Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОЧВЕННЫЕ АНАЭРОБНЫЕ БАКТЕРИЯ РОДА CLOSTRIDIUM, ГЕОГРАФИЧЕСКОЕ РАСПРОСТРАНЕНИЕ И АЗОТФИКСИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ПОЧВЕННЫЕ АНАЭРОБНЫЕ БАКТЕРИЯ РОДА CLOSTRIDIUM, ГЕОГРАФИЧЕСКОЕ РАСПРОСТРАНЕНИЕ И АЗОТФИКСИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ"



МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

Л1£ Л ЛИ Ш И Р АДЖУЛ И СЛ АМ

УДК 631.427.2 : 576.8.01 +63.1.4Ы.5

ЛОЧВЕЛНЫЕ АНАЭРОШШЕ БАКТЕРИМ РОДА сшетшяж, ГЕОГРАФИЧЕСКОЕ Р А С П Р ОСТРА« ЕН « Е И АЗОТФИ КСИ РУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ

(Специальность 03.'00:07 — микробиология)

Автореферат 1 диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1985

Диссертация выполнена л а кафедре микробиологии Московской сельскохозяйственной академии 'лмени К. А. Тимирязева.

..Научный руководитель — лауреат Государственной .премии СССР, Д0,кт0|р биологически« наук, профессор В. Т. Ем-цев.

Официальные оппоненты: доктор биологических, наук, ■профессор Д. Г. Звягинцев; кандидат биологических наук, ст. научный сотрудник А. К. Миненко.

Ведущее предприятие — Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной молекулярной биологии и генетики ВАСХНИЛ.

Защита диссертации состоится « » _ _ .

1985 г. в « часов на заседании Специализированного

ученого совета К 120.35.01 в Московской сел ьакохоз" "'ствен-ной академии им. К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49, сектор защиты диссертаций ТСХА.

С диссертацией 'Можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан « . . . 1985 г.

Ученый секретарь Специализированного совета — доцент

Н. А. Гончарова. |

Актуальность проблемы. В настоящее время фиксация азота микроорганизмами и фотосинтез выделены в число основных физиологических процессов, от которых зависит все производство продуктов в мире. Поэтому интерес к азоту, связываемому из воздуха почвенными микроорганизмами-азотфиксаторами, во всех странах быстро повышается. Основные причины: во-первых,* несмотря на быстрый рост производства минеральных азотных удобрений, в сельском хозяйстве все еще наблюдается недостаток азота, особенно для зерновых; во-вторых,! биологически связанный азот, в отличив от минерального, не только не требует затрат на его производ-, ство, но и дает богатую полноценным белком продукцию и обогаща-, ет почву азотом; в-третьих, что особенно важно в интенсивном ' сельском хозяйстве, биологический азот не загрязняет окружающую среду. Следовательно, азот, фиксируемый микроорганизмами , как симбиотическиыи, так и свободноживущам, должен рассматриваться как мощный фактор формирования потенциального плодородия - почвы. Он создает благоприятный фон для земледелия и позволяет более экономно расходовать минеральные азотные удобрения.

Шлученные к настоящему времени (при использовании современных методов исследований) данные показывалт, что продуктивность' азотфиксации свободноживущими микроорганизмами в почве более значительна, чем считалось презде, и составляет для почв ■ умеренной зоны 25-94 кг/га/год (по данным советских исследователей) и 18-110 кг/га/год (по данным зарубежных исследователей), а в тропических районах - 90-600 кг/га/год (Дарт, Дей, 1979). . : .- . "

Среди свободножизупрсс азотфиксирушзос микроорганизмов, существенное место занимает аназробш.'о бактерш рода СХоз^г!-с11иа . Однако, несмотря 11а значительное количество исследований, посвящонннх , получатао дашшо еще далеки

Цпт,;. Г>.:Гс -а

«г-Д. к;!. К. Л.

от исчерпывающего освещения биологии этих весьма интересных, с теоретической точки зрения, и очень важных в практическом отно-ссшш, азотфлкскруэдих бактерий.

В литературе ггедостаточно освежены вопросы качественного и количественного состава анаэробной флоры в почвах различных почвенно-климатических зон, морфолого-физиологических особенностей, а также условий, в которых осуществляется активное связывание молекулярного азота атмосферы.

В связи с изложенным, в основу нашей работы было положено изучение географического распространения, ыорфолого-физиологических особенностей и азотфнксирующей активности анаэробных бактерий рода С1осъг1й1ид » При этом, существенное внимание было уделено изучен:® этих микроорганизмов в тропических почвах Бангладеш, где, как выяснилось в результате проведенных экспериментов, они повсеместно обнаруживается в значительных количествах, а поэтому могут играть определенную роль в накоплении азота.

Цель и задачи исследований. Целью исследований было сравнительное изучение ареалов распространения представителей са-харолитических азотфиксаторов'рода С1озсг1й±иа в почвах различных почвенно-кликатических зон, их морфолого-физиологиче-ских йсойенностей и азотфиксирующей активности. Для выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить ареалы распространения сахаролитических азот-фиксаторов рода С1оасг1<11ип в почвах разных почвенно-клима-тических зон Советского Союза, Бангладеш, а также ряда других стран.

2. Определить актуальную и потенциальную азотфиксирукицую активность почв разных почвенно-климатических зон.

3. Звделить чистые культуры анаэробных бактерий рода с1оз-1п?1<11ип из почв разных потаенно-климатических зон и определить их азотфиксируюцую активность.

4. Исследовать цитологические особенности клеток чистых культур анаэробных азот&пссаторов.

Научная новизна. В работе впорвые получены количественные ■ данные о численности и азотфпксирукцей активности анаэробных бактерий рода С1озьг1еиип в почвах разных географических широт. Из разнообразных почв выделено 310 штаммов анаэробных бактерий рода С1оз^1а.1из , у которых выявлены различия в активности фиксации азота атмосферы. Наибольшей активностью обладали стаюгы, выделенные из субтропических и тропических почв. Впервые изучена актуальная азотфиксирухсцая активность почв Бангладеш. Установлено, что в зависимости от характера восде-лываемой сельскохозяйственной культуры, фиксация азота может варьировать в пределах 25-75 кг на I га за вегетационный период. Потенциальная азотфиксация была в 3-5 раз выше актуальной, в особенности в почве ризосферы риса.

Показано изменение уровня азотфиксирукцей активности анаэробных бактерий в течение онтогенетического развития культур С1ов<;г1а1ил: . В большинстве случаев в начале стадии спорообразования наблюдается сагшй высокий уровень азотфиксащш. Изучена субмикроскопичоская организация и спорообразование у С1ооЬг1

" на электронно-5гикроскопическом уровне. Влерзио установлены некоторые цитологаческио отличия (наличие двух спор в одной клетке, содержите большого количества гранулезы в спорах, образование параспоральных телец белковой природы и др.), характерные для азотф!КСиругцих С1оасПйЗлиг , сиделешпсс из тропических почв.

Ппактичоская ценность. Результаты исследований могут быть

использовали для разработки приемов рационального и экономного использования азотных удобрений с учетом возможности почв накапливать азот микробиологическим путем.

Кромо того, результаты методических разработок, осуществленных при выполнении диссертационной работы, могут быть использованы в лабораториях научно-исследовательских институтов сельского хозяйства и сельскохозяйственных ВУЗов.

АпГ'Обп'лия работы. {Материалы диссертации доложены на научных конференциях-ТСХА (1932, '1-933, 1984), на Всесоюзном симпозиуме "&1хроорганизмы как компонент биогеоценоза", Алма-Ата, 27-29 сентября 4932; на 12-ом Международном конгрессе почвоведов, Индия, 7-8 февраля "1902; 1!ёвдународном симпозиуме "дологические процессы и плодородие почвы", Англия Лондон, 4-8 июля 1983; 5-ом Международном-симпозиуме по-биологической фиксации азота, Нидерланды, 28 августа - 3 сентября, -1983; 3-ем Международном симпозиуме по фиксации азота небобовьаш ^ультурамя, Финляндия - Хельсинки, . 2-8 сентября* 1984.

Публикации. Но теме диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и обч-вм диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (5 разделов), выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 166 страницах 'машинописного текста, включает 10 таблиц и 52 рисунка. Список -литература кмеот 251 наименований, в том числе 146. иностранные.

Работа выполнена на ка^одро микробиологии Московской ордена Ленина п ордена Трудового Красного Шамони сельскохозяй-ствешюй академии км. К.А. Тимирязева.

Автор выражаот искроши;» благодарность научному, консультан-

-Ч-

ту, заведующему отделом физиологии спорообразухкцих. бактерий ИНМй АН СССР, д-ру. биологических наук В.И.Дуда и ст.н.сотруднику кафедры микробиологии ТСХА Л.К.Ницэ за ценные советы и указания при выполнении и подготовке диссертационной работы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛ££03АНИЯ

Микробиологические методы исследования. Распространение анаэробных бактерий рода Clostridium и юс азотфиксируюпдто активность изучали в почвах, взятых из разных эколого-географи-ческих зон СССР, а также ряда других стран: арктической (о.Плиц-берген), подзолистой (Архангельская область), дерчово-глеевой (Канада), аллювиально-болотной (Египет, дельта реки Кила), красной ферралитной (Куба), аллювиально-карбонатной. (Бангладеш). Образцы почв отбирали по методике Звягинцева и др. (ISS0) из горизонтов А0 и A-J целинных и пахотного слоя окультуренных почв.

Для количественного учета анаэробов испытывали следующие среды: пептонно-дрожжевую среду с глюкозой для учеса ci.pasteu-riauTia , пептонно-дрозкжевую среду с крахмалом для учета 01. üutyricun и среду с кукурузным затором для учета Cl.acoto-butylicúa 1965). Для учета железовосстанавливащих

анаэробов использовал!! следующую среду: KgHPO^ - 0,'25 г; KHgPO^j - 0,25 г; üeS04 - 50 ыг; /VaCI - 50 мг; Л'а.\*о04 -5 мг; CHgCOOya - 5 г; глюкоза - 20 г; дрожжевой экстракт -I г; смесь микроэлементов по Федорову - I мг; СаСО^ - 5 г; дистиллированная вода - 1000 ил; а также раствор витагглнэв (ыг/ 100 мл Н20): биотин - 0,1; пантотенат кальция - 0,1; тиамин хлорид - 2,0; лара-аминобензойная кислота - 1,0; pH 7,0 (На=гдп, Ottow, 1976).

Для учета общего количества сахаролитнчоских и протеоли-тических клостридий использовали среду ( Sotald ot al., 1956):

пептон - 10 г; глюкоза - 5 г; СНдСООУа - 3 г; крахмал - I г; Л'аС1 - 5 г; дроякевой экстракт - I г} МПБ - 200 мл; дистиллиро ванная вода - 800 мл, рН 7,1-7,2« Выделение чистых культур про води;ж из накопительных по описанной методике (Шаустин, йодев 1974). Для культивирования анаэробных микроорганизмов использовали анаэробную камеру о перчатками ( Aracki et al,, 1969), метод Хангейта (Hualato , 1950) и анаэростаты.

Определение нитрогеназной активности микроорганизмов. Азотфиксирущуга активность почвенных образцов, накопительных и чистых культур Clostridium определяли ацетиленовым методом { Hardy et al., 1968).,

Фиксация азота чистыми культурами Cloatridiua изучали на модифицированной среде Виноградского следующего состава: глюкоза - 20 г; КоНР04 - 1,0 г; HeSO^ - 0,5 г; /VaCI - 0,5 г; солянокислый цистеин - 0,5 г; дрожжевой экстракт - 2 г; смесь микроэлементов по Федорову - I мл; CaCOg - 20 г, дистиллированная вода - Т000 мл. Разливали по 30 мл во флаконы емкостью 50 ил и стерилизовали при 0,5 атм в течение 20 мин. Затем флаконы инкубировали при 30°С. Через трое суток определяли связанный азот ацетиленовым методом. Ддяэтого заменяли пробки на резиновые (предварительно простерилизованные 20-минутньм кипячением), фиксировали их металлическими зажимами, затем вводили ацетилен (50$ от объема флакона) и ставили в тормостат при 28-30°С на 2-4 ч, после чего определяли этилен на газовом хроматографе "Хром-4". ' Параллельно с опытным проводили контрольное опрег деленио величины нослецкфического этиленэгенеза в образцах.

Кор*одогкю клеток исследовали на живых и фиксированных препаратах с помощью светового микроскопа "Zetopan снабженного фазово-контрастным устройством, при увеличении 90 х 10.

Для изучения ультратонкой структуры клетки бактерий, их концентрировали при 5000 об/мин в течение 20 мин и фиксировали по методу Ритер-Келленбергера { Ну ter , Kollcnberser , 1958) Е5-ным раствором осмиевой : кислоты в ацетат-вероналовом буфере при pH 6,2 в течение 12 ч. Клетки заключали в агар и дополнительно фиксировали при комнатной температуре в течение 2 ч 0,Ь% уранз1Л= ацетатом, приготовленным в ацетат-вероналовом буфере. Агаровые блоки с клетками обезвоживали спиртом возрастающей крепости, ацетоном и заключали в аралдит» Шлимеризшрпв проводили в капсулах в течение 24 ч при 37° и затем 2 суток при 60°С.

Срезы получали на ультрамикротоме LK3-4S00, окрашивали 20 мин 30-ным водным раствором уранилацетата и 5 мин цитратом свинца по методу Рейнольдса ( Reynolds , 1963).. Микроскопию проводили на электронных микроскопах Jen -7 и Jen -ТОО при , инструментальном увеличении 2000.' -30000.

. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

I. 1Ьучение географического распространения почвенных анаэробных бактерий рода Clostridia

I.I. Распространение маслянокислых и ацетонобутиловых бактерий в почвах разных почвенно-климатических зон

Микробиологический анализ почв показал, что маслянокислые . и ацетона бутило виз анаэробы распространены .. во всех изучаемых почвах. Их количество исчисляется от сотен до тысяч и миллионов клеток lia I г дгсчвц, Тропические аллювиальные карбонатные почвы, трощгч^скио красно-^ерралитные почвы и дер-ново-глеееая почва характеризуются высоким содсрханием маслянокислых и ацетонобутиловых бактерий рода Clostridia . ÎIx I численность снижается в почвах северных зон. Нагаеньгео коли-

-

чество выявлено в арктических гидроморфшх глоевых почвах острова Пяицберген. Пространственное изменение соотношения масляно-кислых и ацетонобутклових бактерий в почве не стирает специфических признаков, характеризующих состав анаэробов в отдельных типах почэ. С очевидностью вырисовывается, что по мере движения с севера на юг об^ая численность анаэробов в почве возрастает.

В тропической почве Бангладеш, в аллювиально-карбонатных почвах, наблюдается значительное разл;гчле в численном составе анаэробов, в зависимости от состояния почвы (табл.1). В неокуль-туренной почве, в зависимости от ее топографического расположения и флористического покрова, в развитии анаэробов выявлены существенные различия.

Таблица I

Развитие анаэробов С1озсг1<Илда в тропических карбонатнз«-адлмвиальных почвах (Бангладеш) {в I г абс.сухой почвы)

.Состояние почвы lCl.paзteu-|Г1апиа •С1,асе<;о— 1 ЪиЪуИсиа 1 .С1.ЬиСу-|г1си» 1 ,С1.вассЬа-{гиЪиЬуг!-| сип

Целина (пойма) 5,5-Ю5 9,9-Ю5 3,3« ю5 4,8-Ю5

Неокультуренная (под кокосом) з.о-га5 1,1-Ю6 9.5.Т04 9, МО5

Окультуренная (просо; 0,5'106 1,8-Юб 3,6-ТО4- 1,3. Я)6

Как видно, С1.ътзгг1сиг и в меньсей степени 01.ря.з(;оиг1ап11=;, развиваются лучзо в целинной пойме, чем а неокультуренной почв», занятой кокосом, в то время как в последней почве сх.ооосоъиф-Ысип и с1.оосоЬагоЬи1угАоиа находят для своего развития лучзке условия, чем в целине. В окультурешасх почвах создаются оптимальные условия для развития большинства видов анаэробов.

Cl.pa3touri.anun;, преобладающая вид анаэробов в почвах северных зон, при определенных оптимальных условиях {по-видигмому, одно из них - обильное снабжение почвы легкорастзоркмыми органически?« соединениями) может зашагать ведущее место в микробных сообществах и в почвах тропических зон. При этом, когда в почве находятся свежие растительные вещества, они обеспечивают но , только развитие С1.асе1:оЪШзг11си= , но и С1.разСеиг1апил. О влиянии агротехнических приемов (обработка почвы, внесенио удобрения и другие) на развитие маслянокислых и ацетонобутило-вых бактерий мояно судить по данным таблицы 2 (на примере подзолистых почв Архангельской области).

Таблица 2

Развитие маслянокислых и ацетонобутиловых бактерий в почвах разных географических вирот (в тис.на I г абс. сухой почвы)

! гпмп тгю ! Глсляно- 1Ацетоно-Тип почвы . ! I кислые I бутиловые _______________! почвы | бактерии }бактпр:щ

Подзолистая почва . Целина 368.800 110.500

(Архангельск) Окультуренная ч 836.600 , 895.300

• (под картофелем)

Тропическая аллвви- Целина 670.000 1.370.000

альная карбонатная

почва (Бангладеш) Окультуренная 1600.000 ' 1.7-40.000

. . В данной климатическоЯ зоне в окультуренной почве энергично развиваются но только СХ.раойеигХапиа , га и С1.асо(:оЪи-<зг11си= - Тагам образом, под влиянием антропогенных факторов происходят существенные изменения в количественном соотногегам видов или групп анаэробов. Анализ образцов почв из-под картофеля показывает, что соотношение С1.рао<:оиг1а2ги2 и С1.асо£оЪи-близко к единице, в то время как в цели гной - их соотносило примерно 3:1. Явно выявляется домшырупщиЯ характер

иаслянокис.тых бактерий в целинных почвах Северных широт. При окультуривании почвы данное соотношение несколько изменяется. Такое га отклонение в характере развития анаэробов в целинных почвах Северных Елрот наблюдается и в почвах Истых- аирот. В окультуренных аллювиальных карбонатных почвах Бангладеш отмечается весьма интенсивное размножение маслянокислых бактерия. В данном биотопе соотношение маслянокислых и ацетонобутилозых бактерий близко к единице, в то время как в необработанной почве ото соотношение равно пр;шерно 0,5:1. По-видимому, в этих условиях в почве находятся свежие растительные остатки, обеспечивающие энергичное развитие маслянокислых бактерий, а также трансформированные органические вещества, обусловливающие хорошев развитие и ацетонойутиловых бактерий.

1.2. Распространенно сахаролитических железовосстанав-

яивающих анаэробных бактерий в почвах разных почвенно-хлиматических зон

В изучаемых нами почвах была выявлена высокая численность анаэробных железовосстанавливающих бактерий, играющих важную роль в процессах оглеения почв, находящихся в водонасыщенном •состоянии. Они хорошо развивайте* в красно-ферралитной

'{Куба), аллювиалшо-варбонатной (Бангладеш) и аляювиально-бояот-ноЛ (дельта р.Нила) почвах. Представителями железовосстанавли-гающих бактерий были Ol.naccharobutyricus, Cl.tyrobutyricuB, Ol.üultlíersontana, Cl.paateuriaEua, Cl.acetobutylicua, Cl. boljurir.ckii, Cl.kluyveri . в арктических почвах анаэробные сахаролитичоскме железовосстанавливающио бактерии интенсивно развиваются в гидромор^лых почвах, слабо - з орштогеюшх (о.ЕпицЗорген). Суммар1ая численность жзлозовосстанавливагщих анаэробов колоблотся в довольно сироких пределах - от 100 тысяч

клеток в I г арктической почва до 10 млн/г в тропической красной ферралитной почве. Экспершенталъно удалось установить, что в составе анаэробной ассоциации бактерий, восстанавливавшие железо, кмезэтся ведущие форлы Дсмииирую^ш представителем явлезовосстанавливаюгцих бактерий в почвах субтропических зон являются Cl.aootobutylicua , Cl.ktuyvori и Cl.Taoijerin-okii • Причем диапазон видового состава этих ассоциаций в субтропических почвах представлен более сироко, В арктических почвах численность желеэовосстанавлнвахкцих сахаролитов невысока и представлена в основном, CX.paotourianun и Gl.tyrobuty-ricvua , более часто встречаемых в гидроморфных почвах. Зависимость развития сахаролитическях железовосстанавливаю^ис бактерий рода Clostridium от анаэробных условий, обусловливает область их распространения в определешшх биотопах игл экологических гасах, что накладывает отпечаток на доминирование видов Clostridium в почвах разных эколого-географических зон,

. 2. Изучите азотфиксирук^ей активности почв разных почвенно-клкматических зон

2.1. Потенциальная азогфшгсирук~ая активность почв

Дзниыо о потеициально-зозиозном уровне еэотфиксацяи в поч» вах различпых эхолого-географичаских зсн проставляют значительный интерес для пошаешяя максимально возможного уровня азот-фявсацил.

В таблица 3 приведены полуденные нами результат о размерах потенциальной азотфкксацш! <api снесении глюкозц в почву) в почвах ряда биокламатичвеких .зон земного кара, определенной ацетиленовым методом.

Как следует из полученных дщщых» цаблгдается определенная закономорюсть в увеличения активности азогфпгсацхл в почвах

Таблица 3

Потенциальная азотф:исиругг;ая активность почв различных почвенно-климатичеешх аон

Почва ! Место сбора | образцов ;Кол-во * изученных ! образцов |Азотфинса-!кг9га/год

Арктические о.Спицберген

- оргитогешшо II 3-14

- гидроморфнке 7 2,5-11

Подзолистая Архангельская обл 9

- долина 18-57

- окультуренная 27-68

Дер I ов о-подз ол не тая Московская обл. 15

- целина 33-127

- окультуренная 41-168

Серозем Таджикская ССР 22 146-380

Аллювиально-болотная Дельта Нила (АРЕ) 5 210-460

Красная ферралитная Куба 3 190-440

Аллпвиально-карбо- Бангладеш

натная

- целина 6 135-370

- ноонультуренная 4 115-260

- окультуренная 3 186-470

при движении с совера на вг. При этом слодует отметить, что добавление в почву глюкозы достаточно бистро активизирует азот-фиксации и отот эффект проявляется во всех почвах вне зависимости от их особешюстей. IIa основании этих данных можно прийти в важному выводу, что азо?£з1ксируюций генофонд почв разных эко-дого-гоогра$ичоскнх зон достаточно богат, а деятельность азот-факсирутс^кх бактерия в них лимитирована главным образом недостатком легкодоступного энергетического субстрата.

2.2. Актуальная и потенциальная азотфиясирукцая активность почв Еангладоз

Влараыо в целинных и снультурешоде аллевпально-карбонатных

— у» —

к других почвах Бангладеш наш была определена актуальная и потенциальная азотфиксирующая активность с использованием ацети- ■ ленового метода. В лесных почвах, а также под кустарниковыми насаждениями, плантациями каучуконосов, рсута, манго и имбиря она была низкой, а в ряде случаев актуальная азотфиксация вооб- ' це не обнаруживалась.

В окультуренных почвах под рисом, хлопком, маисом, тыквой

I

и чайным кустом микроорганизмы фиксировали до 25 кг азота/га за 3-месячный вегетационный период. Наибольшие различия в уровне фиксации азота, а та^яже наибольшая азотфиксируюцая активность - до 72 кг азота/га за вегетационный период, обнаружены в почвах, отобранных под сахаршм тростником и ананасовыми плантациями.

Внесение глюкозы в образцы почв способствовало значительному увеличению азотфиксирующей потенциальной активности во всех исследованных пробах. Так, высокой потенциальной азотфик-сируюцей активностью характвр!зовались почти все изученные почвы Бангладеа (табл.4 а значительные колебания потенциальной активности азотфяксацни являются следртвием различного влияния растительного покрова, который оказывает стимулирующее воздействие на численность и таксономический состав азог-£иксаторов почвы. Различия в уровнях потенциальной активности азотфизсации являются косвенным показателем различной числснно-сти микроорганизмов - азот^иксаторов в почве. Кроме того, ело-даот отметить, что вероятно, процесс фиксации молекулярюго азота в аллювиалшо-карбоиатных почвах Вшгладез мохот лимитироваться недостатком доступного оргашческого воирства.

Слодоватольно, олродолоние несимбиотичоской азог£иксации в почвах разных климатических зон, показало, что практически

Таблица 4

Потенциальная азотфиксирующая активность тропических почв различных типов (Бангладеш) ■

• Почва { Растителг'шй | покров . !Кол-во !изученных 1 образов • !Азотфихсация, !кг/га/год

Глеевая почза целина 2 62-136

просо 3 110-270

рис. 3 135-330

пгеница 2 88-310

кокос 3 ' 17-56

кустарники 2 5-16

Пойма (река Падха) рис 2 160-375

просо 3 I45-3S5

во всех почвах, во всей многообразии природных экосистем, фонд доступного для растений азота пополняется за счет связывания молекулярного азота почвенными диазотрофами.

3. фиксация молекулярного азота атмосферы анаэробными бактериями рода cioatrridius, взделеншаш из почв разных почзекно-климатзетескях зон

3.1. Изучение оффезтяБНосгл азотфиясацяи у екологическях " pao cio3tridius '* .

Из почв различных почвенно-лиматическях зон ряда гарот земного sapa нами било изолировано 310 нтаммов Cloatrldiun.

Результаты исследована показали, что азотфаясир/ющая активность экологических рас различных.видов Clo3tridiu= существенно различается. Таз, достаточно аксской нйтрогеназной актив» костью (75-110 ieíos этилена) обладают d^pasteuriasrs , С1. tyrob-ityrictn и cl.butTrictsa , , изолированные из почв северных гарот. Етаммы га доз Cl.acetoVatylicuá . д С1.зассЬагоЪи- • tyricisi , выделенные из тех ж» почв, имели невысокую шгтроге-назную активность. В го ха время craiani этих ¿о анаэробов -

' ОЛ-фасе^Ъи-ЬуНсиа И С1.аасоЬагоЪиОгх1си= , а также С1. Ъе13ег1пск11 И С1.к1иууег1 , выделенные из почв шных широт, обладали большей нитрогеназной активность» (табл.5). Активными азотфинсаторами в ферралитных почвах Кубы являются, з частности ОХ,Ъе13егЛпскИ и С1.к1цгуог1. Следовательно, интенсивность связывания молекулярного азота атмосферы С1оз№1й1иа определяется почвенно-климатическими факторами, свойственны;«! определенному типу почвы.

Таблица 5

Нитрогзназная активность чистых культур С1оз(:г1<11ш2, выделенных га субтропических и тропических почв южных . широт (в нмол этилена за I час, на 100 мл среда)

! Ви¿¡р _ ________

Типы i"51" ~ Tel." "¡"сГ.Ъи- ГсГ.-I ci Г ~ fei." ciT ~ , paetö-j acato- tyri- ttyro-loacc- J beijo-'kluy-П0ЧВ | uria- , buty- i 0U= i buty- j haro- J rln- ! vurl I nu= . lu- i j ricun. buty- I ckii I ! cu= j , {ricus i 1 ■ штамм {штамм !я?амы ,пггамм i штамм ! а таим {птамм _1 95 { 224 i 135 (168 1Т0в I 144 1 500

Аллювиально* болотная (Египет) (окультуренная; 135 277 88 127 258 283 166

Аллювиальное карбонатная (Бангладеш) - пойма (целина) 75 118 бб 68 275 117 132

- неокульту-ре1шая (под кокосом; 90 157 107 135 236 156 175

- окультуренная (просо) 90 212 97 123 284 IGT? 102

Красная Форра-ли гноя (Йуоа) ' 103 240 118 138 273 373 315

Следует отметить, что результаты опытов, полученных при изучении активности азотф}пссац1И:у экологических pao Cloatri-diun » согласуются с даннымзх по активноста связывания молекулярного азота атмосферы почвами тех типов, из которых были изолированы анаэробные бактерии. •'..*•*

Выявлено, что окультуривание почв ведет к увеличению нит-/ рогеназной активности ' Clostrldiun , , в особенности у штаммов, выделенных из почв южных широт. Все это говорит о том, что на физиологических свойствах анаэробных азотфикскрующпх бактерий сказываются не только почвенно-климатические.условия, но и специфические факторы антропогенного порядка. Причем, как правило, штаммы cio3tridiua , выделенные из окультуренной почеы, характеризуются более высокой азотфиксирующей актишостьв, чем штаммы, выделенные из целинных почв как северных, так и южных широт.

4. Изучение цитологических-особенностей клеток .и процесса. , спорообразования, ciootridiua ' ,, выделенных из тропиче ских * почв. .

, 4.1. Цитологические особенности, бактериальных клеток

' Cl.butyricu=, Cl.pastcœiaaun. И- Cl.flavun ; ~ .

Была изучена цитология азотфаксирувщих бактерий рода С1оз-tridlus » выделенных из троггичестах аллювиально-карбонагоых почв Бангладоз. Особенностью исследуемых штаммов Cloatxddiua -является способность развиваться при повышенном-содержании хлористого натрия в среда. Ка плотшгх питательных средах Clostri-dlu= • формируют кслоша различных типов и морфолопш. • Cl.bu- V : • tyricus и ci.pasteurlAEB¿ . '/ образуют'белые или серые коло-¡ . нии размерен в 2-5 мм, некоторые имеют около 10 мм." ci.flavua

| ' образовывал оранжевого и желтого цвета колонки,- которые дости-| i гали размера в 10-15 мм. ' •. - - ' . -

Установлено, что споры С1.£1ауил отличаются от спор других видов С1оойг1й1ип тем, что сни обладают газовыми колпачками, прикрепленным^к оболочке споры и состоят из газовой везикулы. '

Все выделенные С1озтг1йЗли=. имели палочковидаую и вороте-ношдзую форму, окрашивались раствором Лого ля. Наибольшее количество гранулезы в клетках отмечали для штаммов С1.Ъи£уг1сия,.

Клеточная стенка_(КС2. Анализ ультратонких срезов клеток С1.ра£^виг1апих1 штамма 92 показал, что бактерии имеют типичную для грампояожителышх бактерий клеточную стенку. У всех штаммов Cl.butyri.cun клеточная стенка имела одаослойное строение, толщиной 20-30 мкм, а у С1.раа^иг1апиа штамма 92 стенка состоит из двух слоев - внутреннего, средней электронной плотности и наружного - электронно-плотного слоя, представляющего собой, по-видимому, микрокапсулу.

У некоторых штаммов 01ootrtdi.ua часто дифференцируются три слоя и обнаруживаются расположенные фрагментарно пятислой-ныэ участки клеточной стенки.

Ст|юение_щтоплазмы и ее_основныа компоненты^ Мембранные структуры: в клетках С1оз£г1й1\га видны мембранные структуры, расположенные на периферии и в центре клетки. Они представлены в виде длинных колец и петель, образующих широкие канальцы, заполненные веществом низкой электронной плотности. Мембранные структуры являются инвапшатамн цитоплазматкческой мембраны и имеют такое же трехслойное строение.

В цитоплазме всех изученных штаммов, эа исключением штамма 92, отмечается большое количество включений гранулезы, имеющих вид электронно-прозрачных" гранул различной величизш, а кроме того, отмечаются мезоссмы - внутрицитоплазматические меибряшша

структуры (В1£Л). Эти структуры.связаны с куклеоидом или с клеточной перегородкой. Нуклеоид распределен в центральной части ' клетки в виде электронно-прозрачной зоны, заполненной электронно® плотными нитями ДНК толциной 2,5'нм. Деление клетки осуществляется посредством перетяжки, которая возникает в центральной части клетки, причем в месте деления одновременно инвагинирупт клеточная стенка и цитоплазматическая. мембрана. При делении-обычно происходит полное отделение дочерних особей; Но изредка образуются цепочки, составленные из 2-4 клеток.

4.2. Отология спорообразования; Прослежены превращения клеток в процессе спорообразования. Да яерзой стадии спорообразования отмечается формирование осевого ядерного тяжа (ЯТ), на второй стадии происходит закладка;споруляционной септы и далее .наблюдается образование проспоры (3-я стадия). На четвертой и шестой-стадиях происходит созревание споры, выражающееся следующими процессами: формированием кортекса, электронно-плотных покровов и экзоспориума.'. На седьмой ¿.заключительной стадии, спорангии лизируются и спора освобождается. . '

Токкое_строеш1£ £пор^ Зрелые споры изученных етаммов обладают типичны:«! спороспецяфическими структурами! сердцевиной, кортексом, покровам;!, а неюторые штаммы - ^кзоспор^-мом. ГЬкрови состоят из трех слоев - внутреннего, среднего, электронно® плотного и внешнего. Эти структуры^'как известно, свойственны и «другим видам С1озкг1(Шг= " и.-" ВасШиз ■ ' (Дуда Б.И. ,1932). Однако, нами выявлены некоторые специфические особенности строения спор Cl.but7r.icur:, ' вцделешшх из почв Бангладеш. Для ряда гггакмэв характерно бользое количество вклячегай гранулезы в сердцевине споры, что не свойствешо ранее описанным в литературе С1сзьг1е1гк: (Дуда В.И., 1982). Другой особешюстью этих

же стаммов является формирование полярно расположенных параспо-ральных тачец» Они имеют вид крупных гранул с зернистой структурой и, по-видимому, состоят из белка. Однако, оти тельца не могут быть отнесены к кристаллам формирующимся при спорообразовании, например, у Еао.1иг1вд1епз1а и, таким образом, представляет собой новую структуру клеток азотфиксирующих С1оз£г1-йЗдна почв тропических районов. Этот признак, по-видимому, возможно использовать для идентификации изолятов сходных культур. По наличию или отсутствию экзоспориума изученные штаммы Cl.butyrl.cun. можно разбить на две группы: I) штаммы 86,90,91, 25,87,89 и 93, зкзоспориум у которых отсутствует; 2) итаммы 66, 90,91 - способны формировать экзоспориум. Эта структура имеет вид тонких электронно-плотных листков, расположенных на некотором удалении от оболочки споры. Таким образом, в почвах Бангладеш обнаруживаются два варианта С1.Ъийуг1сип, различающихся по трем описанным признакам (таблица 6).

Таблица б

Различия в строении спор изученных бактерий

Виды ЦЗари-{анты ! | Штаммы 1 » !Экзо-{спори-}ум 1 Грану-(лоза в |про-Iспорах 1Пара-1спораль-|ные 1твкьпа

01.Ьи1уг1сиа I 86,90,91 *

—- * п 25,87,89,93 - - -

92 - - -

Различия между С1.Ъи^г1сип и С1.рав1еиг1апип состоят в неодинаковых размерах клеток (у С1.Ьи1уг1си= клетки болео крупные, их диаметр•провыгает I мкм), в способности 01. Ъи<агг1сип сбраживать крахмал и в строении клеточных стенок

(у С1.раоееиг1апит ' стенка'двухслойная)»Интересно отметить, . что процесс спорообразования, у всех изученных Clostridi.ua зна чительно усиливает нитрогенаэную активность анаэробов.

, Следовательно, нами установлен ряд цитологических особенно стей строения клеток и спор С1.ЪШзгг1сша • и Cl.pasteurianum, изолированных из тропических.почв Бангладеш.

' . выводы . : \

В работе исследовали географическое распространение и азотфиксирую:дую активность почвенных анаэробных бактерий рода С1оз&г1а1ип. На основании проведенных экспериментов можно еде лать.следуете выводы:- . . . •

I. Изучено географическое распространение анаэробных бакте рий рода с1оз&г1<Шш в почвах разных почвенно-климатических зон. Указанные бактерии обнаружены во всех исследованных почвах Их количество было наименьшим в арктических почвах о.Епицберге-на и наибольпимв тропических почвах.Бангладеш и Кубы.

'2. Почвето-климатические условия оказывают определенное, влияние на соотношение' видов и (или) подгрупп почвенных анаэробных бактерий. Тропические почвы характеризуются сироким диапазоном видового состава анаэробов.-. Среди них особое значение имеют сахаролитические жолезовосстанапливающие' бактерии рода C3.03tridl.uz; (С1.сассЬагоЪ;1Иуг1сид , ' СХ. 1угоЪиЬтг1си=: , С1. ЕиЗлиГег^епСааз , С1.асе1оЬи£у11си= и др.). В арктических . почзах указашше бактерии слабо развиты. - .--'.

3. Впервые проведено сравнительное изучение потенциальной. азотфиксирующеЯ активности почв различных географических сирот. Ншменьсая азотф;1кс!?р1Хщзя активность обнаружена в арктических почвах.о.Шпицбергена и наибольшая в.субтропических (Египет) и

тропических (Бангладеш, Куба) почвах.

4. Установлено, что в тропических окультуренных почвах Бангладеш под рисом, хлопком, маисом,'тыквой и чайным кустом актуальная фиксация азота достигала до 25 кг на га, а в почвах под сахарным тростником и ананасовыми плантациями - до 72 кг азота на га за вегетационный период. Потенциальная азотфиксация была в 3-5 раз вше актуальной, в особенности в почве ризосферы риса.

5. Из почв различных типов Советского Союза, Бангладеш и других стран ввделено 310 штаммов разнообразных представителей сахаролитической группы Clostridium существенно различающихся по своей активности связывать молекулярный азот из воздуха. Большей активностью обладали штаммы, ввделенные из субтропических и тропических почв. Причем, штаммы, ввделенные из окультуренных почв, характеризуются более высокой азотфиксирующой активно-

1 стьп, чем штаммы, ввделенные из целинных почв,- как северных, так и тропических.

6. ГЬказано, что динамика азотфиксирущей активности в процессе онтогенетического развития культур Clostridium определяется как почвенно-климатическими, так и антропогенными факторами. Как правило, более интенсивный процесс азотфиксации наблюдается у культур, выделенных из тропических почв, главным образом,. из ризосферы риса, сахарного тростника и некоторых других тропических растений.

7. Установлено, что уровень азотфиксирующой активности •анаэробных бактерий изменяется в точ81ше онтогенетического развития культур Clostridium . В большинстве случаев в начале стадии спорообразования наблюдается наиболее высокий уровень азотфиксации.

8. Изучена субмикроскопическая организация клеток и споро- -образование у анаэробных Clostridium выделенных из тропических почв Бангладей. Установлено наличке в почвах Бангладеш двух вариантов азотфиксирующих Clostridium, различающиеся по ряду Диетологических признаков. 3 частности, впервые обнаружены в культуре Cl.butyricua штаммов 91,93,90 клетки с двумя спорами и с большим количеством гранулезы в спорах. Выявлены также параспоральные тельца, белковой природы, формирующиеся при спорообразовании только у азотфиксирующих Clostridium из тропических почв.

9. Шлученные фактические материалы по определению количественных характеристик численности и азотфиксирующей активности анаэробных бактерий рода Clostridium . в природных условиях и обобщение литературных данных, свидетельствую?, что анаэробная азотфиксация может быть отнесена к числу важных составляющих баланс азота во всех почвенно-климатических зонах, в особенности южных широт (субтропические и тропические почвы).

Список опубликованных работ по теме диссертации:

Т. Еирздкул Ислам Пелли, Ницэ Л.К. - Распространение анаэробных бактерий рода Clostridium в почве разных стран мира. В сб. "".икроорганизмы как:компонент биогеоценоза", Материалы Всесоюзного симпозиума, Алма-Ата, 27-29 сентября, 1932 г., . с. 141-142. . ' • ;

2. Н;п;э Л.К., 0(раджул Ислам Еелли - Распространение анаэробных бактерий рода Clostridium в почвах разных эколого-географи-ческих сон. - Известия ТСХА, 1983, вып.5, с. 105-160.

3. Shorajul Iolaa Shelley,L.E. ITitsco.V.T.Emtcov; Distribution of anaorobic bactoria cf tho geirüs Clostridium ia soil сГ '' difrerest cliratic socos c£ the world. - rrsu^actioas oT

tiie meeting on Biological Broceases and Soil Fertility,. University of Reading, 4-8 July 1983, London, U.K. 1963, p.1^3.

4. Sherajul Islam Shelley, Xi.K.Kitzse, VS. Estsev. Charge in nitrogenada activity of anaerobic bacteria of the genua Clostridium dopending on the cocditiona of gro.vth and phase of development - Advances in nitrogen fixation, research proceedings of the 5th International Q/npooiua on Nitrogen Fixation, lloordwijkerhout, the Netherlands, August 28 -September 3, 1983, p. 24-2.

5. ííitzse L.E., Sotaev V.T and Shera^ul Iolan Shelley. Ecological aspecto of nitrogen-fAxing activity of anaerobic bacteria genua Clostridium, - Tho 5th International Syiapoaiuc on Nitrogen Fixation; Advances in nitrogen Fixation rosearch proceeding, Koordwi;Jkerhoutr the Netherlands, August 28 -September 3, 1983, p. 267.

6. SherajJul Islaa Shelley, V.T. Er.t3ev: Anaerobic nitrogen fixing bacteria of the genus Clostridium and Soil fertility. -International Synposiuc on Soil Test crop reapoaso correlation otrudiea. Abstracts. Bangladesh Agricultural research Council and Soil Science Society of Bangladesh: 1983, p.19.

7. Sherajul Islam Shelley and V,T. Eataev. Distribution of Clostridium pasteurianua in Soils and plant nourishing -The Third International Syaposium on nitrogen fixation with non-Legumes. Q^spoaiun proceeding Helskinki 2-8 Septesbor, 1984.

Объем п. и. Заказ /49 Тираж /СО

Типография .Московской с.-х.'академии им. К. А. Тимирязева 127330, .Москва 11-550, Тимирязевская ул., 44.