Генетический контроль транспозиции и эволюция эррантивирусов у Drosophila

Нефедова, Лидия Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетический контроль транспозиции и эволюция эррантивирусов у Drosophila
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический контроль транспозиции и эволюция эррантивирусов у Drosophila"

На правах рукописи

НЕФЕДОВА Лидия Николаевна

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ТРАНСПОЗИЦИИ И ЭВОЛЮЦИЯ ЭРРАНТИВИРУСОВ У Лто$орЫ1а

03.02.07 - генетика

1 2 ф£В 2015

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2014

005558945

Работа выполнена на кафедре генетики биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор КИМ Александр Иннокентьевич (профессор кафедры генетики биологического факультета, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»)

доктор биологических наук, профессор ЗАХАРОВ Илья Кузьмич (заведующий лабораторией генетики популяций, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук)

доктор биологических наук, профессор ПАСЮКОВА Елена Генриховна (заведующая лабораторией геномной изменчивости, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук)

доктор биологических наук ЗАЦЕПИНА Ольга Георгиевна (старший научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга Российской академии наук)

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Защита состоится « 7 » 02> 20_/}г. в / ¿- часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01, созданного при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 26. Сайт: http://idbras.ru/; E-mail: idbras@bk.ru

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Автореферат разослан « 2^'»

20/ i года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

О.В. Бойко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Понять закономерности эволюции и пути исторической перестройки геномов эукариот невозможно без анализа этих процессов у мобильных генетических элементов (МГЭ), которые составляют значительную часть генома и оказывают заметное влияние на его функционирование. Среди МГЭ особое место занимают ретротранспозоны с длинными концевыми повторами (ДКП-ретротранспозоны). Элементы такого типа имеют варьирующую структуру и могут содержать от одной до трех открытых рамок считывания (ОРС). Наиболее сложными формами, как со структурной, так и с функциональной сторон, являются ДКП-ретротранспозоны с тремя ОРС {gag, pol и env), идентичные по структуре интегрированным в геном формам ретровирусов позвоночных. Их можно считать переходными формами между МГЭ и вирусами. Неслучайно именно у таких ДКП-ретротранспозонов Drosophila melanogaster - первоначально у gypsy (мдг4, mdg4), а затем у ZAM-обнаружены инфекционные свойства. Согласно международной классификации (http://www.ictvonline.org/) инфекционные ДКП-ретротранспозоны gypsy и ZAM, а также сходные с ними МГЭ с тремя ОРС, называют эррантивирусами. Эррантивирусы - первые и пока единственные ретровирусы, обнаруженные у беспозвоночных.

Интеграция ДНК-копии в геном хозяина - ключевой этап в жизненном цикле ретровируса, и осуществляет его интеграза. Выбор интегразой сайта мишени для интеграции ДНК-копии происходит не случайно - интегразы ретроэлементов имеют определенные предпочтения. Знание интеграционного профиля ретровирусов необходимо не только фундаментального понимания процесса интеграции, но и для решения прикладных задач: например, конструирования векторов для трансгенеза. В связи с этим, изучение специфичности интеграции ретровирусов и ДКП-ретротранспозонов в геном хозяина крайне актуально. Показано, что интеграза ДКП-ретротранспозона gypsy, помимо встраивания, способна осуществлять точное вырезание (с восстановлением нуклеотидной последовательности сайта-мишени) встроенной в геном ДНК-копии ретротранспозона. Это явление у ретровирусов в настоящее время изучено слабо и нуждается в дополнительном исследовании.

Бесконтрольная амплификация МГЭ и их хаотичные перемещения в геноме приводят к его нестабильности и повышению уровня спонтанного мутагенеза. Поэтому в процессе совместной эволюции хозяйского генома и МГЭ сформировались защитные механизмы контроля их транспозиции. Ключевой генетический фактор, осуществляющий контроль транспозиции МГЭ gypsy у D.melanogaster, - локус flamenco. Показано, что этот локус представляет собой матрицу для считывания предшественника малых интерферирующих РНК. Однако функционирование этого локуса оставляет много вопросов и требует дальнейшего исследования.

Изучение эволюционных взаимоотношений ДКП-ретротранспозонов и ретровирусов - одно из важнейших направлений современной биологии, поскольку позволяет найти ответ на вопросы о происхождении ретровирусов и

о путях формирования защитных механизмов против вирусной инфекции у организма-хозяина. D.melanogaster является удобным модельным объектом для исследования эволюции ДКП-ретротранспозонов и ретровирусов. Во-первых, структура и механизмы перемещения ДКП-ретротранспозонов в геноме дрозофилы изучены лучше, чем у других организмов. Во-вторых, в пределах одного рода Drosophila секвенированы геномы двадцати видов, сравнительный анализ мобильного компонента которых позволяет по-новому взглянуть на эволюцию ретроэлементов не только у дрозофилы, но и у члелистоногих и даже эукариот в целом.

Важнейшим направлением современной биологии является также исследование процесса молекулярной доместикации генов ретровирусов и ДКП-ретротранспозонов - процесса, в котором организм-хозяин адаптирует чужеродные последовательности для собственных нужд. Молекулярная доместикация генов ретроэлементов может играть значительную роль в макроэволюции и в приобретении организмом новых специфических свойств. Доместицированные гены выполняют широкий спектр функций в организме хозяина, и их изучение представляет значительный интерес. Многие из них тесно связаны с процессами эмбрионального развития и выполняют разнообразные функции, начиная с участия в сигнальных путях и защите от инфекции и заканчивая участием в формировании синцития в трофобласте. В геноме D.melanogaster структура и функции доместицированных генов эррантивирусов до последнего времени изучены не были.

Цели и задачи исследования

Цель работы - исследование механизмов интеграции, генетического контроля транспозиции, филогении и процессов молекулярной доместикации эррантивирусов.

В работе поставлены следующие задачи:

1. Разработать экспериментальную биплазмидную систему in vivo в клетках Escherichia coli для изучения специфичной активности интегразы ретротранспозона-ретровируса gypsy в отношении длинного концевого повтора gypsy с целью регистрации точных эксцизий ретротранспозона, а также получить рекомбинантную интегразу gypsy и исследовать ее сайт-специфичную активность in vitro как в отношении gypsy, так и в отношении других ДКП-ретротранспозонов группы gypsy.

2. Определить природу мутации в локусе flamenco, контролирующем транспозиции gypsy, в линиях SS и MS D. melanogaster; провести сравнительный анализ транскрипции локуса flamenco в тканях линий D. melanogaster, различающихся фенотипом flamenco; установить область начала транскрипции молекулы-предшественника piPHK в локусе flamenco, а также изучить транспозиционную других ДКП-ретротранспозонов группы gypsy в линиях SS и MS.

3. С использованием методов биоинформатики исследовать филогенетические взаимоотношения ретровирусов и ретротранспозонов в геноме D.melanogaster, а также в геномах разных видов дрозофилы и

членистоногих, и разработать новую классификацию семейств ДКП-ретротранспозонов, основанную на сравнительном анализе высококонсервативных последовательностей (интегразы и обратной транскриптазы), слабоконсервативных последовательностей ретроэлементов (белка капсида), а также на специфичности интеграции, обусловленной структурой интеграз, сайтов-мишеней интеграции и концевых последовательностей ДКП, узнаваемых интегразой.

4. Провести структурно-функциональный анализ доместицированного гена gag ДКП-ретротранспозонов группы gypsy - гена Grp (обнаруженного нами в ходе работы) - с использованием методов биоинформатики: определить возраст гена, наличие действия отбора на отдельные сайты, предсказать наличие консервативных доменов; выявить топологию белка молекулярными методами и исследовать тканеспецифичную экспрессию гена Grp на уровне транскрипции и трансляции в линиях D. melanogaster, различающихся по наличию активного ретровируса gypsy, а также установить участие гена Grp в иммунном ответе на инфекцию.

Научная новизна

В работе исследованы вопросы, связанные с проблемами эволюции генома эукариот и его мобильного компонента.

Впервые создана экспериментальная биплазмидная система in vivo на клетках E.coli, позволяющая регистрировать точные вырезания эррантивируса gypsy. Она показала, что интеграза gypsy способна функционировать в клетках E.coli и не только осуществлять транспозицию этого элемента, встраивая в хромосомы дрозофилы ДНК-копии ретротранспозона gypsy, но и вырезать их по точному механизму (с полным восстановлением исходной нуклеотидной последовательности сайта-мишени). Полученные данные указывают на существование альтернативных способов перемещения не только ДКП-ретротранспозонов, но и, возможно, у ретровирусов позвоночных. Впервые выделена рекомбинантная интеграза эррантивируса gypsy, подобраны и оптимизированы условия для ее функционирования. Впервые исследована активность интегразы gypsy в отсутствии N-концевого и С-концевого доменов интегразы, получены данные о ведущей роли центрального (каталитического) домена интегразы gypsy в осуществлении эндонуклеазной реакции (в отличие от ретровирусов позвоночных). Впервые установлено, что рекомбинантная интеграза gypsy in vitro способна узнавать ДКП других ДКП-ретротранспозонов группы gypsy.

Впервые показано, что в линии D. melanogaster SS, мутантной по локусу flamenco, мутантный фенотип обусловлен нарушением процессинга первичного транскрипта предшественника piPHK в тканях яичников. Впервые установлено, что на транскрипционную и транспозиционную активность некоторых эррантивирусов могут влиять цис-регуляторные факторы - повторяющиеся элементы, локализованные в 5'-нетранслируемой области.

На модельном объекте, D. melanogaster, в геноме которого насчитывается 36 семейств ДКП-ретротранспозонов, 27 из которых относят к группе gypsy,

проведен анализ филогении этих МГЭ. Впервые показано, что группа gypsy биологически неоднородна и делится на три подгруппы на основании анализа последовательностей МГЭ. Впервые установлено, что эррантивирусы, в отличие от ретровирусов позвоночных, проявляют специфичность в отношении выбора ДНК-мишени, согласно которой эррантивирусы можно разделить на три группы: gypsy, ZAM и Idefix. Впервые обнаружено, что специфичность встраивания этих ретроэлементов коррелирует со структурными особенностями ДНК мишени: способностью к изгибанию ДНК, способностью B-формы ДНК переходить в А-форму и деформируемостью при взаимодействии с интегразой, а также с определенным строением концевых последовательностей ДКП, не характерным для ретровирусов позвоночных. Обнаружено, что у неспецифично интегрирующих ДКП-ретротранспозонов концевые последовательности ДКП идентичны таковым у ретровирусов позвоночных и, в силу низкой энергии стэкинг-взаимодействия, являются наиболее деформируемыми звеньями в структуре ДНК, способными к образованию локального изгиба двойной спирали, способствующему интеграции. Также обнаружены определенные особенности в первичной структуре интеграз, способствующие взаимодействию интегразы «неспецифичных» ДКП-ретротранспозонов с ДНК.

Впервые обнаружен доместицированный ген gag эррантивирусов - Grp. Показано, что гомологи гена присутствуют во всех секвенированных геномах Drosophila (но не других насекомых). Показано, что его последовательность находится под действием стабилизирующего отбора. Впервые выявлено, что экспрессия гена Grp тканеспецифична - характерна для соматических тканей. Обнаружено, что экспрессия гена Grp индуцируется в ответ на присутствие ретровируса gypsy и грамположительными бактериями Bacillus cereus. Эксперименты по активации иммунитета грамотрицательными и грамположительными бактериями впервые показали, что повышение уровня экспрессии Grp сопряжено с активацией пути Jak-STAT, который является основным сигнальным путем в противовирусном иммунитете D.melanogaster.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в работе данные позволяют по-новому взглянуть на эволюцию генома эукариот в свете коэволюции с его мобильным компонентом и могут бьггь использованы в дальнейшем для исследования вопросов эволюции систем генетического контроля мобильных элементов, интеграции и генообразования, связанного с молекулярной доместикацией генов ретроэлементов у эукариот. Полученные по филогении эррантивирусов данные направлены в Международный комитет по таксономии вирусов (ICTV) для уточнения классификации ретроэлементов. Полученные по эволюции и механизмам генетического контроля транспозиции эррантивирусов данные можно рекомендовать к использованию в учебном процессе, например в спецкурсах «Генетическая рекомбинация» и «Генетика вирусов» (в разделе «Спецглавы генетики»), читаемых на кафедре генетики биологического факультета МГУ.

Положения, выносимые на защиту

1. Интеграза ДКП-ретротранспозона gypsy функционирует в клетках E.coli и осуществляет эксцизии длинного концевого повтора gypsy с полным восстановлением последовательности сайта-мишени.

2. Интеграза ДКП-ретротранспозона gypsy специфична in vitro в отношении конструкций, содержащих длинные концевые повторы gypsy и других ДКП-ретротранспозонов группы gypsy. Ключевой домен интегразы -центральный.

3. В лабораторной линии SS D.melanogaster мутация в локусе flamenco является следствием нарушения процессинга первичного транскрипта-предшественника piPHK.

4. Группа gypsy ДКП-ретротранспозонов D.melanogaster биологически неоднородна и разделяется на подгруппы согласно сравнительному анализу последовательностей и специфичности их интеграции.

5. Эррантивирусы и их производные проявляют специфичность в отношении выбора нуклеотидной последовательности ДНК-мишени и в отношении гетеро- и эухроматина.

6. В процессе эволюции у дрозофил появился новый ген, доместицированный от гена gag эррантивирусов. Функция доместицированного гена высококонсервативна у дрозофилы и связана с участием в иммунном ответе.

Апробация работы

Результаты, полученные в работе, были представлены на международных научных конференциях: «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 2004); «Современные проблемы генетики» (Минск, 2005); «Генетика в России и мире» (Москва, 2006); "Current evolutionary thinking in Biology, Medicine and Sociology" (Новосибирск, 2007); «Математические чтения РГСУ» (Москва, 2007, 2008; 2009); "Evolutionary biology meeting" (Марсель, 2007, 2013); «Вычислительная филогенетика и геносистематика» (Москва, 2007); «IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов» (Новосибирск, 2008); "XX International congress of genetics" (Берлин, 2008); «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» (Харьков, 2008); «Современные проблемы математики, механики и их приложений» (Москва, 2009); на V и VI Съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009; Ростов-на-Дону, 2014); "International Moscow conference on computational molecular biology" (Москва, 2011, 2013) и других научных конференциях и школах.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 56 печатных работ, из них статей в рецензируемых журналах из перечня ВАК - 22, тезисов докладов и материалов конференций - 33.

Личный вклад автора

Основной творческий вклад в исследование принадлежит автору. Вся биоинформатическая часть работы выполнена автором лично. Большинство

экспериментальных результатов получено автором лично. Результаты по анализу транскрипции локуса flamenco и гена Grp получены совместно с аспирантами А.Р. Лавреновым и И.В. Кузьминым соответственно. Подготовка и написание научных статей, тезисов и докладов для научных конференций на основе результатов данного исследования выполнялись автором лично.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 230 страницах, содержит 76 рисунков, 13 таблиц и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 293 цитируемых источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии D. melanogaster. В исследованиях использовали изогенные линии D.melanogaster с мутацией flamenco: линия flamss (SS, не содержит функциональных копий gypsy)-, отводки линии SS: 7К (1), 7К SS, 7К wl; линия flam (MS, содержит активный gypsy) [Kim et al., 1994]; линия OregonR (Oreg+Y+3), несущую мутацию flamenco [Robert et al., 2001]. В качестве контролей использовали лабораторные линии flamenco+ D32 и CantonS из коллекции кафедры генетики МГУ.

Подготовка биологического материала. Для выделения тканей мух анестезировали с помощью диэтилового эфира и под бинокулярным микроскопом препаровальными иглами производили их вскрытие и отделение кишечников, яичников или семенников от остальных тканей (корпуса). Для выделения РНК собирали примерно по 20 мг тканей. Для индукции иммунного ответа использовали воздействие инъекцией бактериями Е. coli и Bacillus cereus. Для введения бактерий в организм D.melanogaster использовали иглу, смоченную в концентрированной культуре бактерий, отобранных на логарифмической стадии роста. В качестве контроля использовали мух, уколотых сухой иглой. Время воздействия составляло 12 час, после чего по 5 особей отбирали в микропробирки для приготовления одной пробы РНК.

Молекулярный анализ ДНК и белков. Выделение плазмидной и геномной ДНК, РНК, белка, обработку ДНК ферментами, клонирование генов и фрагментов генов, экспрессию генов в составе экспрессионных векторов проводили по стандартным методикам [Sambrook, Rüssel, 2001]. В качестве субстрата для изучения эндонуклеазной активности интегразы использовали конструкцию pBSLTR, полученную на основе вектора pBluescript II KS(+) (Fermentas) и содержащую ДКП gypsy, фланкированный сайтами TATA. Плазмиду использовали как в кольцевой, так и в линеаризованной форме. Контролем служил полноразмерный вектор pBluescript II KS(+), а также его фрагменты в линейной и кольцевой формах. Для проведения эндонуклеазной реакции готовили реакционную смесь, содержащую либо полноразмерную рекомбинантную интегразу, либо интегразу без N-конца, либо интегразу без С-конца в буфере 10 мМ Трис-HCl рН7.5, 10 мМ MgCl2H 0,1 мг/мл БСА. Саузерн-блот гибридизацию проводили по стандартной методике [Sambrook, Rüssel,

2001] на мембране Hybond N+ (GE Healthcare). Вестерн-блот гибридизацию проводили с использованием набора Amersham ECL Kit (GE Healthcare). В качестве первичных антител использовали кроличьи антитела против рекомбинантного белка Grp, 1:10000, в качестве вторичных антител использовали антитела P-RAQ фирмы Имтек, 1:50000. Выделение мембранной фракции белка осуществляли с использованием набора ProteoJET Membrane Protein Extraction Kit (Fermentas). Вычитающую гибридизацию выполняли по известной методике [Mamedov et al., 2005].

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времен». Амплификацию проводили в объеме 25 мкл в течение 40 циклов в амплификаторе MiniOpticon Real-Time PCR System (Bio-Rad Laboratories). Использовали реакционную смесь M-428 (Синтол), содержащую флуоресцентный краситель SYBR Green I. Параметры цикла: денатурация -95°С, 30 с; отжиг праймеров - 55°С, 30 с; элонгация - 72°С, 1 мин. Результаты ПЦР обрабатывали в программе Bio-Rad CFX Manager (версия 1.6.541.1028). Экспрессию рассчитывали ДДС(1)-методом. В качестве референсного гена использовали alpha-tubulin или гр49. Эксперименты по количественному измерению экспрессии генов проведены в трех биологических повторах. Статистическую значимость различий в относительном уровне экспрессии оценивали с помощью критерия Манна-Уитни.

Биоинформатический анализ последовательностей. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей осуществляли с использованием программ Clustal W2 (http://www.ebi.ac.uk/ClustalW2/), Dialign 2.2.1 (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/dialign/) и MACSE (http://mbb.univ-montp2.fr/MBB/subsection/softExec.php?soft=macse). Визуализацию и обработку выравниваний проводили в программе GeneDoc

(http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/) и пакете программ MEGA-5 (http://www.megasoftware.net/). Построение филогенетических деревьев проводили с помощью пакета программ PHYLIP3.67 (http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html) методами максимального правдоподобия и ближайшего соседа. Матрицу расстояний между последовательностями рассчитывали в программе Protdist с использованием алгоритма Jones-Taylor-Thornton. Bootstrap анализ выполняли с применением 100 реплик. Анализ действия отбора сделан с помощью пакета программ на сервере DataMonkey (http://www.datamonkey.org/). При анализе индивидуальных сайтов под действием отбора использовали программу REL (Random Effects Likehood). Также использовали программу codeml пакета программ PAML (http://abacus.gene.ucl.ac.uk/sofhvare/paml.html). Выравнивание и визуализация ДКП всех исследуемых ДКП-ретротранспозонов были сделаны с помощью программы GENIO/logo (http://www.biogenio.com/logo/). Структурные характеристики ДНК мишени: способность перехода в A-форму (A-philicity), изгибание (bendability) и дефор-мируемость спирали при взаимодействии с белком (protein induced deformability) рассчитаны путем сравнения не менее чем 50 различных последовательностей размером 100 нуклеотидов, содержащих в

центре сайт мишени. Расчеты сделаны с помощью пакета компьютерных программ MATLAB с использованием табличных значений, приведенных в статьях [Brukner et al., 1995; Ivanov et al., 1994; Crothers, 1998].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Исследование «точных» эксцизий ДКП-ретротранспозона gypsy в модельной системе в клетках Escherichia coli

При исследовании мутантов, полученных в системе генетической нестабильности SS-MS [Ким и др., 1989], факт точного исключения gypsy из сайта инсерции зарегистрировали и подтвердили документально [Kuzin et al., 1994]. Нами разработана система детекции эксцизий gypsy в клетках E.coli, состоящая из двух плазмид: одна (pBSLTR) содержит последовательность ДНК, которая имитирует встраивание ДКП gypsy в мишень TATA (ДКП окружен дупликациями сайта-мишени TATA), другая (pACYCint) содержит фрагмент рамки pol, кодирующий интегразу. Для анализа взаимодействия интегразы gypsy с его ДКП клетки E.coli XLl-Blue котрансформировали полученными рекомбинантными плазмидами pACYCint и pBSLTR (рис. 1). Трансформированные клоны при рассеве на среде LB с X-gal вели себя стабильно, имели белую окраску и не вьпцепляли синие сектора. Частота спонтанно появляющихся синих колоний может быть оценена как не превышающая Ы0"8-1-10"9. В то же время при индукции IPTG и высеве на агаризованную среду, содержащую X-gal, на фоне белых клонов обнаруживали синие клоны с частотой 1-Ю"3- 1-Ю"4. Наличие колоний синей окраски свидетельствует о том, что интеграза gypsy активна в клетках E.coli: экспрессируется, узнает и вырезает ДКП, содержащийся в плазмиде pBSLTR, точно восстанавливая нуклеотидную последовательность и функцию гена lacZ, что и приводит к проявлению активности ß-галактозидазы [Нефедова и др 2006].

Таким образом, на клетках E.coli показано, что интеграза gypsy действительно способна не только осуществлять транспозицию этого МГЭ, встраивая в хромосомы дрозофилы ДНК-копии ретротранспозона gypsy, полученные в результате обратной транскрипции, но и его эксцизию. При этом эксцизия gypsy происходит по точному механизму с полным восстановлением исходной нуклеотидной последовательности сайта-мишени. Это указывает на существование альтернативных способов перемещения ретротранспозонов. Исходя их общей картины поведения ДКП-ретротранспозонов, которые в последнее время рассматриваются как один из классов ретровирусов, можно было бы прогнозировать, что и провирусы «настоящих» ретровирусов, и эндогенные ретровирусы, вероятно, могут как вырезаться из хромосом по точному механизму, так и подвергаться транспозиции за счет действия интеграз.

Рис. 1. Биплазмидная система для анализа точных вырезаний ДКП gypsy в клетках E.coli. Совместимыми плазмидами pBSLTR (содержит длинный концевой повтор gypsy, окруженный дуплицированными последовательностями мишени -TATA-ДКП-TATA) и pACYCint (экспрессирует интегразу gypsy) котрансформируют в клетки E.coli. Плазмида pBSLTR сконструирована таким образом, что при точном вырезании интегразой длинного концевого повтора gypsy, происходит восстановление рамки считывания гена lacZ, активность которого можно детектировать на селективной среде.

Следует отметить, что полученная модельная система может быть i использована в дальнейшем для исследований in vivo активности интегразы gypsy отношении различных мишеней или в опытах по ингибированию интегразной активности.

Получение рекомбинантной интегразы gypsy и исследование ее активности in vitro

На основе экспрессионного вектора рЕТЗО получена рекомбинантная плазмида pET30int, содержащая фрагмент, кодирующий полноразмерную интегразу gypsy. Для экспрессии конструкции использовали штамм Rosetta E.coli. Обнаружено, что в стандартных условиях большая часть белка выделяется в нерастворимой форме в виде телец включения. Наибольший выход рекомбинантного белка в растворимой форме получен при индукции 1М IPTG в течение 44 час при температуре +4°С. В результате очистки клеточного лизата E.coli после индукции IPTG выделена рекомбинантная интеграза с молекулярной массой --45 кДа.

В составе ретровирусной интегразы выделяют три функциональных домена: центральный (коровый), С- и N-концевой [Engelman et al., 1993]. По крайней мере, для интегразы HIV-1 показано, что N-концевой домен задействован в связывании ионов Zn2+, коровый домен отвечает за связывание концов ДКП вирусной ДНК (субстрата), кофакторов и выбор участка интеграции, С-концевой - за неспецифическое связывание ДНК [Gao et al., 2001]. При исследовании делеционных форм интегразы HIV-1 обнаружено, что для процессинга концов ДНК-копии вируса и переноса ее цепей к сайту

Котрансформация ВлоП

Анализ интегразной функции gypsy

мишени необходимо наличие всех трех доменов [Bushman et al., 1993]. В составе интегразы ДКП-ретротранспозона gypsy D. melanogaster на основании сравнительного анализа с интегразами других ретровирусов также можно выделить три домена. С целью изучения функциональной роли отдельных доменов в проявлении сайт-специфичной активности интегразы исследована эндонуклеазная активность форм интегразы без N-концевого или без С-концевого домена. На основе вектора рЕТЗО получены рекомбинантные плазмиды pET30intAC и pET30intAN, содержащие фрагменты, кодирующие интегразу без С-концевого фрагмента и интегразу без N-концевого фрагмента соответственно, размером по 30 кДа.

Для изучения сайт-специфичной активности рекомбинантной интегразы gypsy в качестве субстрата использовали конструкцию pBSLTR, содержащую один ДКП gypsy. Также использовали плазмиду pUCGypsy (плазмида на основе вектора pUC18, содержащая полноразмерную копию ДКП-ретротранспозона gypsy, полученную из плазмиды pDMlll [Ilyin et al., 1978]), однако разницы в результатах реакции с полноразмерным gypsy и его ДКП не увидели, поэтому в дальнейшем приводим результаты, полученные матрицей pBSLTR. В качестве контроля использовали вектор pBlueScript II KS(+), не несущий вставки ДКП. В ходе работы подобраны оптимальные условия для специфичной эндонуклеазной активности интегразы: время реакции и температура, соотношение концентрации фермента и ДНК-мишени, присутствие кофакторов (ионов металлов).

Для проведения эндонуклеазной реакции готовили реакционную смесь, содержащую белок (IN, INAC или INAN соответственно) и ДНК-субстрат в молярном соотношении 1:5. В результате анализа продуктов реакции в агарозном геле показано, что интеграза изменяет конформацию молекул pBSLTR (рис. 2). Переход от суперскрученной формы плазмиды к релаксированной, по-видимому, обусловлен однонитевыми разрывами (никами), вносимыми интегразой. Интеграза также производит двуцепочечные разрывы в плазмиде pBSLTR. Обе Д-формы интегразы распознают и расщепляют ДНК с образованием одно- и двунитевых разрывов так же, как и целый фермент. Отсутствие С-конца не снижает эндонуклеазной активности интегразы.

Полученные результаты свидетельствуют о ведущей роли каталитического домена интегразы gypsy в осуществлении эндонуклеазной реакции. Подтверждением тому служит также тот факт, что реакция протекает в отсутствие ионов цинка, которые у интегразы HIV-1 связываются с N-концевым доменом [Gao et al., 2001]. В наших экспериментах при добавлении ионов цинка активность интегразы gypsy и ее дельта-форм не изменялась [Нефедова и др., 2011; Маннанова, Нефедова и др., 2011].

Электрофоретический анализ интегразы выявил продукт, который мигрировал в геле с ожидаемой массой димера фермента (рис. 3). Димерная форма белка оставалась стабильной при нагревании в течение 30 мин при 90°С в присутствии 8 М мочевины и 1 М дитиотреитола, однако, деградировала в

присутствии EDTA, что свидетельствует о участии двухвалентных катионов в формировании белкового комплекса. Вероятно, появление линейной формы плазмиды pBSLTR в буфере с меньшей ионной силой (рис. 2) обусловлено активностью интегразы в димерной форме.

Полученные нами данные свидетельствуют о сайт-специфичной активности рекомбинантной интегразы in vitro и о влиянии димеризации на ее активность. При этом рекомбинантная интеграза способна самопроизвольно образовывать димеры в системе in vitro. Ключевую роль в связывании и гидролизе интегразой gypsy ДНК-мишени играет коровый домен фермента.

ш ¿да дс IN AN ДС

1 2 3 4 S 6 7 8

димер

Рис. 2. Электрофоретический анализ продуктов эндонуклеазной активности интегразы и ее дельта-форм с pBSLTR: 1, 6 - плазмида после реакции с полноразмерной интегразой (IN); 2, 7 - с интегразой без N-конца (AN); 3, 8 - с интегразой без С-конца (ДС); 5 - плазмида, инкубированная с реакционной смесью без интегразы (контроль); 4 - ДНК-маркер GeneRuler DNA Ladder Mix (Fermentas). В пробах 1-3 использовали белки непосредственно после элюции, в пробах 6-8 - белки, очищенные на колонках Microcon (Millipore) и диализованные против буфера для эндонуклеазной реакции. Черной стрелкой указана кольцевая релаксированная форма плазмиды, белой - суперскрученная, пунктирной - линейная форма плазмиды [Нефедова и др., 2011].

Рис. 3. Электрофоретический анализ рекомбинантной интегразы

gypsy после диализа против буфера для эндонуклеазной реакции (1) и без диализа (2). Слева указаны размеры маркерных белков (М, белки-маркеры (Fermentas)) [Нефедова и др., 2011; Маннанова, Нефедова и др., 2011].

Исследование in vitro активности рекомбинантной интегразы в отношении мишеней других ДКП-ретротранспозонов группы gypsy

При исследовании способности интегразы узнавать ДКП других ДКП-ретротранспозонов группы gypsy использованы конструкции, созданные на основе вектора pCasper ретротранспозонов группы Конструкции обрабатывали реакции анализировали в

и содержащие ДКП следующих ДКП-gypsy: ZAM, Springer, Tirant, 17.6 и Rover, in vitro интегразой gypsy, после чего продукты агарозном геле (рис. 4). Также интегразой

обрабатывали контрольные плазмиды pCasper и pEGFP-Nl.

В результате обнаружено, что интеграза способна вносить однонитевые (но не двунитевые) разрывы в плазмиды, содержащие ДКП ДКП-ретротранспозонов группы gypsy, при этом в плазмиды, на основе которых сделаны используемые конструкции, интеграза разрывы не вносила. Таким образом, можно сделать вывод о том, что интеграза gypsy способна узнавать ДКП других ДКП-ретротранспозонов группы gypsy, но взаимодействует с ними с более низкой эффективностью.

Рис. 4. Электрофоре-грамма, демонстрирующая результаты обработки in vitro интегразой gypsy плазмид, содержащих ДКП ретротранс-позонов группы gypsy. 1, 3, 5, 7, 11 -плазмиды pCasper: :ZAM-LTR, pCasper::Rover-LTR, pCasper: .Tirant-LTR, pCasper:: 17.6-LTR, pCasper::Springer-LTR после реакции с интегразой; 2, 4, 6, 8, 12 - те же плазмиды, не обработанные интегразой; 9, 13 - плазмиды pCasper и pEGFP-Nl после реакции с интегразой (контроль); 10, 14 — плазмиды pCasper и pEGFP-Nl, не обработанные интегразой; M - маркер молекулярных размеров GeneRuler DNA Ladder Mix (Fermentas).

Исследование транскрипции локуса flamenco в лабораторных линиях SS и MS Drosophila melanogaster, мутантных по локусу flamenco

Ген flamenco, контролирующий транспозиции ДКП-ретротранспозона gypsy, был обнаружен при исследовании системы изогенных линий D. melanogaster SS и MS [Prud'homme et al, 1995]. MS - нестабильная мутаторная линия, полученная из стабильной лабораторной линии SS путем введения активной копии gypsy, характеризуется увеличенной частотой спонтанного мутагенеза, нестабильным характером мутаций и активной транспозицией ДКП-ретротранспозона gypsy. Однако в течение 20 последних лет выяснить природу гена flamenco до конца не удалось. Стало известно, что flamenco не является белок-кодирукяцим геном, а представляет собой локус, с которого считывается единая молекула РНК-предшественника piPHK, которая участвует в подавлении транскрипции МГЭ путем РНК-интерференции [Brennecke et al., 2007] и отличается однонаправленностью транскрипции 85% дефектных копий МГЭ, причем большинство из них принадлежат к группе ДКП-ретротранспозонов gypsy [Malone et al., 2009].

Мы предположили, что в линии S S с фенотипом flamenco, молекулярная природа которого неизвестна, может быть нарушен механизм образования piPHK. Причин нарушения может быть, как минимум, две: единый транскрипт-предшественник piPHK или не образуется в результате нарушения инициации транскрипции, или образуется, но не подвергается дальнейшему процессингу. Чтобы разобраться в этом вопросе, проведен анализ транскрипции РНК в

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 M

линиях SS и D32 в четырех точках локуса flamenco. Первая точка локализована в интроне гена DIP1, в антисмысловой нити которого локализован МГЭ НВ1\ этот элемент может являться одним из сайтов инициации транскрипции локуса flamenco и имеет различную структуру в линиях дикого типа и мутанта flamenco, что, соответственно, может влиять на транскрипционную активность локуса flamenco [Нефедова, Ким, 2007]. Три другие точки взяли на расстоянии 2500, 7700 и 10200 п.н. от начала гена/)//5; (рис. 5).

Для постановки обратной транскрипции в качестве затравок использовали 4 праймера, которые отжигали одновременно на одной и той же матрице РНК, выделенной из яичников (или семенников); кДНК получали с антисмысловой (по отношению к гену DIP1) нити РНК, поскольку транскрипция подавляющего большинства последовательностей МГЭ локуса flamenco совпадает с направлением транскрипции гена DIP1 (по данным FlyBase, www.flybase.org).

1234 1234 1234 1234

D32 SS D32 SS

Яичники Семенники

Рис. 5. Уровни транскрипции РНК в локусе flamenco в линиях flamenco* (D32) и flamenco (SS). Стрелками на карте показана локализация 4-х анализируемых точек локуса (пояснения в тексте). А) Диаграмма транскрипции flamenco в яичниках. Б) Диаграмма транскрипции flamenco в семенниках. В) Уровень малых РНК (прямоугольниками выделена фракция малых РНК, уровень которых повышен в линии SS) [Лавренов, Нефедова и др., 2014].

В результате обнаружено, что в яичниках общий уровень транскрипции в анализируемых точках 1 и 2 локуса flamenco примерно в 2 раза ниже в линии SS, чем в линии D32, а в точках 3 и 4 в линии D32 наблюдается снижение уровня транскрипции в 30 и в 3 раза соответственно (рис. 5, А). По-видимому, снижение экспрессии точках 3 и 4 свидетельствует о процессинге РНК-предшественника, считываемого в этом районе и о том, что процессинг осуществляется с разной эффективностью в этих точках. В то же время в линии SS снижение уровня транскрипции в точках 3 и 4 не наблюдается, что

свидетельствует, по-видимому, об отсутствии процессинга РЖ в исследуемой области в линии SS. В семенниках транскрипция в исследуемых точках в линиях дикого типа и мутанта принципиально не различается (рис. 5, Б).

При анализе тотальной РНК, выделенной из мух линий SS (flamenco) и D32 (flamenco4"), обнаружено, что в линии SS повышен уровень малых РНК размером 80-100 н. (рис. 5, В). При этом изменений в экспрессии известных генов системы РНК-интерференции не выявлено.

Чтобы установить область начала транскрипции локуса flamenco, использовали методы ОТ-ПЦР и RACE. В результате установлено наличие промотора в МГЭ НВ в составе гена D1P1. Таким образом, промотор НВ может использоваться как сайт инициации транскрипции предшественника piPHK. Недавно показано, что транскрипция локуса flamenco идет и с альтернативных промоторов [Goriaux et al., 2014]. Транскрипция с обнаруженного нами промотора осуществляется как в линии flamenco, так и в линии flamenco+, и нам не удалось обнаружить доказательств тому, что причиной мутации flamenco служат изменения в структуре МГЭ НВ.

Ретротранспозоны Idefix, ZAM и Tirant способны изменять геномную локализацию в линии MS Drosophila melanogaster, мутантной по гену flamenco

Поскольку МГЭ gypsy является одним из одиннадцати родственных эррантивирусов D. melanogaster, закономерно возникает вопрос, контролирует ли локус flamenco транспозиции других эррантивирусов. Если да, то существуют ли функционально активные эррантавирусы в системе линий продленной генетической нестабильности SS-MS, помимо gypsy. Для анализа транспозиций использовали модифицированный метод ТТТТР -инвертированную ПЦР. На первом этапе убедились, что все ДКП-ретротранспозоны присутствуют и транскрибируются в исследуемых линиях. Оказалось, что это так для всех МГЭ. При этом необычным образом вел себя только МГЭ Tirant (его транскрипция различалась в разных отводках линии SS). В результате проведенных экспериментов различное генетическое окружение обнаружено только у двух МГЭ, кроме gypsy. ZAM и Idefix. Полученные с помощью инвертированной ПЦР результаты подтверждены Саузерн-блот-гибридизацией с зондами к элементам Idefix и ZAM [Нефедова и др., 2010]. Далее методом вычитающей гибридизации отдельно исследована транспозиционная активность МГЭ Tirant. Метод основан на инвертированной ПЦР и позволяет сравнивать один (трэйсер) относительно другого генома (драйвера) [Mamedov et al., 2005]. Удалось выявить транспозиции и установить геномную локализацию трех новых инсерций в линии MS [Нефедова и др., 2012]. Первая инсерция Tirant произошла в ген cactus. Вторая инсерция обнаружена в гене aralarl. Третья инсерция попала в область повторяющейся некодирующей ДНК.

Ранее установлено, что транспозиция ДКП-ретротранспозона ZAM у D. melanogaster осуществляется преимущественно в районы гетерохроматина

[Baldrich et al., 1997]. Для ZAMпоказано прямое взаимодействие повторов в его 5'-UTR с гетерохроматиновым белком HP la [Minervini et al., 2007]. МГЭ Tirant также содержит в 5'-UTR повторы (от 2-х до 6-ти повторяющихся мотивов размером 102 п.н.). Поскольку МГЭ Tirant близок к ZAM в филогенетическом отношении, но не интегрирует в гетерохроматин, особое внимание мы уделили поиску возможной взаимосвязи транспозиционной активности этого МГЭ со структурой его 5'-UTR.

При амплификации ДНК 5'-UTR Tirant обнаружено, что в геномах исследуемых линий встречаются все возможные полиморфные варианты Tirant, содержащие 2-6 повторяющихся мотивов (рис. 6). Чтобы определить какие из полиморфных копий транскрибируются, провели амплификацию 5'-UTR кДНК отводок линии SS и линии MS. Результаты данного эксперимента позволили выдвинуть предположение о том, что селективное преимущество в транскрипции и последующей транспозиции имеют копии МГЭ Tirant с наибольшим числом повторяющихся мотивов в 5'-UTR.

7К1 7KSS 7Kw1 7К SS

7Kw1 SS 7KSS 7K17K

500 п.н.

юоо п.н. —»ДИИМиДИИИИИИИ Tirant

Ъ" - л ■'■■.".

«ООП*. —мииюш о* 2Д1

¡¡¡¡иия ш

250п.н. .............I——I HI 500 П.Н. —--■■■■■ИжЗ

Рис. 6. Амлификация 5'-нетранслируемой области ДНК (слева) и кДНК (справа) Tirant линии SS (отводки 7Kwl, SS, 7KSS, 7К1, Ж). В качестве контроля использован ген гр49. Стрелками указаны длины маркера фрагментов ДНК - Gene Ruler DNA Ladder Mix (Fermentas).

Это предположение подтверждается тем фактом, что обнаруженные нами инсерции Tirant имеют 6 повторяющихся мотивов в 5'-UTR, а также тем фактом, что большинство инсерций Tirant в секвенированном геноме D.melanogaster (содержит 20 полноразмерных копий Tirant, пригодных для биоинформатического анализа) имеет 5-6 повторяющихся мотивов. Следует также отметить, что большинство инсерций Tirant обнаружено преимущественно в активно транскрибирующихся эухроматиновых районах: в интронах генов либо в районах, прилегающих к генам.

Филогения и систематика ДКП-ретроэлементов дрозофилы

Существующая классификация ДКП-ретротранспозонов построена на основании сравнительного анализа консервативного домена обратных транскриптаз. Согласно этой классификации выделяют три группы семейств ДКП-ретротранспозонов - gypsy, copia и BEL. В геноме D. melanogaster группа gypsy самая многочисленная и представлена 27-ю семействами ДКП-ретротранспозонов (всего семейств 36). Наблюдаемое разнообразие семейств

ДКП-ретротранспозонов группы gypsy свидетельствует, очевидно, о недавнем происхождении ныне существующих семейств, о транспозиционной активности МГЭ этой группы и об активно идущих эволюционных процессах внутри этой группы. В состав группы gypsy входят элементы с одной ОРС (gag-pol), двумя ОРС (gag и pol) и тремя ОРС (gag, pol и env). Принято считать, что у дрозофилы 1 ДКП-ретротранспозоны группы gypsy, изначально имевшие две ОРС, приобрели третью ОРС - ген env - и, следовательно, инфекционные свойства, у бакуловирусов, превратившись в ретровирусы [Malik et al., 2000]. К последним относят 11 ДКП-ретротранспозонов группы gypsy, для двух из которых - gypsy и ZAM - инфекционные свойства подтверждены экспериментально. Международная классификация вирусов ICTV делит группу gypsy на 2 рода в зависимости от наличия или отсутствия третьей рамки считывания env: Errantivirus и Metavirus соответственно.

При детальном анализе группы gypsy прежде всего обращает на себя внимание тот факт, что в одной группе находятся МГЭ с одной, двумя и тремя ОРС, а к роду Metavirus относятся МГЭ и с одной, и с двумя ОРС. Это означает, что ни классический подход, примененный первоначально для классификации ДКП-ретротранспозонов на группы [Bowen, MacDonald, 2001], ни классификация, основанная на наличии/отсутствии третьей рамки, не дают никакой информации о филогенетических отношениях МГЭ с разным количеством ОРС внутри одной группы.

Если ретровирусы дрозофилы возникли путем заимствования ДКП-ретротранспозонами группы gypsy с двумя ОРС гена env, то, очевидно, первые должны быть моложе вторых. Чтобы решить, так ли это на самом деле, необходимо было рассмотреть вопрос о филогенетических взаимоотношениях ДКП-ретротранспозонов с двумя и тремя ОРС. В настоящей работе проведен сравнительный анализ последовательностей ДКП-ретротранспозонов группы gypsy, основанный на сравнении последовательностей белка Gag, который эволюционирует быстрее, чем консервативные домены Pol [Terzian et al., 2001], что позволяет более адекватно оценивать эволюционные расстояния между ДКП-ретротранспозонами в пределах одного генома. Проведенный анализ позволяет выделить в группе gypsy три подгруппы: в подгруппу I (названа gypsy) входят ДКП-ретротранспозоны с двумя и с тремя ОРС, в подгруппу II (названа 412) - ДКП-ретротранспозоны с двумя ОРС, в подгруппу III (названа blastopia) - ДКП-ретротранспозоны с одной ОРС (рис. 7) [Нефедова, Ким, 2009].

Внутри подгруппы I установлено близкое родство последовательностей определенных ДКП-ретротранспозонов с двумя и с тремя ОРС. Таким образом, ДКП-ретротранспозоны с двумя ОРС могут считаться либо предшественниками ретротранспозонов с тремя ОРС, приобретшими вирусные свойства, либо их производными, утерявшими ген env. Однако поскольку ген env, по-видимому, имеет монофилетическое происхождение, ДКП-ретротранспозоны с двумя ОРС McClintock, qbert, accord, Burdock, HMS-Beagle и Transpac - производные эррантивирусов, вторично утерявшие инфекционные свойства. Таким образом,

подгруппа I включает эррантивирусы и их производные с двумя ОРС, которые, следовательно, должны относиться не к роду Metavirus (как в современной классификации ICTV), а к роду Err antivirus. Таким образом, группа gypsy демонстрирует способность ретроэлементов к модульной эволюции. При этом ДКП-ретротранспозоны могут преобразовываться в ретровирусы путем захвата гена env, а ретровирусы, в свою очередь, могут терять ген env, преобразуясь в ДКП-ретротранспозоны.

Рис. 7. Филогенетическое дерево ДКП-ретротранспозонов группы gypsy D. melanogaster. При построении использовали последовательности белков Gag. На внутренних ветвях консенсусного дерева приведены значения бутстреп-поддержки узлов. Названия ДКП-ретротранспозонов с тремя ОРС подчеркнуты [Нефедова, Ким, 2009].

Далее проанализировано распределение основных семейств ДКП-ретротранспозонов в секвенированных геномах 20 видов дрозофилы и 11 видов членистоногих. Особое внимание обращали на филогению ДКП-ретротранспозонов группы gypsy, представленную у D. melanogaster наибольшим разнообразием семейств. Возраст инсерций ныне существующих ДКП-ретротранспозонов в геноме D. melanogaster, как, по-видимому, и в любом другом геноме Drosophila, оценивается как 137 ± 89 тыс. лет [Bowen, McDonald, 2001]. Но это не означает, что все ныне существующие ДКП-ретротранспозоны у разных видов Drosophila есть результат их распространения между видами

путем горизонтального переноса. Так, в пределах группы melanogaster есть четкая тенденция к вертикальной передаче ДКП-ретротранспозонов: чем ближе виды, тем больше сходство последовательностей ДКП-ретротранспозонов. По присутствию гомологов исследуемых МГЭ в геномах разных видов можно судить о возрасте этих семейств и установить приблизительное время обособления семейств ДКП-ретротранспозонов. Все три подгруппы внутри группы gypsy у Drosophila обособлены. Обособление подгрупп I и II группы gypsy наблюдается в только видах отрядов Díptera и Lepidoptera. Это указывает на наличие эррантивирусов только в геномах отрядов Díptera и Lepidoptera. При этом в геномах всех исследованных видов присутствуют ДКП-ретротранспозоны группы gypsy с одной (подгруппа III) и с двумя ОРС (подгруппа II).

Очевидны случаи горизонтального переноса некоторых ДКП-ретротранспозонов между геномами дрозофил. Например, близкие гомологи МГЭ 17.6 и Quasimodo не обнаружены в геномах D. simulans, D. sechellia и D.yahiba. При этом практически идентичные копии этих МГЭ присутствуют в геноме D. erecta. По-видимому, ДКП-ретротранспозоны 17.6 и Quasimodo попали в геном D.melanogaster из генома D.erecta недавно и после разделения видов D. melanogaster, D. simulans и D. sechellia. Напротив, из генома D. melanogaster в геном D. erecta попал МГЭ gtwin (в обоих геномах присутствуют идентичные копии этого МГЭ). Примечательно, что ДКП-ретротранспозоны подгруппы II имеют практически идентичные копии в разных видах группы melanogaster подгруппы II и очень близких гомологов (идентичность у последовательностей обратных транскриптаз более 90%) в филогенетически далеких видах (в группе melanogaster и willistoni, virilis, repleta). Это может означать только одно - ДКП-ретротранспозоны подгруппы II способны к горизонтальному переносу без помощи собственного гена env.

Классификация ДКП-ретроэлементов, основанная на комплексном анализе особенностей интеграции

В результате проведенного анализа сайтов интеграции установлено, что эррантивирусы и производные от них ДКП-ретротранспозоны группы gypsy (и только они) проявляют специфичность в отношении выбора ДНК-мишени, и эта специфичность различна в трех подгруппах эррантивирусов, которые мы обозначили gypsy, ZAMyí Idefix (рис. 8) [Nefedova et al., 2011].

ДКП-ретроэлементы подгруппы Idefix предпочитают встраиваться в АТ-повторы (от 3 до 20 динуклеотидов). ДКП-ретроэлементы подгруппы ZAM предпочитают для встраивания последовательность 5'-GCgcGC-3\ Два средних нуклеотида мишени могут варьировать, но, как правило, наблюдаются транзиции G->A и С—>Т. ДКП-ретроэлементы подгруппы gypsy предпочитают для встраивания мишень 5'-АТРиРуАТ-3'. Остальные ДКП-ретротранспозоны группы gypsy строгой специфичности в отношении мишени не проявляют. Исключение составляет подгруппа III (blastopia), для которой можно выделить слабую консенсусную последовательность мишени (АТ)6. Специфичности

встраивания у ДКП-ретротранспозонов групп BEL и copia мы также не обнаружили. Примечательно, что и по механизмам интеграции - дупликации 5 п.н., и по последовательности интеграз ретровирусы (лентивирусы) HIV-1 и SIV оказываются ближе к ДКП-ретротранспозонам групп copia и BEL. Специфичность интеграции не свойственна ретровирусам позвоночных [Wu et al., 2005]. Строгая специфичность интеграции - исключительное свойство эндогенных эррантивирусов D.melanogaster и производных от них ДКП-ретротранспозонов с двумя ОРС.

I LTR-retrotransposon group subgroup ORT numder Target site

. copié. J Copia. 1

»1, ХЧ

îiiît » t- «» С О

-Hi^siv Lentiviruses 3 °WT!ac îS 'HIV Kcuw^iusoe j (Vcetal., 2005}

r3S18—BEL > »-¡-diver

-TOO

.412

\-mdql

BEL

-Bleed _blsszcpie

-—,mdg3

"ilnvader

_accord П31.rirant

i •

'oous ST *

\ "KKS-Beagle

— Burdock »t-springer "'■gypsy •gtwin .ДГ-

fe :

Ideflx Quasimodo

"J237

uy^

422

blaatopLa

Gypsy

gypsy

2-3

McClintock Transpac J

Рис. 8. Систематика ДКП-ретротранспозонов группы gypsy, основанная на филогении и особенностях интеграции. Показаны: филогенетическое древо, построенное на основании сравнения аминокислотных последовательностей интеграз ДКП-ретротранспозонов D.melanogaster и лентивирусов со значениями бутстреп-анализа; классификация групп и подгрупп ДКП-ретротранспозонов; количество ОРС у представителей различных групп и подгрупп ДКП-ретротранспозонов; последовательности сайтов мишеней (по 10 н.), боксами выделены дупликации мишеней (4-5 нуклеотидов) [Nefedova et al., 2011].

В выборе мишени ДКП-ретротранспозонов, как и у ретровирусов позвоночных, важную роль могут играть факторы, благоприятствующие их интеграции. К таким факторам могут относиться структурные особенности

ДНК мишени, в том числе, особенности ее вторичной структуры. Поэтому далее проанализированы структурные особенности районов интеграции ДКП-ретротранспозонов, такие как способность перехода в А-форму, изгибание и деформируемость спирали при взаимодействии с белком.

Используя модель, основанную на расчетах частот тринуклеотидов, мы проанализировали способность к изгибанию области интеграции (100 п.н.) в двух группах и пяти подгруппах ДКП-ретротранспозонов D.melanogaster (рис. 9).

A-philicity Bendability

P-induced deformabilifcy

gypsy 05

Idefix

ZAM o s

blastopia os

412

BEL

.i b»-MiJ£iitJ> t

Copla

Random

20 40 60 SO

Рис. 9. Способность перехода в А-форму (А-philicity), изгибание (bendability) и деформируемость спирали при взаимодействии с белком (protein induced deformability) областей хромосомной ДНК (100 п.), окружающих

инсерции МГЭ.

Стрелками показаны сайты инсерций МГЭ. Random - сгенерированные компьютером случайные последовательности [Nefedova et al„ 2011].

Способность к изгибанию ДНК обнаружена в областях интеграции ДКП-ретротранспозонов подгруппы Idefix. Менее выраженная склонность к изгибанию наблюдается в области интеграции ДКП-ретротранспозонов подгрупп I (gypsy) и II (blastopia). Это не удивительно, поскольку представители всех трех подгрупп предпочитают АТ-богатые области.

Показано, что, участок ретровирусной ДНК, вовлеченный во взаимодействие с обратной транскриптазой, переходит в А-форму [Horton, Finzel, 1996]. В наибольшей степени В-А переходу подвержены динуклеотиды TG, CA, АА, GA, ТС и TT, которые обнаружены в местах интеграции ДКП-ретротранспозонов подгрупп gypsy, Idefix, в меньшей степени - подгруппы blastopia.

Еще одна важная характеристика ДНК - ее деформируемость при взаимодействии с белком (интегразой). TG и CG динуклеотиды наиболее подвержены деформации [Crothers, 1998]. Обнаружено, что последовательность сайта мишени ДКП-ретротранспозонов подгруппы ZAM наиболее подвержена

деформации. В меньшей степени - сайты интеграции ДКП-ретротранспозонов подгрупп gypsy, Idefix и blastopia.

Анализ концевых последовательностей ДКП-ретротранспозонов показывает, что эррантивирусы и их производные несут на 5'-конце консервативный тринуклеотид AGT, на 3'-конце - менее консервативный - АпТ, где п - любой нуклеотид (рис. 10). Примечательно, что наличие именно таких концевых последовательностей коррелирует с наличием строгой специфичности у эррантивирусов дрозофилы в отношении мишеней. Все остальные ДКП-ретротранспозоны имеют на концах консервативные динуклеотиды TG/CA, как и ретровирусы позвоночных. Отметим еще раз, что и те, и другие, строгой специфичности встраивания не имеют. Известно, что динуклеотиды TG, CA и ТА, в силу низкой энергии стэкинг-взаимодействия являются наиболее деформируемыми звеньями в структуре ДНК, способными к образованию локального изгиба двойной спирали. Поэтому эти три динувшеотида являются сайтами узнавания для многих белков, вовлеченных в рекомбинацию, репликацию и инсерционные события [Mashkova et al., 2001]. Это может означать, что концевые последовательности (а не мишень, как в случае мишень-специфичных эррантивирусов и их производных) подготовлены для встраивания - способны к изгибанию, необходимому для образования контакта с мишенью, поэтому специфичность нуклеотидного состава мишени в данном случае не так важна.

Group/SKbgroiip ] -:":1 Sbjai'3' ИИ

Рис. 10. Множественное выравнивание 5'- и З'-концевых последовательностей ДКП-ретроэлементов D.melanogaster [Nefedova et al., 2011].

В результате анализа секвенированного генома D.melanogaster установлено, что инсерции ZAM обнаруживаются только в гетерохроматине, а Tirant - только в эухроматине. Остальные ДКП-ретротранспозоны встречаются и в эухроматине, и в гетерохроматине. Примечательно, что и ZAM, и Tirant имеют в 5'-нетранслируемой области (5'-UTR) тандемные повторы: у ZAM таких повторов 2.3 (длина 307 п.н.), у Tirant выявлен полиморфизм числа тандемных повторов - от 2 до 6 (длина 102 п.н.).

Ранее в геноме D.simulons обнаружено два семейства МГЭ Tirant: С -эухроматиновое (есть у D. simulons и у D.melanogaster), и S -гетерохроматиновое (есть только у D.simulons), различающиеся структурой повторяющихся районов 5'-UTR [Fablet et al., 2006; Fablet et al., 2009]. Проанализировав гетерохроматиновую составляющую секвенированного

ZAM, Gypsy, Idefix.

Copia, BEL, 4.12, blastopia

генома, мы обнаружили новое, ранее не описанное, гетерохроматиновое подсемейство Tirant, которое назвали Tirantjiet. Это подсемейство представляет собой более древнюю, ныне нефункциональную, отдельно эволюционировавшую гетерохроматиновую ветвь подгруппы ZAM группы gypsy. Сходство последовательностей Pol Tirant и Tirantjiet составляет около 80%. Таким образом, наряду со специфичностью интеграции в определенную нуклеотидную мишень, у элементов подгруппы ZAM имеется специфичность в отношении интеграции в эухроматин/гетерохроматин, и эта специфичность определяется регуляторной последовательностью 5'-UTR.

Таким образом, на примере группы gypsy D.melanogaster показаны широкие эволюционные возможности мобильных элементов, которые основаны не только на высокой скорости изменчивости их последовательностей, но и на способности к модульной эволюции, то есть на способности заимствовать отдельные модули или гены в геноме хозяина и у других организмов. В результате определенных преобразований 5'-UTR у ретровирусов возникают возможности специфически интегрировать в эухроматин, что важно для обеспечения их дальнейшей жизнеспособности.

Ген CG4680 D.melanogaster - доместицированный ген gag ¡ эррантивирусов

Проведя с помощью программы BLAST поиск белков, которые имеют гомологию с белком Gag эррантивирусов, мы обнаружили в геноме D.melanogaster единственную ОРС, кодирующую белок с неизвестной функцией, - CG4680 (NP_648891). Обнаруженный ген назвали Grp {Gag related protein). Ген Grp локализован в секции 72Е4-Е5 третьей хромосомы D.melanogaster (FlyBase), вне какого-либо окружения последовательностей ретротранспозона, имеет размер 1714 п.н., не содержит интронов и кодирует продукт размером 352 аминокислотных остатка [Нефедова, Ким, 2009].

Продукт гена Grp проявляет наибольшее сходство с белком Gag ДКП-ретротранспозона группы gypsy Transpac. Gag Transpac и Gip имеют 35% идентичных и 57% сходных аминокислотных остатков. На основании филогенетического анализа сделан вывод о том, что элемент Transpac с двумя ОРС не является производным какого-либо из ныне существующих в геноме D.melanogaster эррантивирусов и появился, по-видимому, близко ко времени обособления подгрупп gypsy, ZAM и ldefix. Таким образом, можно считать, что Grp является производным gag ДКП-ретроэлемента (возможно, эррантивируса), от которого произошел ныне существующий в геноме D.melanogaster ДКП-ретротранспозон Transpac.

Далее исследовали, как происходила эволюция гена Grp у дрозофилы. Близкие гомологи Grp D.melanogaster присутствуют во всех 20 геномах разных видов Drosophila, секвенированных к настоящему времени (рис. 11). Появление гена произошло после выделения семейства Drosophilidae из отряда Díptera, поскольку в геномах комаров и других насекомых, чьи геномы секвенированы, гомолога этого гена нет.

Удивителен тот факт, что ген Grp отличается высокой консервативностью последовательности у всех исследованных видов. Это свидетельствует о том, что его функция важна для Drosophila и поддерживается стабилизирующим отбором. Обращает на себя внимание и тот факт, что в продукте гена Grp имеются вариабельные участки, на которые, по-видимому, действует движущий отбор. Соотношение dN/dS для целого гена (PALM-анализ) не позволяет выделить доменов или отдельных оснований, находящихся под действием движущего отбора. Поэтому мы проводили анализ наличия движущего отбора на отдельные сайты, используя программу REL (Random Effects Likelihood) (http://www.datamonkey.org/), как одну из наиболее подходящих для анализа наличия отбора в небольшой выборке последовательностей. В результате обнаружены три сайта, находящихся под действием движущего отбора, и 254 сайта, находящихся под действием стабилизирующего отбора, в гене Grp.

88г D.simulans (0.103) 100J D.sechellia (0.108)

L- D.melanogaster (0.104) D.erecta (0.020) D.yakuba (0.047) aj— D.rtiopaloa (0.Ю4) —D.elegans (0.101)

EOeugracife (0.052) D ficusfila (0.015) D.takahashii{0MT)

-D.kikkawai (0.015)

D.biarmipes (0.048) - D.ananassae (0.103) I D.miranda (0.035) ToorD.pseudoobscura (0.105) 54l D.persimilis(0M9) D.willistoni (0.047) D.grimshawi (0.047)

-D.viritis (0.160)

-D.mojavertsis (0.104)

inelanogaster group

obscura group

wiliistoni group Hawaii an drosophila group viriiis group repl eta group

- gag_Transpac

■ gag_ZAM

-gag_gypsy

Рис. 11. Молекулярный филогенетический анализ гомологов Сгр в разных видах ВговорМа. Для построения филогенетического древа использовали метод максимального правдоподобия (модель Тамуры-Нея). Средние значения для каждого гена (указаны в

скобках) рассчитаны по модели М09411ЕУ [ЫеГейоуа ег а1., 2014].

В структуре вгр имеются два вариабельных участка (рис. 12). Это участки, образованные путем накопления (амплификации) глицин-богатых последовательностей. Один такой участок - вЫ-богатый - находится в К-концевой части белка. Он не является гидрофобным, поэтому его функцию

предположить сложно. Другой участок - GV-богатый - в С-концевой части белка. Здесь наблюдается отбор в сторону образования трансмембранного домена.

На С-конце белка консервативность структуры невысока, наблюдается низкая комплексность аминокислотного состава и отбор в сторону накопления полярных аминокислотных остатков. В результате анализа топологии и внутриклеточной локализации Grp и его гомологов с помощью пакета программ МетРуре предсказано, что Grp наиболее вероятно является белком, локализованном во внутриклеточной мембране. Наличие трансмембранного домена является интересным фактом. Если учесть предсказанную топологию белка: С-концевая часть (неструктурированная, а значит способная к взаимодействию с другими молекулами, белками или нуклеиновыми кислотами) - снаружи, N-концевая часть - внутри, мембранная локализация может свидетельствовать в пользу некоей рецепторной функции белка Grp.

j—QtlGKGASHG

гвмалса

[--GtTGHGSAWG

IGNGHGAGt |--GNGNGAGHG

-GHANGTCD | - - G - AtTGNGHG GHGliGAGNG •GHGNGAGNG ■ -GUGNGAAHG rGHGNGHAHG iGHGNGHAHG

sghghghahg

GNGHG--1 SGHGKASGk-Vj ¡NGNGHCd 'AHGHGGGA-pHHRTi^9 :HRHGH— 1

GMGGVGV8TVGVGVGM3IGMKRRPGVS S - -'3HGGVGVSrVGVGVQMGIGMRRKPGLSS- -! VGMGGVGVSTVGVGVGHG - -MRCOVSLSS— 'GVSTVGVGVGMG - -KRRGPGLS S — 'STVGVGVGKGMGMRRGP GLS S - -[GGVGVGTVGLGVGMG—AGSQA--SS—

'GVGTVGLGVGMG—AWPGP—SS-----XAI

'GVSTLGLGVGMG—ARP----SA-----XAJ

GLGVGMG—AGSGT--SS-----YAj

'GMGGVGVSTVGLGVGMG—AGSGT- -SS—-

'OVSTVGLlsVetia--AGSaS - -SS-----yaI

'SMGGVGVSTVGLGVGMG - - ASS GP - - S S-----

IGGVGVSTVGLGVGMG—AGPGT--SS-----Щ

'GMGGVGVSTVGLGVGMG—AGSGH—SSAG---is

'GVSTVGLGVGMG--AGSGH--SSAG---Xtf

'GMGGVGVSTVGLGVaKG— AGSGH- -SSAG---YGf

-----GVGVGAVGS GVGHS--LHCLGSIASTGXAGXC»

IGOeVRIGASTMSSGVGMG--LHRLGGXASTGFS-Ш WGTGTVQS SMSVGMeLHCVRGLASTGPS-YG! GMGGVGISTVSLGIGVASCSGGNGGMSY—SSSXffll

Рис. 12. Структура Grp у Drosophila. Белок содержит высоко консервативный N-концевой домен (темно-серый, 70% идентичных аминокислот в 20 выровненных последовательностях), менее консервативный С-терминальный район (серый, 50% идентичных аминокислот в 20 выровненных последовательностях), два G-богатых содержащих повторы района (светло-серые), второй G-богатый район предсказан как трансмембранный. Ниже приведены фрагменты множественного выравнивания G-богатых районов, первое из которых включает фрагмент последовательности и Gag Transpac (второй G-богатый район в Gag Transpac отсутствует). Треугольниками показаны сайты, находящиеся под действием движущего отбора [Nefedova et al., 2014].

Анализ экспрессии гена Сгр на уровне транскрипции

Анализ транскрипции гена Огр показал, что ген Огр экспрессируется у £>. melanogaster. Более того, экспрессия этого гена не является конститутивной и изменяется в течение онтогенеза: с базального уровня на эмбриональной и

личиночной стадиях до ярко выраженного во взрослой стадии [Нефедова и др., 2011].

Дальнейший анализ экспрессии проводили на стадии взрослых мух. Исследование экспрессии гена Grp проведено в пяти линиях D. melanogaster: трех линиях flamenco и двух линиях flamenco+. Линии Canton S и D32 - линии дикого типа (flamenco+), линии SS и Oregon+Y+3 - линии flamenco - имеют две различные мутации в локусе flamenco, линия MS изогенна линии SS, но имеет искусственно введенную функциональную и активно перемещающуюся копию эррантивируса gypsy. Анализ проводили с использованием ПЦР в реальном времени (рис. 13, А).

Различия в уровне экспрессии у мутантов flamenco по сравнению с линиями дикого типа незначительны или отсутствуют. Во всех исследованных линиях дрозофилы (кроме Canton S) у самцов обнаружен повышенный уровень экспрессии гена Grp по сравнению с самками. При этом различие в экспрессии никак на связано с дозой гена Grp, так как он локализован в аутосоме, и его копийность одинаковая у самок и самцов. При сравнении отношения уровня экспрессии гена Grp у самок к уровню экспрессии у самцов обнаруживается, что в линии MS это отношение снижено за счет увеличения уровня экспрессии у самок по сравнению с линией SS.

В дальнейших исследованиях линия SS использована для анализа тканеспецифической экспрессии гена Grp. Методом обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проанализирована экспрессия гена в корпусе взрослых особей (без головы и внутренних органов), голове, кишечнике, семенниках и яичниках (рис. 13, Б). Установлено, что ген Grp экспрессируется на высоком уровне в тканях кишечника взрослых особей линии SS. Транскрипция практически не детектируется в гонадах и выявляется на низком уровне в тканях корпуса. Таким образом, тендерные различия объясняются повышенной экспрессией Grp в тканях кишечника у самцов и отсутствием экспрессии Grp в яичниках. Подобная тканеспецифичность экспрессии может потенциально быть связана с индукцией ответа на вирусную инфекцию, так как кишечник — это первичный барьер для проникновения вирусных частиц в организм мухи.

При сравнении уровней экспрессии в тканях взрослых особей линий SS и MS обнаружено, что уровень экспрессии Grp в корпусе особей линии MS статистически отличается и приблизительно в 2 раза выше, чем в линии S S (рис. 13, В). Такая же тенденция наблюдается в тканях кишечника. В яичниках ген Grp экспрессируется на очень низком уровне. При этом во всех исследуемых органах уровень экспрессии gypsy приблизительно в 20 раз выше у особей линии MS (рис. 13, Г).

Повышенный уровень экспрессии Grp у самок линии MS относительно других линий можно объяснить наличием активной копии ретротранспозона-ретровируса gypsy в геноме этих особей. Отсутствие статистически значимых различий у самцов исследуемых линий может быть связано с различиями в тканевом составе особей разного пола и различиями в регуляции экспрессии

Рис. 13. Количественный ОТ-ПЦР анализ транскрипции гена Grp в линиях дикого типа, SS и MS. А) Относительный уровень экспрессии у самцов и самок различных линий D. melanogaster. Canton S и D32 - линии дикого типа; SS и OregonR+Y+3 линии имеют две различных мутации в локусе flamenco-, линия MS изогенна линии SS, но имеет функциональную копию gypsy. Б) Относительная экспрессия Grp в различных тканях: кишечнике (gut), корпусе (carcass), семенниках (testis), яичниках (ovaries) мух линии SS. Относительная экспрессия гена Grp (В) и ретровируса gypsy (Г) в тканях мух линий SS и MS. Представлены средние значения уровня экспрессии (данные трех независимых биологических повторов), нормализованные на экспрессию референсного гена (альфа-тубулина). Показаны стандартные ошибки средних значений (SEM) [Нефедова и др., 2011; Nefedova et а., 2014].

Таким образом, присутствие функциональной, активно перемещающейся копии ретротранспозона-ретровируса gypsy в геноме D. melanogaster влияет на экспрессию гена Grp, повышая ее уровень.

гена Grp в разных тканях. Можно предположить, что доля органов и тканей, в которых Grp выполняет свою специфическую функцию и отвечает повышением экспрессии (например, жировое тело), у самок выше.

А Б

ВН-----------------------------

§§ maies Ш femalss

MS Oreg+y+3 D-32 Cantons SS

female female ovaries male male testis carcass gut carcass gut

Г gypsy

0,02--

Исследование влияния активации различных путей иммунного ответа на экспрессию генов Grp у имаго D.melanogaster

Далее проведено исследование уровня экспрессии гена Grp у самок линии дикого типа (D32, возраст 7-8 суток) в ответ на введение в организм грамположительных (Bacillus cereus) и грамотрицательных (E.coli) бактерий. Также проанализирована экспрессия эффекторных генов иммунного ответа: Metchnikowin (Mtk) (отвечает на широкий спектр патогенов), Defensin (Def) (главным образом, эффектор То11-сигнального пути), Turandot А (TotA) (эффектор Jak-STAT-сигнального пути и МАРК-сигнального пути) (рис. 14). Индукцию иммунного ответа проводили путем введения бактерий в организм иглой, смоченной в концентрированной культуре бактерий.

Defensin

Рис. 14. Относительный уровень экспрессии гена Grp и различных эффекторов иммунного ответа при его активации. 1 - интактные мухи, 2 - контроль (повреждение тканей сухой иглой), 3 - введение E.coli, 4 - введение В.cereus. Время индукции - 12 час.

Обнаружено, что экспрессия гена Grp повышается только в ответ на индукцию иммунного ответа В.cereus. При этом В.cereus вызывает активацию генов всех исследуемых антимикробных пептидов и гена TotA (для всех генов обнаружены статистически значимые отличия по сравнению с контролем). Таким образом, инфекция В.cereus активирует сигнальные пути Toll и Jak-STAT. Инфекция E.coli повышает уровень экспрессии гена Mtk, а гены-эффекторы сигнальных путей Toll и Jak-STAT {Def и TotA соответственно) не отличаются по уровню экспрессии от контрольных образцов.

д д Ct 1Ä

1.4 т

0.8

0,6

0.4

0.2

TurandotA

Далее проведен поиск в последовательности гена Grp регуляторных последовательностей для связывания с транскрипционным фактором STAT (STAT92E) сигнальной системы Jak/STAT [Rivas et al., 2008]. В результате обнаружено наличие у гена Grp регупяторной последовательности канонической TTCnnnGAA для связывания с транскрипционным фактором STAT92E на расстоянии 180-189 п.н. от начала ОРС, что подтверждает вероятность функционирование гена Grp в сигнальном пути Jak-STAT.

В совокупности, полученные нами данные и данные полногеномного анализа транскрипции при активации пути Jak-STAT [Dostert et al., 2005], свидетельствуют о том, что экспрессия гена Grp активируется в ответ на инфекцию B.cereus вместе с активацией Jak-STAT сигнального пути.

Анализ экспрессии гена Grp на уровне трансляции

Для анализа экспрессии гена Grp на уровне трансляции получена рекомбинантная конструкция на основе экспрессионного вектора рЕТ-30. Установлено, что рекомбинантный белок нерастворим и выделяется в составе телец включения из клеток Е. coli. Известно, что экспрессия в составе телец включения характерна для мембранных белков, каковым является по данным биоинформатического анализа продукт гена Grp. Для дальнейшего изучения было необходимо получить растворимый неденатурированный белок. Такой белок удалось выделить из большого объема культуры, индуцированной малыми концентрациями IPTG.

Для поиска белкового продукта гена Grp поставлена вестерн-гибридизация тотального экстракта белков, выделенных из взрослых особей D. melanogaster (линия D32) с сыворотками первичных антител к белку Grp. Анализировали серию из четырёх разведений экстракта (рис. 15).

А Б

kDa 20 5 1

ivud мкг мет .мм- с M

120 — kDa 120 —» ЯЙЙРШИЙ

85 — 85 —» шар

90 50 —» - ' f. ; BflBH

35 _¡B~ i Jj 35—» |||Ш|@

Рис. 15. Иммуноблотинг с белковым экстрактом из имаго D.melanogaster. А)

Разведения белка Grp. Стрелками показаны размеры белка, соответствующие полосам маркера (Fermentas). Б) Демонстрация мембранной локализации белка Grp. С -цитоплазматическая белковая фракция, М - мембранная фракция. Масса нанесенного белка -5 мкг на дорожку. Стрелками показаны размеры белка, соответствующие полосам маркера [Кузьмин, Нефедова и др., 2011; Nefedova et al., 2014].

В результате на иммуноблотах обнаружена единственная полоса, интенсивность которой уменьшается в серии разведений (рис. 15, А). Полосы соответствуют размеру белка -50 кДа. Поскольку для белка Grp предсказана мембранная локализация, для экспериментального подтверждения топологии белков проводили вестерн-блот гибридизацию с выделенными мембранной и цитоплазматической фракциями белковых экстрактов. Наносили по 5 мкг тотального белка (рис. 15, Б).

Показано, что белок Grp обнаруживается в мембранной фракции, сигнал от цитоплазматической фракции слабый. Результаты эксперимента позволяют с большой вероятностью предполагать наличие у белка Grp трансмембранного домена, предсказанного с помощью биоинформатического анализа. Это означает, что белок Grp (гомолог Gag) приобрел новую, не характерную для белка Gag, трансмембранную локализацию. Наличие трансмембранного домена характерно для разнообразных по функциональной классификации белковых молекул: ферментов, транспортеров, белков мембранных пор, сигнальных трансдукторов, рецепторов и структурных молекул. Учитывая функциональные особенности белков Gag, а также топологию белка Grp, можно предполагать, что белок Grp участвует в противовирусном ответе через прямое взаимодействие со своим гомологом Gag (рис. 16).

Обнаруженный нами случай молекулярной доместикации гена эррантивируса, приобретенного дрозофилами после отделения их от общего эволюционного древа насекомых (по разным расчетам 50-60 млн. лет назад), а также данные о молекулярной доместикации генов ретровирусов у позвоночных позволяют утверждать, что ДКП-ретротранспозоны - древнее семейство мобильных элементов; по-видимому, появление ДКП-ретротранспозонов у насекомых - результат модульной эволюции геномных элементов, а не следствие деградации ретровирусов в хозяйском геноме.

Рис. 16. Гипотетическая схема, иллюстрирующая противовирусную функцию гена Grp. При попадании ретровируса в клетку (1) он оказывается в составе эндосомы (2); в результате активируется экспрессия гена Grp, продукт которого локализуется в эндосомальной мембране и взаимодействует с белками Gag, предотвращая выход вируса из эндосомы (3) [Nefedova et al., 2014].

выводы

1. Разработана двуплазмидная модельная система в клетках E.coli, позволяющая фиксировать точные эксцизии длинного концевого повтора ДКП-ретротранспозонов gypsy из сайта мишени. Показано, что интеграза gypsy оказывается функциональной в клетках E.coli и осуществляет эксцизии длинного концевого повтора gypsy с полным восстановлением последовательности сайта-мишени. Полученные данные указывают на существование альтернативных способов перемещения ДКП-ретротранспозонов и, возможно, ретровирусов.

2. Исследована эндонуклеазная активность рекомбинантной интегразы gypsy in vitro. Показано, что интеграза связывается с мишенью и разрезает ДНК в области длинных концевых повторов как в полноразмерной форме, так и при отсутствии N- и С-концевых доменов с одинаковой эффективностью, что свидетельствует о ключевой роли центрального домена фермента в этих процессах. Показано, что интеграза gypsy in vitro проявляет специфическую активность в отношении длинных концевых повторов других ДКП-ретротранспозонов/эррантивирусов.

3. Идентифицирована молекулярная природа мутации в локусе flamenco, контролирующем транспозицию эррантивируса gypsy, в линиях продленной генетической нестабильности SS и MS. Показано, что в этой системе, мутантной по flamenco, не происходит полноценного процессинга первичного транскрипта-предшественника piPHK.

4. Проведено исследование транспозиционной активности ДКП-ретротранспозонов/эррантивирусов в системе линий продленной генетической нестабильности SS и MS. Обнаружено, что в ней, кроме самого gypsy, еще три родственных ему ретроэлемента - ZAM, Idefix и Tirant - способны изменять геномную локализацию. Полученные данные свидетельствуют об участии локуса_/7атепсо в генетическом контроле транспозиции более широкого круга ретротранспозонов/эррантивирусов, чем считалось ранее.

5. Показано, что эволюция ДКП-ретроэлементов происходит двунаправлено: как путем приобретения, так и потери отдельных генов или модулей генов. При этом ДКП-ретротранспозоны могут преобразовываться в ретровирусы путем приобретения за счет рекомбинации гена env, а ретровирусы, в свою очередь, могут терять ген env, преобразуясь в ДКП-ретротранспозоны. Выявлено, что исследованные ретротранспозоны/эррантивирусы начали формироваться у насекомых до эволюционного разделения отрядов Diptera и Lepidoptera.

6. Установлено, что группа ДКП-ретротранспозонов gypsy у Drosophila структурно-функционально неоднородна и разделяется на три подгруппы: (I) эррантивирусы, содержащие ОРСЗ (env), и их производные, утерявшие ген env, (II) ретротранспозоны с двумя ОРС; (III) ретротранспозоны с одной ОРС. ДКП-ретротранспозоны с двумя ОРС подгруппы I следует относить к роду Errantivirus, а не к роду Metavirus.

7. Обнаружено, что эррантивирусы, в отличие от ретровирусов позвоночных, проявляют специфичность в выборе нуклеотидной последовательности ДНК-мишени, согласно которой их можно разделить на три подгруппы: gypsy, ТАМ и Idefix. Специфичность коррелирует со структурными особенностями концевых последовательностей ДНК эррантивирусов и ДНК-мишеней. Таким образом, у одного из подсемейств ретровирусов выявлено уникальное свойство - способность к сайт-специфичной интеграции в геном.

8. В геномах видов рода Drosophila обнаружен новый доместицированный ген gag эррантивирусов - Grp (Gag related protein). На основании консервативности его структуры, выявленной с помощью биоинформатического анализа, можно предполагать, что он находится под действием стабилизирующего отбора. Тем не менее, показано, что в процессе доместикации гомолог Gag претерпел структурные изменения и приобрел трансмембранный домен.

9. Установлено, что ген Grp участвует в ответе на ретровирусную инфекцию gypsy у D.melanogaster. Таким образом, в процессе эволюции доместицированный ген gag эррантивирусов претерпел молекулярную экзаптацию, утеряв первоначальную функцию гена gag и став компонентом иммунного ответа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК РФ

1. Нефедова JI.H.. Любомирская Н.В., Ильин Ю.В., Ким А.И. Точные эксцизии длинных концевых повторов ретротранспозона МДГ4 (gypsy) Drosophila melanogaster, регистрируемые в клетках Escherichia coli, обусловлены его интегразной функцией // Генетика. 2006. 42(12):1654-1661.

2. Нефедова JI.H.. Романова Н.И., Ким А.И. Мутации в гене flamenco Drosophila melanogaster коррелируют с изменениями структуры гена DIP1 // Вестник Московского университета. Серия 16. Биология. 2006.4:53-58.

3. Нефедова JI.H.. Романова Н.И., Ким А.И. Особенности структурной организации гена DIP! в линиях Drosophila melanogaster, мутантных по гену flamenco // Генетика. 2007. 43(1):71-78.

4. Нефедова JI.H.. Ким А.И. Мобильный элемент HB в геноме Drosophila melanogaster: структурный и функциональный анализ // Генетика. 2007.43(5):620-632.

5. Нефедова JI.H.. Ким А.И. Эволюция от ретротранспозонов к ретровирусам: источник и происхождение гена env II Журнал общей биологии. 2007. 68(6):459-467.

6. Нефедова JI.H.. Ким А.И. Эволюция эррантивирусов Drosophila melanogaster. Стратегия 2: от ретровирусов к ретротранспозонам // Генетика. 2007. 43(10):1388-1395.

7. Нефедова JI.H.. Ким А. И. Молекулярная эволюция мобильных элементов группы gypsy, гомолог гена gag у Drosophila I/ Генетика. 2009. 45(1):30-37.

8. Нефедова JI.H.. Потапова М.В., Романова Н.И., Ким А.И. Анализ структуры и экспрессии гена DIP1 в линиях Drosophila melanogaster, мутантных по гену flamenco И Генетика. 2009.45(2):203-208.

9. Нефедова JI.H.. Ким А.И. Геномика вирусов: новый подход и старая модель // Природа. 2009. 8:22-25.

10. Нефедова Л.Н.. Ким А.И. Молекулярная филогения и систематика ретротранспозонов и ретровирусов дрозофилы // Молекулярная биология. 2009. 43(5):807-815.

П.Потапова М.В., Нефедова Л.Н.. Ким А.И. Анализ структуры и экспрессии кластера генов D.melanogaster DIP1, CG32500, CG32819 и CGI4476, входящих в область гена flamenco // Генетика. 2009.45(10):1324-1331.

12. Нефедова Л.Н.. Дыйканов Д.Т., Мартиросян И.А., Ким А.И. Ретротранспозоны Idefix и ZAM способны к транспозиции в линии MS Drosophila melanogaster, мутантной по гену flamenco // Вестник Московского университета. Серия 16: Биология. 2010. 2:3-8.

13. Nefedova L.N., Mannanova М.М., Kim A.I. Integration specificity of LTR-retrotransposons and retroviruses in the Drosophila melanogaster genome // Virus Genes. 2011. 42(2):297-306.

14. Нефедова Л.Н.. Кузьмин И.В., Бурмистрова Д.А., Резазадех С., Ким А.И. Анализ транскрипции гена Grp, геномного гомолога гена gag ретротранспозона gypsy, у Drosophila melanogaster // Генетика. 2011. 47(8):1032-1037.

15. Кузьмин И.В., Шнырева A.A., Нефедова Л.Н.. Ким А.И. Анализ экпспрессии гена Grp, геномного гомолога гена gag ретротранспозона gypsy Drosophila melanogaster, на уровне трансляции // Генетика. 2011. 47(9):1275-1278.

16. Маннанова М.М., Нефедова Л.Н.. Ким А.И. Исследование активности интегразы ретротранспозона gypsy Drosophila melanogaster in vitro // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2011.15(2):261-270.

17. Нефедова Л.Н.. Маннанова М.М., Гусев Н.Б., Ким А.И. Структурно-функциональный анализ интегразы ретротранспозона gypsy Drosophila melanogaster II Вавиловский журнал генетики и селекции. 2011. 15(2):277-282.

18. Урусов Ф.А., Нефедова Л.Н.. Ким А.И. Анализ ткане- и стадиеспецифичности транскрипции ретротранспозонов группы gypsy у Drosophila melanogaster //Вавиловский журнал генетики и селекции. 2011. 15(2):283-288.

19. Нефедова Л.Н.. Урусов Ф.А., Романова Н.И., Ким А.И. Исследование транскрипционной и транспозиционной активности ретротранспозона Tirant в линиях Drosophila melanogaster SS, мутантных по гену flamenco II Генетика. 2012. 48(11):1271-1279.

20. Урусов Ф.А., Нефедова Л.Н.. Лавренов А.Р., Романова Н.И., Ким А.И. Генетический и молекулярный анализ комплементации локусов flamenco и piwi у Drosophila II Вавиловский журнал генетики и селекции. 2013. 17(3):381-389.

21. Nefedova L.. Kuzmin I., Makhnovskii P., Kim A. Domesticated retroviral gag gene in Drosophila: new functions for an old gene // Virology. 2014. 450-451:196-204.

22. Лавренов A.P., Нефедова Л.Н.. Романова Н.И., Ким А.И.. Экспрессия генов семейства hpl и их возможная роль в формировании фенотипа flamenco у D. melanogaster II Биохимия. 2014. 79(11):1554- 1560.

Напечатано с готового оригинал-макета

Подписано в печать 28.11.2014 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ 278.

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 527 к. Тел. 8(495)939-3890/91. Тел./факс 8(495)939-3891.

Информация о работе

Нефедова, Лидия Николаевна
доктора биологических наук
Москва, 2014
ВАК 03.02.07

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Генетический контроль транспозиции и эволюция эррантивирусов у Drosophila ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический контроль транспозиции и эволюция эррантивирусов у Drosophila"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетический контроль транспозиции и эволюция эррантивирусов у Drosophila
ВАК РФ 03.02.07, Генетика