Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ АНАЭРОБЫ РОДА CLOSTRIDIUM И ИХ РОЛЬ В ТРАНСФОРМАЦИИ БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ В ПОЧВЕ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ АНАЭРОБЫ РОДА CLOSTRIDIUM И ИХ РОЛЬ В ТРАНСФОРМАЦИИ БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ В ПОЧВЕ"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

Альфира Камнльевна ГОРОВА

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ АНАЭРОБЫ РОДА CLOSTRIDIUM И ИХ РОЛЬ В ТРАНСФОРМАЦИИ БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ

В ПОЧВЕ

Специальность 03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА —1979

Диссертация выполнена на кафедре микробиологии Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Научный руководитель — доктор биологических наук профессор В, Т. Емцев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук С. В. Летунова, кандидат биологических наук И. Н. Сквор-цова.

Ведущее предприятие — Институт микробиологии АН СССР. -£>

Защита диссертации состоится . 1979 г.

в Ж час. на заседании Специализированного совета К-120.35.06 при Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева. -

Адрес: 127550, г, Москва, И-550, ул. Тимирязевская, 49. Сектор защиты диссертаций ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан « . » . * . . 1979 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

доцент (В. Г. МАРЬЕНКО)

Актуальность проблемы. Известно, что преобладающая часть азота в почве находится в форме органических соедине* ний, которые до 20—40% представлены белковыми веществами и аминокислотами (Bremner, 1965).

Своим происхождением они связаны с растительными* и животными остатками, микробной массой. Белок попадает в почву также с органическими удобрениями: при внесении навоза, различных компостов, при запашке зеленых удобрений. Белковые вещества входят в состав перегноя.

В почве непрерывно происходят процессы: синтеза и рас* прда белков. При этом динамика усвояемых форм азота тесно связана с разложением белков и аминокислот. Все эти процессы влияют на почвенное плодородие, развитие растений и их урожайность (Джуманиязов, Каэиев, 1975).

Одним из ведущих процессов в трансформации белковых веществ в почве является их протеолиз, осуществляемый как аэробными, так и анаэробными микроорганизмами. Трансформация белковых соединении аэробными микроорганизмами изучена достаточно подробно (Мишустин, Тимофеева, 1944; Красильников, 1958; Пошон, Баржак, 1960; Сапожников и др., 1973; Илялетдинов,. 1976 и др.). Несмотря на обширную литературу, посвященную трансформации белковых веществ микроорганизмами, роль анаэробных бактерий рода Clostridium в разложении укззанных соединений остается невыясненной. Между тем представители рода Clostridium широко распространены в природе. Они выделены нз многих естественных субстратов, но наиболее часто они обнаруживаются в почве. Эти,разнообразная группа микроорганизмов включает сахаро-, пектино-, пурино- и протеолитнческие анаэробы. Наиболее подробно изучены сахаролнтические кло-стридии {Мантейфель. 1939; Френкель, 1956; Дуда, 1964; Гудков, 1965; Емцев, 1974 и Др.).

Протеолитнческие Clostridium относятся к числу малоизученных микроорганизмов. Эти анаэробы исследовались до настоящего времени главным образом в медицинской микробиологии и ветеринарной практике как возбудители раневых

инфекинй, пищевых отравлений и других клостридиозов {Львов, 1960;,Тарков, 1961; Парцвання, 1971).

Однако в последние годы протеолитические анаэробы привлекли внимание и почвенных микробиологов. Было показано, что большинство бактерий рода Clostridium находится в почве в состоянии вегетативных клеток и поэтому они могут участвовать в ряде важных биохимических процессов, вероятно, также и в процессах протеолиза белковых веществ, обогащая таким образом почву доступным для растений азотом (Емцев, 1974; Соболева и др., 1977; Skinner, 1968, 1979). Все это обусловливает необходимость,изучения этой группы микроорганизмов.

Цель. и< задачи исследования. Целью исследования было изучение эколого-физиологических особенностей протеолити-ческих Clostridium и выяснение их роли в трансформации белковых веществ в почве.

Для выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1. Определить распространение протеолитических анаэробных бактерий рода Clostridium в почвах Советского Союза.

2. Выделить из различных почв чистые культуры. протеолитических Clostridium и изучить их морфологические, куль* туральные и физиологические свойства.

3. Исследовать влияние экологических факторов на фи-зиолого-биохимическне особенности протеолитических Clostridium.

4. Выяснить участие протеолнтической группы бактерий рода Clostridium в трансформации белковых веществ в почве.

Научная.новизна, В работе впервые получены количественные данные о наличии протеолитических анаэробов рода Clostridium в основных типах почв СССР. Были выделены из различных почв • разнообразные представители протеолнтической группы Clostridium, активно трансформирующие белковые вещества. У изученных видов Clostridium: CI. sporogenes, CI. bifermentans, CI. subterminate впервые установлено изменение фнзиолого-биохимических особенностей (изменение протеолнтической активности, метаболитов реакции Стикленда, продуктов брожения белков и др. свойств) в зависимости от эколого-географнческих факторов. Также впервые выявлена трансформация белков в почве анаэробными микроорганизмами и показана ее зависимость от почвенно-климатических условий. Выявленная исследованиями способность протеолитических анаэробов рода Clostri* dium; трансформировать белковые вещества в почве, а также определение факторов, обусловливающих интенсивность это--2

го процесса, позволяет говорить о возможности направленного регулирования разложения органических азотсодержащих веществ с целью интенсификации высвобождения минеральных форм азота для повышения урожайности сельскохозяйственных культур.

Практическая ценность. Результаты исследований могут быть использованы для разработки практических рекомендаций эффективного применения органических удобрений: в сельском хозяйстве, в частности, в районах орошаемого земледелия,

Кроме того, результаты методических разработок, осуществленных при выполнении диссертационной работы, могут использоваться в лабораториях микробиологии научно-исследовательских институтов сельского хозяйства, пищевой промышленности. а также в медицинских учреждениях.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались на Республиканской конференции «Микробиологические процессы в почвах н урожайность сельскохозяйственных культур» (Каунас, 1978) и на Всесоюзной научно-технической конференции по улучшению работы в подборе, расстановке, воспитанию и подготовке молодых кадров в свете решений XXV съезда КПСС (Углич, 1978).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи.

Объем работы. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста, включая 6 рисунков,- 10 фотографий, 50 таблиц. Список использованной литературы содержит 305 наименований, в том числе 129 зарубежных. ' •

Автор выражает глубокую благодарность канд. биол. наук А. В. Гудкову и канд. техн. наук М. С. Уманскому за помощь в работе и ценные консультации.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Распространение протеолитических анаэробных бактерий рода Clostridium изучали в различных почвах СССР —в дерново-подзолистой почве, черноземе, светло-каштановой почве, а также в сероземе.

Для количественного учета протеолитических Clostridium было испытано 6 питательных сред. Наиболее приемлемой оказалась среда следующего состава: желатина —10%; пептон— 3%, цистеин — 0,05%; смесь микроэлементов по Федорову (1957) — 1 мл/л среды; дрожжевой экстракт — 7 мг/l л среды, нейтральрот —0,004%; мясной бульон—до 1000 мл. pH 7,2—7,4%. Определение численности протеолитических анаэробов производили методом предельных разведений пу-

тем посева почвы из водной суспензии на питательные среды с предварительной обработкой почвы по Д. Г. Звягинцеву (1969). Повторность четырехкратная. Наблюдения за ростом и учет проводили каждые сутки в течение 7—10 дней по следующим показателям: 1) снижению гНг среды (восстановление нейтральрота Clostridium приводит к флуоресценции среды, которая приобретает золотисто-желтую окраску); 2) разжижению желатины; 3) наличию газообразования, при этом отмечали очень сильный гнилостный запах; 4) по микроскопической картине (присутствию клеток, типичных для протеолнтических Clostridium).

Выделение чистых культур указанных анаэробов проводили на предложенной нами селективной среде для протеолнтических анаэробов (ССПЛ) следующего состава: гидролизат казеина — 50%; пептон — 3%; дрожжевой автолизат — 4%; хлорид натрия — 0,3%; ацетат натрия — 0,1%; смесь микроэлементов по Форду (Ford, 1962) — 10 мл/л; агар — 2—3%; дистиллированная вода до 1000 мл; нейтральрот—1 мл 4%-ного водного раствора на 1 л среды. Ацетат натрия введен в качестве стимулятора роста споровых анаэробов. pH 7,2—7,4. Селективные условия создавали внесением в среду смеси двух антибиотиков: неомицина и лолимиксина М в концентрациях 50 мкг/мл и 50 ед/мл соответственно, которые стерилизовали фильтрацией" и вносили в среду перед употреблением.

Изолирование протеолнтических Clostridium в чистую культуру осуществляли двумя способами; 1) с помощью накопительных культур, которые получали в среде Кигт-Та-роцци с 2-кратным пересевом по методу И. С. Скалона (I960) с пастеризацией при температуре 85° в течение 10—15 мин. и без пастеризации; 2) путем прямого посева почвенной разводки (пастеризованного и непастеризованного вариантов) на чашки Петри со средой ССПА.

Выделение .чистых культур анаэробов из накопительных проводили в трубках Вейона (Бычковская, 1966) и в чашках Петри в анаэростатах, в которых создавали вакуум с остаточным давлением в Ю-1 мм рт. ст. В некоторых случаях их заполняли COj, N3, а для поглощения неудаленного Оа помещали щелочной раствор пирогаллола. В качестве поглотителя влаги использовали прокаленную окись алюминия. Температура инкубации посевов 37°.

Морфологические особенности выделенных культур изучали в СДЛ (Гудков, .1966), среде Китт-Тароцци н в безуглеводной среде, в которой источником азота служили пептон и смесь аминокислот деминерализованного гидролизата казеина. Данная среда представляет собой среду ССПЛ, из которой исключены селективные агенты — смесь антнбиоти-4

ков, н именуется'нлмл в дальнейшем средой СПЛ (средой для протеолнтических анаэробов).

Микроскопию проводили с помощью микроскопа МБИ-1 с фазово-контрастной насадкой, а также просматривали оттененные и негатнвноокращенные препараты целых клеток в электронном микроскопе марки «JEM-7» (Япония) или «BS-513» (ЧССР).

Культур ал ьные свойства Clostridium изучали при выра-щиваншгв средах Китт-Тароццн, СПЛ, СДЛ, мозговой среде с железом ..среде Виллиса и Хоббса (Willis, Hobbs, 1959), кровяном агаре (Лабмнская, 1978). С целью идентификации у выделенных протеолнтических анаэробов был изучен ряд физиологических свойств: разжижение желатины (Clarke, 1955); рост в лакмус-молоке (Beerens et al, 1962); ферментация различных источников углерода; редукция нитратов (Козлов, 1950); образование HsS; индола (Биргер, 1907); ацетон на (Федоров, 1957), липолитические свойства (Gon-zaller, Sierra, 1961; Лобырева, 1973; Dole, 1970).

Протеолитнческую активность выделенных культур Clostridium определяли по нарастанию количества .тирозина в процессе протеолиза растворов казеина и гемоглобина. Содержание тирозина определяли с реактивом Фолнна—Чио-кальтео (Polin, Ciokalten, 1927). Интенсивность окраски окрашенных растворов измеряли на спектрофотометре фирмы «Gilford» при длине волны света 570 им.

Трансформацию белковых вешеств анаэробами характеризовали по трем показателям: изменению содержания в питательной среде белков, пептидов и свободных аминокислот (Клнмовский к др., 1968). Определение белков и пептидов проводили по бнуретовой реакции (оптическую плотность растворов определяли при длине волны света 584-нм), свободные аминокислоты определяли по нингндрнновой реакции при длине волны 570 им. Оптическую плотность устанавливали на спектрофотометре фирмы «Gilford» с проточной кюветой (США). Разделение свободных аминокислот в культу-ральной жидкости проводили методом нисходящей хроматографии на бумаге {Пасхнна, 1954).

Определение трансформации белковых веществ методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПЛДГ) проводили по Мауреру (J971).

Разделение белковых веществ проводили в 7,5% ПЛЛГ (pH 8,3—8,9) в аппарате для электрофореза «модель 96» Реанал, Венгрия. По окончании электрофореза гелевые колонки фиксировали уксусной кислотой и окрашивали амидо-шварием для выявления позиций белков. Для определения интенсивности окраски белковых фракций окрашенные геле-

вые колонки спектрофотометрировали при 605 им на спектрофотометре «Gilford».

Из продуктов брожения белков определяли летучие жирные кислоты (ЛЖК) методом газовой хроматографии, основанном на их выделении из образца при паровой дистилляции, концентрации, перевода их в метиловые-эфиры и разделения газовой смеси на отдельные компоненты на газожнд-костном хроматографе «Chrom-41» с пламенно-ноннзацион-ным детектором на стальной спиралевидной колонке длиной 1 м. Твердый носитель — иеллит 545. Жидкая подвижная фаза—смесь реоплекса 400 с 2%-ным раствором фосфорной кислоты. Температура термостата — ¿0°. Идентификацию ЛЖК проводили по времени удерживания: пики метиловых эф про в ЛЖК располагаются в порядке возрастания молекулярного веса.

Определение спиртов в культуральной жидкости протео-литических клостридий проводили газохроматографически на ГЖХ ЛХМ 8 МД с пламенно-ионизационным детектором на двухметровой стальной колонке (Новгородова и др., 1978). Твердый носитель — целлит 545: Жидкая неподвижная фа-за-р|1'-оксидипропнонннтрил (10%). Газ-носитель — азот, скорость его 30 мл/мин. Температура хроматографии — 20°С. Идентификацию спиртов проводили по времени выхода стан* дартных алкилнитритов, которые готовили в аналогичных условиях, используя водные 0,1%-ные растворы спиртов.

При исследовании реакции Стикленда у протеолитических Clostridium определяли следующие метаболиты: аммиак — колориметрически-с реактивом Несслера и летучие жирные кислоты.

При изучении температурных характеристик рост культур фиксировали по оптической плотности, измеренной на спектрофотометре фирмы «Gilford» (США) при длине волны 570 им.

Для изучения роли протеолитических Clostridium в превращении белковых веществ в почве нами были проведены модельные опыты. Трансформация указанных соединений изучалась в дерново-подзолистой почве, черноземе и светло-каштановой почве. Схема опытов предусматривала варианты с инокулировзнием стерильной почвы чистыми культурами протеолитических Clostridium и с внесением различных бе-локсодержащих субстратов (казеина, альбумина животного происхождения, зеленой массы клевера, навоза). В качестве дополнительного источника органического вещества в некоторых вариантах вносили глюкозу. О разложении в почве белковых веществ судили по выделению N—NM« азота. Кроме того, проводили количественный учет - протеолитических Clostridium, определяли содержание свободных амнно-

кислот; летучих жирных кислот; измеряли рН. почвенной суспензии. Количественный учет проводили методом предельных разведений с предварительной обработкой почвы по Д. Г. Звягинцеву (1969) на модифицированной нами среде TGTSM-трипти казеин-глюкоза-тирозин-сульфит среде (Вее-rens, Garcia, 1970) -

Фракцию N—NH< азота определяли колориметрически с реактивом Несслера в вытяжке, полученной при обработке почвы 2%-иым раствором КС1 (Дринушкина, 1970).

Изучение состава свободных аминокислот в почве проводили после их экстракции 20%-ным этанолом и водой (Gilbert, Altman, 1966) методом бумажной хроматографии.

Определение рН проводили потепциометрнчески в почвенной суспензии, приготовленной при отношении почвы к воде 1 :2,5Ч

В ряде случаев при составлении калибровочных графиков данные обрабатывали на ЭВМ «Tfixtronic» фирмы «Gilford». (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение распространения протеолитических анаэробов■ . в почвах Советского Союза и выделение Clostridium в чистую культуру

Учет протеолитических анаэробов рода Clostridium в различных типах почв широтных зон СССР показал,, что они распространены во всех исследованных почвах, однако наибольшее их количество содержится в сероземе, наименьшее — в дерново-подзол истой почве. Выявлено, что имеется определенная тенденция к увеличению количества анаэробов с про-теолитическими свойствами с севера на юп Наши наблюдения согласуются с данными прежних исследований {Емцев, 1974), согласно которым по мере продвижения от севера к югу уменьшается численность сахаролитнческих (масляно-кислых) бактерий и, наоборот, происходит возрастание количества ацетоиобутиловых бактерий, которые, как известно, обладают протеолитической активностью. В исследованных нами почвах происходит увеличение количества анаэробов, обладающих протеолитической активностью, также в южных ■ почвах.

Известно, что в дерново-подзолистой почве вследствие , сравнительно низкой биогенности и слабой скорости минерализации растительных остатков происходит накопление большого количества легкодоступных соединений (типа углеводов) — это обусловливает преимущественное развитие масля-нокислых бактерий; однако именно эти условия оказываются

неблагоприятными для развития протеолитических анаэробов, которые требуют наличия белков и пептидов- для нормального роста (Кондратьева, Шведова, 19G1 а, б). Для почв южных районов характерна быстрая минерализация растительных остатков, что, в свою очередь, ограничивает развитие мэслянокнслых бактерий, а вследствие большей обогащен-ностн этих почв белком за счет высокой биогенности среди анаэробов доминирующее ' положение начинают занимать протеолнтнческие виды.

Изучение динамики численности протеолитических анаэробов в течение вегетационного периода показало возрастание их количества в августе-сентябре. Вероятно, такую тенденцию можно объяснить благоприятными условиями для их жизнедеятельности в этот период: накоплением раститель-ных.остатков, содержащих белковые вещества, обогащением почвы биологически активными соединениями н т. д.

Что касается влияния* окультуривания почвы на распространение протсолитических анаэробов, то, по нашим данным, в большинстве исследованных почв их численность выше . в окультуренных почвах.

Таким образом, протеолитические анаэробные бактерии рода Clostridium были обнаружены во всех исследованных намн почвах Советского Союза. Выявлена тенденция к увеличению численности этих организмов с севера на юг. Наименьшее их количество установлено в дерново-подзолистой почве, наибольшее — в сероземе.

Что касается изолирования протеодитическнх Clostridium из почвы, то имеющие место трудности при их выделении в чистую* культуру вызваны в большинстве случаев сложностью их культивирования, а также отсутствием селективных сред. Исследование пригодности предложенной нами селективной среды для протеолитических анаэробов (ССПЛ) показало, что представители сахаролитнческой группы Clostridium на ней не развиваются, а испытанные коллекционные культуры протеолитических Clostridium нечувствительны к введенным в среду ССПЛ антибиотикам. Коэффициент селективности предлагаемой среды при рассеве суспензии различных почв достигал 90,1—96,6%, что свидетельствует о ее высокой селективности.

Использование двух различных способов выделения в чистую культуру протеолитических Clostridium показало преимущество способа изолирования чистых культур путем посева почвенных разводок непосредственно на селективную ' среду.

Из накопительных культур нами были выделены 4 шта мма,

а 44 штамма протеолитических Clostridium изолировали пу-$

тем посева почвенных разводок непосредственно на селективную среду.

Таким образом, среда ССПЛ отвечала требованиям селективной среды и изолирование чистых культур лротеолнтиче-скнх Clostridium из почвы путем прямого посева почвенных разводок на нее позволило сравнительно легко выделить достаточно широкий набор протеолитических Clostridium . из различных почв.

Изучение некоторых морфологических, культуральных и физиологических свойств позволило выделенные культуры протеолитических анаэробов идентифицировать согласно определителю Берге (Bergey, 1974) и отнести их к соответствующим видам рода Clostridium: CK subterminale—2 штамма, CI, bifermentans— 8 штаммов, CI. sporogenes—13 штаммов, 01. lentoputrescens — 1 штамм, CI. ßhoni — 1 штамм, CI, putrificum— 2 штамма, CI. cadaveris—1 штамм, Ct. ace-tobutylicum—1 штамм. Всего было идентифицировано 29 штаммов. . :

Экологическая изменчивость протеолитических Clostridium;

Изучение протеолитической активности у выделенных культур Clostridium. Все исследованные 'культуры Clostridium выделяли в культуральную жидкость экзопротеазы, активность которых при стандартных условиях протеолиза, описанных в методической части, при расщеплении казеина (pH 8,0) варьировала от 31,3 до 56,3 ед/мл, а гемоглобина (pH 7,5)—от 9,2. до 26,4 ед/мл у разных бактерий. При сравнительном исследовании протеолитических свойств у культур CI. bifermentans н CI. sporogenes было выявлено различие по величине протеолитической активности {табл. 1). Обнаружено, что наиболее высокой протеолитической активностью обладают культуры, выделенные из светло-каштановой почвы и. серозема, наименьшая активность была у культур из дерн о во-подзол истой почвы.

Таким образом, по свойству продуцировать протеолити-ческие ферменты;клостридни из различных почв заметно отличаются друг от друга.

Трансформация- белковых веществ- протеолмткческимн Clostridium. Нами была изучена трансформация белковых веществ у выделенных из различных почв протеолитических анаэробов. Установлено, что рост культур Clostridium сопровождался снижением уровня белков в среднем в 10—15 раз по сравнению с исходным количеством, однако у штаммов С!, bifermentans,' выделенных из дер ново-подзолистой почвы и чернозема, и одного штамма CI. sporopenes Из чернозе-

Таблица 1

Протеолиткческаа активность выделенных культур Clostridium *

• (ед/мл культурэльиого фильтрата)

Почва

Субстрат

казеин pH 8.0

гечоглобнн pH 7,5

Cl.bifermentans

Дерново-подзолистая Чернозем

Светло-каштановэ я . Серозем ....

Дерново-подзол иста я Чернозем . . , . Светло-каштановая . Серозем.....

3-1,7 39, ( 53.7 53,1

С), sporogenes

31,3 46.8 54.6 56.3

[1,2 17.3 21,0 22.3

9.2 16,7 23.6 26.1

* Усредненные данные по ряду штаммов.

ма отмечена незначительная убыль указанных веществ. Бактерии из южных почв активно трансформировали данные соединения.

Концентрация пептидов у большинства культур превышала контрольный уровень в среднем в 5—10 раз. Отмечен незначительный прирост этих соединений у вышеуказанных микроорганизмов со слабой протеолитической активностью, а также у ряда Clostridium, обладающих высокой протеолитической активностью. В последнем случае это связано со значительной пептидазной активностью бактерий.

Определение количества свободных аминокислот, образующихся при гидролизе белков и пептидов, показало их значительное накопление у большинства исследуемых культур, но «спектр» свободных аминокислот зависел от протеолитической активности и от специфических потребностей в аминокислотах.

Таким образом, установлено, что трансформация белковых веществ протеолитическими: Clostridium сопровождается значительной убылью концентрации белков в среде, приростом пептидов и накоплением свободных аминокислот. При этом интенсивность гидролиза белковых соединений зависит не только от протеолитической активности данного вида анаэробных бактерий, но в значительной степени определяется типом почвы, из которой была выделена культура Clostridium.

Изучение трансформации белковых веществ протсолитн-ческими клостридиями методом электрофореза в полиакри-. ламидном геле (ПЛЛГ) показало, что бактерии из дерново-подзолистой почвы и чернозема обладали способностью к неглубокому протеолнзу и образовывали много пептидов и других белковых фрагментов, в то время как у культур из светло-каштановой почвы и серозема гидролиз указанных соединений характеризовался достаточной глубиной, дающей мало пептидов и много'низкомолекулярных продуктов. Интенсивность трансформации белковых веществ у одних и тех же штаммов Clostridium также изменялась в зависимости от типа почвы. Самый слабый протеолиз белковых веществ отмечен в культуре CI. sporogenes из дерново-подзолистой почвы,.в то время как у того же микроорганизма из серозема он достигал наибольшей величины.

Исследование окислительно-восстановительной реакции Стикленда. Многие виды Clostridium получают большую часть энергии в процессах катаболизма пары аминокислот посредством реакции Стикленда (Stickland, 1934, 1935; Бар-кер, 1963). При исследовании реакции Стикленда у культур CI. sporogenes, выделенных из разных почв, нами обнаружены некоторые различия протекания данной реакции. Так, у штаммов из дерново-подзолистой почвы и чернозема из метаболитов найдены муравьиная и масляная кислоты и аммиак. Иными н более сложными были соотношения продуктов данной реакции у штаммов, выделенных из светло-каштановой почвы и серозема, у которых, кроме обнаруженных выше продуктов, была выявлена и уксусная кислота. Следовательно, культурн CI. sporogenes, изолированные из разных почв, характеризуются различным соотношением продуктов реакции Стикленда, а также отличаются по образуемым метаболитам.

Изучение продуктов брожения белков протеолитическими Clostridium. В наших исследованиях все изученные культуры образовывали летучие жирные кислоты, в составе которых преобладала уксусная кислота в отличие от сахаролнтиче-скнх видов, у которых, как известно, главным продуктом является масляная кислота (Lewis et al., 1967). Определение летучих жирных кислот у культур CI. sporogenes, CI, bifer-mentans, CL subtcrminale, выделенных из различных типов почв, показало, что культуры из дер но во-подзол истой почвы и чернозема образуют меньше уксусной и больше масляной кислоты по сравнению с культурами, полученными нз светло-каштановой почвы и серозема, у которых, наоборот, в составе летучих кислот возрастает количество уксусной кислоты и уменьшается доля масляной. При изучении спиртов у штаммов CI. sporogenes в наибольшем количестве выявлен этанол,

а также незначительные количества бутанола и нзобутанола. Содержание этанола было больше у штаммов из южных почв; штаммы из северных почв образовывали больше бутанола.

Влияние температуры на рост протеолитических анаэробов. Обнаружено, что температура оказывает большое влияние на рост изученных бактерий, и отношение к температуре как к климатическому фактору меняется у культур Clostridium в зависимости от географических условий, что было ранее также установлено для представителей сахаролитиче-ской группы клострндий (Емцев, 1971).

Таким образом, изучение экологической физиологии различных штаммов протеолитических анаэробных бактерий рода Clostridium — CI, sporogenes и CI. bifermentans, выделенных нз разных типов почв СССР, показало, что под влиянием почвенно-климатических условий их свойства изменяются. Это дает основание говорить о существовании экологических рас указанных микроорганизмов.

Трансформация белковых веществ в почве лротеолнтнческнми Clostridium

В литературе отсутствуют данные о жизнедеятельности и участии протеолитических Clostridium в трансформации белковых веществ в почве. Нами было исследовано разложение различных белоксодержащих субстратов протеолитиче-скими анаэробными бактериями в условиях модельных опытов.

Трансформация протеолитнческими Clostridium очищенных белковых'препаратов в почве. Как видно из таблицы 2, в вариантах с инокуляцией CI. sporogenes гидролиз указанного белка происходит наиболее интенсивно в светло-каштановой почве, в меньшей степени в дер ново-подзол истой почве. Наибольшее высвобождение фракции N—NH* азота наблюдается при внесении в почву альбумина по фону инокуляции, причем опять самая интенсивная аммонификация происходит в светло-каштановой почве.

. Следовательно, протеолитические'Clostridium в почве осуществляют протеолнз белка, причем в различных почвах он происходит с разной интенсивностью. Тип почвы оказывает существенное влияние на активность протеолнза, а также на соотношение продуктов брожения белков у протеолитических анаэробных бактерий. Интенсивность гидролиза белка в почве возрастает по мере продвижения с севера на юг: наиболее слабо гидролиз белка протекает в дерново-подзолистой почве, наиболее интенсивно в светло-каштановой почве.

Разложение альбумина указанными бактериями сопро-12

Таблица й

Накопление N—N11« азота в различных почвах при трансформации альбумина протеолитическими анаэробами (в мг на 100 г сухой почвы)

Число дней после ззклзлки опита

Вариант опыта 3 10

Дерново-подзолистая почва

1. Почва (контроль) ....

2. Иочаа+С1, крогодспея . . .

3. Пичва 4-аль0уч(ш (контроль) '4. Почва+альЙумнн+С!. &рого£с

пе$..........

4.51 9,23 18,00

71,42

Саетло-каштановая почва:

1. Почва (контроль) ....

2. Почва+С1. sporogenes . . ,

3. Почва + альОумин (контроль)

4. Почва+альбумин+Cl, sporoge

tics :.........

2,91 15.23 13,01

89,67

4,51 13,18 18,90

80,17

2.91 16,23 13.91

110,79

вождается образованием летучих жирных кислот: муравьиной, уксусной, в некоторых случаях масляной, однако их количество увеличивалось при внесении в почву глюкозы и достигало наибольшей величины в дерново-подзолистой почве. Следовательно, С1. зрогодепез, изолированный из дерново-подзолистой почвы, обнаруживает большую бродильную активность по сравнению с культурами, выделенными из более южных почв.

Обогащение почвы казенном с последующей инокуляцией культурами С1. ЫГегтеШапз, полученными из'различных типов почн, показало, что наиболее энергично протеолиз указанного субстрата осуществляют бактерии, изолированные из южных почв {светло-каштановой и серозема), при этом высвобождается больше X—N114 азота и свободных аминокислот.

Влажность оказывала существенное влияние на трансформацию казенна: менее энергично она проходила при уровне влажности, соответствующей 60% от полной влагоемкости, и достигала максимальной величины в условиях полного затопления.

Разложение растительного материала.с высоким содержанием азота(клевера). Опыты показали, что лротеолитические клостридни в почве гидролизуют белковые вещества, входящие в состав клевера. Процесс разложения данного растения характеризуется аммонификацией его протеинов. Интенсивность трансформации белковых соединений клевера куль-

турами CI. sporogenes зависела от типа почвы, из которой был» изолированы указанные бактерии. Наибольшую про-теолитическую активность в почве обнаружили культуры, выделенные из серозема, наименьшую — культуры из дерново-подзолистой почвы. Протеолиз белковых веществ сопровождался подщелачивай и ем почвы, образованием свободных аминокислот и их дезаминированием, продукцией летучих жирных кислот, главным образом уксусной!

Участие протеолитических Clostridium - в разложении_ белков органического удобрения, (навоза). Наряду с растительным материалом источником белкового азота в почве являются также органические удобрения (навоз). Нашими исследованиями установлена способность CI. sporogenes разлагать белковые вещества, входящие в состав навоза. Температура оказывала существенное влияние на трансформацию белко* вых компонентов навоза. Наибольшая их аммонификация наблюдалась при температуре 37° и она практически отсутствовала при 5". При 37° С отмечена и наибольшая численность протеолитических клострндий. Обнаружено быстрое превращение аминокислот в почве, образующихся при гидролизе белков навоза. Разложение навоза протеолитическими кло-стрндиями сопровождалось образованием уксусной кислоты в почве.

Резюмируя результаты проведенных опытов, следует отметить, что хотя масштабы разложения белковых веществ в модельных опытах отличаются от масштабов соответствующих явлений в естественных условиях, однако имеются все основания считать, что данная группа микроорганизмов играет большую роль в трансформации органических азотсодержащих соединений в почве.

В ы воды

1. Изучено распространение протеолитических анаэробных бактерий рода Clostridium в основных типах почв СССР. Указанная группа микроорганизмов обнаружена во всех исследованных почвах. Отмечена тенденция к увеличению численности в почвах протеолитических анаэробов с севера на юг. Их количество было наименьшим в дерново-подзолистой почве и наибольшим в сероземе.

2. Из различных почв на предложенной нами селективной среде (ССПЛ) выделены разнообразные представители про-теолитической группы Clostridium, активно трансформирующие белковые вещества. Полученные культуры были идентифицированы как-Ct. sporogenes, CI. bifermentans, CI. putrifi-cum, CI. subterminale, CI, ghoni, CI. lentoputresccns, CI, ca-daveris, CI. acetobutylicum.

3. У выделенных культур протеолптнческих Clostridium— CI. sporogenes и CI. bifermentans впервые установлена экологическая изменчивость, обусловливающая образование экологических рас. Показано изменение ряда физиологических особенностей протеолитических анаэробов в зависимости от почвенно-климатических условий.

Наиболее высокой протеолитической активностью характеризуются культуры 01. sporogenes и Ci; bifermentans, изолированные из светло-каштановой почвы и серозема, наименьшая активность была у культур, полученных из дерново-под-золнетой почвы.

Обнаружено; что Clostridium из дер ново-подзолистой почвы и чернозема осуществляли неглубокий протеолиз белков и образовывали много пептидов и других белковых фрагментов, в то время как у культур анаэробов из светло-каштановой почвы и серозема гидролиз указанных соединений характеризовался глубиной, дающей мало пептидов и много низкомолекулярных продуктов.

Культивирование CI. sporofjenes и CI. bifermentans при различных температурах показало, что у бактерий из южных почв максимальная протеолитическая активность наблюдается при выращивании их при более высоких температурах, в то время как у культур из северных почв наибольшая, активность протеаз обнаруживается при более низких значениях температур.

4. Впервые установлено различие в продуктах реакции Стиклеида.а также изменение их соотношения у культур Ol. sporogenes, выделенных из различных типов почв.

5. Обнаружено, что культуры Ol. sporogenes, 01. bifermentans и Ol. subterminale, изолированные из дерново-подзолн-стой почвы и чернозема, при брожении белков продуцируют меньше уксусной и больше масляной кислоты по сравнению с теми же микроорганизмами, полученными из светло-каштановой почвы и серозема, у которых, наоборот, в составе летучих кислот возрастает количество уксусной кислоты и уменьшается доля масляной.

У культур CI. sporogencs в наибольшем количестве выявлен этанол, содержание которого было больше у штаммов из южных почв, штаммы из северных почв образовали больше бутанола.

, 6. Отношение к температуре как к климатическому фактору меняется у протеолитических анаэробов в зависимости от географических условий, что отражается на их температурных характеристиках. .

7. В условиях модельных опытов впервые выявлена способность протеолитических Clostridium разлагать в почве

органические азотсодержащие вещества (нативные белковые вещества, растительные остатки, навоз).

Показано, что интенсивность гидролиза белков в почве возрастает по мере продвижения с севера на юг: наиболее слабо гидролиз белка протекает в' дерново-подзолистой почве, наиболее интенсивно — в светло-каштановой.

Соотношение продуктов протеолиза белков {аммиачного азота, свободных аминокислот, летучих жирных кислот) у анаэробных Clostridium существенно различается в разных типах почв..

Обнаружено, что на разрушение белковых веществ анаэробами в почве большое влияние оказывают влажность и температура.

8. Выявлено, что процесс разложения белковых вешеств клевера в почве характеризуется их аммонификацией, причем интенсивность разложения указанных соединений протеоли-тическнми Clostridium определяется типом почв, из которых они были изолированы. Наименьшую протеолити ческую активность в почве обнаруживали культуры, выделенные из дерново-подзолистой почвы и чернозема, наибольшую — культуры из светло-каштановой почвы и серозема.

9, Изучение участия анаэробных протеолитических бактерий (Ct. sporogenes) в трансформации белковых компонентов органического удобрения (навоза) .в почве показало, что интенсивность разложения указанных соединений зависит от температуры — наиболее энергично процесс аммонификации протекал при ЗУС и практически отсутствовал при 5е. Разложение внесенного в почву навоза сопровождалось образованием летучих жирных кислот.

Материалы диссертации опубликованы в работах

1. Распространение протеолитических анаэробных бактерий рода Clostridium в зональных почвах (в соавторстве). Известия ТСХА, 1978, вып. 5, 124—131.

2. Анаэробные бактерии рода Clostridium как индикаторы типа почв (в соавторстве). В сб. «Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйственных культур», 1978, Вильнюс, 81.

3. Выделение протеолитических Clostridium из объектов внешней среды (в соавторстве). В сб. «Вклад молодых специалистов в повышение качества и эффективности производства в маслоделии:и сыроделии». 1978, Ярославль, 103—104,

vi G9086 22А'—79 г. Обьем 1 п. л. Заказ 873._Тираж 100

Типография Мскжо&скоЛ с.-х. академии им. К. Л. Тимирязева 127550, Москва П-530, Тимирязевская ул., 44