.В., Кудряшов A.B., Полянская Е.В., Краснов В.А., Ляхович В.В. Полиморфизм NAT2, фармакокинетика изониазида и гепатотоксические реакции у больных туберкулезом легких // Материалы 3 международной конференции «Фундаментальные науки - медицине», 2-8 октября 2007 г, Новосибирск, с. 18.

2. Кудряшов A.B. Поиск информативных маркеров токсичности противотуберкулезных препаратов // Материалы Международной XII экологической студенческой конференции. Экология России и сопредельных территорий/ Ново-сиб. Гос. ун-т. Новосибирск, 2007, С.144.

3. Кудряшов A.B. Поиск информативных маркеров токсичности противотуберкулезных препаратов // Материалы XLVI Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Биология/ Но-восиб. Гос. ун-т. Новосибирск, 2008, С. 112-113.

4. Вавилин В. Д., Макарова С. И., Колпакова Т.А., Мутайхан Ж., Никишина М. В., Кожанова JI. А., Полянская Е. В., Кудряшов А. В., Краснов В. А., Ляхович В. В. Поиск информативных прогностических маркеров развития гепатоток-сичности при лечении больных туберкулезом // Тез. науч. докл. IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-16 мая 2008 г, Новосибирск, Россия. - С. 235.

5. Vavilin V.A. Makarova S.I., Kolpakova Т.А., Kudryashov A.V., Mutaikhan J., Nikishina M.V., Kojanova L.A., Polyanskaya L.V., Krasnov V.A., Lyakhovich V.V. The prognostic value of genetic and phenotypic markers of drug metabolism and host and exposure factors for antituberculous drug induced hepatotoxicity // Ehrlich II -2nd World Conference on Magic Bullets, Nürnberg, October 2-5, 2008. ,

6. Кудряшов A.B., Макарова С.И., Никишина M.B.; Колпакова Т.А., Мутайхан Ж., Вавилин В.А. Полиморфизм ариламин N-ацетилтрансферазы 2 у больных туберкулезом легких г. Новосибирска // Омский научный вестник. - 2009. -Приложение № 1 к выпуску 84. - С. 57-61.

7. Макарова С. И., Вавилин В. А., Кудряшов A.B. Соответствие генотипа и фенотипа ацетилирования // Клиническая фармакология и терапия. - 2009. - N

6 (доп) Материалы конференции «Достижения клинической фармакологии в России», с. 37-39.

8. Кудряшов A.B. Сравнение информативности генетических и фармакокине-тических маркеров при прогнозировании гепатотоксичности у больных туберкулезом легких // Клиническая фармакология и терапия. - 2009. - N 6 (доп) Материалы конференции «Достижения клинической фармакологии в России», с.

9. Вавилин В.А., Кудряшов A.B., Макарова С.И., Никишина М.В., Полянская Е.В., Сафронова О.Г., Мутайхан Ж., Колпакова Т.А., Краснов В.А., Ляхович В.В. Индивидуальные особенности метаболизма лекарств и гепатотоксичность у больных туберкулезом легких // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике - 2011. - Вып. 16. - С. 82 - 93.

10. Кудряшов A.B., Вавилин В.А., Колпакова Т.А., Мутайхан Ж., Краснов В.А., Ляхович В.В. Связь полиморфизма CYP2E1 с повышением активности АлАТ при лечении больных туберкулезом легких // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2011. - Т. 151. - №.6. - С. 689 - 694.

GSTA2 - глутатион S-трансфераза А2 ДИ - доверительный интервал GSTM1 - глутатион S-трансфераза Ml МА - медленные ацетиляторы

GSTP1 - глутатион S-трансфераза PI МБТ - микобактерии туберкулеза

GSTT1 - глутатион S-трансфераза Т1 ММ - «медленные метаболизеры»

35-37.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AUC - площадь под кривой CYP2E1 - цитохром Р450 2Е1 GST - глутатион S-трансферазы

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГТР - гепатотоксические реакции

NAT2 - N-ацетилтрансфераза 2 SNP - однонуклеотидный полиморфизм

АЛТ - аланинаминотрансфераза ACT - аспартатаминотрансфераза АТФ - аденозинтрифосфат БА - быстрые ацетиляторы БМ - «быстрые метаболизеры»

ПТП - противотуберкулёзные препараты

ПЦР - полимеразная цепная реакция ФБК - ферменты биотрансформации ксенобиотиков

ОШ - отношение шансов

ПДРФ - полиморфизм длин рестрик-ционных фрагментов

Соискатель:

Кудряшов Алексей Владимирович

Подписано к печати 27 октября 2011г.

Тираж 100 экз. Заказ № 064. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кудряшов, Алексей Владимирович

Список сокращений.

Введение.

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1 Характеристика и механизмы развития гепатотоксических реакций при лечении больных туберкулезом.

1.2 Система биотрансформации ксенобиотиков.

1.3 Действие на микобактерий туберкулеза, метаболизм, фармакокинетика противотуберкулезных препаратов, побочные эффекты и механизмы токсичности.

1.3.1 Пиразинамид.

1.3.2 Рифампицин.

1.3.3 Этамбутол.

1.3.4 Стрептомицин.

1.3.5 Изониазид.:.

1.4 Ферменты, участвующие в метаболизме противотуберкулезных препаратов

1.4.1 №ацетилтрансфераза 2.

1.4.2 Цитохром Р450 2Е1.

1.5 Глутатион Б-трансферазы.

ГЛАВА 2. Материалы и методы.•.

2.1. Характеристика групп больных, клинические и лабораторные методы обследования.

2.2. Реактивы и оборудоваие.

2.3. Хроматографическое определение изониазида, ацетилизониазида, пирази-намида и пиразиноевой кислоты в сыворотке крови.

2.4. Выделение ДНК.

2.5. Генотипирование ТЧ-ацетилтрансферазы 2 (ЫАТ2).

2.6. Генотипирование глутатион 8-трансферазы Р1 (ОЭТР!).

2.7. Генотипирование глутатион 8-трансферазы А2 (в8ТА2).

2.8. Определение делеционного полиморфизма глутатион 8-трансферазы М1 (08ТМ1) и глутатион 8-трансферазы Т1 (08ТТ1).

2.9. Генотипирование цитохромаР45О 2Е1 (СУР2Е1).

2.10. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований.

3.1. Параметры фармакокинетики пиразинамида и их, соотношение с биохимическими маркерами развития гепатотоксических реакций у больных туберкулезом лёгких.

3.2. Фармакокинетические параметры пиразиноевой кислоты и их соотношение с биохимическими маркерами развития гепатотоксических лекарственных» осложнений.

3.3. Параметры фармакокинетики изониазида и их соотношение с биохимическими маркерами развития гепатотоксических реакций*у больных туберкулезом' при интермиттирующем- приеме ПТП,.

3.4. Полиморфизм Ы-ацетилтрансферазы 2 и биохимические маркеры развития* гепатотоксических реакций.

3.5. Соотношение генотипов ЫАТ2 и фенотипов ацетилирования у пациентов-при интермиттирующем приеме ПТП.

3.6. Соотношение биохимических маркеров развития гепатотоксических реакций и полиморфизма цитохрома Р450 2Е1.

3.7. Соотношение биохимических маркеров развития гепатотоксических лекарственных осложнений и полиморфизма глутатион 8-трансфераз М1 и Т1.

3.8. Соотношение биохимических маркеров развития гепатотоксических реакций и полиморфизма глутатион 8-трансферазы А2.

3.9. Соотношение биохимических маркеров развития гепатотоксических реакций и полиморфизма глутатион 8-трансферазы Р1.

3.10. Отношения шансов для различных генотипов ферментов биотрансформации и антиоксидантной защиты.

3.11. Комбинации генотипов ферментов метаболизма ПТП и антиоксидантной защиты и развитие гепатотоксических реакций.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Полиморфизм ферментов метаболизма ксенобиотиков и антиоксидантной защиты и развитие гепатотоксических реакций у больных туберкулёзом легких"

Актуальность исследования. По данным ВОЗ. ежегодно в мире заболевают туберкулезом 9,4 миллиона человек. Смертность от туберкулеза составляет более 1,3 миллионов человек в год fhttp://www.who.int/tb/publications/ global report/2010/en/index.htmn. Заболеваемость туберкулезом органов-дыхания в России в 2010 году составила 67,31 случаев на 100000 населения (http://12.rospotrebnadzor.ru/directions/profilaktika/48877^, при этом в Сибирском Федеральном Округе показатель заболеваемости превышает 120 на 100000 населения, что соответствует состоянию эпидемии (Белиловский Е.М'. и соавт., 2010; Сельцовский П.П. и соавт., 2011). Неблагополучие эпидемической обстановки определяется в основном двумя факторами: числом невыявленных больных и числом неизлеченных больных туберкулёзом, которые являются распространителями инфекции. Ежегодно остаются неизлеченными свыше 60% больных. Среди причин низкой эффективности лечебных мероприятий, наряду с лекарственной устойчивостью, достигающей 30% у больных с впервые выявленным туберкулезом легких и 60% у больных с рецидивами (Стрелис А.К. и соавт., 2009) и рядом социальных факторов, следует отметить и непереносимость противотуберкулёзных препаратов (ПТП), развивающуюся в процессе лечения (Скачкова Е.И., Нечаева О.Б, 2008; Шилова М.В., 2010; Колпа-кова Т.А., 2011). Лечение больных туберкулёзом требует длительного - до 1224 месяцев, непрерывного одновременного приёма 4 — 8 ПТП. Используются различные способы их введения - внутрь, наиболее частый, и парентеральные, при этом препараты принимают ежедневно или 2 — 3 раза в неделю в различных комбинациях. Помимо лечебного эффекта ПТП способны оказывать отрицательное воздействие на органы и системы пациента, что затрудняет процесс лечения, заставляет прерывать его, а в некоторых случаях и отказываться. Наиболее частыми проявлениями осложнений антибактериальной терапии у больных туберкулёзом являются гепато-, нейро- и гастротоксические реакции (Колпакова Т.А., 2002; Мишин В.Ю. и соавт., 2004; Мордык A.B. Антропова В.В., 2008; Колпакова Т.А., 2011).

Частота развития гепатотоксических реакций (ГТР) при терапии туберкулеза достигает 47% и зависит от многих факторов: от режима терапии, расы, пола, возраста, массы тела, приема алкоголя и инфицирования вирусными гепатитами В и С (Huang Y.S., 2007). Проявления гепатотоксичности могут варьировать от повышения активностей сывороточных трансаминаз, до развития тяжелого гепатита, заканчивающегося смертельным исходом (Полунина Т.Е., 2005). Часто непредсказуемые поражения печени с функциональной недостаточностью развиваются на фоне дозозависимых повышений трансаминаз (Russmann S. et al., 2009).

При исследовании причин возникновения- гепатотоксичности большое внимание уделяется-метаболизму ПТП. Известно, что биологические эффекты химических соединений в значительной мере зависят от метаболизма, т.к. на этом этапе меняется биологическая активность вещества (Parkinson А., 2001). Метаболизм многих лекарственных соединений, осуществляемый ферментами биотрансформации ксенобиотиков (ФБК), характеризуется большой межиндивидуальной вариабельностью. Отдельные фармакокинетические параметры могут различаться в 103-104 раз. Во многих случаях вариабельность обусловлена генетическим полиморфизмом ФБК (Guengerich F.P., 2003).

Изониазид является основным препаратом при лечении туберкулеза. N-ацетилтрансфераза 2 (NAT2) играет важную роль в метаболизме изониазида. Большинство исследователей сходятся во мнении, что пациенты с генотипом медленного ацетилирования более предрасположены к гепатотоксичности по сравнению с быстрыми ацетиляторами (Ohno М. et al., 2000; Huang Y.S. et al., 2002; Higuchi N. et al., 2007; Lee S.W. et al., 2010). Тем не менее, существуют работы, обозначившие фенотипически быстрых ацетиляторов как группу риска развития гепатотоксичности при лечении туберкулеза (Mitchell J.R, et al., 1976), либо не обнаружившие ассоциаций с генотипом NAT2 (Roy В. et al., 2001; Yaf mada S. et al., 2009). Противоречия могут быть следствием этнических различий исследуемых популяций, поэтому необходимо анализировать эти ассоциации в каждой интересующей нас популяции. Кроме того, в популяциях встречается неполное соответствие генотипа NAT2 фенотипу ацетилирования (Cascorbi I. et al., 1995, Le Marchand L. et al., 1996). В связи с этим использование фенотипи-ческих маркеров может быть более информативным при прогнозировании гепа-тотоксических реакций.

Кроме NAT2, важную роль в метаболизме изониазида играет цитохром Р450 2Е1 (CYP2E1). CYP2E1 окисляет метаболит изониазида - ацетилгидразин - с образованием токсических метаболитов (Roy P.D., 2008). Показана связь отдельных полиморфизмов CYP2E1 с гепатотоксичностью, вызванной ПТП, однако имеющиеся данные противоречивы (Huang Y.S. et al., 2003; Bose P.D. et al., 2010). Кроме того, связь полиморфизма CYP2E1 с гепатотоксичностью при лечении больных туберкулезом впопуляциях России остается неизученной. ''

Поскольку образование реакционноспособных метаболитов и вызываемый ими окислительный стресс в клетках печени является конечным результатом взаимодействия противотуберкулезных препаратов с ФБК, большую роль в защите от гепатотоксичности могут играть ферменты антиоксидантной защиты, в частности, глутатион S-трансферазы. Для глутатион S-трансфераз Ml (GSTM1) и TI (GSTT1) описан нуль-полиморфизм, который проявляется полным отсутствием белка (Seidegârd J. et al., 1988; Pemble S. et al., 1994) и должен выражаться в ослаблении антиоксидантной защиты и, как следствие, в усилении токсичности. Действительно, эта закономерность подтверждена в ряде работ, но одни исследователи выделяют делецию GSTM1 (Roy В. et al., 2001; Huang Y.S. et al., 2007), а другие делецию GSTT1 (Leiro V., 2008) как фактор риска развития гепатотоксичности, вызванной ПТП.

Глутатион S-трансфераза А2 (GSTA2) высоко экспрессируется в печени (Coles B.F. and Kadlubar F.F., 2003). Полиморфизм GSTA2 проявляется изменением экспрессии (Ning В., 2004), поэтому разные аллельные варианты GSTA2 могут с разной силой защищать клетки печени от повреждающего действия токсичных метаболитов и тем самым влиять на восприимчивость к токсическому действию ПТП. В литературе мы не обнаружили публикаций, касающихся связи полиморфизма GSTA2 с токсичностью ПТП, а полиморфизм GSTA2 в популяциях России не определялся вообще.

Глутатион S-трансфераза PI (GSTP1) предствлена в печени в небольшом количестве (Nishimura М. et al., 2006). Тем не менее, этому ферменту приписывается, важная роль в регуляции ответа клетки на окислительный стресс и апоп-тоза через пути сигнальной трансдукции. (Adler V. et al., 1999; Bernardini S. et al., 2000). Учитывая функциональное проявление полиморфных вариантов GSTP1 (Johansson A.S. et al., 1998; Moyer A.M. et al., 2008), они могут вносить значительный вклад в развитие ГТР.

Таким образом, развитие ГТР зависит от функционального взаимодействия ферментов, нарабатывающих токсические метаболиты и детоксифицирук}-щих их и/или устраняющих последствия вызванного ими окислительного стресса. Изучение роли фармакогенетических и фенотипических особенностей пациента расширит возможности прогнозирования и профилактики лекарственных осложнений при терапии туберкулеза.

Цель исследования

Выявление полиморфных вариантов генов ферментов, участвующих в биотрансформации противотуберкулезных препаратов и антиоксидантной защите, а также особенностей фармакокинетики, ассоциированных с гепатоток-сическими реакциями при лечении больных туберкулезом.

Задачи:

1. Охарактеризовать активность N-ацетилтрансферазы 2 и амидазы по фар-макокинетике изониазида и пиразинамида у больных туберкулезом легких.

2. Определить частоты полиморфных вариантов генов NAT2, CYP2E1, GSTA2, GSTM1, GSTT1, GSTP1 в исследуемой выборке больных.

3. Определить соотношение генотипов NAT2 и фенотипов ацетилирования.

4. Проанализировать связь сывороточных активностей аланинаминотранс-феразы и аспартатаминотрансферазы с фармакокинетическими параметрами изониазида и пиразинамида.

5. Проанализировать связь полиморфных вариантов генов ЫАТ2, СУР2Е1, 08ТА2, ОБТМ1, G5'ГГІ и С8ТР1 с повышением уровней аланинаминотрансфе-разы и аспартатаминотрансферазы.

Научная новизна исследования

Впервые в России охарактеризована частота встречаемости полиморфных вариантов бЗО>С 5 экзона, 83А>С 7 экзона гена в8ТА2 и -7Ю>Т, С>Т (¥421¥) гена СУР2Е1.

Предложен новый метод определения полиморфизмов 313А>0 и 341С>Т гена 08ТР1 с использованием аллель-специфичной ПЦР с последующим

ПДРФ-анализом. Данный метод позволяет определить сцепление локусов 3131 и 1

341. Разработаны новые способы определения полиморфизмов бЗО>С 5 экзона, 83А>С 7 экзона гена в8ТА2 и -7Ю>Т, 7632Т>А , С>Т (¥А2Щ гена СУР2Е1 с помощью ПДРФ-анализа. Предложен новый способ определения полиморфизма 341Т>С те,ио.ЫАТ2 с использованием аллель-специфичной ПЦР.

Впервые путем анализа связи полиморфных вариантов генов ферментов, участвующих в метаболизме противотуберкулезных препаратов и антиокси-дантной защите с гепатотоксическими реакциями в условиях интермиттирую-щего и ежедневного приема ПТП показано, что эта связь меняется в зависимости от режима терапии.

Впервые в мире показано, что генотип 63СС 5 экзона1 С8ТА2 предрасполагает к развитию гепатотоксических реакций при интермиттирующем приеме противотуберкулезных препаратов, при ежедневном приеме этот генотип напротив связан с устойчивостью к развитию гепатотоксических реакций.

Впервые в мире показано, что генотип 08ТР1*А/В предрасполагает к развитию гепатотоксических реакций у больных с интермиттирующим режимом терапии, при ежедневном режиме терапии этот генотип не проявляет себя.

Впервые в России показано, что генотип CYP2E1*7632TA связан с усилением гепатотоксических реакций. Также впервые в России показано, что гомозиготная делеция GSTT1 предрасполагает к гепатотоксическому действию противотуберкулезных препаратов при их ежедневном приеме.

Практическая значимость работы

Предложены новые способы определения полиморфизмов^ генов NAT2, CYP2E1, GSTA2, GSTP1, которые могут применяться в исследованиях, связанных с изучением функциональных проявлений полиморфизмов, а таюке в по-пуляционно-генетических и генетико-эпидемиологических исследованиях.

Найденные достоверные ассоциации генетических и фенотипических маркеров с гепатотоксическими реакциями при лечении туберкулеза могут быть использованы для прогнозирования и профилактики лекарственного поражения печени у пациентов с интермиттирующим и ежедневным режимом терапии.

Результаты работы могут быть использованы в учебно-методическом процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Медленный метаболизм пиразинамида и изониазида предрасполагает к гепатотоксическому действию противотуберкулезных препаратов при ежедневном режиме терапии.

2. Носители генотипов NAT2, кодирующих фенотип-медленного ацетилиро-вания, и генотипа -7632ТА CYP2E1 более подвержены гепатотоксическому действию противотуберкулезных препаратов.

3. Наличие полиморфных вариантов генов глутатион S-трансфераз, уменьшающих их экспрессию и активность, усиливает гепатотоксическое действие противотуберкулезных препаратов. Их значение более выражено при интер-миттирующем приеме и уменьшается при увеличении дозовой нагрузки при ежедневном приеме.

4. Сочетание полиморфных вариантов N-ацетилтрансферазы 2 и цитохрома Р450 2Е1, усиливающих генерацию токсичных метаболитов противотуберкулезных препаратов и вариантов глутатион S-трансфераз А2 и PI, ослабляющих антиоксидантную защиту, способствует развитию гепатотоксических реакций.

Апробация работы

Материалы исследования были представлены на 3-й международной конференции «Basic Science for Medicine», (Новосибирск, 2007); на XII Международной Экологической Студенческой Конференции «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2007); на XLVI Международной Научной Студенческой Конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2008); на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); на конференции «Ehrlich II - 2nd World Conference on Magic Bullets» (Nürnberg, 2008); на научно-практической конференции с международным- участием, посвященной 25-летию кафедры клинической* фармакологии ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова Росздрава (2 тезиса, Москва, 2009); на межрегиональной научно-практической конференции «Молекулярные основы персонификации лекарственной терапии» (Новосибирск, 2011).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 2 в рекомендованных ВАК журналах и 1 статья в сборнике.

Структура и объем диссертации

Работа состоит из следующих разделов: введение, анализ литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и список литературы, включающий 28 отечественных и 206 иностранных источников. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками, содержит 27 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кудряшов, Алексей Владимирович

Выводы

1. Медленная элиминация пиразинамида и изониазида предрасполагает к токсическому действию комбинации изониазида, пиразинамида, рифам-пицина и стрептомицина при ежедневном режиме терапии.

2. При определении однонуклеотидных замен 341Т>С, 5900>А и 8570>А гена ИАТ2 точность предсказания фенотипа ацетилирования составляет 86,5%. Все гомозиготы по аллелю «дикого типа» ИАТ2 и гетерозиготы 857О А являются фенотипически быстрыми ацетиляторами, а гомозиготы 341СС и 590АА и гетерозиготы одновременно по 341 и 857 заменам — фенотипически медленными ацетиляторами; другие генотипы проявляются фенотипами и медленного, и быстрого ацетилирования.

3. Носители генотипов медленного ацетилирования ЫАТ2, С¥Р2Е1*7632ТА, гомозиготной делеции 057Т1, 63СС 5 экзона ЖШ и С8ТР1*А/В или *В/В более подвержены гепатотоксическому действию комбинации изониазида, пиразинамида, рифампицина, этамбутола и стрептомицина при интермиттирующем режиме терапии.

4. При ежедневном приеме комбинации изониазида, пиразинамида, рифампицина и стрептомицина повышение активностей трансаминаз выше верхней границы нормы чаще происходит у пациентов с генотипами медленного ацетилирования ЫАТ2, СУР2Е1 *7632ТА и 63вО 5 экзона 63X42.

5. Генотипы, для которых была выявлена связь с гепатотоксическими реакциями при их индивидуальном анализе, в комбинации обусловливают еще более выраженную подверженность токсичности при любом режиме терапии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кудряшов, Алексей Владимирович, Новосибирск

1. Белиловский Е.М., Борисов С.Е., Скачкова Е.И., Сон И.М., Галкин В.Б., ■ Данилова И.Д., Пашкевич Д.Д. Туберкулёз в Российской Федерации 2009 г.

2. Аналитический обзор статистических показателей по туберкулёзу, используемых в Российской Федерации. Москва, 2010. - С. 22 — 60.

3. Вестник Казанского технологического университета. — 2006. — № 5. — С. 32 — 40.

4. Григорян В'. Г. Влияние этионамида и пиразинамида на ультраструктуру клеток печени кроликов / Григорян В. Г., Салов В: Ф. // Проблемы туберкулеза-. -1976.-№ 8.-С. 55-60.

5. Кайгородова Е.В. Роль редокс-чувствительных МАР-киназ ЖК и р38 в дизрегуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при окислительном стрессе // Дисс. канд. мед. наук: // СибГМУ. Томск, 2008. - 137 с.

6. Колпакова Т.А. Осложнения антибактериальной терапии у больных туберкулезом легких с сопутствующими заболеваниями^// Дисс. докт. мед. наук: Новосибирск, 2002. 288 с.

7. Липкина Г. С. Гистологическое и электронномикроскопическое изучение действия рифампицина на органы крыс / Липкина Г. С., Фомина В. А. // Антибиотики. 1973. - Т. 18, № 7. - С. 639 - 645.

8. Макарова С. И. Показатели атопии у детей с бронхиальной астмой возрастают с накоплением нуль-аллелей глутатион-8-трансферазы М1 / Макарова С.

9. И., Сафронова, О. Г., Вавилин, В. А., Батычко О. А., Гавалов С. М. // Бюллетень эксперимен. Биол. и мед. 2004. - Т. 13 8, № 11. — С. 520 — 522.

10. Малюк В. И. Новые данные о биохимических механизмах туберкулезного процесса и коррекция их нарушений этиопатогенетическими препаратами. // Проблемы туберкулеза. 1984. -№ 11. - С. 61 - 64.

11. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва: Мир, 1984. — 480 с.

12. Меныцикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь H.A., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. — Москва: Фирма «Слово», 2006. 556 с.

13. Мишин В.Ю., Чуканов В .И., Григорьев Ю.Г. Побочное действие противотуберкулёзных препаратов при стандартных и индивидуализированных режимах химиотерапии. Москва: Издательство «Компьютербург», 2004. - 208 с.

14. Мордык A.B. Влияние неблагополучных побочных реакций химиотерапии на показатели качества жизни больных инфильтративным туберкулёзом лёгких / Мордык A.B. Антропова В.В. // Проблемы туберкулеза и болезней лёгких. -2008.-№9.-С. 44-46.

15. Никишина М.В. Исследование полиморфизма генов ариламин N-ацетилтрансфераз и ассоциации полиморфных вариантов с раком легкого у европеоидов г. Новосибирска: Дисс. канд. биол. наук: Новосибирск, 2007. 125 с.

16. Полунина Т. Е. Лекарственные поражения печени. // Лечащий врач. -2005. -№ 3. — С. 8 — 13.

17. Сельцовский П.П. Анализ особенностей эпидемической ситуации по туберкулёзу и системы защиты населения от туберкулёза в г. Москве / Сельцовский П.П., Рыбка Л.И., Кочетова Е.Я., Горбунов A.B. // Туберкулёз и болезни лёгких.-2011.-№6.-С. 10-16.

18. Скакун Н. П. Сравнительная гепатотоксичность изониазида, рифампицина-и этамбутола / Скакун Н. П., Табачук О. Е. // Проблемы туберкулеза. — 1991. — №10. — С. 77 — 79.

19. Скакун Н. П. Эффективность антиоксидантов при поражении печени изо-ниазидом / Скакун Н. П., Шманько В. В. // Фармакология и токсикология. — 1986. Т.49, № 4. - С. 86 - 89.

20. Скачкова Е.И. О программе государственных гарантий' оказания гражданам России бесплатной ^ медицинской помощи в противотуберкулёзных учреждениях/ Скачкова Е.И., Нечаева О.Б. // Проблемы туберкулеза. 2008. - № 8. -С. 17:

21. Сливка Ю. И; О гепатотоксическом действии сочетаний« пиразинамида с изониазидом и рифампицином / Сливка Ю: И., Климнюк Е. В>, Табачук О. Е. // Проблемы туберкулеза. — 1989. -№ 4. С. 39 - 42.

22. Фисенко В. Противотуберкулезные средства: принципы действия, побочные эффекты и перспективы создания новых лекарственных препаратов. // Врач. 2006. - № 12. - С. 30 - 34.

23. Холодов JI. Е., Яковлев В. П. Клиническая фармакокинетика. Москва: Медицина, 1985. - 464 с.

24. Шилова М.В. Противотуберкулёзные стационары России (потребность, перспективы развития) // Проблемы туберкулеза и болезней лёгких. — 2009. — № 5.-С.9-15.

25. Ю В. В. Факторы риска развития гепатоксических эффектов при проведении противотуберкулезной химиотерапии у пациентов из Азиатских стран. // Международный журнал по туберкулезу и заболеваниям легких. — 2006. — Вып. 1,№2.-С. 74-77.

26. Adler V. Regulation of JNK signaling by GSTp / Adler V., Yin Z., Fuchs S. Y., Benezra M., Rosario L., Tew K. D., Pincus M. R., Sardana M., Henderson C. J., Wolf C. R., Davis R. J., Ronai Z. // EMBO J. 1999 - V. 18, N. 5. - P. 1321 - 1334.

27. Agundez J.A. Glutatione S-transferase GSTT1 and GSTM1 allozymes: beyond null alleles / Agundez J.A., Ladero J.M, // Pharmacogenomics. 2008. - V. 9, N. 3. -P. 359-363.

28. American Thoracic Society / Centers for Disease Control and Prevention / Infectious Diseases Society of America: Treatment of Tuberculosis //Am. J. Crit. Care Med. 2003. - V. 167. - P. 603 - 662.

29. Arisawa T. Nrf2 gene promoter polymorphism and gastric carcinogenesis / Arisawa Т., Tahara Т., Shibata Т., Nagasaka M., Nakamura M., Kamiya Y., Fujita H.,

30. Yoshioka D., Okubo M., Hirata I., Nakano H. // Hepatogastroenterology. 2008. -V. 55, N. 82-83. - P. 750 - 754.

31. Bernardini S. Modulation of GST Pl-1 activity by polymerization during apop-tosis / Bernardini S., Bernassola F., Córtese C., Ballerini S., Melino G., Motti C., Bel-lincampi L., Iori R, Federici G. // J. Cell Biochem. 2000. V. 77, N. 4. - P.645 -653.

32. A.A., Cederbaum A.T. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2004 - V. 44. - P. 27 -42*.

33. Chatterjee S. GSTT1 and GSTM1 gene deletions are not associated with hepato-toxicity caused by antitubercular drugs / Chatterjee S., Lyle N., Mandai A., Kundu S. // J. Clin. Pharm. Ther. 2010. - V. 35, N. 4. - P. 465 - 470:

34. Chien J.Y. Pharmacokinetic consequences of induction of CYP2E1 by ligand stabilization / Chien J.Y., Thummel K.E., Slattery J.T. // Drug Metab Dispos. 1997.-V. 25, N. 10. P. 1165 -1175.

35. Choi S.Y. Optic neuropathy associated with ethambutol in Koreans / Choi S.Y., Hwang J.M. // Korean J. Ophthalmol. 1997. - V. 11, N. 2. - P. 106 - 110.

36. Cynamon M.IT. High-Dose Isoniazid Therapy for- Isoniazid-Resistant Murine Mycobacterium tuberculosis Infection / Cynamon M.H., Zhang Y., Harpster T., Cheng S., Destefano M.S. // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - V. 43, N. 12. - P. 2922 - 2924.

37. De Rosa HJ: The effect, of pyrazinamide and rifampicin on isoniazid metabolism in rats / DerRbsaTiiJi, Baldan №M:, Brunetti I.L., Ximcnes V.F., Machado R.Gi //Biopharm^ DrugDispos. 2007. - V. 28, N. 6. - Pr 291 - 296.

38. Deguchi T. Correlation between acetylator phenotypes and genotypes of polymorphic arylamine N-acetyltransferase in human liver / Deguchi T., Mashimo Ml, Suzuki T.//J. Biol. Chem.- 1990.-V. 265.-P. 12757- 12760.

39. Deka M. Role of CYP2E1 gene polymorphisms association with hepatitis risk in Northeast India / Deka M, Bose M, Baruah B, Bose PD», Medhi S, Bose S, Saikia A, Kar P: // World J. Gastroenterol. 2010 V. 16, N. 38: - P. 4800- 4808.

40. Desta Z. Inhibition of cytochrome P450 (CYP450) isoforms by isoniazid: potent inhibition of CYP2C19 and CYP3A / Desta Z., Soukhova N.V., Flockhart D.A. Antimicrob. Agents Chemother. 2001. - V. 45, N. 2. -P. 382 -392.

41. Doll M;A. Codominant expression of N-acetylation and O-acetylation activities catalyzed by N-acetyltransferase 2 in human hepatocytes. Doll M.A., Zang Y., Moel-ler T., I-Iein D. W. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2010. -V. 334, N. 2. -P. 540-544.

42. Donald P.R. Early Bactericidal Activity of Isoniasid Related to Its Dose Size in Pulmonary Tuberculosis / Donald P.R., Sirgel F.A., Botha F.J., Seifart H.I., Parkin

43. D.P., Vandenplas M.L., Van de Wal B.W., Maritz J.S., Mitchison D.A. // Amer. Jour. Crit. Care Med. 1997. - V. 156, N. 3, Pt. 1. - P. 895 - 900.

44. Dossing M. Liver injury during antituberculosis treatment: an 11-year study / D0ssing M., Wilcke J.T., Askgaard D.S., Nybo>B. // Tuber. Lung Dis. 1996. -V.77, N. 4.-P. 335-340.

45. Du Toit L.C. Tuberculosis chemotherapy: current drug delivery approaches / Du Toit L.C., Pillay V., Danckwerts M.P. // Respiratory research. 2006. - V. 7, N. 1. -P. 118-136.

46. Eliasson E. Substrate-, hormone-, and cAMP-regulated cytochrome P450 degradation / Eliasson E., Johansson I., Ingelman-Sundberg M. // Proc. Natl. Acad. Sei. U S A. -1990. V. 87, N. 8. - P. 3225 - 3229.

47. Ellard G.A. Absorption, metabolism and excretion of pyrazinamide in man. // Tubercle. 1969. -V. 50, N. 2. - P. 144 - 158.

48. Ergul Y. Effect of vitamin C on oxidative liver injury due to isoniazid in rats / Ergul Y., Erkan T., Uzun H., Gene H., Altug T., Erginoz E. // Pediatr. Int. 2010. -V. 52,N. l.-P. 69-74.

49. Ernstgärd L. Robustness of chlorzoxazone as an in vivo measure of cytochrome P450 activity / Ernstgärd L., Warholm M., Johanson G. // Br. J. Clin. Pharmacol. -2004. V. 58, N. 2. - P. 190 - 200.

50. Fairbrother K.S. Detection and characterization of novel polymorphisms in the CYP2E1 gene / Fairbrother K.S., Grove J., de Waziers I., Steimel D.T., Day C.P., Crespi C.L., Daly A.K. // Pharmacogenetics. 1998. - V. 8, N. 6. - P. 543 - 552.

51. Forbes M. Effect of ethambutol on Mycobacteria / Forbes M., Peets E.A., Kuck N.A.//Ann. N. Y. Acad. Sci. 1966. - V. 135,N.2-P. 726-731.

52. Forget E. Adverse reactions to first-line antituberculosis drugs / Forget E., Men-zies D. // Expert Opin. Drug Saf. 2006. - V. 5, N. 2 - P. 231 - 249.

53. García-Martín E. Interethnic and intraethnic variability of NAT2 single nucleotide polymorphisms. // Curr. Drug Metab. 2008. - V. 9, N. 6. - P. 487 - 497.

54. Gonzalez F.J. Cytochrome P450 and xenobiotic receptor humanized mice. / Gonzalez F.J., Yu A.M. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2006. - V. 46. - P. 41 -64.

55. Guengerich F.P. Cytochromes P450, drugs, and diseases. // Mol. Interv. — 2003. . —V. 3,N. 4.-P. 194-204.

56. Guengerich F.P. Reactions and significance of cytochrome P-450 enzymes. // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266, N. 16. - P. 10019 - 10022.

57. Gunawan B.K. c-Jun N-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophen hepatotoxicity / Gunawan B.K., Liu Z.X., Han D., Hanawa N., Gaarde W.A., Kaplowitz N. // Gastroenterology. 2006. - V. 131, N. 1. - P. 165 - 178.

58. Guy C.A. Promoter polymorphisms in glutathione-S-transferase genes affect transcription / Guy C.A., Hoogendoorn B., Smith S.K., Coleman S., O'Donovan M.C., Buckland P.R. // Pharmacogenetics. -2004. -V. 14, N: 1.-P. 45-51.

59. Hakkola J. Mechanisms of down-regulation of CYP2E1 expression by inflammatory cytokines in rat hepatoma cells / Hakkola J., Hu Y., Ingelman-Sundberg M. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003. -V. 304, N. 3. - P. 1048 - 1054.

60. Hayashi S. Genetic polymorphisms in the 5'-flanking region change transcriptional regulation of the human cytochrome P450IIE1 gene / Hayashi S., Watanabe J.,

61. Kawajiri K. // J. Biochem. 1991. - V. 110, N. 4. - P. 559 - 565.

62. Hayes J.D. Glutathione transferases / Hayes J.D., Flanagan J.U., Jowsey I.R. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2005. - V.45. - P. 51 - 88.

63. Hein D.W. N-acetyltransferase SNPs: emerging concepts serve as a paradigm for understanding complexicities of personalized medicine. // Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 2009. - V. 5, N. 4. - P. 353 - 366.

64. Hickman D. Chromosomal localization^ of human genes for arylamine N-acetyltransferase / Hickman D., Risch A., Buckle V., Spurr N.K., Jeremiah S.J., McCarthy A., Sim E. // Biochem J. 1994. - V. 297, Pt, 3. - P. 441 - 445.

65. Hickman D. Enzyme kinetic properties of human recombinant arylamine N-acetyltransferase 2 allotypic variants expressed in esherichia coli / Hickman D., Palamanda J.R., Unadkat J.D., Sim E. // Biochem. Pharmacol. 1995. - V. 50, N. 5. -P. 697-703.

66. Hickman D. N-acetyltransferase polymorphism. Comparison of phenotype and genotype in humans / Hickman D., Sim E. // Biochem Pharmacol. 1991. - V. 42, N. 5.-P. 1007-1014.

67. Hu Y. Genetic polymorphism of human CYP2E1: characterization of two variant alleles / Hu Y., Oscarson M., Johansson I., Yue Q.Y., Dahl M.L., Tabone M., Arinco S., Albano E., Ingelman-Sundberg M. // Мої. Pharmacol. 1997. - V. 51, N. 3.-P. 370-376.

68. Huang Y.S. Cytochrome P450 2E1 genotype and the susceptibility to antituberculosis drug-induced,hepatitis / Huang Y.S., Chern H.D., Su W.J., Wu J.C., Chang S.C., Chiang'C.H., Chang F.Y., Lee*S.D: // Hepatology. 2003. - V. 37, N. 4. - P. 924 - 930.

69. Huang Y.S. Genetic polymorphisms of drug-metabolizing enzymes and the susceptibility to antituberculosis drug-induced liver injury. // Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 2007. - V. 3, N. 1. - P.1 - 8.

70. Huang Y.S. Polymorphism of the N-acetyltransferase 2 gene as a susceptibility risk factor for antituberculosis drug-induced hepatitis / Huang Y.S., Chern H.D., Su• WJ. // Hepatology. 2002. - V.35. -N.4. - P.883 - 889.

71. Ito K. Manganese-mediated oxidative damage of cellular and isolated DNA by isoniazid and related hydrazines: non-Fenton-type hydroxyl radical formation / Ito K., Yamamoto K., Kawanishi S. II Biochemistry. 1992. - V. 31, N. 46 - P.l 1606 -11613.

72. Khalili H. Is there any difference between acetylator phenotypes in tuberculosis patients and healthy subjects? / Khalili H., Dashti-Khavidaki S., Amini M., Mahjub R., Hajiabdolbaghi M. // Eur. J. Clin. Pharmacol. 2010. - V. 66, N. 3. - 261 - 267.

73. Kim R.B. Interindividual variability of chlorzoxazone 6-hydroxylation in men and women and its relationship to; CYP2E1 genetic polymorphisms / Kim R.B., O'Shea D. // Clin. Pharmacol. Ther. 1995. - V. 57, N. 6. - P. 645 - 655.

74. Kim S.H. GSTT and GSTM1 null mutations and adverse reactions induced by antituberculosis drugs in Koreans / Kim S.H., Kim S.H., Yoon H.J., Shin D.H., Park

75. S.S., Kim Y.S., Park J.S., Jee Y.K. // Tuberculosis (Edinb). 2010. - V. 90, N. 1 - P. 39-43.

76. Kita T. N-acetyltransferase 2 Genotype Correlated with Isoniazid Acetylation in Japanese Tuberculous Patients / Kita T., Tanigawara Y., Chikazawa S. // Biol. Pharm. Bull. 2001. - V. 24, N. 5. - P: 544 - 549.

77. Lacroix C. Pharmacokinetics of pyrazinamide and its metabolites in healthy subjects / Lacroix C., Hoang T.P., Nouveau J., Guyonnaud C., Laine G., Duwoos H., La-font O. // Eur. J. Clin. Pharmacol. 1989. - V. 36, N. 4. - P. 395 - 400.

78. Le Marchand L. Predictors of N-acetyltransferase activity: should caffeine phe-notyping and NAT2 genotyping be used interchangeably in epidemiological studies? / Le Marchand L., Sivaraman L., Franke A.A., Custer L.J., Wilkens L.R., Lau A.F.,

79. Cooney R.V. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1996. - V. 5, N. 6. - P. 449 -455.

80. Lee B.H. Inactive hepatitis B surface antigen carrier state and: hepatotoxicity during antituberculosis chemotherapy / Lee B.H., Koh W.J., Choi M.S., Suh G.Y., Chung M.P., Kim H:, Kwon OiJ. // Chest; — 2005;.— V. 127,.N. 4. — P. 1304-1311.

81. Lee S.W. NAT2 and;CYP2E1 polymorphisms and susceptibility to first-line antituberculosis drug-induced hepatitis / Lee: S.W., Chung L.S., Huang H.IL, Chuang T.Y., Liou Y.H., Wu L.S. U Int¿ J. Tuberc. Lung Dis. 2010. - V. 14, N. 5.- P. 622 -626.

82. Lee S.Y. Complete sequencing of a genetic polymorphism in NAT2 in the Korean population / Lee S.Y., Lee K.A., Ki C.S., Kwon O .J., Kim H.J., Chung M.P., Suh G.Y., Kim LW. H Clin. Chem. 2002. - V.48, N. .5. - P: 775 - 111.

83. Leff M.A. Novel humamN-acetyltransferase 2 alleles that différ in mechanism for slow acetylator phenotype / Leff M.A., Fretland A.J., Doll M.A., Hein D.W. H I. Biol. Chem.- 1999.-V. 274, N. 49.-34519-34522. '

84. Leist M. Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis / Leist M., Single B., Castoldi A.F., Kiihnle S.,NicoteraP. // J. Exp. Med. — 1997. — V. 185,N. 8.-P. 1481-1486.

85. Levy S. The role of c-jun phosphorylation in EpRE activation of phase II genes / Levy S., Jaiswal A.K., Forman H.J. // Free Radic. Bio. Med. 2009i - V. 47, N. 8. -P.l 172-1179.

86. Loos U. Pharmacokinetics of oral and intravenous rifampicin during chronic administration / Loos U., Musch E., Jensen J.C., Mikus G:, Schwabe H.K., Eichelbaum M. // Klin. Wochenschr. 1985. - V. 63, N. 23. - P. 1205 - 1211.

87. Lum A. A simple mouthwash method for obtaining genomic DNA in? molecular epidemiological studies / Lum A., Le Marchand L. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1998. - V. 7, N. 8. - P. 719 - 724.

88. Mainwaring G.W. The distribution of theta-class glutathione S-transferases in the liver and lung of mouse, rat and human / Mainwaring G.W., Williams S.M., Foster J.R., Tugwood J., Green T. // Biochem J. 1996. - V. 318, Pt. 1. - P. 297 - 303.

89. Makarova S.I. Human N-Acetytransferases and Drug-Induced Hepatotoxicity // Curr. Drug Metab. 2008. - V. 9, N. 6. - P. 538 - 545.

90. Makhlouf H.A. A prospective study of antituberculous drug-induced hepatotoxicity in an area endemic for liver diseases / Makhlouf H.A., Helmy A., Fawzy E., El-Attar M., Rashed H.A. // Hepatol. Int. 2008. - V. 2, N. 3 - P. 353 - 360.

91. Malhi H. Cellular and molecular mechanisms of liver injury / Malhi H., Gores G.J. // Gastroenterology. 2008. - V. 134, N. 6. - P. 1641 - 1654.

92. Masjedi M.R. Chromosomal aberrations and micronuclei in lymphocytes of patients before and after exposure to anti-tuberculosis drugs / Masjedi M.R., Heidary A., Mohammadi F., Velayati A.A., Dokouhaki P. // Mutagenesis. 2000. - V. 15, N. 6.-P. 489-494;

93. MattesrW.B. Quantitative reverse transcriptase/PCR assay for the measurement of induction in cultured hepatocytes / Mattes: W.B., Li A.P. // Chem. Biol; Interact. — 1997.-V. 107,N. 1-2,P. 47-61.

94. Meyer D.J. Theta, a new class of glutathione transferases purified from rat and man / Meyer D.J., Coles B., Pemblë S.E., Gilmore K.S;, Fraser G.M., Ketterer B. // Biochem. J. 1991.-V. 274, Pt, 2: - P. 409-414.

95. Morel Y. A repressive cross-regulation between catalytic and promoter activities of the CYP1A1 and CYP2E1 genes: role of H202 / Morel Y., de Waziers I, Barouki R. // Mol. Pharmacol. 2000. - V. 57, N. 6. - P. 1158 - 1164.ff, »

96. Morike K. Identification of N2 as a metabolite of acetylhydrazine in the rat / Morike K., Koch M., Fritz P., Urban W., Eichelbaum M. // Arch. Toxicol. 1996. -V. 70,N. 5. -P. 300-305.

97. Moyer A.M. Glutathione S-Transferase PI: Gene Sequence Variation and Functional Genomic Studies / Moyer A.M., Salavaggione O.E., Wu T.Y., Moon I., Eckloff

98. B.W., Hildebrandt M.A., Schaid D.J., Wieben E.D., Weinshilboum R.M. // Cancer Res. 2008. - V. 68, N. 12. - P. 4791 - 4801*.

99. Neafsey P. Genetic polymorphism in CYP2E1: Population distribution of CYP2E1 activity / Neafsey P., Ginsberg G., Hattis D., Johns D.O., Guyton K.Z., Sonawane B. // J. Toxicol. Environ. Health B. Crit. Rev. 2009. - V. 12, N. 5-6. - P. 362-388.

100. Nelson S.D. Isoniazid and iproniazid: activation of metabolites to toxic intermediates in man and rat / Nelson S.D., Mitchell J.R., Timbrell J.A., Snodgrass W.R., Corcoran G.B. 3rd. // Science. 1976. - V. 193, N. 4256. - P. 901 - 903.

101. Ning B. Human glutathione S-transferase A2 polymorphisms: variant expression, distribution in prostate cancer cases/controls and a novel form / Ning B., Wang

102. C., Morel F., Nowell S., Ratnasinghe D.L., Carter W!, Kadlubar F.F., Coles B. // Pharmacogenetics. 2004. - V. 14, N. 1. - P. 35 - 44.

103. Nishimura M. Tissue-Specific mRNA expression profiles of human phase I metabolizing enzymes except for cytochrome P450 and Phase II metabolizing enzymes / Nishimura M., Naito S. // Drug Metab. Pharmacokinet. 2006. - V. 21, N. 5. - P.• 357-374.

104. Nishimura Y. Inhibitory effect of antituberculosis drugs on human cytochrome P450-mediated activities / Nishimura Y., Kurata N., Sakurai E., Yasuhara H. // J. Pharmacol. Sci. 2004. - V. 96, N. 3. - P. 293 - 300:

105. Novak R.F. The alcohol-inducible form of cytochrome P450 (CYP 2E1): role in toxicology and regulation of expression / Novak R.F., Woodcraft K. J. // Arch. Pharm.

106. Res. 2000. - V. 23, N. 4. - P. 267 - 282.

107. Pande J.N. Risk factors for hepatotoxicity from antituberculosis drugs: a case-control study / Pande J.N., Singh S.P., Khilnani G.C., Khilnani S., Tandon R.K. // Thorax. -1996. -V. 51, N. 2. P. 132 - 136.

108. Parkinson A. Disposition of xenobiotics // Casarett and Doull's Toxicology. The basic science of poisons. New York. - 2001. - P. 133 - 224.

109. Powell H. Expression of cytochrome P4502E1 in human liver: assessment by mRNA, genotype and phenotype / Powell H., Kitteringham N.R., Pirmohamed M., Smith D.A., Park B.K. // Pharmacogenetics. 1998. - V. 8, N. 5. - P. 411 - 421.

110. Qiu L.O. Suppression of cytochrome P450 2E1 promoter activity by interferon-gamma1 and loss of response due to the -71G>T nucleotide polymorphism of the CYP2E1*7B allele / Qiu L.O., Linder M.W., Antonino-Green D.M., Valdes RJr. // J.

111. Pharmacol. Exp. Ther. 2004. - V. 308, N. 1. - P. 284 - 288.

112. Rana S.V. Role of N-acetylcysteine in rifampicin-induced hepatic injury of young rats / Rana S.V., Attri S., Vaiphei K., Pal R., Attn A., Singh K. // World J. Gastroenterol. 2006. - V.12, N. 2. - P. 287 - 291.

113. Raucy J.L. Regulation of CYP2E1 by ethanol and palmitic acid and CYP4A11 by clofibrate in primary cultures of human hepatocytes / Raucy J.L., Lasker J'., Ozaki K., Zoleta V. // Toxicol. Sci. 2004. - V. 79, N. 2. - P. 233 - 241.

114. Rawat R. The isoniasid-NAD adduct is a slow, tight-binding inhibitor of InhA, , the Mycobacterium tuberculosis enoyl reductase: Adduct affinity and drug resistance

115. Rawat R., Whitty A., Peter J.T. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2003. - V. 100, N. 25.-P. 13881 -13886.

116. Reeves P.T. In vivo mechanisms for the enhanced acetylation of sulfamethazine in the rabbit after hydrocortisone treatment / Reeves P.T., Minchin R.F., Ilett K.F. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1989. - V. 248, N. 1. - P. 348 - 352.

117. Riesbeck K. Cyprofloxacin does not inhibit mitochondriar functions but otherantibiotics.do / Riesbeck K., Bredberg A., Forsgren A. // Antimicrob. Agents Chemother. 1990.-V. 34, N. l.-P. 167-169.

118. Robin M.A. Plasma membrane cytochromes P450 as neoantigens and autoimmune targets in drug-induced hepatitis / Robin M.A., Le Roy M., Descatoire V., Pes-sayre D. // J. Hepatol. 1997. - V. 26, Suppl. 1. - P. 23 - 30.

119. Rodrigues-Lima F. Effect of environmental substances on the activity of arylamine N-acetyltransferases / Rodrigues-Lima F., Dairou J., Dupret J.M. // Curr. Drug Metab. 2008. - V. 9, N. 6. - P. 505 - 509.

120. Roy P.D. Pharmakogenomics of anti-TB drugs-related hepatotoxicity / Roy P.D., Majumder M., Roy B. // Pharmacogenomics. 2008. - V. 9, N. 3. - P. 311 -321.

121. Runge-Morris M. Hydrazine-mediated DNA damage: role of hemoprotein, electron transport, and organic free radicals / Runge-Morris M., Wu N., Novak R.F. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1994. - V. 125, N. 1. - P. 123 - 132.

122. Sarich T.C. Role of hydrazine in the mechanism of isoniazid hepatotoxicity in' rabbits / Sarich T.G., Youssefi M., Zhou T., Adams S.P., Wall R.A., Wright J.M. // Arch. Toxicol. 1996. - V. 70, N. 12. - P. 835 - 840.

123. Schaberg T. Risk factors for side-effects of isoniazid, rifampin and pyrazinamide in patients hospitalized for pulmonary tuberculosis / Schaberg T., Rebhan K., Lode H. //Eur. Respir. J. 1996. - V. 9, N. 10. - P. 2026 - 2030.

124. Scholar E.M., Pratt W.B. The antimicrobial drugs 2nd. ed // Oxford Univ. Press. -New York. 2000.

125. Vorachek W. R., Pero R.W., Pearson W.R. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. -V. 85, N. 19. - P. 7293 - 7297.

126. Seidegard J. The role of human glutathione transferases; and epoxide hydrolases in the metabolism of xenobiotics / Seidegard J:, Ekstrom G. // Environ. Health Per-spect. 1997. - V.105, Suppl. 4. -P. 791 - 799.

127. Seifart HJi Population screening for isoniazid acetylator phenotype / Seifart H:I., Parkin D.P., Botha F.J., Donald P.R., Van Der Walt B.J. // Pharmacoepidemiol. Drug Saf.- 2001. V. 10, N. 2. - P. 127- 134.

128. Sendo T. Metabolic hydrolysis, of isoniazid by subcellular fractions of rat liver / Sendo T., Noda A., Nodall., Hsu K.Y., Yamamoto Y. II J: UOEH. 1984. - V. 6, N. 3. -Pi 249- 255.

129. Sim E. An update on genetic, structural and functional studies of arylamine N-acetyltransferases in eucaryotes and. procaryotes / Sim E., Payton M., Noble M., Minchin R; // Hum. Mol. Genet. 2000. - V. 9, N. 16.-P; 2435 - 2441.

130. Sim E. Arylamine N-acetyltransferases: structural and functional?: implications of polymorphisms / Sim E., Lack N., Wang C.J., Long 11., Westwood I., Fullam E., Kawamura A. // Toxicology. 2008. - V. 254, N. 3. - P. 170 - 183.

131. Sipes I.G., Gandolfi A.J. Biotransformation of toxicants // Casarett and Doull's toxicology New York, Macmillan Publishing Company - 1986. - P. 99 - 173.

132. Steele M.A. The role of pyrazinamide in tuberculosis chemotherapy / Steele M.A., Des Prez R.M. // Chest. 1988. - V. 94, N. 4. - P. 845 - 850.

133. Strolin Benedetti M. Induction and autoinductionproperties of rifamycin derivatives: a review of animal and human studies / Strolin Benedetti M., Dostert P. // Environ: Health Perspect. 1994. - V. 102, Suppl. 9. - P. 101 - 105.

134. Sturgill M.G. Xenobiotic-induced hepatotoxicity: mechanisms of liver injury and methods of monitoring hepatic function / Sturgill M.G., Lambert G.H. // Clin. Chem. 1997. - V. 43,N. 8, Pt. 2.-P. 1512 - 1526.

135. Svensson C.K. Effects of chloroquine and primaquine on rat liver cytosolic N-acetyltransferase activity / Svensson C.K., Drobitch R.K., Tomilo M. // Biochem. Pharmacol. 1991. - V. 42, N. 4. - P. 954 - 956.

136. Tafazoli S. Role of hydrazine in isoniazid-induced hepatotoxicity in a hepatocyte inflammation model / Tafazoli S., Mashregi M., O'Brien P.J. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2008. - V. 229, N. 1. - P. 94 - 101.

137. Tang K. The Pstl/Rsal and Dral polymorphisms of CYP2E1 and head and neck cancer risk: a meta-analysis based on 21 case-control studies / Tang K., Li Y., Zhang Z., Gu Y„ Xiong Y., Feng G., He L., Qin S. // BMC Cancer. 2010. - V. 10. - P. 575-582.

138. Tayal V. Hepatoprotective effect of tocopherol against isoniazid and rifampicin induced hepatotoxicity in albino rabbits / Tayal V., Kalra B.S., Agarwal S., Khurana N., Gupta U. // Indian J. Exp. Biol. 2007. - V. 45, N. 12. - P: 1031 - 1036.

139. Teleman M.D. Hepatotoxicity of tuberculosis chemotherapy under general programme conditions in Singapore. / Teleman M.D., Chee C.B., Earnest A., Wang Y.T. // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2002. - V. 6, N. 8. - P. 699 - 705.

140. Tetlow N. Functional polymorphism of human glutathione transferase A2 / Tet-low N., Board P.G. // Pharmacogenetics. 2004. - V. 14, N. 2. - P. 111 - 116.

141. Tetlow N. Polymorphism of human Alpha class glutathione transferases / Tetlow N., Liu D., Board P. // Pharmacogenetics. 2001. - V. 11, N. 7. - P. 609 - 617.

142. Thomas B.H. Effect of rifampin, phenobarbital pretreatment, and acetylator phe-notype on acetylisoniazid metabolism in the rabbit / Thomas B.H., Zeitz W., White-house L.W. // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1987. -V. 65, N. 3. - P. 419 - 423.

143. Timbrell J.A. Isoniazid hepatoxicity: the relationship between covalent binding and metabolism in vivo / Timbrell J.A., Mitchell J.R., Snodgrass W.R., Nelson S.D. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1980. - V. 213, N. 2. - P. 364 - 369.

144. Tomalik-Scharte D: The clinical role of genetic polymorphisms in drug-metabolizing enzyme / Tomalik-Scharte D., Lazar A., Fuhr U., Kirchheiner J. // Pharmacogenomics J. 2008. - V. 8, N. 1. - P. 4 - 15.

145. Walubo A. The effect of isoniazid containing regimen on CYP2E1 during antituberculosis therapy / Walubo A'., Coetsee C., Arti D:, Du Plessis J.B. // Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol. 2005. - V. 117 - 118. - P. 137 - 151.

146. Walubo A. The role of oxygen free radicals in isoniazid-induced hepatotoxicity / Walubo A., Smith P., Folb Pit // Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 1998. - V. 20, N. 8-P. 649-655.

147. Wang J. IL-4-mediated transcriptional regulation of human CYP2E1 by two independent signaling pathways / Wang J., Hu Y., Nekvindova J., Ingelman-Sundberg M., Neve E.P. // Biochem. Pharmacol. 2010. - V. 80, N. 10. - P. 1592 - 1600.s

148. Wang T. Association of P450-2E1 and GSTM1 genetic polymorphisms withsusceptibility to antituberculosis drug-induced hepatotoxicity / Wang T., Wang W.,

149. Wang Z.Y., Pan Y.Y., Su Q.Q., He L.X. // Zhonghua Jie. He. He. Hu. Xi. Za. Zhi. -2009. V. 32, N. 8. - P. 585 - 587.

150. Watanabe J. Different regulation and expression of the human CYP2E1 gene due to the Rsal polymorphism in the 5'-flanking region / Watanabe J., Hayashi S., Kawa-jiri K. // J Biochem. 1994. - V. 116, N. 2. - P. 321 - 326.

151. Weiner I.M. Pharmacology of pyrazinamide: metabolic and renal function studies related to the mechanism of drug-induced urate retention / Weiner I.M., Tinker J.P. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1972. - V. 180, N. 2. - P. 411 - 434.

152. Wen X. Isoniazid is a mechanism-based inhibitor of cytochrome P450 1A2, 2A6, 2C19 and 3A4 isoforms in human liver microsomes / Wen X., Wang J.S., Neu-vonen P:J., Backman J.T. // Eur. J. Clin. Pharmacol. 2002. - V. 57, N. 11. - P. 799 -804.

153. Wilkins J.J. Variability in the population pharmacokinetics of pyrazinamide in South African tuberculosis patients / Wilkins J.J., Langdon G., Mcllleron H., Pillai

154. G.C., Smith P.J., Simonsson U.S. // Eur. J. Clin. Pharmacol. 2006. - V. 62, N. 9 -P. 727 - 735.

155. Wong W.M. Antituberculosis drug-related liver dysfunction in chronic hepatitis B infection / Wong W.M., Wu P.C., Yuen M.F., Cheng C.C., Yew W.W., Wong P.C., Tam C.M., Leung C.C., Lai C.L. // Hepatology. 2000. - V. 31, N. 1. - P. 201 -206.

156. Wu D. Ethanol cytotoxicity to a transfected HepG2 cell line expressing human-cytochrome P4502E1 / Wu D., Cederbaum A.I. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271, N. 39-P. 23914-23919.

157. Yew W.W. Antituberculosis drugs and hepatotoxicity / Yew W.W., Leung C.C. // Respirology. 2006. - V. 11, N. 6. - P. 699 - 707.

158. Younossian A.B. High hepatotoxicity of pyrazinamide and ethambutol for treatment of latent tuberculosis / Younossian A.B., Rochat T., Ketterer J.P., Wacker J., Janssens J.P. // Eur. Respir. J. 2005. - V. 26, N. 3. - P. 462 - 464.

159. Yue J. Effects of rifampin on CYP2E1 -dependent hepatotoxicity of isoniazid in rats / Yue J., Peng R., Chen J., Liu Y., Dong G. // Pharmacol. Res. 2009. - V. 59, N. 2.-P. 112-119.

160. Zhang Y. The curious characteristics of pyrazinamide: a review1/ Zhang Y., . Mitchison D. // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2003. - V. 7, N. 1. - P. 6 - 21.