Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности процесса денитрификации в засоленных почвах

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности процесса денитрификации в засоленных почвах"

РГ6 ОА

- 8 OUI ^35

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.М.В.ЛОМОНОСОВА Факультет почвоведения

На правах рукописи

МЕНЯЙЛО Олег Владимирович

ОСОБЕННОСТИ ПРОЦЕССА ДЕНИТРИФИКАЦИИ В ЗАСОЛЕННЫХ

ПОЧВАХ

Специальность 03.00.07- микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1996 г.

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета Почвоведения Московского Государственного Университета им. М. В. Ломоносова '

Научный руководитель: доктор биологических наук, ' . профессор М.М.Умаров

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В. Т.Емцев кандидат биологических наук, ст. н. с. Е. В. Лебедева

Ведущее учреждение: Институт почвоведения и фотосинтеза РАН

Защита диссертации состоится " " дэв г.

в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета по микробиологии и агрохимии К. 053.05.86 в МГУ им. М. В. Ломоносова

Адрес: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Факультет Почвоведения, Ученый совет. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета Почвоведения МГУ.

Автореферат разослан " и _ 1996 г.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании диссертационного совета, а отзывы на автореферат в 2-х экземплярах просим направлять по указанному выше адресу.

Ученый секретарь ___

диссертационного совета Д/эЛЛ^у к. б.н. И. П.Бабьева

Актуальность темы. Проблема аридизации суши и неуклонного увеличения площадей засоленных почв признана приоритетной на уровне ООН (Varyallyay, 1994). Более 35% земель мира подвержены опустыниванию и засолению (Ковда, 1992). Причиной такого быстрого увеличения ареала засоленных почв называют комплекс факторов, обусловленных глобальным изменением климата и неумелой хозяйственной деятельностью человека.

Беспрецедентным примером такого изменения природы является усыхание Аральского моря, ставшего моделью возможных изменений окружающей среды под воздействием естественных и антропогенных факторов.

На солончаках было впервые обнаружено явление торможения денитрификации на стадии образования закиси азота (М2 0) (Umarov et al., 1989; Кромка и др. ,1991). что при отмеченных темпах засоления почв может являться одной из причин наблюдаемого ныне повышения концентрации N20 в атмосфере. Как известно, по биогеохимической классификации газов закись азота относится к числу активных микрокомпонентов атмосферы из-за своей способности влиять на тепловой баланс планеты и разрушать ее озоновый экран (Bouwman, 1990). Известно также, что среди различных природных и антропогенных процессов образования закиси азота ведущим признается микробиологическая денитрификация в почвах, осуществляемая исключительно широким кругом бактерий (Umarov, 1990; Davidson, 1994; Костина и др. ,1994). В то же время пока нет сведений о причинах торможения денитрификации в засоленных почвах на стадии образования М20. Нет также данных для экстраполяции результатов, полученных на солончаках Приаралья, на почвы других типов, подвергающихся засолению.

В этой связи представлялось необходимым изучить особенности процесса денитрификации в широком ряду засоленных почв и выяснить возможные механизмы торможения его на стадии образования

мго.

Целы» работы было изучение микробиологических особенностей

процесса денитрификации в естественно-засоленных почвах, а также в модельных искусственно-засоленных почвах, для которых ухе наблюдаются процессы зторичного засоления.

В задачи исследования входило:

1.Изучить активность и биомассу денитрифицирующих микроорганизмов в засоленных и незаселенных почвах.

2.Изучить влияние солей на активность отдельных этапов процесса денитрификации в засоленных почвах и у чистых культур микроорганизмов.

3.Изучить влиянье солей на разные этапы процесса денитрификации в зональных (незасоленных) почвах при их искусственном засолении.

4.Определить влияние отдельных солей (хлориды, сульфаты, карбонаты), характерных для засоленных почв, а также их смесей на активность денитрификации в почве.

Научная новизна. Впервые определена зависимость биомассы и активности микроорганизмов, осуществляющих денитрификацию, от концентрации и качественного состава солей в почве. Подтверждено для широкого ряда засоленных почв, включая и вторично-засоленные, что ^0 является основным конечным продуктом процесса денитрификации. Установлено для чистых культур бактерий-денит-рификаторов и для почв разных типов, что повышение концентрации солей вызывает в первую очередь ингибирование процесса на стадии восстановления закиси азота. Впервые показано, что редукта-за закиси азота - наиболее чувствительный по отношению к солям фермент в цепи денитрификации.

Практическая ценность. Из разных почв засоленного ряда выделена коллекция гапотолерантных и умеренно г&лофильных микроорганизмов, способных восстанавливать закись азота. Определены концентрации солей в почве, при которых блокируется восстановление закиси азота. Выяснено влияние чистых солей и их смесей на О-родуктаэу. Остановлено, что наиболее сильном ингиоирую-с;иы действием обладают НагСОа. ?1аНС0;{ и ИаС1. Впервые показан

эффект антагонизма солей для N2О-редуктазы. что может быть использовано для снижения уровня эмиссии закиси азота в атмосферу из засоленных почв. Материалы диссертации могут быть также использованы в исследованиях по микробиологии, биохимии и биогеохимии засоленных почв, при прогнозировании экологических последствий засоления почв, при создании имитационных математических моделей. Полученные результаты используются в курсе лекций по биологии почв и физиологии микроорганизмов, читаемых на факультете Почвоведения МГУ.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на экологической секции Международной конференции "Transformations of Russia - transformations of the World" (Дания, 1993), на конференции молодых ученых МГУ (Москва, 1994), на заседании лаборатории азотного метаболизма Института биохимии им.Баха (Москва. 1995), на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукaw "Ломоносов-96" (Москва, 1996), на заседании III комиссии ВОП (Москва, 1996), на II сьезде Российского общества почвоведов (Санкт-Петербург, 1996).

Публикации. Материалы диссертации изложены в 9 работах.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, экспериментальной части, заключения и выводов. Материалы диссертации изложены на стр. машинописного текста, список литературы состоит из названий, из них зарубежные.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работу проводили на образцах засоленных почв, отобранных на обсохшей и прилегающей частях Аральского моря. Характеристика почв приведена в таблице 1. В ряде экспериментов по моделированию засоления использовали образцы почв зональных типов: дерново-подзолистой, чернозема обыкновенного, темно-каштановой, серозема. Их характеристика приведена в диссертации.

Анализ газов (М?0. СО?) проводили на газовом хроматографе Московского опытного завода "Хроматограф"- модель 3700/4. Использовали колонки из нержавеющей стали диаметром 2 мм. длиной 3 м. Колонки заполняли адсорбентом Полисорб-1. Температура ка-тарометра 100 °С. измерительных элементов 150 °С. ток измерительных элементов 148 мА. Температура термостата 30 °С. камеры впрыска 40 °С, объем вводимой пробы 0.5 см3. Скорость потока газа - носителя (гелий) - 30 мл/мин.

Для определения активности дыхания почв (по эмиссии С0г) 10 г воздушно-сухой почвы помещали во флакон объемом 50 мл, увлажняли дистиллированной водой до 6036 ППВ. Проводили прединку-бацию в течение 3 суток при 28°. Затем вводили раствор глюкозы (10 мл) из расчета 2.5 мг глюкозы на 1 г почвы. Герметично закрывали резиновыми пробками, фиксировали зажимами, инкубировали при 28°. Через 1 сутки измеряли количество выделившейся СОг-Активность дыхания выражали в нкг С-С02/г/ч.

Активность денитрификации определяли двумя методами: (1) по скорости эмиссии N¿0 и (2) по скорости ее потребления. В первом случае использовали ацетилен в качестве ингибитора ре-дуктазы закиси азота (Методы.... 1992). Для этого навеску воз-дуино-сухой почвы массой 15 г помещали в стеклянный флакон (50 мл), увлажняли 5 мл дистиллированной воды и прединкубировали в течение 3 суток при температуре 28°. Затем добавляли по 1 мл раствора глюкозы и нитрата калия из расчета 0.2 мг И-МОз" и 2.5 мг глюкозы на 1 г почвы. Флаконы закрывали резиновыми пробками, фиксировали зажимами, вводили 3 см3 ацетилена и инкубировали в течение 6 часов при 28°. Затем отбирали 0.5 см3 газовой пробы и анализировали на газовом хроматографе. Во втором случае почву готовили аналогичным образом. Однако, вместо нитрата калия в герметично закрытые флаконы вводили 0.2 см3 Мг0 и инкубиооьали при 28°. Газовые пробы отбирали через 1 и в часов после начала эксперимента. Активность выражали в микрограшах М-й20 на 1 г почпы за 1 час.

Название почвы Место отбора Глубина 50*4/С Г Сумма солей % РН < Сорг. %

1 Серо-бурая пустынная С ы рдар ьинская СЛ1 /о /0

х рящевато-щебнистая обл. ( Приаралье) 2-8 0.3 0.25 7.62 2.1

2 Серозем луговый

солончаковый ......./......... 1.5-17 0.35 0.4 8.06 2.5

3 Пустынная песчаная

слаборазвитая засоленная ...../-—-..... 0-4 1.2 0.52 8.16 1.2

4 Примитивная песчаная ....../.....—- 0-3 1.5 0.60 8.06 0.3

5 Такыровидная

остаточно-луговая -----/........ 0-5 2.0 0.60 8.04 1.0

6 Солончак корковый 1 Обсохшая часть дна

Аральского моря 0-5 3.1 5.0 8.94 0.8

7 Солончак отакыренньш ......./........ 0-6 3.4 5.5 8.68 1.1

8 Солотгчак луговый

отлкыривающийся —......./....... 6-24 4.0 5.8 8.92 1.8

9 Солончак корковый 2 .........../...... - 0-7 3.5 10.3 7.81 0.7

Таблица 1. Некоторые свойства засоленных почв, использованных для исследования

Общую биомассу гетеротрофных микроорганизмов расчитывали кинетическим методом, используя данные по эмиссии С0г (Пани-ков, 1992).

Биомассу бактерий-денитрификаторов определяли кинетическим методом на основе данных по эмиссии и потреблению N20 (Методы. ...1992). Биомассу выражали в мкг С на 1 г почвы.

Оценку численности бактерий в почвах проводили методом посева на агаризованные питательные среды - МПА, Rich, Бакстера с 5% и 10% NaCI.

Оценку численности денитрификагогов проводили методом предельных разведений на жидкой питательной среде Эшби.

Для изучения влияния солей на активность эмиссии N?0 из почв отбирали навеску в 15 г, помещали в стеклянный флакон объемом 50 мл, увлажняли дистиллированной водой до 605! ППВ и проводили прединкубацию в течение 5 дней. Затем вводили раствор нитрата калия из расчета 0.2 мг KN03 на 1 г почвы и глюкозы из расчета 2.5 мг на 1 г почвы и растворы солей (НагС03; NaHC03; NaCI; NajS04; MgS04; СаС1г) в различных концентрациях. Флаконы закрывали резиновыми пробками, фиксировали пластмассовыми зажимами, для создания анаэробных условий кислород вытесняли из газовой фазы аргоном. В течение 7 дней с интервалом в 1 сутки определяли количество образовавшейся закиси азота.

Исследование совместного влияния солей проводили аналогично, используя соли CaCI2, NagS04 и ИагСОз в разных концентрациях на постоянном "фоне" NaCI в 2 М.

Изучение чувствительности различных ферментов процесса де~ нитрификации к NaCI проводили на образце темно-каштановой почвы. Для этого навеску воздушно-сухой почвы в 15 г помещали в стс1слянный флакон объемом 50 мл. увлажняли дистиллированной водой до 6056 ППВ и проводили прединкубацию в термостате при 2« °С в течение 5 суток. Затем вносили раствор глюкозы из расчета 2.5 мг на 1 г почвы и в качестве конечных акцепторов электронов -различимо окисленные соединения азота: нитраты (0.2 иг/г поч-

вы), нитриты (0.1 мг/г) з виде растворов; окись азота и закись

о

азота в виде хроматографически-чистых газов вводили по 0.5 см медицинским шприцем в газовую фазу. Кроме того, чувствительность различных ферментов денитрификации к солям изучали у бактерий Bacillus subtilis 2, выделенных из солончака коркового и отличавшихся высокой активностью денитрификации. Культивировали бактерии на среде Зшби.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

На начальном этапе работы в сравнительном плане двумя методами (по образованию и потреблению закиси азота) была изучена активность денитрификации в образцах засоленных почв Приаралья и некоторых зональных почв (дерново-подзолистой и чернозема) (рис.1). Полученные при этом данные подтвердили, что и в солончаках Приаралья скорость выделения Н20 преобладает над ее потреблением, в то время как в почвах других типов наблюдается обратное соотношение.

Измерение биомассы бактерий-денитрификаторов кинетическим методом по величине эмиссии и потребления закиси азота показало, что во всех изучавшихся в опытах почвах, исключая солончаковые, биомасса "потребляющих" Ng0 микроорганизмов примерно равна биомассе N20 "выделяющих" микроорганизмов (рис.2). В то же время в солончаках доля первых составляет примерно 30% от общей биомассы денитрификаторов. Таким образом, подтверждены полученные ранее данные (Кромка и др.,1991) о специфических особенностях протекания денитрификации в засоленных почвах.

С целью выяснения причин этого явления были определены численность, активнрсть и рассчитана биомасса денитрификаторов в почвах засоленного ряда с разным типом засоления и содержанием солей (табл.1). На основе данных по образованию COg (рис.3) была рассчитана также суммарная биомасса гетеротрофных микроорганизмов в засоленных почвах Приаралья.

Дерново- Чернозем Солончак

подзолистая

Рис.! Активность денитрификации в почвах зональных типов, измеренная двумя методами: (1)-по эмиссии, (2)-по потреблению N¿0

Дерново- Чернозем Солончак

подзолистая

Рис.2 Биомасса денитрификаторов в почвах зональных типов,измеренная по восстановлению ЫаО(1) и г выделению ЫгО (2)

Общая биомасса организмов этой группы тесно коррелировала с запасом органического вещества в почвах и составляла от 20 до 60 мкг С на г почвы, что по имеющимся в литературе оценкам и полученными нами данным в 2-3 раза меньше, чем, например, в черноземе.

Степень засоления прямо влияла на образование закиси азота - возрастала активность выделения и падала активность потребления N20 (рис.4). Данные о биомассе этих двух групп денитрифика-торов (рис.5) свидетельствуют о кажущемся преимущественном сокращении доли N2 0-оосста) :авливающих микроорганизмов на фоне общего снижения биомассы денитрификаторов по мере возрастания степени засоленности почв.

Все эти результаты позволяют сделать первый общий вывод о том, что преобладание в засоленных почвах И20 в составе продуктов денитрификации обусловлено преимущественным подавлением у денитрифицирующих бактерий их способности к восстановлению закиси азота до N2.

Для понимания причин этого явления существенно важным было выяснить - являются ли различия в биомассе Н20-потребляющих и N20-выделяющих бактерий следствием различий в составе микробного комплекса засоленных почв на уровне видов, родов и т.д., или же это обусловлено подавлением активности некоторых ферментов денитрификации у представителей бактерий, доминирующих в таких почвах?

Отметим в этой связи, что имеется относительно большой материал о влиянии солей на нитратредуктазу высших растений. Показано, что среднее засоление (0,6% ИаС1) приводит к диссоциации молибдена в молекуле нитратредуктазы, а более сильное (1% ИаСП - к диссоциации всей молекулы кофактора. Известно также, что N20 - редуктаза бактерий содержит медь вместо молибдена, тогда как другие ферменты цепи диссимиляторной нитратредукции во многом подобны по свойствам ассимиляторным нитратредуктазам бактерий и растений (Львов, 1989).

Рис.3 Активность образования СОг в засоленных почвах (здесь и далее названия почв см. табл.1)

Рис.4 Активность /¡енигрификацни п образцах засоленных почв, измеренная по потреблению N¿0 (1) и по

¡»миссии N2О (2)

Возможно, именно эти особенности редуктазы закиси азота делают ей более чувствительной к присутствию солей.

С другой стороны, имеются противоречивые дачные об особенностях микробного комплекса засоленных почв. Например, отмечается, что он характеризуется специфическим качественным и количественным составом, причем наиболее четко это проявляются на галофильной части бактериального сообщества (Gallnskl. 1994).

Исходя из этого мы определили в составе денитрификаторов долю галофильных и долю галотолерантных бактерий. С этой целью методом посева была определена численность основных групп микроорганизмов в этих почвах (рис. 6). Количество микроорганизмов, учитываемых на МПА и среде Rich, составляло 105-106 колоний-образующих единиц (КОЕ) на 1 г почвы, в то время как на среде Бакстера (с 5% и 1056 NaCI) для учета галофильных микроорганизмов численность КОЕ было на 1-2 порядка ниже. Следовательно, во всех изученных наш засоленных почвах доминируют галото-лерантные гетеротрофные бактерии, что в целом совпадает с имеющимися в литературе данными (Емцев, Мишустин. 1993). Об этом свидетельствует также то, что численность бактерий в слабозасо-ленных почвах примерно равна их численности в сильнозасоленных солончаках, содержание солей в которых было выше почти в 50 раз. С другой стороны, относительно высокая численность бактерий обнаружена в. почве с минимальной активной биомассой, свидетельствуя о том, что основная часть' бактерий находится в неактивном состоянии. Таким образом, нами не было обнаружено существенных качественных различий в составе бактериального комплекса почв с разным уровнем засоления. В почвах с высоким содержанием солей и в почвах с их низким содержанием доминировали представители родов Bacillus и Pseudomonas.

Учет численности денитрифицирующих бактерий в засоленных почвах был проведен на среде Эиби без дополнительного введения солей. Согласно полученным данным (рис.7), в отсутствие солей численность N20-выделяющих и ^-потребляющих денитрификаторов

Рис.5 Биомасса денитрнфикаторов в образцах засоленных но измеренная но потреблению NgO (1) и выделению N^O (2)

почвы

Рис.6 Численность бактерий в засоленных почвах: и среде M1IA (1), Rich (2), Вакстера с 5% (3) и 10% (.1) NaCl

в почвах Приаралья примерно равна. Исходя из всей полученной нами информации можно утверждать, что преимущественное образование закиси азота в засоленных почвах не является следствием каких-либо особенностей в составе микробного комплекса засоленных почв.

Можно полагать, что преобладание эмиссии N¡>0 над её потреблением в этих почвах вызывается, вероятнее всего, ингибиро-ванием солями М20-рсдуктазы.

Для проверки обоснованности этого вывода было изучено в модельных опытах влияние NaCI на денитрифицирующую активность чистых культур денитрифицирующих микроорганизмов. Объектом исследования служили 5 штаммов бактерий - представителей разных родов, проявивших высокую активность денитрификации. Культивирование вели на среде Эшби с разным содержанием NaCI - от 1 до 7%. Некоторые результаты этих экспериментов приведены на рис. 8 и 9.

Как и предполагалось, наблюдались значительные различия в способности денитрифицирующих бактерий осуществлять разные этапы процесса денитрификации. Так, выделение Nz0 у Вас.subtllls 2 наблюдалось до 7% NaCI, тогда как потребление Ng0 - только до 355 (рис.8). Примерно такие же результаты получены и для других культур (рис.9). Концентрация соли, которая ингибирует потребление закиси азота, почти во всех случаях ниже, чем её концентрация, ингибирующая образование М20. Эти данные подтверждают предположение, что N2 0-редуктаза обладает повышенной чувствительностью к присутствию солей нежели остальные ферменты денитрификации. Можно полагать также, что преимущественное образование N20 в засоленных почвах связано прежде всего с ингибирова-нием солями N20-редуктазы денитрифицирующих микроорганизмов.

Согласно этому выводу, внесение в незасоленную почву солей должно приводить к преимущественному подавлению процесса потребления N,->0. Это предположение било проверено п зкепер'"''""' с искусственным засолением образцов почв разных типоп - чопно-

сере пустынная солончак солончак

бур.пустьга. песч. корк. луг.

Рис.7 Численность денитрификаторов в засоленных почвах, потребляющих N¿0 (1) и выделяющих N¡¡.0 (2)

ИаС1 <Х)

Рис.8 Влияние ЫаС1 на активность денитрификации у Вас. 5иЬ11Л5 2: выделение N¡,0 (1) и потребление N¿0 (2)

ВасШиз кр.1 СогупеЬайвг. АгтгоЬасПег ВасШих ВасШих $р.З

Рис.9 Влияние ЫаО на выделение (1) и потребление N20 (2) чистыми бактериальными культурами

12

10

и

\

о* 8

и

и 6

м 58 4

О

2

0 <

10

н—(-

н—н

-*~1 2

5

6 7

15

сутки

Рис.10 Динамика образования СО^ темно-каштановой почвой при создании в ней концентрации №С1: 1) 0%; 2)-0.5%; 3)-1%; 4)-2.5%; 5)-5%; 6)-1(>%; 7>-15%

зема, серозема, темно-каштановой.

Данные по влиянию искусственного засоления на эмиссию диоксида углерода и закиси азота из темно-каштановой почвы представлены на рис.10 и 11. Как и следовало ожидать, с увеличением концентрации всех испытанных в опытах солей в почие резко падала активность "дыхания" (выделения С02). Так. при создании максимальной концентрации ИаС1 (15%) активность образования и эмиссии С02 снижалась почти в 5 раз по сравнению с контролем, что свидельствовало о переходе большинства микроорганизмов в неактивное состояние.

Принципиально иной характер носила динамика образования и выделения Поскольку в систему не был введен ацетилен, ко-

торый является специфическим ингибитором редуктазы закиси азота, то под "образованием" следует понимать суммарный процесс между образованием и потреблением 1Ч20. В контроле (без внесения НаС1), а также при минимальной концентрации соли в вносимом растворе (0.5%) выделения И20 не наблюдалось, что свидетельствует с протекании процесса денитрификации до конца, т. е. до стадии образования молекулярного азота.

Дальнейшее повышение уровня засоления почвы приводило к постепенному увеличению доли И20 в конечных продуктах денитрификации, причем максимум выделения 1<20 наблюдался при максимальной концентрации вносимой соли. Характерно, что при этом общая интенсивность образования закиси азота (активность денитрификации) падала с увеличением солености среды аналогично подавлению активности дыхания (эмиссии С02), однако скорость поглощения (восстановления) закиси азота ингибировалась значительно сильнее. Так, при максимальной концентрации солей потребление М20 отсутствовало практически полностью, что однозначно свидетельствует о полном ингибировании редуктазы закиси азота. Таким образом, подтверждено высказанное нами ранее предположение, что доминирование закиси азота в конечных продуктах денитрификации в засоленных почвах связано с высокой чувствитель-

-tr- 3 -к-4

-+-7

сутки

Рис.11 Динамика образования закиси NzO темно-каштановой почвой при создании и ней концентрации NaCI: 1 )-0%; 2) 0.5%; 3)-1%; 4)-2.5%; 5)-5%; 6)-10%; 7)15%

2.5 M

5 M

NaCI

Рис.12 Влияние разных концентраций NaCI h.i ->,чн<... N20 из образцов некоторых почв яоилльныт гнпоп

ностью редуктазы закиси азота к присутствию солей.

С целью проверки возможности экстраполяции этого вывода на почвы других типов экспериментальному засолению были подвергнуты образцы чернозема и серозема (рис.12). Отметим, что сравнение данных по интенсивности образования закиси азота в образцах трех разных типов почв позволяет выделить темно-каштановую почву, как наиболее чувствительную к засолению. Активность эмиссии N30 из нее преобладала над активностью эмиссии закиси азота из чернозема и серозема при всех изученных концентрациях ИаС1.

Другая особенность состоит в том, что степень ингибирова-ния N3О-редуктазной активности у почв разных типов при всех испытанных уровнях засоления неодинакова, что определяется, возможно, неодинаковой буферностью этих почв к засолению, определяемой составом ионов в ППК.

Тем не менее, общая картина изменения состава конечных продуктов денитрификации ( N2 0 и №2) во всех трех почвах была сходной - засоление способствовало возрастанию доли закиси азота.

Для выяснения возможных механизмов торможения денитрификации в засоленных почвах на стадии образования закиси азота было изучено отношение к присутствию солей других ферментов процесса денитрификации: соответственно, Ш3~,Ж)2~ и ИО-редуктаз. С этой целью был поставлен модельный опыт по изучению влияния разных концентраций №аС1 на отдельные эте 1 денитрификации. В качестве конечных акцепторов электронов использовали в разной степени окисленные соединения азота: N03", Ш2~, N0, И20. Об активности соответствующих ферментов у микроорганизмов -денитрификаторов в почве судили по скорости образования N¡0 в присутствии ацетилена для первых трех соединений и по потреблению ее - последнего. Как видно из данных, приведенных в таблице 2, наиболее чувствительным к солям ферментом является ^О-редуктаза. Так, при создании в почве концентрации ИаС1 в 5% потребление закиси азота полностью тормозилось. На втором месте по чувствительности к

Табл.2 Чувствительность основных ферментов процесса денитрификации к НаС1 в темно-каштановой почве

1.................— г 1 источник! 1 N1 1 МаС1 1 • ■ ----- 'Г 1 но3- 1 1 1 — - г 1 М)2~ 1 1 1 1 N0 1 —1 Н20 1

1 0 % г 1 г 1 100 1 1 1 100 1 1 100 1 100 1

1 5 % 1 1 1 4.81 1 1 1 13.88 1 1 13.89 1 0 1

1 10 % 1 1 1 1 1.10 1 1 1 3.36 1 1 1.82 1 0 1

I 20 % 1 . 1 1 ■1 1 0.18 1 1 0.17 1 ..............1 0.75 1 .„ , ___________ ,1 0 1 ...... .1

20 -

N301

Рис. 13 Активность ферментоп деннтрифнкаии( Вас. киЬШ^ 2 при разной хоннштранш)

солям находится N03~- редуктаза; при концентрации соли 5% ее активность снижалась примерно в 20 раз и при 10% - почти в 100 раз. Наименее чувствительными ферментами в цепи денитрификации являются N02", NO-редуктазы. проявляющие примерно одинаковую устойчивость к присутствию солей в почве. В частности, при концентрации NaCI в 5% их активность падала до 1356 по сравнению с вариантом без внесения этой Соли.

Проверка закономерностей изменения активности различных ферментов процесса денитрификации в присутствии солей была проведена с использованием культуры бактерий Bacillus subtllus 2 -активного денитрификатора, выделенного из солончака (рис.13). Характерно, что в целом для бактерий наблюдается почти полная аналогия с почвами в отношении чувствительности различных ферментов процесса денитрификации к NaCI. Отличие состоит только в том, что ферменты в клетках чистой культуры бактерий реагировали на присутствие NaCI в значительно меньших концентрациях (0-636), чем в опытах с почвой. Активность Nz 0-редуктазы подавлялась полностью уже при концентрации соли i%, тогда как у остальных ферментов активность сохранялась до 6%.

Среди других трех ферментов наиболее солечувствительным также является нитратредуктаза, активность которой падала в 11 раз при концентрации NaCI в 636 по сравнению с контролем.

Поскольку различные катионы и анионы могут по-разному влиять на активность отдельных ферментов, то с этой целью (помимо NaCI) было изучено токсическое действие на N20-редуктазу других солей, наиболее часто встречающихся в почвах. Как видно из данных. представленных на рисунке 14, наибольшим токсическим действием при одной и той же концентрации обладают NaCI и Na2S04, а наименьшим - СаС12 и MgS04.

Известно, что карбонат и бикарбонат натрия в почве отличаются наибольшим неблагоприятным действием на растения (т. н. "содовое" засоление), резко ухудшают многие свойства почв ("черные" солончаки).

0N3014М

□ №С12М

Г-1 ' . | □ №С1 1 М

1 5

1 ¡?" | ■ N3^0,2 М

Ь'- ] а N3^50,1 М

а N3,80,0.5 М

7 0СзС121 М

0 Мд50,1 М

Рис.14 Влияние различных солей на эмиссию N20 из темно —каштановой

почвы

сутки

Рис.15 Влияние разной концентрации СаСЛ^и ЫаС! (2 М] на эмиссию ЫгО из темно-каштановой почвы

Рис.16 Совместное влияние в разной

концентрации и ЫаС1 на эмиссию N¿0 из темно-каштановой почвы

В известной нам литературе нет данных о влиянии содового засоления на процессы азотного цикла в почве. Мы исследовали действие этих солей на активность NgO-редуктазы. Установлено, что уяе при концентрациях NagC03 в 0.01М и 0.1М для NaHC03 происходило полное подавление активности всех ферментов процесса денитрифккации и N20 не регистрировалась, что позволяет рассматривать эти соли как самые токсичные по отношению к денитрифицирующим бактериям. По этим данным был построен ряд токсичности солей для денитрифицирующих бактерий по аналогии с имеющимися в литературе данными для растений:

Nag С03 > NaHC03 > NaCI > Wa2S04 > MgS04 > CaCI2.

Полученный нами ряд обнаруживает большое сходство с данными Крогулеаич P.E.' (1987) и с рядом, приведенным Ковдой В.А (1984). Вероятно, мы наблюдали проявление общебиологического эффекта торможения метаболизма при содовом засолении.

Известно, что в присутствии разных солей их общая токсичность может снижаться из-за т.н. антагонизма солей. Пег:-ольку этот эффект мог наблюдаться и в отношении денитрификации, нами было изучено совместное влияние NaCI, CaCI2, NaeS0t и NagCC^ на активность разных ферментов.

Как видно из рис.15, эффект антагонизма наиболее четко проявился в отношении ионов Са++ и Na4 в смеси солей NaCI и Са-С12. Отчетливое снижение токсического действия солей проявилось при концентрации 1 М.СаС12 и 2 М NaCI. Аналогичный эффект снижения токсичности был обнаружен и при добавлении в почву 0.01 М NajS04 на фоне 2 М NaCI (рис.16). В то же время не было обнару-гено уменьшения токсичности NaCI при добавлениии раствора соды в разных концентрациях. По видимому, это объясняется большим антагонистическим действием S042" к СГ. нежели карбонат-иона.

Следовательно, увеличение концентрации солей в почвенном растворе может способствовать повышению активности Мг 0-редуята-зы и уменьшению эмиссии закиси азота в атмосферу.

В заключение можно отметить, что засоление поч>> не таи,ко

снижает их хозяйственную ценность, но и, способствуя торможению процесса денитрификации на стадии образования закиси азота, повышает риск изменения существующего в биосфере динамического равновесия. Последнее является еще одним аргументом в пользу рационального природопользования;

ВЫВОДЫ

1. Подтверждено для широкого ряда засоленных почв, что закись азота (N^0) является преобладающим продуктом денитрифи-кации в таких почвах.

2. Впервые показано, что преобладание эмиссии И20 над ее потреблением в засоленных почвах обусловлено ингибированием солями фермента И20-редуктаэы у денитрифицирующих бактерий.

3. Вне зависимости от типа почвы засоление вызывает торможение денитрификации на стадии образования ^0, причем доля ей возрастает по мере увеличения содержания солей в почве.

4. Ферменты денитрификации проявляют разную чувствительность к солям; наиболее чувствительны: Н20-редуктаза и N03" -редуктаза; наименее чувствительны: N02 ~- редуктаза и N0 - ре-дукдуктаза.

5. Впервые получен ряд токсичности солей по отношению к процессу денитрификации:

ЫагСОз > МаНС03 > ИаЫ > ^БО« > МеБОд > СаС12. Наибольшим токсичным действием обладают На?С03. ИаНСОз и ИаС1, наименьшим - СаС12.

6. Выявлен эффект антагонизма солей, проявляющийся в снижении токсичности МаС1 для М20-редуктазы при добавлении СаС12 и НагБО,.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1.Меняйло 0.В., Степанов А. Л., Умаров М. М. Особенности де-нитрификации в засоленных почвах.// Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 17.' Почвоведение, 1994, N4, С. 52 - 55.

2. Меняйло 0.В. Микробный метаболизм азота в почвах Приа-ралья. / Современные проблемы почвоведения и экологии. Краснови-дово, 23 - 20 мая 1994. С. 135.

3. Меняйло 0.В., Степанов А.Л.. Умаров М.М. Превращение закиси азота денитрифицирующими микроорганизмами в солончаках. //Почвоведение, 1996, N 7, С. .

4. Меняйло 0. В. Роль засоленных почв в формировании климата планеты./ Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-96". Тезисы докладов. Почвоведение. Москва, 1996. С. 55.

5. Умаров М.М. .Меняйло 0. В. Засоленные почвы как микробиологический источник закиси азота. / Всероссийский съезд почвоведов. Санкт-Петербург, 1996 (в печати).

6. Меняйло 0.В..Степанов А. Л., Умаров М, М. Влияние солей на соотношение конечных продуктов денитрификации в почвах. // Почвоведение, 199? (в печати).

7. Menyailo O.V.. Stepanov A. L.. Umarov М.М. Formation and consumption of nitrous oxide In salinity soils./ IUMS Congres-ses'94. Prague. Czecn Republic, July 3rd-8th, 1994, P. 104.

8. Unarov Ы.М., Menyailo O.V. Salt - affected soils as a biotic sources of nitrous oxide (N¡>0)./ XII International Symposium on Environmental Biogeochenistry. Biosphere and Atisosh-perlc Changes. Abstracts. Rio de Jeneiro. Brasil, 3-8 Sept.. 1995 P. 165.

9. Menyailo O.V., Umarov U.K. Denitrifying bacterial сов-munlty of some soil types./ IUMS Congresses'96. Jerusalem. Israel. August 18-23, 1996.(In press).