pH-индуцируемое образование покоящихся форм микобактерий и роль аденилатциклазы в их реактивации

Кудыкина, Юлия Константиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
pH-индуцируемое образование покоящихся форм микобактерий и роль аденилатциклазы в их реактивации
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "pH-индуцируемое образование покоящихся форм микобактерий и роль аденилатциклазы в их реактивации"

на правах рукописи

005004694 ^

Кудыкина Юлия Константиновна

рН-ИНДУЦИРУЕМОЕ ОБРАЗОВАНИЕ ПОКОЯЩИХСЯ ФОРМ МИКОБАКТЕРИЙ И РОЛЬ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ В ИХ РЕАКТИВАЦИИ

специальность 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 1 ДЕК 2011

Москва-2011

005004694

Работа выполнена в лаборатории биохимии стрессов микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А. Н. Баха

РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор А. С. Капрельянц

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор О. В. Королева доктор биологических наук, профессор Л. П. Блинкова

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов

им. Г. К. Скрябина РАН

Защита состоится » декабря 2011 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А. Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33. стр.1.

Автореферат разослан «ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических # ¡^^(к1- * *

наук / 4 Г 7 А. Ф. Орловск!

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. По данным ВОЗ, каждый третий человек на Земле латентно инфицирован возбудителем туберкулеза - Mycobacterium tuberculosis (МТБ), но до сих пор единого понимания природы латентного состояния и механизмов, посредством которых оно регулируется, не существует. Известно, что клетки МТБ могут сохраняться в организме человека в течение длительного периода времени в особом физиологическом нерепликативном (покоящемся) состоянии. Покоящиеся клетки МТБ, которые являются, как полагают многие авторы, причиной латентного туберкулеза, до сих пор не были выделены из тканей хозяина, так как их количество в инфицированных органах или тканях может быть крайне мало. Кроме того, покоящиеся клетки микобактерий могут быть условно «некультивируемыми» (т.е., не способными образовывать колонии на плотной среде, в норме обеспечивающей рост вегетативных клеток) и поэтому не обнаруживаются при посевах клинических образцов.

При попадании в организм микобактерии захватываются клетками иммунной системы - альвеолярными макрофагами. В активированных макрофагах микобактерии подвергаются воздействию активных форм кислорода и оксида азота, гидролитических ферментов лизосом, а также низких значений рН, но при этом полной гибели возбудителя туберкулеза не происходит. Более того, микобактерии способны выживать в неблагоприятных условиях внутренней среды макрофага, в том числе, при рН 6.1 - 6.5, возможно, переходя в состояние покоя [Biketov et al., 2000]. До сих пор остается неясным, какой из факторов может запускать процессы, приводящие к переходу из активного состояния в покоящееся. Поскольку вегетативные клетки микобактерий имеют высокую чувствительность к низким значениям рН окружающей среды, можно предположить, что снижение рН среды играет роль своеобразного триггера в процессах перехода клеток МТБ в состояние низкой метаболической активности или покоя. Для подтверждения этого предположения необходимы эксперименты in vitro, моделирующие адаптацию микобактерий к таким условиям. При изучении адаптации вегетативных клеток к стрессам и их перехода в пост-стационарных культурах в состояние покоя, целесообразно также учитывать скорость, с которой клетки бактерий подвергаются неблагоприятным внешним воздействиям. Так, в модели перехода микобактерий в нерепликативное состояние в условиях гипоксии (модель Вэйна) было показано, что быстрое истощение кислорода в культуре

приводило к гибели большинства клеток МТБ, в то время как постепенное развитие гипоксии способствовало их переходу в покоящееся состояние без утраты культивируемое™ [Wayne et al., 1982]. Аналогично показанному в модели Вэйна, мы могли ожидать переход МТБ в состояние покоя при постепенном снижении рН среды.

Одним из наиболее важных аспектов, касающихся латентности туберкулеза, является изучение причин спонтанной активизации латентной формы туберкулеза с появлением жизнеспособных клеток возбудителя в органах и тканях. Ранее в данной лаборатории было обнаружено, что клетки микобактерий секретируют в среду культивирования белок Rpf, который позволяет реактивировать покоящиеся формы (ПФ) и стимулирует размножение вегетативных клеток [Kaprelyants et al., 1996; Mukamolova et al., 1998].

Однако, для реализации Rpf-зависимой активации покоящихся клеток МТБ, необходимо наличие стартовой концентрации Rpf, синтез которого в покоящихся клетках, по-видимому, отсутствует. Нельзя исключить, что в этих условиях индуктором реактивации являются другие, более простые факторы, являющиеся продуктом метаболизма микобактерий. Однако, до сих пор такие индукторы не обнаружены. Известно, что клетки МТБ, находясь в организме, используют липиды хозяина в качестве источника углерода [Miner et al., 2009], поэтому поиск индукторов реактивации липидной природы нам представлялся перспективным.

На основании изложенных данных были сформулированы следующие цели и задачи данного исследования.

Цели и задачи работы. Целями данного исследования являлись изучение ответа микобактерий (М. smegmatis и М. tuberculosis) к постепенно развивающемуся кислотному стрессу, с акцентом на возможность формирования покоящихся клеток с измененной морфологией, а также поиск низкомолекулярных индукторов реактивации ПФ липидной природы. В соответствии с целями были поставлены следующие задачи:

1. Изучить возможность образования ПФ М. smegmatis и М. tuberculosis в условиях постепенного снижения рН окружающей среды в стационарной фазе.

2. Провести микробиологическую и биохимическую характеристики полученных форм бактерий.

3. Осуществить поиск новых индукторов реактивации ПФ микобактерий липидной природы и выявить механизмы их действия.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые показано, что адаптация микобактерий М. smegmatis и М. tuberculosis в условиях постепенного снижения рН приводит к образованию специализированных структур, которые представлены укороченными овоидными формами с утолщенной клеточной стенкой. По сохранению жизнеспособности, устойчивости к повреждающим воздействиям, особенностям строения овоидные формы диких штаммов М. smegmatis и М. tuberculosis могут быть отнесены к покоящимся формам бактерий.

Модель рН-индуцируемого образования НК клеток с участием возбудителя туберкулеза, бактерии М. tuberculosis, разработанная в ходе настоящего исследования, представляет особый интерес и может считаться уникальной, поскольку в мировой литературе до сих пор не упоминалось о возможности образования «некультивируемых» клеток (НК) М. tuberculosis в условиях постепенного закисления в пост-стационарной фазе. Кроме того, было показано, что такие формы обладают инфекционным потенциалом in vivo.

Впервые найдено, что свободные ненасыщенные жирные кислоты (СНЖК) и цАМФ в низких концентрациях являются факторами реактивации НК М. smegmatis.

В ходе настоящей работы впервые было установлено участие мембраносвязаной аденилатциклазы М. smegmatis MSMEG_4279 в процессе реактивации микобактерий жирными кислотами.

Впервые предложена схема, в которой реактивация НК М. smegmatis под действием СНЖК осуществляется с помощью цАМФ-зависимого синтеза белков Rpf.

Практическая значимость работы. Предложенная модель является новым инструментом для изучения механизмов образования ПФ микобактерий и оценки активности генов, вовлеченных в процесс перехода микобактерий в покоящееся состояние. С другой стороны, полученные покоящиеся клетки микобактерий могут быть использованы для тестирования новых антибактериальных препаратов, эффективных в отношении реактивирующихся ПФ микобактерий, персистирующих в организме хозяина. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих научных конференциях: IV съезд микробиологов Узбекистана,

Ташкент, 2008; IV международная молодежная школа-конференция, Москва, 2008; Зй Европейский конгресс микробиологов (FEMS), Гётеборг, Швеция, 2009; Конференция Европейского общества молекулярных биологов (ЕМВО), Барселона, Испания, 2010; Зя Конференция Европейского общества молекулярных биологов (ЕМВО), Вена, Австрия, 2011. Проект «Биологическая система для тестирования новых соединений против латентного туберкулеза», выполненный в рамках данного исследования, был поддержан Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (конкурс У.М.Н.И.К.).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК, и 5 тезисов в материалах конференций.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, списка цитируемой литературы ссылка). Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит J/Л^

рисунков и таблиц.

Сокращения, принятые в тексте. КОЕ - колониеобразующие единицы, НВЧК - наиболее вероятное число клеток, OD6oo - оптическая плотность при длине волны 600 нм, МКР - метод конечных разведений, НК - «некультивируемые» клетки, состояние, ПФ - покоящиеся формы бактерий, КОК - контрастные овоидные клетки, Rpf - фактор, способствующий реактивации ПФ бактерий (от Resuscitation promoting factor), МТВ - Mycobacterium tuberculosis, PI -йодид пропидия, флуоресцентный краситель, детектирующий поврежденные клетки, СНЖК - свободные ненасыщенные жирные кислоты, цАМФ -циклический аденозинмонофосфат.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы.

В обзоре литературы рассматривается явление покоя микобактерий как процесс, лежащий в основе латентной формы туберкулеза. В связи с чем подробно рассматриваются стрессовые факторы и стратегии выживания МТБ в организме хозяина, освещаются некоторые молекулярные механизмы покоящегося состояния и выхода из него. Делается акцент на назначение рН среды как стрессового фактора, и описываются некоторые механизмы адаптации микобактерий к кислым значениям рН среды.

Глава 2. Материалы и методы исследования. Выращивание бактериальных культур. В качестве объектов исследования были выбраны бактерии Mycobacterium smegmatis штамм mc2 155 (АТСС 700084) и Mycobacterium tuberculosis штамм H37Rv, а также ряд мутантных штаммов (табл. 1).

Таблица 1. Штаммы Mycobacterium smegmatis и плазмиды, использованные в исследовании.

Сокращенное название штамма Краткое описание Источник

Wt 2 Штамм MC 155 дикого топа

Hlp-0 Штамм Hlp-0 с инактивированным геном hip путем вставки канамициновой кассеты Предоставлен Томасом Диком [Leeefa/, 1998]

AdevR Мутант AdevR с инактивированным геном devR двухкомпонентной системы devSR предоставлен Маргарет Смелдерс [Кеег et all, 2001]

ДАс Мутант ДАс с делетированным геном MSMEG_4279, маркированный геном устойчивости к канамицину получен в ходе данной работы

ДАс + pMindAc Мутант ДАС + pMindAc, штамм с делетированным геном MSMEG_4279, трансформированный плазмидой, несущей pMindAc получен в ходе данной работы

ДАС + pAGR Мутант ДАС + pAGR, штамм с делетированным геном MSMEG_4279, трансформированный плазмидой, несущей Rpf получен в ходе данной работы

pMind Плазмида устойчивости к канамицину и гигромицину Blokpoel etal., 2005

pAGH Плазмида устойчивости к канамицину и гифомицину Mukamolova et at., 2002

pAGR Дериват pAGH, несущий ген rpf Shleeva etal., 2004

pMindAc Дериват pMind, несущий ген MSMEG 4279. Получен в ходе данной работы

Mycobacterium smegmatis. Клетки первоначально выращивали на среде Nutrient Broth (NB) («Himedia», Индия) при 37°С в течение 24 часов с перемешиванием (220 об/мин). Для получения ПФ инокулят (1 мл) вносили в 100 мл среды Сатона [Connell, 1994], с начальным значением рН 6.0 и выращивали при 37°С на качалке (220 об/мин) в течение 16 - 20 сут до установления постоянного значения рН среды. Для получения гомогенно растущей культуры в среду добавляли 0.05% раствор Твина-80. Далее

выращенные культуры хранили при комнатной температуре в пластиковых пробирках с закручивающимися пробками в течение 1-3 мес, периодически перемешивая и отбирая пробы для посева.

Для получения «некультивируемых» форм клетки выращивали в течение 72 час на модифицированной среде Hartmans-de Bont (HdB), содержащей стерильный 0,5% раствор БСА (Cohn Analog) («Sigma», США).

При выращивании штаммов, полученных трансформацией плазмидами, в среды роста добавляли гигромицин в концентрации 50 мкг/мл, в отдельных случаях - канамицин в концентрации 10 мкг/мл.

Mycobacterium tuberculosis штамм H37Rv первоначально выращивали в течение 12-15 суток при 37° С на качалке (200 об/мин) в колбах объемом 100 мл, содержащих 40 мл синтетической среды Сатона и 0.05% раствора Твин-80 с добавлением БСА (Cohn Analog, «Sigma», США) - 50 мг/л, глюкоза - 20 мг/л и NaCI - 8,5 мг/мл [Connell, 1994]. Затем культуру пересевали на свежую модифицированную среду (Сатон). Когда pH среды в пост-стационарных культурах МТБ достигал 6.0-6.2 (37-45 сут), выращенные культуры переносили в пластиковые пробирки с закручивающимися пробками (50 мл) и хранили при комнатной температуре в течение 3 мес, периодически перемешивая и отбирая пробы для посева. Чтобы избежать закисления среды, к культурам добавляли 20 мМ MOPS. Для того чтобы увеличить долю покоящихся форм в образце, осадок с клетками ресуспендировали в супернатанте, полученном при фильтровании культуральной жидкости (60-100-суточных культур МТБ) через 0.2 мм фильтр (Millex Millipore). Реактивация «некультивируемых» (НК) клеток. Для оценки числа реактивировавшихся клеток использовали метод конечных разведений (МКР), заключающийся в приготовлении серии последовательных 10-кратных разведений в свежей питательной среде с разбавлением бактериальной суспензии до концентрации 10 клеток в мл, и далее инкубировали при 37°С с перемешиванием. При подсчете наиболее вероятного числа (НВЧ) реактивированных клеток учитывали лунки/пробирки с видимым бактериальным ростом. Значение вероятного количества реактивируемых клеток в 1 мл определяли по стандартным статистическим таблицам [de Man, 1975].

Включение радиоактивной метки. Уровень синтеза РНК и ДНК в клетке определяли по включению меченого по водороду урацила или тимидина. К суспензии клеток (1 мл) добавляли 1 мкл [5,6-3Н] урацила или тимидина (в виде растворов с радиоактивностью метки 40 Мбк/мл в 50% этаноле) и

инкубировали 4 часа при 37°С при перемешивании. Клетки отмывали 10% ТХУ и 96% этанолом на стеклянных фильтрах GFC («Whatman»), которые затем помещали в сцинтилляционную жидкость. Уровень радиоактивности измеряли на счетчике LS6500 «Beckman Coulter» (USA). Определение внутриклеточного уровня АТФ и цАМФ. Для получения клеточных экстрактов клетки микобактерий, осажденные центрифугированием при 3000 д, суспендировали в небольшом объеме ДМСО (0.5 мл) и разрушали в дезинтеграторе BeadBeater («BioSpec Products», США) с циркониевыми бусами (0.2 мл). Неразрушенные клетки осаждали центрифугированием в течение 2 мин при 3000 д. Содержание АТФ в клеточном экстракте измеряли по интенсивности биолюминесценции люциферин/люциферазы на люминометре ЛЮМ-1. Измерения проводили в трех повторностях, используя 0.02 мл анализируемого раствора и 0.18 мл АТФ-реагента (ApoSENSOR™ ATP Cell Viability Assay Kit, BioVision). Концентрацию цАМФ в клетке проводили прямым иммунологическим анализом при помощи cAMP Direct Immunoassay Kit («BioVision»).

Глава 3. Основные результаты и их обсуждение.

3.1. рН-индуцируемое образование покоящихся форм микобактерий.

Было обнаружено, что культивируемость на плотных средах (КОЕ/мл) метаболически активных и пост-стационарных культур М. smegmatis и МТБ менялась синхронно с изменением рН среды роста. Эксперименты показали, что клетки МТБ начинают делиться, когда рН среды достигает значения 6.4, а клетки М. smegmatis - при рН 6.0. По-видимому, существует пороговое значение рН среды, ниже которого клетки микобактерий не могут размножаться. При дальнейшем культивировании клеток микобактерий происходило плавное снижение рН до 5.8 - 5.7 у М. smegmatis и до 4.8 - 5.0 у МТБ (рис. 1). Такие изменения значений рН среды связаны, вероятно, с активным метаболизмом вегетативных клеток. Синхронно с закислением среды в пост-стационарной фазе в культурах микобактерий дикого типа наблюдали появление контрастных овоидных клеток (КОК) с измененной морфологией, содержание которых увеличивалось по мере дальнейшего культивирования от 12% до 45% (рис. 1).

В условиях длительного хранения при комнатной температуре в культурах М. smegmatis при рН среды 6.1-5.8 наблюдали снижение численности КОЕ на 1.5 порядка (до 108 КОЕ/мл) через 60 сут инкубации (рис.

1 А) и до 104 - 105 КОЕ/мл через 1 год инкубации. Следует отметить, что численность жизнеспособных клеток в 30-60 суточных популяциях М. этедтаИз, выявленная методом предельных разведений (НВЧК) составляла 5хЮ8-Ю10 кл/мл и оказалась на 1 - 2 порядка выше титра колониеобразующих клеток (КОЕ) (рис. 1 А). Отсутствие Р1-положительных КОК в культуре МТБ в длительной пост-стационарной фазе подтверждало сохранение их потенциальной жизнеспособности, несмотря на то, что наблюдалось резкое снижение числа КОЕ (рис. 1 Б).

О 10 20 30 40 50 60 Время инкубации, сут

ФАЗА 1 ФАЗА 2

10- ко:

07. 2% 15% 23% 40% 45% 47% 47%

9- д. ^ л: НВЧК 2

8- I 4 4 I i

с s

10*

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Время инкубации, сут

Рис. 1. Изменение значения рН среды, численности жизнеспособных клеток (КОЕ и НВЧК) и доли КОК в культурах М. smegmatis (А) и М. tuberculosis (Б) при культивировании на среде Сатона со стартовым рН 6.0. Шкала КОК - прирост доли клеток с измененной морфологией, КОК - контрастные овоидные клетки. Фаза-1 - инкубация на качалке при 37 С, Фаза-2 - инкубация при комнатной температуре без перемешивания. НВЧК 1 - количество жизнеспособных клеток, оцененное с помощью МКР;

НВЧК 2 - количество жизнеспособных клеток, оцененное с помощью МКР в супернатанте активных культур. Представленные данные усреднены по

результатам пяти

экспериментов. Приведены среднеквадратичные отклонения.

Аналогично M. smegmatis, 60-суточные культуры МТБ, содержащие КОК, в которых число КОЕ достигло нуля, могли самореактивироваться при культивировании в жидкой среде Сатона ("спонтанная реактивация") до 3 *108 клеток/мл (рис. 1 Б, НВЧК 1). Однако при дальнейшей инкубации культур МТБ доля клеток, которые были способны к возобновлению роста в реактивирующей среде, приближалось к нулю через 180 суток культивирования. Для реактивации таких клеток требовалось добавление супернатанта (СН), взятого из активно растущих культур МТБ. Число клеток, восстановленных в присутствии СН, практически не менялось на протяжении 180 сут культивирования (рис. 1 Б, НВЧК 2).

При реактивации клетки из овоидной формы переходят в палочковидную. Анализ последовательностей 16S РНК КОК после реактивации показал 100% идентичность клеткам М. smegmatis и М. tuberculosis, соответственно.

Для того чтобы выяснить, насколько формирование овоидных клеток связано с закислением среды и скоростью закисления, в культуры М. smegmatis стационарной фазы вносили буфер MOPS или MES (10-50 мМ, рН 7.5) для обеспечения меньшего снижения величины рН и более плавного или более резкого понижения его значений на 0.5 - 2 единицы за период 7-14 сут инкубации (табл. 2).

Таблица 2. Зависимость образования овоидных клеток M. smegmatis от уровня закисления среды в пост-стационарной фазе, 14 сут культивирования.

Модификация условий культивирования* ДрН" Доля овоидных форм"* Доля переходных клеточных форм"*

S6 2.2 45 25

S6 + MOPS 50 мМ 0.5 5 0

S6 + MOPS 25 мМ 1.0 15 5

S6 + MOPS 10 MM 1.5 30 10

S6 + MES 10 мМ 2.0 35 30

S7 1.2 10-15 5

S7 + MOPS 50 мМ 0.4 3 0

* Буфер вводили в среду Сатона (Б6 - рН 6.0, Б7 - рН 7.0) на 7 сут инкубирования, когда рН среды достигал 7.5, для того чтобы снизить уровень закисления среды.

" ДрН - разница между максимальным значением рН среды (7 сут) и минимальным значением (14 сут).

*** Доля покоящихся клеток по результатам прямых микроскопических подсчетов числа овоидных клеток и переходных клеточных форм, предшествующих овоидным формам (см. рис. 4). Относительная ошибка составляет 5%.

На стандартной среде Сатона с начальным значением рН 6.0 в условиях постепенного снижения рН на 2.2 единицы после 14 суток культивирования доля овоидных форм составляла 45%. Было обнаружено, что при внесении

буфера MOPS понижающейся молярности увеличение числа образующихся овоидных форм коррелировало со степенью снижения рН. Высокая доля овоидных клеток (35%) в культурах дикого штамма M. smegmatis наблюдалась в условиях постепенного снижения рН на 2 единицы при внесении буфера MES (10 мМ). Отметим, что на стандартной среде Сатона с начальным значением рН 7.0 доля овоидных форм в культуре на 14 сут инкубирования оказалась значительно ниже, а именно, 10-15%, кроме того, при дальнейшем культивировании начинался вторичный рост, который приводил к повышению рН среды. На этом фоне внесение буфера MOPS (50 мМ) не способствовало увеличению доли овоидных форм. В случае, когда значение рН среды резко снижалось на 2 единицы за счет внесения в культуру (7 сут) кислого буфера MES (50 мМ, рН 3.5), овоидные формы M. smegmatis не обнаруживались даже на 14 сут инкубации, и клетки в дальнейшем лизировапись.

Таким образом, образованию «некультивируемых» контрастных овоидных форм микобактерий M. smegmatis и М. tuberculosis способствует постепенное закисление среды в стационарных культурах до значений рН 4.8 - 5.5 с последующей их статической инкубацией при комнатной температуре и этих же значениях рН, что, очевидно, связано с процессом адаптации и изменением метаболизма клеток.

Также в работе было показано участие продуктов генов hip и devR в процессе перехода клеток в покоящееся состояние. Ранее предполагали, что белок DevR регулирует адаптацию бактерий к кислородному голоданию [Wayne, 1982]. Однако, по мнению других авторов, продукты гена devR могут быть задействованы и в других видах стресса [O'Toole, 2003]. Действительно, как следует из результатов настоящего исследования, ген devR и, возможно, контролируемый этим геном кластер Dos-регулон играют важную роль в процессах адаптации вегетативных клеток микобактерий к кислотному стрессу.

Ранее было показано, что продукт гена hip, гистоноподобный белок Hip, задействован в обеспечении повышенной устойчивости покоящихся клеток микобактерий к термообработке, УФ-облучению, действию антибиотиков, что, по-видимому, обусловлено компактизацией нуклеоида при участии Hip [Anuchin et al., 2010]. При закислении пост-стационарных культур мутантного штамма М. smegmatis клетки с инактивированным геном hip не только утрачивали жизнеспособность, но и не образовывали овоидные ПФ. Вероятно, гены hip и devR входят в глобальную систему регуляции и адаптации клеточного метаболизма, позволяющую микобактериям

образовывать ПФ и переживать неблагоприятные условия среды в состоянии покоя.

3.2. Биохимическая и микробиологическая характеристики ПФ микобактерий.

Полученные при постепенном снижении рН среды клетки с измененной морфологией представляли собой контрастные овоидные формы с утолщенной слоистой клеточной стенкой и электронно-плотной цитоплазмой (табл. 3). Микроскопические исследования этих культур показали постепенный переход от палочковидной формы к морфологически измененной овоидной форме. После 30 - 40 сут инкубации культур МТБ при постепенном закислении среды (рН 6.8 —► 6.2) мы наблюдали появление клеточных агрегатов, содержащих тысячи укороченных палочковидных форм.

Таблица 3. Микроскопия клеток микобактерий. Культуры выращивали на среде Сатона со стартовым значением рН 6.0_

Вегетативные клетки

Переходные формы клеток

Контрастные овоидные клетки

Фазово-

контрастная

микроскопия

Длина масштабной метки 2 мкм М. втедтай$

Электронная микроскопия тонких срезов

М. зтедтаИв

МЛиЬегси^з

Длина масштабной метки 2 мкм

—

Атомно-силовая микроскопия клеток

М. втедта^

Таблица 4. Биохимические изменения в клетках М. smegmatis и М. tuberculosis при переходе в состояние покоя. В закрашенных полях представлены данные для МТБ. Вегетативные клетки М. smegmatis - 2 сут культивирования, МТБ - 10 сут, клетки стационарной фазы М. smegmatis - 20 сут, МТБ - 40 сут, КОК М. smegmatis - 60 сут, МТБ-70 сут._

Параметр Вегетативные клетки Клетки стационарной фазы Овоидные клетки

Включение радиоактивной метки (имп/мин) Тимидин [3Н1 40196 + 2354 7560 + 1524 860 ±101

Урацил [3Н] 93286 ± 3730 12340 ±1632 408 ± 94

76 327 = MI9 12 984 i 1924 350 ± 7Л

Внутриклеточная концентрация АТФ в культуре, нМ* 514 + 41.12 264 ±15.84 183 ±9.15

569 + 47 441-227 0.7 = й 2

Плавучая плотность клеток (г/мл) 1.214 + 0.01 1.23 ±0.01 1.278 ±0.01

1.30 ±0.1 ||¡IÍ¡Í||||||||||¡||||Í|: 1.60 ±0.1

Термоустойчивость клеток(% от контроля без прогревания)** 60 °С 65 75 85

70 °С 9 12 18

80 °С 2 4 10

Устойчивость клеток к антибиотикам*** Канамицин 1хЮ2 2x102 4хЮ2

Гигромицин 1х102 2x103 1хЮ7

Тетрациклин 1x105 1 х106 1 х 107

* Концентрация АТФ в мл культуры при одинаковом количестве клеток (1 х10а КОЕ/мл)

** Доля клеток после термообработки в течение 10 мин, непрокрашиваемых йодистым пропидием, определяемая по результатам прямых микроскопических подсчетов. Относительная ошибка 5%.

*** Остаточное число КОЕ/мл М. зтедтаИэ после воздействия 100 мкг/мл антибиотика на 1*108 клеток в течение суток, по высевам на стандартной среде (N61.5% агаре).

В ходе дальнейшей инкубации в течение 50 суток при снижающемся рН среды до 5.8, клеточные агрегаты частично деградировали, освобождая палочковидные формы с концевыми вздутиями. Такие «промежуточные» формы были переходными при образовании КОК в 60-суточных культурах при снижении рН среды от 5.8 до 5.5. По данным атомно-силовой микроскопии

(табл. 3), размеры вегетативных клеток М. smegmatis в экспоненциальной фазе роста составляли в среднем 3.7 х 0.8 мкм и значительно отличались от размеров КОК - 1.2 * 0.9 мкм.

КОК в 60-180-суточных культурах МТБ, полученные при соответствующих условиях, характеризовались также уменьшением размеров (1.2-1.5 х 0.6-0.7 мкм) по сравнению с клетками стационарной фазы (1.5-2 х 0.3-0.4 мкм). При окрашивании реагентом Циля-Нильсена, КОК МТБ имели темно-красный цвет, в отличие от розового цвета, присущего вегетативным палочковидным клеткам, что возможно связано с утолщением клеточной стенки. КОК не прокрашивались йодистым пропидием (PI). Отрицательное окрашивание клеток было и при использовании Nile Red (маркера на включения триглециридов).

В длительной пост-стационарной фазе культур микобактерий, выращенных на модифицированной среде Сатона с исходным значением рН 6.0 (рис. 1), наблюдалось снижение синтеза РНК, который оценивался по скорости включения 5,6-3Н-урацила в клетках. Вместе с аналогичным падением уровня АТФ в клетках, эти данные указывают на крайне низкую метаболическую активность КОК, в отличие от вегетативных и постстационарных клеток. Однако ненулевые уровни включения урацила и наличие внутриклеточного АТФ определенной концентрации могут указывать на протекание «остаточного» метаболизма в КОК, на очень низком уровне, необходимом для поддержания жизнеспособности (табл. 4).

Различия в значении плавучей плотности между вегетативными клетками и КОК, особенно для МТБ (1.3 г/мл и 1.6 г/мл, соответственно), возможно, отражают увеличение белок-липидного соотношения в покоящихся клетках (табл. 4). КОК МТБ в 70-суточных культурах обладали повышенной устойчивостью к температуре, в отличие от вегетативных клеток. Число восстановленных КОК при воздействии 70 °С в течение 10 мин было в 50 раз меньше по сравнению с контролем, в то время как вегетативные клетки практически не восстанавливались после воздействия той же температуры. КОК были также более устойчивы к воздействию антибиотиков: гигромицина (50 мкг/мл), канамицина (50 мкг/мл), тетрациклина (50 мкг/мл) и рифампицина (20 мкг/мл), чем метаболически активные клетки. Так, при воздействии 100 мкг/мл гигромицина на клетки M.smegmatis (108 КОЕ/мл) в течение 24 часов, остаточная выживаемость составляла 107 КОЕ/мл для овоидных форм, тогда как для вегетативных клеток -102 КОЕ/мл (табл. 4).

Таким образом, морфологически измененные КОК, сохраняющие жизнеспособность в течение длительного периода времени в состоянии очень низкой метаболической активности и устойчивые к повреждающим факторам (температура и антибиотики), могут рассматриваться как покоящиеся формы микобактерий.

Инфекционный потенциал покоящихся форм МТБ. Полученные в условиях pH-индукции КОК МТБ (76 сут культивирования, КОЕ/мл=0, НВЧК 1 = 4.3x103, НВЧК 2 =105) использовались для заражения лабораторных мышей лини Black. Спустя полтора года у мышей по достижении ранних этапов старения регистрировались в органах типичные активные клетки МТБ. По-видимому, ослабевание иммунной системы мышей приводит к реактивации покоящихся форм М. tuberculosis.

Таким образом, впервые были получены специализированные покоящиеся формы микобактерий как следствие их адаптации к снижению pH окружающей среды, сохраняющие инфекционный потенциал. Возможно, такой механизм образования ПФ реализуется у латентных форм МТБ in vivo.

3.3. Механизм реактивации ПФ М. smegmatis под влиянием веществ липидной природы.

Вышеупомянутые эксперименты с культурой М. tuberculosis позволили выделить два типа покоящихся клеток: спонтанно реактивирующиеся и СН-индуцируемые. Очевидно, клетки 2-й группы находятся в более глубоком состоянии покоя, когда для восстановления жизнеспособности клеткам недостаточно собственных ресурсов, и они требуют экзогенных стимулирующих факторов реактивации. Ранее в нашей лаборатории было показано, что в СИ активных клеток присутствуют белки семейства Rpf, вызывающие реактивацию покоящихся форм некоторых бактерий. Однако трудно себе представить, что в макрофагах белок Rpf присутствует в концентрации, достаточной для инициации реактивации ПФ, учитывая малое количество клеток микобактерий, захваченных макрофагом. Поэтому, вероятно, в организме хозяина действуют и другие факторы инициации реактивации, среди которых могут быть низкомолекулярные вещества, компоненты клеточных стенок или факторы иммунной системы. Факторы реактивации липидной природы. Было изучено действие фосфолипидов различного состава на реактивацию НК М. smegmatis, полученных при выращивании на среде, не содержащей солей калия [Shleeva, 2004]. Было обнаружено, что при добавлении в среду фосфатидилхолина

(лецитин), кардиолипина и изо-фосфатидилхолина приводит к стимуляции реактивации подобно действию (рис 2.). Поскольку общими компонентами этих фосфолипидов являются остатки жирных кислот, было изучено действие свободных жирных кислот на процесс реактивации НК клеток М. БтедтаНэ. Для изучения роли соединений липидной природы в процессе реактивации ПФ пересевали в свежую жидкую среду Сатона, содержащую ионы калия и определенное количество липидного компонента, влияние которого на реактивацию клеток оценивали с помощью МКР.

с 106 1

■а

£ ю5

х 104

-О

Ф 102 со 5:

о 10'

| ю"

Контроль Яр* ФОСФОЛИПИДЫ

Рис. 2. Реактивация «некультивируемых» клеток М. этедта^Б фосфолипидами.

Контроль - реактивация НК в жидкой среде без стимулирующих добавок; Р^ - реактивация НК в жидкой среде в присутсвии 5 нг/мл белка 1-3 добавление к среде реактивации 200 мкг/мл фосфолипидов:

1 - фосфатидилхолина,

2 - кардиолипина,

3 - лизо-фосфатидилхолина.

При добавлении СЖК различной длины в концентрации 3.5 мкМ в среду, содержащую 106 клеток/мл, находящихся в «некультивируемом» состоянии, было показано, что наибольшим стимулирующим эффектом на реактивацию обладали ненасыщенные жирные кислоты (СНЖК) (рис. 3). Влияние фосфолипидов и СНЖК на реактивацию зависит от их концентрации. Важно, что интервал действующих концентраций олеиновой кислоты (1.8 - 10.6 мкМ) находится в области меньших концентраций, по сравнению с фосфолипидами (7.5 - 36.6 мкМ). Очевидно, это указывает на то, что именно СНЖК ответственны за реактивирующий эффект, а фосфолипиды выступают в роли их источников (возможно, за счет действия бактериальных фосфолипаз и эстераз).

жирные кислоты

Рис. 3. Влияние жирных кислот (в концентрации 1 мкг/мл) на реактивацию НК М. зтедтаИз.

Контроль - реактивация НК в жидкой среде без

стимулирующих добавок. Реактивацию НК проводили в 50% среде Сатана с содержанием 0.5% глицерина в присутствии 0.025% дрожжевого экстракта.

Роль аденилатциклазы в реактивации ПФ. Известно, что одним из регуляторных белков микобактерий, который «чувствует» ЖК во внешней среде, является мембраносвязанная аденилатциклаза. Гены, кодирующие этот белок, известны (У МТБ Яу2212, а у М. этедта^ - МЗМЕС_4279). По-видимому, олеиновая кислота активирует этот фермент, что может приводить к увеличению концентрации цАМФ в клетке.

10 20 30 40

Время инкубации, часы

Рис. 4. Изменение уровня цАМФ внутри клетки и изменения в оптической плотности культуры при реактивации ПФ М. 5тедтаи$ в присутствии 10.6 мкМ олеиновой кислоты. Реактивацию НК проводили в 50% среде Сатана с содержанием 0.5% глицерина в присутствии 0.025% дрожжевого экстракта.

Так, экспериментально было обнаружено, что спустя сутки с начала реактивации в присутствии олеиновой кислоты, происходит увеличение уровня внутриклеточного цАМФ в лаг-фазе до начала размножения клеток {рис. 4). Добавление цАМФ (1.5-3.0 мМ) в среду приводило к стимуляции реактивации ПФ М. этедта^э, подобно действию СНЖК.

Было установлено, что активация метаболизма, которую оценивали по скорости включения в клетки радиоактивно меченного урацила, при

реактивации в присутствии олеиновой кислоты или цАМФ, происходит через 48 часов реактивации, тем самым предшествуя делению, которое начинается после 72 часов культивирования (рис. 5.).

Таким образом, можно полагать, что в процессах реактивации в лаг-фазе вначале активируется аденилатциклаза, повышается уровень цАМФ, как следствие, в клетке начинается синтез нуклеиновых кислот и активация других звеньев метаболизма, что, в конечном счете, приводит к делению клетки.

Время инкубации, час

Время икубации, нас

Рис. 5. Начальные этапы реактивация НК М. этедтаГк в присутствии 3.5 мкМ олеиновой кислоты или 3 мМ цАМФ. Контроль - без внесения добавок.

А - изменение оптической плотности культуры; Б - Скорость включения радиоактивной метки урацил-Н3.

Реактивацию проводили в 50% среде Сатона с содержанием 0.5% глицерина в присутствии 0.025% дрожжевого экстракта.

Для доказательства роли аденилатциклазы МЗМЕС_4279 в реактивации НК М. зтедтаИэ жирными кислотами в ходе работы был получен мутант М. зтедтаИБ ААс с делетированным геном МЗМЕС_4279. Такой штамм образовывал покоящиеся НК клетки, которые оказались не способны к реактивации в присутствии олеиновой кислоты, как это было показано для дикого типа. Однако, в присутствии ЗмМ цАМФ, после 11 суток культивирования клетки восстанавливали способность к росту в жидкой среде. Интересно, что штамм с гиперэкспрессией этого гена (рггипйАс) был

(

неспособен образовывать НК ПФ в тех же условиях, что указывает на важность аденилатциклазы М8МЕв_4279 в регуляции образования ПФ. Связь реактивации ПФ под действием СНЖК с белками Из

литературных данных известно, что среди многих белков, «чувствующих» цАМФ в клетке МТБ, существует транскрипционный фактор Р?у3676, продукт которого связывается с промоторной областью гена, кодирующего синтез Р^А. Это натолкнуло нас на мысль о том, что цАМФ может регулировать уровень экспрессии генов при реактивации в присутствии СНЖК как в МТБ, так ив М. этедтаИз.

3,0x10'

О <5 2'5*10' Г- I

•*>! £ 2,0x10'

1,5x10'

сп 2 1

Ъ. § 5,0x10'

СО

■ч-<0 ч-

1,0x10'

— _ 8,0x10'

сэ ш 5 (Л 2

а се.

Т 2,0x10'

Реактивация, 67 час

Экспоненциальная Стационарная Покоящееся

Контроль Олеиновая

фаза

состояние

6,0x10 ■

Экспоненциальная Ст ационарная Покоящееся фаза фаза

I :

1 ■ ........... ж

состояние

Контроль Олеиновая

Рис. 6. Изменения уровня экспрессии генов гр{А и разных физиологических состояний и в процессе реактивации покоящихся форм М. этедтаИз.

Реактивацию проводили в присутствии 3.5 мкМ олеиновой кислоты. Данные приведены для 67 часа реактивации. Число копий гена отнесено к 50 нанограммам РНК.

В геноме М. Бтедтайэ имеется 4 гр^одобных гена: М5МЕС_5700, М5МЕв_5439, МБМЕв_4640, М5МЕв_4643 продуктами которых являются

белки [^А, КрГВ, РрГС, RpfF, соответственно. Все гены были исследованы на предмет изменения уровня экспрессии в процессе реактивации НК форм методом обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени.

Особый интерес вызывают 2 гена - МБМЕС_5700 (фМ) и МБМЕ6_4643 (/р/Р), для которых было обнаружено изменение уровня транскрипции. Так, для гена грЛА существенные изменения, а именно, снижение уровня транскрипции, наблюдалось в стационарной фазе и в состоянии покоя. И, наоборот, для гена М5МЕС_4643 (гр/71) было продемонстрировано увеличение экспрессии по мере развития культуры от экспоненциальной фазы к покоящемуся состоянию. Интересно, что при реактивации ПФ в присутствии олеиновой кислоты наблюдалось увеличение уровня экспрессии гена фЛ4 в 1.5 раза, и его снижение в 4 раза для Таким образом, действительно, экспрессия генов гр/Д, фГ зависит от присутствия индуктора (в данном случае, олеиновой кислоты) в среде реактивации (рис. 6).

На основании этих данных мы предполагаем связь между реактивацией веществами липидной природы и белками Рр^ Олеиновая кислота, которая также может высвобождаться вследствие деградации фосфолипидов, выступает стимулятором мембраносвязанной аденилтциклазы, что приводит к увеличению концентрации цАМФ в клетке. Каким образом концентрация цАМФ приводит к модуляции генов гр£ остается неясным. Возможно, что экспрессия ф(А связана с цАМФ-зависимым транскрипционным фактором. Реактивация ПФ М. зтедтаНэ может происходить под действием разных индукторов, как белков Кр^ так и СНЖК. Опираясь на наши исследования, мы предполагаем, что оба механизма реактивации ПФ М. этедтаНз являются звеньями одной цепи. Данный процесс наглядно представлен в виде схемы на рис. 7.

Работа была поддержана программой РАН «Молекулярная и клеточная биология», ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы ГК №14.740.11.0246 и №14.740.11.1056.

Рис. 7. Предполагаемая схема реактивации ПФ М. зтедтаНз в жидкой среде в присутствии индукторов (фосфолипидов - ФЛ, свободных ненасыщенных жирных кислот (СНЖК) или цАМФ). На первом этапе СНЖК (которая может высвобождаться также вследствие гидролиза ФЛ) активирует мембраносвязанную аденилатциклазу МЭМЕС_4279, в результате чего повышается уровень цАМФ в клетке. цАМФ, добавленный к среде реактивации в больших концентрациях может попадать внутрь клетки и выступать также стимулятором реактивации ПФ подобно действию СНЖК. На втором этапе реактивации происходит увеличение уровня экспрессии гена фй4, возможно, через цАМФ-зависимый транскрипционный фактор, и как следствие, синтез белка Р^А. Завершающим этапом является деление клетки М. зтедтаИв.

выводы

1. Адаптация микобактерий М. smegmatis и М. tuberculosis к условиям постепенного снижения рН среды приводит к образованию покоящихся форм, способных к реактивации in vitro.

2. Полученные формы характеризуются измененной морфологией, «некультивируемостью» на плотных средах, низким уровнем метаболизма и повышенной устойчивостью к стрессовым воздействиям (антибиотики, температура). Покоящиеся формы М. tuberculosis способны к реактивации in vivo, вызывая заболевание туберкулезом у зараженных мышей.

3. Свободные ненасыщенные жирные кислоты (СНЖК) и цАМФ, экзогенно добавленные в концентрациях 2-10 мкМ и 0.05 - 3.0 мМ, соответственно, стимулируют реактивацию покоящихся кпеток М. smegmatis.

4. Мутантный штамм М. smegmatis с делетированным геном аденилатциклазы MSMEG_4279 (ААс) утрачивает способность к реактивации под действием олеиновой кислоты, но сохраняет способность к реактивации под действием цАМФ.

5. Штамм М. smegmatis с гиперэкспрессией гена аденилатциклазы MSMEG_4279 не способен образовывать «некультивируемые» покоящиеся формы.

6. Введение олеиновой кислоты в среду реактивации увеличивает уровень экспрессии гена rpfA и снижает уровень экспрессии гена rpfF М. smegmatis, участвующих в реактивации покоящихся форм.

7. Предложена схема, в которой экзогенные СНЖК связываются с мембранной аденилатциклазой микобактерии, что приводит к увеличению внутриклеточного уровня цАМФ, увеличению уровня экспрессии генов rpfA и реактивации покоящихся форм М. smegmatis.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Ю. К. Кудыкина. М. О. Шлеева, В. Ю. Арцатбанов, Н. Е. Сузина, А. С. Капрельянц. Образование покоящихся форм М. smegmatis в длительной стационарной фазе при постепенном закислении среды. 2011. Микробиология, Т. 80, № 5, с. 625-636.

2. М. О. Shleeva, Yu. К. Kudvkina. G. N. Vostroknutova, N. E. Suzina, A. L. Mulyukin, A. S. Kaprelyants. Dormant ovoid cells of Mycobacterium tuberculosis formed in response to gradual external acidification. 2011. Tuberculosis, V. 91, № 2, p. 146-154.

3. А.Л. Мулкжин, Ю.К. Кудыкина. М.О. Шлеева, A.M. Анучин, Н.Е. Сузина, В.Н. Данилевич, В.И. Дуда, А.С. Капрельянц, Г.И. Эль-Регистан. Внутривидовое разнообразие покоящихся форм Mycobacterium smegmatis. 2010. Микробиология, т. 79, № 4, с. 486-497.

4. Е.В. Назарова, М.О. Шлеева, Н.С. Морозова, Ю.К. Кудыкина, Г.Н. Вострокнутова, А.О. Ружицкий, А.А. Селищева, Г.М. Сорокоумова, В.И. Швец, А.С. Капрельянц. Роль липидных компонентов в процессах образования и реактивации «некультивируемых» форм Mycobacterium smegmatis. 2011. Биохимия, т. 76, № 6, с. 781-791.

5. A.M. Анучин, А.В. Гончаренко, И.В. Галон, О.И. Демиденок, Ю.К. Кудыкина. М.М. Мойсенович, А.Л. Мулюкин, А.С. Капрельянц. Модель покоящихся форм микобактерий для тестирования химиопрепаратов против латентных форм туберкулеза. 2010. Прикладная биохимия и микробиология, т. 46, №3, с. 308-314.

Материалы конференций:

1. Ю.К. Кудыкина, М.О. Шлеева, А.С. Капрельянц. Изучение биохимических факторов выживания микобактерий внутри клеток хозяина при моделировании стресса in vitro. 2008. Тезисы докладов IV съезда микробиологов Узбекистана (Ташкент, Узбекистан), с. 162-163.

2. Ю.К. Кудыкина. М.О. Шлеева, А.С. Капрельянц. Образование покоящихся форм микобактерий (М. smegmatis и М. tuberculosis) при моделировании стрессовых условий фагосомы in vitro. 2008. Актуальные аспекты современной микробиологии. Тезисы IV международной молодежной школы-конфернции (Москва), с. 27-29.

3. М. Shleeva, Yu. Kudvkina. A. Kaprelyants. Formation of dormant cells of Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis during adaptation to low pH. FEMS 2009. 3rd Congress of European Microbiologists (Gotenburg, Sweden), 2009.

4. Yu. Kudvkina. M.Shleeva, A. Kaprelyants. Mycobacteria produce dormant forms with distinct morphology in response to gradual acidification. 2010. The 2nd EMBO Meeting (Barcelona, Spain), p. 35.

5. M. Shleeva, Yu. Kudvkina, M. Young, D. Young, A. Kaprelyants. Free fatty acids - new inducers of dormant mycobacterial cell reactivation. 2011. The 3rd EMBO Meeting (Vienna, Austria), p. 46.

Подписано в печать 21 ноября 2011 г. Объем 1,2 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 515 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кудыкина, Юлия Константиновна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. МЕХАНИЗМЫ ВЫЖИВАНИЯ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS H37RV

В ОРГАНИЗМЕ ХОЗЯИНА.

Стратегии выживания, используемые М. tuberculosis в клетках хозяина.

Гены вирулентности у М. tuberculosis.

Взаимодействие с сигнальными сетями хозяина.

1.2 ПОКОЯЩЕЕСЯ СОСТОЯНИЕ МИКОБАКТЕРИЙ И ЛАТЕНТНОСТЬ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ

ИНФЕКЦИИ.

Покоящееся состояние бактерий и модели получения ПФ In vitro.

Покоящееся состояние и модели туберкулеза на животных.

Молекулярные механизмы состояния покоя.

Молекулярные механизмы реактивации ПФ бактерий.

Роль покоя в латентном туберкулезе.

1.3. АДАПТАЦИЯ МИКОБАКТЕРИЙ К КИСЛЫМ УСЛОВИЯМ pH СРЕДЫ.

Чувствительность и адаптация бактерий к кислому стрессу.

Проблемы, связанные с кислыми условиями среды.

Защита и репарация в кислых условиях среды.

Защелачивание периплазмы.

Цитоплазматическая и наружняя мембраны как «кислотные» барьеры.

Защита цитоплазмы при кислом стрессе.

Метаболизм и регуляция цитоплазматического pH.

Ионы Na+ и регуляция внутриклеточного pH.

Системы кислотоустойчивости.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Выращивание бактериальных культур.

2.2. Подсчет общего числа клеток.

2.3. Микроскопические исследования.

2.4. Оценка культивируемости клеток.:.

2.5. Реактивация «некультивируемых» клеток.

2.6. Включение радиоактивной метки.

2.7. Определение внутриклеточного уровня АТФ и цАМФ.

2.8. Изучение чувствительности клеток к действию стрессовых факторов.

2.9. Фракционирование морфологически дистинктных клеток.

2.10. Определение содержания ионов аммония в клетках и культуральной жидкости.

2.11. Высокоэффективная жидкостная хроматография.

2.12. Выделение клеточных экстрактов.

2.13. Электрофорез и иммуноблоттинг клеточных экстрактов.

2.14. Выделение и очистка РНК.

2.15. ПЦР в реальном времени.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. рН-ИНДУЦИРУЕМОЕ ОБРАЗОВАНИЕ ПОКОЯЩИХСЯ ФОРМ МИКОБАКТЕРИЙ.

3.1.1. Адаптация микобактерий (М. smegmatls и М. tuberculosis) к слабо-кислым условиям pH среды.

3.1.2. Образование овоидных форм микобактериями (М. smegmatis и М. tuberculosis) при снижении pH среды в пост-стационарной фазе.

3.1.3. Участие генов hip и devR в адаптации клеток М. smegmatis к закислению среды роста.

3.2. БИОХИМИЧЕСКАЯ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПФ МИКОБАКТЕРИЙ.

3.2.1. Микроскопия клеток микобактерий при рН-индуцируемом переходе в покоящееся состояние.

3.2.2. Культивируемость КОК микобактерий.

3.2.3. Метаболическая активность и устойчивость к повреждающим факторам.

3.2.4. Инфекционный потенциал покоящихся форм МТБ.

3.3. МЕХАНИЗМ РЕАКТИВАЦИИ ПОКОЯЩИХСЯ ФОРМ М. SMEGMATIS

ПОД ВЛИЯНИЕМ ВЕЩЕСТВ ЛИПИДНОЙ ПРИРОДЫ.

3.3.1. Факторы реактивации липидной природы.

3.3.2. Механизм действия СНЖК на клетку при реактивации.

3.3.3. Роль аденилатциклазы в реактивации ПФ М. smegmatis СНЖК.

3.3.4. Связь реактивации ПФ под действием СНЖК с белками Rpf.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "pH-индуцируемое образование покоящихся форм микобактерий и роль аденилатциклазы в их реактивации"

Актуальность проблемы. По данным ВОЗ, каждый третий человек на Земле латентно инфицирован возбудителем туберкулеза - Mycobacterium tuberculosis (МТБ), но до сих пор единого понимания природы латентного состояния и механизмов, посредством которых оно регулируется, не существует. Известно, что клетки МТБ могут сохраняться в организме человека в течение длительного периода времени в особом физиологическом, нерепликативном (покоящемся) состоянии (Arend & van Dissel, 2002; Flynn & Chan, 2001; Gupta et al; Soper & Amberson, 1938). Покоящиеся клетки МТБ, которые являются, как полагают многие авторы, причиной латентного туберкулеза, до сих пор не были изолированы из тканей хозяина, так как их количество в инфицированных органах или тканях может быть крайне мало (Hernandez-Pando et al, 2000). Кроме того, покоящиеся клетки микобактерий могут быть условно «некультивируемыми» (т.е. не способными образовывать колонии на плотной среде, в норме обеспечивающей рост вегетативных клеток), и поэтому не обнаруживаются при посевах клинических образцов (Biketov et al, 2000; de Wit et al, 1995; Dhillon et al, 2004; Khomenko & Golyshevskaya, 1984; McCune et al, 1956; McCune & Tompsett, 1956). Несмотря на длительную историю исследований МТБ in vitro и in vivo, явление покоя клеток микобактерий до сих пор остается во многом неизученным, что связано, в том числе, с отсутствием моделей in vitro, в которых .образовывались бы покоящиеся клетки микобактерий в достаточном для изучения количестве. Логично предположить, что покоящиеся формы могут быть получены в лабораторных культурах в условиях, имитирующих ситуацию в организме хозяина.

Таким образом, можно предположить, что снижение рН играет роль в процессах перехода клеток МТБ в состояние покоя. Для подтверждения этого предположения необходимы эксперименты in vitro, моделирующие переход микобактерий в покоящееся состояние в этих условиях. Кроме того, при изучении адаптации вегетативных клеток к стрессам и их перехода в пост-стационарных культурах в состояние покоя целесообразно также учитывать скорость, с которой клетки бактерий подвергаются неблагоприятным внешним воздействиям. Так, в модели перехода микобактерий в нерепликативное состояние в условиях гипоксии (модель Вэйна) было показано, что быстрое истощение кислорода в культуре приводило к гибели большинства клеток МТБ, в то время как постепенное развитие гипоксии способствовало их переходу в покоящееся состояние без утраты культивируемости (Wayne & Lin, 1982). Аналогично показанному в модели Вэйна, мы могли ожидать переход МТБ в состояние покоя при постепенном снижении рН среды.

Ранее в данной лаборатории было обнаружено, что клетки микобактерий секретируют в среду культивирования белок (Rpf), который позволяет реактивировать покоящиеся клетки и стимулирует размножение вегетативных клеток (Kaprelyants et al, 1996; Votyakova et al, 1994).

Однако, для реализации Rpf -зависимой активации покоящихся клеток МТБ, очевидно, необходимо наличие стартовой концентрации Rpf, синтез которого в покоящихся клетках, очевидно, отсутствует. Нельзя исключить, что в этих условиях индуктором реактивации являются другие более простые факторы, являющиеся продуктом метаболизма микобактерий. Однако до сих пор такие индукторы не обнаружены. Известно, что МТБ, будучи в организме, используют липиды хозяина в качестве источника углерода (Miner et al, 2009). Поэтому поиск индукторов реактивации липидной природы нам представлялся перспективным.

На основании изложенных данных были сформулированы следующие цели и задачи данного исследования.

Цели и задачи работы. Целями данного исследования являлись изучение ответа микобактерий (M. smegmatis и M. tuberculosis) к постепенно развивающемуся кислотному стрессу, с акцентом на возможность формирования покоящихся клеток с измененной морфологией, а также поиск низкомолекулярных индукторов реактивации ПФ липидной природы. В соответствии с целями были поставлены следующие задачи:

2. Провести микробиологическую и биохимическую характеристики полученных форм бактерий.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые обнаружено, что адаптация микобактерий М. smegmatis и М. tuberculosis в условиях плавного снижения рН приводит к образованию специализированных форм микобактерий, которые представлены укороченными овоидными формами с утолщенной клеточной стенкой. По сохранению жизнеспособности, устойчивости к повреждающим воздействиям, особенностям строения овоидные формы дикого штамма М. smegmatis и М. tuberculosis могут быть отнесены к покоящимся формам бактерий.

Модель рН-индуцируемого образования НК клеток с участием возбудителя туберкулеза - бактерии М. tuberculosis, разработанная в ходе настоящего исследования, • представляет особый интерес и может считаться уникальной, поскольку в мировой литературе до сих пор не упоминалось о возможности образования «некультивируемых» клеток (НК) М. tuberculosis в условиях постепенного закисления в пост-стационарной фазе. Кроме того, было показано, что такие формы обладают инфекционным потенциалом in vivo.

В ходе настоящей работы впервые было установлено участие мембраносвязанной аденилатциклазы М. smegmatis MSMEG4279 в процессе реактивации микобактерий жирными кислотами.

Впервые предложена схема, в которой реактивация НК М. smegmatis под действием СНЖК осуществляется с помощью цАМФ - зависимого синтеза белков Rpf. Практическая значимость работы. Полученная модель является хорошим инструментом для изучения механизмов образования ПФ микобактерий, оценки активности генов, вовлеченных в процесс перехода микобактерий в латентное состояние. С другой стороны, полученные покоящиеся клетки микобактерий могут быть использованы для тестирования новых антибактериальных препаратов, эффективных для ингибирования реактивирующихся ПФ микобактерий, персистирующих в организме хозяина.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих научных конференциях: IV съезд микробиологов Узбекистана, Ташкент, 2008; IV международная молодежная школа-конференция, Москва, 2008; Зй Европейский конгресс микробиологов (РЕМЭ), Гётеборг, Швеция, 2009; Конференция Европейского общества молекулярных биологов (ЕМВО), Барселона, Испания, 2010; Зя Конференция Европейского общества молекулярных биологов (ЕМВО), Вена, Австрия, 2011. Проект «Биологическая система для тестирования новых соединений против латентного туберкулеза», выполненный в рамках данного исследования, был поддержан Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (конкурс У.М.Н.И.К.).

Связь работы с государственными программами. Работа была поддержана программой РАН «Молекулярная и клеточная биология», ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы ГК №14.740.11.0246 и №14.740.11.1056.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кудыкина, Юлия Константиновна

выводы

3. Свободные ненасыщенные жирные кислоты (СНЖК) и цАМФ, экзогенно добавленные в концентрациях 2-10 мкМ и 0.05 - 3.0 мМ, соответственно, стимулируют реактивацию покоящихся клеток М. smegmatis.

4. Мутантный штамм М. smegmatis с делетированным геном аденилатциклазы MSMEG4279 (ААс) утрачивает способность к реактивации под действием олеиновой кислоты, но сохраняет способность к реактивации под действием цАМФ.

5. Штамм М. smegmatis с гиперэкспрессией гена аденилатциклазы MSMEG4279 не способен образовывать «некультивируемые» покоящиеся формы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кудыкина, Юлия Константиновна, Москва

1. Abdel Motaal A, Tews I, Schultz JE, Under JU (2006) Fatty acid regulation of adenylyl cyclase Rv2212 from Mycobacterium tuberculosis H37Rv. FEBS J 273(18): 4219-4228

2. Abramovitch RB, Rohde KH, Hsu FF, Russell DG aprABC: a Mycobacterium tuberculosis complex-specific locus that modulates pH-driven adaptation to the macrophage phagosome. Mol Microbiol 80(3): 678-694

3. Ahearn JM, Fearon DT (1989) Structure and function of the complement receptors, CR1 (CD35) and CR2 (CD21). Adv Immunol 46: 183-219

4. Ahmed S, Booth IR (1983) The effect of beta-galactosides on the protonmotive force and growth of Escherichia coli. J Gen Microbiol 129(8): 2521-2529

5. Anand PK, Kaul D (2003) Vitamin D3-dependent pathway regulates TACO gene transcription. Biochem Biophys Res Commun 310(3): 876-877

6. Andrutis KA, Fox JG, Schauer DB, Marini RP, Murphy JC, Yan L, Solnick JV (1995) Inability of an isogenic urease-negative mutant stain of Helicobacter mustelae to colonize the ferret stomach. Infect Immun 63(9): 3722-3725

7. Anuchin AM, Goncharenko AV, Demina GR, Mulyukin AL, Ostrovsky DN, Kaprelyants AS The role of histone-like protein, Hip, in Mycobacterium smegmatis dormancy. FEMS Microbiol Lett 308(2): 101-107

8. Anuchin AM, Mulyukin AL, Suzina NE, Duda VI, El-Registan Gl, Kaprelyants AS (2009) Dormant forms of Mycobacterium smegmatis with (distinct morphology. Microbiology 155(Pt 4): 10711079

9. Arcus VL, Rainey PB, Turner SJ (2005) The PIN-domain toxin-antitoxin array in mycobacteria. Trends Microbiol 13(8): 360-365

10. Arend SM, van Dissel JT (2002) Evidence of endogenous reactivation of tuberculosis after a long period of latency. J Infect Dis 186(6): 876-877

11. Armitige LY, Jagannath C, Wanger AR, Norris SJ (2000) Disruption of the genes encoding antigen 85A and antigen 85B of Mycobacterium tuberculosis H37Rv: effect on growth in culture and in macrophages. Infect Immun 68(2): 767-778

12. Arruda S, Bomfim G, Knights R, Huima-Byron T, Riley LW (1993) Cloning of an M. tuberculosis DNA fragment associated with entry and survival inside cells. Science 261(5127): 1454-1457

13. Athmann C, Zeng N, Kang T, Marcus EA, Scott DR, Rektorschek M, Buhmann A, Melchers K, Sachs G (2000) Local pH elevation mediated by the intrabacterial urease of Helicobacter pylori cocultured with gastric cells. J Clin Invest 106(3): 339-347

14. Atrih A, Foster SJ (1999) The role of peptidoglycan structure and structural dynamics during endospore dormancy and germination. Antonie Van Leeuwenhoek 75{A)'. 299-307

15. Av-Gay Y, Everett M (2000) The eukaryotic-like Ser/Thr protein kinases of Mycobacterium tuberculosis. Trends Microbiol 8(5): 238-244

16. Bai G, Schaak DD, McDonough KA (2009) cAMP levels within Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG increase upon infection of macrophages. FEMS Immunol Med Microbiol 55(1): 68-73

17. Bang IS, Kim BH, Foster JW, Park YK (2000) OmpR regulates the stationary-phase acid tolerance response of Salmonella enterica serovar typhimurium. J Bacteriol 182(8): 2245-2252

18. Baronofsky JJ, Schreurs WJ, Kashket ER (1984) Uncoupling by Acetic Acid Limits Growth of and Acetogenesis by Clostridium thermoaceticum. Appl Environ Microbiol 48(6): 1134-1139

19. Beatty WL, Rhoades ER, Ullrich HJ, Chatterjee D, Heuser JE, Russell DG (2000) Trafficking and release of mycobacterial lipids from infected macrophages. Traffic 1(3): 235-247

20. Beck F, Yegian D (1952) A study of the tubercle bacillus in resected pulmonary lesions. Am Rev Tuberc 66(1): 44-51

21. Betts JC, Lukey PT, Robb LC, McAdam RA, Duncan K (2002) Evaluation of a nutrient starvation model of Mycobacterium tuberculosis persistence by gene and protein expression profiling. Mol Microbiol 43(3): 717-731

22. Bijlsma JJ, Lie ALM, Nootenboom IC, Vandenbroucke-Grauls CM, Küsters JG (2000) Identification of loci essential for the growth of Helicobacter pylori under acidic conditions. J Infect Dis 182(5): 1566-1569

23. Blokpoel MC, Murphy HN, O'Toole R, Wiles S, Runn ES, Stewart GR, Young DB, Robertson BD (2005) Tetracycline-inducible gene regulation in mycobacteria. Nucleic Acids Res 33(2): e22

24. Blumberg HM, Leonard MK, Jr., Jasmer RM (2005) Update on the treatment of tuberculosis and latent tuberculosis infection. JAMA 293(22): 2776-2784

25. Boon C, Dick T (2002) Mycobacterium bovis BCG response regulator essential for hypoxic dormancy. J Bacteriol 184(24): 6760-6767

26. Boshoff HI, Myers TG, Copp BR, McNeil MR, Wilson MA, Barry CE, 3rd (2004) The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action. J Biol Chem 279(38): 40174-40184

27. Boyd DA, Cvitkovitch DG, Bleiweis AS, Kiriukhin MY, Debabov DV, Neuhaus FC, Hamilton IR (2000) Defects in D-alanyl-lipoteichoic acid synthesis in Streptococcus mutans results in acid sensitivity. J Bacteriol 182(21): 6055-6065

28. Britton RA, Powell BS, Court DL, Lupski JR (1997) Characterization of mutations affecting the Escherichia coli essential GTPase era that suppress two temperature-sensitive dnaG alleles. J Bacterial 179(14): 4575-4582

29. Britton RA, Powell BS, Dasgupta S, Sun Q, Margolin W, Lupski JR, Court DL (1998) Cell cycle arrest in Era GTPase mutants: a potential growth rate-regulated checkpoint in Escherichia coli. Mol Microbiol 27(4): 739-750

30. Brown JL, Ross T, McMeekin TA, Nichols PD (1997) Acid habituation of Escherichia coli and the potential role of cyclopropane fatty acids in low pH tolerance. Int J Food Microbiol 37(2-3): 163173

31. Butler D (2000) New fronts in an old war. Nature 406(6797): 670-672

32. Calcott PH, Postgate JR (1972) On substrate-accelerated death in Klebsiella aerogenes. J Gen Microbiol 70(1): 115-122

33. Caldon CE, March PE (2003) Function of the universally conserved bacterial GTPases. Curr Opin Microbiol 6(2): 135-139

34. Castanie-Cornet MP, Penfound TA, Smith D, Elliott JF, Foster JW (1999) Control of acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol 181(11): 3525-3535

35. Chaisson RE, Slutkin G (1989) Tuberculosis and human immunodeficiency virus infection. J Infect Dis 159(1): 96-100

36. Chakraborty P, Sturgill-Koszycki S, Russell DG (1994) Isolation and characterization of pathogen-containing phagosomes. Methods Cell Biol 45: 261-276

37. Chan J, Fan XD, Hunter SW, Brennan PJ, Bloom BR (1991) Lipoarabinomannan, a possible virulence factor involved in persistence of Mycobacterium tuberculosis within macrophages. Infect Immun 59(5): 1755-1761

38. Chang YY, Eichel J, Cronan JE, Jr. (2000) Metabolic instability of Escherichia coli cyclopropane fatty acid synthase is due to RpoH-dependent proteolysis. J Bacteriol 182(15): 4288-4294

39. Chao MC, Rubin EJ Letting sleeping dos lie: does dormancy play a role in tuberculosis? Annu Rev Microbiol 64: 293-311

40. Chapman JS, Bernard JS (1962) The tolerances of unclassified mycobacteria. I. Limits of pH tolerance. Am RevRespirDis 86: 582-583

41. Chatterjee D, Hunter SW, McNeil M, Brennan PJ (1992) Lipoarabinomannan. Multiglycosylated form of the mycobacterial mannosylphosphatidylinositols. J Biol Chem 267(9): 6228-6233

42. Chen H, Richardson AE, Rolfe BG (1993) Studies of the Physiological and Genetic Basis of Acid Tolerance in Rhizobium leguminosarum biovar trifolii. Appl Environ Microbiol 59(6): 1798-1804

43. Cheville AM, Arnold KW, Buchrieser C, Cheng CM, Kaspar CW (1996) rpoS regulation of acid, heat, and salt tolerance in Escherichia coli 0157:H7. Appl Environ Microbiol 62(5): 1822-1824

44. Chitale S, Ehrt S, Kawamura I, Fujimura T, Shimono N, Anand N, Lu S, Cohen-Gould L, Riley LW (2001) Recombinant Mycobacterium tuberculosis protein associated with mammalian cell entry. Cell Microbiol 3(4): 247-254

45. Christensen SK, Gerdes K (2003) RelE toxins from bacteria and Archaea cleave mRNAs on translating ribosomes, which are rescued by tmRNA. Mol Microbiol 48(5): 1389-1400

46. Chua J, Deretic V (2004) Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. J Biol Chem 279(35): 36982-36992

47. Clemens DL, Lee BY, Horwitz MA (2000) Deviant expression of Rab5 on phagosomes containing the intracellular pathogens Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila is associated with altered phagosomal fate. Infect Immun 68(5): 2671-2684

48. Cohen-Gonsaud M, Barthe P, Bagneris C, Henderson B, Ward J, Roumestand C, Keep NH (2005) The structure of a resuscitation-promoting factor domain from Mycobacterium tuberculosis shows homology to lysozymes. Nat Struct Mol Biol 12(3): 270-273

49. Cohen-Gonsaud M, Keep NH, Davies AP, Ward J, Henderson B, Labesse G (2004) Resuscitation-promoting factors possess a lysozyme-like domain. Trends Biochem Sci 29(1): 710

50. Comstock GW, Livesay VT, Woolpert SF (1974) The prognosis of a positive tuberculin reaction in childhood and adolescence. Am J Epidemiol 99(2): 131-138

51. Connell ND (1994) Mycobacterium: isolation, maintenance, transformation, and mutant selection. Methods Cell Biol 45: 107-125

52. Cotter PD, Gahan CG, Hill C (2001) A glutamate decarboxylase system protects Listeria monocytogenes in gastric fluid. Mol Microbiol 40(2): 465-475

53. Cox JS, Chen B, McNeil M, Jacobs WR, Jr. (1999) Complex lipid determines tissue-specific replication of Mycobacterium tuberculosis in mice. Nature 402(6757): 79-83

54. Crowle AJ, Dahl R, Ross E, May MH (1991) Evidence that vesicles containing living, virulent Mycobacterium tuberculosis or Mycobacterium avium in cultured human macrophages are not acidic. Infect Immun 59(5): 1823-1831

55. Csillag A (1961) Spore formation and 'dimorphism' in the mycobacteria. J Gen Microbiol 26: 97109

56. Culliton BJ (1992) Drug-resistant TB may bring epidemic. Nature 356(6369): 473

57. Cunningham AF, Spreadbury CL (1998) Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. J Bacteriol 180(4): 801-808

58. Curran TM, Lieou J, Marquis RE (1995) Arginine deiminase system and acid adaptation of .oral streptococci. Appl Environ Microbiol 61(12): 4494-4496

59. Daffe M, Draper P (1998) The envelope layers of mycobacteria with reference to their pathogenicity. Adv Microb Physiol 39: 131-203

60. Dass BK, Sharma R, Shenoy AR, Mattoo R, Visweswariah SS (2008) Cyclic AMP in mycobacteria: characterization and functional role of the Rv1647 ortholog in Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol 190(11): 3824-3834

61. Davies AP, Dhillon AP, Young M, Henderson B, McHugh TD, Gillespie SH (2008) Resuscitation-promoting factors are expressed in Mycobacterium tuberculosis-infected human tissue. Tuberculosis (Edinb) 88(5): 462-468

62. De Koning-Ward TF, Robins-Browne RM (1995) Contribution of urease to acid tolerance in Yersinia enterocolitica. Infect Immun 63(10): 3790-3795de Man JC (1975) The probability of most probable numbers. European Journal of Applied Microbiology 1:67-68

63. Deretic V, Fratti RA (1999) Mycobacterium tuberculosis phagosome. Mol Microbiol 31(6): 16031609

64. Desjardin LE, Hayes LG, Sohaskey CD, Wayne LG, Eisenach KD (2001) Microaerophilic induction of the alpha-crystallin chaperone protein homologue (hspX) mRNA of Mycobacterium tuberculosis. J Bacteriol 183(18): 5311-5316

65. Devergne O, Emilie D, Peuchmaur M, Crevon MC, D'Agay MF, Galanaud P (1992) Production of cytokines in sarcoid lymph nodes: preferential expression of interleukin-1 beta and interferon-gamma genes. Hum Pathol 23(3): 317-323

66. Dhillon J, Lowrie DB, Mitchison DA (2004) Mycobacterium tuberculosis from chronic murine infections that grows in liquid but not on solid medium. BMC Infect Dis 4: 51

67. Dick T, Lee BH, Murugasu-Oei B (1998) Oxygen depletion induced dormancy in Mycobacterium smegmatis. FEMS Microbiol Lett 163(2): 159-164

68. Domenech P, Reed MB, Barry CE, 3rd (2005) Contribution of the Mycobacterium tuberculosis MmpL protein family to virulence and drug resistance. Infect Immun 73(6): 3492-3501

69. Dubnau E, Chan J, Raynaud C, Mohan VP, Laneelle MA, Yu K, Quemard A, Smith'I, Daffe M (2000) Oxygenated mycolic acids are necessary for virulence of Mycobacterium tuberculosis in mice. Mol Microbiol 36(3): 630-637

70. Dussurget O, Rodriguez M, Smith I (1998) Protective role of the Mycobacterium smegmatis IdeR against reactive oxygen species and isoniazid toxicity. Tuber Lung Dis 79(2): 99-106

71. Dussurget O, Stewart G, Neyrolles O, Pescher P, Young D, Marchai G (2001) Role of Mycobacterium tuberculosis copper-zinc superoxide dismutase. Infect Immun 69(1): 529-533

72. Dutkiewicz R, Slominska M, Wegrzyn G, Czyz A (2002) Overexpression of the cgtA (yhbZ, obgE) gene, coding for an essential GTP-binding protein, impairs the regulation of chromosomal functions in Escherichia coli. Curr Microbiol 45(6): 440-445

73. Dutt AK, Stead WW (1993) Tuberculosis in the elderly. Med Clin North Am 77(6): 1353-1368

74. Edwards C (2000) Problems posed by natural environments for monitoring microorganisms. Mol Biotech noH 5(3): 211-223

75. Ehlers S (2009) Lazy, dynamic or minimally recrudescent? On the elusive nature and location of the mycobacterium responsible for latent tuberculosis. Infection 37(2): 87-95

76. Eichel J, Chang YY, Riesenberg D, Cronan JE, Jr. (1999) Effect of ppGpp on Escherichia coli cyclopropane fatty acid synthesis is mediated through the RpoS sigma factor (sigmaS). J Bacteriol 181(2): 572-576

77. Ernst JD (1998) Macrophage receptors for Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun 66(4): 1277-1281

78. Ferrari G, Langen H, Naito M, Pieters J (1999) A coat protein on phagosomes involved in the intracellular survival of mycobacteria. Cell 97(4): 435-447

79. Ferrero RL, Cussac V, Courcoux P, Labigne A (1992) Construction of isogenic urease-negative mutants of Helicobacter pylori by allelic exchange. J Bacteriol 174(13): 4212-4217

80. Fisher MA, Plikaytis BB, Shinnick TM (2002) Microarray analysis of the Mycobacterium tuberculosis transcriptional response to the acidic conditions found in phagosomes. J Bacteriol 184(14): 4025-4032

81. Flesselles B, Anand NN, Remani J, Loosmore SM, Klein MH (1999) Disruption of the mycobacterial cell entry gene of Mycobacterium bovis BCG results in a mutant that exhibits a reduced invasiveness for epithelial cells. FEMS Microbiol Lett 177(2): 237-242

82. Flynn JL, Chan J (2001) Tuberculosis: latency and reactivation. Infect Immun 69(7): 4195-4201

83. Foster JW (1993) The acid tolerance response of Salmonella typhimurium involves transient synthesis of key acid shock proteins. J Bacteriol 175(7): 1981-1987

84. Foster JW (1999) When protons attack: microbial strategies of acid adaptation. Curr Opin Microbiol 2(2): 170-174

85. Foster JW, Hall HK (1991) Inducible pH homeostasis and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium. J Bacteriol 173(16): 5129-5135

86. Foster JW, Moreno M (1999) Inducible acid tolerance mechanisms in enteric bacteria. Novartis Found Symp 221: 55-69; discussion 70-54

87. Fox W, Ellard GA, Mitchison DA (1999) Studies on the treatment of tuberculosis undertaken by the British Medical Research Council tuberculosis units, 1946-1986, with relevant subsequent publications. Int J Tuberc Lung Dis 3(10 Suppl 2): S231-279

88. Gajiwala KS, Burley SK (2000) HDEA, a periplasmic protein that supports acid resistance in pathogenic enteric bacteria. J Mol Biol 295(3): 605-612

89. Gale EF, Epps HM (1942) The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced. Biochem J 36(7-9): 600-618

90. Garbe T, Harris D, Vordermeier M, Lathigra R, Ivanyi J, Young D (1993) Expression of the Mycobacterium tuberculosis 19-kilodalton antigen in Mycobacterium smegmatis: immunological analysis and evidence of glycosylation. Infect Immun 61(1): 260-267

91. Garton NJ, Christensen H, Minnikin DE, Adegbola RA, Barer MR (2002) Intracellular lipophilic inclusions of mycobacteria in vitro and in sputum. Microbiology 148(Pt 10): 2951-2958

92. Gatfield J, Pieters J (2000) Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science 288(5471): 1647-1650

93. George HA, Chen JS (1983) Acidic Conditions Are Not Obligatory for Onset of Butanol Formation by Clostridium beijerinckii (Synonym, C. butylicum). Appl Environ Microbiol 46(2): 321-327

94. George HA, Johnson JL, Moore WE, Holdeman LV, Chen JS (1983) Acetone, Isopropanol, and Butanol Production by Clostridium beijerinckii (syn. Clostridium butylicum) and Clostridium aurantibutyricum. Appl Environ Microbiol 45(3): 1160-1163

95. Ghosh J, Larsson P, Singh B, Pettersson BM, Islam NM, Sarkar SN, Dasgupta S, Kirsebom LA (2009) Sporulation in mycobacteria. Proc Natl Acad Sci USA 106(26): 10781-10786

96. Giebel JD, Carr KA, Anderson EC, Hanna PC (2009) The germination-specific lytic enzymes SleB, CwlJ1, and CwlJ2 each contribute to Bacillus anthracis spore germination and virulence. J Bacteriol 191(18): 5569-5576

97. Gill WP, Harik NS, Whiddon MR, Liao RP, Mittler JE, Sherman DR (2009) A replication clock for Mycobacterium tuberculosis. Nat Med 15(2): 211-214

98. Glickman MS, Jacobs WR, Jr. (2001) Microbial pathogenesis of Mycobacterium tuberculosis: dawn of a discipline. Cell 104(4): 477-485

99. Gollop N, March PE (1991) A GTP-binding protein (Era) has an essential role in growth rate and cell cycle control in Escherichia coli. J Bacteriol 173(7): 2265-2270

100. Gordon AH, Hart PD, Young MR (1980) Ammonia inhibits phagosome-lysosome fusion In macrophages. Nature 286(5768): 79-80

101. Goren MB (1977) Phagocyte lysosomes: interactions with infectious agents, phagosomes, and experimental perturbations in function. Annu Rev Microbiol 31: 507-533

102. Graham JE, Clark-Curtiss JE (1999) Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci USA 96(20): 11554-11559

103. Gupta A (2009) Killing activity and rescue function of genome-wide toxin-antitoxin loci of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiol Lett 290(1): 45-53

104. Gupta A, Kaul A, Tsolaki AG, Kishore U, Bhakta S Mycobacterium tuberculosis: Immune evasion, latency and reactivation. Immunobiology

105. Haiser HJ, Yousef MR, Elliot MA (2009) Cell wall hydrolases affect germination, vegetative growth, and sporulation in Streptomyces coelicolor. J Bacteriol 191(21): 6501-6512

106. Hart PD, Young MR, Jordan MM, Perkins WJ, Geisow MJ (1983) Chemical inhibitors of phagosome-lysosome fusion in cultured macrophages also inhibit saltatory lysosomal movements. A combined microscopic and computer study. J Exp Med 158(2): 477-492

107. Harth G, Maslesa-Galic S, Tullius MV, Horwitz MA (2005) All four Mycobacterium tuberculosis glnA genes encode glutamine synthetase activities but only GlnA1 is abundantly expressed and essential for bacterial homeostasis. Mol Microbiol 58(4): 1157-1172

108. Hayes F (2003) Toxins-antitoxins: plasmid maintenance, programmed cell death, and cell cycle arrest. Science 301(5639): 1496-1499

109. Heffron JD, Lambert EA, Sherry N, Popham DL Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores. J Bacteriol 192(3): 763-770

110. Hengge-Aronis R (1993) Survival of hunger and stress: the role of rpoS in early stationary phase gene regulation in E. coli. Cell 72(2): 165-168

111. Hernandez-Pando R, Jeyanathan M, Mengistu G, Aguilar D, Orozco H, Harboe M, Rook GA, Bjune G (2000) Persistence of DNA from Mycobacterium tuberculosis in superficially normal lung tissue during latent infection. Lancet 356(9248): 2133-2138

112. Hett EC, Chao MC, Deng LL, Rubin EJ (2008) A mycobacterial enzyme essential for cell division synergizes with resuscitation-promoting factor. PLoS Pathog 4(2): e1000001

113. Hett EC, Chao MC, Steyn AJ, Fortune SM, Deng LL, Rubin EJ (2007) A partner for the resuscitation-promoting factors of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol 66(3): 658-668

114. Hobby GL, Auerbach O, Lenert TF, Small MJ, Comer JV (1954) The late emergence of M. tuberculosis in liquid cultures of pulmonary lesions resected from humans. Am Rev Tuberc 70(2): 191-218

115. Hommais F, Krin E, Laurent-Winter C, Soutourina O, Malpertuy A, Le Caer JP, Danchin A, Bertin P (2001) Large-scale monitoring of pleiotropic regulation of gene expression by the prokaryotic nucleoid-associated protein, H-NS. Mol Microbiol 40(1): 20-36

116. Honer Zu Bentrup K, Miczak A, Swenson DL, Russell DG (1999) Characterization of activity and expression of isocitrate lyase in Mycobacterium avium and Mycobacterium tuberculosis. J Bacteriol 181(23): 7161-7167

117. Jacobs WR, Glickman MS, Cox JS (2000) A novel mycolic acid cyclopropane synthetase is required for cording, persistence, and virulence of Mycobacterium tuberculosis. Molecular Cell 5(4): 717-727

118. Jan G, Leverrier P, Pichereau V, Boyaval P (2001) Changes in protein synthesis and morphology during acid adaptation of Propionibacterium freudenreich». Appl Environ Microbiol 67(5): 2029-2036

119. Jenkins DE, Schultz JE, Matin A (1988) Starvation-induced cross protection against heat or H202 challenge in Escherichia coli. J Bacteriol 170(9): 3910-3914

120. Jones G, Dyson P (2006) Evolution of transmembrane protein kinases implicated in coordinating remodeling of gram-positive peptidoglycan: inside versus outside. J Bacteriol 188(21): 74707476

121. Jordan KN, Oxford L, O'Byrne CP (1999a) Survival of low-pH stress by Escherichia coli 0157:H7: correlation between alterations in the cell envelope and increased acid tolerance. Appl Environ Microbiol 65(7): 3048-3055

122. Jordan SL, Glover J, Malcolm L, Thomson-Carter FM, Booth IR, Park SF (1999b) Augmentation of killing of Escherichia coli 0157 by combinations of lactate, ethanol, and low-pH conditions. Appl Environ Microbiol 65(3): 1308-1311

123. Kana BD, Mizrahi V Resuscitation-promoting factors as lytic enzymes for bacterial growth and signaling. FEMS Immunol Med Microbiol 58(1): 39-50

124. Kang CM, Abbott DW, Park ST, Dascher CC, Cantley LC, Husson RN (2005) The Mycobacterium tuberculosis serine/threonine kinases PknA and PknB: substrate identification and regulation of cell shape. Genes Dev 19(14): 1692-1704

125. Kaprelyants AS, Gottschal JC, Kell DB (1993) Dormancy in non-sporulating bacteria. FEMS Microbiol Rev 10(3-4): 271-285

126. Kaprelyants AS, Kell DB (1993) Dormancy in Stationary-Phase Cultures of Micrococcus luteus: Flow Cytometric Analysis of Starvation and Resuscitation. Appl Environ Microbiol 59(10): 31873196

127. Kaprelyants AS, Mukamolova GV, Davey HM, Kell DB (1996) Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus by Flow Cytometry and Cell Sorting. Appl Environ Microbiol 62(4): 1311-1316

128. Kashino SS, Napolitano DR, Skobe Z, Campos-Neto A (2008) Guinea pig model of Mycobacterium tuberculosis latent/dormant infection. Microbes Infect 10(14-15): 1469-1476

129. Keer J, Smeulders MJ, Williams HD (2001) A purF mutant of Mycobacterium smegmatis has impaired survival during oxygen-starved stationary phase. Microbiology 147(Pt 2): 473-481

130. Kell DB, Kaprelyants AS, Weichart DH, Harwood CR, Barer MR (1998) Viability and activity in readily culturable bacteria: a review and discussion of the practical issues. Antonie Van Leeuwenhoek 73(2): 169-187

131. Keren I, Shah D, Spoering A, Kaldalu N, Lewis K (2004) Specialized persister cells and the mechanism of multidrug tolerance in Escherichia coli. J Bacteriol 186(24): 8172-8180

132. Kesavan AK, Brooks M, Tufarielio J, Chan J, Manabe YC (2009) Tuberculosis genes expressed during persistence and reactivation in the resistant rabbit model. Tuberculosis (Edinb) 89(1): 1721

133. Khomenko AG, Golyshevskaya VI (1984) Filtrable forms of mycobacteria tuberculosis. Z Erkr Atmungsorgane 162(2): 147-154

134. Kim SY, Lee BS, Shin SJ, Kim HJ, Park JK (2008) Differentially expressed genes in Mycobacterium tuberculosis H37Rv under mild acidic and hypoxic conditions. J Med Microbiol 57(Pt 12): 1473-1480

135. Klinkenberg LG, Sutherland LA, Bishai WR, Karakousis PC (2008) Metronidazole lacks activity against Mycobacterium tuberculosis in an in vivo hypoxic granuloma model of latency. J Infect Dis 198(2): 275-283

136. Kobayashi G, Moriya S, Wada С (2001) Deficiency of essential GTP-binding protein ObgE in Escherichia coli inhibits chromosome partition. Mol Microbiol 41(5): 1037-1051

137. Kohanski MA, Dwyer DJ, Hayete B, Lawrence CA, Collins JJ (2007) A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics. Cell 130(5): 797-810

138. Korch SB, Contreras H, Clark-Curtiss JE (2009) Three Mycobacterium tuberculosis Rel toxin-antitoxin modules inhibit mycobacterial growth and are expressed in infected human macrophages. J Bacteriol 191(5): 1618-1630

139. Korch SB, Hill TM (2006) Ectopic overexpression of wild-type and mutant hipA genes in Escherichia coli: effects on macromolecular synthesis and persister formation. J Bacteriol 188(11): 3826-3836

140. Koul A, Choidas A, Treder M, Tyagi AK, Drlica K, Singh Y, Ullrich A (2000) Cloning and characterization of secretory tyrosine phosphatases of Mycobacterium tuberculosis. J Bacteriol 182(19): 5425-5432

141. Koul A, Choidas A, Tyagi AK, Drlica K, Singh Y, Ullrich A (2001) Serine/threonine protein kinases PknF and PknG of Mycobacterium tuberculosis: characterization and localization. Microbiology 147(Pt 8): 2307-2314

142. Maddock J, Bhatt A, Koch M, Skidmore J (1997) Identification of an essential Caulobacter crescentus gene encoding a member of the Obg family of GTP-binding proteins. J Bacteriol 179(20): 6426-6431

143. Maiti D, Bhattacharyya A, Basu J (2001) Lipoarabinomannan from Mycobacterium tuberculosis promotes macrophage survival by phosphorylating Bad through a phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway. J Biol Chem 276(1): 329-333

144. Manabe YC, Saviola BJ, Sun L, Murphy JR, Bishai WR (1999) Attenuation of virulence in Mycobacterium tuberculosis expressing a constitutively active iron repressor. Proc Natl Acad Sei USA 96(22): 12844-12848

145. March PE, Lerner CG, Ahnn J, Cui X, Inouye M (1988) The Escherichia coli Ras-like protein (Era) has GTPase activity and is essential for cell growth. Oncogene 2(6): 539-544

146. McCune RM, Feldmann FM, Lambert HP, McDermott W (1966a) Microbial persistence. I. The capacity of tubercle bacilli to survive sterilization in mouse tissues. J Exp Med 123(3): 445-468

147. McCune RM, Feldmann FM, McDermott W (1966b) Microbial persistence. II. Characteristics of the sterile state of tubercle bacilli. J Exp Med 123(3): 469-486

148. McDonough KA, Kress Y, Bloom BR (1993) Pathogenesis of tuberculosis: interaction of Mycobacterium tuberculosis with macrophages. Infect Immun 61(7): 2763-2773

149. McGowan CC, Necheva A, Thompson SA, Cover TL, Blaser MJ (1998) Acid-induced expression of an LPS-associated gene in Helicobacter pylori. Mol Microbiol 30(1): 19-31

150. McMurray DN (2001) Disease model: pulmonary tuberculosis. Trends Mol Med 7(3): 135-137

151. Medlar EM (1952) Survival of bacilli in tuberculous lesions. Am Rev Tuberc 66(3): 381-382

152. Meena LS, Rajni Cloning and characterization of engA, a GTP-binding protein from Mycobacterium tuberculosis H(37)Rv. Biologicals 39(2): 94-99

153. Meena LS, Rajni Survival mechanisms of pathogenic Mycobacterium tuberculosis H37Rv. FEBS J 277(11): 2416-2427

154. Merrell DS, Bailey C, Kaper JB, Camilli A (2001) The ToxR-mediated organic acid tolerance response of Vibrio cholerae requires OmpU. J Bacteriol 183(9): 2746-2754

155. Merrell DS, Camilli A (1999) The cadA gene of Vibrio cholerae is induced during infection and plays a role in acid tolerance. Mol Microbiol 34(4): 836-849

156. Merrill MH (1931) Studies on Carbon Metabolism of Organisms of the Genus Mycobacterium: III. End Products of Carbohydrate Utilization as Determined in Synthetic Media Cultures. J Bacteriol 21(5): 375-381

157. Meyer-Rosberg K, Scott DR, Rex D, Melchers K, Sachs G (1996) The effect of environmental pH on the proton motive force of Helicobacter pylori. Gastroenterology 111(4): 886-900

158. Miner MD, Chang JC, Pandey AK, Sassetti CM, Sherman DR (2009) Role of cholesterol in Mycobacterium tuberculosis infection. Indian J Exp Biol 47(6): 407-411

159. Mitchison DA (2004) The search for new sterilizing anti-tuberculosis drugs. Front Biosci 9: 10591072

160. Moore PB (1995) Molecular mimicry in protein synthesis? Science 270(5241): 1453-1454

161. Moulder JW (1985) Comparative biology of intracellular parasitism. Microbiol Rev 49(3): 298337

162. Mukamolova GV, Kaprelyants AS, Kell DB, Young M (2003) Adoption of the transiently non-culturable state-a bacterial survival strategy? Adv Microb Physiol 47: 65-129

163. Mukamolova GV, Kaprelyants AS, Young Dl, Young M, Kell DB (1998a) A bacterial cytokine. Proc Natl Acad Sei USA 95(15): 8916-8921

164. Mukamolova GV, Turapov O, Malkin J, Woltmann G, Barer MR Resuscitation-promoting factors reveal an occult population of tubercle Bacilli in Sputum. Am J Respir Crit Care Med 181(2): 174-180

165. Mukamolova GV, Turapov OA, Kazarian K, Telkov M, Kaprelyants AS, Kell DB, Young M (2002a) The rpf gene of Micrococcus luteus encodes an essential secreted growth factor. Mol Microbiol 46(3): 611-621

166. Mukamolova GV, Turapov OA, Young Dl, Kaprelyants AS, Kell DB, Young M (2002b) A family of autocrine growth factors in Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol 46(3): 623-635

167. Mukamolova GV, Yanopolskaya ND, Kell DB, Kaprelyants AS (1998b) On resuscitation from the dormant state of Micrococcus luteus. Antonie Van Leeuwenhoek 73(3): 237-243

168. Munoz-Elias EJ, McKinney JD (2005) Mycobacterium tuberculosis isocitrate lyases 1 and 2 are jointly required for in vivo growth and virulence. Nat Med 11(6): 638-644

169. Munoz-Elias EJ, Timm J, Botha T, Chan WT, Gomez JE, McKinney JD (2005) Replication dynamics of Mycobacterium tuberculosis in chronically infected mice. Infect Immun 73(1): 546551

170. Muttucumaru DG, Roberts G, Hinds J, Stabler RA, Parish T (2004) Gene expression profile of Mycobacterium tuberculosis in a non-replicating state. Tuberculosis (Edinb) 84(3-4): 239-246

171. Ng V, Zanazzi G, Timpl R, Talts JF, Salzer JL, Brennan PJ, Rambukkana A (2000) Role of the cell wall phenolic glycolipid-1 in the peripheral nerve predilection of Mycobacterium leprae. Cell 103(3): 511-524

172. Nguyen L, Walburger A, Houben E, Koul A, Muller S, Morbitzer M, Klebl B, Ferrari G, Pieters J (2005) Role of protein kinase G in growth and glutamine metabolism of Mycobacterium bovis BCG. J Bacteriol 187(16): 5852-5856

173. O'Toole R, Smeulders MJ, Blokpoel MC, Kay EJ, Lougheed K, Williams HD (2003) A two-component regulator of universal stress protein expression and adaptation to oxygen starvation in Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol 185(5): 1543-1554

174. Ohno H, Zhu G, Mohan VP, Chu D, Kohno S, Jacobs WR, Jr., Chan J (2003) The effects of reactive nitrogen intermediates on gene expression in Mycobacterium tuberculosis. Cell Microbiol 5(9): 637-648

175. Okamoto S, Itoh M, Ochi K (1997) Molecular cloning and characterization of the obg gene of Streptomyces griseus in relation to the onset of morphological differentiation. J Bacteriol 179(1): 170-179

176. Okamoto S, Ochi K (1998) An essential GTP-binding protein functions as a regulator for differentiation in Streptomyces coelicolor. Mol Microbiol 30(1): 107-119

177. Oliver JD (2005) The viable but nonculturable state in bacteria. J Microbiol 43 Spec No: 93-100

178. Olson ER (1993) Influence of pH on bacterial gene expression. Mol Microbiol 8(1): 5-14

179. Paidhungat M, Setlow P (2000) Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. J Bacteriol 182(9): 2513-2519

180. Pan JW, Macnab RM (1990) Steady-state measurements of Escherichia coli sodium and proton potentials at alkaline pH support the hypothesis of electrogenic antiport. J Biol Chem 265(16): 9247-9250

181. Papavinasasundaram KG, Chan B, Chung JH, Colston MJ, Davis EO, Av-Gay Y (2005) Deletion of the Mycobacterium tuberculosis pknH gene confers a higher bacillary load during the chronic phase of infection in BALB/c mice. J Bacteriol 187(16): 5751-5760

182. Park HD, Guinn KM, Harrell Ml, Liao R, Voskuil Ml, Tompa M, Schoolnik GK, Sherman DR (2003) Rv3133c/dosR is a transcription factor that mediates the hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol 48(3): 833-843

183. Park YK, Bearson B, Bang SH, Bang IS, Foster JW (1996) Internal pH crisis, lysine decarboxylase and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium. Mol Microbiol 20(3): 605-611

184. Pedersen K, Christensen SK, Gerdes K (2002) Rapid induction and reversal of a bacteriostatic condition by controlled expression of toxins and antitoxins. Mol Microbiol 45(2): 501-510

185. Peirs P, De Wit L, Braibant M, Huygen K, Content J (1997) A serine/threonine protein kinase from Mycobacterium tuberculosis. Eur J Biochem 244(2): 604-612

186. Perez E, Samper S, Bordas Y, Guilhot C, Gicquel B, Martin C (2001) An essential role for phoP in Mycobacterium tuberculosis virulence. Mol Microbiol 41(1): 179-187

187. Pierce CH, Dubos RJ, Schaefer WB (1953) Multiplication and survival of tubercle bacilli in the organs of mice. J Exp Med 97(2): 189-206

188. Polesky A, Farber HW, Gottlieb DJ, Park H, Levinson S, O'Connell JJ, Mclnnis B, Nieves RL, Bernardo J (1996) Rifampin preventive therapy for tuberculosis in Boston's homeless. Am J Respir Crit Care Med 154(5): 1473-1477

189. Prabhakaran K, Harris EB, Randhawa B (2000) Regulation by protein kinase of phagocytosis of Mycobacterium leprae by macrophages. J Med Microbiol 49(4): 339-342

190. Ramage HR, Connolly LE, Cox JS (2009) Comprehensive functional analysis of Mycobacterium tuberculosis toxin-antitoxin systems: implications for pathogenesis, stress responses, and evolution. PLoS Genet 5(12): e1000767

191. Ramakrishnan L, Federspiel NA, Falkow S (2000) Granuloma-specific expression of Mycobacterium virulence proteins from the glycine-rich PE-PGRS family. Science 288(5470): 1436-1439

192. Raman S, Song T, Puyang X, Bardarov S, Jacobs WR, Jr., Husson RN (2001) The alternative sigma factor SigH regulates major components of oxidative and heat stress responses in Mycobacterium tuberculosis. J Bacteriol 183(20): 6119-6125

193. Rao M, Streur TL, Aldwell FE, Cook GM (2001) Intracellular pH regulation by Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium bovis BCG. Microbiology 147(Pt 4): 1017-1024

194. Rao SP, Ogata K, Catanzaro A (1993) Mycobacterium avium-M. intracellulare binds to the integrin receptor alpha v beta 3 on human monocytes and monocyte-derived macrophages. Infect Immun 61(2): 663-670

195. Raviglione MC, Snider DE, Jr., Kochi A (1995) Global epidemiology of tuberculosis. Morbidity and mortality of a worldwide epidemic. JAMA 273(3): 220-226

196. Rektorschek M, Buhmann A, Weeks D, Schwan D, Bensch KW, Eskandari S, Scott D, Sachs G, Melchers K (2000) Acid resistance of Helicobacter pylori depends on the Urel membrane protein and an inner membrane proton barrier. Mol Microbiol 36(1): 141-152

197. Rifat D, Bishai WR, Karakousis PC (2009) Phosphate depletion: a novel trigger for Mycobacterium tuberculosis persistence. J Infect Dis 200(7): 1126-1135

198. Rindi L, Fattorini L, Bonanni D, lona E, Freer G, Tan D, Deho G, Orefici G, Garzeiii C (2002) Involvement of the fadD33 gene in the growth of Mycobacterium tuberculosis in the liver of BALB/c mice. Microbiology 148(Pt 12): 3873-3880

199. Roe AJ, McLaggan D, Davidson I, O'Byrne C, Booth IR (1998) Perturbation of anion balance during inhibition of growth of Escherichia coli by weak acids. J Bacteriol 180(4): 767-772

200. Rohde K, Yates RM, Purdy GE, Russell DG (2007) Mycobacterium tuberculosis and the environment within the phagosome. Immunol Rev 219: 37-54

201. Rook GA, Seah G, Ustianowski A (2001) M. tuberculosis: immunology and vaccination. Eur RespirJ 17(3): 537-557

202. Rowbury RJ (1999) Acid tolerance induced by metabolites and secreted proteins, and how tolerance can be counteracted. Novartis Found Symp 221: 93-106; discussion 106-111

203. Rowbury RJ, Goodson M (1993) PhoE porin of Escherichia coli and phosphate reversal of acid damage and killing and of acid induction of the CadA gene product. J Appl Bacteriol 74(6): 652661

204. Russell-Goldman E, Xu J, Wang X, Chan J, Tufariello JM (2008) A Mycobacterium tuberculosis Rpf double-knockout strain exhibits profound defects in reactivation from chronic tuberculosis and innate immunity phenotypes. Infect Immun 76(9): 4269-4281

205. Rustad TR, Sherrid AM, Minch KJ, Sherman DR (2009) Hypoxia: a window into Mycobacterium tuberculosis latency. Cell Microbiol 11(8): 1151-1159

206. Salina EG, Mollenkopf HJ, Kaufmann SHE, Kaprelyants AS (2009) M. tuberculosis gene expression during transition to the "non"culturable" state. Acta Naturae 2: 73-77

207. Salina EG, Zhogina YA, Shleeva MO, Sorokoumova GM, Selishcheva AA, Kaprelyants AS Biochemical and morphological changes in dormant ("Nonculturable") Mycobacterium smegmatis cells. Biochemistry (Mose) 75(1): 72-80

208. Salkin D, Wayne LG (1956) The bacteriology of resected tuberculous pulmonary lesions. I. The effect of interval between reversal of infectiousness and subsequent surgery. Am Rev Tuberc 74(3): 376-387

209. Salmond CV, Kroll RG, Booth IR (1984) The effect of food preservatives on pH homeostasis in Escherichia coli. J Gen Microbiol 130(11): 2845-2850

210. Schade C, Flemstrom G, Holm L (1994) Hydrogen ion concentration in the mucus layer on top of acid-stimulated and -inhibited rat gastric mucosa. Gastroenterology 107(1): 180-188

211. Schaloske RH, Blaesius D, Schlatterer C, Lusche DF (2007) Arachidonic acid is a chemoattractant for Dictyostelium discoideum cells. J Biosci 32(7): 1281-1289

212. Scheindlin S (2006) The fight against tuberculosis. Mol Inten/ 6(3): 124-130

213. Schlesinger LS (1993) Macrophage phagocytosis of virulent but not attenuated strains of Mycobacterium tuberculosis is mediated by mannose receptors in addition to complement receptors. J Immunol 150(7): 2920-2930

214. Schlesinger LS, Kaufman TM, Iyer S, Hull SR, Marchiando LK (1996) Differences in mannose receptor-mediated uptake of lipoarabinomannan from virulent and attenuated strains of Mycobacterium tuberculosis by human macrophages. J Immunol 157(10): 4568-4575

215. Shah D, Zhang Z, Khodursky A, Kaldalu N, Kurg K, Lewis K (2006) Persisters: a distinct physiological state of E. coli. BMC Microbiol 6: 53

216. Shah IM, Laaberki MH, Popham DL, Dworkin J (2008) A eukaryotic-like Ser/Thr kinase signals bacteria to exit dormancy in response to peptidoglycan fragments. Cell 135(3): 486-496

217. Sherman DR, Sabo PJ, Hickey MJ, Arain TM, Mahairas GG, Yuan Y, Barry CE, 3rd, Stover CK (1995) Disparate responses to oxidative stress in saprophytic and pathogenic mycobacteria. Proc Natl Acad Sei USA 92(14): 6625-6629

218. Shleeva MO, Kudykina YK, Vostroknutova GN, Suzina NE, Mulyukin AL, Kaprelyants AS Dormant ovoid cells of Mycobacterium tuberculosis are formed in response to gradual external acidification. Tuberculosis (Edinb) 91(2): 146-154

219. Sinha RP (1986) Toxicity of organic acids for repair-deficient strains of Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 51(6): 1364-1366

220. Sirakova TD, Fitzmaurice AM, Kolattukudy P (2002) Regulation of expression of mas and fadD28, two genes involved in production of dimycocerosyl phthiocerol, a virulence factor of Mycobacterium tuberculosis. J Bacteriol 184(24): 6796-6802

221. Sirakova TD, Thirumala AK, Dubey VS, Sprecher H, Kolattukudy PE (2001) The Mycobacterium tuberculosis pks2 gene encodes the synthase for the hepta- and octamethyl-branched fatty acids required for sulfolipid synthesis. J Biol Chem 276(20): 16833-16839

222. Sissons CH, Hancock EM (1993) Urease activity in Streptococcus salivarius at low pH. Arch Oral Biol 38(6): 507-516

223. Skouloubris S, Thiberge JM, Labigne A, De Reuse H (1998) The Helicobacter pylori Urel protein is not involved in urease activity but is essential for bacterial survival in vivo. Infect Immun 66(9): 4517-4521

224. Small P, Blankenhom D, Welty D, Zinser E, Slonczewski JL (1994) Acid and base resistance in Escherichia coli and Shigella flexneri: role of rpoS and growth pH. J Bacteriol 176(6): 1729-1737

225. Snider DE, Jr., La Montagne JR (1994) The neglected global tuberculosis problem: a report of the 1992 World Congress on Tuberculosis. J Infect Dis 169(6): 1189-1196

226. Song H, Huff J, Janik K, Walter K, Keller C, Ehlers S, Bossmann SH, Niederweis M Expression of the ompATb operon accelerates ammonia secretion and adaptation of Mycobacterium tuberculosis to acidic environments. Mol Microbiol 80(4): 900-918

227. Soper WB, Amberson JB (1938) Pulmonary Tuberculosis in Young Adults, Particularly Among Medical Students and Nurses. Trans Am Clin Climatol Assoc 54: 193-220

228. Spoering AL, Lewis K (2001) Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials. J Bacteriol 183(23): 6746-6751

229. Susstrunk U, Pidoux J, Taubert S, Ullmann A, Thompson CJ (1998) Pleiotropic effects of cAMP on germination, antibiotic biosynthesis and morphological development in Streptomyces coelicolor. Mol Microbiol 30(1): 33-46

230. Talaat AM, Lyons R, Howard ST, Johnston SA (2004) The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice. Proc Natl Acad Sei USA 101(13): 4602-4607

231. Talarico S, Durmaz R, Yang Z (2005) Insertion- and deletion-associated genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis phospholipase C-encoding genes among 106 clinical isolates from Turkey. J Clin Microbiol 43(2): 533-538

232. Thompson SA, Blaser MJ (1995) Isolation of the Helicobacter pylori recA gene and involvement of the recA region in resistance to low pH. Infect Immun 63(6): 2185-2193

233. Traag BA, Driks A, Stragier P, Bitter W, Broussard G, Hatfull G, Chu F, Adams KN, Ramakrishnan L, Losick R Do mycobacteria produce endospores? Proc Natl Acad Sei USA 107(2): 878-881

234. Trach K, Hoch JA (1989) The Bacillus subtilis spoOB stage 0 sporulation operon encodes an essential GTP-binding protein. J Bacteriol 171(3): 1362-1371

235. Tsai MC, Chakravarty S, Zhu G, Xu J, Tanaka K, Koch C, Tufariello J, Flynn J, Chan J (2006) Characterization of the tuberculous granuloma in murine and human lungs: cellular composition and relative tissue oxygen tension. Cell Microbiol 8(2): 218-232

236. Tsuda M, Karita M, Morshed MG, Okita K, Nakazawa T (1994) A urease-negative mutant of Helicobacter pylori constructed by allelic exchange mutagenesis lacks the ability to colonize the nude mouse stomach. Infect Immun 62(8): 3586-3589

237. Vandal OH, Pierini LM, Schnappinger D, Nathan CF, Ehrt S (2008) A membrane protein preserves intrabacterial pH in intraphagosomal Mycobacterium tuberculosis. Nat Med 14(8): 849-854

238. Velmurugan K, Chen B, Miller JL, Azogue S, Gurses S, Hsu T, Glickman M, Jacobs WR, Jr., Porcelli SA, Briken V (2007) Mycobacterium tuberculosis nuoG is a virulence gene that inhibits apoptosis of infected host cells. PLoS Pathog 3(7): e110

239. Vidwans SJ, Ireton K, Grossman AD (1995) Possible role for the essential GTP-binding protein Obg in regulating the initiation of sporulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol 177(11): 3308-3311

240. Voskuil Ml (2004) Mycobacterium tuberculosis gene expression during environmental conditions associated with latency. Tuberculosis (Edinb) 84(3-4): 138-143

241. Voskuil Ml, Schnappinger D, Visconti KC, Harreil Ml, Dolganov GM, Sherman DR, Schoolnik GK (2003) Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program. J Exp Med 198(5): 705-713

242. Voskuil Ml, Visconti KC, Schoolnik GK (2004) Mycobacterium tuberculosis gene expression during adaptation to stationary phase and low-oxygen dormancy. Tuberculosis (Edinb) 84(3-4): 218-227

243. Votyakova TV, Kaprelyants AS, Kell DB (1994) Influence of Viable Cells on the Resuscitation of Dormant Cells in Micrococcus luteus Cultures Held in an Extended Stationary Phase: the Population Effect. ApplEnviron Microbiol 60(9): 3284-3291

244. Wang AY, Cronan JE, Jr. (1994) The growth phase-dependent synthesis of cyclopropane fatty acids in Escherichia coli is the result of an RpoS(KatF)-dependent promoter plus enzyme instability. Mol Microbiol 11(6): 1009-1017

245. Waterman SR, Small PL (1996) Identification of sigma S-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri. Mol Microbiol 21(5): 925-940

246. Wayne LG (1954) Growth of Mycobacterium tuberculosis from resected specimens under various atmospheric conditions. Am Rev Tuberc 70(5): 910-911

247. Wayne LG, Lin KY (1982) Glyoxylate metabolism and adaptation of Mycobacterium tuberculosis to survival under anaerobic conditions. Infect Immun 37(3): 1042-1049

248. Wayne LG, Sohaskey CD (2001) Nonreplicating persistence of mycobacterium tuberculosis. Annu Rev Microbiol 55: 139-163

249. Wayne LG, Sramek HA (1994) Metronidazole is bactericidal to dormant cells of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother 38(9): 2054-2058

250. Wei J, Dahl JL, Moulder JW, Roberts EA, O'Gaora P, Young DB, Friedman RL (2000) Identification of a Mycobacterium tuberculosis gene that enhances mycobacterial survival in macrophages. J Bacteriol 182(2): 377-384

251. Welsh KM, Trach KA, Folger С, Hoch JA (1994) Biochemical characterization of the essential GTP-binding protein Obg of Bacillus subtilis. J Bacteriol 176(23): 7161-7168

252. Wiegeshaus EH, McMurray DN, Grover AA, Harding GE, Smith DW (1970) Host-parasite relationships in experimental airborne tuberculosis. 3. Relevance of microbial enumeration to acquired resistance in guinea pigs. Am Rev RespirDis 102(3): 422-429

253. Wieles B, Ottenhoff TH, Steenwijk TM, Franken KL, de Vries RR, Langermans JA (1997) Increased intracellular survival of Mycobacterium smegmatis containing the Mycobacterium leprae thioredoxin-thioredoxin reductase gene. Infect Immun 65(7): 2537-2541

254. Wilson TM, de Lisle GW, Collins DM (1995) Effect of inhA and katG on isoniazid resistance and virulence of Mycobacterium bovis. Mol Microbiol 15(6): 1009-1015

255. Wu X, Yang Y, Han Y, Zhang J, Liang Y, Li H, Li B, Wang L (2008) Effect of recombinant Rv1009 protein on promoting the growth of Mycobacterium tuberculosis. J Appl Microbiol 105(4): 1121-1127

256. Xu S, Cooper A, Sturgill-Koszycki S, van Heyningen T, Chatteijee D, Orme I, Allen P, Russell DG (1994) Intracellular trafficking in Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium-infected macrophages. J Immunol 153(6): 2568-2578

257. Young GM, Amid D, Miller VL (1996) A bifunctional urease enhances survival of pathogenic Yersinia enterocolitica and Morganella morganii at low pH. J Bacteriol 178(22): 6487-6495

258. Yuan Y, Crane DD, Simpson RM, Zhu YQ, Hickey MJ, Sherman DR, Barry CE, 3rd (1998) The 16-kDa alpha-crystallin (Acr) protein of Mycobacterium tuberculosis is required for growth in macrophages. Proc Natl Acad Sei USA 95(16): 9578-9583

259. Yuan Y, Lee RE, Besra GS, Belisle JT, Barry CE, 3rd (1995) Identification of a gene involved in the biosynthesis of cyclopropanated mycolic acids in Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sei USA 92(14): 6630-6634

260. Zhang Y (2004) Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Front Biosci 9: 1136-1156

261. Zhang Y, Yang Y, Woods A, Cotter RJ, Sun Z (2001) Resuscitation of dormant Mycobacterium tuberculosis by phospholipids or specific peptides. Biochem Biophys Res Commun 284(2): 542547

262. Zhang Y, Zhang H, Sun Z (2003) Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to weak acids. J Antimicrob Chemother52^): 56-60

263. Коновалова Е.Ю., Эль-Регистан Г.И., И.П. Б (1985) Динамика и накопление ауторегуляторных факторов di и d2 дрожжами Rhodosporidium toruloides. Биотехнология{3): 71-74

264. Светличный В.А., Эль-Регистан Г.И., Романова А.К. ДВИ (1983) Характеристика ауторегуляторного фактора d2, вызывающего автолиз клеток Pseudomonas carboxydoflava и Bacillus cereus. Микробиология 52: 33-38

265. Скулачев ВП (1989) Учеб. пособ. для биол. и мед.-БбЗ биол.спец. вузов/Под ред. A.A. Болдырева. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии. М: Высш шк Книга 6: 220-221

266. Ткаченко АГ, Чудинов АА (1989) Обмен полиаминами между клеткой и средой как один из факторов, определяющих развитие культур Escherichia coli с подпиткой. Микробиология 4(58): 584-590

267. Шлеева МО, Мукамолова ГВ, Телков MB, Березинская ТЛ, Сыроешкин AB, Бикетов СФ, Капрельянц АС (2003) Образование "некультивируемых" клеток Mycobacterium tuberculosis и их оживление. Микробиология 72(1): 76-831. БЛАГОДАРНОСТИ

268. Автор выражает глубокую признательность Маргарите Олеговне Шлеевой за переданные знания и опыт, непосредственное участие в постановке экспериментов и неоценимую помощь при обсуждении результатов.

269. Отдельная благодарность доктору биологических наук Андрею Львовичу Мулюкину за помощь в проведении экспериментов по электронной микроскопии и интерпретации полученных данных, а также за внимательное отношение к работе и рецензирование публикаций.

270. Благодарю всех друзей и коллег за поддержку и внимание к моей работе.

Информация о работе

Кудыкина, Юлия Константиновна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

pH-индуцируемое образование покоящихся форм микобактерий и роль аденилатциклазы в их реактивации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы