Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Полиморфизм эндогенного ретровируса МДГ4 (gypsy) в линиях рода Drosophila подгруппы melanogaster
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм эндогенного ретровируса МДГ4 (gypsy) в линиях рода Drosophila подгруппы melanogaster"
На правах рукописи
Саленко Вениамин Борисович
ПОЛИМОРФИЗМ ЭНДОГЕННОГО РЕТРОВИРУСА МДГ4 (дав};) В ЛИНИЯХ РОДА ЫЮБОРШЫ ПОДГРУППЫ МБЫтвАЯТЕЯ
03 00 03 - Молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2007 год
1
003162321
Работа выполнена в Лаборатории подвижности генома Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН
Научный руководитель*
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Крамеров Д А
заведующий Лабораторией эволюции эукариотических геномов Института молекулярной Биологии им В А Энгельгардта РАН
кандидат биологических наук Мельникова Л С
заведующая Группой структурно-функциональной организации генома Ого5орр1а те1апоцай1ег Института биологии гена РАН
Ведущая организация: Институт биологии развития им Н К Кольцова РАН
Защита диссертации состоится «13» ноября 2007 года в 13 00 часов на заседании Диссертационного совета Д 002 235 01 при Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, Москва, ул Вавилова, 32
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, г Москва, ул Вавилова, 32
Автореферат разослан «12» октября 2007 года
доктор биологических наук, профессор, академик РАН
Ильин Юрий Викторович
кандидат химических наук
Ученый секретарь Диссертационного сове
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Мобильные генетические элементы составляют существенную часть генома эукариот На их долю у различных организмов приходится от 10 до 90% всей геномной ДНК У Drosophila melanogaster 10% генома оккупировано мобильными элементами Взаимодействия мобильных генетических элементов с геномом хозяина весьма сложны С одной стороны, мобильные элементы могут встраиваться в кодирующие последовательности, нарушая их структурную целостность, а поскольку они несут собственные сигналы инициации и терминации транскрипции и трансляции, а также могут содержать разнообразные регуляторные последовательности, такие как энхансеры, сайленсеры и инсуляторы, то присутствие мобильного элемента вблизи гена также может сильно повлиять на его экспрессию Считается, что в основном, в условиях стабильности среды обитания, перемещения мобильных элементов приводят к негативным последствиям С другой стороны, транспозиции мобильных элементов полезны для популяции хозяина в условиях изменяющейся окружающей среды, так как они являются важным фактором эволюции, участвуя в рекомбинационных процессах
Спонтанные транспозиции мобильных элементов происходят относительно редко, с частотой, как правило, не превышающей 10"6, что свидетельствует о наличии систем жесткого контроля за перемещениями мобильных элементов со стороны клетки В некоторых случаях частота спонтанных перемещений заметно выше, что, по-видимому, является следствием нарушения работы системы контроля Повышение частоты перемещений может происходить у потомков от особых скрещиваний (эффект получил название гибридного дисгенеза), когда нарушается сложившийся механизм репрессии транспозиций продуктом самого элемента, и в особенных линиях, названных генетически нестабильными, в которых происходят нарушения нормального функционирования системы клеточного контроля Исследование одной из таких линий (названой MS, Mutator Strain) и стабильной линии SS (Stable Strain), из которой была получена линия MS, показало, что генетическая нестабильность в данной линии связана с мутацией гена flamenco [Ilyin et al, 1991, Prud'homme et al, 1995], играющего ключевую роль в контроле перемещений ретротранспозона МДГ4 с использованием механизмов РНК интерференции, в соответствии с недавно предложенной моделью своеобразного иммунитета к транспозициям мобильных элементов [Brennecke et al, 2007]
Мобильный элемент МДГ4 Drosophila melanogaster, в англоязычной литературе известный как gypsy, относится к классу ДКП-содержащих ретроэлементов Он использует РНК-интермедиат для транспозиции, содержит три открытых рамки считывания, аналогичных ретровирусным генам gag, pol и em, и жизненный цикл ею аналогичен
ретровирусному Также имеются экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу того, что этот ретротранспозон является эндогенным ретровирусом дрозофилы [Kim et al, 1994] Несмотря на то, что ретровирусы и ретротранспозоны довольно давно являются объектом пристального внимания исследователей, взаимоотношения на генетическом уровне между ретротранспозонами и ретровирусами и их хозяевами по-прежнему являются по большей части загадкой Поэтому обнаружение эндогенных ретровирусов у дрозофилы, являющейся классическим модельным объектом, открывает новые широкие горизонты для исследования генетического контроля со стороны хозяина за перемещением ретроэлементов Ранее было обнаружено, что ретротранспозон МДГ4 имеет два четко различимых подсемейства, отличающихся ретротранспозиционной активностью, и получивших названия «активный» и «неактивный» [Lyubomirskaya et al, 1993] Исследование распределения двух вариантов элемента в 21 линии дрозофилы показало, что «неактивный» МДГ4 является эволюционно более древним, и, по всей видимости, «активный» вариант образовался из «неактивного» путем накопления точечных мутаций [Lyubomirskaya et al, 2001] Однако в том же исследовании была обнаружена одна линия (Г32), которая содержала необычный вариант МДГ4, появившийся, скорее всего, в результате рекомбинационных процессов Исследование полиморфизма полноразмерных копий МДГ4 является актуальным, так как позволяет пролить свет на происхождение измененных форм элемента, способных преодолевать жесткий контроль со стороны клетки, а изучение неканонических копий МДГ4 позволит подойти к вопросу о происхождении гетерохроматических последовательностей ретротранспозонов, представление о роли которых сегодня существенно меняется Цель и задачи исследования.
Целью данного исследования явилось изучение структурных особенностей ретротранспозона МДГ4 (gypsy) в линии Г32 Drosophila melanogaster, а также в различных видах рода Drosophila подгруппы melanogaster с целью установления возможного источника «активного» варианта МДГ4 В соответствии с целью в работе были поставлены следующие задачи
• провести скрининг ранее созданной геномной библиотеки линии Г32 на основе
бактериофага X и отобрать клоны, имеющие гомологию с МДГ4,
• провести рестрикционно-гибридизационный анализ полученных клонов с целью выявления
полноразмерных копий и общей характеристики неканонических вариантов
последовательностей МДГ4,
• определить первичную структуру нуклеотидных последовательностей, фланкирующих
клонированные копии МДГ4, с целью их локализации в геноме,
• определить принадлежность клонированных полноразмерных вариантов МДГ4 из линии
Г32 к «активному» и «неактивному» подсемействам,
• определить нуклеотидную последовательность и провести сравнительный анализ
полноразмерных вариантов МДГ4 из линии Г32 и доступных из баз данных в сети Интернет,
• получить методом ПЦР, клонировать фрагменты ОРСЗ МДГ4 из различных видов рода
ОгозорЫа подгруппы те\апо£аМег, определить первичную структуру их ДНК на предмет принадлежности к «активному» или «неактивному» подсемейству МДГ4,
• построить филогенетическое древо МДГ4 из различных видов рода дрозофилы на
основании клонированных последовательностей ОРСЗ и сравнить его с древом рода ОгозорЫа подгруппы melanogaster
Научная новизна и практическая ценность работы.
Данная работа посвящена исследованию полиморфизма эндогенного ретровируса МДГ4 в линии Г32 ОгояорЫа те1апо%а$1ег, сравнению различных опубликованных вариантов МДГ4 и анализу элемента из некоторых других видов подгруппы melanogaster рода Т)го$орЫа Последовательности ретроэлемента МДГ4 обнаруживаются в геноме практически всех видов рода дрозофила, одпако, лишь некоторые из них представляют собой неповрежденные полноразмерные и, следовательно, способные к активной транспозиции, копии Таким образом, с одной стороны получается, что МДГ4 (точнее его очень древний предшественник) является давним «жителем» генома дрозофилы С другой стороны, его современный вариант, скорее всего, распространился в геномах дрозофил не так давно Наличие двух четко различимых подсемейств, «активного» и «неактивного», привносит еще большую интригу в ситуацию вокруг МДГ4 и его происхождения
В ходе данной работы из генома линии Г32 ОторЫа me¡anogaster выделены 28 уникальных клонов, имеющих гомологию с МДГ4 Из них четыре оказались впервые клонированным ретротранспозоном gtw¡n и были исключены из данной работы Остальные клоны были проанализированы и классифицированы
Рестриктный анализ выявил 4 полноразмерных копии МДГ4, 2 из которых принадлежат к «неактивному», а 1 - к «активному» подсемействам этого ретроэлемента 4-ая копия МДГ4 - «химерная» - имеет характерные особенности, свойственные обоим вариантам МДГ4 Остальные 20 клонов содержали гетерохроматические последовательности, большинство из которых имеет гомологию с практически полным МДГ4 и, по-видимому, являются компонентом недавно выявленной системы своеобразного иммунитета клетки к транспозициям МДГ4, использующей механизмы РНК-интерференции
Анализ нуклеотидной последовательности четырех полноразмерных вариантов МДГ4 из линии Г32 и сравнение их с доступными в базах данных сети Интернет показал, что все известные до сих пор варианты элемента можно строго отнести к одному из подсемейств, в то время как полученные из библиотеки линии Г32 полноразмерные клоны, хотя их и можно было отнести к «активному» или «неактивному» варианту, имели и замены, характерные для противоположного типа, а также ряд общих для всех вариантов замен, характерных только для данной линии На основании этих, а также ряда данных, полученных в рамках других исследований линии Г32, можно полагать, что в этой линии, по всей видимости, образуется большое количество разрывов ДНК, наличие которых активизирует рекомбипационные процессы, в частности генную конверсию, и перемещение ЬШЕ-подобных ретротранспозонов
Для установления возможного источника эволюционно более молодого «активного» варианта МДГ4 были получены фрагменты ОРСЗ различных видов рода йговорЫа подгруппы mela.noga.ster Анализ нуклеотидной последовательности полученных фрагментов свидетельствует о том, что «активное» подсемейство присуще только виду йгохорЫа melanogaster Сравнение филогенетического древа МДГ4, построенного на основании полученных фрагментов ОРСЗ, с общепринятым древом рода ВгояорЫа подгруппы melanogaster выявило определенное несоотвествие в одной из ветвей на фоне, в целом, существенного совпадения
Полученные данные открывают ряд возможностей для дальнейших исследований эволюции как самого мобильного элемента МДГ4, так и системы клеточного контроля его перемещений Также большой интерес представляют дальнейшие исследования линии Г32 Пго$орЫа те\апо%аШг, имеющей ряд генетических особенностей, одной из которых является повышенная частота рекомбинационных процессов
Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены на XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, апрель 2005)
Публикации По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на НО страницах машинописного текста и состоит из следующих частей введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы Библиография включает в себя '/ДГисточтжов Работа иллюстрирована'// рисунками и ^таблицами
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе исследований причин генетической нестабильности в мутаторной линии MS Drosophila melanogaster бьио обнаружено два подсемейства мобильного элемента МДГ4 (gypsy), отличавшихся своей транспозиционной активностью в культуре клеток Они были условно названы «активным» и «неактивным» Разтличия между этими двумя подсемействами обнаруживаются уже на уровне рестриктных карт Два варианта МДГ4 отличаются наличием у «активного» варианта сайтов рестрикции Ми/(5335), Clal(6939) и HmdIII{4483) в теле элемента и сайта Xbal(430, 7417) в его ДКП (см рис 1) Ранее проведенные исследования распределения элемента в 21 линии Drosophila melanogaster показали, что «неактивный» вариант обнаруживается во всех линиях, а «активный» лишь в некоторых, что свидетельствует о том, что «неактивный» вариант является эволюционно более древним Также в ходе этой работы была обнаружена необычная копия МДГ4 в линии Г32 Этот вариант элемента имеет в своем составе сайт рестрикции Hindlll, свойственный «активному» подсемейству МДГ4, но не содержит сайтов рестрикции Mlul и Clal Для выделения и детального анализа выявленных вариантов МДГ4, Карповой НН была сконструирована геномная библиотека липии Г32 на основе бактериофага 7. 1 Скрининг геномной библиотеки линии Г32 Drosophila melanogaster и общая характеристика клонов
При создании геномной библиотеки ДНК, выделенная из мух, была обработана рестрикционной эндонуклеазой BamHI, сайты которой не содержатся в ретротранспозоне МДГ4 Полученные фрагменты лигировали с вектором XGEM11, упаковывали в капсиды т vitro и использовали для заражения клеток Ecoh MRA, лизогенных по фагу Р2 В такой системе негативные бляшки на чашках Петри образуют только рекомбинантные молекулы Это объясняется тем, что центральный фрагмент векторного бактериофага МЗЕМ11 содержит в своем составе ген gam Фаги gam* не способны к образованию бляшек на штаммах Е coli, лизогенных по фагу Р2, поэтому формировать негативные колонии на таком газоне будут только рекомбинантные (gam ) фаговые частицы
При первичном скрининге было проанализировано не менее 45000 рекомбинантных клопов Этого числа достаточно для того, чтобы охватить практически все уникальные последовательности генома дрозофилы Также в пользу достаточности такого количества клонов говорит и тот факт, что практически все последовательности были выделены в нескольких повторностях Скрининг проводился методом Саузерн-бчот гибридизации на чашках В качестве зонда использовался фрагмент Xhol-Xhol длиной 7 тпн (зонд 1 на рис 1), охватывающий все последовательности МДГ4
MIuI(5335)*
HindIII(4483)*
Hindm(2826) PvuH(2733)
Ncol(1201) Xhal(430) XhoI(199)
EcoRI(6653) CIaI(6939)* Hpal(6991) XhoI(7186) Xbal(7417)* Pstl
L
EffiM
0PC2
p**Пзза
Рисунок 1. Сравнение рестриктных карт "активной" и "неактивной" копий МДГ4. Звездочкой отмечены сайты рестрикции, отсутствующие в "неактивной" копии, в скобках указано расположение рестриктных сайтов на нуклеотидной последовательности МДГ4 (соответствуют первому нуклеотиду в узнаваемой ферментом последовательности) Цифрами обозначены зонды, использованные в Саузерн-блот-гибридизации для выявления структурной организации клонов В нижней части рисунка показаны функциональные области ретротранспозона МДГ4
Выделенные таким образом клоны, гибридизующиеся с последовательностью полного МДГ4, подвергали дальнейшему более детальному анализу методом Саузерн-блот гибридизации с использованием зондов, охватывающих отдельные ОРС и ДКП Данная работа проводилась совместно с АПКотновой и детально описана в ее диссертации и совместной статье
С целью обнаружения клонов, содержащих полноразмерный МДГ4, все клоны обрабатывали рестрикционной эндонуклеазой Xhol и гибридизовали с меченым 32Р зондом Hpal-Pstl (зонд 2, см рис 1), соответствующим ДКП элемента При такой гибридизации в случае полноразмерного элемента на радиоавтографе будут видны 3 полосы, одна длиной порядка 7 тпн, соответствующая телу элемента с фрагментами ДКП по краям, и две -произвольной длины, соответствующие фрагментам ДКП элемента с флакирующими геномными последовательностями В ходе данного эксперимента были выявлены 4 клона (4 1, 8 1, BIO и В18), содержащие полноразмерные копии МДГ4
Из литературных данных известно, что количество эухроматических копий ретротранспозона МДГ4, как правило, не превышает нескольких копий на геном В то же время, ретротранспозоны составляют существенную часть гетерохроматических и прицентромерных районов генома дрозофилы В данной работе мы проанализировали 24 клона, полученных из геномной библиотеки линии Г32 Drosophila melanogaster и только четыре из них являются каноническими Большинство же клонов представляет собой сильно дивергированные последовательности МДГ4
Клоны, идентифицированные как несущие неполноразмерный или сильно дивергировашшй МДГ4, подвергали дальнейшему анализу с использованием рестрикционных эндонуклеаз Xhol и Hindlll Фрагменты, полученные после обработки этими ферментами, разделяли электрофорезом в агарозном геле и переносили на нейлоновый фильтр, который последовательно гибридизовали с 32Р-мечеными зондами 2-5 (рис 1), соответствующими различным ОРС элемента и его ДКП Результаты анализа представлены в Таблице 1
Все клоны можно разделить па 3 группы К первой, наиболее многочисленной, относятся последовательности 12-ти клонов (1 1, 4 2, б 1, 9 1, 1 3, В2, В13, В15, В25, ВЗО, В36, 40А), имеющих гомологию со всеми использованными зондами Строение этих вариантов значительно отличается от канонических полноразмерных копий МДГ4 Саузерн-блот анализ с использованием других рестрикционных эндонуклеаз - Clal, Kprtl, EcoRI, Pstl, Xbal - подтвердил значительные различия в рестрикционных картах МДГ4 и отобранных клонов (данные не показаны) На основании данных Саузерн-блот анализа можно утверждать, что во всех клонах данной группы порядок расположения последовательностей трех рамок полностью совпадает с каноническим, однако, в некоторых клонах происходит их «сжатие» (когда они располагаются на значительно более коротком участке ДНК, чем в каноническом), в других - «растяжение» В ряде случаев имеет место «растяжение» одной из рамок и «сжатие» других В одном случае (клон 40А) одна из рамок данным методом вообще не выявляется (отсутствует гибридизация с зондом 4)
Вторая группа представлена клонами, у которых отсутствует гомология с последовательностью ДКП, но присутствуют последовательности, гомологичные всем трем ОРС МДГ4 (5 1, 7 1) Порядок расположения последовательностей, принадлежащих ОРС, также, как и в случае первой группы, соответствует каноническому МДГ4 Отсутствие ДКП позволяет утверждать, что данные последовательности не способны к самостоятельной экспрессии
В третью группу входят клоны (12А, 3 1, В8, В12, В20, В22), имеющие гомологию только с отдельными участками МДГ4, причем 3 из 6-ти имеют фрагменты только ОРС1, 1 -
0РС1 и совсем незначительный фрагмент ОРС2,1 клон имеет короткий участок гомологии с ОРСЗ, и 1 дает слабую гибридизация с зондами ОРСЗ и ДКП
Таким образом, среди 20 проанализированных клонов, содержащих неканонические последовательности МДГ4, большинство представляет собой сильно дивергированные последовательности полного МДГ4, а несколько клонов несут отдельные фрагменты этого ретротраиспозона Стоит отметить, что ОРС2, гомологичная ретровирусному гену pol, очень консервативна и, следовательно, мы могли выделить не только МДГ4, но и иные гомологичные элементы В пользу последнего утверждения свидетельствует и тот факт, что среди обнаруженных нами последовательностей были 4 копии родственного МДГ4 элемента gtwin
Наличие большого числа неканонических последовательностей МДГ4 хорошо согласуется с недавно представленной моделью контроля транспозиций мобильных элементов, представляющей собой своего рода иммунный ответ клетки на заражение Эта модель является альтернативой широко распространенным представлениям о саморегуляции перемещений мобильных элементов на основе использования репрессоров -модифицированных продуктов самого элемента Предложенная Бреннеком и соавторами модель базируется на использовании механизмов РНК-интерференции, в которой участвуют короткие РНК, образованные на гетерохроматических кластерах дефектных мобильных элементов Предположительно, ген flamenco, контролирующий перемещения МДГ4, является именно таким кластером
Таким образом, установление контроля над транспозициями мобильного элемента (приобретение иммунитета) включает в себя следующие этапы 1) горизонтальный перенос «нового» для клетки элемента, 2) его активные перемещения и накопление дефектных вариантов в гетерохроматине, 3) экспрессия определенных участков гетерохроматина, продуктом которой являются короткие РНК, используемые в РНК-интерференции Данная модель объясняет зависимость контроля транспозиций мобильных элементов от числа их копий
Для локализации неканонических последовательностей МДГ4 мы провели секвенирование их фланкирующих последовательностей, которое проводилось с праймеров к ТЗ и Т7 промоторам, что позволяло определить обе нуклеотидные последовательности, прилегающие к сайтам рестрикционной эндонуклеазы BamHI, по которым клоны были переклонированы из фагового вектора в плазмиду pBluescnpt II SK(+) Для каждого из проанализированных клонов было определено порядка 300-400 пн с каждого конца вставки Полученные последовательности были проанализированы на наличие гомологичных им последовательностей в геноме Drosophla melanogaster с помощью Интернет ресурса
Таблица 1. Общая характеристика клопов, содержащих неканонические последовательности МДГ4, основанная на результатах Саузерн-блог-гибридизации ДНК, выделенной из рекомбинантных клонов бактериофага X, со специфическими ДНК-зондами "+" - значительная гибридизация, "+/-" - слабая гибридизация, "-" - отсутствие гибридизации с соответствующим ДНК-зондом
№ клона1 Наличие гомологии с дкп Наличие гомологии с ОРС1 Наличие гомологии с ОРС2 Наличие гомологии с ОРСЗ Структурная организация ОРС1 Окружающие мобильные элементы и возможная локализация3 в геноме
] 1 (14) + + + + 1 - растянута, 2,3 -сжаты stalker, invader, 42F
б 1 (9,5) + + + + 3,8 тпн - все три рамки X, scaffolds
9 1 (16) + + + + 5,5 тпн - все три рамки stalker, springer, 19E8 или 40E1
1 3 (15) + + + +/- 4,3 тпн - все три рамки baggins, jockey
4 2(13) + + + + 1 - растянута, 2,3 - сжаты X, 42A
В2 (17) + + + + 3 - растянута invader, scaffolds
В13 (20) + + + + Похож на канонический теломера 2R хромосомы
В15 (15) + + + + Все растянуты не определяли
В25 (19) + + + + Похож на канонический Mb, Crla, 41D3
В30 (14) + + + +/- 1 - растянута не определяли
ВЗб (19) + + + + Идентичен В25, но вставка ЮОпн в ОРС2 idefix, гетерохроматин 41D2
40А (13) + + - + Растянут F, BS
5 1 (9,5) - + + + Все растянуты scaffolds
7 1 (14,5) - + + + 1 - сжата, 2, 3 - растянуты roo, 1360 (Hoppel), 41E4
12А (18) +/- - - +/- 64A6, между генами Chd64 и Ack
3 1 (9,5) - + + - 1-растянута, 2-незначит участок F, X, 71D
В8 (12) - +/- - - нет гомологии
В12 (13) - - - + нет гомологии
В20 (15) - + - - не определяли
В22 (15) - + - - Участок ОРС 1 не определяли
' В скобках указан размер вставки в тпн
2 Порядок рамок определялся на основании того, что зонд Зперекрывает ОРС2, а зонд 5 затрагивает ОРС2 О «растяжении» и «сжатии» судили по минимальной сумме размеров гибридизующихся фрагментов
3 Номер секции указан в том случае, когда в нее попадают обе фланкирующие последовательности, однако, ни в одном случае размер вставки не совпал с дистанцией на хромосоме
http //www nebí nlm nih gov/BLAST Следует отметить, что все последовательности, прилежащие к выделенным из линии Г32 неканоническим копиям МДГ4, находятся в гетерохроматине, преимущественно прицентромерном Во всех случаях фактический размер вставки в клоне не совпал с расстоянием между соответствующими последовательностями генома дрозофилы, используемого в данном ресурсе (Drosophila melanogaster genome build 5 1, FlyBase GeneBank, release 4), что свидетельствует о значительных межлинейных вариациях гетерохроматических районов Из 20 последовательностей нам удалось более-менее точно локализовать только 5 (В13, В25, В36, 7 1, 12А) Последовательности МДГ4 из клонов В25, ВЗб имеют схожую структурную организацию (по результатам Саузерн-блот анализа с использованием различных рестрикционных эндонуклеаз) и попадают в один и тот же самый большой кластер мобильных элементов, выявленный Бергманом и соавторами и расположенный в 2R хромосоме В этом же кластере локализуется и последовательность МДГ4 из клона 7 1, причем только эта последовательность соседствует с мобильным элементом - не ретротранспозоном Положение еще 4-х (1 1, 9 1, 4 2, 3 1) можно определить лишь с некоторой долей уверенности, так как фланкирующие последовательности локализуются примерно в одинаковых местах, но расстояние между ними в геноме дрозофилы из базы данных сильно превышает размер вставки в клоне Остальные 11 клонов локализовать не удалось, поскольку они давали гомологию с различными ретротранспозонами в разных участках генома или давали гомологию только с неклассифицированными последовательностями (genomic scaffolds)
Как уже отмечалось, из локализованных клонов большая часть попадает в прицентромерные районы хромосом, в частности в секцию 41 хромосомы 2R, что согласуется с данными Бергмана и коллег, определившего в геноме дрозофилы 23 кластера мобильных элементов, 12-ый из которых (2R, секция 41) - самый большой и, по их данным, скорее всего, фиксирован у D melanogaster Дальнейшее детальное исследование структуры неканонических копий МДГ4 и их локализации в геноме представляет большой интерес, так как может пролить свет на формирование «иммунной памяти» клетки об инвазии ретроэлемента
2. Анализ полноразмерных вариантов МДГ4
2.1 Проверка клонов на наличие сайтов рестрикции MluI, Clal и HindlII, характерных для «активного» варианта МДГ4
С целью проверки наличия сайтов рестрикции, отличающих «активный» вариант МДГ4 от «неактивного», переклонированные в плазмиду pBluescriptll SK(+) клоны, содержащие полноразмерные МДГ4, обрабатывали маркерными рестрикционными эндонуклеазами и гибридизовали с соответствующими зондами
В случае сайга рестрикции Ми! (5335) ДНК клонов была обработана рестриктазами МЫ и Х1ю!, поел с чего фрагменты разделяли электрофорезом в ага розном геле и гибридизонали с зондом НтсПП-ЕсоЮ (зонд 5, рис. 1). В случае наличия сайта М1и! л положении 5335, как у «активною» варианта ретротранспозона. на радиоавтографе можно наблюдать две полосы, соответствующие фрагментам ДНК длиной 1850 и 1564 пи. В случае отсутствия этого сайта, что характерно д.тя «неактивного;» варианта, наблюдается одна полоса, соответствующая фрагменту длиной 3414 гш (см. рис, 2).
а) Ь) „ с)
' пн 8.1 В1$в10 4,1 ! пн 8.1 В18В10 -4.1 1 пн 8.1 В18В10 4.1
3414-
1ШI 3483 :
P-fíí:'
Рисунок 2, Исследования палячпя маркерных сайтов рестрикции в полно раз мерных копиях МДГ4 из линии Г32. а) наличие сайта рестрикции Mini, Ь) наличие сайта рестрикции Clal, с) наличие сайта рестрикции HinaUl(Объяснение см. в тексте).
Для выявления сайта рестрикции Clal (6939) ДНК клонов обрабатывали рестрикционными эндонужлевзвми Clal и ШЩ после чего фрагменты разделяли электрофорезом в агарозном геле и анализировали с помощью гибридизации с зондом HindlH-EcoRl (зонд 5. рис. 1). В случае наличия сайта Clal в положении 6939, характерного для «активного!) варианта МДГ4, на радиоавтографе можно наблюдать полосу, соответствующую фрагменту ДНК длиной 3483 пн. В противном случае размер выявляемого фрагмента составляет 3730 пн (см. рис, 2).
Аналогичным образом проводили определение наличия сайта рестрикция Hindll! (4483). В этом случае ДНК клонов обрабатывали рестриктазами НшНИ и Xhol, а в качестве зонда использовали фрагмент Hindlll-HindHf (зонд 4, рис. 1). При наличии сайта Hindli! в положении 4483, что характерно для «активного» варианта элемента, на радиоавтографе можно наблюдать полосу, соответствующую фрагменту ДНК длиной 2703 пн. В случае отсутствия этого сайта наблюдается одна полоса длиной 4360 пн (см. рие. 2).
Как видно из рис. 2, клопы 8.1 и В18 содержат копии МДГ4, несущие все сайты, характерные для «актаниогол МДГ4, МДГ4 клона 4.1 по данным рестрикционного анализа можно отнести к «неактивному» варианту. Копия МДГ4 из клона В10, подобно «активному»
подсемейству, содержит сайт Hindlll (4483), и как «неактивное» подсемейство не содержит сайтов Мм/(5335) и ClaJ(6939)
2.2 Сравнительный анализ полноразмерных вариантов МДГ4 из линии Г32
Среди четырех полноразмерных клонов МДГ4, выделенных из линии Г32 Drosophila melanogaster, два клона (8 1 и В18) имели все рестрикционные сайты, характерные для «активного» семейства, один (4 1) не имел этих сайтов, и, соответственно, gypsy в этом клоне был отнесен к «неактивному» типу, а оставшийся клон BIO имел сайты HmdIII(4483) в теле элемента и Л2>а/(430,7417) в обоих ДКП, но не имел сайтов Mlul и Clal, характерных для «активного» варианта Все это делало классификацию данного клона весьма затруднительной
Мы провели определение полной нуклеотидной последовательности всех полноразмерных вариантов МДГ4 из линии Г32 D melanogaster и проанализировали их отличия друг от друга и от других полноразмерных МДГ4, последовательности которых доступны в базе данных в сети Интернет В общей сложности нами было проанализировано 14 последовательностей, 4 из которых происходят из линии Г32 Две последовательности, полученные из GenBank, были идентичны друг другу, хотя и имели разное происхождение (AF033821 и М12927), еще одна последовательность (СР000207) была исключена из рассмотрения, так как в ней находилось слишком большое количество точечных инсерций и делеций во второй ОРС
Результаты анализа всех известных полноразмерных вариантов МДГ4 представлены в таблице 2 Нами было обнаружено 49 дискриминативных (между «активным» и «неактивным» вариантами МДГ4) нуклеотидных замен, и только 10 из них приводят к замене аминокислоты 4 в ОРС1, и по 3 в каждой другой ОРС (см таблицу 2, рис 3) Семь единичных замен в ОРС1, 9 в ОРС2 и 10 в ОРСЗ синонимичны Также есть по 10 дискриминативных замен в каждом из ДКП, 2 в 5' нетранслируемой области и 1 в области между ОРС2 и 3 Помимо всего выше перечисленного, есть еще определнное количество полиморфных сайтов, замены в которых характерны только для определенного элемента
У всех, кроме трех, полноразмерных вариантов, выявленных в базах данных в Интернет, левый и правый ДКП были идентичны Исключениями были варианты АС150550, АС008256 и AABU01002764 У всех четырех элементов из Г32 левый и правый ДКП также совпадали, что свидетельствует об относительно недавних транспозициях этих элементов
Все полноразмерные варианты МДГ4, полученные из баз данных, имеют дискриминативные сайты либо «активного», (М12927, АС150550 и АС008256) либо «неактивного» (Z31368, СР000224, СР000368, AABU01002764 и AABU01000655) типа В
Таблица 2 Количество замен в различных частях полноразмерных клонов МДГ4, получены* из линии Г32 и баз данных сети Интернет, "а" - "активный" вариант замены, "н" - "неактивный" тип, у - уникальный (характерный только для конкретной копии) Количество аминокислотных
Часть элемента ДКП Обл инсулят ОРС1 ОРС2 ОРСЗ
Изменения ДНК а н У а н У а н У а н У а н У
4 1(DQ887187) 1 9 2 0 2 1 1 10(4) 1 0 14(3) 1 1 12(3) 0
B10(DQ887186) 3 7 0 0 2 0 5(1) 6(3) 0 2 12(3) 1 1 12(3) 0
8 KEF591042) 10 0 2 1 1 1 11(4) 0 0 9(3) 5 2 11(3) 2 4
B18(EF591043) 10 0 2 1 1 1 11(4) 0 0 9(3) 5 3 11(3) 2 2
Ml 2927 10 0 0 2 0 0 11(4) 0 0 14(3) 0 2 13(3) 0 1
Z31368 0 10 1 0 2 1 2 9(4) 3 0 13(3) 4 0 13(3) 1
АС 1505 50 10 0 0 2 0 0 11(4) 0 0 14(3) 0 0 13(3) 0 0
СР000224 0 10 1 0 2 2 0 11(4) 0 0 14(3) 2 0 13(3) 1
АС008256 10 0 0 2 0 0 11(4) 0 2 14(3) 0 0 13(3) 0 0
СР000368 0 10 1 0 2 0 0 11(4) 0 0 14(3) 0 0 13(3) 1
AABU01002764 0 10 0 0 2 1 0 11(4) 0 0 14(3) 0 0 13(3) 2
AABU01000655 1 9 1 0 2 0 0 11(4) 0 0 14(3) 0 0 13(3) 0
ту т TI » т » »
11 m 1 т IT Т т | IT т т
TT IT 1 т » » 1 1 т т ,„1„п. и
TT Т 1 Т 1 » » 1 т т Т
1 п т т т т
п т т TT II » » 1 YI т 1 1
TT т » » т т т т
СР000224 | TT IT 1 TI Т т т «—А™.
1 TT у т » » » » _
1 TT т т т . »,,.„,Т, ,у.„ .......
JII 1,1. TT т т т T Т т т ___а
пит ТПН. о OS 1И OPC1 1 5 2 25 3 35 ОРС2 4 4.5 5 55 ОРСЗ Е 65 №Ш1 7 75
Рисунок 3 Сравнительный анализ полноразмерных вариантов МДГ4 Последовательности, соответствующие «активному» типу, показаны черным, «неактивному» - серым Дискриминативные аминокислотные замены показаны стрелками, уникальные замены - черточками Структурная организация элемента показана внизу рисунка
линии Г32 ситуация отличная Клоны 8 1 и В18 могут быть отнесены к «активному» подсемейству, но оба клона имеют 8 одинаковых замен «неактивного» типа (1 в 5'нетранслируемой области, 4 в ОРС2, 1 между ОРС2 и 3, и 2 в ОРСЗ) Эти клоны отличаются друг от друга несколькими уникальными заменами и своим положением в геноме Оба этих элемента имеют по 2 уникальных замены в ДКП и несколько (1 в 5' нетранслируемой области, 1 в ОРС2 и 1 в ОРСЗ) общих для обоих Кроме того, клон 8 1 несет 3 уникальные замены (1 в ОРС2 и 2 в ОРСЗ), которых не имеет вариант В18, в то время как в клоне В18 есть 2 замены в ОРС2, характерные только для этого элемента
Наибольшее число замен в элементе из клона 4 1 относятся к «неактивному» типу, но есть четыре сайта, характерных для «активного» варианта МДГ4 (1 в каждом из ДКП и по одному в ОРС1 и 3)
Однако наибольший интерес представляет клон BIO Большинство дискриминативных сайтов относятся к «неактивному» типу, но есть 13 сайтов, представляющих собой «активные» замены по 3 из них располагаются в каждом из ДКП, 5 в ОРС1 и по 1 в ОРС2 и 3 (см рис 3) Эти замены располагаются на последовательности не случайным образом 3 сайта в ОРС1 образуют «активный» участок длиной 136 пн в «неактивном» окружении элемента BIO 2 из 3-х сайтов, расположенных в ДКП, находятся на 3' концах ДКП, образуя «активный» фрагмент длиной 122 пн Оставшиеся 6 сайтов расположены на элементе равномерно Все эти факты не позволили нам четко классифицировать элемент из клона BIO, мы решили назвать его «химерным»
Кроме всего перечисленного выше, мы обнаружили ряд сайтов, общих для всех элементов из линии Г32, независимо от их принадлежности к «активному», «неактивному» или уникальному типу (1 «активный» в ДКП элемента, 1 «неактивный» в 5' нетранслируемой области, 1 «активный» в ОРС1, 4 «неактивных» в ОРС2, 1 «неактивный» между ОРС2 и 3 и 1 «активный» и 2 «неактивных» в ОРСЗ элемента) Это указывает на наличие у линии Г32 некоторых особенностей, характерных только для данной линии Drosophúa melanogaster
Интересно также, что все полноразмерные копии МДГ4 в линии Г32 содержат всего один повтор в 109 нуклеотидов в инсуляторе (в норме МДГ4 несет два таких повтора в своем инсуляторе, потеря одного из них сильно снижает мутагенный эффект от встраивания данного элемента, если он обусловлен взаимодействием инсулятора с регуляторными областями гена-мишени)
Нами также были частично определены нуклеотидные последовательности, фланкирующие полноразмерные элементы МДГ4 из линии Г32 Секвенировались как фрагменты, прилежащие к ДКП элемента, так и прилежащие к сайтам рестрикции BamHl, по которым проводилось клонирование Оказалось, что элементы из клонов 8 1, BIO и В18 окружены дуплицированным сайтом встраивания TACA, а клон 4 1 - сайтом TATA Такие дупликации по краям элемента являются классическими для МДГ4 и свидетельствуют о том, что эти копии могли перемещаться в относительно недалеком прошлом В геноме дрозофилы был проведен поиск последовательностей, гомологичных фланкирующим последовательностям полноразмерных МДГ4 из линии Г32 с помощью Интернет ресурса http //www nebí nlm mh gov/BLAST Элемент из клона BIO удалось локализовать точно в секции 78D3 в прицентромерном районе хромосомы 3L Два активных варианта МДГ4, 8 1 и
В18, по результатам сиквенирования прилегающего к ДКП элементов окружения, встроены в одно и то же место в ДКП ретротранспозона micropta с дупликацией сайта встраивания TACA, однако дисталыюе окружение у них различно, что говорит о расположении этих элементов в разных участках генома дрозофилы (предположительно оба элемента находятся в прицентромерном гетерохроматине хромосомы 2 8 1 в кластере мобильных элементов в секции 41 плеча R, а В18 ™ в секции 40 плеча L) Вероятно после встраивания МДГ4 в ретротранспозон micropia произошел перенос уже такого составного элемента в другое место с последующим накоплением незначительных изменений, что и объясняет столь небольшую разницу между элементами из клонов 8 1 и В18 Точная локализация «неактивной» копии ретротранспозона МДГ4 из линии Г32 не представляется возможной в силу отсутствия гомологии ее окружения с одпой стороны с аннотированными последовательностями генома дрозофилы Однако по результатам анализа другой фланкирующей последовательности можно полагать, что данная копия также находится в кластере 41-й секции хромосомы 2R
Как уже говорилось ранее, линия Г32 содержит большое количество сильно перестроенных вариантов МДГ4 Кроме того, в этой линии присутствует элемент gtwm, число копий котрого по данным гибридизации in situ на политенных хромосомах существенно превышает обычное Цитогепетическиое исследование этой линии выявило наличие двух протяженных инверсии в 3-й хромосоме, фланкированных ретротранспозоном gtwm и вызванных, по всей видимости, рекомбинацией по этому элементу Исследование линии Г32 методом т situ гибридизации на политенных хромосомах на наличие активности других мобильных элементов показало, что в этой линии происходят перемещения LINE-подобных элементов Doc и Jokey Все эти факты позволяют нам предположить, что в линии Г32 с повышенной частотой образуются разрывы в ДНК, что активизирует перемещение LINE-подобных ретротранспозонов, а также рекомбинационные процессы, включая генную конверсию, которая, по всей видимости, приводит к «усреднению» полноразмерных вариантов МДГ4 в линии Г32
3 Анализ ОРСЗ МДГ4 из различных видов Drosophüa подгруппы melanogaster
Проведенный нами анализ всех известных вариантов полноразмерного МДГ4 показал, что они четко распределяются на два подсемейства - «активное» и «неактивное» Исключении являются копии из линии Г32, в которой обнаруживается некоторое «усреднение» вариантов Однако, это скорее свойство данной линии, а не свидетельство в пользу постепенного «мутирования» «неактивного» МДГ4 в «активный» Таким образом, вопрос о происхождении «активного» варианта МДГ4 остается открытым Наши недавние исследования распределения МДГ4-подобного ретротранспозона gtwm в различных видах подгруппы melanogaster рода Drosophila показали, что в недавнем времени произошел акт
горизонтального переноса этого элемента межу видами D melanogaster и D erecta В этой связи мы решили провести поиск МДГ4 «активного» типа в геноме видов рода Drosophila, являющихся ближайшими родственниками D melanogaster
3.1 Получение фрагментов ОРСЗ МДГ4 из разных видов дрозофилы подгруппы melanogaster
Методом ПЦР был получен фрагмент длинной 1184 пн, охватывающий практически полностью ОРСЗ МДГ4 (5806-6789) В качестве матрицы использовали геномную ДНК, выделенную из 6-ти видов Drosophila подгруппы melanogaster ОРСЗ была выбрана в связи с тем, что она необходима для проявления ретровирусной активности МДГ4 Кроме того, амплифицированный нами фрагмент содержит 10 из 13 дискриминативных замен, имеющихся в ОРСЗ Анализ соответствующих последовательностей Drosophila simulons и Drosophila sechellia, доступных из базы данных Trace Archive в Интернет, содержащей последовательности геномов различных видов организмов, определение полной первичной структуры ДНК которых еще не закончено (http //www nebí nlm nih gov/BLAST/, базы данных «unfinished Drosophila sechellia genomic sequences» и «unfinished Drosophila simulons genomic sequences»), показал, что эти последовательности имеют гомологию всего 88% с аналогичным участком МДГ4 из Drosophila melanogaster, что не позволяет классифицировать их как «активные» или «неактивные», поскольку последние имеют гомологию 99% Поэтому данные виды были исключены из рассмотрения
ДНК остальных 6 видов дрозофилы подгруппы melanogaster, а именно Drosophila mauritiana, Drosophila orena, Drosophila erecta, Drosophila santomea, Drosophila yakuba, Drosophila teissieri, была использована в качестве матрицы для получения интересующего нас фрагмента методом ПЦР Полученные ПЦР-продукты анализировали на предмет полиморфизма вариантов МДГ4 в пределах каждого вида Эти данные в дальнейшем позволили нам отобрать индивидуальные клоны для определения их нуклеотидной последовательности
Для анализа использовали шесть рестрикционных эндонуклеаз Xbal (5840), EcoRI (6654), Bcll{6013, 6161), AccI (6090, 6313, 6746), Mfel (6202) и Dral (5903) Результаты этих экспериментов представлены на рисунке 4 Как видно из рисунка, при обработке ПЦР-продуктов эндонуклеазой Xbal (рис 4а) обнаруживается полиморфизм по этому сайту только у Drosophila mauritiana У остальных видов этот сайт либо присутсвует (Drosophila yakuba, Drosophila teissieri и Drosophila santomea), либо его нет (Drosophila erecta и Drosophila orena)
При обработке ПЦР-продуктов рестрикционной эндонуклеазой Dral (рис 4Ь) полиморфизм по наличию этого сайта рестрикции обнаруживается у Drosophila erecta У
остальных наследованных пкдоо дрозофилы полиморфизма по этому сайту нет: он есть в элементах из Ого$орЫ1а тстгШапа и ОгозоркИа огепа, а у Вго.чоркПа уакиЬа, ОгозорИИа 1еЫ1егг пЁгогорЬИч мМотеа сайт рестрикции Вга! отсутствует.
1 %
а)
«
5
а
(3
'Я
4, Л 1 в 3
I $ 1 I *
3 сз о" ¡3 а'
яШ \
им— Ш':
; . Я»
297 •
,5 в
£ й -ё
3 I 1 Ч
и ПИ ^ О о а
I
1 ф
1Щ-
629407-
ИЗ-
■Зв^ЧЙ«! :
3
I I
■¡Й§|
^ 13
I 1 I
ЗЯЯИр, , ,
ь
о .к
о
1 1
£ а
ш
104В—
136-
■ЛЩ'"
КС?*. ■
Рисунок 4, Электрофоре граммы рестрикций ПЦР-продуктов, полученных при амплификации фрагмента ОРСЗ МД14. Над дорожками указаны виды дрозофилы. ДНК которых использовалась в качестве матрицы. Обработку ПЩ-продуктов проводили рестрикционямми эндонукдеазами: а) ХЬаТ, Ь) Вга1, с) ВЫ/, а) Асс1 о) М/е1ч 0 ЕсоЮ.
При обработке ПЦР-продуктов ресгрикционной эндоиуклеазой Bell (рис 4с) полиморфизма не обнаруживается ни в одном из исследованных видов Оба сайта рестрикции этого фермента отсутствуют в ДНК Drosophila mauritiana и оба присутствуют в ДНК всех остальных исследованных видов
При обработке ПЦР-продуктов ферментом Mfel (рис 4е) также полиморфизм не выявляется ни в одном из исследованных видов Ситуация полностью аналогична ситуации с обработкой рестрикционной эндонуклеазой Bell сайт этого фермента обнаруживается в элементе Drosophila mauritiana и отсутствует во всех остальных исследованных видах
При обработке ПЦР-продуктов рестрикционной эндонуклеазой EcoRI (рис 4f) не обнаруживается никакого полиморфизма Этот сайт присутствует в МДГ4 всех исследованных видов дрозофилы
Наиболее сложная картина наблюдается в случае рестрикционной эндонуклеазы Accl Этот фермент имеет три сайта узнавания в интересующем нас фрагменте ОРСЗ в положениях 6090, 6313 и 6746, причем последний из них располагается на расстоянии 44 пн от конца фрагмента, в связи с чем определить его наличие в фрагменте не представляется возможным Фрагмент длиной 223 пн присутствует во всех видах, кроме Drosophila mauritiana Этот фрагмент может появиться на электрофорезе только в том случае, ести присутствуют оба сайта рестрикции, расположенные в положении 6090 и 6313 Таким образом можно утверждать, что эти сайты присутствуют во всех исследованных видах, кроме Drosophila mauritiana В силу недостаточной ясности ситуации с Accl, обработка этим ферментом была повторена после клонирования ПЦР-продукта Полиморфизм по наличию третьего сайта рестрикции Accl (6746) был обнаружен только в клонах из Drosophila mauritiana На рисунке 4 можно также видеть некоторые дополнительные минорные полосы, которые могут соответствовать случаям неполного гидролиза ДНК Такие случаи легко отличить от случаев полиморфизма по интенсивности свечения окрашенных бромистым этидием полос в жестком ультрафиолетовом свете Однако, такие случаи все равно проверялись после клонирования фрагмента Выводы о полиморфизме или неполном переваривании всегда подтверждались
Следует отметить, что уже на предварительной стадии стало ясно, что МДГ4 в Drosophila mauritiana существенно отличается от этого элемента в других видах, исследованных в данных экспериментах В дальнейшем секвинирование ПЦР-продуктов, показало, что МДГ4 в Drosophila mauritiana гораздо более близок к ретроэлементу из Drosophila sechellia и Drosophila simulons и имеет гомологию всего 88% с МДГ4 Drosophila melanogaster, что делает невозможным дискриминацию между «активным» и «неактивным»
вариантами Поэтому данный вид дрозофилы был также исключен из дальнейшего рассмотрения
3.2 Анализ пуклеотидной последовательности фрагментов ОРСЗ МДГ4 из разных видов дрозофилы подгруппы melanogaster
ПЦР-продукты были клонированы в вектор pBluesknptll SK (+), в результате было получено не менее 6 индивидуальных клопов с ПЦР-продуктом каждого вида. Все клоны снова подвергались рестриктному анализу с помощью рестрикционных эндонуклеаз, по которым был обнаружеп полиморфизм при первичном анализе Как уже упоминалось выше, клоны всех видов были проанализированы на наличие у них третьего сайта узнавания фермента AccI В результате были отобраны индивидуальные уникальные клоны для каждого вида
Для всех клонов была определена первичная структура ДНК Последовательности сравнивали с помощью программы Vector NTI Suite 9, филогенетическое древо было построено с помощью программы MEGA 3 1 Результаты сравнительного анализа представлены на рисунке S и в таблице 3
МДГ4 из всех видов, кроме Drosophila таигшапа, Drosophila sechellia и Drosophila simulons, имел гомологию около 98% с «неактивным» МДГ4 из Drosophila melanogaster В анализируемом фрагменте находится 10 дискриминативных замен, позволяющих отличать «активный» и «неактивный» варианты МДГ4 Две из этих замен ведут к замене аминокислоты Все, кроме одного, сайты в исследованных последовательностях были «неактивного» типа (за исключением D santomea) Единственный сайт «активного» типа
Таблица 3 Нуклеотидные замены, характерные аля «активного» н «неактивного» вариантов МДГ4, находящиеся в ОРСЗ элемента из различных вндов подгруппы те1аподаИег. Замены «активного» типа выделены жирным шрифтом Положение указано согласно последовательности
Положение замены 5749 5902 6070 6362 6409 6490 6535 6668 6717 6748
Dmel "акт" (Ml2927) С т А T С С С А А A
Dmel "неакт" (Z31368) т А G С т т т С G С
Dorena 14 (EF591046) т А G с т с т С G С
Derecta 19 (EF591044) т А G с т с т с G С
Derecta20 (EF591045) т А G с т с т с G с
D santomea 19 (EF591047) т А G T т с т с G с
D yakuba 7 (EF591049) т А G с т с т с G с
Dteissien 1 (EF591048) т А G с т с т с G с
fs
чг
-г
L-d
Р melanogaster D simulans 0 mauritiana D sechelia Dteissieri D santomea Dyakuba Derecta
orena
H_
D melanogaster "неактивный" D melanogaster "активный" teissieri-1
K- santomea-19 T- yakuba-7 г erecta-20 erecta-19 orena-14 - gtwinORF3
Рисунок 5 Филогенетическое древо рода Drosophila подгруппы melanogaster (слева) и филогенетическое древо фрагментов ОРСЗ ретроэлемента МДГ4 из различных видов подгруппы (справа) Древо ОРСЗ было получено по методу Кимуры с применением программы MEGA 3 1
обнаруживается во всех последовательностях в положении 6490 Эта замена не приводит к изменению аминокислоты и совпадает с одним из «активных» сайтов, общих для всех клонов МДГ4 из линии Г32 МДГ4 из Drosophila santomea имеет еще один сайт «активного» типа, находящийся в положении 6362, который также синонимичен (не приводит к замене аминокислоты)
Таким образом, проведенный нами анализ ОРСЗ МДГ4 из различных видов рода Drosophila подгруппы melanogaster не выявил наличия «активных» вариантов МДГ4 ни в одном из них (кроме собственно Drosophila melanogaster) Это может говорить о том, что «активный» вариант элемента характерен только для данного вида дрозофилы Ранее предполагалось, что в ходе эволюции дрозофилы появился механизм, репрессирующий перемещения МДГ4 В ответ на это появился «активный» вариант элемента, поскольку только «активный» МДГ4 перемещается в присутствии пермиссивного аллеля гена flamenco Если так, то можно предполагать, что это произошло в какой-то популяции Drosophila melanogaster сравнительно недавно, уже после того, как сформировалось современное древо дрозофил, и «активный» вариант распространяется только в пределах одного вида -Drosophila melanogaster Вместе с тем, если принять во внимание последние данные Бреннека и соавторов, которые считают, что flamenco репрессирует экспрессию МДГ4 через РНК-интерференцию, причем репрессивный аллель действует как на «активный» так и на «неактивный» МДГ4, то возникает вопрос почему пермиссивный аллель «разрешает» перемещаться только «активному» варианту1? Возможно, flamenco является не единственным регулятором экспрессии МДГ4, причем именно другие контролирующие гены способны различать РНК «активного» и «неактивного» элементов Существует также иное объяснение данному факту Возможно, что РНК обоих вариантов МДГ4 не разрушается в линиях с
пермессивным аллелем flamenco, но судьба этих РНК различна на более поздних стадиях ретротранспозиционпого цикла
Филогенетическое исследование ОРСЗ из различных видов рода Drosophila показало отсутствие серьезных различий между древом МДГ4 и древом видов, из которых элемент выделен, если исключить D simulans, D mauritiana и D sechellia Таким образом получается, что все виды подгруппы можно поделить на две больших категории D orena, D erecta, Dsantomea, Dyakuba и Dteissieri, имеющие гомологию 98% с «неактивным» вариантом МДГ4 из Drosophila melanogaster, и D simulans, D mauritiana и D sechellia, последовательности ОРСЗ которых имеют лишь 88% гомологии с МДГ4 из Drosophila melanogaster В то же время, именно последние виды, согласно общепринятой филогении подгруппы, являются ближайшими родственниками Drosophila melanogaster Наши данные, полученные при анализе последовательностей ОРСЗ, коррелируют с результатами аналогичной работы, в которой авторы проводили анализ участка длиной 362 пн из гена pol элемента МДГ4 Они также обнаружили два различных варианта МДГ4, один в D simulans, D mauritiana и D sechellia и другой в остальных видах подгруппы Это несоответствие может быть отнесено либо на счет большей частоты спонтанных мутаций, затронувших МДГ4 после отделения ветви D simulans, D mauritiana и D sechellia от Drosophila melanogaster, либо, что более вероятно, горизонтальным переносом МДГ4 между Drosophila melanogaster и каким-то из его родственных видов
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1 Bergman CM, Quesneville Н, Anxolabehere D, Ashburner М (2006) Recurrent insertion and
duplication generate networks of transposable element sequences ш the Drosophila melanogaster genome Genome Biol, 7 R112
2 Brennecke J, Aravin AA, Stark A, Dus M, Kellis M, Sachidanandam R, Hannon GJ (2007)
Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila Cell 128. 1089-1103
3 Ilyin YV, Lyubomirskaya NV, Kim AI (1991) Retrotransposon Gypsy and genetic instability in
Drosophila (review) Genetica, 85 13-22
4 Kim AI, Terzian C, Santamana P, Pelisson A, Prud'homme N, Bucheton A (1994) Retroviruses
m invertebrates the gypsy retrotransposon is apparently an infectious retrovirus of Drosophila melanogaster Proc Natl Acad Sci USA 91 1285-9
5 Lyubomirskaya NV, Avedisov SN, Surkov SA, Буш YV (1993) Two Drosophila
retrotransposon gypsy subfamilies differ in ability to produce new DNA copies via reverse transcription in Drosophila cultured cells Nucl Acids Res 21 3265-3268
6 Lyubomirskaya NV, Smirnova JB, Razorenova OV, Karpova NN, Surkov SA, Avedisov SN,
Kim AI, Ilyin YV (2001) Two variants of the Drosophila melanogaster retrotransposon gypsy (mdg4) structural and functional differences, and distribution m fly stocks Mol Genet Genomics Apr,265(2) 367-74
7 Prud'homme N, Gans M, Terzian C, Bucheton A (1995) Flamenco, a gene controlling the gypsy
retrovirus of Drosophila melanogaster Genetics 139 697-711
выводы
1 Проведен рестрикционно-гибридизационный анализ полученных при скрининге
геномной библиотеки линии Г32 клонов, и вьивлены 4 полноразмерных копии МДГ4 и 20 неканонических вариантов последовательностей МДГ4, большинство из которых представлено сильно дивергированными копиями полного или почти полного (без ДКП) элемента, однако есть копии, представленные лишь фрагментами отдельных рамок считывания,
2 Определена первичная структура нуклеотидных последовательностей, фланкирующих
клонированные копии МДГ4 и показано, что все копии, включая 4 полноразмерных, локализуются в гетерохроматине, преимущественно в прицентромерных кластерах мобильпых элементов, причем 2 «активные» копии располагаются в одном и том же месте внутри ДКП ретротранспозона micropia, но в разных кластерах с двух сторон от цетромеры 2-й хромосомы, в одном из этих кластеров располагается, по-видимому, и неактивная полноразмерная копия,
3 Определена нуклеотидная последовательность полноразмерных вариантов МДГ4 из
линии Г32 и проведен сравнительный анализ всех известных полноразмерных копий МДГ4, включая доступные из баз данных в сети Интернет, который показал, что все полученные ранее копии МДГ4, последовательности которых доступны в GenBank, можно строго отнести либо к «активному», либо к «неактивному» подсемействам МДГ4,
4 Полноразмерные копии МДГ4 из линии Г32 имеют характерные особености 2 копии
являются «активными» с отдельными заменами, присущими «неактивному» варианту элемента, 1 копия является «неактивной» с отдельными заменами, присущими «активному» варианту элемента, 1 копия является «химерной», имея большое количество «активных» замен при преобладании «неактивных», что свидетельствует о том, что в данпой линии с повышенной частотой происходят рекомбинационные процессы, включая генную конверсию,
5 Методом ПЦР получены фрагменты ОРСЗ МДГ4 из различных видов рода Drosophila
подгруппы melanogaster и клонированы в вектор pBluescnpt II SK (+), определена первичная структура их ДНК и показано, что все копии МДГ4 в видах Dorena, D erecta, Dsantomea, Dyakuba и Dteissien относятся к «неактивному» подсемейству МДГ4, принадлежность копий МДГ4 в видах D таиппапа, D santomea, D sechellia к конкретному подсемейству определить невозможно, так как уровень гомологии составляет всего 88%,
6 Построено филогенетическое древо МДГ4 из различных видов рода дрозофилы на основании клонированных последовательностей ОРСЗ, которое в целом совпадает с древом рода Drosophila подгруппы melanogaster, за исключением МДГ4 из видов D mauritiana, D santomea, D sechelha, которые имеют гомологию 88% с МДГ4 из D melanogaster, в то время как МДГ4 более далеких видов подгруппы имеют гомологию 98%, что может указывать на имевший место в прошлом горизонтальный перенос
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИСЕРТАЦИИ
1 Котноеа А П, Карпова Н Н, Саленко В Б, Любомирская НВ, Ильин Ю В Канонические
и неканонические последовательности МДГ4 (gypsy), содержащиеся в геноме Drosophila melanogaster Доклады Академии Наук, 2005, Т 400 (6), С 827-830
2 Котноеа А П, Феоктистова М А, Глухое И А , Саленко В Б, Любомирская Н В, Ким
А И, Ильин Ю В Gtwin - ретротранспозон дрозофилы, специфичный для подгруппы melanogaster Доклады Академии Наук, 2006, Т 409 (5), С 691-693
3 Саленко В Б, Котноеа А П, Карпова Н Н, Любомирская Н В, Ильин Ю В Полиморфизм
полноразмерных копий мобильного элемента МДГ4 [gypsy), клонированных из линии Г32 Drosophila melanogaster Доклады Академии Наук, 2007, Т 412 (3), С 408-411
4 KotnovaAP, GlukhovIA, KarpovaNN, Salenko VB, Lyubomirskaya N V, Ilyin Yu V
Evidence for recent horizontal transfer of gypsy-homologous LTR-retrotransposon gtwin into Drosophila erecta followed by its amplification with multiple aberrations Gene 2007 Jul 1,396(1) 39-45
%
Напечатано с готового оригинал-макета
Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 03 10 2007 г Формат 60x90 1/16 Услпечл 1,5 Тираж 100 экз Заказ 492 Тел 939-3890 Тел/Факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им М В Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Саленко, Вениамин Борисович
Список сокращений и условных обозначений.
1. Введение.
2. Ретротранспозоны (обзор литературы).
2.1. Структура ретроэлементов.
2.1.1. Классификация мобильных элементов.
2.1.2. Структура ретротранспозонов.
2.1.3. Экспрессия и перемещение ретротранспозонов.
2.2. Взаимодействие ретроэлементов с геномом хозяина.
2.2.1. Инсерционный мутагенез.
2.2.2. Генетическая нестабильность.
2.2.3. Контроль за перемещениями мобильных элементов.
2.3. Ретроэлементы как фактор эволюции.
2.3.1. Эволюция ретроэлементов.
2.3.2. Соотношение эволюции ретроэлементов и их хозяев.
2.3.3. Горизонтальный перенос.
2.3.4. Транспозиции ретроэлементов и генетическое разнообразие.
2.3.5. Скачкообразная эволюция под воздействием мобильных элементов при изменении условий окружающей среды.
3. Материалы и методы.
3.1. Линии мух и штаммы бактерий, использованные в работе.
3.1.1. Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе.
3.1.2. Штаммы Escherichia coli, использованные в работе.
3.2. Приготовление компетентных клеток.
3.2.1. Приготовление компетентных клеток для трансформации плазмидной ДНК.
3.2.2. Приготовление бактерий для заражения бактериофагом X.
3.3. Выделение ДНК.
3.3.1. Выделение геномной ДНК из мух.
3.3.2. Выделение ДНК бактериофага X.;.
3.3.3. Выделение плазмидной ДНК.
3.4. Постановка рестрикции.
3.4.1. Рестрикция плазмидной ДНК.
3.4.2. Рестрикция ДНК бактериофага X.
3.4.3. Рестрикция геномной ДНК дрозофилы.
3.5. Лигирование.
3.6. Скрининг бляшек бактериофага Я методом гибридизации.
3.6.1. Заражение Е. coli бактериофагом X.
3.6.2. Перенос молекул неупакованной ДНК бактериофага X на нейлоновый фильтр
3.6.3. Приготовление радиоактивного ДНК-зонда.
3.6.4. Выделение фрагмента ДНК из агарозного геля для приготовления радиоактивного зонда.
3.6.5. Мечение ДНК-зонда методом рассеянной затравки.
3.6.6. Гибридизация.
3.7. Саузерн-блот гибридизация.
3.7.1. Перенос ДНК с агарозных гелей на нейлоновые фильтры.
3.8. Полимеразная цепная реакция.
3.9. Определение первичной последовательности и анализ полученных данных.
4. Результаты.
4.1. Скрининг геномной библиотеки линии Г32 Drosophila melanogaster.
4.2. Общая характеристика клонов, содержащих неканонические последовательности
МДГ4 из линии Г32.
4.3. Анализ полноразмерных вариантов МДГ4.
4.3.1. Проверка клонов на наличие сайтов рестрикции Mlul, Clal и Hindlll, характерных для «активного» варианта МДГ4.
4.3.2. Сравнительный анализ полноразмерных вариантов МДГ4 из линии Г32.
4.4. Анализ ОРСЗ МДГ4 из различных видов Drosophila подгруппы melanogaster.
4.4.1. Получение фрагментов ОРСЗ МДГ4 из разных видов дрозофилы подгруппы melanogaster.
4.4.2. Анализ нуклеотидной последовательности фрагментов ОРСЗ МДГ4 из разных видов дрозофилы подгруппы melanogaster.
5. Обсуждение.
5.1. Скрининг геномной библиотеки линии Г32 Drosophila melanogaster и анализ неканонических последовательностей МДГ4.
5.2. Сравнительный анализ полноразмерных вариантов МДГ4 из линии Г32 Drosophila melanogaster и сети Интернет.
5.3. Анализ последовательностей ОРСЗ МДГ4 из различных видов рода Drosophila подгруппы melanogaster.
6. Выводы.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Полиморфизм эндогенного ретровируса МДГ4 (gypsy) в линиях рода Drosophila подгруппы melanogaster"
Мобильные генетические элементы составляют существенную часть генома эукариот. На их долю у различных организмов приходится от 10 до 90% всей геномной ДНК [Nuzhdin, 1999]. У Drosophila melanogaster МГЭ занимают около 10% генома [Pimpinelli et al, 1995]. Взаимодействия мобильных генетических элементов с геномом хозяина весьма сложны. Мобильные элементы могут встраиваться в кодирующие последовательности, нарушая их структурную целостность и, таким образом, функционирование. Но этим влияние мобильных элементов не ограничивается. Поскольку они содержат промоторы и терминаторы транскрипции и трансляции, сайты полиаденилирования, кэпирования и сплайсинга РНК, а также могут содержать разнообразные регуляторные последовательности, такие как энхансеры, сайленсеры и инсуляторы, то даже если мобильный элемент встроится не в экзон гена, а в интрон или даже вне рамки считывания гена, он все равно может сильно повлиять на его экспрессию. Считается, что в основном, в условиях стабильности среды обитания, перемещения мобильных элементов приводят к негативным последствиям. Однако, транспозиции мобильных элементов полезны для популяции хозяина в условиях изменяющейся окружающей среды, так как они являются важным фактором эволюции, участвуя в рекомбинационных процессах.
Мобильный элемент МДГ4 Drosophila melanogaster, в англоязычной литературе известный как gypsy, относится к классу ДКП-содержащих ретроэлементов. Он использует РНК-интермедиат для транспозиции, содержит три открытых рамки считывания, аналогичных ретровирусным генам gag, pol и env, и жизненный цикл его аналогичен ретровирусному [Arkhipova et al, 1995]. Недавно полученные данные о способности МДГ4 образовывать вирусные частицы, а так же косвенные данные о его способности к горизонтальному переносу, позволяют говорить об МДГ4 как об эндогенном ретровирусе беспозвоночных [Kim et al, 1994а, Song et al, 1994, Lecher et al, 1997]. Несмотря на то, что ретровирусы и ретротранспозоны довольно давно являются объектом пристального внимания исследователей, взаимоотношения на генетическом уровне между ретротранспозонами и ретровирусами и их хозяевами по-прежнему являются по большей части загадкой. Поэтому обнаружение эндогенных ретровирусов, особенно так хорошо изученных как МДГ4, у дрозофилы, являющейся классическим модельным объектом, открывает новые широкие горизонты для исследования генетического контроля со стороны хозяина за перемещением ретроэлементов.
Спонтанные транспозиции мобильных элементов происходят относительно редко, с частотой, как правило, не превышающей 10"6, но в некоторых случаях частота спонтанных перемещений заметно выше. Повышение частоты перемещений может происходить у потомков от особых скрещиваний (эффект получил название гибридного дисгенеза), либо в особенных линиях, названных генетически нестабильными [Arkhipova et al, 1995]. При исследовании одной из таких линий (названой MS, Mutator Strain) и стабильной линии SS (Stable Strain), из которой была получена линия MS, было обнаружено, что ретротранспозон МДГ4 имеет два четко различимых подсемейства, отличающихся транспозиционной активностью в культуре клеток Drosophila hydei. Эти два варианта были условно названы «активным» и «неактивным».
Активный» и «неактивный» варианты МДГ4 различаются уже на уровне рестрикционных карт. «Активный» вариант содержит сайты рестрикции Hindlll (4483), МЫ (5335) и Clal (6939), не характерные для «неактивного» класса [Lyubomirskaya et al, 1990]. Изучение распределения двух подсемейств элемента в 21 линии дрозофилы показал, что «неактивный» вариант эволюционно более древний, поскольку он присутствует во всех исследованных линиях, в то время как «активный» вариант только в некоторых. Кроме того, по всей видимости, «активный» вариант получился из «неактивного» путем накопления точечных мутаций. Так, рестрикционные сайты, отличающие эти два варианта, накапливались в следующей последовательности: сначала сайт Mlul (5335), затем Clal (6939) и последним Hindlll (4483) [Разоренова и др, 2001; Lyubomirskaya et al, 2001].
Однако, в том же исследовании была обнаружена одна линия, которая содержала вариант МДГ4, несущий сайт рестрикции Hindlll (4483), но не имевший сайтов Mlul (5335) и Clal (6939) (линия Г32). Исследование нетрадиционных копий МДГ4 в геноме линии Г32 представляет особый интерес, поскольку возможно они образовались в результате рекомбинационных процессов и их исследование может пролить свет на вопрос происхождения «активного» варианта МДГ4.
Целью данного исследования явилось изучение структурных особенностей ретротранспозона МДГ4 (gypsy) в линии Г32 Drosophila melanogaster, а также в различных видах рода Drosophila подгруппы melanogaster с целью установления возможного происхождения «активного» варианта МДГ4. В соответствии с целью в работе были поставлены следующие задачи:
• провести скрининг ранее созданной геномной библиотеки линии Г32 на основе бактериофага X, и отобрать клоны, имеющие гомологию с МДГ4;
• провести рестрикционно-гибридизационный анализ полученных клонов с целью выявления полноразмерных копий и общей характеристики неканонических вариантов последовательностей МДГ4;
• определить первичную структуру нуклеотидных последовательностей, фланкирующих клонированные копии МДГ4, с целью их локализации в геноме;
• определить принадлежность клонированных полноразмерных вариантов МДГ4 из линии Г32 к «активному» и «неактивному» подсемействам;
• определить нуклеотидную последовательность и провести сравнительный анализ полноразмерных вариантов МДГ4 из линии Г32 и доступных из баз данных в сети Интернет;
• получить методом ПЦР и клонировать фрагменты ОРСЗ МДГ4 из различных видов рода Drosophila подгруппы melanogaster, определить первичную структуру их ДНК на предмет принадлежности к «активному» или «неактивному» подсемейству МДГ4;
• построить филогенетическое древо МДГ4 из различных видов рода дрозофилы на основании клонированных последовательностей ОРСЗ и сравнить его с древом рода Drosophila подгруппы melanogaster.
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Саленко, Вениамин Борисович
6. Выводы
1. Проведен рестрнкционно-гибридизационный анализ полученных при скрининге геномной библиотеки линии Г32 клонов, и выявлены 4 полноразмерных копии МДГ4 и 20 неканонических вариантов последовательностей МДГ4, большинство из которых представлено сильно дивергированными копиями полного или почти полного (без ДКП) элемента, однако есть копии, представленные лишь фрагментами отдельных рамок считывания;
2. Определена первичная структура нуклеотидных последовательностей, фланкирующих клонированные копии МДГ4 и показано, что все копии, включая 4 полноразмерных, локализуются в гетерохроматине, преимущественно в прицентромерных кластерах мобильных элементов, причем 2 «активные» копии располагаются в одном и том же месте внутри ДКП ретротранспозона micropia, но в разных кластерах с двух сторон от цетромеры 2-й хромосомы, в одном из этих кластеров располагается, по-видимому, и неактивная полноразмерная копия;
3. Определена нуклеотидная последовательность полноразмерных вариантов МДГ4 из линии Г32 и проведен сравнительный анализ всех известных полноразмерных копий МДГ4, включая доступные из баз данных в сети Интернет, который показал, что все полученные ранее копии МДГ4, последовательности которых доступны в GenBank, можно строго отнести либо к «активному», либо к «неактивному» подсемействам МДГ4;
4. Полноразмерные копии МДГ4 из линии Г32 имеют характерные особености: 2 копии являются «активными» с отдельными заменами, присущими «неактивному» варианту элемента, 1 копия является «неактивной» с отдельными заменами, присущими «активному» варианту элемента, 1 копия является «химерной», имея большое количество «активных» замен при преобладании «неактивных», что свидетельствует о том, что в данной линии с повышенной частотой происходят рекомбинационные процессы, включая генную конверсию;
5. Методом ПЦР получены фрагменты ОРСЗ МДГ4 из различных видов рода Drosophila подгруппы melanogaster и клонированы в вектор pBluescript II SK (+); определена первичная структура их ДНК и показано, что все копии МДГ4 в видах D.orena, D.erecta, D.santomea, D.yakuba и D.teissieri относятся к «неактивному» подсемейству МДГ4, принадлежность копий МДГ4 в видах D. mauritiana,
D.santomea, D.sechellia к конкретному подсемейству определить невозможно, так как уровень гомологии составляет всего 88%;
6. Построено филогенетическое древо МДГ4 из различных видов рода дрозофилы на основании клонированных последовательностей ОРСЗ, которое в целом совпадает с древом рода Drosophila подгруппы melanogaster, за исключением МДГ4 из видов D.mauritiana, D.santomea, D.sechellia, которые имеют гомологию 88% с МДГ4 из D.melanogaster, в то время как МДГ4 более далеких видов подгруппы имеют гомологию 98%, что может указывать на имевший место в прошлом горизонтальный перенос.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Саленко, Вениамин Борисович, Москва
1. Alberola ТМ and de Frutos R (1996) Molecular structure of a gypsy element of Drosophila subobscura (GypsyDs) constituting a degenerate form of insect retroviruses. Nucleic Acids Res. 24: 914-923.
2. Arkhipova IR, Lyubomirskaya NV, and Ilyin YV (1995) Drosophila retrotransposons. Mol. Biol. Intel. Unit: R. G. Landes Company, USA. 130p.
3. Arkhipova IR, Mazo AM, Cherkasova VA, Gorelova TV, Schuppe NG, and Ilyin YV (1986) The steps of reverse transcription of Drosophila mobile dispersed genetic elements and U3-R-U5 structure of their LTRs. Cell. 44: 555-563
4. Avedisov SN and Ilyin YV (1994) Identification of spliced RNA species of Drosophila melanogaster gypsy retrotransposon: new evidence for retroviral nature of the gypsy element. FEBS Lett. 350: 147-150.
5. Balcells L, Modolell J, and Ruiz-Gomez M (1988) A unitary basis for different Hairy-wing mutations of Drosophila melanogaster. EMBOJ. 7: 3895-3906.
6. Belyaeva ES, Pasyukova EG, Gvozdev VA, Ilyin YV, and Kaidanov LZ (1982) Transposition of mobile dispersed genes in Drosophila melanogaster and fitness of stocks. Mol. Gen. Genet. 1982; 185: 324-328.
7. Bender W, Weiffenbach B, Karch E, and Peifer M (1985) Domains of c/'s'-interaction in the bithorax complex. Cold Spring Harbor Syrup. Quant. Biol. 50: 173-180.
8. Benson M and Pirrotta V (1988) The Drosophila Zeste protein binds cooperatively to sites in many gene regulatory regions: implications for transvection and gene regulation. EMBO J. 7: 3907-3915.
9. Bergman CM, Quesneville H, Anxolabehere D, and Ashburner M (2006) Recurrent insertion and duplication generate networks of transposable element sequences in the Drosophila melanogaster genome. Genome Biol. 7(11): R112.
10. Boeke JD and Corces VG (1989) Transcription and reverse transcription of retrotransposons. Annu. Rev. Microbiol. 43: 403-434.
11. Bregliano JC, Picard G, Bucheton A, Pelisson A, Lavige JM, and L'Heritier P (1980) Hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster. Science. 207: 606-611.
12. Brennecke J, Aravin AA, Stark A, Dus M, Kellis M, Sachidanandam R, and Hannon GJ (2007) Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. Cell. 128(6): 1089-1103.
13. Brierley С and Flavell AJ (1990) The retrotransposon copia controls the relative levels of its gene products post transcriptionally by differential expression from its two major RNAs. Nucl. Acids Res. 18: 2947-2951.
14. Brookfield JF and Badge RM (1997) Population genetics models of transposable elements. Genetica. 100: 281-294.
15. Bucheton A (1990) I transposable elements and I-R hybrid dysgenensis. Trends Genet. 6: 16-19.
16. Bucheton A (1995) The relationship between the flamenco gene and gypsy in Drosophila: how to tame a retrovirus. Trends Genet. 11: 349-353.
17. Bucheton A, Paro R, Sang HM, Pelisson A, and Finnegan DJ (1984) The molecular basis of I-R hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster. identification, cloning, and properties of the I factor. Cell. 38: 153-163.
18. Bucheton A, Simonelig M, and Vaury С (1986) Sequences similar to the I transposable element involved in I-R hybrid dysgenesis in D.melanogaster occur in other Drosophila species. Nature. 322: 650-652.
19. Busseau IA, Pelisson A, and Bucheton A (1989) I elements of Drosophila melanogaster generate specific chromosomal rearrangements during transposition. Mol. Gen. Genet. 218:222-228.
20. Campuzano S, Balcells L, Villares R, Carramolino L, Garcia-Alonso L, and Modolell J (1986) Excess function hairy-wing mutations caused by gypsy and copia insertions within structural genes of the achaete-scute locus of Drosophila. Cell. 44: 303-312.
21. Canizares J, Grau M, Paricio N, and Molto MD (2000) Tirant is a new member of the gypsy family of retrotransposons in Drosophila melanogaster. Genome. 43: 9-14.
22. Сару P, Bazin C, Higuet D, and Langin T (1997a) Dynamics and evolution of transposable elements. Landes Bioscience, Austin, TX.
23. Сару P, Langin T, Higuet D, Maurer P, and Bazin С (1997b) Do the integrases of LTR-retrotransposons and class II element transposases have a common ancestor? Genetica 100: 63-72.
24. Chaboissier MC, Bucheton A, and Finnegan DJ (1998) Copy number control of a transposable element, the I factor, a LINE-like element in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 95(20): 11781-11785.
25. Chalvet F, Teysset L, and Terzian С (1999) Proviral amplification of the gypsy endogenous retrovirus of Drosophila melanogaster involves еот-independent invasion of the female germline. EMBO J. 18: 2659-2669.
26. Charlesworth В and Langley CH (1986) The evolution of selfregulated transposition of transposable elements. Genetics. 112: 359-383.
27. Charlesworth B, Sniegowski P, and Stephan W (1994) The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes. Nature. 371: 215-220.
28. Clark JB, Maddison WP, and Kidwell MG (1994) Phylogenetic analysis supports horizontal transfer of P transposable elements. Mol Biol Evol. 11(1): 40-50.
29. Coffin JM (1992) Retroviridae and their replication. In: Fields BN, Knipe DM et al. eds. Virology. 2nd ed. New York: Raven Press: 1437-1500.
30. Contursi C, Minchiotti G, and Di Nocera PP (1995) Identification of sequences which regulate the expression of Drosophila melanogaster Doc elements. J Biol Chem. 270(44): 26570-16576.
31. Crozatier M, Vaury C, Busseau I, Pelisson A, and Bucheton A (1988) Structure and genomic organization of I elements involved in I-R hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster. Nucl. Acids Res. 16: 9199-9213.
32. Dawkins R (1974) The selfish gene. Oxford Univ. Press, Oxford, U.K.
33. Dej KJ, Gerasimova T, Corces VG, and Boeke JD (1998) A hotspot for the Drosophila gypsy retroelement in the ovo locus. Nucl. Acids Res. 26: 4019-4025.
34. Desset S, Meignin C, Dastugue B, and Vaury С (2003) COM, a heterochromatic locus governing the control of independent endogenous retroviruses from Drosophila melanogaster. Genetics. 164: 501-509.
35. Dorsett D, Viglianti GA, Rutledge BJ, and Meselson M (1989) Alteration of hsp82 gene expression by the gypsy transposon and suppressor genes in Drosophila melanogaster. Genes Dev 3: 454-468.
36. Eickbush T (1994) Origin and evolutionary relationships of retroelements. In: Morse SS ed. The evolutionary biology of viruses. NY: Raven Press: 121-157.
37. Emori Y, Shiba T, Kanaya S, Inouye S, Yuki S, Saigo К (1985) The nucleotide sequences of copia and copia-related RNA in Drosophila virus-like particles. Nature 315: 773-776.
38. Engels WR (1989) P elements in Drosophila melanogaster. In: Berg DE, Howe MM eds. Mobile DNA. Washington, DC: American Society for Microbiology: 437-484.
39. Engels WR and Preston CR (1984) Formation of chromosome rearrangements by P factors in Drosophila. Genetics 107: 657-678.
40. Evgen'ev MB, Corces VG, and Lankenau D-H (1992) Ulysses transposable element of Drosophila shows high structural similarities to functional domains of retroviruses. J. Mol. Biol. 225: 917-924.
41. Evgen'ev MB, Zelentsova H, Poluectova H, Lyozin GT, Veleikodvorskaja V, Pyatkov KI, Zhivotovsky LA, and Kidwell MG (2000) Mobile elements and chromosomal evolution in the virilis group of Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 97(21): 11337-11342.
42. Finnegan DJ (1988) I factors in Drosophila melanogaster and similar elements in other eukaryotes. In: Kingsman AJ, Kingsman S, Chater K, eds. Transposition. Cambridge: Cambridge University Press: 271-285.
43. Finnegan DJ (1989a) Eukaryotic transposable elements and genome evolution. Trends Genet. 5:103-107.
44. Finnegan DJ (1989b) The I factor and I-R hybrid dysgenensis in Drosophila melanogaster. In: Berg DE, Howe MM eds. Mobile DNA. Washington, DC: American Society for Microbiology: 503-517.
45. Finnegan DJ (1997) Transposable elements: how non-LTR retrotransposons do it. Curr. Biol. 7: 245-248.
46. Flavell AJ (1984) Role of reverse transcriptase in the generation of extrachromosomal copia mobile genetic elements. Nature. 310: 514-516.
47. Flavell AJ and Brierley С (1986) The termini of extrachromosomal linear copia elements. Nucl. Acids Res. 14: 3659-3569.
48. Fourcade-Peronnet F, d'Auriol L, Becker J, Galibert F, and Best-Belpomme M (1988) Primary structure and functional organization of Drosophila 1731 retrotransposon. Nucl. Acids Res. 16:6113-6125.
49. Freund R and Meselson M (1984) Long terminal repeat nucleotide sequence and specific insertion of the gypsy transposon. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4462-4464.
50. Fridell RA, Pret A-M, and Searles LL (1990) A retrotransposon 412 insertion within an exon of the Drosophila melanogaster vermilion gene is spliced from the precursor RNA. Genes Dev. 4(4): 559-66.
51. Fuetterer J and Hohn T (1987) Involvement of nucleocapsids in reverse transcription: a general phenomenon? Trends Biochem. Sci. 12: 92-95.
52. Gabriel A and Boeke JD (1993) Retrotransposon reverse transcription. In: Skalka AM, Goff SP Reverse transcriptase. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press: 275-328.
53. Gerasimova TI (1981) Genetic instability at the cut locus of Drosophila melanogaster induced by the MR-hl2 chromosome. Mol. Gen. Genet., 184, 544-547.
54. Gerasimova TI (1983) Superunstable alleles at the cut locus in Drosophila melanogaster. Mol. Gen. Genet., 190,390-394.
55. Gerasimova TI, Gdula DA, Gerasimov DV, Simonova 0, and Corces VG (1995) A Drosophila protein that imparts directionality on a chromatin insulator is an enhancer of position-effect variegation. Cell. 82(4): 587-597.
56. Gerasimova TI, Matjunina LV, Mizrokhi LJ, and Georgiev GP (1985) Successive transposition explosions in Drosophila melanogaster and reverse transpositions of mobile dispersed genetic elements. The EMBO J. 4(13B): 3773-3779.
57. Gerasimova TI, Mizrokhi LJ, and Georgiev GP (1984) Transposition bursts in genetically unstable Drosophila melanogaster. Nature. 309: 3773-3779.
58. Geyer PK and Corces VG (1987) Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster. Genes Dev. 1: 996-1004.
59. Geyer PK, Chien AJ, Corces VG, and Green MM (1991) Mutations in the su(s) gene affect RNA processing in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88(16): 71167120.
60. Geyer PK, Green MM, and Corces VG (1988a) Reversion of a gy/wy-induced mutation at the yellow (y) locus of Drosophila melanogaster is associated with the insertion of a newly defined transposable element. Proc. Natl Acad. Sci USA. 85(11): 3938-3942.
61. Geyer PK, Green MM, and Corces VG (1988b) Mutant gene phenotypes mediated by a Drosophila melanogaster retrotransposon require sequences homologous to mammalian enhancers. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 85(22): 8593-8597.
62. Geyer PK, Green MM, and Corces VG (1990) Tissue-specific transcriptional enhancers may act in trans on the gene located in the homologous chromosome: the molecular basis of transvection in Drosophila. EMBO J. 9: 2247-2256.
63. Gilboa E, Mitra S, and Goff S (1979) A detailed model of reverse transcription and a test of crucial aspects. Cell. 18: 93-100.
64. Goldberg ML, Sheen J-Y, Gehrubg WJ, and Green MM (1983) Unequal crossing-over associated with asymmetrical synapsis between nomadic elements in the Drosophila melanogaster genome. Proc Natl Acad Sci USA. 80(16): 5017-5021.
65. Green MM (1976) Mutable and mutator loci. In: Ashburner M, Novinski E. The genetics and biology of Drosophila. Vol lb. New York: Academic Press: 929-946.
66. Hope IA, Mahadevan S, and Struhl К (1988) Structural and functional characterization of the short acidic transcriptional activation region of yeast GCN4 protein. Nature 333: 635— 640.
67. Inouye S, Yuki S, and Saigo К (1986) Complete nucleotide sequence and genome organization of a Drosophila transposable genetic element, 297. Eur. J. Biochem. 154: 417425.
68. Ivanov VA, Melnikov AA, Siunov AV, Fodor II, and Ilyin YV (1991) Authentic reverse transcriptase is coded by jockey, a mobile Drosophila element related to mammalian LINEs. EMBO J. 10: 2489-2495.
69. Jensen S, Gassama MP, and Heidmann T (1999) Taming of transposable elements by homology-dependent gene silencing. Nat. Genet. 21(2): 148-149.
70. Kidwell MG, and Lisch D (1997) Transposable elements as sources of variation in animals and plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 7704-7711.
71. Kidwell MG, Kidwell JF, and Sved JA. (1977) Hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster. a syndrome of aberrant traits including mutation, sterility and male recombination. Genetics. 86(4): 813-833.
72. Kim A, Terzian C, Santamaria P, Pelisson A, Prud'homme N, and Bucheton A (1994a) Retrovirus in invertebrates: the gypsy retrotransposon is apparently an infectious retrovirus of Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91(4): 1285-1289.
73. Kim Al and Belyaeva ES (1991) Transposition of mobile elements gypsy (mdg4) and hobo in germ line and somatic cells of a genetically unstable Mutator strain of Drosophila melanogaster. Mol. Gen. Genet. 229: 437-444.
74. Kim Al, Belyaeva ES, and Aslanyan MM (1990) Autonomous transposition of gypsy mobile elements and genetic instability in Drosophila melanogaster. Mol. Gen. Genet. 224: 303-308.
75. Klug A and Rhodes D (1987) Zinc fingers: a novel protein fold for nucleic acid recognition. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 52: 473-482.
76. Kumar S, Tamura K, and Nei M (2004) MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics. 5(2): 150-163.
77. Lahn ВТ and Page DC (1999) Four evolutionary strata on the human X chromosome. Science. 286: 964-967.
78. Landschulz WH, Johnson PF, and McKnight SL (1988) The leucine zipper: a hypothetical structure common to a new class of DNA binding proteins. Science. 240: 1755-1764.
79. Lankenau D-H, Huijser P, Jansen E, Miedema K, and Hennig W (1988) Micropia: a retrotransposon of Drosophila combining structural features of DNA viruses, retroviruses, and non-viral transposable elements. J. Mol. Biol. 204: 233-246.
80. Lavige JM (1986) I-R system of hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster. further data on the arrest of development of the embryos from SF females. Biol. Cell. 56: 207-216.
81. Leblanc P, Dastugue B, and Vaury С (1999) The integration machinery of zam, a retroelement from Drosophila melanogaster, acts as a sequence-specific endonuclease. J. Virol. 73: 7061-7064.
82. Lecher P, Bucheton A, and Pelisson A (1997) Expression of the Drosophila retrovirus gypsy as ultrastructurally detectable particles in the ovaries of flies carrying a permissive flamenco allele. J. Gen. Virol. 78(9): 2379-2388.
83. Levis R, O'Hare K, and Rubin GM (1984) Effects of transposable element insertions on RNA encoded by the white gene of Drosophila. Cell. 38(2): 471-481.
84. Lim JK (1988) Intrachromosomal rearrangements mediated by hobo transposons in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 9153-9157.
85. Lin YJ, Seroude L, Benzer S (1998) Extended life-span and stress resistance in the Drosophila mutant methuselah. Science. 282(5390): 943-946.
86. Luan DD, Korman MH, Jackubczak JL, and Eickbush TH (1993) Reverse transcription of R2Bm is primed by a nick at the chromosomal target site: a mechanism for non-LTR retrotransposition. Cell 72: 595-605.
87. Luciw PA and Leung NJ (1992) Mechanisms of retroviral replication. In: Levy J.A., ed. The Retroviridae. NY: Plenum Press: 159-298.
88. Lyttle TW and Haymer DS (1992) The role of the transposable element hobo in the origin of endemic inversions in wild populations of Drosophila melanogaster. Genetica 86: 113126.
89. Lyubomirskaya NV, Arkhipova IR, and Ilyin YY (1990) Molecular analysis of the gypsy (mdg4) retrotransposon in two Drosophila melanogaster strains differing by genetic instability. Mol. Gen. Genet. 223: 305 309.
90. Lyubomirskaya NV, Avedisov SN, Surkov SA, and Ilyin YV (1993) Two Drosophila retrotransposon gypsy subfamilies differ in ability to produce new DNA copies via reverse transcription in Drosophila cultured cells. Nucl. Acids. Res. 21: 3265 3268.
91. Marlor RL, Parkhurst SM, and Corces VG (1986) The Drosophila melanogaster gypsy transposable element encodes putative gene products homologous to retroviral proteins Mol. Cell. Biol. 6(4), 1129-1134.
92. Marsano RM, Moschetti R, Caggese C, Lanave C, Barsanti P, and Caizzi R (2000) The complete tirant transposable element in Drosophila melanogaster shows a structural relationship with retrovirus-like retrotransposons. Gene. 247: 87-95.
93. McClintock В (1956) Controlling elements and the gene. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 21:197-216.
94. McClintock В (1984) The significance of responses of the genome to challenge. Science. 226: 792-801.
95. McClure MA (1991) Evolution of retroposons by acquisition or deletion of retrovirus-like genes. Mol. Biol. Evol. 8: 835-856.
96. McClure MA (1999) The retroid agents: disease, function, and evolution. Pp. 163-195 in E. Domingo, R. Webster, and J. Holland, eds. Origin and evolution of viruses. Academic Press, London.
97. Mejlumian L, Pelisson A, Bucheton A, Terzian С (2002) Comparative and functional studies of Drosophila species invasion by the gypsy endogenous retrovirus. Genetics. 160:201-209.
98. Minchiotti G, Contursi C, and Di Nocera PP (1997) Multiple downstream promoter modules regulate the transcription of the Drosophila melanogaster I, Doc and F elements. J. Mol. Biol. 267: 37-46.
99. Mizrokhi LJ and Mazo AM (1991) Cloning and analysis of the mobile element gypsy from D.virilis. Nucleic Acids Res. 19: 913-916.
100. Mizrokhi LJ, Georgieva SG, and Ilyin YV (1988) Jockey, a mobile Drosophila element similar to mammalian LINEs, is transcribed from the internal promoter by RNA polymerase II. Cell. 54: 685-691.
101. Modolell J, Bender W, and Meselson M (1983) Drosophila melanogaster mutations suppressible by the suppressor of Hairy-wing are insertions of a 7.3-kilobase mobile element. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 80(6): 1678-1682.
102. Mount SM and Rubin GM (1985) Complete nucleotide sequence of the Drosophila transposable element copia: homology between copia and retroviral proteins. Mol. Cell Biol. 5: 1630-1638.
103. Mueller-Storm HP, Sogo JM, and Schaffner W (1989) An enhancer stimulates transcription in trans when attached to the promoter via a protein bridge. Cell 58: 767-777.
104. Nee S and Maynard J (1990) The evolutionary biology of molecular parasites. Parasitology 100(S): 5-18.
105. Nuzhdin SV (1999) Sure facts, speculations, and open questions about the evolution of transposable element copy number. Genetica. 107(1-3): 129-137.
106. Nuzhdin SV, Pasyukova EG, and Mackay TFC (1996) Positive association between copia transposition rate and copy number in Drosophila melanogaster. Proc. R. Soc. bond. В Biol. Sci. 263:823-831.
107. Parkhurst SM and Corces VG (1985) Forked, gypsys, and suppressors in Drosophila. Cell 41:429-437.
108. Parkhurst SM and Corces VG (1986) Interaction among the gypsy transposable element and the yellow and suppressor-of-Hairy-wing loci in Drosophila melanogaster. Mol. Cell Biol. 6(1): 47-53.
109. Peifer M and Bender W (1986) The anterobithorax and bithorax mutations of the bithorax complex. EMBO J. 5(9): 2293-2303.
110. Peifer M and Bender W (1988) Sequences of the gypsy transposon of Drosophila necessary for its effects on adjacent genes. Proc. Natlacad. Sci. USA. 85(24): 9650-9654.
111. Pelisson A, Mejlumian L, Robert V, Terzian C, and Bucheton A (2002) Drosophila germline invasion by the endogenous retrovirus gypsy: involvement of the viral env gene. Insect Biochem Mol Biol. 32(10): 1249-1256.
112. Pelisson A, Teysset L, Chalvet F, Kim A, Prud'homme N, Terzian C, and Bucheton A (1997) About the origin of retroviruses and the co-evolution of the gypsy retrovirus with the Drosophila flamenco host gene. Genetica. 100: 29-37.
113. Picard G (1976a) Non-mendelian female sterility in Drosophila melanogaster. sterility in the dughter progeny of SF and RSF females. Biol Cell. 31: 235-244.
114. Picard G (1976b) Non-mendelian female sterility in Drosophila melanogaster. hereditary transmission of I factor. Genetics. 83: 107-123.
115. Picard G, Bregliano JC, Bucheton A, Lavige JM, Pelisson A, and Kidwell MG (1978) Non-mendelian female sterility and hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster. Genet. Res. 32: 275-287.
116. Proust J and Prudhommeau С (1978) Hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster. 1. Further evidence for, and characterization of, the mutator effect of the inducer-reactive interaction. Mutat. Res. 95: 225-235.
117. Prud'homme N, Gans M, Masson M, Terzian C, and Bucheton A (1995) Flamenco, a gene controlling the gypsy retrovirus of Drosophila melanogaster. Genetics 139: 697-711.
118. Quentin Y (1992) Origin of the Alu family: a family of Alu-like monomers gave birth to the left and the right arms of the Alu elements. Nucleic Acids Res. 20: 3397-3401.
119. Robert V, Prud'homme N, Kim A, Bucheton A, and Pelisson A (2001) Characterization of the flamenco region of the Drosophila melanogaster genome. Genetics. 158(2): 701-13.
120. Robertson HM (1997) Multiple Mariner transposons in flatworms and hydras are related to those of insects. J. Hered. 88: 195-201.
121. Robertson HM and Lampe DJ (1995) Recent horizontal transfer of a mariner transposable element among and between Diptera and Neuroptera. Mol. Biol. Evol. 12: 850-862.
122. Robin S, Chambeyron S, Bucheton A, and Busseau I (2003) Gene silencing triggered by non-LTR retrotransposons in the female germline of Drosophila melanogaster. Genetics. 164:521-531.
123. Roche SE, Schiff M, and Rio DC (1995) P-element repressor autoregulation involves germ-line transcriptional repression and reduction of third intron splicing. Genes Dev. 9(10): 1278-1288.
124. Rutledge BJ, Mortin MA, Schwarz E, Thierry-Mieg D, and Meselson M (1988) Genetic interactions of modifier genes and modifiable alleles in Drosophila melanogaster. Genetics. 119(2): 391-397.
125. Saigo K, Kugimiya W, and Matsuo Y (1984) Identification of a coding sequence for a reverse transcriptase-like enzyme in a transposable genetic element in Drosophila melanogaster. Nature. 312: 659-661.
126. Schwarz-Sommer Z, Leclerq L, and Sardler H (1987) Cin4, an insert altering the structure of the Al gene in Zea mays, exhibits properties of nonviral retrotransposons. EMBO J. 6: 3873-3880.
127. Simmons MJ, Ryzek DF, Lamour C, Goodman JW, Kummer NE, and Merriman PJ (2007) Cytotype regulation by telomeric P elements in Drosophila melanogaster. evidence for involvement of an RNA interference gene. Genetics. 176(4): 1945-1955.
128. Song SU, Gerasimova T, Kurkulos M, Boeke JD, and Corces VG (1994) An ercv-like protein encoded by a Drosophila retroelement: evidence that gypsy is an infectious retrovirus. Genes Dev. 8: 2046-2057.
129. Song SU, Kurkulos M, Boeke JD, and Corces VG (1997) Infection of the germ line by retroviral particles produced in the follicle cells: a possible mechanism for the mobilization of the gypsy retroelement of Drosophila. Development. 124: 2789-2798.
130. Spana С and Corces VG (1990) DNA bending is a determinant of binding specificity for a Drosophila zinc finger protein. Genes Dev. 4: 1505-1515.
131. Syomin BV, Fedorova LI, Surkov SA, and Ilyin YV (2001) The endogenous Drosophila melanogaster virus gypsy can propagate in Drosophila hydei cells. Mol. Gen. Genet. 264: 588-594.
132. Tanda S, Mullor JL, Corces VG (1994) The Drosophila torn retrotransposon encodes an envelope protein. Mol. Cell Biol. 14: 5392-5401.
133. Terzian C, Ferraz C, Demaille J, and Bucheton A (2000) Evolution of the gypsy endogenous retrovirus in the Drosophila melanogaster subgroup. Mol. Biol. Evol. 17(6): 908-914.
134. Terzian C, Pelisson A, and Bucheton A (2001) Evolution and phylogeny of insect endogenous retroviruses. BMC Evolutionary Biology. 1:3.
135. Teysset L, Burns JC, Shike H, Sullivan BL, Bucheton A, and Terzian С (1998) A Moloney murine leukemia virus-based retroviral vector pseudotyped by the insect retroviral gypsy envelope can infect Drosophila cells. J. Virol. 72: 853-856.
136. Whalen JH and Grigliatti ТА (1998) Molecular characterization of a retrotransposon in Drosophila melanogaster, nomad, and its relationship to other retrovirus-like mobile elements. Mol. Gen. Genet. 260: 401-409.
137. Xiong Y and Eickbush TH (1990) Origin and evolution of retroelements based upon their reverse transcriptase sequences. EMBO J. 9: 3353-3362.
138. Yang H-P and Nuzhdin SV (2003) Fitness costs of Doc expression are insufficient to stabilize its copy number in Drosophila melanogaster. Mol. Biol. Evol. 20(5): 800-804.
139. Аведисов CH, Черкасова В А и Ильин ЮВ (1990) Характеристика первичной структуры полноразмерной копии ретротранспозона дрозофилы МДГ1. Генетика. 26: 1905-1914.
140. Асланян ММ и Ким АИ (1981) Мутанты дрозофилы, чувствительные к метилметансульфонату. Выделение и генетический анализ. Доклады Высшей Школы, Биол. Науки. 11: 83-88.
141. Гловер Д, ред. (1988) Клонирование ДНК. Методы. М: Мир, 538с.
142. Державец ЕМ, Ким АИ и Асланян ММ (1988) Анализ спонтанных хромосомных перестроек в нейробластах генетически нестабильной мутаторной линии Drosophila melanogaster. Генетика. 24: 857-866.
143. Ким АИ, Пасюкова ЕГ, Карпова НН и Разоренова ОВ (1999) Геномные факторы, регулирующие транспозиции мобильных элементов дрозофилы. Генетика. 35: 15111521.
144. Любомирская НВ и Ильин ЮВ (1999) Мобильные генетические элементы: прошлое, настоящее, будущее. Мол. Биол. 33: 1-11.
145. Маниатис Т, Фрич Э и Сэмбрук Дж (1984) Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва, "Мир".
146. Автор выражает признательность коллективу лаборатории подвижности генома ИМБ им. В.А.Энгельгардта РАН за помощь при проведении экспериментов, написании данной работы и моральную поддержку.
147. Особую благодарность автор выражает своему учителю, наставнику и научному руководителю, академику РАН, Юрию Викторовичу Ильину.
148. Автор глубоко признателен профессору кафедры генетики МГУ им. М.В.Ломоносова Александру Иннокентьевичу Киму за помощь и ценные советы при выполнении данной работы и за предоставленных для работы мух.
149. Отдельно стоит отметить помощь Котновой Алины Петровны, Карповой Нины Николаевны и Глухова Ивана Андреевича, научивших автора работать руками и грамотно ставить эксперименты.
-
Саленко, Вениамин Борисович
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2007
-
ВАК 03.00.03
- Изучение структурного полиморфизма мобильного генетического элемента МДГ4 (GYPSY) в линиях Drosophila melanogaster
- Канонические и неканонические последовательности эндогенного ретровируса МДГ4 (gypsy) в геноме дрозофилы
- Генетический контроль транспозиции и эволюция эррантивирусов у Drosophila
- Молекулярно-генетическая характеристика двух подсемейств ретротранспозона МДГ4
- Исследование некоторых поведенческих и биохимических особенностей в линиях Drosophila melanogaster, мутантных по гену flamenko
