Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм CGG-области гена FMR1 в семьях с высоким риском синдрома ломкой Х хромосомы (Мартина-Белла)

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм CGG-области гена FMR1 в семьях с высоким риском синдрома ломкой Х хромосомы (Мартина-Белла)"

Національна Академія наук України

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

Малярчук Світлана Григорівна

УДК 575.11 577.21 577.213.3

ПОЛІМОРФІЗМ ССЄ-ОБЛАСТІ ГЕНА РМШ В СІМ’ЯХ З ВИСОКИМ РИЗИКОМ СИНДРОМА ЛАМКОЇ X ХРОМОСОМИ (МАРТІНА-БЕЛА)

03.00.26 — молекулярна генетика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ

Наукові керівники: кандидат біологічних наук, ст.н.с.,

Лівшиць Людмила Аврамівна,

Інститут молекулярної біологи і генетики НАН України, м. Київ ст.н.с. відділу генетики людини

кандидат біологічних наук, ст.н.с.,

Лукаш Любов Леонідівна -

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ, зав. відділом генетики людини

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, ярофесор,

член-кореспондент НАН і АМН України

Кордюм Віталій Арнольдович

Інститут молекулярної біології і

генетики НАН України, м. Київ,

зав. відділом регуляторних механізмів клітини

доктор медичних наук, ст.н.с.,

Пілінська Марія Андріївна Науковий центр радіаційної медицини АМН України, м.Київ, зав.лабораторією цитогенетики

Провідна установа: Український науковий центр медичної генетики

МОЗ і НАН України, м.Київ

Захист відбудеться?^К¿іліМС 1998 р. о № годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.01.86.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою:

252143, м. Київ-143, вул. академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, 252143, м. Київ-143, вул. академіка Заболотного, 150.

Автореферат розісланий ^ 1998 р.

Вчений секретар /)

спеціалізованої вченої ради ./ ІСср

кандидат біологічних наук / С.І.Черних

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Невід'ємною складовою геному людини є повторювані послідовності ДНК. Особливий інтерес для досліджень представляють мікросателітні локуси геному людини - STR (short tandem repeat), які останнім часом інтенсивно досліджуються. Вони складаються з простих повторювальних послідовностей ДНК і їх розмір варіює від 1 до 6 пар нуклеотидів. Характерною особливістю всіх мікросателітних послідовностей є їх поліморфізм, тобто існування великого числа алелей, що відрізняються між собою кількістю копій тандемних повторів і, відповідно, своєю довжиною.

Новим етапом у вивченні мікросателітів стало відкриття їх ролі в мутагенезі людини. Одним з найяскравіших подій в молекулярній генетиці за останні роки стало відкриття принципово нового типу мутацій - експансії (збільшення) числа копій внутрішньогенних тринуклеотидних повторів. Такий тип мутацій, що призводить до спадкових захворювань людини, було названо динамічним. Експансія CAG-повторів призводить до деяких неврологічних захворювань, таких як хорея Гентіпгтона, хвороба Кенеді, спиноцеребральна атаксія, міотонічна дистрофія. Експансію CGG-повторів пов’язують з групою ламких фолат-чутливих сайтів на хромосомі X (FRAXA, FRAXE).

Вперше нестабільність STR-локусів, пов’язана з динамічними мутаціями, була показана для синдрому ламкої X хромосоми (Мартіна-Белла). Цей синдром є найрозповсгодженішим після синдрому Дауна спадковою формою розумової відсталості. В 1991 році було відкрито ген цього захворювання - FMR1, що містить в 5’-області тандемну послідовність CGG-триплетів. В багатьох лабораторіях світу проводяться інтенсивні дослідження нестабільності CGG-області FMR1 гена. Такі дослідження спрямовані на вивчення природи динамічних мутацій, молекулярних основ патогенезу та клінічної гетерогенності синдрому Мартіна-Бела. На основі цих результатів розробляються методи профілактики цього захворювання, основними заходами яких є генетичний скринінг носіїв мутації, ефективна молекулярно-генетична діагностика,

включаючи пренатальну, що є необхідним заходом для запобігання народження хворих дітей.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дослідження здійснювалися в рамках тематичних планів ІМБіГ НАНУ N2.2.4.27 “Молекулярно-генетичний аналіз мутацій в генах, що призводять до розвитку тяжких спадкових захворювань людини в Україні” (1991-1995); N1.01.01/055-92 “Використання молекулярно-генетичного аналізу для діагностики та розробки засобів профілактики найбільш поширених спадкових захворювань серед населення різних регіонів України” (1992-1995) і N2.28.2.2 “Популяційно-генетичні дослідження мутацій в групах високого ризику тяжких спадкових патологій в Україні” (1996-2000).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи був аналіз нестабільної СвО-області гена РМКД у хворих з розумовою відсталістю із сімей з високим ризиком синдрому Мартіна-Белла, а також вивчення алельного поліморфізму СОО-повторів серед здорових жінок-донорів.

У процесі виконання роботи вирішувалися такі задачі:

1. Отримання банку ДНК з лейкоцитів периферійної крові хворих з клінічними ознаками синдрому Мартіна-Бела та членів їх родин, а також здорових жінок-донорів.

2. Вивчення поліморфізму СОО-повторів в гені РМКІ серед здорових жінок-донорів.

3. Аналіз мутацій в гені БМЮ в сім’ях з високим ризиком синдрому Мартіна-Бела.

4. Вивчення метилювання промоторної області гена в родинах з динамічними мутаціями в СОО-області та тяжкою формою розумової відсталості у хворих.

5. Розробка методу для скринінгу динамічних мутацій в гені РМШ в ірупах високого ризику синдрому Мартіна-Бела.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні проведено аналіз поліморфізму нестабільної СОО-області РМИІ гена на 124 зразках ДНК хворих та членів їх сімей з високим ризиком синдрому Мартіна-Бела.

з

Досліджено алельний поліморфізм в мікросателітній області гена FMR1 серед здорових жінок-донорів із України. Показано, що динамічні мутаційні процеси в CGG-області гена можуть призводити як до спадкової, так і соматичної нестабільності в сім’ях високого ризику синдрома Мартіна-Бела. Отримано дані про асоціацію такої нестабільності та метилювання промоторної області гена FMR1 з розвитком різних форм розумової відсталості у хворих із такою спадковою патологією. Досліджено характер мутацій в гені FMR1, що можуть призводити до розвитку різних форм розумової відсталості у хворих. У роботі проведено аналіз молекулярних механізмів, що можуть призводити до нестабільності мікросателітної CGG-ділянки гена FMR1, природи мутацій в цьому гені та асоціації цих мутацій з клінічним фенотипом.

Практичне значення одержаних результатів. Створено банк ДНК, який налічує 108 зразків лейкоцитарної ДНК хворих та членів їх родин з високим ризиком синдрому ламкої X хромосоми (Мартіна-Бела) та 50 зразків лейкоцитарної ДНК здорових жінок-донорів. Розроблено модифікований варіант методу полімеразної ланцюгової реакції для скринінгу експансії CGG-повторів в гені FMR1 серед пацієнтів з розумовою відсталістю, що надає змогу швидко та якісно проводити попередній аналіз на наявність мутацій у цій ділянці геному. Результати роботи мають важливе значення для подальшого вивчення спектру мутацій в гені FMR1 та їх ролі у розвитку різних форм розумової відсталості, а також для розробки ефективної стратегії профілактики носійства мутантної X хромосоми та пренатальної діагностики у родинах з високим ризиком синдрому Мартіна-Бела.

Особистий внесок здобувана. Основні результати, викладені в дисертації, одержані автором самостійно.

Апробація результатів дисертації. Матеріачи дисертації було оприлюднено на II з’їзді медичних генетиків України (Львів, 1995), на 45-ій щорічній конференції Американської Спілки генетиків людини (Мінеаполіс, США, 1995), 8-му з’їзді по генетиці людини (Гетінген, Німеччина, 1996), 1-ій Європейській конференції по цитогенетиці (Афіни, Греція, 1997).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 3 друковані праці у наукових журналах та 5 тез доповідей.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, отриманих результатів, їх обговорення, висновків та списку літератури -147 джерел. Роботу викладено на 135 сторінках машинописного тексту, що містить 3 таблиці та 13 рисунків.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Зразки периферійної крові зі стандартним консервантом донорської крові (глюгіциром) хворих з клінічними ознаками синдрома Мартіна-Бела та членів їх родин було отримано з установ, де вони проходили клінічне та патопсихологічне обстеження: Київського інституту педіатрії, акушерства та гінекології АМН України, Київського та Сімферопольського міжобласних медико-гснетичних центрів, Українського Центру медичної генетики АМН та НАН України. Члени сім’ї К. проходили клінічне та медико-генетичне консультування у відділі Медичної Генетики Університету Південної Алабами (США). Зразки донорської крові для аналізу регіональної популяції України було отримано на станціях переливання крові.

ДШС-зонди РХ6 та рР2 (Xq.27.3) і ОХЕ.20 (Xq.28) були люб’язно надані доктору Л.А.Лівіїшць проф. Д.Нелсоном (США) та проф.К.Девіс (Англія).

Олігонуклеотидні праймери було синтезовано в Інституті біоорганічної хімії РАН (Москва, Росія).

Виділення та очищення препаратів лейкоцитарної ДНК проводили за методом H.Wehnert et al [1988]. Для аналізу популяційного поліморфізму CGG-повторів та мутацій в гені FMR1 використовували метод блот-гібридизації та проводили ампліфікацію ДНК in vitro за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) за методами Brown et al.[1993] та Cao et al. [1994] з власними модифікаціями і використанням модифікованого дезоксінуклеотиду 7-deaza-dGTP. При проведенні ЦЛР за методом Brown et al.[1993] продукти ампліфікації розділяли в 6%-му денатуруючому поліакріаламідному гелі і переносили на нейлоновий фільтр. Детекцію продуктів ампліфікації проводили за допомогою

методу блот-гібридизації з використанням синтетичного олігонуклеотиду 5’-(CGG)5-3’, міченого лужною фосфатазою. Візуалізацію продуктів ПЛР при використанні методу Cao et al. [1994] проводили за допомогою електрофорезу в 2%-му агарозному гелі з подальшим фарбуванням бромистим етідієм.

При проведенні гібридизації по Саузерну з використанням ДНК-зондів РХ6 та рР2 (ген FMR1) зразки ДНК гідролізували ендонуклеазами рестрикції PstI (зонд РХ6), EcoRI і EcoRI/EagI (зонд рР2) в стандартних умовах [Т.Маніатіс та

ііі.,1985]. Електрофоретичне розділення зразків ДНК проводили в 1%-ій агарозі з наступним переносом ДНК на нейлонову мембрану за загальноприйнятими методами [Т.Маніатіс та ін.,1985]. Гібридизацію з ос32Р-міченими ДНК-зондами проводили в буфері з 50%-им вмістом формаміду при 42 °С протягом 16 годин. Для аналізу нестабільної області в районі Xq.28 зразки ДНК гідролізували з ендонуклеазою HindIII і гібридизували з радіоактивноміченим ДНК-зондом ОХЕ.20.

Статистичну обробку здійснювали, використовуючи критерій Ст’юдента та аналізу % 2

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Поліморфізм туинуклеотидних CGG-повтопів гена FMR1 уздоуовік жінок-донорів з України

ДНК-аналіз поліморфізму тринуклеотидних CGG-повторів гена FMR1

проводили на 92 X хромосомах здорових

жінок з України з використанням метода

ПЛР з наступною блот-гібридизацією з

синтетичним олігонуклеотидом 5’-(CGG)j-

3’. Розміри продуктів ампліфікації in vitro

варіювали від 131 до 167 пн (рис.1). В

результаті дослідження нами було Рис.1. Аналіз поліморфізму CGG-

повторів в гені FMR1 в груді виявлено 13 поліморфних варіантів CGG-здорових жінок. повторів, кількість яких варіювала від 23

152 пн 149 пн 146 пн 140 пн 134 пн 132 пн

до 35 копій. Серед проаналізованої кількості хромосом нами не було виявлено алеля з числом повторів, що відповідають премутації (50-230 CGG-копій), що узгоджується з даними популяційних досліджень, отриманими іншими авторами [ Jacobs P. et al.,1993, Murray A. et аі.,1996].

Найрозповсюдженішим виявився варіант Н, що відповідає 30-ти копіям CGG-триплетів (52%), тоді як варіанти F,I,K (28,32 та 33 копії відповідно) зустрічалися рідше (рис.2), що узгоджується з даними, отриманими для популяцій Європи [W.Brown et al, 1993].

Кількість ССО-повторів

Рис.2. Розподіл алельнвх варіантів СвС-повторів гена РМШ серед здорових жінок У країни

Важливим параметром при вивченні генетичного складу популяції є оцінка гетерозиготності. Розрахована нами фактична гетерозиготність склала 54,4%, при цьому не було виявлено вірогідних відхилень між виявленим рівнем гетерозиготності та теоретично розрахованим у відповідності з рівновагою Харді-Вайнберга (1(1= 1,7; Р>0,05).

Молекулярно-генетичний аналіз області ССО-повторів в гені РМШ в сім 'ях з високим ризиком синдрому ламкоїXхромосоми (Маутіна-Бепа) з України Нами проведено аналіз варіювання СОО-повторів у 53 пробандів з характерними клінічними ознаками синдрому Мартіна-Бела, а також членів їх сімей. При цьому використовувався метод блот-гібридизації геномної ДНК, гідролізованої ендонуклеазою Рзїі, з міченим а-32Р ДНК-зондом РХ6. Розмір гібридизаційних фрагментів у 9 пробандів коливався від 1,8 до 9 тпн, що відповідало кількості СОй-копій від 250 до ~ 2500, відповідно. Цей факт свідчив

про наявність експансії таких тринуклеогидів в гені FMR1 і за розміром відповідав повній мутації. При аналізі 4 зразків ДІЖ пробандів нами було виявлено не один, а декілька гібридизаційних фрагментів, причому в одного з пацієнтів їх розмір дорівнював 1,1, 6 та 9 тпн (рис.З).

Це свідчить про те, що в кровотоці даних індивідуумів циркулюють лімфоцити, X хромосоми яких містять різну кількість повторів, що, найвірогідніше, викликано динамічними мутаційними процесами у даному локусі і, які призводять до такого соматичного мозаїцизму.

У 44 пробандів були виявлені гібридизаційні фрагменти, довжина яких не перевищувала 1 тпн, що відповідало кількості CGG-триплетів в межах норми.

В сім’ях, де у пробандів було встановлено наявність експансії в гені FMR1, нами був проведений аналіз CGG-

області гена серед матерів хворих. Дослідження показало,

_ . _ . „ Рис.З. Аналіз CGG-

іцо 7 матерів пробандів мали один нормальний алель, повторів в гені

другий - з незначною експансією триплетів (від 1,1 до 1,6 1:

1- пробанд;

тпн), так названу премутацію з числом повторів від 90 до 2,3 - здорові донори. 180 копій. Таким чином, в процесі успадкування у 7 пробандів відбулося збільшення числа триплетів від премутації до повної мутації.

Така ж закономірність спостерігалась при аналізі CGG-області гена у трьох сибсів жіночої статі із нерідних сімей, де у пробанда була виявлена експансія. Нами було встановлено, що всі сестри мали один алель з нормальною кількістю повторів та алель з премутацією і (або) повною мутацією, причому розмір мутантного алеля перевищував материнський.

Відомо, що ризик матері-носія премутації мати хворого хлопчика з повною мутацією залежить від кількості CGG-копій [Fisch G. et al., 1995]. Отримані нами результати узгоджуються з даними англійських вчених про те, що материнські премутації з числом повторів більше 100 копій в 100% випадків переходять в повну мутацію у першому поколінні [Murray A. et al., 1997]. Таким чином, отримані нами дані по вивченню нестабільності CGG-повторів в FMR1 гені

1 2 З

s

I

«Iі

m

1 2 3 4 5

З тпн

-2 TDH

* 1,8 тпн 1,2 тпн

1 ТПН

Рнс.4. Блот-гібридизація з зондом PX6 в сім’ї Б: 1> бабуся пробанда; 2- мати пробанда; З- пробанд; 4-сесгра пробанда; 5- здоровий донор.

свідчать про те, що розмір премутацгі материнського алеля є головним чинником ризику при наслідуванні.

Цікавими виявилися результати, отримані при молекулярному аналізі сім’ї Б.(рис.4). Нами було встановлено, що бабуся даного пацієнта була носієм невеликого розміру премутації, яку успадкувала її донька, але вже з більшою кількістю CGG-копій. Пробанд із цієї сім’ї був соматичним мозаїком за кількостю повторів, так як і його мати, лімфоцити якої містили алелі і з премутацією, і з повною мутацією нарівні з алелем з нормальною кількістю повторів. Причому, при успадкуванні відбулася стрімка експансія CGG-повторів у пробанда, а також у його сестри, у якої теж спостерігалася соматична різноманітність у клітинах крові. Таким чином, у даній сім’ї спостерігається високий рівень мейотичної нестабільності мутантних алелей, що в свою чергу може спровоковувати таку соматичну різноманітність клітин крові.

В низці робіт деяких авторів висловлюється припущення про асоціацію метилювання CpG-острівця в промоторній області гена FMR1 з повною мутацією і розвитком тяжкої форми розумової відсталості [ McConkie-Rosell et al., 1993;de Vries et al., 1996]. Оскільки у пробандів з сімей Б. і П. була встановлена найтяжча форма розумової відсталості, а у їх сестер спостерігались психічні розлади доцільним виявилося вивчення метилювання CpG-осфівку гена FMR1 у цих пацієнтів та членів їх сімей. Для цього проводили гідроліз зразків ДНК за допомогою ендонуклеаз рестрикції EcoRI та чутливої до метилювання EagI, що розпізнає неметильований сайт пізнавання, з подальшою блот-гібридизацією з а32Р-міченим зондом рР2. Результати аналізу по вивченню метилювання промоторної області даного гена в цих родинах представлені на рис.5. У матері пробанда з сім’ї Б. було виявлено три гібридизаційні фрагменти різної довжини:

2,8 тпн, що відповідав продукту гідролізу двома ендонуклеазами з нормальною

кількістю повторів, 5,2 тпн, наявність якого могла свідчити про відсутність сайта

пізнавання для Еа§ 1 (інактивована X хромосома у жінок) та 5,7 тпн, що

відповідав алето з повного мутацією і метильований в СрО-осірівці гена (рис.5).

При аналізі зразка ДНК матері пробанда П. було встановлено наявність алеля з

премутацією і відсутністю метилювання в промоторній області гена (3,1 тпн) та

нормального алеля (5,2 тпн) (рис.5). В обох пробандів з даних сімей нами були

виявлені гібридизаційні фрагменти довжиною 5,8 тпн, що свідчило про повне

метилювання Срв-острівка і експансію Свв-повторів до повної мутації гена

РМЛІ. Два сибси жіночої статі із цих сімей мали нормальної довжини фрагменти

2,8 та 5,2 тпн, а також фрагменти довжиною 5,8 тпн, що відповідали повній

мутації з метильованим Срй-острівком гена (рис.5).

Невеликого розміру премутація була

виявлена у бабусі пробанда з сім’ї Б.,

при цьому метилювання в

промоторній області гена не

спостерігалось. Таким чином,

отримані нами дані підтримують

гіпотезу про асоціацію метилювання

Срв-острівку гена РМІІІ X хромосом

з експансією СОв-повторів і

розвитком тяжкої форми розумової Рис.5. Блот-гібридизація з зондом рР2 в

сім’ях Б і П: сім’я Б : 1- бабуся пробанда; відсталості. При цьому отримані

2- маги пробанда; З- пробанд; 4 - сибс.

сім’я П: 5- мати пробанда; б- пробанд; нами дані, а також дані низки авторів,

7 - сибс. .

свідчать про те, що, можливо, в

процесі успадкування X хромосоми з премутацією відбувається стрімка

експансія цих тринуклеотидів, яка є наслідком, або супроводжуєпься

метилюванням Срв-острівка гена РМШ в даній X хромосомі [МІ£еоп В., еі

аі.,1992].

В 15 сім’ях з легкою формою розумової відсталості, в яких не було виявлено мутацій в гені РМКЛ, нами був проведено додатковий молекулярний аналіз на наявність динамічних мутацій в області Xq.28 з використанням блот-

5,8 тпн

63 Ы У'-

• " . ' ? 5,2 тпн

: 'і .А '-Л'?. І-,*' .

2,8 тпн

1 2 3 4 5 6 7

гібридизації з ДНК-зондом ОХЕ.20 [Knight S. et al., 1994]. У всіх проаналізованих зразках ДНК виявлено гібридизаційний фрагмент довжиною 5,2 тпн, що відповідає нормальній кількості CCG-повторів в даній області.

Випадок спонтанноїмутаиії у тюобанда з вираженим фенотипом синдрома

Мартіна-Бела

Молекулярно-генетичний , аналіз синдрому

Мартіна-Бела був проведений у матері та пробанда

з сім’ї В. Пробанд мав всі характерні ознаки даного

синдрому: тяжка форма розумової відсталості

(IQ=58), великі вуха, виступаюча вперед щелепа,

слабкість у м’язах, гіперактивна поведінка. Нами

був проведений аналіз CGG-області гена FMR1 у

матері і пробанда за допомогою методів блот-

гібридизації та ПЛР. В результаті проведеної

ампліфікації області CGG-повторів in vitro з

використанням ПЛР в матеріалі пробанда не було

виявлено продукту ампліфікації, що могло

вказувати або на те, що розмір даних триплетів

надто великий (>400копій) для проведення реакції р,ІС-6‘АпалІЇ CGG- області

гена FMR1 методом ШІР в

ампліфікації, або про наявність делеції в цьому сім’ї В: 13- здорові допори,

2-мати пробанда; 4-пробанд регіоні (рис.6). (відсутність фрагменту)

Подальший ДНК-

аналіз з використанням блот-гібридизації з зондом РХ6 також показав відсутність гібридизаційного сигналу, що могло свідчити про делецію в даному регіоні гена (рис.7). Проведена контрольна гібридизація з зондом р 114.2 показала наявність фрагменту довжиною 1 тпн у зразку ДНК пробанда, що свідчила про відсутність артефакту при проведенні блот-гібридизації з зондом РХ6. Для

%

"г І 1,3 тпн

-".'.'■"і ту- г- і.і'Хї -- • 1 тпн

і 2 3 4

Рнс.7. Блот-гібрндизація зондом РХ6 в сім’ї В: 1,4-

здорові допорн, 2-мати пробанда; 3- пробанд (відсутність фрагменту)

1 Ш [s' ' 340ПН

6 -

|i"?f ?аШ * * і .

12 3 4

перевірки припущення про делецію в CGG- регіоні гена була проведена гібридизація з зондом рР2. Результати аналізу показали наявність гібридизаційного фрагменту довжиною 5,2 тпн. Враховуючи всі отримані результати, можна зробити припущення, що дана делеція локалізована в Pstl-фрагменті гена, який включає CGG-область. ДНК-аналіз матері пробанда за допомогою чутливого методу ПЛР показав, що в кровотоці даної жінки циркулюють лімфоцити, X хромосоми яких мають різну кількість CGG-повторів, що варіює від премутації до повної мутації (рис.6). Наявність тяжкої форми розумової відсталості у пробанда свідчить про те, що дана делеція, яка виникла в процесі успадкування мутантного материнського алеля, скоріше за все, призводить до порушення нормального синтезу білка гену FMR1. На сьогодні описано кілька випадків виникнення невеликого розміру делецій, локалізованих в CGG-регіоні 5’-нетранслюючої області гена, причому в усіх цих пацієнтів спостерігали явише соматичного мозаїцизму в лімфоцитах крові, коли їх X хромосоми містили або повну мутацію і делецію fde Graaff et al.,1996; Mila et al., 1996], або - нормальний алель та делецію [Hirst et аі.,1995]. На відміну від цих даних, лімфоцити пацієнта В. не проявляли соматичної різноманітності ( хоча не виключена можливість соматичного мозаїцизму в інших тканинах), тому, можна припустити, що делеція в даному регіоні мала місце в оогенезі або на самих ранніх стадіях ембріогенезу. Найімовірнішим молекулярним механізмом утворення делеції, на наш погляд, являється процес “вирізання” протягом реплікації “петлі” з великою кількістю CGG-копій, що утворилася в результаті спарення двох, фланкуючих її інвертованих або коротких (2-6 пн) повторів, запропонований Thacker J. [1992]. Описаний нами випадок спонтанної делеції є ще одним підтвердженням того, що високоваріабельна область CGG-повторів гена FMR1 являється гарячою точкою динамічних мутацій різної природи.

Вивчення експансії CGG-повтопів в гені FMR1 в трьох поколіннях сім ’ї К. з високим ризиком синдрома Мартіна-Бела Найважливішим і найскладнішим питанням на сьогоднішній день є проблема нестабільності CGG-повторів в гені FMR1 в процесі успадкування, що

може призводити, або до значної експансії даних триплетів, наслідком якої являється тяжка форма розумової відсталості, або до невеликого збільшення, чи, навіть, редукції СОй-копій. Найкращим шляхом вивчення успадкування динамічних мутацій є їх дослідження у кількох поколіннях однієї великої родини. Таке детальне молекулярно-генетичне дослідження СОв-нестабільної області в РМШ гені було проведено нами у трьох поколіннях сім’ї К.(рис.8).

©—тУИ2

7 8 9 10 І

4* 12 13

14 15 16

В:

:т

■Ф

’ІК-

¥г

«г:

шш

2,5тпн

2тпн

1,5тпн

Ітпн

,1, ,ц "и л 'її н _гї ^и ,,ш;т ьтп чи. іп ш ш "ш

1 2 3 5 6 7 8 9 К 1 З 4”* "12 ' із" 14 15 16

Рис. 8. Вивчення експансії ССС-новторів в гені ПУШІ в сім’ї К:

А - родовії] сім’ї К; В - Блот-гібріщизація зондом РХ6.

Пробанд з цієї сім’ї (III-12) мав всі характерні ознаки синдрому Мартіна-Бела. При проведенні подальшого клініко-генеалогічного аналізу серед 15 членів даної родини були виявлені ще 5 хворих з клінічними ознаками синдрому. Для дослідження нестабільної СОв-області гена РМЯІ нами був проведений молекулярний аналіз з використанням методів блот-гібридизації та ПЛР у 16 членів сім’ї К. При проведенні ПЛР-аналізу нами було встановлено наявність у бабусі пробанда (1-1) премутацій з різною кількістю СОй-повторів (прибл. 90 і

114 копій) на обох X хромосомах . Таким чином, всі її восьмеро дітей отримали від матері одну з мутантних X хромосом, причому в процесі успадкування відбулося збільшення кількості СОО-копій. Цікавим виявився той факт, що при передачі своїм дітям X хромосоми з премутацією спостерігалося неоднакове збільшення даних триплетів. Якщо у двох дочок (ІІ-З і ІІ-8) було виявлено незначне збільшення СОО-копій на материнській X хромосомі (в межах премутації), то у інших дочок (И-6 і И-9) спостерігалася стрімка експансія триплетів на рівні повної мутації (рис.8). Неоднакове успадкування материнської премутації спостерігалося і в синів. Майже однакового розміру гібридизаційні фрагменти, що відповідали повній мутації, були виявлені у чоловіків ІІ-5 і ІІ-7 з тяжкою формою розумової відсталості, тоді як у третього сина ІІ-2, у якого спостерігалась неповна пенетрантність характерних ознак синдрому, був виявлений дифузний гібридизаційний сигнал в діапазоні від премутації до повної мутації (рис.8). На основі одержаних результатів, можна припустити, що в нього в клітинах з X хромосомами з премутацією все таки відбувається, хоча і на недостатньому рівні, неповний синтез білка БМКР, необхідний для підтримування такого інтелектуального рівня. Цікавими виявилися результати аналізу трьох дочок цього індивідуума ІІ-2. Всі вони успадкували батьківський мутантний алель, причому в двох із них (рис.8) відбулася редукція кількості ССКЗ-копій, тоді як у третьої спостерігалося їх незначне збільшення, що не виходило за межі премутації. Ці дані підтверджують те, що при успадкуванні мутантного алеля від чоловіків може відбуватися або незначне збільшення розміру премутації, або, навіть, редукція. На відміну від цього протягом успадкування X хромосоми з динамічною мутацією від жінок-носительок спостерігається стрімка експансія СвО-повторів до рівня повної мутації. Доказом цього є наявність X хромосом з повпою мутацією у пробанда ІІІ-12, та у трьох дітей (111-14,111-15,111-16) жінки И-9 (рис.8). Причому, в результаті аналізу за методом блот-гібридизації з використанням зонду РХ6 з’ясувалося, що всі вони (ІІІ-14, ІІІ-15 і ІІІ-16) були соматичними мозаїками за кількістю СОО-повторів, про що свідчила наявність виявлених у них гібридизаційних фрагментів різної довжини. Таким чином, сім’я К. є типовим

прикладом сімейної форми синдрому Мартіна-Бела. Незвичайним фактом, досі ще не описаним у світовій літературі, е те, що жінка-носій 1-1 мала на обох X хромосомах алелі з премутадією. Саме тому, всі її діти були або хворими, або облігатними носіями X хромосоми з динамічною мутацією в гені FMR1. Можна припустити, що дана жінка отримала один алель від батька-трансмітера, інший -від матері-носія. Але, слід зазначити, що така подія є дуже рідкою. Тому, існує, також, ймовірність того, що одна з її премутацій виникла de novo внаслідок нерівного кросинговеру.

Молекулярно-генетичний скринінг експансії CGG-повторів в гені FMR1 серед

паиієнтів з розумовою відсталістю з використанням ПЛР

В зв’язку з високою частотою синдрому Мартіна-Бела гостро виникає

проблема ефективного та недорогого скринінгу індивідуумів з розумовою

відсталістю на наявність експансії CGG-повторів в гені FMR1. З цією метою

нами було модифіковано меггод Cao et al., [1994], що дозволило проводити

ампліфікацію in vitro CGG-послідовності гена FMR1 за допомогою ПЛР при

використанні модифікованого дезоксінуклеотиду 7-deaza-dGTP. Розмір

отриманих нами продуктів ампліфікації коливався від 491 до 635 пн. Даний

метод дозволяє визначати FMR1 алелі нормальної довжини і з невеликою

премутацією. В 12 із 25 проаналізованих нами зразків ДНК хлопчиків з

розумовою відсталістю було отримано продукти ПЛР (рис.9). Цей факт свідчив

про те, що їх алелі мали

кількість повторів, що

відповідали нормі. Можна

припустити, що в цих пацієнтів

розумова відсталість пов’язана з

іншими мутаціями в гені FMR1

[Wang Y., et al.,1997], або їх

М

клінічний фенотип зумовлений Рис. 9. ДНК-аналіз CGG-області гена FMR1

методом ПЛР. М - маркер молекулярної ваги -патогенезом іншої, може, навіть, pBR322/MspI.

неспадкової природи, чи - з наявністю мутацій в інших локусах геному [Gedeon

Й-.-і’í* ÿgËJà

622 пн 527пн

A. et аі.,1994]. У 13 пацієнтів спостерігалася відсутність продуктів ампліфікації, що могло вказувати або на експансію CGG-повторів, при якій неможливе проведення успішної реакції ампліфікації in vitro, або - про наявність делеції в ньому регіоні. 7 зразків ДНК пробандів, у яких не було виявлено продуктів ампліфікації, в подальшому аналізували методом блот-гібридизації. У цих пробандів було встановлено наявність алелей з повною мутацією. Таким чином, відсутність продуктів ампліфікації при аналізі не є артефактом, тому цей метод є ефективним для проведення попереднього скринінгу пацієнтів з розумовою відсталістю, а також може бути використаний для проведення пренатальної діагностики в сім’ях, де встановлено наявність CGG-експансії у пробанда.

ВИСНОВКИ

1. Досліджено поліморфізм CGG-області гена FMR1 серед здорових жінок із України. Кількість CGG-повторів варіювала від 23 до 35 копій.

2. В результаті аналізу CGG-поліморфізму в гені FMR1 в сім’ях хворих з клінічними ознаками синдрома Мартіна-Бела в 19% випадків було виявлено наявність експансії даних тринуклеотидів, що вказує на клінічну гетерогенність цього синдрому.

3. В сім’ях з синдромом Мартіна-Бела показано нестабільність CGG-області гена FMR1, яка проявлялась як експансія при успадкуванні X хромосоми з премутацією, так і у вигляді соматичного мозаїцизму лімфоцитів периферійної крові.

4. Показано, що нестабільність в цій області може бути вираженою не тільки як експансія CGG-повторів, але й стати причиною спонтанних делеційних процесів, що відбуваються в даному регіоні.

5. Розроблено модифікований варіант методу полімеразної ланцюгової реакції для скринінгу експансії CGG-повторів в гені FMR1 серед пацієнтів з розумовою відсталістю, а також виявлення премуіацїї у здорових жінок.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Малярчук С.Г., Лившиц Л.А., Бычкова A.M., Кравченко С.А. Полиморфизм тринуклеотидных CGG-повторов гена FMR-1 у здоровых женщин и матерей больных с синдромом Мартина-Белла из Украины // Биополимеры и клетка.-1995.-T.il, N6,-С.104-108.

2. С.Г.Малярчук, А.М.Бычкова, Ш.Ли, В .Вертелецкий, Л.А. Лившиц. Случай спонтанной делеции в гене FMR1 у больного с синдромом Мартина-Белла // Цитология и генетика.- 1997.- т.31, N1.- С.54-58.

3. Малярчук С.Г. Молекулярно-генетические аспекты синдрома ломкой X-хромосомы Н Биополимеры и клетка,- 1998.-т.14, N1.- С.5-11.

4. Малярчук С.Г., Лі Ш., Бичкова Г.М., Лівшиць Л.А., Вертелецький В. Делеція в гені FMR1 у хлопчика з типовим фенотипом синдрому Х-фрагільності // Матеріали II з’їзду медичних генетиків України. -Львів- 1995.-С.99.

5. Малярчук С.Г., Лі НІ., Бичкова Г.М., Лівшиць Л.А., Вертелецький В. Поліморфізм гена FMR1 у сім’ях з синдромом Мартіна-Бела // Матеріали II з’їзду медичних генетиків України.- Львів.- 1995.-С.100.

6. S.Li, S.Malarchuk, J.IMartinez, C.M.Tuck-Muller,Q.Yan & W.Wertelecki. Double allelic premutations of the FMR-1 gene in a transmitting female//Abstracts of 45th Annual Meeting of the American Society of Human Genetics.- Minneapolis (USA) Am.J.Hum.Genet.- 1995. -v57. - A218.

7. S.Malarchuk, A.M.Bychkova, S.Li, W.Wertelecki, Livshits L. Analysis of patients with the Fragile X syndrome in Ukraine. // 8Jahrestagung der gesellschaft fur humangenetik.- Gottingen (Germany).- 1996,- P.31.

8. S.Malarchuk, S.Li, W.Wertelecki, A.Bychkova, L.Livshits. Analysis of patients with Fragile X syndrome in Ukraine // Abstracts of the 1st European Cytogenetics Conference.- Athens (Greece).- Cytogenet. Cell Genet.- 1997,- v.77,Nl,2.- P.250.

Малярчук С.Г. Поліморфізм ССЮ-області гена РМЮ в сім’ях з високим ризиком сшщрома ламкої X хромосоми (Мартіна-Бела).- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю

03.00.26 -— молекулярна генетика,— Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 1998.

Дисертацію присвячено проблемі молекулярно-генетичних основ патогенезу синдрому ламкої X хромосоми (Мартіна-Бела). Отримано дані з алельного поліморфізму в мікросагелітній області гена РМЮ серед здорових жінок з України. Встановлено, що в 19% хворих з клінічними ознаками сищфому Мартіна-Бела спостерігалася експансія СОО-повторів в гені РМН1. Отримано дані про мейотичну та мітотичну нестабільність ССЮ-області гена РМШ. Показано, що така нестабільність проявлялася як СОКЗ-експансія різного ступеня або делеція. Розроблено модифікований варіант методу полімеразної ланцюгової реакції для скринінгу експансії ССКЗ-повторів в гені РМШ серед пацієнтів з розумовою відсталістю, а також виявлення премутації у здорових жінок.

Ключові слова: ССКЗ-повтори, БМКІ ген, синдром Мартіна-Бела, полімеразна ланцюгова реакція.

Малярчук С.Г. Полиморфизм CGG-области гена FMR1 в семьях с высоким риском синдрома ломкой X хромосомы (Маршна-Белла).- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.0026 — молекулярная генетика.— Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 1998.

v

Диссертация посвящена проблеме молекулярно-генетических основ патогенеза синдрома ломкой X хромосомы (Мартина-Белла). Получены данные по аллельному полиморфизму в микросахеллитной области гена FMR.1 среди здоровых женщин из Украины. Установлено, что в 19% больных с клиническими признаками синдрома Мартина-Белла наблюдалась экспансия CGG-повторов в гене FMR1. Получены данные о мейотической и митотической нестабильности CGG-области гена FMR1. Показано, чго такая нестабильность проявлялась как CGG-экспансия разной степени или делеция. Разработан модифицированный вариант метода полимеразной цепной реакции для скрининга экспансии CGG-повторов в гене FMR1 у пациентов с умственной отсталостью, а также выявления премутации у здоровых женщин.

Ключевые слова: CGG-повторы, FMR1 ген, синдром Мартина-Белла, полимеразная цепная реакция.

Malyarchuk S.G. CGG polymorphism at FMR1 gene in families with high risk of Fragile X syndrome (Martin-Bell).- Manuscript

Thesis for a candidate's degree on speciality 03.00.26 — molecular genetics.— Institute of Molecular Biology and Genetics, Ukrainian NAS, Kiev, 1998.

The dissertation is devoted to the problem of molecular basis of pathogenesis of Fragile X syndrome (Martin-Bell). The data of allelic polymorphism at microsalellite region in FMR1 gene among healthy women from Ukraine were obtained. There is established lhat 19% of patients with clinical features of Martin-Bell syndrome had an CGG expansion at FMR1 gene. The data of meiotic and mitotic instability of CGG-region in FMR1 gene were obtained. It was shown that such instability was manifested as different range of CGG expansion or deletion. It was elaborated an modified variant of polymerase chain reaction method suitable for the screening of CGG expansion at FMR1 gene in mental retarded patients as well to reveal a premutalion in healthy women Key Words: CGG-repeat, FMR1 gene, Maitin-Bell syndrome, Polymarase Chain Reaction.

Підписано до друку 18.03.98 р. Формат 60x90/16. Ум. друк, арк.1.0, Обл.-вид. арк. 0,8.

Наклад 100. Зам. 74.

Відділ оперативної поліграфії Центру Міжнародної освіти 227-12-75, 227-37-86